DE10125033A1 - SS-A (Ro) und SS-B (La) als Targets zur Beeinflussung der Apoptose - Google Patents

SS-A (Ro) und SS-B (La) als Targets zur Beeinflussung der Apoptose

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Beeinflussung von apoptotischen Prozessen in einer Zelle, welche auf der Aktivität der Apoptose-induzierenden Proteine SS-A oder Ro (Sjögren Syndrom Antigen A) oder/und SS-B oder La (Sjögren Syndrom Antigen B) basieren. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Identifizierung von Apoptose-inhibierenden bzw. Apoptose-induzierenden Substanzen sowie deren Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen, zur Behandlung und Diagnose von Erkrankungen, die mit verminderter oder übermäßiger Apoptose verbunden sind. Zusätzlich betrifft die Erfindung Zellsysteme sowie transgene Tiere und deren Verwendung zur genetischen und/oder pharmakologischen Untersuchung dieser Krankheiten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Beeinflussung von apoptotischen Prozessen in einer Zelle, welche auf der Aktivität der Apoptose-induzierenden Proteine SS-A oder Ro (Sjögren Syndrom Antigen A) oder/und SS-B oder La (Sjögren Syndrom Antigen B) basieren. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Identifizierung von Apoptose- inhibierenden bzw. Apoptose-induzierenden Substanzen sowie deren Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen, zur Behandlung und Diagnose von Erkrankungen, die mit verminderter oder übermäßiger Apoptose verbunden sind. Zusätzlich betrifft die Erfindung Zellsysteme sowie transgene Tiere und deren Verwendung zur genetischen und/oder pharmakologischen Untersuchung dieser Krankheiten.
Apoptose ist eine Form von genetisch programmiertem Zelltod und wird durch die Zelle selbst reguliert. Die Apoptose ist unter anderem für eine ordnungsgemäße Embryogenese und Metamorphose der Zelle, für die Gewebehomöostase und die Funktion des Immunsystems notwendig. Demzufolge muss die Induktion der Apoptose in der Zelle streng reguliert sein. Eine nicht-regulierte Aktivierung der Apoptose kann ernsthafte Konsequenzen für den Organismus haben. So kann z. B. eine übermäßige Apoptose-Induktion zu degenerativen Erkrankungen wie Alzheimer führen (Loo et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7951-7955). Andererseits kann eine verminderte Apoptose-Aktivität der Zellen zu dem Mehrstufenprozess der Tumorgenese beitragen, da Tumorzellen zahlreichen anti-apoptotischen Stimuli ausgesetzt sind (McGill, G., 1997, Front. Biosci. 2: 353-379). Demzufolge wird die Induktion der Apoptose in der Zelle durch ein hochentwickeltes System von Regulationsmechanismen gesteuert.
Eine Reihe von Faktoren wurden bislang identifiziert, die an der Apoptose- Induktion beteiligt sind. Darunter befindet sich eine Gruppe cytoplasmatischer Proteasen, die eine Hauptrolle bei der Aktivierung der Apoptose spielen. Allerdings liegen bislang keine Hinweise vor, ob diese Proteasen koordiniert, als Teil einer einzigen Funktionseinheit oder innerhalb eines funktionellen Komplexes tätig werden. Vermutlich ist die Aktivierung einer Familie von Cystein-Proteasen, den sogenannten Caspasen, für das Einsetzen der Apoptose verantwortlich (Salvesen und Dixit, 1997, Cell 91: 443-446). Diese Enzyme sind in der Lage, spezifische Substrate in der Zelle zu spalten, was vermutlich zu der Induktion der Apoptose und der Selbstzerstörung der Zelle führt. Als Zielsubstrate dieser Proteasen wurden beispielsweise folgende Proteine identifiziert: Poly(ADP-Ribose)-Polyme­ rase, Lamin B1, α-Fodrin, Topoisomerase I und β-Actin.
Der apoptotische Zelltod wird auch initiiert, wenn der Zelloberflächenrezeptor Fas (auch Apo-1 genannt) und der Typ-1- Tumornekrosefaktor-Rezeptor (TNF-1) entweder ihre Liganden oder quervernetzende Antikörper binden. Da der natürliche Ligand von Fas ein glycosyliertes Transmembranprotein Typ II ist, wird eine Apoptose- Induktion durch Zell-Zell-Kontakt nicht ausgeschlossen. Diese Vermutung wird zudem durch die Beobachtung gestützt, dass cytotoxische T-Zellen in der Lage sind, Apoptose in den Zielzellen zu induzieren, wenn sie an Fas binden.
Ein erstes Anzeichen, dass Mitochondrien eine wichtige Rolle bei der Induktion der Apoptose spielen, war die Beobachtung, dass ein in-vitro- System zur Apoptose-Induktion die Anwesenheit von Mitochondrien benötigte (Newmeyer et al., 1994, Cell 79: 353-364). Dem Mitochondrien-Transport-Poren-Komplex - PT-Komplex ("permeability transition pore(PT) - complex" (Zoratti und Szabo, 1995, Biochem. Biophys. Acta 1241: 129-176)) - einem Proteinaggregat der inneren und äußeren Mitochondrienmembran, wurde eine Rolle bei der Induktion der Apoptose zugeschrieben (Petit et al., 1995, J. Cell. Biol. 130: 157-167; Zamzami et al., 1995, J. Exp. Med. 181: 1661-1672). Es konnte gezeigt werden, dass zahlreiche pharmakologische Stimuli diesen Komplex über einen noch unbekannten Mechanismus aktivieren (Fulda et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 33942-33948; Zamzami et al., 1998, Oncogene 16: 1055-1063). Die Aktivierung dieses Membran-Komplexes führt zu einem Zusammenbruch des elektrochemischen Potentialgradienten über die innere Mitochondrienmembran (ΔΨm). Dies führt zu einem Anschwellen der Mitochondrien, der Bildung von Sauerstoffradikalen (Van der Heiden et al., 1997, Cell 91: 627-637; Zamzami et al., 1995, J. Exp. Med. 182: 367-­ 377) und der nachfolgenden Expression von Apoptose-induzierenden Caspasen (Susin et al., 1999, J. Exp. Med. 189: 381-394) und einer Oxidoreduktase (Susin et al., 1999, Nature 397: 441-446) in der betroffenen Zelle. Die freigesetzten Caspasen und die Oxidoreduktase unterstützen die Apoptose-Induktion zusätzlich.
