FI119989B - Apilapeptididimeeri, menetelmä sen valmistamiseksi ja tällaisen dimeerin sisältävä farmaseuttinen koostumus sekä sen käyttö - Google Patents

Description

Apilapeptididimeeri, menetelmä sen valmistamiseksi ja tällaisen dimeerin sisältävä farmaseuttinen koostumus sekä sen käyttö - Klöverpeptiddimer, förfarande för framställning av densamma och farmaceutisk komposition innehällande en dylik dimer samt användning av densamma 5

Keksinnön ala

Esillä oleva keksintö koskee apilapeptididimeerejä, menetelmää apilapeptidien dimeerien valmistamiseksi, farmaseuttista koostumusta, joka sisältää apilapeptididimeerejä ja niiden käyttöä gastrointestinaalialueen häiriöiden hoitamiseen.

10

Keksinnön tausta

Apilapeptidit muodostavat peptidiperheen, jota esiintyy pääasiassa gastrointestinaalialueen yhteydessä. Nisäkkään apilapeptidit sisältävät yhden tai useamman karakteristisen apiladomainin (Thim et ai., 1989), joista jokainen muodostuu 38 tai 15 39 aminohappotähteen sekvenssistä, jossa 6 puolikystiinitähdettä on kytkeytynyt konfiguraatioon 1-5, 2-4 ja 3-6 muodostaen siten tunnusomaisen apilarakenteen (kolmilehtirakenteen) (Thim, 1989).

Tällä hetkellä tunnetut nisäkkään apilapeptidit sisältävät joko yhden tai kaksi api- • · ['I, ladomainia (katsauksen saamiseksi katso Thim, 1994; Poulsom & Wright, 1993; • · · .1 ' 20 Hoffmann & Hauser, 1993), kun taas sammakon Xenopus laevis peptidien ja pro- • · ·*..]’ teiinien on kuvattu sisältävän yhden (Hauser & Hoffmann, 1991), kaksi (Hauser et !*··* ai., 1992a), neljä (Hoffmann, 1988) tai kuusi (Hauser & Hoffmann, 1992b) apila- : *** domainia. Nisäkkään apilapeptidit, jotka sisältävät yhden domainin, ovat rinta- • · · : syöpään liittyvä pS2 peptidi, joka toistaiseksi tunnetaan ihmisestä (Jakowlev et ai., 25 1984, Prud'homme et ai., 1985) ja hiirestä (Lefebvre et ai., 1993), ja intestinaa- : V: liapilatekijä, joka toistaiseksi tunnetaan ihmisestä (Podolsky et ai., 1993; Hauser et :***: ai., 1993) ja rotasta (Suemori et ai., 1991; Chinery et ai., 1992). Spasmolyyttinen ··♦ .· . polypeptidi (SP), joka sisältää kaksi apiladomainia, on kuvattu ihmisestä • · ♦ *· *j (Tomasetto et ai., 1990), siasta (Thim et ai., 1982) ja hiirestä (Tomasetto et ai., \ * 30 1990). Ihmisissä kolme apilapeptidiä hpS2, hITF ja hSP ilmentyvät kaikki nor- ·:·*: maaleissa olosuhteissa maha-suolialueella: hSP ja hps2 mahan epiteelilimakalvo- ·:··· kerroksessa (Tomasetto et ai., 1990; Rio et ai., 1988) ja hITF ohutsuolen ja pak susuolen epiteelilimakalvokerroksessa (Podolsky et ai., 1993).

2

Apilapeptidien fysiologista toimintaa ei ymmärretä kovin hyvin. Apilapeptidien lisääntyneen ilmentymisen gastrointestinaalialueella on raportoitu useissa tiloissa aikaansaavan limakalvovaurioita, kuten suolitulehdusta (Rio et ai., 1991; Poulsom et ai., 1992; Wright et ai., 1993) ja haavautumista mahassa ja pohjukaissuolessa 5 (Rio et ai., 1991; Hanby et ai., 1993; Wright et ai., 1990). Onkin esitetty, että apilapeptidien tehtävänä olisi limakalvojen korjaaminen (esimerkiksi Wright et ai., 1993). Näyttöä siitä, että apilapeptidit edistävät limakalvon epiteelin korjaantumista vaurion jälkeen, ovat viime aikoina esittäneet Dignass et ai., 1994, Playford et ai., 1994 ja Babyatsky et ai., 1994. Mekanismi, jolla apilapeptidit edistävät kor-10 jaustehtäväänsä, saattaa olla musiini-glykoproteiinien ristikytkentä, jolloin muodostuu visko-elastinen geelikerros, joka sietää ruoansulatusentsyymejä (Thim, 1994; Gajhede et ai., 1993).

