DE69535060T2

DE69535060T2 - Dimere des kleeblatt-proteins

Info

Publication number: DE69535060T2
Application number: DE69535060T
Authority: DE
Inventors: Lars Thim; Helle Fabricius Wöldike; Per Franklin Nielsen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1994-08-26
Filing date: 1995-08-25
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2015-08-26
Also published as: ES2267104T3; NO323642B1; HU226921B1; CZ54897A3; FI970783A; CN1156459A; FI119989B; WO1996006861A1; PL318785A1; HUT77917A; BR9508773A; MX9701239A; DK0777687T3; DE69535060D1; JPH10504720A; UA68324C2; AU3341595A; EP1739091A1; RU2162857C2; JP2007161720A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Dimere des Kleeblatt-Peptids, ein Verfahren zur Herstellung von Dimeren der Kleeblatt-Peptide, Dimere des Kleeblatt-Peptids umfassende Arzneimittel und deren Verwendung bei der Behandlung von Magen-Darm-Störungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Kleeblatt-Peptide bilden eine Peptidfamilie, die hauptsächlich in Verbindung mit dem Magen-Darm-Trakt zu finden ist. Kleeblatt-Peptide des Säugers enthalten eine oder mehrere charakteristische Kleeblatt-Domänen (Thim et al., 1989), wobei jede davon aus einer Sequenz von 38 oder 39 Aminosäureresten besteht, in welchen 6 Halb-Cystein-Reste in der Konfiguration 1-5, 2-4 und 3-6 verknüpft sind, wodurch eine charakteristische Kleeblatt-Struktur gebildet wird (Thim, 1989).
Die gegenwärtig bekannten Kleeblatt-Peptide des Säugers enthalten entweder eine oder zwei Kleeblatt-Domänen (für einen Überblick siehe Thim, 1994; Poulsom & Wright, 1993; Hoffmann & Hauser, 1993), wohingegen Peptide und Proteins des Froschs, Xenopus laevis, die eine (Hauser & Hoffmann, 1991), zwei (Hauser et al., 1992a), vier (Hoffmann, 1988) oder sechs (Hauser & Hoffmann, 1992b) Kleeblatt-Domänen enthalten, beschrieben wurden. Bei den eine Domäne enthaltenden Kleeblatt-Peptiden des Säugers handelt es sich um das mit Brustkrebs verbundene pS2-Peptid, das bisher vom Menschen (Jakowlev et al., 1984, Prud'homme et al., 1985) und von der Maus (Lefebvre et al., 1993) her bekannt ist, und der Magen-Darm-Kleeblatt-Faktor (intestinal trefoil factor, ITF), der bisher vom Menschen (Podolsky et al., 1993; Hauser et al., 1993) und von der Ratte (Suemori et al., 1991; Chinery et al., 1992) her bekannt ist. Spasmolytisches Polypeptid (SP), das zwei Kleeblatt-Domänen enthält, wurde vom Menschen (Tomasetto et al., 1990), vom Schwein (Thim et al., 1982) und von der Maus (Tomasetto et al., 1990) beschrieben. Beim Menschen werden alle sämtliche der drei Kleeblatt-Peptide hpS2, hITF und hSP unter normalen Bedingungen im Magen-Darm-Trakt exprimiert: hSP und hpS2 in der epithelialen Schleimhautschicht des Magens (Tomasetto et al., 1990; Rio et al., 1988) und HITF in der epithelialen Schleimhautschicht des Dünndarms und Dickdarms (Podolsky et al., 1993). Die Reinigung und Charakterisierung von rekombinant in Hefe hergestelltem hSP wurde ebenfalls beschrieben (Thim et al., 1993, FEBS Lett. 318(3), S. 345-352).
Die physiologische Funktion der Kleeblatt-Peptide ist nicht sehr gut verstanden. Eine erhöhte Expression von Kleeblatt-Peptiden im Magen-Darm-Trakt wurde in verschiedenen Zuständen, an welchen eine Schleimhautverletzung beteiligt ist, wie bei entzündlicher Darmerkrankung (Rio et al., 1991; Poulsom et al., 1992; Wright et al., 1993) und bei einer Geschwürbildung im Magen und Zwölffingerdarm (Rio et al., 1991; Hanby et al., 1993; Wright et al., 1990) berichtet. Demzufolge wurde eine Schleimhautreparaturfunktion der Kleeblatt-Peptide nahe gelegt (z.B. Wright et al., 1993). Ein Beweis dafür, dass Kleeblatt-Peptide die epitheliale Schleimhautwiederherstellung nach einer Verletzung fördern, wurde von Dignass et al., 1994, Playford et al., 1994, und Babyatsky et al., 1994, bereitgestellt. Der Mechanismus, durch welchen Kleeblatt-Peptide ihre Reparaturfunktion vorantreiben, kann eine Vernetzung von Mucin-Glycoproteinen unter Bildung einer viskoelastischen Gelschicht, die gegen Verdauungsenzyme resistent ist, beinhalten (Thim, 1994; Gajhede et al., 1993).
Das Klonieren eines Darm-Kleeblatt-Faktors der Ratte und des Menschen Mensch mit einer einzelnen Domäne und die Verwendung des Darm-Kleeblatt-Faktors bei der Behandlung einer Magen-Darm-Verletzung sind in WO 92/14837 beschrieben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wurde nun gefunden, dass es möglich ist, Dimere der Kleeblatt-Faktoren herzustellen, die nur eine Kleeblatt-Domäne und interessante pharmakologische Eigenschaften aufweisen.
Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung ein Kleeblatt-Peptid, das eine einzelne Kleeblatt-Domäne enthält, wobei das Peptid dadurch gekennzeichnet ist, dass es in dimerer Form vorliegt.
Wie vorstehend angegeben, wird angenommen, dass Kleeblatt-Peptide zum Heilen von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren und anderen Schleimhautbeschädigungen durch Stabilisieren der Schleimhautschicht des Darmtrakts beitragen. Der Mechanismus dieser Stabilisation ist gegenwärtig unbekannt. Jedoch zeigt die Röntgenstruktur von spasmolytischem Schweine-Bauchspeicheldrüsen-Polypeptid (PSP) (vgl. Gajhede et al., 1993), das zwei Kleeblatt-Domänen aufweist, dass die Mehrzahl an bewahrten Resten zu einer Spalte mit einer Breite von 8-10 Å beiträgt, die in jeder der Kleeblatt-Domänen zu finden ist. Erste Kupplungsversuche zeigten, dass die Spalte einen Teil einer Oligosaccharidkette, z.B. das an einem Mucinglycoprotein angelagert Kohlenhydrat, aufnehmen könnte. Ist dies der Fall, kann PSP mit zwei derartigen Spalten Muzine vernetzen, was sie dabei unterstützt, ein schützendes Gel über dem Schleimhautepithelium zu bilden. Es ist gegenwärtig nicht bekannt, ob Kleeblatt-Peptide mit einer einzelnen Kleeblatt-Domäne (wie ITF und pS2) in vivo Dimere bilden, um eine ähnliche Funktion auszuüben, oder ob sie einen unterschiedlichen Wirkungsmechanismus aufweisen. Jedoch wird gegenwärtig angenommen, dass Dimere derartiger Kleeblatt-Peptide tatsächliche Muzine vernetzen können und deshalb die aktive Form der Peptide darstellen könnten.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Dimers eines Kleeblatt-Peptids, das eine einzelne Kleeblatt- Domäne enthält, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Züchten einer geeigneten Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die ein eine Kleeblatt-Domäne enthaltendes Kleeblatt-Peptid kodiert unter die Herstellung des Peptids gewährenden Bedingungen; Abtrennen des erhaltenen Monomers des Kleeblatt-Peptids und Dimers des Kleeblatt-Peptids von der Kultur durch ein chromatographisches Verfahren; und Gewinnen des erhaltenen Dimers des Kleeblatt-Peptids aus der Kultur.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Arzneimittel, das ein Dimer eines eine einzelne Kleeblatt-Domäne enthaltenden Kleeblatt-Peptids umfasst, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel oder Vehikulum.
