CN1070867C - 三叶形肽双体 - Google Patents

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Abstract

一种带有单一的三叶形结构域的三叶形肽，其特征在于它呈双体形式。

Description

三叶形肽双体
本发明涉及三叶形肽双体，一种制备三叶形肽双体的方法，一种含有三叶形肽双体的药物组合物及其在治疗胃肠道疾病方面的用途。
三叶形肽是肽的一个家族，主要见于与胃肠道相关的部位。哺乳动物的三叶形肽含有一个或几个特有的三叶形结构域(Thim等，1989)，每个结构域是由一段有38或39个氨基酸残基的序列构成，其中，6个半-胱氨酸残基以1-5、2-4和3-6构型连接，从而形成一种特有的三叶形结构(Thim,1989)。
现在所知的三叶形肽类含有一个或两个三叶形结构域(见Thim,1994；Poulsom & Wright,1993；Hoffmann & Hauser,1993)而蛙，爪蟾肽及蛋白质，已报导其含有一个(Hauser & Hoffmann,1991)、二个(Hauser等，1992a)四个(Hoffmann,1988)或六个(Hauser& Hoffmann,1992b)三叶形结构域。带有一个结构域的哺乳动物三叶形肽包括迄今所知的与人的乳腺癌有关的pS2肽(Jakowlev等，1984,Prudhomme等，1985)和与小鼠有关的pS2肽(Lefebvre等，1993)，及迄今所知获自人(Podolsky等，1993；Hanser等，1993)和大鼠(Suemori等，1991；Chinery等，1992)的肠道三叶形因子。已报导了从人(Tomasetto等，1990)、猪(Thim等，1982)和小鼠(Tomasetto等，1990)体内得到的含有两个三叶形结构域的解痉多肽(SP)。在人体内，三种三叶形肽hpS2、hITF和hSP都是在正常条件下在胃肠道中表达的：hSP和hps2是在胃的上皮粘膜层中表达(Tomasetto等，1990；Rio等，1988)，hITF是在小肠和结肠的上皮粘膜层中表达(Podolsky等，1993)。
对这种三叶形肽的生理功能尚不十分清楚。已有报导说三叶形肽在胃肠道中大量表达与几种粘膜损伤有关，如发炎性肠道疾病(Rio等，1991；Poulsom等，1992；Wright等，1993)，并且与胃和十二指肠溃疡有关(Rio等，1991；Hanby等，1993；Wright等，1990)。由此表明，这种三叶形肽具有粘膜修复功能(例如，Wright等，1993)。Dignass等(1994)、Playford等(1994)和Bahyatsky等(1994)最近提供了三叶形肽促进粘膜上皮层受伤后重建的证据。三叶形肽促进修复功能的机理可能是，交联的粘蛋白一糖蛋白构成了抵御消化酶的粘弹性凝胶层(Thim,1994；Gajhede等，1993)。
在WO92/14837中披露了大鼠和人单一结构域肠道三叶形因子的克隆及将这种肠道三叶形因子用于治疗胃肠损伤的用途。
业已发现，可以制备仅有一个三叶形结构域的三叶形因子双体，而且其具有有价值的药理学特性。
因此，本发明涉及一种带有单一的三叶形结构域的三叶形肽，这种肽的特征在于它是呈双体形式。
如上所述，据信三叶形肽可通过稳定肠道的粘膜层而治愈消化性溃疡和其它粘膜损伤。这种稳定作用的机理目前尚不清楚。不过，对具有两个三叶形结构域的猪胰腺解痉多肽(PSP)进行的X-衍射分析(见Gajhede等，1993)表明，在每个结构域中，大部分保守残基构成宽8-10A的裂缝。初步停靠实验已经证实，所述裂缝可以容纳寡糖链，如与粘蛋白糖蛋白结合的碳水化合物的一部分。如果事实确实如此的话，带有两个这种裂缝的PSP能够与粘蛋白交联，在粘膜上皮上面形成一层保护性凝胶层。现在还不清楚的是，具有单一三叶形结构域的三叶形肽(如ITF和pS2)是在体内形成双体后产生一种类似的功能还是具有不同的作用机理。不过，现在相信，这种三叶形肽双体确实能与粘蛋白交联，因此，它是这种肽的活性形式。
另一方面，本发明涉及一种制备带有单一三叶形结构域的三叶形肽双体的方法，该方法包括：培养一种用编码一种带有一个三叶形结构域的三叶形肽的DNA序列转化一种合适的宿主细胞，培养是在有利于所述肽产生的条件下进行；以及从培养物中回收所产生的三叶形肽双体。
再一方面，本发明涉及一种药物组合物，它含有带有单一三叶形结构域的三叶形肽双体和一种可以药用的稀释剂或媒介物。
另一方面，本发明涉及一种被用作药物的带有一个三叶形结构域的三叶形肽双体，以及将一种带有一个三叶形结构域的三叶形肽双体用于制备用来预防或治疗胃肠疾病的药物的用途。
具体地讲，这种三叶形因子双体可以是肠道三叶形因子(ITF)或乳腺癌相关肽(pS2)的双体。
具体地讲，所述三叶形因子是人ITF，其单体氨基酸序列为：ZEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKPLQEAECTF
其中，Z是Glu、Gln或pyrGlu，
或是其能够二聚化并具有类似活性的同源物；或
人pS2，其单体氨基酸序列为：ZAQTETCTVAPRERQNCGFPGVTPSQCANKGCCFDDTVRGVPWCFYPNTIDVPPEEECEF
其中，Z是Glu、Gln或pyrGlu，
或是其能够二聚化并具有类似活性的同源物。
ITF或pS2同源物包括相同的半胱氨酸结构和二硫化物结构(图1)，并且在环1、环2和环3上表现出一定的序列同源性(被理解为在相应的位置上有相同的氨基酸或保存性置换)。所述环形区域的序列同源性可以是1～10个氨基酸残基，而每个环里的氨基酸残基数目(除半胱氨酸外)为7-12个，最好是9-10个。