Rotan ja ihmisen yksidomainisen intestinaalisen apilatekijän kloonausta ja intesti-naalisen apilatekijän käyttöä gastrointestinaalialueen vaurioissa kuvataan julkai-15 sussa WO 92/14837.

Yhteenveto keksinnöstä

Nyt on todettu mahdolliseksi valmistaa apilatekijöiden dimeerejä, joissa on aino- ;v, astaan yksi apiladomaini ja joilla on mielenkiintoisia farmakologisia ominaisuuksia.

• · • · • · :Λ: 20 Esillä oleva keksintö koskeekin apilapeptididimeeriä, joka on apilapeptidi- :**·· monomeerin dimeerimuoto, joka monomeeri sisältää yhden ainoan apiladomainin.

• · · • · • ·

Kuten edellä mainittiin, apilapeptidien uskotaan olevan myötävaikuttamassa pep- \.l* tisten haavautumien ja muiden limakalvovaurioiden korjautumisessa stabiloimalla • · · maha-suolialueen limakalvokerrosta. Tämän stabilisoinnin mekanismia ei tällä het-25 kellä tunneta. Sian haiman spasmolyyttisen polypeptidin (PSP), jossa on kaksi • · apiladomainia, röntgenrakenne (vrt. Gajhede et ai., 1993) kuitenkin osoittaa, että • φ · suurin osa säilyneistä tähteistä on myötävaikuttamassa 8-10 Ä:n halkeamassa, .·. : jota todettiin kummassakin apiladomainissa. Alustavat telakointikokeet ovat .[..I osoittaneet, että halkeamassa voisi olla osa jostakin oligosakkaridiketjusta, esi- • · . 30 merkiksi hiilihydraatti, joka on liittynyt musiiniglykoproteiiniin. Mikäli näin on, PSP, jossa on kaksi sellaista halkeamaa, saattaa ristisitoa musiineja auttaen niitä muo-dostamaan suojaavan geelin limakalvon epiteelille. Tällä hetkellä ei tiedetä, muodostavatko apilapeptidit, joissa on yksi apiladomaini (kuten ITF ja pS2), dimeerejä 3 in vivo samanlaista toimintaa varten vai onko niillä jokin erilainen toimintamekanismi. Tällä hetkellä kuitenkin uskotaan, että sellaisten apilapeptidien dimeerit todellakin saattavat ristikytkeä musiineja ja sen vuoksi olla peptidien aktiivisia muotoja.

5 Erään toisen aspektinsa mukaan esillä oleva keksintö koskee menetelmää apila-peptididimeerin valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista, että se on apilapeptidi-monomeerin dimeerimuoto, joka monomeeri sisältää yhden apiladomainin, jossa menetelmässä viljellään jotakin sopivaa isäntäsolua, joka on transformoitu DNA-sekvenssillä, joka koodaa apilapeptidimonomeeriä, joka sisältää yhden ainoan 10 apiladomainin, olosuhteissa, jotka tekevät mahdolliseksi peptidin tuotannon, saatu apilapeptidimonomeeri ja apilapeptididimeeri erotetaan viljelmästä kromatografisella menetelmällä, ja apilapeptididimeeri otetaan talteen.

Vielä erään toisen aspektin mukaan esillä oleva keksintö koskee farmaseuttista koostumusta, joka käsittää apilapeptidi-dimeerin, jolle on tunnusomaista, että se 15 on apilapeptidimonomeerin dimeerimuoto, joka monomeeri sisältää yhden ainoan apiladomainin, yhdessä jonkin farmaseuttisesti hyväksyttävän laimentimen tai kantajan kanssa.

