CN104865389A - 一种检测人血清杂合轻链抗体的方法及试剂盒 - Google Patents

一种检测人血清杂合轻链抗体的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测人血清杂合轻链抗体的方法及试剂盒，属于临床检验学领域。检测人血清杂合轻链抗体的试剂盒，组成如下：(1)抗人lambda轻链抗体包被微孔板；(2)免疫标记的抗人kappa轻链抗体；(3)洗涤液(PBST)；(4)稀释液；(5)底物液：3′,3′,5′,5′,-四甲基联苯胺；(6)标准参考血清；(7)阴性对照液；(8)终止液。本发明用于双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测人血清杂合轻链抗体，是一种简单易行的方法，并且可以作为鉴别诊断自身免疫性胰腺炎和胰腺癌的新方法。

Description

一种检测人血清杂合轻链抗体的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测人血清杂合轻链抗体的试剂盒，属于临床检验学领域。
背景技术
在过去的十多年里，众多的实验证实，IgG4分子可以能够在体内外通过“半分子交换”(Fab arm exchange)的方式形成双特异性抗体，这种过程包括不同的IgG4分子的重-轻链对之间的交换、绞链区二硫键的重新生成，能够产生一种同时具有两种不同的抗原结合域的免疫球蛋白。抗体的绞链区第228位丝氨酸和CH3区第409位精氨酸以及血清还原型谷胱甘肽(GSH)对于这种抗体分子间的交换是必不可少的。人体内免疫球蛋白轻链有两种，分别是kappa和lambda，编码两条轻链的基因在染色体上的位置分别位于2p12-p11和22q11，经典免疫学理论认为：一个天然的Ig分子两条轻链总是相同的，不存在同时含有kappa和lambda轻链的杂合抗体分子，因此可以根据轻链的型别分为kappa或lambda链的抗体分子。但IgG4抗体的独特的半分子交换的特性表明，含kappa轻链的IgG4分子可以与含lambda轻链的IgG4分子通过“半分子交换”作用产生既含有kappa又含有lambda轻链的杂合抗体，体内可以存在同时具有kappa和lambda型的杂合抗体分子。
自身免疫性胰腺炎(Autoimmune pancreatitis,AIP)是一种慢性胰腺炎症性疾病，以阻塞性黄疸为特征性临床表现，胰腺组织活检伴有大量淋巴浆细胞浸润和组织纤维化，也称为淋巴浆细胞性硬化性胰腺炎。自身免疫性胰腺炎的典型血清学特征是IgG4水平明显增高，因此，又被称为IgG4相关性胰腺炎。血清IgG4水平是自身免疫性胰腺炎的诊断标准之一。在临床上，AIP病人和胰腺癌病人有许多共同的临床表现，如无痛性黄疸、体重减轻、新发糖尿病、胰腺肿物的形成，这给两者的鉴别诊断带来很多困难，明确诊断AIP可以避免不必要的胰腺切除手术，同时对疾病治疗和预后具有重要意义。目前尚未有研究报道自身免疫性胰腺炎患者体内是否存在杂合轻链抗体IgG4。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测人血清杂合轻链抗体的试剂盒。
本发明要解决的另一个技术问题是提供上述试剂盒的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测人血清杂合轻链抗体的试剂盒，由以下试剂组成：
(1)抗人lambda轻链抗体包被微孔板；
(2)免疫标记的抗人kappa轻链抗体；
(3)洗涤液(PBST)：含0.05％吐温-20的PBS溶液；
(4)稀释液：含体积百分比为20％的小牛血清的PBST；
(5)底物液：3′,3′,5′,5′,-四甲基联苯胺；
(6)标准参考血清：人为规定20例健康人等体积混合血清杂合抗体浓度为1AU/ml；
(7)阴性对照液：体积百分比为20％的小牛血清的PBST；
(8)终止液：0.5M硫酸。