In noch weiteren Aspekten betrifft die Erfindung ein Dimer eineseine Kleeblatt-Domäne enthaltenden Kleeblatt-Peptids zur Verwendung als Medikament, und die Verwendung eines Dimers eines eine Kleeblatt-Domäne enthaltenden Kleeblatt-Peptids zur Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe oder Behandlung von Magen-Darm-Störungen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das Dimer des Kleeblatt-Peptids kann insbesondere ein Dimer vom Darm-Kleeblatt-Faktor (ITF) oder vom mit Brustkrebs verbundenem Peptid (pS2) sein.
Insbesondere ist das Kleeblatt-Peptid Human-ITF, wobei die monomere Aminosäuresequenz davon lautet:
ZEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKPLQEAECTF
wobei Z Glu, Gln oder pyrGlu ist,
oder
Human-pS22, wobei die monomere Aminosäuresequenz davon lautet:
ZAQTETCTVAPRERQNCGFPGVTPSQCANKGCCFDDTVRGVPWCFYPNTIDVPPEEECEF
wobei Z Glu, Gln oder pyrGlu ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Dimer des Kleeblatt-Peptids der Erfindung ein ungefähres Molekulargewicht von 13000 auf. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein ITF-Dimer der Erfindung aus zwei ITF-Monomeren zusammengesetzt, die durch eine Disulfidbindung zwischen zwei Cysteinresten in Position 57 jedes Monomers verknüpft sind. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist ein pS2-Dimer der Erfindung aus zwei pS2-Monomeren zusammengesetzt, die durch eine Disulfidbindung zwischen zwei Cysteinresten in Position 58 jedes Monomers verknüpft sind.
Das Dimer des Kleeblatt-Peptids wird vorzugsweise durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt. Zu diesem Zweck kann eine das Kleeblatt-Peptid kodierende DNA-Sequenz durch Herstellen einer genomischen oder cDNA-Bibliothek und Durchmustern auf DNA-Sequenzen, die das gesamte oder einen Teil des Peptid/s kodieren, durch Hybridisierung unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotidsonden gemäß Standardtechniken (vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) isoliert werden. Für den vorliegenden Zweck ist die das Peptid kodierende DNA-Sequenz vorzugsweise menschlichen Ursprungs, d.h. von einer menschlichen genomischen DNA- oder cDNA-Bibliothek abgeleitet.
Die das Kleeblatt-Peptid kodierende DNA-Sequenz kann auch synthetisch durch etablierte Standardverfahren, z.B. das Phosphoamidit-Verfahren, beschrieben von Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869, oder das Verfahren beschrieben von Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801-805, hergestellt werden. Gemäß dem Phosphoamidit-Verfahren werden Oligonukleotide, z.B. in einer automatischen DNA-Syntheseapparatur, synthetisiert, gereinigt, ausgeglüht, ligiert und in geeignete Vektoren kloniert.
Die DNA-Sequenz kann auch durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von spezifischen Primern, z.B. wie beschrieben in US 4,683,202 , Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491, oder Sambrook et al., vorstehend, hergestellt werden.
Die das Kleeblatt-Peptid kodierende DNA-Sequenz wird gewöhnlich in einen rekombinanten Vektor eingefügt, der ein beliebiger Vektor sein kann, der günstigerweise rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen werden kann, und die Wahl des Vektors hängt häufig von der Wirtszelle ab, in welche er einzubringen ist. Folglich kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor, d.h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit vorliegt, wobei deren Replikation von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, z.B. ein Plasmid, sein. Alternativ dazu kann der Vektor einer sein, der nach dem Einbringen in eine Wirtszelle in das Wirtszellengenom integriert und zusammen mit dem (den) Chromosom(en), in welche(s) er integriert wurde, repliziert.
Der Vektor ist vorzugsweise ein Expressionsvektor, in welchem die das Kleeblatt-Peptid kodierende DNA-Sequenz funktionsfähig mit zusätzlichen Segmenten, die zur Transkription der DNA erforderlich sind, verknüpft ist. Im Allgemeinen ist der Expressionsvektor von Plasmid- oder viraler DNA abgeleitet oder kann Elemente von beiden enthalten. Der Begriff „funktionsfähig verknüpft" weist darauf hin, dass die Segmente derart angeordnet werden können, dass sie für ihre beabsichtigten Aufgaben zusammen wirken, z.B. beginnt eine Transkription in einem Promotor und verläuft durch die für das Polypeptid kodierende DNA-Sequenz.
Der Promotor kann eine beliebige in der Wirtszelle der Wahl Transkriptionsaktivität zeigende DNA-Sequenz und von Proteine entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle kodierenden Genen abgeleitet sein.
Beispiele für geeignete Promotoren zum Leiten der Transkription der das Kleeblatt-Peptid kodierenden DNA in Säugerzellen sind der SV40-Promotor (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864), der MT-1(Metallothionein-Gen-)-Promotor (Palmiter et al., Science 222 (1983), 809-814) oder der späte Adenovirus-2-Hauptpromotor.
Ein Beispiel für einen geeigneten Promotor zur Verwendung in Insektenzellen ist der Polyhedrin-Promotor ( US 4,745,051 ; Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992 7-11), der P10-Promotor (J.M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, S. 765-778), der Polyhedrose-Virus-Basisproteinpromotor von Autographa californica ( EP 397 485 ), der zwischenfrühe Gen-1-Promotor von Baculovirus ( US 5,155,037 ; US 5,162,222 ) oder der verzögerte frühe Gen-Promotor von Baculovirus 39K ( US 5,155,037 ; US 5,162,222 ).
Beispiele für geeignete Promotoren zur Verwendung in Hefewirtszellen schließen Promotoren von glycolytischen Hefegenen (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber und Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434) oder Promotoren von Alkoholdehydrogenasegenen (Young, et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al., Hrsg.), Plenum Press, New York, 1982) oder die TPI1- ( US 4,599,311 ) oder ADH2-4c- (Russell et al., Nature 304 (1983), 652-654) ein.
Beispiel für geeignete Promotoren zur Verwendung in Fadenpilzwirtszellen sind, z.B., der ADH3-Promotor (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099) oder der tpiA-Promotor. Beispiele für andere nützliche Promotoren sind diejenigen, die von dem Gen, kodierend TAKA-Amylase von A. oryzae, Aspartanproteinase von Rhizomucor miehei, neutrale α-Amylase von A. niger, säurestabile α- Amylase von A. niger, Glucoamylase (gluA) von A. niger oder A. awamori, Lipase von Rhizomucor miehei, alkalische Protease von A. oryzae, Triosephosphatisomerase von A. oryzae oder Acetamidase von A. nidulans, abgeleitet sind. Bevorzugt sind die TAKA-Amylase- und gluA-Promotoren. Geeignete Promotoren sind z.B. in EP 238 023 und EP 383 779 erwähnt.