Lisäksi keksintö koskee apilapeptididimeerin, jolle on tunnusomaista, että se on ·*·*; apilapeptidimonomeerin dimeerimuoto, joka monomeeri sisältää yhden ainoan • · 20 apiladomainin, käyttöä valmistettaessa gastrointestinaalisten häiriöiden ehkäisyyn tai hoitoon tarkoitettua lääkettä.

• · · • · ·

Keksintö koskee lisäksi apilapeptididimeeriä, jolle on tunnusomaista se, että se on • · : *·· apilapeptidimonomeerin dimeerimuoto, joka monomeeri sisältää yhden ainoan :T: apiladomainin, käytettäväksi lääkkeenä sekä apilapeptididimeeriä, jolle on tun- 25 nusomaista se, että se on apilapeptidimonomeerin dimeerimuoto, joka monomeeri :y. sisältää yhden ainoan apiladomainin, käytettäväksi gastrointestinaalisten häiriöi- • · .···. den ehkäisyyn tai hoitoon.

• · · • · • · · • ·«

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus • · ·:··· 30 Apilatekijän dimeeri voi erityisesti olla intestinaalisen apilatekijän (ITF) tai rin- tasyöpään liittyvän peptidin (pS2) dimeeri.

4

Erityisesti apilatekijä on ihmisen ITF, jonka monomeerinen aminohapposekvenssi on

ZEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKPLQ

EAECTF

5 jossa Z on Glu, Gin tai pyrGlu, tai jokin sen homologi, joka kykenee dimerisoitu-maan ja jolla on samanlainen aktiivisuus; tai ihmisen pS2, jonka monomeerinen aminohapposekvenssi on

ZAQTETCTVAPRERQNCGFPGVTPSQCANKGCCFDDTVRGVPWCFYPNTIDVP

PEEECEF

10 jossa Z on Glu, Gin tai pyrGlu, tai jokin sen homologi, joka kykenee dimerisoitumaan ja jolla on samanlainen aktiivisuus.

ITF:n ja pS2:n homologeilla on sama kysteiinimalli ja d isu If id ijä rjesty s (kuvio 1) ja niillä on tietty sekvenssihomologia (ymmärretään tarkoittavan joko identtisiä 15 aminohappoja vastaavissa asemissa tai konservatiivisia substituutioita) silmukassa 1, 2 ja 3. Sekvenssihomologia voi silmukka-alueilla vaihdella 1-10 aminohappotähteeseen ja aminohappotähteiden lukumäärä kussakin silmukassa (kyste- • · · : V iinejä lukuun ottamatta) voi vaihdella 7 -12, edullisesti 9 -10.

• · • · · • · # ITF- tai pS2-homologeilla voi olla yksi tai useampi aminohapposubstituutio, -delee- • ·· 20 tio tai additio. Nämä muutokset ovat edullisesti luonteeltaan sellaisia, että substi- • · [·*·* tuutiot eivät merkittävästi vaikuta proteiinin laskostumiseen tai aktiivisuuteen.

• ·

Pieniä muutoksia ovat tyypillisesti 1 - noin 3 aminohappoa silmukka-alueilla ja 1 -: noin 10 aminohappoa N-ja C-terminaalisilla alueilla; yksittäiset amino- tai karbok- syylipään pidennykset, kuten aminopään metioniinitähde, pieni, enintään noin 10 • · 25 tähteen pituinen kytkijäpeptidi tai pieni pidennys, joka helpottaa puhdistamista, kuten polyhistidiinialue, antigeeniepitooppi tai sidontadomaini. Katso yleensä Ford : et ai., Protein Expression and Purification 2; 95-107, 1991. Esimerkkejä konserva- • · · * I tiivisista substituutioista on emäksisten aminohappojen (kuten arginiini, lysiini, histidiini), happamien aminohappojen (kuten glutamiinihappo ja asparagiinihappo), *:**: 30 poolisten aminohappojen (kuten glutamiini ja asparagiini), hydrofobisten amino- *:*·: happojen (kuten leusiini, isoleusiini, väliini), aromaattisten aminohappojen (kuten 5 fenyylialaniini, tryptofaani, tyrosiini) ja pienten aminohappojen (kuten glysiini, ala-niini, seriini, treoniini, metioniini) ryhmässä.