Solche Apoptose-induzierenden Gene besitzen die dominante Eigenschaft, den Zelltod durch ihre Überexpression in der Zelle zu induzieren. Dieses gemeinsame Merkmal ist über verschiedene Spezies konserviert (McCarthy und Dixit, 1998, J. Biol. Chem. 273: 24009-24015). Die Überexpression der Proteine führt zu vermehrt auftretenden Protein-Protein-Kontakten in der Zelle und erzeugt so wahrscheinlich das Signal für die Apoptose- Induktion (Yang et al., 1998, Science 281: 1355-1357).
Grimm und Leder (Grimm und Leder, 1997, J. Exp. Med. 185: 1137-­ 1142) entwickelten ein Screening-Verfahren zur Bestimmung von dominanten Apoptose-induzierenden Genen. Dieses Screening-Verfahren basiert auf der iterativen Transfektion von Säugetier-Zellen durch kleine Plasmid-Pools einer normalisierten cDNA-Bank und der morphologischen Bestimmung der Apoptose-Induktion. Mit Hilfe dieses Verfahrens konnte das Apoptose-induzierende Adeninnukleotid-Translokase-1(ANT-1)Gen identifiziert werden. Der ANT-1-induzierte Zelltod wird durch Aktivierung der ANT-1 Überexpression und durch nachfolgende Protein-Protein- Wechselwirkungen in der Zelle induziert (PCT/EP00/08812).
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung eines neuen Apoptose­ induzierenden Gens: des SS-B (La)-Gens, das für das SS-B (La)-Protein kodiert. Die Nukleotidsequenz des SSB-B (La)-Gens ist bekannt, siehe z. B. Maus-SS-B (La)-Gen: NM 009278; Mensch-SS-B (La)-Gen: J04205, M11108, X13697; Mensch-SS-B(La)-Gen, alternative Spliceform in PBLs: X69804. Bei der Initiation der Apoptose in der Zelle kommt es in verschiedenen Zell- und Gewebesystemen zu einer transienten Überexpression des SS-B(La)-Proteins. Dies führt zu vermehrt auftretenden Protein-Protein- oder/und Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen in der Zelle und somit zu einem zellinternen Signal zur Einleitung des Zelltods. Ein weiteres im Rahmen der vorliegenden Erfindung identifiziertes Apoptose-induzierendes Gen ist das SS-A(Ro)-Gen, das für das SS-A(Ro)- Protein kodiert. Die Nukleotidsequenz des SS-A(Ro) Gens ist bekannt, siehe z. B. Maus-SS-A (Ro)-Gen: NM_009277 (SS-A1 (52 kDa)), NM_013835 (SS-A2 (60 kDa)); Mensch-SS-A (Ro)-Gen: XM_006064 (SS- A1 (52 kDa)), XM_001901 (SS-A2 (60 kDa)).
Bisher wurden das SS-A (Ro)- und das SS-B (La)-Protein als prominente Antigene bei einer humanen Krankheit, dem Sjögren-Syndrom, beschrieben (Chan und Andrade, Rheum. Clin. North. Am. 18 (1992), 551-570). Diese Krankheit führt im Anfangsstadium zur Austrocknung sämtlicher Schleimdrüsen und im späteren Verlauf zu degenerativen und autoimmunen Prozessen wie SLE (Systemischer Lupus erythematosus) und Rheumatoide Arthritis (RA). Beim Sjögren-Syndrom kommt es zu einer körpereigenen Produktion von Autoantikörpern gegen das SS-A (Ro)-Protein oder/und das SS-B (La)-Protein sowie zum Verlust der Immuntoleranz. Obwohl der anti- SS-A (Ro)-Antikörper oder/und der anti-SS-B (La)-Antikörper die besten diagnostischen Marker des Sjögren-Syndroms sind, war die klinische Bedeutung dieser Antikörper bislang unbekannt.
Weiterhin war bekannt, dass Lymphocyten von Patienten mit Sjögren Syndrom verminderte oder teilweise keine Apoptose zeigen (Nakamura et al., Clin. Exp. Immunol. 114 (1998), 106-112). Eine Induktion von apoptotischen Prozessen durch SS-A (Ro) bzw. SS-B (La) war bisher jedoch nicht bekannt.
Erst durch die zur vorliegenden Erfindung führenden Untersuchungen konnten die Apoptose-induzierenden Wirkungen des SS-A (Ro)- und des SS-B (La)-Gens bzw. der davon kodierten Proteine nachgewiesen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Verwendung einer Apoptose- induzierenden SS-A (Ro) - oder/und SS-B (La)-Nukleinsäure oder eines davon kodierten Polypeptids oder Peptids als Target zur Diagnose oder/und Beeinflussung apoptotischer Prozesse. Gegebenenfalls können die Nukleinsäuren auch Mutationen und Trunkierungen gegenüber der nativen Sequenz aufweisen. Gegenstand der Erfindung sind somit auch unter stringenten Bedingungen mit den zuvor genannten Sequenzen hybridisierende Nukleinsäuren. Stringente Bedingungen sind dabei definiert, wie in Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1101-1104) beschrieben. Vorzugsweise liegt eine stringente Hybridisierung dann vor, wenn nach Waschen für 1 h mit 1 × SSC und 0,1% SDS bei 50°C, bevorzugt bei 55°C, mehr bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C, und bevorzugt für 1 h mit 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 50°C, bevorzugt bei 55°C, mehr bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C, immer noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Beeinflussung, z. B. Steigerung oder Hemmung, apoptotischer Prozesse in einer Zelle oder in einem Organismus, bei dem die Zelle oder der Organismus mit einer wirksamen Menge einer Substanz behandelt wird, die geeignet ist, die Menge oder/und Aktivität, insbesondere die Apoptose- stimulierende Aktivität des Proteins SS-A (Ro) oder des Proteins SS-B (La) zu veringern.
Vorzugsweise sollen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren apoptotische Prozesse in Wirbeltierzellen, vorzugsweise Säugetierzellen und besonders bevorzugt humanen Zellen, wie Krebszellen oder Drüsenzellen, gehemmt werden. Des Weiteren weist die Zelle oder der Organismus vorzugsweise eine pathologische Störung auf, die mit übermäßiger Apoptose verbunden ist.
