JP2007161720A - 三つ葉状のペプチド2量体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ラットおよびヒトで見いだされた、腸の三つ葉状因子および乳癌ペプチドからなる、1つの三つ葉状単量体をコードする、特定の塩基配列で形質転換された適当な宿主細胞、たとえば酵母細胞を、上記ペプチドの生産を許容する条件下で培養し、セファロース等のクロマトグラフィーで精製し回収することにより製造する。
【選択図】図6
Description
ZEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKP
LQEAECTF (配列番号1)
(式中、ZはGlu, GlnまたはpyrGlu) もしくは2量体化可能で同様な活性を示すその同族体またはヒトのpS2単量体状アミノ酸配列であって、
ZAQTETCTVAPRERQNCGFPGVTPSQCANKGCCFDDTVRGVPWCFYPNTID
VPPEEECEF (配列番号2)
(式中、ZはGlu, GlnまたはpyrGlu) もしくは2量体化可能で同様な活性を示すその同族体である。
例
物質及び方法
ラットのITF(rITF) 及びヒトのITF(hITF) のクローン化
ラット及びヒトの ITFのクローン化を国際特許出願公開第92/14837 号に記載されたように及び Suemori他 (1991年) 及び Chinery他 (1992年)(ラットのITF)並びにPodolsky他 (1993年) 及びHauser他 (1993年)(ヒトのITF)により記載されたように実施した。
rITF及びhITF発現プラスミドの構築
ラットの ITFの分泌のための発現プラスミドpHW756及びヒトの ITFの分泌のための発現プラスミド pHW1066を図7〜9に概説したように構築した。酵母発現ベクターpKFN1003 (国際特許出願公開90/10075 号に記載されている)はプラスミドCPOT(Kawasaki, G「International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology」1984年9月17日〜24日、エジンバラ・スコットランド要約第15頁)の誘導体である。それは選択マーカーとしてのシゾサッカロミセス ポンベ TPI遺伝子(POT) (Russell, P.R.「Gene」40 (1985 年) 第 125〜130 頁) 及び発現の調節のためにS.セレビシアエトリホースホスフェート イソメラーゼ(TPI) プロモーター及びターミネーターを有している (Alber, T及びKawasaki, G.「J. Mol. Appl. Genet.」1 (1982年) 第 419〜434 頁) 。
1858: 5′-CATGGCTGAAAGATTGGAAAAGAGACAAGAGTTCGTTGGTTTGT
CTCCATCCCAATGT-3′58bp (配列番号3)
1862: 5 ′-TTGGGATGGAGACAAACCAACGAACTCTTGTCTCTTTTCCAAT
CTTTCAGC- 3′ 51bp (配列番号4)
前記リンカーはコドンの選択にいくつかの変化を有するThim, L., Norris, K., Nielsen, P.F., Bjorn, S., Christensen, M., Petersen J.の「FEBS Lett.」318 (1993年) 第 345〜352 頁に記載されたリーダー配列のC−末端8−アミノ酸及びラットの ITF遺伝子N−末端部、すなわち QEFVGLSPSQCをコードしている。シグナル及びリーダーのアミノ酸配列は同所に記載されている。
ヒトの ITF遺伝子を PUC19中にクローン化し、図9に記載したように増殖させた。合成DNA リンカーNcol1−BsaAl は次の配列を有している。
2292: 5′-CATGGCTGAAAGATTGGAAAAGAGAGAAGAATAC-3′ 34bp (配列番号6)
2287: 5′-GTATTCTTCTCTCTTTTCCAATCTTTCAGC-3′ 30bp (配列番号7)
前記リンカーはrITF構築について記載されたC−末端8−アミノ酸のリーダー及びhITF遺伝子のN−末端3アミノ酸: EEYをコードする。シグナル及びリーダーは上記と同じである。