ITF或pS2的同源物可以有一个或几个氨基酸取代、缺失或添加。上述变化最好是这种性质的：所述取代不会明显影响该蛋白的折叠或活性。较小的缺失通常是指在环形区域缺失1～大约3个氨基酸，在N-末端和C-末端区域缺失1～大约10个氨基酸；单氨基-或羧基末端突出，如一个氨基末端蛋氨酸末端，一个最多可达10个残基的小连接肽，或一个便于提纯的小突出，如多组氨酸序列、抗原表位或结合结构域。统一参阅Ford等，Protein Expression andPurification(2:95-107,1991)。保存性置换的例子有：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)之间的置换，酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)之间的置，极性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)之间的置换，疏水氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)之间的置换，芳族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)之间的置换，和小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸)之间的置换。
本领域技术人员可以理解，所述取代可发生在对该分子的功能起关键作用的区域之外，取代之后得到的仍然是一种活性多肽。可用本领域已知的方法鉴定对本发明的三叶形肽的活性起关键作用的氨基酸，以便不对这些氨基酸进行取代。所述鉴定方法有定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,Science 244,1081-1085,1989)。在后一种方法中，将突变引入该分子的每一个残基，并检验所得到的分子的生物活性(例如粘膜恢复，保护粘膜，胃溃疡恢复)，以确定对该分子的活性起关键作用的氨基酸残基。
所述同源物可以是一种等位变体，即因突变而产生的一个基因的另一种形式，或由突变的基因所编码的另一种肽，但这种肽具有与本发明的肽大致相同的活性。因此，突变可以是沉默的(所编码的肽不发生变化)或者编码具有不同的氨基酸序列的肽。
本发明三叶形肽的同源物也可以是种间同源物，即一种具有类似活性的多肽来自另一个物种，例如，小鼠、大鼠、兔、牛、猪或蛙。
在一种优选实施方案中，本发明的三叶形肽双体的近似分子量为13000。所述双体由两个三叶形肽单体组成，对于类ITF单体来说，两个单体是通过位置57上的两个半胱氨酸间的二硫键连接在一起，而对于类pS2单体来说，两个单体是通过位置58上的两个半胱氨酸间的二硫键连接在一起。
所述三叶形肽双体最好是由重组DNA技术生产。为此，可用标准技术(参见Sambrook等，Molecular Cloning:A laboratory Manu-al,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989)提取编码所述三叶形肽的DNA序列：制备基因组或cDNA文库，并通过用合成的寡核苷酸探针的杂交法筛选编码这种肽的全部或部分的DNA序列。为此目的，编码这种肽的DNA序列最好是人的，即来自人基因组DNA或cDNA文库。
这种编码所述三叶形肽的DNA序列还可以用已建立的标准方法合成制备，例如，由Beaucage和Carutlcers所披露的亚磷酰胺(phosphoamidite)法(Tetrahedron Letters 22(1981),1859-1869)，或由Matthes等所披露的方法(EMBO Journal 3(1984),801-805)。按照亚磷酰胺法，可在例如一台自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，对其进行纯化、退火、连接，并克隆到合适载体上。
所述DNA序列也可以通过PCR反应用特殊引物进行制备，如在US4,683,202中、由Saiki等(Science 239,1988,487-491)或Sambrook等(Supra)所述。
所述编码该三叶形肽的DNA序列通常被插入一种重组载体，该载体可以是便于进行重组DNA操作的任何载体，而且，载体的选择通常取决于它将被导入的宿主细胞。因此，所述载体可以是一种自主复制的载体，即作为染色体外因子存在的载体，它的复制独立于染色体的复制，例如，一种质粒。另外，所述载体也可以是这样的：当其被导入宿主细胞后，整合到宿主细胞基因组上，并且与它所整合的染色体一起复制。
所述载体最好是一种表达载体，其中，编码所述三叶形肽的DNA序列与该DNA转录所需要的其它片段可操纵地连接。一般，该表达载体来自质粒或病毒DNA，或是同时带有二者的因子。“可操纵地连接”一词是指所述片段是这样设置的：它们一齐发挥其应有的作用，例如，在一个启动子中开始转录，并转录编码所述多肽的DNA序列。
启动子可以是在所选择的宿主细胞中具有转录活性的任何DNA序列，并可由编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因衍生而来。
适于指导编码所述三叶形肽的DNA在哺乳动物细胞中转录的启动子的例子有：SV40启动子(Subramani等，Mol.Cell Biol.1(1981),854～864),MT-1(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter等，Science 222(1983),809-814)或腺病毒2主要晚期启动子。