Der Begriff "Substanz, die geeignet ist, die Menge oder/und Aktivität, insbesondere die Apoptose-stimulierende Aktivität des Proteins SS-A (Ro) oder/und des Proteins SS-B (La) zu verändern" umfasst in der vorliegenden Anmeldung eine Substanz, die wenigstens eine der im folgenden beschriebenen Eigenschaften besitzt. Die Hemmung bzw. Inaktivierung von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) kann dabei auf unterschiedliche Weise erfolgen. Zum einen kann die Aktivität von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) auf Nukleinsäureebene inhibiert werden. Dies kann erfindungsgemäß durch eine Reduktion der SS-A (Ro)- bzw. SS-B (La)-Genexpression, z. B. durch Verwendung von Antisense-Konstrukten (z. B. Oligonukleotiden oder RNAi)(Brass, B. L. (2000), Cell 101, 235-238), die die Transkription des SS- A (Ro)- bzw. SS-B (La)-Gens verhindern, durch Verwendung von Ribozymen, die geeignet sind, die SS-A (Ro)- bzw. SS-B (La)-mRNA- Transkripte zu spalten oder/und durch eine Inhibierung der Aktivität des endogenen SS-A (Ro)- bzw. SS-B (La)-Promotors, z. B. über SS-A (Ro)- bzw. SS-B (La)-spezifische Transkriptionsfaktoren, erreicht werden. Eine Reduktion der SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Genexpression kann jedoch auch erreicht werden, in dem die Aktivität von Proteinen, beispielsweise durch spezifische Inhibitoren, beeinflusst wird, die stromaufwärts dieser Transkriptionsfaktoren wirken, wie z. B. Proteinkinasen und Phosphatasen.
Zum anderen kann die Aktivität von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) auf Proteinebene inhibiert werden. Dies wird erfindungsgemäß beispielsweise erreicht durch anti-SS-A (Ro)- bzw. anti SS-B (La)-Antikörper, durch SS-A (Ro)- bzw. SS-B (La)-regulatorische Proteine oder durch SS-A (Ro)- bzw. SS-B (La)-Protein-Antagonisten, die die apoptotische Aktivität von SS-A (Ro)- bzw. SS-B (La) inhibieren.
Eine weitere Inaktivierungsmöglichkeit betrifft einen Signaltransduktions­ weg, durch den SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) aktiviert wird, wobei einer oder mehrere Schritte dieses Signaltransduktionswegs inhibiert werden. Dies kann beispielsweise über Antikörper gegen Enzyme erfolgen, die einzelne Schritte des Signaltransduktionswegs katalysieren oder durch Inhibitoren, die die Aktivität der entsprechenden Proteine hemmen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Beeinflussung eine direkte Wechselwirkung mit SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) oder eine indirekte Wechselwirkung, vermittelt über einen Signaltransduktionsweg. Vorzugsweise umfasst die Beeinflussung die Steigerung oder Hemmung apoptotischer Prozesse.
Mit Hilfe dieses Verfahrens können insbesondere durch den erfindungsgemäßen Einsatz von Apoptose-beeinflussenden Substanzen apoptotische Prozesse in einer Zelle oder einem Organismus beeinflusst, z. B. gehemmt oder stimuliert werden. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Identifizierung von Apoptose-beeinflussenden Substanzen, bei dem eine Testsubstanz auf die Fähigkeit untersucht wird, die Menge oder/und Aktivität, insbesondere die Apoptose-stimulierende Aktivität von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) zu verändern. Der Begriff "Testsubstanz" umfasst dabei niedermolekulare Substanzen, Proteine wie z. B. Antikörper, Peptide, Protein- und Peptidfragmente, Nukleinsäuren und Liganden.
Vorzugsweise wird die Testsubstanz in dem erfindungsgemäßen Verfahren auf die Fähigkeit untersucht, direkt an SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) oder eine Domäne davon zu binden. Die Wechselwirkung zwischen Testsubstanz und SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) kann nicht-kovalenter oder/und kovalenter Natur, d. h. reversibel oder nicht reversibel, sein. Die Bindung der Testsubstanz an SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) führt zu einer Veränderung, z. B. Inhibierung oder Stimulierung der Apoptose- induzierenden Aktivität des Proteins. Beispielsweise kann die Testsubstanz in das aktive Zentrum von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) binden und so seine Apoptose-induzierende Aktivität inhibieren. Die Bindung der Testsubstanz an SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) kann aber auch einen Konformationswechsel erzwingen, der zu einer Reduktion und/oder Inhibierung der Aktivität führt. Desweiteren kann die Bindung der Testsubstanz an SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) die Bindung von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) an eine Nukleinsäure verhindern. Alternativ können auch indirekte Hemm- oder Stimulationssubstanzen bestimmt werden, die nicht direkt an SS-A (Ro) oder/und SS-B (La), sondern an einen physiologisch essenziellen Bindepartner von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) oder an ein mit SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) über einen Signaltransduktionsweg in Verbindung stehendes Protein binden.
Die Identifizierung von Apoptose-beeinflussenden Substanzen, z. B. Apoptose-inhibierende oder/und Apoptose-stimulierende Substanzen, kann in Form eines Hochdurchsatz-Assays durchgeführt werden, wodurch eine parallele Bestimmung von wenigstens 24 und bevorzugt wenigstens 96 Testsubstanzen ermöglicht wird. Der Assay kann beispielsweise in Form eines zellulären Assays durchgeführt werden, wobei ein Testsystem verwendet wird, das SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-enthaltende Zellfraktionen oder SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-enthaltende Zellen umfasst. In diesem Fall erfolgt die Identifizierung der Apoptose­ beeinflussenden Substanz vorzugsweise über die Messung der Apoptose- Induktion. Die Apoptose-Induktion kann dabei über verschiedene Parameter, die mit der Apoptose verbunden sind, gemessen werden, wie z. B. DNA-Fragmentierung, Caspase-Aktivierung oder die charakteristische Veränderung der Zellmorphologie bei Apoptose. Außerdem können auch andere bekannte Verfahren zur qualitativen oder/und quantitativen Bestimmung der Apoptose eingesetzt werden.