所述(1)抗人lambda轻链抗体包被微孔板的包被条件是：每个微孔加入100μL浓度为1-10μg/ml的抗人lambda轻链抗体溶液，4℃包被过夜。
所述(2)免疫标记为酶标记、荧光素标记或生物素标记。
所述酶标记为辣根过氧化物酶标记或碱性磷酸酶标记。
所述(2)免疫标记的抗人kappa轻链抗体使用浓度为100μL/孔。
所述(6)标准参考血清为20例健康人等体积混合血清，定义此标准参考血清杂合抗体浓度为1AU/ml。
所述的试剂盒在检测杂合轻链抗体中的应用。例如用于检测人工合成的kappa和lambda杂合轻链抗体的含量，这类人工合成的kappa/lambda杂合轻链抗体可能作为诊断试剂或治疗药物用于未来的医学研究和/或药物开发。
所述的试剂盒在检测kappa/lambda杂合轻链抗体中的应用，尤指检测天然杂合轻链抗体中的应用。本试剂盒可以定量检测那些在患者血清中含有此类杂合轻链抗体的疾病，尤其是当该杂合抗体被证明为某疾病的检测指标物质时，可极大提高检测效率。
所述的试剂盒在检测自身免疫性胰腺炎的应用，尤指所述的试剂盒用于制备检测自身免疫性胰腺炎的试剂的应用。由于IgG4分子独特的半分子交换的特性，我们推测AIP患者体内同时带有kappa轻链和lambda轻链的杂合轻链抗体分子水平明显增高，而这种升高的杂合轻链抗体可以作为AIP与胰腺癌鉴别诊断的全新血清学标志物。经过大量研究，本发明首次发现，在自身免疫性胰腺炎患者的血清中杂合轻链抗体水平明显增高。通过对自身免疫性胰腺炎患者血清，胰腺癌血清，疾病对照血清和健康对照血清进行检测发现，杂合轻链抗体在自身免疫性胰腺炎患者中的水平明显高于胰腺癌组和对照组(疾病对照和健康对照)，并具有统计学意义。因此，本发明人所发现杂合轻链抗体可以看作是存在于自身免疫性胰腺炎患者血清中的一种新型指标，且这类新型指标能够作为诊断自身免疫性胰腺炎和鉴别诊断胰腺癌的新的血清学标志。
所述试剂盒用于鉴别诊断自身免疫性胰腺炎与胰腺癌的应用，尤指所述试剂盒用于制备鉴别诊断自身免疫性胰腺炎与胰腺癌的试剂的应用。
本发明试剂盒的简要检测程序为：
(1)采用抗人lambda包被微孔板作为固相抗原；
(2)加入稀释血清样本进行温育；
(3)加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人kappa轻链抗体；
(4)加显色底物；
(5)终止读数。
本发明的优点：本发明提供了一种双抗体夹心法的酶联免疫检测试剂盒，使用方便，操作简单，特异性强，安全，可用于定量检测杂合轻链抗体及鉴别诊断自身免疫性胰腺炎和胰腺癌。
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行说明，以使公众更好地理解本发明内容及应用，并不以任何方式造成对本发明的限定。凡依照本发明公开内容所做的任何等同替换，均属于本发明保护范围。
附图说明
图1为背景技术所述的人体内同时具有kappa和lambda型的杂合抗体分子。
图2为杂合轻链抗体在自身免疫性胰腺炎患者、胰腺癌患者、疾病对照患者和正常然血清中的分布图，图中AIP表示自身免疫性胰腺炎患者血清，Pca表示胰腺癌患者血清，DC表示疾病对照患者血清，HC表示健康人血清。
图3为实施例2中各浓度下的标准血清和对应的吸光度得到的拟合曲线。
具体实施方式
以下为实施例中涉及的主要材料和试剂：
抗人lambda轻链抗体，Sigma，美国
辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人kappa抗体，Abcam，沙特
十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，北京化学试剂公司，中国
二水磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)，北京化学试剂公司，中国
磷酸二氢钾(KH2PO4)，北京化学试剂公司，中国
氯化钠(NaCl)，北京化学试剂公司，中国