适用于昆虫细胞的启动子的例子有：多角体蛋白启动子(US4,745,051；Vasuvedan等，FEBS Lett～11,(1992)7-11),P10启动子(J.M.Vlak等，J.Gen.Virology 69,1988,pp765～776)，苜蓿银纹夜蛾(Autographa califormica)多角体病毒碱蛋白启动子EP397485)，杆状病毒立即早期基因1启动子(US5,155,037；US5,162,222)，或杆状病毒39K延迟早期基因启动子(US5,155,037；US5,162,222)。
适用于酵母宿主细胞的启动子的例子包括：得自酵母糖酵解基因(Hitzeman等，J.Biol.Chem.255(1980),12073-12080；Alber和Kawaski,J.Mol.Appl.Gen.1(1982),419-434)或醇脱氢酶基因(Young等,Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaender等著)，Plenum出版社，New York,1982)的启动子，或TPI1启动子(US4,599,311)或ADH2-4c启动子(Russell等，Na-ture 304(1983),652-654)。
适用于丝状真菌宿主细胞的启动子的例子有：ADH3启动子(McKnight等，The EMBOJ.4(1985),2093-2099)或tpiA启动子。其它适用启动子的例子包括由编码以下酶的基因衍生来的启动子，这些酶是：米曲酶(A.oryzae)TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳α-淀粉酶，黑曲霉或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(gluA),Rhizomucormiehei脂肪酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶。优选TAKA淀粉酶和gluA启动子。在EP238023和EP383779中提到了适合的启动子。
如有必要，还可将编码所述三叶形肽的DNA序列与合适的终止子可操纵地连接，如人生长激素终止子(Palmiter等，Science 222,1983,pp809-814)或(用于真菌宿主的)TPI1(Allber和Kawasaki,J.Mol.Appl.Gen.1,1982,pp.419-434)或ADH3(McKniht等，TheEMBO J.4,1985,pp.2093-2099)终止子。所述载体还包括以下因子，如聚腺苷酸化信号(例如，获自SV40或腺病毒5Elb区段)，转录增强子序列(例如SV40增强子)和翻译增强子序列(例如编码腺病毒VA RNAs的序列)。
所述重组载体还可以包括使该载体能在相应宿主细胞中复制的DNA序列。这种序列的一个例子(当宿主细胞为哺乳动物细胞时)是SV40复制起点。
当宿主细胞为酵母细胞时，能使载体复制的合适序列是酵母质粒2μ复制基因REP1-3和复制起点。
所述载体还可包括一个选择标记，例如，一个其产物可以弥补宿主细胞的一种缺陷的基因，如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)TPI基因(由P.R.Russell披露，Gene 40,1985,pp.125-130)，或一种能产生抗药性的基因，例如抗氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤。对丝状真菌来说，选择标记包括amdS,pyrG,anyB,ni-aD或sC。
为了把本发明的三叶形肽导入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体上提供一个分泌信号序列(也被称作前导序列，前原序列或前序列)。该分泌信号序列以正确的阅读框架同编码三叶形肽的DNA序列接合。分泌信号序列通常位于编码所述肽的DNA序列的5′端。所述信号序列可以是与所述肽正常连接的序列或是来自编码另一种分泌蛋白的基因。
为了由酵母细胞进行分泌，所述分泌信号序列可以编码任何能确保把表达的三叶形肽有效导入该细胞的分泌途径的信号肽。所述信号肽可以是天然信号肽或其功能性片段，或者是合成肽。已证实的合适的信号肽有：α-因子信号肽(US-4,870,008)，小鼠唾液淀粉酶信号肽(O.Hagenbuchle等，Nature 289,1981,pp.643-646)，修饰的羧肽酶信号肽(L.A.Valls等，Cell 48,1987,pp.887-897)，酵母BAR1信号肽(WO87/02670)，或酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(见M.Egel-Mitani等，Yeast 6,1990,pp.127-137)。
为了在酵母中进行有效分泌，还可将编码一种前导肽的序列插在所述信号序列的下游和编码所述三叶形肽的DNA序列的上游。该前导肽的作用是把所表达的肽由内质网、引导至高尔基体，并进一步引导至分泌小泡，以便分泌到培养基里(即把所述三叶形肽通过细胞壁或者至少通过细胞膜输送到酵母细胞的壁膜间隙里)。该前导肽可以是酵母α-因子前导肽(在US4,546,082,US4,870,008,EP16201,EP123 294,EP123 544和EP163529中披露了其用途)。另外，该前导肽也可以是合成前导肽，即不是天然存在的前导肽。举例来说，合成前导肽可以按WO89/02463或WO92/11378披露的方法构建。