Alternativ kann der Assay beispielsweise auch in Form eines molekularen Assays durchgeführt werden, wobei ein im Wesentlichen aufgereinigtes und isoliertes Protein, ausgewählt aus SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) oder eine Domäne davon, verwendet wird. Bei dem im Wesentlichen aufgereinigten SS-A (Ro)-Protein oder/und SS-B (La)-Protein handelt es sich vorzugsweise um rekombinantes SS-A (Ro)-Protein oder/und SS-B (La)- Protein bzw. um eine rekombinant exprimierte Domäne des SS-A (Ro)- Proteins oder/und SS-B (La)-Proteins. In diesem Fall erfolgt die Messung der Apoptose-Induktion vorzugsweise über die Bestimmung von Protein- Protein-Wechselwirkungen, z. B. der Wechselwirkung von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) mit der Testsubstanz. Solche Protein-Protein- oder/und Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen können beispielsweise durch Gelpermeationschromatographie oder native Polyacrylamid- Gelelektrophorese bestimmt werden. Jedoch sieht die Erfindung auch andere, dem Fachmann bekannte Bestimmungsverfahren vor, z. B. Reportergen-Assays oder Two-Hybrid-Systeme.
Auf diese Weise können Apoptose-inhibierende Substanzen identifiziert bzw. bereitgestellt werden, die die Fähigkeit besitzen, die Apoptose- induzierende Fähigkeit von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) zu inhibieren. Vorzugsweise besitzt die Apoptose-inhibierende Substanz wenigstens eine der vorangehend beschriebenen Eigenschaften zur Hemmung bzw. Inaktivierung der Aktivität von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La). Allerdings können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens auch Apoptose- stimulierende Substanzen identifiziert werden. Vorzugsweise handelt es sich bei der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Apoptose-beeinflussenden Substanz um eine Apoptose-inhibierende oder Apoptose-induzierende Substanz.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Bereitstellung der identifizierten Substanz oder einer davon abgeleiteten Substanz als pharmazeutische Zusammensetzung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Apoptose- beeinfiussende Substanz, identifiziert durch das oben beschriebene Verfahren zur Identifizierung Apoptose-beeinflussender Substanzen, oder eine davon abgeleitete Substanz. Die Apoptose-beeinflussende Substanz ist vorzugsweise eine Apoptose-inhibierende oder Apoptose-induzierende Substanz.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Induktion apoptotischer Prozesse in einer Zelle oder in einem Organismus, welches eines der folgenden Schritte umfasst:
  • a) Verabreichen von SS-A (Ro)-Protein oder/und SS-B (La)-Protein, SS- A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Nukleinsäuren und Fragmenten oder Derivaten davon, oder
  • b) Verabreichen einer wirksamen Menge einer Substanz, die geeignet ist, die Aktivität oder/und Menge von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) zu erhöhen.
Dieses Verfahren zur Induktion apoptotischer Prozesse wird vorzugsweise in Wirbeltierzellen, vorzugsweise Säugetierzellen und besonders bevorzugt humanen Zellen eingesetzt, insbesondere wenn die Zelle eine pathologische Störung aufweist, die mit verminderter oder/und fehlender Apoptose verbunden ist.
Die Induktion von apoptotischen Prozessen kann durch Zugabe einer Apoptose-induzierenden Substanz erfolgen. Der Begriff "eine Substanz, die geeignet ist, die Aktivität oder/und Menge des SS-A (Ro)-Proteins oder/und SS-B (La)-Proteins zu erhöhen" umfasst eine Aktivierung auf Nukleinsäureebene oder/und eine Aktivierung auf Proteinebene. Die Aktivierung auf Nukleinsäureebene kann durch eine Substanz erfolgen, die die Aktivität des SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Promotors verstärkt, z. B. über SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-spezifische Transkriptionsfaktoren. Auf Proteinebene kann die Verstärkung durch Zugabe von SS-A (Ro)-Protein oder/und SS-B (La)-Protein, SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-DNA und Fragmenten oder Derivaten davon oder SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)- Aktivatoren erfolgen. Eine Verstärkung der Induktion kann auch über die Aktivierung eines Signaltransduktionswegs erreicht werden, durch den SS- A (Ro) oder/und SS-B (La) aktiviert wird.
Desweiteren umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, die mit Apoptose assoziiert sind, bei dem einem Patienten eine pharmazeutisch wirksame Menge einer Substanz verabreicht wird, die die Aktivität, insbesondere die Apoptose-stimulierende Aktivität von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) beeinflusst. Die vorliegende Erfindung sieht dabei vor, dass mit diesem Verfahren Krankheiten behandelt werden können, die mit übermäßiger oder verminderter bzw. fehlender Apoptose verbunden sind.
Für die Prävention oder Behandlung von Krankheiten, die mit übermäßiger Apoptose verbunden sind, wird dem Patienten vorzugsweise eine pharmazeutisch wirksame Menge einer Apoptoseinhibierenden Substanz verabreicht. Beispiele für solche Krankheiten sind degenerative Erkrankungen, z. B. Morbus Alzheimer, Cardiomyopathie und Schlaganfall, oder autoimmune Erkrankungen, z. B. Sjögren-Syndrom (primär und sekundär), Multiple Sklerose, Rheumatoide Arthritis und Typ-I-Diabetes.
Für die Prävention oder Behandlung von Krankheiten, die mit verminderter bzw. fehlender Apoptose verbunden sind, wird dem Patienten vorzugsweise eine pharmazeutisch wirksame Menge einer SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-aktivierenden Substanz oder/und das SS-A (Ro)-Protein oder/und SS-B (La)-Protein, der SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Nukleinsäure und Fragmente oder Derivate davon, verabreicht. Beispiele für solche Krankheiten sind hyperproliferative Erkrankungen, z. B. Krebs.
Die vorliegende Erfindung betrifft überdies eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff eine Substanz enthält, die die Aktivität, insbesondere die Apoptose-stimulierende Aktivität von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) beeinflusst. Zusätzlich enthält die pharmazeutische Zusammensetzung ggf. weitere pharmazeutisch verträgliche Träger, Verdünnungsmittel oder Zusatzstoffe.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist geeignet für orale, parenterale, z. B. intradermale, intravenöse oder intramuskuläre, rektale, nasale und lokale Anwendungen. Daher kann die Zusammensetzung sowohl in Form einer Injektionslösung, als Tablette, Zäpfchen, Tropfen, z. B. Augentropfen oder Ohrentropfen, als Saft, Salbe, Creme oder Spray vorliegen. Die Erfindung sieht weiterhin vor, dass die pharmazeutische Zusammensetzung auch als Depotwirkstoff vorliegen kann, der eine verzögerte Freigabe der aktiven Substanz ermöglicht.