Die das Kleeblatt-Peptid kodierende DNA-Sequenz kann auch gegebenenfalls funktionsfähig an einen geeigneten Terminator, wie den Humanwachstumshormonterminator (Palmiter et al., Science 222, 1983, S. 809-814) oder (für Pilzwirte) die Terminatoren von TPI1 (Alber und Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, S. 419-434) oder ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4, 1985, S. 2093-2099) gebunden sein. Der Vektor kann des Weiteren Elemente, wie Polyadenylierungssignale (z.B. von SV40 oder der Adenovirus-5-Elb-Region), Transkriptionsverstärkersequenzen (z.B. den SV40-Verstärker) und Translationsverstärkersequenzen (z.B. diejenigen, die Adenovirus VA-RNAs kodieren) umfassen.
Der rekombinante Vektor kann des Weiteren eine DNA-Sequenz umfassen, die es dem Vektor ermöglicht, in der fraglichen Wirtszelle zu replizieren. Ein Beispiel für eine derartige Sequenz (falls die Wirtszelle eine Säugerzelle ist) ist der SV40-Replikationsursprung.
Ist die Wirtszelle eine Hefezelle, sind geeignete Sequenzen, die dem Vektor die Replikation ermöglichen, die Hefeplasmid-2μ-Replikationsgene REP 1-3 und der Replikationsursprung.
Der Vektor kann auch eine selektierbare Markierung, z.B. ein Gen, dessen Produkt einen Fehler in der Wirtszelle ausgleicht, wie das Gen, das für Dihydrofolatreduktase (DHFR) kodiert, oder das TPI-Gen von Sschizosaccharomyces pombe (beschrieben von P.R. Russell, Gene 40, 1985, S. 125-130), oder eines, das gegen ein Arzneimittel, z.B. Ampicillin, Kanamycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Neomycin, Hygromycin oder Methotrexat, Resistenz verleiht, sein. Für Fa denpilze schließen selektierbare Markierungen amdS, pyrG, argB, niaD oder sC ein.
Zum Leiten eines Kleeblatt-Peptids der vorliegenden Erfindung in den Sekretionsweg der Wirtszellen kann eine Sekretionssignalsequenz (auch bekannt als Leader-Sequenz, Präpo-Sequenz oder Präsequenz) im rekombinanten Vektor bereitgestellt werden. Die Sekretionssignalsequenz ist in korrektem Ableseraster mit der das Kleeblatt-Peptid kodierenden DNA-Sequenz verbunden. Sekretionssignalsequenzen befinden sich gewöhnlich in 5'-Position an der das Peptid kodierenden DNA-Sequenz. Die Sekretionssignalsequenz kann diejenige sein, die normalerweise mit dem Peptid verbunden ist, oder kann von einem Gen abstammen, das ein anderes sekretiertes Protein kodiert.
Zur Sekretion aus Hefezellen kann die Sekretionssignalsequenz ein beliebiges Signalpeptid kodieren, was eine effiziente Leitung des exprimierten Kleeblatt-Peptids in den Sekretionsweg der Zelle gewährleistet. Das Signalpeptid kann ein natürlich vorkommendes Signalpeptid oder ein funktioneller Teil davon oder ein synthetisches Peptid sein. Es wurde gefunden, dass geeignete Signalpeptide das α-Faktor-Signalpeptid (vgl. US 4,870,008 ), das Signalpeptid der Mäusespeichelamylase (vgl. O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, S. 643-646), ein modifiziertes Carboxypeptidase-Signalpeptid (vgl. L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, S. 887-897), das Hefe-BAR1-Signalpeptid (vgl. WO 87/02670) oder das Hefeaspartamprotease-3-(YAP3)-Signalpeptid (vgl. M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, S. 127-137) ist.
Für eine effiziente Sekretion in Hefe kann eine ein Leader-Peptid kodierende Sequenz auch stromabwärts der Signalsequenz und stromaufwärts der das Kleeblatt-Peptid kodierenden DNA-Sequenz eingefügt werden. Die Funktion des Leader-Peptids ist es, dass es dem exprimierten Peptid erlaubt wird, von dem endoplasmatischen Retikulum zu der Golgi-Apparatur und weiter zu einem sekretorischen Vesikulum zur Sekretion in das Kulturmedium (d.h. der Export des Kleeblatt- Peptids über die Zellwand oder zumindest durch die Zellmembran in den periplasmatischen Raum der Wirtszelle) geleitet zu werden. Das Leader-Peptid kann der Hefe-α-Faktor-Leader sein (dessen Verwendung z.B. in US 4,546,082 , US 4,870,008 , EP 16201 , EP 123 294 , EP 123 544 und EP 163 529 beschrieben ist). Alternativ dazu kann das Leader-Peptid ein synthetisches Leader-Peptid sein, das als Leader-Peptid gilt, das nicht in der Natur zu finden ist. Synthetische Leader-Peptide können z.B. wie in WO 89/02463 oder WO 92/11378 beschrieben konstruiert werden.
Zur Verwendung in Fadenpilzen kann das Signalpeptid günstigerweise von einem Gen, das eine Amylase oder Glucoamylase von Aspergillus sp. kodiert, einem Gen, das eine Lipase oder Protease von Rhizomucor miehei oder eine Lipase von Humicola lanuginosa kodiert, abgeleitet sein. Das Signalpeptid ist vorzugsweise von einem Gen abgeleitet, das eine TAKA-Amylase von A. oryzae, eine neutrale α-Amylase von A. niger, eine säurestabile Amylase von A. niger oder eine Glucoamylase von A. niger kodiert. Geeignete Signalpeptide sind z.B. in EP 238 023 und EP 215 594 offenbart.
Zur Verwendung in Insektenzellen kann das Signalpeptid günstigerweise von einem Insektengen (vgl. WO 90/05783), wie dem lepidopteranen adipokinetischen Hormonvorläufersignalpeptid von Manduca sexta (vgl. US 5,023,328 ), abgeleitet sein.
Die Verfahren, die zum Ligieren der das Kleeblatt-Peptid kodierenden DNA-Sequenzen, des Promotors bzw. optional der Terminator- und/oder sekretorischen Signalsequenz und zu deren Einfügen in geeignete die zur Replikation nötige Information enthaltenden Vektoren verwendet werden, sind dem Fachmann bekannt (vgl. z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Die Wirtszelle, in welche die das Kleeblatt-Peptid kodierende DNA-Sequenz eingebracht wird, kann eine beliebige Zelle sein, die das Peptid in dimerer Form herstellen kann, und schließt Hefe-, Pilz- und höhere eukaryontische Zellen ein.
Beispiele für geeignete Säugerzelllinien sind die Zelllinien COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL (ATCC CCL39) oder CHO (ATCC CCL61). Verfahren zum Transfizieren von Säugerzellen und Exprimieren von in die Zellen eingebrachten DNA-Sequenzen sind z.B. in Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621; Southern und Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham und van der Eb, Virology 52 (1973), 456; und Neumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841-845, beschrieben.