用于丝状真菌的信号肽通常可由编码曲霉菌淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因、编码Rhizomucor miehei脂肪酶或蛋白酶或HumicolaLanuginosa脂肪酶的基因产生。理想的是，该信号肽是由编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶的基因产生。在EP238023和EP215594中披露了合适的信号肽。
用于昆虫细胞的信号肽通常是由昆虫基因产生(见WO90/05783)，如鳞翅目烟草天蛾(Manduco sexta)脂动激素前体信号肽(见US5,023,328)。
分别用于连接编码所述三叶形肽的DNA序列、启动子和有选择地连接终止子和/或分泌信号序列的方法，以及将其插入带有复制所需信息的合适载体上的方法是本领域技术人员所熟知的(例如，Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor,New York,1989)。
将被导入编码所述三叶形肽的DNA序列的宿主细胞，可以是能够以双体形式产生这种肽的任何细胞，其中包括酵母、真菌和高等真核细胞。
合适的哺乳动物细胞系有COS(ATCC CRL 1650)、BHK(ATCC CRL 1632,ATCC CCL10)、CHL(ATCC CCL39)或CHO(ATCC CCL61)细胞系。转染哺乳动物细胞及在导入了有关DNA序列的细胞中表达该序列的方法，披露在以下文献中，例如Kaufman和Sharp,J.Mol.Biol.159(1982),601-621；Southern和Berg,J.MolAppl.Genet.1(1982),327-341；Loyter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79(1982),422-426；Wigler等，Cell 14(1978),725；Corsaro和Pearson,Somatic Cell Genetics 7(1981),603,Graham和Van der Eb,Virology 52(1973),456；和Neumann等，EMBOJ.1(1982),841-845。
合适的酵母细胞的例子有酵母菌或裂殖酵母菌，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)菌株。用于用异源DNA转化酵母细胞并用该细胞生产异源多肽的方法披露在以下文献中，例如US4,599,311,US4,931,373,US4,870,008,US5,037,743和US4,845,075，这些文献全被收作本文的参考。通过表型测定，由一个选择标记选择转化细胞，选择标记通常是药物抗性或是在缺少一种特殊营养成分如亮氨酸的条件下生长的能力。用于酵母的优选载体是披露于US4,931,373中的POT1载体。如上文所述，编码所述三叶形肽的DNA序列可以以一个信号序列为前导，并可以有选择的连接一个前导序列。合适的酵母细胞的其它例子有克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)菌株，如乳酸克鲁维酵母(K.Lactis)，汉森酵母菌属(Hansenula)菌株，如多形汉森酵母(H.polymorpha)，或毕赤酵母属，如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)(Gleeson等，J.Gen.Microbiol.132,1986,pp.3459-3465,US4,882,279)。
其它真菌细胞的例子包括丝状真菌，例如曲霉菌、链孢霉菌、镰孢菌或木霉菌，特别是米曲霉、构巢曲霉或黑曲霉菌株。在EP272277、EP238023和EP184438中披露了用曲霉菌表达蛋白质的用途。例如，可以按照Malardier等所披露的方法(1989,Gene.78:147-156)转化尖镰孢(F.oxysporum)。可按照EP244234中披露的方法转化木霉菌。
当把丝状真菌用作宿主细胞时，可用本发明的DNA结构对其进行转化，通常是通过把该DNA结构整合到宿主染色体上以获得重组宿主细胞。这种整合一般被认为是有益的，因为这样一来所述DNA序列倾向于更稳定地保留在宿主细胞中。可按照常规方法，例如通过同源或异源重组方法把所述DNA结构整合到宿主染色体上。
可按照在US4,745,051；US4,879,236；US5,155,037；US5,162,222；EP397,485中所披露的方法转化昆虫细胞，并在转化的细胞中生产异源多肽，以上文献均被收作本发明的参考。用作宿主的昆虫细胞系可以是鳞翅目细胞系，如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(见US5,077,214)。培养条件可如在WO89/01029或WO89/01028中所述，或如任何上述文件所述。
然后，在有利于所述三叶形肽表达的条件下，在合适的营养培养基中培养上述转化的或转染的宿主细胞，然后从该培养基中以双体形式回收全部或部分所述三叶形肽。用于培养所述细胞的培养基可以是任何适合于宿主细胞生长的常规培养基，如含有合适添加剂的极限培养基或复合培养基。合适的培养基可从供应商处购买或按照公开的配方制备(例如，参见American Type Culture Collection目录)。然后，通过常规方法从培养基中回收由所述细胞产生的三叶形肽，该方法包括：通过离心或过滤从宿主细胞中分离宿主细胞，用盐，如硫酸铵从上清液或滤液中沉淀蛋白类成分，用各种层析方法进行提纯，例如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等，具体层析方法取决于相应多肽的类型。