Die Dosierung der aktiven Substanz der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung hängt von der spezifischen Apoptose-beeinflussenden Substanz ab, die verabreicht wird, sowie von der Art und der Schwere der Erkrankung. Geeignete Applikationsdosen, die benötigt werden, um eine Erkrankung zuverlässig zu behandeln, können durch einen Fachmann einfach bestimmt werden. Z. B. kann eine Dosierung von 0,01 mg bis 100 mg aktiver Substanz pro Tag und pro Kilogramm Körpergewicht des Patienten geeignet sein.
Die pharmazeutische Zusammensetzung wird vorzugsweise zur Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten eingesetzt, die mit übermäßiger oder verminderter bzw. fehlender Apoptose verbunden sind. Beispiele für solche Krankheiten wurden vorangehend bereits genannt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose von apoptotischen Prozessen, insbesondere in Krankheiten, die mit einer übermäßigen oder verminderten oder/und fehlenden Apoptose verbunden sind, bei dem eine Probe, z. B. eine Gewebeprobe oder/und eine Körperflüssigkeit von einem Patienten auf Vorhandensein, Menge, Veränderung der DNA-Sequenz und/oder Aktivität von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) untersucht werden.
Die Messung von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) kann beispielsweise mittels eines spezifischen SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Protein-Assays durchgeführt werden. Dies ermöglicht eine quantitative Bestimmung des SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Gehalts der Probe. Es ist jedoch auch möglich, die Aktivität von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La), z. B. über die Messung der SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-induzierten Apoptose zu bestimmen.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Verlaufskontrolle vor, während oder/und nach der Krankheitstherapie eingesetzt werden. Die Gewebeproben oder/und Körperflüssigkeiten eines Patienten werden dabei auf das Vorhandensein oder/und Aktivitäten von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) bzw. auf Veränderungen davon untersucht.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind transgene nichthumane Tiere, die (i) das SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Gen konstitutiv oder induzierbar überexprimieren, (ii) das endogene SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Gen in inaktiver Form enthalten, (iii) das endogene SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Gen vollständig oder teilweise durch ein mutiertes SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Gen ersetzt enthalten, (iv) eine konditionale und gewebsspezifische Überexpression oder Unterexpression des SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Gens aufweisen oder (v) einen konditionalen und gewebsspezifischen Knockout des SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Gens aufweisen.
In einer ersten Ausführungsform kann das transgene Tier zusätzlich ein exogenes SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Gen unter Kontrolle eines die Überexression erlaubenden Promotors enthalten. Alternativ kann das endogene SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Gen durch Aktivierung oder/und Austausch des eigenen Promotors überexprimiert werden. Gegebenenfalls kann das eingeführte SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Gen zusätzliche Mutationen aufweisen.
Eine zweite Ausführungsform betrifft ein transgenes Tier, welches das endogene SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Gen in inaktivierter Form enthält. Die Inaktivierung des SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Gens erfolgt dabei vorzugsweise durch Einführung einer Knockout-Mutation mittels homologer Rekombination oder durch Einführung eines Antisense-Konstrukts oder eines RNAi-Konstrukts.
Eine dritte Ausführungsform betrifft ein transgenes Tier, bei dem das endogene SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Gen vollständig oder teilweise durch ein mutiertes SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Gen ersetzt ist.
Eine vierte Ausführungsform betrifft ein transgenes Tier, welches eine konditionale und gewebsspezifische Überexpression oder Unterexpression des SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Gens aufweist.
In einer fünften Ausführungsform weist das transgene Tier einen konditionalen und gewebsspezifischen Knockout des SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Gens auf.
Vorzugsweise ist das transgene Tier ein Säugetier, wie etwa ein Nager, z. B. eine Maus. Die Herstellung solch Gen-manipulierter Tiere ist dem Fachmann hinreichend bekannt und wird nach üblichen Verfahren durchgeführt (Hogan, B., Beddington, R., Costantini, F. und Lacy, E. (1994), Manipulating the mouse embryo: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines solchen transgenen Tiers zur genetischen und/oder pharmakologischen Untersuchung von Krankheiten, die mit übermäßiger oder verminderter bzw. fehlender SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Expression verbunden sind.
Die erfindungsgemäßen transgenen Tiere können als Modell für die mit dem SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Gen verbundenen Krankheiten beim Menschen oder auch bei Nutztieren dienen. So kann beispielsweise die Auswirkung von Wirkstoffen oder Gentherapien auf den Krankheitsverlauf bestimmt werden. Ebenfalls können diese Tiere zur Diagose bzw. dem frühzeitigen Erkennen einer Krankheit von Nutzen sein.
Alternativ oder zusätzlich können auch Zellkultursysteme für die Anwendungen eingesetzt werden, die für das transgene Tier beschrieben sind.
Die nachfolgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.
Fig. 1 zeigt die x-fache Induktion von Apoptose von HEK 293 Zellen durch SS-B (La) gegenüber einer Vektorkontrolle und dem Apoptose-Inducer Nedd-2. Bestimmt wurde die Induktion von Apoptose mittels CPRG-Assay. Als Parameter der Apoptoseinduktion wurde der Verlust der Membranintegrität im CPRG-Assay bestimmt. Der Darstellung liegen Mittelwerte aus mindestens zwei unabhängigen Experimenten zugrunde. (A) und (B) zeigen die Induktion der Apoptose 24 h bzw. 48 h nach Transfektion der HEK 293 Zellen mit der entsprechenden cDNA im CPRG-Assay. Die Apoptose durch SS-B (La) ist signifikant gegenüber der Vektor-Kontrolle erhöht, aber schwächer als durch den Apoptose-Inducer Nedd-2.
Fig. 2 zeigt mikroskopische Aufnahmen von transfizierten HEK 293 Zellen (Kontrollvektor pcDNA, SS-B (La)-cDNA, Bax-cDNA) mit 20facher Vergrößerung. Die Induktion von Apoptose durch SS-B (La) ist signifikant stärker als durch den Kontrollvektor, jedoch schwächer als durch den Apoptose Inducer Bax.