発酵
上記形質転換体を追加の酵母抽出物 (60g/L)を補足した酵母ペプトンデキストロース(YPD) 培地(Sherman他、1981年) 中で30℃で72時間培養した。発酵の終りに 660nmでのOD価はHW756(rITF) 及びHW1066 (hITF) について、それぞれ、 153及び 232に達した。発酵の終りにpHを1Mリン酸で 2.5に調整し、酵母細胞を 3000rpm、15分間の遠心分離により除去した。
組換えrITFの精製
酵母発酵肉汁培地及び精製の間に得られた分画におけるrITFの濃度を分析的HPLCにより測定した。30℃で平衡化されたVydac214TP54逆相C4 HPLC カラム (0.46×25cm) にアリコート (通常50〜200 μL) を15%(v/v)のアセトニトリル中の 0.1% (v/v)の TFAと共に流量 1.5mL/分で注入した。10分間の定組成溶離の後、溶離溶媒中のアセトニトリルの濃度は40分にわたって55%に上昇した。吸収は 214nmで測定した。26.5分、27.3分及び28.2分で溶離する3つのピーク(図2)はrITFの2量体型を表わすことを見い出した。計算された hSP標準 (Thim他、1993年) を用いて、そのペプチドの量を測った。
組換えhITFの精製
酵母発酵肉汁培地及び精製の間に得られた分画中のhITFの濃度をrITFについて記載したものと同一のHPLC系で測定した。この系においては、質量スペクトル及びシークエンス分析により、2つの溶離ピークが21.2分及び27.1分で見い出され、hITFの2量体型及び単量体型を表わす。この酵母系における組換えヒト ITFの発現レベルは90mg/Lであった。
組換えrITF及びhITFの特徴づけ
真空密封管内で6M HClで 110℃で24、48、96時間、加水分解後、試料 (50μg) をベックマン (Model 121 MB) 自動アミノ酸分析機で分析した。半−シスチンを、トリブチルホスフィンによるジスルフィド結合の還元(Rueegg及びRudinger、1974年) に続く4−ビニルピリジンを用いるカップリング (Friedman他、1970年) 後、S−β−(4−ピリジルエチル)誘導体として測定した。4−ビニルピリジン処理試料の加水分解を4Mメタンスルホン酸または3Mメルカプトエタンスルホン酸により、 110℃で24時間上記のように実施した。アミノ酸配列分析をApplied Biosystems Model 470A 気相シークエンサーを用いて自動化エドマン分解によって測定した (Thim他、1987年) 。
Claims (10)
- 各々が唯一の三つ葉状のドメインを含む2つの三つ葉状のペプチド単量体を含む三つ葉状のペプチドの2量体であって、前記単量体は2つのシステイン残基の間のジスルフィド結合によって結合されている前記2量体。
- 前記三つ葉状のペプチド単量体が腸の三つ葉状の因子(ITF)及び乳がんに関係するペプチド(pS2)からなる群から選択されるものである請求項1に記載のペプチド。
- 2つの ITF単量体の2量体である請求項2に記載のペプチド。
- 前記 ITF単量体がヒトの ITF単量体である請求項3に記載のペプチド。
- 分子量が約 13000である請求項3に記載のペプチド。
- 前記 ITF2量体が、各単量体の位置57における2つのシステイン残基の間のジスルフィド結合によって結合されている請求項3に記載のペプチド。
- 2つのpS2単量体の2量体である請求項2に記載のペプチド。
- 前記pS2単量体がヒトのpS2単量体である請求項7に記載のペプチド。
- 前記pS22量体が、各単量体の位置58における2つのシステイン残基の間のジスルフィド結合によって結合されている請求項7に記載のペプチド。
- 各々が唯一の三つ葉状のドメインを含む2つの三つ葉状のペプチド単量体を含む三つ葉状のペプチドの2量体を製造する方法であって、1つの三つ葉状単量体をコードする DNA配列で形質転換された適当な宿主細胞をそのペプチドの生産を許容する条件下で培養し、その培養から結果として生ずる三つ葉状のペプチドを回収することを含む前記方法。
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