在本发明的药物组合物中，所述三叶形肽双体可通过任何已建立的制备药物组合物的方法进行制备，例如，如在Remington’sPharmaceutical Sciences(1985)中所述。该组合物可制成适于全身注射或灌注的形式，例如用无菌水或等渗盐水或葡萄糖溶液配制。可用本领域已知常规灭菌技术对该组合物进行灭菌。所得到的水溶液可以包装使用或在无菌条件下过滤并进行冷冻干燥，在服用之前将冻干的制剂与无菌水溶液混合。所述组合物中，根据相应生理条件的需要可含有可以药用的辅助成分，如缓冲剂、渗压调节剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。
本发明的药物组合物也适于经鼻、经皮或直肠使用。在该组合物中可以采用的载体或稀释剂可以是任何常见固体载体。固体载体的例子包括乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁和硬脂酸。同样地，所述载体或稀释剂也可以包括本领域已知的任何缓释材料，如一硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，或是这些材料与蜡的混合物。固体载体的用量可以有较大变化，但一般在约25mg至1g范围内。
该组合物中三叶形肽的浓度变化范围很大，即，其重量百分比在大约5～约100％之间。优选浓度为重量百分比在50～100％范围内。一个单位剂量的该组合物，通常含有约1mg～约200mg所述肽，含量为约25～约75mg较好，含量为约50mg特别好。
如上所述，本发明的三叶形肽双体被认为是该肽的活性形式。因此，将其用于预防或治疗胃肠疾病是有利的。更具体地讲，可将其用于下列疾病的治疗：胃溃疡或消化性溃疡，发炎性肠道疾病，Crohn病或因辐射治疗、细菌或其它感染所引起的肠道损伤等。为患者使用这种多肽的剂量依受治疾病的类型和严重程度而变化，但一般是在0.1～1.0mg/kg体重的范围内。
下面将结合附图以实施例的形式对本发明做更详细的说明。
图1表示人肠道三叶形因子ITF的结构。其一级氨基酸序列援引自Hauser等(1993)，而二硫键位于与PSP和pS2同源区域(Thim,1988)。
图2是获自能表达大鼠ITF的酵母菌株HW756的上清液在Vydac 214 TP54柱上进行反相HPLC的结果。
图3是部分纯化的人ITF在Fast Flow SP-Sepharose柱上进行离子交换层析的结果。通过分析HPLC测定hITF(单体)和hITF(双体)量。柱子表示为进一步纯化单体和双体形式而收集的级分。虚线表示洗脱溶剂中NaCl的浓度。
图4表示纯化的大鼠ITF、双体(A)、人ITF(单体)B和人ITF(双体C)在Vydac214 TP54C柱上的反相HPLC结果。虚线表示洗脱溶剂中乙腈的浓度。
图5表示纯化大鼠ITF(双体)(A)、人ITF(单体)(B)和人ITF(双体)(C)的重建质谱。
图6表示人ITF的双体形式结构。
图7表示质粒KFN1003的限制图。
图8表示质粒pHW756的构建。
图9表示质粒pHW1066的构建。
                  实施例
                 材料和方法大鼠ITF(rITF)和人ITF(hITF)的克隆
大鼠和人ITF的克隆是按照下列文献中披露的方法进行：WO92/14837，Suemori等(1991)，Chinery等(1992)(大鼠ITF)，Podolsky等(1993)，和Hauser等(1993)(人ITF)。构建rITF和hITF表达质粒
按照图7-9所示步骤构建用于分泌大鼠ITF的表达质粒pHW756和用于分泌人ITF的表达质粒pHW1066。酵母表达载体pKFN1003(见WO90/10075)是质粒CPOT(Kawasaki,G.Interna-tional Conference On Yeast Genetics and Molecular Biology,Sept,17-24,1984,Edinburgh,Scotland,Abstr.P15)的衍生物。它以球形裂殖酵母TPI基因(POT)为选择标记(Russell,P.R.Gene 40(1985),125-130)，并带有酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)启动子和终止子，以控制表达(Alber,T.和Kawasaki,G.J.Mol.Appl.Genet.1(1982),419-434)。
首先把大鼠ITF基因克隆到BluescriptⅡKS(-)(Stratagene)上，由它按图8所示进行繁殖。提供有用的克隆位点的辅助载体pSX54由pUC18和pDN1050组成(Diderichsen,B.,Poulsen,G.B.,Jφrgensen,S.T.Plasmid 30(1993),312-315)。合成的DNA接头Ncol-PfIM1是有如下序列：1858:5’-CATGGCTGAAAGATTGGAAAAGAGACAAGAGTTCGTTGGTTTGT
     CTCCATCCCAATGT-3     58bp1862:5’-TTGGGATGGAGACAAACCAACGAACTCTTGTCTCTTTTCCAAT
     CTTCAGC-3’          51bp
所述接头编码由Thim.L.Norris,K.Norris,F.,Nielsen,P.F.,Bjφrn,S.,Christensen,M.,Petersen所披露的前导序列的C-末端的8个氨基酸(J.FEBS Lett.318,(1993),345-352)，在密码子选择上只有很少的变化，而且大鼠ITF基因的N-末端部分是：QE-FVGLSPSQC。所述信号及前导的氨基酸序列出处同上：MKAVFLVLSLIGFCWAQPVTGDESSVEIPEESLIIAENVTTLANVAMAERLEKR.