氯化钾(KCl)，北京化学试剂公司，中国
碳酸氢钠(NaHCO3)，北京化学试剂公司，中国
碳酸钠(Na2CO3)，北京化学试剂公司，中国
小牛血清，GIBCO，新西兰
96孔酶标板，Nunc,丹麦
吐温-20(Tween-20)，SIGMA，美国
3′,3′,5′,5′,-四甲基联苯胺(TMB)，SIGMA，美国
抗体测定溶液配制
(1)碳酸盐包被缓冲液：Na2CO30.795g，NaHCO31.465g，去离子水400mL，充分溶解后用1M HCl调节pH值至9.6，加入去离子水定容至500mL，保存于室温。
(2)磷酸盐缓冲(PBS)溶液：NaCl 8g，Na2HPO4.12H2O 3.63g，KCl 0.2g，KH2PO40.24g，去离子水800mL，充分溶解后用1M HCl调节溶液的pH值至7.4，加去离子水定容至1L，高压灭菌后保存。
(3)洗涤缓冲液PBST(洗板用)：PBS 1L，Tween-20500μL，搅拌混匀，每次使用前新鲜配制。
(4)稀释液：PBST 80mL，小牛血清20mL，充分混匀，每次使用前新鲜配制。
实施例1：检测人血清杂合轻链抗体的试剂盒
一.试剂盒组成
1.抗人lambda轻链抗体包被微孔板；
2.辣根过氧化物酶标记的抗人kappa轻链抗体：Abcam公司；
3.洗涤液(PBST)：含0.05％吐温-20的PBS溶液；(1L PBS中加入500μL Tween-20，充分混匀)
4.稀释液：含20％(v/v)小牛血清的PBST；
5.底物液：3′,3′,5′,5′,-四甲基联苯胺(TMB)；
6.标准参考血清：20例健康人等体积混合血清，规定杂合抗体浓度为1AU/ml；
7.阴性对照液：体积百分比为20％的小牛血清的PBST；
8.终止液：0.5M硫酸。
二.抗人lambda轻链包被微孔板制备的条件及方法：
A：微孔板：Nunc，96孔板，丹麦；
B：包被缓冲液：碳酸盐包被缓冲液：Na2CO30.795g，NaHCO31.465g，去离子水400mL，充分溶解后用1M HCl调节pH值至9.6，加入去离子水定容至500mL，保存于室温。
C：抗人lambda抗体包被浓度：5μg/ml(大于1μg/ml均可进行包被，一般选择1-10μg/ml，可根据实际情况进行调整)；
D：包被条件：4℃过夜；
包被条件：每个微孔加入100μL浓度为5μg/ml的抗人lambda抗体溶液，4℃包被过夜；
E：封闭：含20％(v/v)小牛血清的PBST，每孔200μL，37℃温育2小时。
实施例2：人血清杂合轻链抗体的检测
一.材料
1.实施例1所述的试剂盒
2.血清：34份自身免疫性胰腺炎患者血清，60例胰腺癌患者血清，42例疾病对照血清(包括急性胰腺炎23例、慢性非自身免疫性胰腺炎19例)，62例健康人血清。分析前均储存于-80℃。
二.方法
1.双抗体夹心法检测杂合轻链抗体
(1)测定前，所有材料和试剂均平衡至室温；
(2)稀释标准血清：用加样枪吸取1μL试剂盒提供的标准血清加入到1mL稀释液中，配制成1AU/uL的原液，接着吸取500uL加入到1ml稀释液中，连续进行6次2倍梯度稀释，配制得到浓度分别为1AU/uL、0.5AU/uL、0.25AU/uL、0.125AU/uL、0.0625AU/uL、0.03125AU/uL的标准血清；
(3)稀释样本：用加样枪吸取1μL血清加入到100μL试剂盒提供稀释液中，旋涡振荡器混匀，然后吸取上述稀释血清10μL加入到990μL稀释液中，旋涡振荡器混匀；
(4)分别吸取上述标准血清、稀释样本和阴性对照液各100ul加入到抗人lambda抗体包被的微孔板中。各梯度标准血清和每个样本均做复孔，37℃温育1小时；
(5)洗涤液(PBST)洗涤5次，拍干。
(6)HRP标记的抗人kappa抗体用稀释液进行1:2000稀释，充分混匀后加入各微孔(100μL/孔)，37℃温育1小时；
(7)洗涤液(PBST)洗涤5次，拍干；
(8)每孔加入100μL底物液，37°显色10分钟。