Beispiele für geeignete Hefezellen schließen Zellen von Saccharomyces spp. oder Schizosaccharomyces spp., insbesondere Stämmen von Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces kluyveri, ein. Verfahren zum Transformieren von Hefezellen mit heterologer DNA und Herstellen von heterologen Polypeptiden daraus sind z.B. in US 4,599,322 , US 4,931,373 , US 4,870,008 , US 5,037,743 und US 4,845,075 beschrieben.
Transformierte Zellen werden durch einen Phänotyp ausgewählt, der durch eine selektierbare Markierung, üblicherweise durch Arzneimittelresistenz oder die Fähigkeit, in Abwesenheit eines bestimmten Nährstoffs, z.B. von Leucin, zu wachsen, bestimmt wird. Ein bevorzugter Vektor zur Verwendung in Hefe ist der in US 4,931,373 offenbarte POT1-Vektor. Der das Kleeblatt-Peptid kodierenden DNA-Sequenz kann eine Signalsequenz und wahlweise eine wie z.B. vorstehend beschriebene Leadersequenz vorangehen. Weitere Beispiele für geeignete Hefezellen sind Stämme von Kluyveromyces, wie K lactis, Hansenula, z.B. H. polymorpha, oder Pichia, z.B. P. pastoris (vgl. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, S. 3459-3465; US 4,882,279 ).
Beispiele für andere Pilzzellen sind Zellen von Fadenpilzen, z.B. Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. oder Trichoderma spp. insbesondere Stämmen von A. oryzae, A. nidulans oder A. niger. Die Verwendung von Aspergillus spp. zur Expression von Proteinen ist z.B. in EP 272 277 , EP 238 023 , EP 184 438 beschrieben. Die Transformation von F. oxysporum kann z.B. wie beschrieben von Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, durchgeführt werden. Die Transformation von Trichoderma spp. kann z.B. wie in EP 244 234 beschrieben durchgeführt werden.
Wird ein Fadenpilz als Wirtszelle verwendet, kann er mit dem DNA-Konstrukt der Erfindung, günstigerweise durch Integrieren des DNA-Konstrukts in das Wirtschromosom zum Erhalt einer rekombinanten Wirtszelle transformiert werden. Diese Integration wird im Allgemeinen als Vorteil betrachtet, da die DNA-Sequenz in der Wirtszelle wahrscheinlicher stabil gehalten wird. Die Integration der DNA-Konstrukte in das Wirtschromosom kann gemäß herkömmlichen Verfahren, z.B. durch homologe oder heterologe Rekombination, durchgeführt werden.
Die Transformation von Insektenzellen und Herstellung von heterologen Polypeptiden darin kann wie beschrieben in US 4,745,051 ; US 4,879,236 ; US 5,155,037 ; US 5,162,222 ; EP 397,485 durchgeführt werden. Die Insektenzelllinie, die als Wirt verwendet wird, kann geeigneterweise eine Lepidoptera-Zelllinie, wie Zellen von Spodoptera frugiperda oder Zellen von Trichoplusia ni (vgl. US 5,077,214 ), sein. Die Züchtungsbedingungen können geeigneterweise wie z.B. in WO 89/01029 oder WO 89/01028 oder einer beliebigen der vorstehend erwähnten Bezugnahmen beschrieben, sein.
Die vorstehend beschriebene transformierte oder transfizierte Wirtszelle wird dann in einem geeigneten Nährmedium unter Bedingungen, die die Expression des Kleeblatt-Peptids erlauben, gezüchtet, wonach das gesamte oder ein Teil des erhaltenen Peptids aus der Kultur in dimerer Form gewonnen werden kann. Das zum Züchten der Zellen verwendete Medium kann jedes beliebige herkömmliche Medium, das zum Wachsen der Wirtszellen geeignet ist, wie Minimal- oder Komplexmedien, die geeignete Ergänzungsstoffe enthalten, sein. Geeignete Medien sind von Händlern erhältlich oder können gemäß veröffentlichten Rezepturen (z.B. in Katalogen der American Type Culture Collection) hergestellt werden. Das durch die Zellen hergestellte Kleeblatt-Peptid kann dann durch herkömmliche Verfahren, einschließlich Abtrennen der Wirtszellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Ausfällen der proteinhaltigen Bestandteile des Überstands oder Filtrats durch ein Salz, z.B. Ammoniumsulfat, Reinigung durch eine Vielfalt an chromatographischen Verfahren, z.B. Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen, je nach fraglichem Polypeptidtyp, gewonnen werden. In einem Verfahren der Erfindung zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Dimers des Kleeblatt-Peptids werden das Monomer des Kleeblatt-Peptids und das Dimer des Kleeblatt-Peptids von der Kultur durch chromatographische Verfahren abgetrennt, wonach das Dimer gewonnen wird.
Im Arzneimittel der Erfindung kann das Dimer des Kleeblatt-Peptids durch jedes beliebige der etablierten Verfahren der Formulierung von Arzneimitteln, z.B. wie beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985, formuliert werden. Die Zusammensetzung kann in einer Form vorliegen, die zur systemischen Injektion oder Infusion geeignet ist und kann als solche mit sterilem Wasser oder einer isotonischen Kochsalzlösung oder Glucoselösung formuliert werden. Die Zusammensetzungen können durch herkömmliche Sterilisationstechniken sterilisiert werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Die erhaltenen wässrigen Lösungen können zur Verwendung verpackt oder unter aseptischen Bedingungen filtriert und lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat mit der sterilen wässrigen Lösung vor der Verabreichung kombiniert wird. Die Zusammensetzung kann pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe, wie für angenäherte physiologische Bedingungen erforderlich, wie Puffermittel, tonizitätseinstellende Mittel und der gleichen, z.B. Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid usw., enthalten.
Das Arzneimittel der vorliegenden Erfindung kann für eine nasale, transdermale oder rektale Verabreichung angepasst werden. Das pharmazeutisch verträgliche Vehikulum oder Verdünnungsmittel, das in der Zusammensetzung eingesetzt wird, kann ein beliebiger herkömmlicher fester Träger sein. Beispiele für feste Träger sind Laktose, Terraalba, Saccharose, Talkum, Gelatine, Agar, Pektin, Akaziengummi, Magnesiumstearat und Stearinsäure. Gleichermaßen kann das Vehikulum oder das Verdünnungsmittel jedes beliebige auf dem Fachgebiet bekannte Material mit Dauerfreisetzung wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat, allein oder gemischt mit einem Wachs, einschließen. Die Menge eines festen Trägers variiert breit, beträgt jedoch gewöhnlich etwa 25 mg bis etwa 1 g.
Die Konzentration des Dimers des Kleeblatt-Peptids in der Zusammensetzung kann breit, d.h. von etwa 5 bis etwa 100 Gew.-%, variieren. Eine bevorzugte Konzentration liegt im Bereich von 50-100 Gew.-%. Eine Dosierungseinheit der Zusammensetzung kann typischerweise etwa 1 bis etwa 200 mg, vorzugsweise etwa 25 bis etwa 75 mg, insbesondere etwa 50 mg des Dimers enthalten.