Fig. 3 zeigt die x-fache Induktion von Apoptose in HEK 293 Zellen durch SS-B (La) gegenüber einer Vektorkontrolle und dem Apoptose-Inducer Nedd-2. Bestimmt wurde die Induktion von Apoptose mittels CDD+-Assay. Als Parameter der Apoptoseinduktion wurde die DNA-Fragmentierung im CDD+- Assay bestimmt. Der Darstellung liegen Mittelwerte aus mindestens zwei unanbhängigen Experimenten zugrunde. Die Induktion von Apoptose (DNA-Fragmentierung) durch SS-B (La) ist signifikant gegenüber der Vektorkontrolle erhöht, aber schwächer als durch den Apoptose-Inducer Nedd-2.
Fig. 4 zeigt die x-fache Induktion von Apoptose durch SS-B (La) in den Zelllinien Ratl, Hela, DU145, MCF-7, SW480, HT22. Bestimmt wurde die Induktion von Apoptose durch SS-B (La) mittels CDD+-Assay. Als Parameter der Induktion von Apoptose wurde die DNA-Fragmentierung im CDD+-Assay bestimmt. Die Induktion von Apoptose durch SS-B (La) ist in allen Zelilinien signifikant gegenüber der Vektorkontrolle erhöht (nicht gezeigt). Am stärksten induziert SS-B (La) Apoptose in Hela, gefolgt von Du145, MCF-7 und HT22. In Ratl und SW480 wird die SS-B (La)-Apoptose nur schwach induziert.
Fig. 5 zeigt den Median der grünen (A) und roten (B) Fluoreszenz in den mit Kontrollvektor, SS-B (La)-cDNA und Bax-cDNA transfizierten Hela-Zellen. Bestimmt wurde die Induktion von Apoptose mittels DePsipher™-Assay, wobei der Verlust des Mitochondrienpotentials durchflusszytrometrisch bestimmt wurde. Die Induktion von Apoptose durch SS-B (La) ist signifikant gegenüber der Vektorkontrolle erhöht, aber schwächer als durch den Apoptose-Inducer Bax.
Fig. 6 zeigt den Prozentsatz der Hela-Zellen, transfiziert mit Kontrollvektor, SS-B (La)-cDNA und Nedd-2-cDNA, in denen aktivierte Caspase-3 in dem CaspaTag™-Assay nachgewiesen wurde. Die Induktion von Apoptose durch SS-B ist signifikant gegenüber der Vektorkontrolle erhöht und ist vergleichbar mit dem Apoptose-Inducer Nedd-2.
Fig. 7 zeigt die x-fache Induktion von Apoptose in Hela-Zellen durch SS-B (La) gegenüber der Vektorkontrolle und dem Apotose- Inducer Bax. Bestimmt wurde die Induktion von Apoptose mittels Caspase-3-Assay, wobei die Aktivierung der Caspase- 3 als Parameter der Apoptoseinduktion diente. Der Darstellung liegen Mittelwerte aus mindestens zwei unabhängigen Experimenten zugrunde. Die Induktion von Apoptose durch SS-B (La) ist signifikant gegenüber der Vektorkontrolle erhöht, aber schwächer als durch den Apoptose-Inducer Bax.
Beispiele Beispiel 1 Bestimmung der Induktion von Apoptose durch SS-B (La) im CPRG-Assay
Die Induktion von Apoptose wurde mittels CPRG-Assay bestimmt. Als Parameter der Apoptoseinduktion wurde der Verlust der Membranintegrität im CPRG-Assay bestimmt. Bei apoptotischen HEK 293 Zellen wird die Zellmembran für CPRG durchlässig und CPRG wird anschließend im Cytoplasma durch β-Galaktosidase umgesetzt. Als Produkt dieser enzymatischen Reaktion entsteht ein roter Farbstoff, der photometrisch bei 570 nm vermessen werden kann.
HEK 293 Zellen wurden mit jeweils 1,5 µg der folgenden cDNAs - Kontrollvektor pcDNA, SS-B (La)-cDNA und Nedd-2-cDNA - und 0,5 µg β- Galaktosidase Reporter-Plasmid co-transfiziert und die Apoptose 24 h (Fig. 1A) und 48 h (Fig. 1B) nach Transfektion im CPRG-Assay bestimmt. Hierzu wurden dem Kulturüberstand 30 µl einer 3 mM CPRG-Lösung zugegeben, die Zellen für 2 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert und anschließend die optische Dichte bei 570 nm gemessen. Als negative Kontrolle wurde der leere Vektor pcDNA verwendet, als positive Kontrolle diente die Apoptose-induzierende cDNA von Nedd-2.
Fig. 1 zeigt die x-fache Induktion von Apoptose durch SS-B (La) gegenüber der Vektorkontrolle und dem Apoptose-Inducer Nedd-2. Die Induktion von Apoptose durch SS-B (La) ist signifikant gegenüber der Vektorkontrolle erhöht, aber schwächer als durch den Apoptose-Inducer Nedd-2.
Beispiel 2 Phänotypische Bestimmung der Induktion von Apoptose durch SS-B (La) (Zellmorphologie)
Als Parameter der Induktion von Apoptose wurde die Morphologie der Zellen untersucht. Apoptotische HEK 293 zeigen eine stark veränderte Morphologie gegenüber nicht-apoptotischen Zellen.
HEK 293 Zellen wurden mit jeweils 1,5 µg der folgenden cDNAs - Kontrollvektor pcDNA, SS-B (La)-cDNA und Bax-cDNA - transfiziert und der morphologische Phänotyp der Zellen 24 h nach Transfektion mittels Mikroskopie bestimmt. Als negative Kontrolle wurde der leere Vektor pcDNA verwendet, als positive Kontrolle diente die Apoptose-induzierende cDNA von Bax.
Fig. 2 zeigt mikroskopische Aufnahmen von transfizierten HEK 293 Zellen mit 20facher Vergrößerung. Die Induktion von Apoptose durch SS-B (La) ist signifikant gegenüber der Vektorkontrolle verstärkt, aber schwächer als durch den Apoptose-Inducer Bax.
Beispiel 3 Bestimmung der Induktion von Apoptose durch SS-B (La) im CDD+-Assay
Die Induktion von Apoptose wurde mittels CDD+-Assay bestimmt. Als Parameter der Induktion von Apoptose wurde die DNA-Fragmentierung im CDD+-Assay bestimmt.
HEK 293 Zellen wurden mit jeweils 2,0 µg der folgenden cDNAs - Kontrollvektor pcDNA, SS-B (La)-cDNA, Nedd-2-cDNA - transfiziert und die DNA-Fragmentierung 24 h nach Transfektion mittels CDD+-Assay nach Angaben des Herstellers photometrisch bestimmt (Cell Death Detection ELISAPLUS, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland). Als negative Kontrolle wurde der leere DNA-Vektor verwendet, als positive Kontrolle diente die Apoptose-induzierende cDNA von Nedd-2.