Alan ammattilaisille on selvää, että sellaisia substituutioita voidaan tehdä muille alueille kuin niille, jotka ovat kriittisiä molekyylin toiminnan kannalta, ja silti tulok-5 sena on aktiivinen polypeptidi. Aminohapot, jotka ovat olennaisia esillä olevan apilapeptidin aktiivisuuden kannalta ja joihin ei sen vuoksi edullisesti tehdä korvauksia, voidaan tunnistaa alalla tunnetuilla menetelmillä, kuten ohjatulla mutageneesilla tai alaniini-pyyhkäisymutageneesilla (Cunningham ja Wells, Science 244, 1081-1085, 1989). Viimeksi mainitussa menetelmässä mutaatiot 10 viedään jokaiseen tähteeseen molekyylissä ja tuloksena olevien mutanttimolekyy-lien biologinen aktiivisuus (esimerkiksi limakalvojen parantaminen, limakalvojen suojaaminen, mahahaavan parantaminen) testataan sellaisten aminohappotähteiden tunnistamiseksi, jotka ovat kriittisiä molekyylin aktiivisuuden kannalta.

Homologi voi olla jokin alleelinen variantti, so. jokin vaihtoehtoinen muoto geenis-15 tä, joka syntyy mutaation kautta, tai jokin muuttunut peptidi, jota mutatoitu geeni koodaa, mutta jolla on olennaisesti sama aktiivisuus kuin esillä olevalla peptidillä. Mutaatiot voivat siis olla hiljaisia (ei muutoksia koodatussa peptidissä) tai ne voivat koodata peptidejä, joilla on muuttunut aminohapposekvenssi.

Esillä olevan apilapeptidin homologi voi olla myös jokin lajihomologi, so. polypep-20 tidi, jolla on samanlainen aktiivisuus, mutta joka on johdettu jostakin toisesta la- • · · :*.* jista, esimerkiksi hiirestä, rotasta, kaniinista, lehmästä, siasta tai sammakosta.

• · · • · ·

Eräässä edullisessa toteutusmuodossa keksinnön mukaisen apilapeptididimeerin ·**.. likimääräinen molekyylipaino on 13 000. Dimeeri muodostuu kahdesta apilapep- :T: tidimonomeerista, jotka on kytketty disulfidisillalla kahden kysteiinitähteen väliin 25 ITF:n kaltaisten monomeerien asemaan 57 tai pS2:n kaltaisten monomeerien ase-maan 58.

• · · • · • · · '···’ Apilapeptididimeeri valmistetaan edullisesti yhdistelmä-DNA-menetelmillä. Tätä tarkoitusta varten apilapeptidiä koodaava DNA-sekvenssi voidaan eristää valmis- • · tamalla genominen tai cDNA-kirjasto ja seulomalla DNA-sekvenssejä, jotka koo-* . 30 daavat koko peptidiä tai osaa siitä, hybridisaation avulla käyttämällä synteettisiä [ oligonukleotidikoettimia standardimenetelmien mukaan (vrt. Sambrook et ai.,

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Esillä olevaa tarkoitusta varten peptidiä koo- 6 daava DNA-sekvenssi on edullisesti peräisin ihmisestä, so. johdettu ihmisen ge-nomisesta DNA- tai cDNA-kirjastosta.

Apilapeptidiä koodaava DNA-sekvenssi voidaan valmistaa myös synteettisesti vakiintuneilla standardimenetelmillä, esimerkiksi fosfoamidiittimenetelmällä, jota 5 Beaucage ja Caruthers ovat kuvanneet julkaisussa Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869, tai menetelmällä, jota Matthes et ai. ovat kuvanneet julkaisussa EMBO Journal 3 (1984), 801-805. Fosfoamidiittimenetelmässä oligonukleotidit syntetisoidaan esimerkiksi automaattisessa DNA-syntetisaattorissa, puhdistetaan, lämpökäsitellään, ligatoidaan ja kloonataan sopivissa vektoreissa.