将人ITF基因克隆到PUC19上，并按图9所示进行繁殖。合成的DNA接头Ncol-BsaAl具有如下序列：2292:5’-CATGGCTGAAAGATTGGAAAAGAGAGAAGAATAC-3’34bp2287:5’-GTATTCTTCTCTCTTTTCCAATCTTCAGC-3’     30bp
该接头编码如说明rITF的构建时所述的前导序列的C-末端8个氨基酸，还编码hITF基因N-末端的3个氨基酸：EEY。其信号和前导序列同上。
将表达质粒转化入酿酒酵母菌株MT663(E2-7BXE11-36a/α,Δtpi/Δtpi,pep4-3/pep4-3)，在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长进行选择。
表达大鼠ITF和人ITF的酵母转化体分别被命名为HW756和HW1066。发酵
将上述转化体在补充了酵母提取物(60g/L)的酵母胨葡萄糖(YPD)培养基(Sherman等，1981)中，在30℃下培养72小时。当发酵结束时，HW756(rITF)和HW1066(hITF)在660nm处的OD值分别为153和232。发酵结束时用1M磷酸把pH调至2.5，并通过在3000rpm速度下离心15分钟除去酵母细胞。纯化重组rITF
通过分折HPLC测定酵母发酵液和在纯化期间所获得级分里的rITF浓度。将试样(通常为50-200μL)加注到Vydac 214 TP54反相C4HPLC柱(0.46×25cM)上，该柱在30℃、以用在15％(v/v)乙腈中配制的0.1％(v/v)TFA平衡过，流速为1.5ml/分。在等度洗脱10分钟以后，用40分钟时间把洗脱溶剂里的乙腈的浓度提高到55％。在214nm处测光吸收。发现在26.5分钟、27.3分钟和28.2分钟的三个洗脱峰里洗脱的是双体形式的rITF(图2)。用校正的hSP标准曲线(Thim等，1993)对所述肽进行定量分析。
重组rITF在该酵母系统里的表达水平为113mg/L。
通过离心从一个10L的发酵罐中分离8.7L发酵液。用14.8L的蒸馏水将上清液稀释至较低的导电性。以600ml/h的流速把所得样品泵送到一根Fast Flow S-Sepharose(Pharmacia)柱(5×42cM)上。加样之前，该柱在50mM的甲酸缓冲液，pH3.7中平衡过。用含有50mMNacl的50mM甲酸，pH3.7将大鼠ITF从该柱上洗脱。以600mL/h的流速收集100mL级分，并分析其rITF含量。收集上一步中含有rITF的级分(2.3L)，并泵送至Amberchrome(G-71)柱(5×10cM)上。加样以前，该柱以0.5L/h的流速在10mM乙酸铵缓冲液，pH4.8中平衡过。加样以后，用0.5L平衡缓冲液洗涤该柱，并用含有60％(v/v)乙醇的10mM乙酸铵缓冲液(pH4.8)以0.1L/h的流速洗脱。按照其rITF含量收集到10mL级分。通过添加2倍体积的乙醇(99.9％,v/v)把收集液里的乙醇浓度从60％(v/v)提高至87％(v/v)，并通过在-25℃下把所得到的混合物冷却16小时使rITF沉淀。
通过在-25℃下，10,000g离心1小时收集沉淀物，并在室温下将其重新溶解在130ml的20mM甲酸(pH3.0)里。以50mL/h的流速把所得样品泵送到Fast Flow Sp-Sepharose(Phamacia)柱(5×20CM)上，使用前该柱用20mM甲酸(pH3.0)平衡过。用1.5L50mM甲酸(pH3.0)和含有0.5M NaCl的、1.5L甲酸(pH3.0)之间的线性梯度将肽从柱上洗脱。以80mL/h的流速收集级分(10ml)，并测280nm处的光吸收。分析级分中rITF的浓度。收集与rITF相关的级分。通过制备HPLC对大鼠ITF进行进一步提纯。将收集的级分(900ml)泵送至Vydac 214 TP1022C4制备HPLC柱(2.2×25cM)上，该柱在0.1％(v/v)TFA中平衡过。在25℃下以5ml/分的流速将肽洗脱，采用由MeCN/H2O/TFA(10:89.9:0.1,v/v/v)和MeCN/H2O/TFA(65:34.9:0.1,v/v/v)构成的线性梯度液(540ml)。以280nm的波长监测UV吸收，并收集相当于10ml的级分，测其rITF含量。收集含有rITF的级分，并通过真空离心将体积减少至30％。通过冷冻干燥从所得收集液中分离rITF。从8.7L发酵培养基中所得到的rITF总产量为236mg，相当于总纯化产率为24％。纯化重组hITF
在一个与用于rITF的相同的HPLC系统测定酵母发酵液中和在纯化期间所得级分中的hITF浓度。在该系统中，通过质谱法在21.2分钟和27.1分钟发现两个洗脱峰，序列分析表明一个为双体形体的hITF，一个为单体形式的hITF。重组人ITF在该酵母体系中的表达水平为90mg/l。
通过离心，从一个10L发酵罐中分离到8.0L发酵液。用40L的10mM甲酸(pH2.5)将该样品透析3次(每次24小时)。将样品泵送(0.25L/h)到一根SP-Sepharose Fast Flaw(Pharmacia)柱(5×40cM)上。用5L的20mM甲酸(pH2.5)洗涤该柱，并用一种由5L20mM甲酸(pH2.5)和5L含有1MNaCl的甲酸(pH2.5)构成的线性梯度液进行洗脱。收集100mL级分，分析其hITF含量(图3)。从该柱上洗脱两种形式的hITF：一种代表单体形式的hITF(由0.5M NaCl洗脱)，一种代表双体形式的hITF(由0.78M NaCl洗脱)。分别收集与上述两种形式相应的级分。
将每种级分分成3等份(体积约为700ml)，并泵送到在0.1％(v/v)TFA中平衡过的Vydac214 TP1022C4柱(2.2×25cM)上。用MeCN/H2O/TFA(10:89.9:0.1,v/v/v)和MeCN/H2O/TFA(65:34.9:0.1,v/v/v)之间的线性梯度液，以4ml/分的流速把肽洗脱。监测280nm处的UV吸收，收集相当于10ml的级分，分析其hITF含量。