Fig. 3 zeigt die x-fache Induktion von Apoptose durch SS-B (La) gegenüber der Vektorkontrolle und dem Apoptose-Inducer Nedd-2. Die Induktion von Apoptose (DNA-Fragmentierung) durch SS-B (La) ist signifikant gegenüber der Vektorkontrolle erhöht, aber schwächer als durch den Apoptose-Inducer Nedd-2.
Beispiel 4 Bestimmung der Induktion von Apoptose durch SS-B (La) in verschiedenen Zelllinien im CDD+-Assay
Die Induktion von Apoptose wurde mittels CDD+-Assay bestimmt. Als Parameter der Induktion von Apoptose wurde die DNA-Fragmentierung im CDD+-Assay bestimmt.
Die folgenden Zelllinien - Ratl, Hela, Du145, MCF-7, SW 480 und HT22 - wurden mit cDNA von SS-B (La) bzw. dem Kontrollvektor pcDNA transfiziert und die DNA-Fragmentierung 48 h nach Transfektion mittels CDD+-Assay nach Angaben des Herstellers photometrisch bestimmt (Cell Death Detection ELISAPLUS, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland). Als negative Kontrolle diente der leere Kontrollvektor pcDNA.
Fig. 4 zeigt die x-fache Induktion von Apoptose durch SS-B (La). Die Induktion von Apoptose durch SS-B (La) ist in allen Zelllinien signifikant gegenüber der Vektorkontrolle erhöht (nicht gezeigt). Am stärksten induziert SS-B (La) Apoptose in Hela, gefolgt von Du145, MCF-7 und HT22. In Ratl und SW480 wird die SS-B (La)-Apoptose nur schwach induziert.
Beispiel 5 Bestimmung der Induktion von Apoptose durch SS-B (La) im Depsipher™-Assay
Die Induktion von Apoptose wurde mittels DePsipher™-Assay bestimmt. Als Parameter der Induktion von Apoptose wurde der Verlust des Mitochondrienpotentials im DePsipher™-Assay durchflusszytrometrisch bestimmt. In apoptotischen Zellen ist das Mitochondrienmaterial zerstört und der Farbstoff liegt in den Zellen als Monomer vor. Die Monomere fluoreszieren grün (Fig. 5A). Bei intaktem Mitochondrienpotential liegt der Farbstoff in den Zellen als Multimer vor und fluoresziert rot (Fig. 5B).
Hela Zellen wurden mit jeweils 0,4 µg der folgenden cDNAs - Kontrollvektor pcDNA, SS-B (La)-cDNA und Bax-cDNA - transfiziert und die Apoptose wurde 48 h nach Transfektion mittels DePsipher™-Assay nach Angaben des Herstellers bestimmt (DePsipher™Kit, Trevigen Inc., Gaithersburg, MD, USA). Als negative Kontrolle wurde der leere Kontrollvektor pcDNA verwendet, als positive Kontrolle diente die Apoptose-induzierende cDNA von Bax.
In Fig. 5 ist jeweils der Median als dem Fachmann bekanntes relevantes statistisches Mittel der grünen (A) und roten (B) Fluoreszenz in den transfizierten Zellen dargestellt. Die Induktion von Apoptose durch SS-B (La) ist signifikant gegenüber der Vektorkontrolle erhöht, aber schwächer als durch den Apoptose-Inducer Bax.
Beispiel 6 Bestimmung der Induktion von Apoptose durch SS-B (La) im CaspaTag™-Assay
Die Induktion der Apoptose wurde mittels CaspaTag™-Assay bestimmt. Als Parameter der Induktion von Apoptose wurde die Aktivierung der Caspase- 3 im CaspaTag™-Assay bestimmt.
Hela-Zellen wurden mit jeweils 0,4 µg der folgenden cDNAs - Kontrollvektor pcDNA, SS-B (La)-cDNA und Nedd-2-cDNA - transfiziert und die Apoptose 20 h nach Transfektion quantitativ mittels FACS im CaspaTag™-Assay nach Angaben des Herstellers bestimmt (CaspaTag™Caspase-3 (DEVD) Activity Kit, Intergen Company, Purchase, NY, USA). Als negative Kontrolle wurde der leere Kontrollvektor pcDNA verwendet, als positive Kontrolle diente die Apoptose-induzierende cDNA von Nedd-2.
Fig. 6 zeigt den Prozentsatz der Zellen, in denen Caspase-3 aktiviert wurde. Die Induktion von Apoptose durch SS-B (La) ist signifikant gegenüber der Vektorkontrolle erhöht und ist vergleichbar mit dem Apoptose-Inducer Nedd-2.
Beispiel 7 Bestimmung der Induktion von Apoptose durch SS-B (La) im Caspase-3-Assay
Die Induktion von Apoptose wurde mittels Caspase-3-Assay bestimmt. Als Parameter der Induktion von Apoptose wurde die Aktivierung der Caspase- 3 bestimmt.
Hela-Zellen wurden mit jeweils 0,4 µg der folgenden cDNAs - Kontrollvektor pcDNA, SS-B (La)-cDNA und Bax-cDNA - transfiziert und die Apoptose 24 h nach Transfektion bestimmt. Zu diesem Zweck wurden die transfizierten Zellen lysiert und die Aktivität der Caspase-3 durch Umsetzung des Substrates Ac-DEVD-AMC im Lysat fluorometrisch gemessen. Die proteolytische Spaltung des Substrates durch Caspasen bewirkt eine Zunahme der Fluoreszenz, die bei 460 nm detektiert werden kann. Als negative Kontrolle wurde der leere Vektor pcDNA verwendet, als positive Kontrolle diente die Apoptose-induzierende cDNA von Bax.
Fig. 7 zeigt die x-fache Induktion von Apoptose durch SS-B (La) gegenüber der Vektorkontrolle und dem Apoptose-Inducer Bax. Die Induktion von Apoptose durch SS-B (La) ist signifikant gegenüber der Vektorkontrolle erhöht, aber schwächer als durch den beschriebenen Apoptose-Inducer Bax.