(9)洗涤液(PBST)洗涤5次，拍干；
(10)每孔加入50μL终止液终止反应。
(11)读数：用双波长450nm/630nm测定各孔OD值。
2.标准曲线绘制和结果计算
(1)利用计算机软件对标准血清各浓度下的吸光度平均值进行曲线拟合，采用四参数回归的方法，求出标准曲线的回归公式；
(2)将各样本的吸光度平均值代入公式，计算出样本的杂合抗体浓度，乘以稀释倍数，可以得到样本的最终杂合抗体浓度。当样本吸光度超过线性范围时，应进一步稀释，再乘以相应的稀释因子。
三.结果
1.标准曲线的绘制
该测定中，以包被于微孔板上的抗人lambda抗体为捕获抗体，HRP标记的抗人kappa抗体为检测抗体，对试剂盒提供的稀释标准血清进行四参数拟合。图3为各浓度下的标准血清和对应的吸光度得到的拟合曲线，在此检测范围内具有良好的拟合效果，相关系数大于0.99。(注：本研究中该标准血清基于20份正常人等体积混合血清，推广应用时可根据不同的参比血清进行调整)。
2.杂合轻链抗体的测定
该测定中，以包被于微孔板上的抗人lambda抗体为捕获抗体，HRP标记的抗人kappa抗体为检测抗体，检测自身免疫性胰腺炎患者(AIP)和胰腺癌患者(Pca)血清中杂合轻链抗体。疾病对照患者血清(DC)和正常人血清(HC)作为对照。检测结果见图2，杂合轻链抗体在自身免疫性胰腺炎患者血清(34例)、胰腺癌患者血清(60例)、疾病对照患者血清(42例)和正常人血清(62例)中的分布图。结果显示，自身免疫性胰腺炎患者血清(AIP组)中杂合轻链抗体水平明显高于其它各组，该杂合抗体可以作为自身免疫性胰腺炎的特异性检测指标，并能够作为一种鉴别诊断自身免疫性胰腺炎和胰腺癌的血清学指标。

Claims (10)

1.一种检测人血清杂合轻链抗体的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成：
(1)抗人lambda轻链抗体包被微孔板；
(2)免疫标记的抗人kappa轻链抗体；
(3)洗涤液(PBST)：含0.05％吐温-20的PBS溶液；
(4)稀释液：含体积百分比为20％的小牛血清的PBST；
(5)底物液：3′,3′,5′,5′,-四甲基联苯胺；
(6)标准参考血清：20例健康人等体积混合血清杂合抗体浓度为1AU/ml；
(7)阴性对照液：体积百分比为20％的小牛血清的PBST；
(8)终止液：0.5M硫酸。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述(1)抗人lambda轻链抗体包被微孔板的包被条件是：每个微孔加入100μL浓度为1-10μg/ml的抗人lambda轻链抗体溶液，4℃包被过夜。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述(2)免疫标记为酶标记、荧光素标记或生物素标记。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标记为辣根过氧化物酶标记或碱性磷酸酶标记。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述(2)免疫标记的抗人kappa轻链抗体使用体积为100μL/孔。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述(6)标准参考血清：20例健康人等体积混合血清杂合抗体浓度为1AU/ml。
7.权利要求1至6中任何一项所述的试剂盒在检测杂合轻链抗体的应用。
8.权利要求1至6中任何一项所述的试剂盒在检测天然杂合轻链抗体中的应用。
9.权利要求1至6中任何一项所述的试剂盒在检测自身免疫性胰腺炎中的应用。
10.权利要求1至6中任何一项所述的试剂盒在鉴别诊断自身免疫性胰腺炎与胰腺癌的应用。
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