Wie vorstehend angegeben, wird angenommen, dass das Dimer des Kleeblatt-Peptids die aktive Form des Peptids ist. Als solche wird sie zur Verwendung zur Vorbeugung oder Behandlung von Magen-Darm-Störungen als vorteilhaft erwogen. Insbesondere wird sie zur Verwendung bei der Behandlung von Magen- oder Zwölffingerdarmgeschwüren, entzündlicher Darmerkrankung, Crohn-Krankheit oder durch Strahlentherapie, bakterielle oder andere Infektionen verursachte Verletzung des Darmtrakts erwogen. Die Dosierung des an einen Patienten verabreichten Polypeptids variiert mit dem Typ und der Schwere des zu behandelnden Zustands, liegt jedoch im Allgemeinen im Bereich von 0,1-1,0 mg/kg Körpergewicht.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines Dimers des Kleeblatt-Peptids der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe oder Behandlung von Magen-Darm-Störungen, wie einer der letzteren erwähnten Störungen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird in weiteren Details beispielhaft mit Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, bei welchen es sich um Folgendes handelt:
1 Vorgeschlagene Struktur von menschlichem Darm-Kleeblatt-Faktor ITF. Die primäre Aminosäuresequenz ist von Hauser et al., 1993, entnommen, und die Disulfidbindungen sind homolog zu PSP und pS2 (Thim, 1988) angeordnet.
2 Umkehrphasen-HPLC auf einer Säule des Typs Vydac 214TP54 des Überstands vom Ratten-ITF exprimiereneden Hefestamm HW756.
3 Ionenaustauschchromatographie auf einer Fast-Flow-SP-Sepharose-Säule von teilweise gereinigtem Human-ITF. Die Mengen von hITF (Monomer) und hITF (Dimer) wurden durch analytische HPLC bestimmt. Die Balken geben die Fraktionen an, die zur weiteren Reinigung der monomeren und dimeren Formen gepoolt wurden. Die gestrichelte Linie zeigt die NaCl-Konzentration im eluierenden Lösungsmittel.
4 Umkehrphasen-HPLC auf einer C4-Säule des Typs Vydac 214TP54 von gereinigtem Ratten-ITF, Dimer (A), Human-ITF (Monomer) (B) und Human-ITF (Dimer) (C). Die gestrichelten Linien zeigen die Konzentration von Acetonitril im eluierenden Lösungsmittel.
5 Rekonstruierte Massenspektren von gereinigtem Ratten-ITF (Dimer) (A), Human-ITF (Monomer) (B) und Human-ITF (Dimer) (C).
6 Struktur der dimeren Form von Human-ITF.
7 Restriktionsabbildung von Plasmid KFN 1003.
8 Konstruktion von Plasmid pHW756.
9 Konstruktion von Plasmid pHW1066.
BEISPIEL
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Klonieren von Ratten-ITF (rITF) und Human-ITF (hITF)
Das Klonieren von Ratten- und Human-ITF wurde wie in WO 92/14837 beschrieben und wie von Suemori et al., 1991, und Chinery et al., 1992 (Ratten-ITF), und Podolsky et al., 1993, und Hauser et al., 1993 (Human-ITF), beschrieben durchgeführt.
Konstruktion von rITF- und hITF-Expressionsplasmiden
Die Expressionsplasmide pHW756 zur Sekretion von Ratten-ITF und pHW1066 zur Sekretion von Human-ITF wurden wie in 7-9 umrissen konstruiert. Der Hefeexpressionsvektor pKFN1003 (beschrieben in WO 90/10075) ist ein Derivat von Plasmid CPOT (Kawasaki, G., International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, 17.-24. Sept. 1984, Edinburgh, Schottland, Abstr. P15.). Er weist das TPI-Gen von Schizosaccharomyes pombe (POT) als Selektionsmar kierung (Russell, P.R., Gene 40 (1985), 125-130) und den Triosephosphatisomerase(TIP-)-Promotor und -Terminator von S. cerevisiae zur Steuerung der Expression auf (Alber, T. und Kawasaki, G., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 419-434).
Das Ratten-ITF-Gen wurde anfänglich in Bluescript II KS(-) (Stratagene) kloniert, von welchem es gemäß 8 vermehrt wurde. Der nützliche Klonierungsstellen bereitstellende Helfervektor pSX54 ist aus pUC18 und pDN1050 zusammengesetzt (Diderichsen, B., Poulsen, G.B., Jørgensen, S.T., Plasmid 30 (1993), 312-315). Die synthetische DNA-Verknüpfungsgruppe Nco1-Pf1M1 weist die folgende Sequenz auf:
Die Verknüpfungsgruppencodes für die C-terminalen 8 Aminosäuren der Leader-Sequenz, wie beschrieben in Thim, L., Norris, K., Norris, F., Nielsen, P.F., Bjørn, S., Christensen, M. Petersen, J., FEBS Lett. 318 (1993), 345-352, mit ein paar Änderungen in der Kodonauswahl, und der N-terminale Teil des Ratten-ITF-Gens: QEFVGLSPSQC. Die Aminosäuresequenz der Signal- und der Leader-Sequenz ist nachstehend beschrieben:
MKAVFLVLSLIGFCWAQPVTGDESSVEIPEESLIIAENTTLANVAMAERLEKR.
Das Human-ITF-Gen wurde in PUC19 kloniert und wie in 9 beschrieben vermehrt. Die synthetische DNA-Verknüpfungsgruppe Nco!-BsaA1 weist die folgende Sequenz auf:
Die Verknüpfungsgruppencodes für die C-terminalen 8 Aminosäuren der Leader-Sequenz wie für die rITF-Konstruktion und für die N-terminalen 3 Aminosäuren des hITF-Gens beschrieben: EEY. Die Signal- und Leader-Sequenz sind dieselben wie vorstehend.
Die Expressionsplasmide wurden in den Stamm MT 663 von S. cerevisiae (ES-7B X E11-36 a/α, Δtpi/Δtpi, pep 4-3/pep 4/3) durch Selektion auf Wachstum auf Glucose als einzige Kohlenstoffquelle transformiert.
Die Hefetransformanten, die Ratten-ITF und Human-ITF exprimierten, wurden HW756 bzw. HW1066 genannt.
Fermentationen
Die vorstehend beschriebenen Transformanten wurden bei 30°C für eine Dauer von 72 h in Hefepeptondextrose(YPD)-Medium (Sherman et al., 1981), ergänzt mit zusätzlichem Hefeextrakt (60 Gramm/l), gezüchtet. OD-Werte bei 660 nm von 153 und 232 für HW756 (rITF) bzw. HW1066 (hITF) wurden am Ende der Fermentationen erreicht. Der pH-Wert wurde mit 1 M Phosphorsäure am Ende der Fermentation auf 2,5 eingestellt, und die Hefezellen wurden durch Zentrifugation bei 3000 UpM für eine Dauer von 15 Min. entfernt.