10 DNA-sekvenssi voidaan myös valmistaa polymeraasiketjureaktiolla käyttämällä spesifisiä alukkeita, esimerkiksi kuten kuvataan US-patentissa 4 683 202, Saiki et ai., Science 239 (1988), 487-491, tai Sambrook et ai., supra.

Apilapeptidiä koodaava DNA-sekvenssi insertoidaan tavallisesti johonkin rekom-binanttivektoriin, joka voi olla mikä tahansa vektori, joka soveltuu yhdistelmä-DNA-15 käsittelyihin, ja vektorin valinta riippuu usein isäntäsolusta, johon se on määrä in-sertoida. Niinpä vektori voi olla jokin itsenäisesti replikoituva vektori, so. vektori, joka on olemassa kromosomin ulkopuolisena yksikkönä, jonka replikoituminen on riippumatonta kromosomin replikoitumisesta, esimerkiksi jokin plasmidi. Vaihto-ehtoisesti vektori voi olla sellainen, että kun se viedään johonkin isäntäsoluun, se 20 integroituu isäntäsolun genomiin ja replikoituu yhdessä kromosomi(e)n kanssa, • · · .·*/ johon se on integroitu.

• · · • ··

Vektori on edullisesti ilmentämisvektori, jossa apilapeptidiä koodaava DNA-sek- venssi on toiminnallisesti liittynyt lisäsegmentteihin, jotka tarvitaan DNA:n trans- :T: skriptiota varten. Yleensä ilmentämisvektori johdetaan plasmidi- tai virus-DNA:sta 25 tai se voi sisältää osia kummastakin. Termi "toiminnallisesti liittynyt" tarkoittaa, että segmentit ovat järjestäytyneet siten, että ne toimivat yhdensuuntaisesti aiottujen .···. tarkoitusten hyväksi, esimerkiksi transskriptio alkaa jossakin promoottorissa ja ete- • · *·' nee polypeptidiä koodaavan DNA-sekvenssin läpi.

• · · • · · • ·

Promoottori voi olla mikä tahansa DNA-sekvenssi, jolla on transskriptioaktiivisuutta • . 30 valitussa isäntäsolussa ja se voidaan johtaa geeneistä, jotka koodaavat joko j isäntäsolun kanssa homologisia tai heterologisia proteiineja.

• · 7

Esimerkkejä sopivista promoottoreista apilapeptidiä koodaavan DNA:n transkription ohjaamiseksi nisäkässoluissa ovat SV40-promoottori [Subramani et ai., Mol. Cell Biol. 1 (1981) 854-864], MT-1 (metallotioneiinigeeni)promoottori [Palmiter et ai., Science 222 (1983), 809-814] tai adenovirus-2:n suurempi myöhäinen pro-5 moottori.

Eräs esimerkki sopivasta promoottorista käytettäväksi hyönteissoluissa on poly-hedriinipromoottori [US 4,745,051; Vasuvedan et ai., FEBS Lett. 311 (1992) 7-11], P10-promoottori (J.M. Vlak et ai., J. Gen. Virology 69, 1988, ss. 765-776), Auto-grapha califomica polyhedroosiviruksen emäksinen proteiinipromoottori 10 (EP 397 485), baculoviruksen välitön varhainen geeni 1 -promoottori (US 5,155,037; US 5,162,222) tai baculovirus 39K viivästynyt varhainen geenipro-moottori (US 5,155,038; US 5,162,222).

Esimerkkejä sopivista promoottoreista käytettäviksi hiivaisäntäsoluissa ovat hiivan glykolyyttisistä geeneistä [Hitzeman et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-15 12080; Alber ja Kawasaki, J. Mol. Appi. Gen. 1 (1982), 419-434] tai alkoholidehyd- rogenaasigeeneistä [Young et ai., julkaisussa Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et ai., toim.), Plenum Press, New York, 1982] peräisin olevat promoottorit tai TPI1-promoottori (US 4,599,311) tai ADH2-4c -promoottori [Russell et ai., Nature 304 (1983) 652-654).