分别收集上一步含有hITF(单体)和hITF(双体)的级分，并把pH调整至3.0。将上述样品分别加至在含有40％(v/v)乙醇的20mM甲酸(pH3.0)中平衡过的SP-Sepharose Hiload 16/10(Phar-macia)柱(1.6×10cM)上。用80ml平衡缓冲液洗涤该柱，并用200ml20mM甲酸(pH3.0)、40％(v/v)乙醇和200ml含有1MNaCl的20mM甲酸(pH3.0)，40％(v/v)乙醇之间的线性梯度溶液以4ml/分的流速进行洗脱。收集级分(5ml)，并分析其hITF含量。
分别收集含有hITF(单体)和hITF(双体)的级分，通过把乙醇浓度调至90％(v/v)和在-25℃下，冷却混合物72小时使肽成分沉淀。离心收集沉淀物，并进行冷冻干燥。从8L发酵液中所得到的总产量为256mg hITF(单体)和133mg hITF(双体)，相当于单体和双体形式的总纯化产率分别为50％和65％。重组rITF和hITF的特征分析
在110℃下，在真空密封试管中用6M HCl水解24、48和96小时之后，在一台Beckman(Model 121MB)自动氨基酸分析仪上对样品(50μg)进行分析。在用三丁基膦还原二硫键以后测定S-β-(4-吡啶乙基)衍生物形式的半-胱氨酸(Rüegg和Rudinger,1974)，随后用乙烯吡啶偶联(Friedman等，1970)。按上述条件，在110℃下用4M甲磺酸或3M巯基乙磺酸水解4-乙烯吡啶处理过的样品24小时。通过自动Edman降解法，用一台Applied BiosystemsModel 470A气相测序仪进行氨基酸序列分析(Thim等，1987)。
有一台APIⅢLC/MS/MS系统进行质谱法分析(Sciex,Thorn-hill,Ont.,加拿大)。这种三元四极装置的质荷比(m/z)为2400，并装配有一个气动电喷射(又被称为离子喷射)界面(Bruins等，1987；Covey等，1988)。由一个注射灌输泵(Sage Instruments,Cambridge,MA)经熔融毛细管(内径75μm)加注样品，液体流速设为0.5-1μl/分。在同一分辨度下，用聚丙二醇(PPGs)单电荷铵加合离子校正该装置的m/z比。这种质谱测量的准确度通常优于0.02％。
图4表示在纯化的rITF(图4A)和hITF(图4B和4C)上获得的分析HPLC层析谱。重组rITF含有由3种密切相关的肽组成的混合物，并不打算将这3种形式的肽分离。在用电喷射质谱法进行分析时，发现3种优势分子量，相当于13112.2,13096.6和13078.8(图5A)。单体形式的大鼠ITF(其中Cys-57带有一个自由的-SH基)的计算分子量为6558.3。双体形式的大鼠ITF(例如，在两个Cys-57之间形成S-S键)的计算分子量为13114.6。由所发现的重组大鼠ITF的分子量可以清楚地看出，所有3种肽均为rITF的双体形式。从其N-末端氨基酸残基为Gln的其它三叶形肽，如PSP(Thim等，1985；Tomasetto等，1980)得知，该残基有环化形成吡咯烷酮羧酸(pyrGlu)的倾向。就其预计N-末端序列为Gln-Glu-Phe-Val-Gly的大鼠ITF而言，有理由认为其N-末端Gln也会环化形成pyrGlu。这种衍生作用，可分别导致大鼠ITF(双体)的分子量下降17(一个pyrGlu)或34(两个pyrGlu)个质量单位。所观察到的分子量13096.6和13078.8(图5A)分别相当于其中一个或两个N-末端Gln残基被环化的双体形式rITF。所述形式rITF的计算分子量为13097.6和13080.6，能很好地吻合所得实验测定值。因此，通过HPLC(图4A)和质谱分析(图5A)可得出这样的结论，重组的大鼠ITF由3种不同的双体形式构成：一种含有2个N-末端(Gln，另一种含有1个N-末端Gln和一个N-末端pyrGlu，再一种含有2个N-末端pyrGlu。表Ⅰ所示的大鼠ITF氨基酸组成与预期值十分吻合。
图5A和5B分别表示通过分析HPLC分析出的hITF(单体)和hITF(双体)的纯度。双体形式(图5C)看起来比较纯，但单体形式(图5B)似乎混杂了洗脱肽之前的材料。不过，在对主峰洗脱材料进行再次层析时，获得了类似的层析谱(结果未示出)。这似乎表明，它是hITF(单体)在反相柱上的一种异常表现，而不是纯度不够。以前，我们还观察到了高度纯化的猪PSP及高度纯化的重组hSP具有类似行为(Thim等，1993)。
对hITF(单体)进行质谱分析观察到一个优势峰相当于6694.0的分子量(图5B)。从氨基酸序列(图1)计算出该分子量为6574.4，表明Cys-57是以-SH形式存在。氨基酸序列分析(表Ⅱ)证实了预期的N-末端序列：Glu-Glu-Tyr-Val-Gly-。氨基酸组成分析(表Ⅰ)证实了预期值，不同的是出现了7.3(8)个半胱氨酸。另一个与hITF单体的Cys-57相连的半胱氨酸，可把分子量提高到6694.7，这一数字与质谱法测得的值(6694.0)极为接近。因而可以断定在hITF(单体)上，Cys-57通过一个二硫键与另一个半胱氨酸连接。质谱中的次分子量峰(图5B)可能代表Cys-57的另一衍生物，或是制剂中的杂质。
hITF(双体)(其中，两个单体通过两个Cys-57残基之间的二硫键连接)的计算分子量为13146.8。这一数字与质谱法测得的值(13147，图5C)极为吻合。质谱中的另一峰(13169)或许代表Na+加合的hITF(双体)。序列分析(表Ⅰ)及氨基酸组成分析(表Ⅱ)也都与预期值十分吻合。表Ⅰ大鼠ITF(双体)，人ITF(单体)和人ITF(双体)的氨基酸组成
氨基酸     大鼠ITF(双体)          人ITF(单体)          人ITF(双体)