Reinigung von rekombinantem rITF
Die rITF-Konzentration in der Hefefermentationsbrühe und während der Reinigung erhaltenen Fraktionen wurde durch analytische HPLC gemessen. Aliquote (gewöhnlich 50-200 μl) wurden auf eine Umkehrphasen-C4-HPLC-Säule des Typs Vydac 214TP54 (0,46 × 25 cM) äquilibriert bei 30°C, mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/Min. mit 0,1 Vol.-%igem TFA in 15 Vol.-%igem Acetonitril injiziert. Nach 10-minütiger isokratischer Elution wurde die Konzentration von Acetonitril im eluierenden Lösungsmittel auf 55% über eine Dauer von 40 Min. angehoben. Die Absorption wurde bei 214 nm gemessen. Es wurde gefunden, dass die drei Peaks, die bei 26,5 Min. 27,3 Min. und 28,2 Min. (2) eluierten, dimere Formen von rITF darstellen. Die Peptide wurden unter Verwendung eines kalibrierten hSP-Standards (Thim et al., 1993) quantifiziert.
Der Expressionsgrad für rekombinante Ratten-ITF im vorliegenden Hefesystem betrug 113 mg/l.
Von einem Fermentator mit 10 l wurden 8,7 l Fermentationsbrühe durch Zentrifugation isoliert. Der Überstand wurde mit 14,8 l destilliertem Wasser zum Vermindern der Leitfähigkeit verdünnt. Die Probe wurde auf eine Fast-Flow-S-Sepharose- (Pharmacia) -Säule (5 × 42 cM) mit einer Fließgeschwindigkeit von 600 ml/Std. gepumpt. Vor dem Aufbringen wurde die Säule in 50 mM Ameisensäurepuffer, pH 3,7, äquilibriert. Ratten-ITF wurde von der Säule durch 50 mM Ameisensäure, pH 3,7, enthaltend 50 mM NaCl, eluiert. Fraktionen von 100 ml wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von 600 ml/Std. aufgefangen und auf den rITF-Gehalt analysiert. Fraktionen des vorstehenden Schritts, enthaltend rITF, wurden gepoolt (2,3 l) und auf eine Amberchrome-(G-71)-Säule (5 × 10 cM) gepumpt. Vor dem Aufbringen wurde die Säule mit 10 mM Ammoniumacetatpuffer, pH 4,8, mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 l/Std. äquilibriert. Nach dem Aufbringen wurde die Säule mit 0,5 l Äquilibrierungspuffer gewaschen und mit 10 mM Ammoniumacetatpuffer, pH 4,8, enthaltend 60 Vol.-% Ethanol, mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,1 l/Std. eluiert. Fraktionen von 10 ml wurden aufgefangen und gemäß ihrem rITF-Gehalt gepoolt. Die Ethanolkonzentration im Pool wurde durch die Zugabe von 2 Volumen Ethanol (99,9 Vol.-%ig ) von 60 Vol.-% auf 87 Vol.-% angehoben, und rITF wurde durch Kühlen des erhaltenen Gemischs auf minus 25°C für eine Dauer von 16 Std. ausgefällt.
Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation für eine Dauer von 1 Std. bei 10.000 g bei -25°C aufgefangen und bei Raumtemperatur in 130 ml 20 mM Ameisensäure, pH 3,0, erneut gelöst. Die Probe wurde auf eine Fast-Flow-SP-Sepharose-(Pharmacia)-Säule (5 × 20 cM) mit einer Fließgeschwindigkeit von 50 ml/Std. gepumpt. Vor dem Aufbringen wurde die Säule mit 20 mM Ameisensäure, pH 3,0, äquilibriert. Peptide wurden von der Säule durch einen linearen Gradienten zwischen 1,5 l von 50 mM Ameisensäure, pH 3,0, und 1,5 l Ameisensäure, pH 3,0, enthaltend 0,5 M NaCl, eluiert. Fraktionen (10 ml) wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von 80 ml/h aufgefangen, und die Absorption bei 280 nm wurde gemessen. Die Fraktionen wurden auf den rITF-Gehalt getestet. Fraktionen, die rITF entsprachen, wurden gepoolt. Ratten-ITF wurde weiter durch präparative HPLC gereinigt. Die gepoolten Fraktionen (900 ml) wurden auf eine präparative C4-HPLC-Säule des Typs Vydac 214TP1022 (2,2 × 25 cM), äquilibriert in 0,1 Vol.-%igem TFA, gepumpt. Die Peptide wurden bei 25°C und mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/Min. mit einem linearen Gradienten (540 ml), gebildet aus MeCN/H₂O/TFA (10:89,9:0,1, V/V/V) und MeCN/H₂O/TFA (65:34,9:0,1, V/V/V), eluiert. Die UV-Absorption wurde bei 280 nm überwacht und Fraktionen, entsprechend 10 ml, wurden aufgefangen und auf den rITF-Gehalt analysiert. Fraktionen, enthaltend rITF, wurden gepoolt und das Volumen durch Vakuumzentrifugation auf 30% reduziert. Aus dem erhaltenen Pool wurde rITF durch Lyophilisierung isoliert. Die Gesamtausbeute von rITF aus 8,7 l Fermentationsmedium betrug 236 mg, entsprechend einer Gesamtreinigungsausbeute von 24%.
Reinigung von rekombinantem hITF
Die Konzentration von hITF in der Hefefermentationsbrühe und während der Reinigung erhaltenen Fraktion wurde in einem HPLC-System, das mit demjenigen, das für rITF beschrieben wurde, identisch war, gemessen. In diesem System wurde durch Massenspektrometrie und Sequenzanalyse gefunden, dass zwei Peaks, die mit 21,2 Min. und 27,1 Min. eluierten, eine dimere und eine monomere form von hITF darstellten. Der Expressionsgrad für rekombinantes Human-ITF im vorliegenden Hefesystem betrug 90 mg/l.
Von einem Fermentator mit 10 l wurden 8,0 l Fermentationsbrühe durch Zentrifugation isoliert. Die Probe wurde 3 Mal (jedes Mal in 24 Std.) gegen 40 l 10 mM Ameisensäure, pH 2,5, dialysiert. Die Probe wurde auf eine SP-Sepharose-Fast-Flow-(Pharmacia)-Säule (5 × 40 cm) gepumpt (0,25 l/Std.). Die Säule wurde mit 5 l 20 mM Ameisensäure, pH 2,5, gewaschen und mit einem linearen Gradienten, gebildet aus 5 l 20 mM Ameisensäure, pH 2,5, und 5 l Ameisensäure, pH 2,5, enthaltend 1 M NaCl, eluiert. Fraktionen von 100 ml wurden aufgefangen und auf den Gehalt an hITF analysiert (3). Zwei hITF-Formen wurden von der Säule eluiert: eine, entsprechend einer monomeren Form von hITF (eluierend mit 0,5 M NaCl) und eine, entsprechend einer dimeren Form von hITF (eluierend mit 0,78 M NaCl). Fraktionen, entsprechend den beiden Formen, wurden getrennt gepoolt.
Jede Fraktion wurde in drei gleiche Teile unterteilt (Volumen: etwa 700 ml) und auf eine C4-Säule des Typs Vydac 124TP1022 (2,2 × 25 cM), äquilibriert in 0,1 Vol.-%igem TFA, gepumpt. Die Peptide wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/Min. mit einem linearen Gradienten (540 ml) zwischen MeCN/H₂O/TFA (10:89,9:0,1, V/V/V) und MeCN/H₂O/TFA (65:34,9:0,1, V/V/V) eluiert. Die UV-Absorption wurde bei 280 nm überwacht, und Fraktionen, entsprechend 10 ml, wurden aufgefangen und auf den hITF-Gehalt analysiert.