·· · • · · • · !·.·. 20 Esimerkkejä sopivista promoottoreista käytettäviksi rihmasieni-isäntäsoluissa ovat esimerkiksi ADH3-promoottori [McKnight et ai., The EMBO J. 4 (1985) 2093-2099] *... tai tpiA-promoottori. Esimerkkejä muista käyttökelpoisista promoottoreista ovat • · [;··* sellaiset, jotka on johdettu geenistä, joka koodaa A. oryzae TAKA amylaasia, • · • ** Rhizomucor miehei asparagiinihappoproteinaasia, A. niger neutraalia a-amy- • · · : 25 laasia, A. niger happostabiilia a-amylaasia, A. niger tai A. awamori glukoamy- laasia (gluA), Rhizomucor miehei lipaasia, A. oryzae alkalista proteaasia, A. ory-zae trioosifosfaatti-isomeraasia tai A. nidulans asetamidaasia. Edullisia ovat • · TAKA-amylaasi- ja gluA-promoottorit. Sopivia promoottoreita mainitaan esimer- .* . kiksi EP 238 023:ssa ja EP 383 779:ssä.

• · · • · *:**: 30 DNA-sekvenssi, joka koodaa apilapeptidiä, voi myös tarpeen vaatiessa olla toi- minnallisesti liittynyt johonkin sopivaan terminaattoriin, kuten ihmisen kasvuhor- • · moniterminaattoriin (Palmiter et ai., Science 222, 1983, ss. 809-814) tai (sieni- isäntien ollessa kysymyksessä) TPI1-terminaattoriin (Alber ja Kawasaki, J. Mol.

• · 8

Appln. Gen. 1, 1982, ss. 419-434) tai ADH3-terminaattoriin (McKnight et al., The EMBO J. 4, 1985, ss. 2093-2099). Vektorissa voi lisäksi olla sellaisia elementtejä kuten polyadenylaatiosignaaleja (esimerkiksi SV40:stä tai adenovirus 5 Elb alueelta), transskription vahvistajasekvenssejä (esimerkiksi SV40 vahvistaja) ja 5 translaation vahvistajasekvenssejä (esimerkiksi sellaisia, jotka koodaavat adenovirus VA RNAiita).

Yhdistelmävektori voi lisäksi käsittää DNA-sekvenssin, joka mahdollistaa vektorin replikoitumisen kysymyksessä olevassa isäntäsolussa. Eräs esimerkki sellaisesta sekvenssistä (kun isäntäsolu on jokin nisäkässolu) on SV40 replikaation aloitus-10 kohta.

Kun isäntäsolu on hiivasolu, sopivia sekvenssejä, jotka mahdollistavat vektorin replikoitumisen, ovat hiivaplasmidi 2μ replikaatiogeenit REP 1-3 ja replikaation aloituskohta.

Vektori voi käsittää myös jonkin valikoituvan markkerin, esimerkiksi geenin, jonka 15 geenituote komplementoi jonkin defektin isäntäsolussa, kuten geeni, joka koodaa dihydrofolaattireduktaasia (DHFR), tai Schizosaccharomyces pombe TPI geeni (jota on kuvannut P.R. Russell, Gene 40, 1985, ss. 125-130) tai sellainen, joka antaa resistenssin jollekin lääkeaineelle, esimerkiksi ampisilliinille, kanamysiinille, tetrasykliinne, kloramfenikolille, neomysiinille, hygromysiinille tai metotreksaatille.

*·,.*. 20 Rihmasienille valikoituvia markkereita ovat amdS. pvrG. argB, niaD tai sC.