Claims (31)

1. Verwendung einer SS-A(Ro)- oder/und einer SS-B(La)-Nukleinsäure oder eines davon kodierten Polypeptids oder Peptids als Target zur Diagnose oder/und Beeinflussung apoptotischer Prozesse.
2. Verfahren zur Beeinflussung apoptotischer Prozesse in einer Zelle oder in einem Organismus, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle oder der Organismus mit einer wirksamen Menge einer Substanz behandelt wird, die geeignet ist, die Menge oder/und Aktivität, insbesondere die Apoptose-stimulierende Aktivität von SS- A (Ro) oder/und SS-B (La) zu verändern.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle oder der Organismus eine pathologische Störung aufweist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Beeinflussung auf Nukleinsäureebene erfolgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Beeinflussung auf Proteinebene erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Beeinflussung eine direkte Wechselwirkung mit SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) oder eine indirekte Wechselwirkung, vermittelt über einen Signaltransduktionsweg, umfasst.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Beeinflussung eine Hemmung apoptotischer Prozesse umfasst.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Beeinflussung eine Steigerung apoptotischer Prozesse umfasst.
9. Verfahren zur Identifizierung von Apoptose-beeinflussenden Substanzen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Testsubstanz auf die Fähigkeit untersucht wird, die Menge oder/und Aktivität, insbesondere die Apoptose-stimulierende Aktivität von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) zu verändern.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man Apoptose-inhibierende Substanzen identifiziert.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man Apoptose-stimulierende Substanzen identifiziert.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es in Form eines Hochdurchsatz-Assays durchgeführt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es in Form eines zellulären Assays durchgeführt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es in Form eines molekularen Assays durchgeführt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es die Bereitstellung der identifizierten Substanz oder einer davon abgeleiteten Substanz als pharmazeutische Zusammensetzung umfasst.
16. Apoptose-beeinflussende Substanz, identifiziert durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15, oder eine davon abgeleitete Substanz.
17. Verfahren zur Induzierung apoptotischer Prozesse in einer Zelle oder in einem Organismus, umfassend:
  • a) Behandeln der Zelle oder des Organismus mit SS-B (La)- Protein, SS-A (Ro)- oder/und SS-B (La)-Nukleinsäuren und Fragmenten oder Derivaten davon, oder
  • b) Behandeln der Zelle mit einer wirksamen Menge einer Substanz, die geeignet ist, die Menge oder/und Aktivität von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) zu erhöhen.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle oder der Organismus eine pathologische Störung aufweist.
19. Verfahren zur Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, die mit Apoptose assoziiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass einem Patienten eine pharmazeutisch wirksame Menge einer Substanz verabreicht wird, die die Aktivität, insbesondere die Apoptose-stimulierende Aktivität von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) beeinflusst.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit eine degenerative, autoimmune oder hyperproliferative Erkrankung ist.
21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit Sjögren-Syndrom (primär und sekundär), Alzheimer, Krebs, Cardiomyopathie, Schlaganfall, Multiple Sklerose oder Rheumatoide Arthritis ist.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff eine Substanz, die die Aktivität, insbesondere die Apoptose-stimulierende Aktivität von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) beeinflusst, und zusätzlich gegebenenfalls weitere pharmazeutisch verträgliche Träger, Verdünnungsmittel und Zusatzstoffe enthält.
23. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22 für die Prävention oder/und Behandlung von Krankheiten, die mit übermäßiger oder verminderter und/oder fehlenderApoptose verbunden sind.
24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit eine degenerative, autoimmune oder hyperproliferative Erkrankung ist.
25. Verfahren zur Diagnose von apoptotischen Prozessen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe, z. B. eine Gewebeprobe und/oder Körperflüssigkeiten von einem Patienten auf Vorhandensein, Menge oder/und Aktivität von SS-A (Ro) oder/und SS-B (La) untersucht wird.
26. Transgenes nichthumanes Tier,
  • a) welches das SS-A (Ro)-Gen oder/und das SS-B (La)-Gen konstitutiv oder induzierbar überexprimiert,
  • b) welches das endogene SS-A (Ro)-Gen oder/und SS-B (La)-Gen in inaktivierter Form enthält,
  • c) bei dem das endogene SS-A (Ro)-Gen oder/und SS-B (La)-Gen vollständig oder teilweise durch ein mutiertes SS-A (Ro)-Gen oder/und SS-B (La)-Gen ersetzt ist,
  • d) welches eine konditionale und gewebsspezifische Über- oder Unterexpression des SS-A (Ro)-Gen oder/und SS-B (La)-Gens aufweist oder
  • e) welches einen konditionalen und gewebsspezifischen Knockout des SS-A (Ro)-Gen oder/und SS-B (La)-Gens aufweist.
27. Transgenes Tier nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Nager, insbesondere eine Maus ist.
28. Verwendung eines transgenen Tiers nach einem der Ansprüche 26 bis 27 zur genetischen und/oder pharmakologischen Untersuchung von apoptotischen Prozessen, insbesondere von Krankheiten, die mit erhöhter oder verminderter Apoptose assoziiert sind.
29. Zellkultur
  • a) welche das SS-A (Ro)-Gen oder/und das SS-B (La)-Gen konstitutiv oder induzierbar überexprimiert,
  • b) welche das endogene SS-A (Ro)-Gen oder/und SS-B (La)-Gen in inaktivierter Form enthält,
  • c) bei der das endogene SS-A (Ro)-Gen oder/und SS-B (La)-Gen vollständig oder teilweise durch ein mutiertes SS-A (Ro)-Gen oder/und SS-B (La)-Gen ersetzt ist,
  • d) welche eine konditionale und gewebsspezifische Über- oder Unterexpression des SS-A (Ro)-Gens oder/und SS-B (La)-Gens aufweist oder
  • e) welche einen konditionalen und gewebsspezifischen Knockout des SS-A (Ro)-Gens oder/und SS-B (La)-Gens aufweist.
30. Zellkultur nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus humanen Zellen besteht.
31. Verwendung einer transgenen Zellkultur nach einem der Ansprüche 29 bis 30 zur genetischen und/oder pharmakologischen Untersuchung von apoptotischen Prozessen, insbesondere von Krankheiten, die mit erhöhter oder verminderter Apoptose assoziiert sind.
DE10125033A 2001-05-22 2001-05-22 SS-A (Ro) und SS-B (La) als Targets zur Beeinflussung der Apoptose Withdrawn DE10125033A1 (de)

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