Fraktionen von dem vorstehenden Schritt, enthaltend hITF (Monomer) und hITF (Dimer), wurden getrennt gepoolt, und der pH-Wert wurde auf 3,0 eingestellt. Die Proben wurden getrennt auf eine SP-Sepharose-Säule des Typs HiLoad 16/10 (Pharmacia) (1,6 × 10 cM), äquilibriert in 20 mM Ameisensäure, pH 3,0, enthaltend 40 Vol.-% Ethanol, aufgebracht. Die Säule wurde mit 80 ml Äquilibrierungspuffer gewaschen und mit einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/Min. mit einem linearen Gradienten zwischen 200 ml 20 mM Ameisensäure, pH 3,0, 40 Vol.-% Ethanol und 200 ml 20 mM Ameisensäure, pH 3,0, 40 Vol.-%, enthaltend 1 M NaCl, eluiert. Fraktionen (5 ml) wurden aufgefangen und auf den hITF-Gehalt analysiert.
Fraktionen, enthaltend hITF (Monomer) bzw. hITF (Dimer) wurden gepoolt, und der Peptidgehalt durch Einstellen der Ethanolkonzentration auf 90 Vol.-% und Kühlen des Gemischs für eine Dauer von 72 Std. bei -25°C ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation aufgefangen und lyophilisiert. Die Gesamtausbeute von 81 Fermentationsbrühe betrug 256 mg hITF (Monomer) und 133 mg hITF (Dimer), entsprechend einer Gesamtreinigungsausbeute von 50% bzw. 65% für die monomere und dimere Formen.
Charakterisierung von rekombinantem rITF und hITF
Nach der Hydrolyse in 6 M HCl bei 110°C in vakuumversiegelten Röhrchen für eine Dauer von 24, 48 und 96 Std. wurden die Proben (50 μg) auf einem automatischen Aminosäureanalysator des Typs Beckman (Modell 121 MB) analysiert. Halbcystein wurde als S-β-(4-Pyridylethyl)-Derivat nach Reduktion der Disulfidbindungen durch Tributylphosphin (Rüegg & Rudinger, 1974), gefolgt von Kuppeln mit 4-Vinylpyridin (Friedman et al., 1970) bestimmt. Hydrolysen von mit 4-Vinylpyridin behandelten Proben wurden durch 4 M Methansulfonsäure oder 3 M Mercaptoethansulfonsäure bei 110°C für eine Dauer von 24 Std., wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Aminosäuresequenzanalyse wurde durch automatischen Edman-Abbau unter Verwendung einer Gasphasen-Sequenzapparatur von Applied Biosystems, Modell 470A (Thim et al., 1987), bestimmt.
Eine Massenspektrometrieanalyse wurde unter Verwendung eines DC/MS/MS-Systems des Typs API III (Sciex, Thornhill, Ont., Kanada) durchgeführt. Das Triple-Quadrupole-Instrument weist einen Masse-zu-Ladung(m/z)-Bereich von 2400 auf und ist mit einem pneumatisch unterstützten Elektronensprüh-(auch be zeichnet als Ionensprüh)-Interface ausgestattet (Bruins et al., 1987; Covey et al., 1988). Die Probeneinbringung wurde mit einer Spritzeninfusionspumpe (Sage Instruments, Cambridge, MA) durch eine geschmolzene Kapillare (75 μm i.d.) mit einer flüssigen Fließgeschwindigkeit, eingestellt auf 0,5-1 μl/min, durchgeführt. Die Instrument-m/z-Skala wurde mit einzeln geladenen Ammoniumadduktioen von Poly(propylenglykolen) (PPGs) unter Einheitsauflösung kalibriert. Die Genauigkeit der Massemessungen ist im Allgemeinen besser als 0,02%.
4 zeigt die analytischen HPLC-Chromatogramme, die von dem gereinigten rITF (4A) und hITF (4B und 4C) erhalten wurden. Rekombinantes rITF enthält ein Gemisch aus 3 eng verwandten Peptiden, und keine Versuche wurden unternommen, diese Formen zu trennen. Beim Analysieren durch Elektronensprüh-Massenspektrometrie wurden drei dominierende Molekulargewichte gefunden, entsprechend: 13112,2, 13096,6 und 13078,8 (5A). Das berechnete Molekulargewicht von Ratten-ITF in monomerer Form, in welcher Cys-57 eine freie -SH-Gruppe enthält, beträgt 6558,3. Das berechnete Molekulargewicht von Ratten-ITF in dimerer Form (z.B. ist eine S-S-Brücke zwischen zwei Cys-57 aufgebaut) beträgt 13114,6. Aus diesen für das rekombinante Ratten-ITF gefundenen Molekulargewichten ist es klar, dass alle drei Peptide dimere Formen von rITF darstellen. Von anderen Kleeblatt-Peptiden, in welchen der N-terminale Aminosäurerest Gln ist, z.B. PSP (THim et al., 1985, und Tomasetto et al., 1990), ist es bekannt, dass dieser Rest die Neigung dazu aufweist, unter Bildung einer Pyrrolidoncarbonsäure (pyrGlu) zu zyklisieren. Im Falle von Ratten-ITF mit einer vorhergesagten N-terminalen Sequenz von Gln-Glu-Phe-Val-Gly, scheint die Annahme vernünftig, dass das N-terminale Gln ebenfalls unter Bildung von pyrGlu zyklisieren könnte. Eine derartige Derivatisierung würde zu einer Verminderung im Molekulargewicht von Ratten-ITF (Dimer) auf 17 (ein pyrGlu) bzw. 34 (zwei pyrGlu) Masseneinheiten führen. Die beobachteten Molekulargewichte von 13096,6 und 13078,8 (5A) entsprechen der dimeren Form von Ratten-ITF, in welcher eine bzw. zwei N-terminale Gln-Reste zyklisiert wurden. Das berechnete Molekulargewicht dieser Formen beträgt 13097,6 und 13080,6, was in guter Ü bereinstimmung mit den experimentell bestimmten Werten liegt. Folglich wird aus der HPLC (4A) und Massenanalyse (5A) geschlossen, dass das rekombinante Ratten-ITF aus 3 verschiedenen dimeren Formen besteht: eine, enthaltend 2N-terminales Gln, eine, enthaltend 1 N-terminales Gln und 1 N-terminales pyrGlu und eine, enthaltend 2 N-terminales pyrGlu. Tabelle I zeigt die Aminosäurezusammensetzung von Ratten-ITF, die in guter Übereinstimmung mit den erwarteten Werten liegt.
5A und 5B zeigen die Reinheit von hITF (Monomer) bzw. hITF (Dimer), wie analysiert durch analytische HPLC. Die dimere Form (5C) sieht relativ rein aus, wohingegen die monomere Form (5B) mit vor dem Peptid eluierendem Material kontaminiert zu sein scheint. Jedoch wurde nach einer erneuten Chromatographie des im Hauptpeak eluierenden Materials ein ähnliches Chromatogramm erhalten (Ergebnisse nicht dargestellt). Dies scheint eher auf ein atypisches Verhalten des hITF (Monomer) auf Umkehrphasensäulen als auf Verunreinigungen hinzuweisen. Wir beobachteten zuvor ein ähnliches Verhalten von hoch gereinigtem Schweine-PSP sowie hoch gereinigtem rekombinantem hSP (Thim et al., 1993).