• · · • · • · : *·· Esillä olevan keksinnön mukaisen apilapeptidin ohjaamiseksi isäntäsolujen sek- reetiotiehen, rekombinanttivektorissa tulee olla jokin sekreetiosignaalisekvenssi (tunnetaan myös johtosekvenssinä, preprosekvenssinä tai presekvenssinä). Sek-reetiosignaalisekvenssi liittyy apilapeptidiä koodaavaan DNA-sekvenssiin oikeassa 25 lukukehyksessä. Sekreetiosignaalisekvenssit sijoittuvat tavallisesti 5' -päähän peptidiä koodaavaan DNA-sekvenssiin. Sekreetiosignaalisekvenssi voi olla nor- • · · .M, maalisti peptidiin liittyvä sekvenssi tai se voi olla peräisin geenistä, joka koodaa • · T jotakin toista erittyvää proteiinia.

• · • · · • · · • ·

Sekreetion toteuttamiseksi hiivasoluista sekreetiosignaalisekvenssi voi koodata • , 30 mitä tahansa signaalipeptidiä, joka turvaa ilmentyneen apilapeptidin tehokkaan * * ohjautumisen solun eritystiehen. Signaalipeptidi voi olla luonnossa esiintyvä sig- naalipeptidi tai jokin sen funktionaalinen osa tai se voi olla synteettinen peptidi. Sopiviksi signaalipeptideiksi on todettu α-tekijäsignaalipeptidi (vrt. US 4,870,008), 9 hiiren sylkirauhasamylaasin signaalipeptidi (vrt. O. Hagenbuchle et ai., Nature 289, 1981, ss. 643-646), jokin modifioitu karboksipeptidaasisignaalipeptidi (vrt. L.A. Valls et ai., Cell 48, 1987, ss. 887-897), hiivan BAR1 signaalipeptidi (vrt. WO 7/02670) tai hiivan asparagiinihappoproteaasi 3 (YAP3) signaalipeptidi (vrt. 5 M. Egel-Mitani et ai., Yeast 6,1990, ss. 127-137).

Tehokkaan erittymisen aikaansaamiseksi hiivassa voidaan jokin johtopeptidiä koo-daava sekvenssi sijoittaa signaalisekvenssin alavirtaan ja apilapeptidiä koodaavan DNA-sekvenssin ylävirtaan. Johtopeptidin tehtävänä on sallia ilmentyneen peptidin ohjautuminen endoplasman reticulumista Golgin laitteeseen ja edelleen sekree-10 tiovesikkeliin erittymistä varten viljelynesteeseen (so. apilapeptidin kulkeutumisen solun seinän poikki tai ainakin solukalvon läpi hiivasolun periplasmatilaan). Johto-peptidi voi olla hiivan α-tekijäjohtopeptidi (jonka käyttöä kuvataan esimerkiksi patenteissa US 4 546 082, US 4,870,008, EP 16 201, EP 123 294, EP 123 544 ja EP 163 529). Vaihtoehtoisesti johtopeptidi voi olla jokin synteettinen johtopeptidi, 15 joka on niin sanoaksemme johtopeptidi, jota ei tavata luonnossa. Synteettisiä johtopeptidejä voidaan rakentaa esimerkiksi kuten julkaisussa WO 89/02463 tai WO 92/11378 kuvataan.

Rihmasienissä käyttöä varten signaalipeptidi voidaan sopivasti johtaa jostakin geenistä, joka koodaa Aspergillus sp. amylaasia tai glukoamylaasia, geenistä, Γ\: 20 joka koodaa Rhizomucor miehei lipaasia tai proteaasia tai Humicola lanuginosa :V: lipaasia. Signaalipeptidi on edullisesti johdettu geenistä, joka koodaa A. oryzae TAKA amylaasia, A. niger neutraalia α-amylaasia, A. niger happostabiilia amy- • .*··. laasia tai A. niger glukoamylaasia. Sopivia signaalipeptidejä kuvataan esimerkiksi.

:·!’ EP 238 023:ssa ja EP 215 594:ssä.

• · · • · · v · 25 Hyönteissoluissa käyttöä varten signaalipeptidi voidaan sopivasti johtaa jostakin hyönteisgeenistä (vrt. WO 90/05783), kuten Manduca sexta -perhosen adipoki- :Y: neettisen hormonin prekursorisignaalipeptidi (vrt. US 5 023 328).