AsxThraSeraGlxProbGlyAlaValMetIleLeuTyrbPheLysHisTrpArgPE-Cysb  11.928.009.8615.9812.486.022.0411.921.801.983.922.027.882.140.002.163.9412.70     (12)(8)(10)(16)(12)(6)(2)(12)(2)(2)(4)(2)(8)(2)(0)(2)(4)(14)     6.002.032.046.92n.d.c4.203.914.920.001.172.031.942.933.070.99n.d.c2.967.30     (6)(2)(2)(7)(6)(4)(4)(5)(0)(1)(2)(2)(3)(3)(1)(1)(3)(7)     12.014.014.0114.00n.d.c8.097.909.860.002.133.993.925.946.092.03n.d.c6.0513.80     (12)(4)(4)(14)(12)(8)(8)(10)(0)(2)(4)(4)(6)(6)(2)(2)(6)(14)
    总计     (118)     (59)     (118)
括号中的值是由cDNA推算出来的：大鼠ITF(Chinery等，1992)，人ITF(Hauser等，1993)。
a)在水解的零时刻推测
b)通过在4M甲磺酸中水解测得
c)未测定表Ⅱ大鼠ITF(双体)，人ITF(单体)和人ITF(双体)的自动Edman降解
轮数      大鼠ITF(双体)         人ITF(单体)     人ITF(双体)
  PTA-A.A.    产量(pmol)    PTH-A.A.     产量(pmol)         产量(pmol)
 123456789101112134015161718192021     GlnGluPheValGlyLeuSerProSerGln(Cys)MetValProAlaAsnValArgValAsp(Cys)     9897319671072701838497965406820n.d.581971962529791952331956476n.d.     GluGluTyrValGlyLeuSerAlaAsnGln(Cys)AlaValProAlaLysAspArgValAsp(Cys)     151719982205240916252318852172913941494n.d.124314681223124812709378911002847n.d.     GluGluTyrValGlyLeuSerAlaAsnGln(Cys)AlaValProAlaLysAspArgValAspCys     222723612528243118032253904171215181499n.d.137713561195124910509919641069932n.d.
表Ⅱ(续)大鼠ITF(双体)，人ITF(单体)和人ITF(双体)的自动Edman降解)
轮数         人ITF(双体)        人ITF(单体)    大鼠ITF(双体)
PTA-A.A. 产量(pmol) PTH-A.A. 产量(pmol)     产量(pmol)
    22232425262728293031323334353637383940     GlyTyrProThrValThrSerGluGln(Cys)AsnAsnArgGly(Cys)(Cys)PheAspSer     381352927498812510225398499n.d.557591196222n.d.n.d.335275164     GlyTyrProHisValThrProLysGlu(Cys)AsnAsnArgGly(Cys)(Cys)PheAspSer     709894766309755505458444219n.d.312464325239n.d.n.d.18913349     GlyTyrProHisValThrProLysGlu(Cys)AsnAsnArgGly(Cys)(Cys)PheAspSer     703792701236670576473321304n.d.300503294223n.d.n.d.17413743
    R.Y.    97.0％    93.2％    92.5％
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Claims (12)

1．一种带有单一三叶形结构域的三叶形肽的双体，其中所述三叶形肽是肠道三叶形因子(ITF)或乳腺癌相关肽(pS2)。
2．如权利要求1的双体，其中所述三叶形肽是肠道三叶形因子(ITF)。
3．如权利要求2的双体，其中所述ITF是人ITF。
4．如权利要求2的双体，其近似分子量为13000。
5．如权利要求2的双体，其中所述ITF双体是由两个ITF单体组成，两个单体是通过在每个单体位置57上的两个半胱氨酸残基之间的二硫键连接在一起。
6．如权利要求1的双体，其中所述三叶形肽是乳腺癌相关肽(pS2)。
7．如权利要求6的双体，其中所述pS2是人pS2。
8．如权利要求7的双体，其中所述pS2双体是由两个pS2单体组成，两个单体是通过在每个单体的位置58上的两个半胱氨酸残基之间的二硫键连接在一起。
9．一种制备权利要求1的双体的方法，该方法包括在有利于这种肽表达的条件下培养用编码一种带有一个三叶形结构域的三叶形肽的DNA序列转化的合适宿主细胞，以及从培养物中回收所得到的三叶形肽双体。
10．一种药物组合物，含有权利要求1的双体以及一种可以药用的稀释剂或媒介物。
11．如权利要求10的药物组合物，含有权利要求2-8中任一项所述的双体。
12．权利要求1的双体在制备预防或治疗胃肠道疾病的药物中的用途。
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