Eine Massenspektrometrieanalyse des hITF (Monomer) zeigt ein Molekulargewicht des dominierenden Peaks, entsprechend 6694,0 (5B). Das Molekulargewicht, wie berechnet von der Aminosäuresequenz (1), beträgt 6574,4, unter Voraussetzung, dass Cys-57 auf der -SH-Form vorliegt. Die Aminosäuresequenzanalyse (Tabelle II) zeigt die erwartete N-terminale Sequenz von Glu-Glu-Tyr-Val-Gly-. Die Aminosäurezusammensetzungsanalyse (Tabelle I) zeigt die erwarteten Werte, außer für die Gegenwart von 7,3 (8) Cysteinen. Ein zusätzliches Cystein, geknüpft an Cy-57 von hITF-Monomer, würde das Molekulargewicht auf 6694,7 ansteigen lassen, was sehr nahe an dem Wert liegt, der durch Massenspektrometrie bestimmt wurde (6694,0). Es wird deshalb vorausgesetzt, dass im hITF (Monomer) Cys-57 an ein zusätzliches Cystein durch Disulfid verknüpft ist. Der kleinere Molekulargewichtspeak im Massenspektrum (5B) kann ein anderes Derivat von Cys-57 darstellen oder kann eine Verunreinigung im Präparat sein.
Das berechnete Molekulargewicht von hITF (Dimer), in welchem zwei Monomere durch eine Disulfidbindung zwischen zwei Cys-57-Resten verknüpft sind, beträgt 13146,8. Dies liegt in guter Übereinstimmung mit dem Wert, der durch Massenspektrometrie bestimmt wurde (13147, 5C). Der andere Peak im Massenspektrum (13169) stellt möglicherweise das Na⁺-Addukt von hITF (Dimer) dar. Die Sequenzanalyse (Tabelle I) sowie die Aminosäurezusammensetzungsanalyse (Tabelle II) liegen ebenfalls in guter Übereinstimmung mit den erwarteten Werten. Tabelle I Aminosäurezusammensetzung von Ratten-ITF (Dimer), Human-ITF (Monomer) und Human-ITF (Dimer)
Werte in Klammern sind diejenigen, die aus der cDNA gefolgert wurden: Ratten-ITF (Chinery et al., 1992), Human-ITF (Hauser et al., 1993).

^a) Bestimmt durch Extrapolation auf eine Nullzeit-Hydrolyse
^b) Bestimmt durch Hydrolyse in 4 M Methansulfonsäure
^c) Nicht bestimmt

LITERATURANGABEN

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Claims

Dimer des Kleeblatt-Peptids, dadurch gekennzeichnet, dass es eine dimere Form eines Monomers des Kleeblatt-Peptids darstellt, wobei das Monomer eine einzelne Kleeblatt-Domäne enthält.
Dimer des Kleeblatt-Peptids nach Anspruch 1 mit einem Molekulargewicht von etwa 13000.
Dimer des Kleeblatt-Peptids nach Anspruch 1, das ein Dimer des Magen-Darm-Kleeblatt-Faktors (intestinal trefoil factor, ITF) ist.
Dimer des Kleeblatt-Peptids nach Anspruch 1 oder 3, das ein Dimer eines Human-ITF ist.
Dimer des Kleeblatt-Peptids nach Anspruch 3 oder 4, wobei das ITF-Dimer aus zwei ITF-Monomeren zusammengesetzt ist, die durch eine Disulfidbindung zwischen zwei Cysteinresten in Position 57 jedes Monomers miteinander verknüpft sind.
Dimer des Kleeblatt-Peptids nach Anspruch 1, das ein Dimer eines mit Brutkrebs verbundenen Peptids (pS2) ist).
Dimer des Kleeblatt-Peptids nach Anspruch 1 oder 6, das ein Dimer von Human-pS2 ist.
Dimer des Kleeblatt-Peptids nach Anspruch 6 oder 7, wobei das pS2-Dimer aus zwei pS2-Monomeren zusammengesetzt ist, die durch eine Disulfidbin dung zwischen zwei Cysteinresten in Position 58 jedes Monomers miteinander verknüpft sind.
Verfahren zur Herstellung eines Dimers des Kleeblatt-Peptids, dadurch gekennzeichnet, dass es eine dimere Form eines Monomers des Kleeblatt-Peptids ist, wobei das Monomer eine einzelne Kleeblatt-Domäne enthält, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Züchten einer geeigneten Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die ein eine Kleeblatt-Domäne enthaltendes Monomer des Kleeblatt-Peptids kodiert, unter die Herstellung des Peptids gewährenden Bedingungen; Abtrennen des erhaltenen Monomers des Kleeblatt-Peptids und Dimer des Kleeblatt-Peptids von der Kultur durch ein chromatografisches Verfahren; und Gewinnen des Dimers des Kleeblatt-Peptids.
Arzneimittel, umfassend ein Dimer des Kleeblatt-Peptids, dadurch gekennzeichnet, dass es eine dimere Form eines Monomers des Kleeblatt-Peptids ist, wobei das Monomer eine einzelne Kleeblatt-Domäne enthält, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel oder Vehikulum.
Arzneimittel nach Anspruch 10, umfassend ein Dimer des Kleeblatt-Peptids nach einem der Ansprüche 2-8.
Dimer des Kleeblatt-Peptids, dadurch gekennzeichnet, dass es eine dimere Form eines Monomers des Kleeblatt-Peptids ist, wobei das Monomer eine einzelne Kleeblatt-Domäne enthält, zur Verwendung als Medikament.
Dimer des Kleeblatt-Peptids nach einem der Ansprüche 2-8 zur Verwendung als Medikament.
Dimer des Kleeblatt-Peptids, dadurch gekennzeichnet, dass es eine dimere Form eines Monomers des Kleeblatt-Peptids ist, wobei das Monomer eine einzelne Kleeblatt-Domäne enthält, zur Verwendung bei der Prophylaxe oder Behandlung von Magen-Darm-Störungen.
Dimer des Kleeblatt-Peptids nach einem der Ansprüche 2-8 zur Verwendung bei der Prophylaxe oder Behandlung von Magen-Darm-Störungen.
Dimer des Kleeblatt-Peptids nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Magen-Darm-Störung ausgewählt ist aus: Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren; entzündlicher Darmerkrankung; Crohn-Krankheit; und Verletzung des Darmtrakts, verursacht durch Strahlungstherapie, Bakterieninfektion oder anderen Infektionen.
Verwendung eines Dimers des Kleeblatt-Peptids, dadurch gekennzeichnet, dass es eine dimere Form eines Monomers des Kleeblatt-Peptids ist, wobei das Monomer eine einzelne Kleeblatt-Domäne enthält, zur Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe oder Behandlung von Magen-Darm-Störungen.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Dimer des Kleeblatt-Peptids ein Dimer des Kleeblatt-Peptids nach einem der Ansprüche 2-8 ist.
Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Magen-Darm-Störung ausgewählt ist aus: Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren; entzündlicher Darmerkrankung; Crohn-Krankheit; und Verletzung des Darmtrakts, verursacht durch Strahlungstherapie, Bakterieninfektion oder anderen Infektionen.