··» • · • · T Menettelytavat, joita käytetään apilapeptidiä koodaavien DNA-sekvenssien, pro- • · ·’.*·: moottorin ja valinnaisesti terminaattorin ja/tai sekreetiosignaalisekvenssin, vastaa- "**: 30 vasti ligatoimiseen ja niiden insertoimiseen sopiviin vektoreihin, jotka sisältävät replikaation tarvittavan informaation, ovat alaan perehtyneiden tuntemia (ks. esi- merkiksi Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1989).

• · 10

Isäntäsolu, johon apilapeptidiä koodaava DNA-sekvenssi, viedään, voi olla mikä tahansa solu, joka kykenee tuottamaan peptidin dimeerimuodossa ja sellaisia ovat hiivasolut, sienisolut ja korkeammat eukaryoottiset solut.

Esimerkkejä sopivista nisäkässolulinjoista ovat COS (ATCC CRL 1650), BHK 5 (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL (ATCC CCL39) tai CHO (ATCC CCL 61) -solulinjat. Menetelmiä nisäkässolujen transfektoimiseksi ja soluihin vietyjen DNA-sekvenssien ilmentämiseksi kuvaavat esimerkiksi Kaufman ja Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621: Southern ja Berg, J. Mol. Appln. Genet. 1 (1982), 327-341; Loyter et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79 (1982), 422-426; Wigler et ai., Cell 14 10 (1978), 725; Corsaro ja Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham ja van der Eb, Virology 52 (1973), 456; ja Neumann et ai., EMBO J. 1 (1982), 841-45.

Esimerkkejä sopivista hiivasoluista ovat Saccharomyces spp. tai Schizosaccharo-myces spp. solut, erityisesti Saccharomyces cerevisiae tai Saccharomyces 15 kluyveri -kannat. Menetelmiä hiivasolujen transformoimiseksi heterologisella DNA:lla ja heterologisten polypeptidien tuottamiseksi niistä kuvataan esimerkiksi patenteissa US 4 599 311, US 4 931 373, US 4 870 008, 5 037 743 ja US 4 845 075, jotka kaikki sisällytetään tähän viitejulkaisuina. Transformoidut solut seulotaan fenotyypin avulla, joka määritetään jollakin valikoituvalla markke- • · · : 20 rilla, tavallisesti lääkeresistenssillä tai kyvyllä kasvaa ilman jotakin tiettyä ravinto- :Y: ainetta, esimerkiksi leusiinia. Eräs edullinen vektori käytettäväksi hiivasoluissa on POT1-vektori, jota kuvataan US-patentissa 4 931 373. Ennen DNA-sekvenssiä, joka koodaa apilapeptidiä, voi olla jokin signaalisekvenssi ja valinnaisesti jokin • · · :·. johtosekvenssi, esimerkiksi jokin edellä kuvattu sekvenssi. Muita esimerkkejä so- [·;·. 25 pivista hiivasoluista ovat Kluyveromyces-kanta, kuten K. Iactis, Hansenula-kanta, • · · esimerkiksi H. polymorpha, tai Pichia-kanta, esimerkiksi P. pastoris (vrt. Gleeson et ai., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, ss. 3459-3465; US 4 882 279).

• · · • · t • ·

Esimerkkejä muista sienisoluista ovat rihmasienisolut, esimerkiksi Aspergillus X ; spp., Neurospora spp., Fusarium spp., tai Trichoderma spp., erityisesti A. oryzae, • · · A. nidulans tai A. niger - kannat. Aspergillus spp.:n käyttämistä proteiinien ilmentämiseen kuvataan esimerkiksi patenteissa EP 272 277, EP 238 023, EP 184 438. *:**:* Esimerkiksi F. oxysporumin transformointi voidaan suorittaa Malardierin et ai., ·:··: 1989, Gene 78; 147-156 kuvaamalla tavalla. Trichoderma spp.:n transformointi voidaan suorittaa esimerkiksi EP 244 234:ssä kuvatulla tavalla.

11

Kun isäntäsoluna käytetään jotakin rihmasientä, se voidaan transformoida keksinnön mukaisella DNA-rakenteella sopivasti integroimalla DNA-rakenne isäntäkro-mosomiin yhdistelmä-isäntäsolun aikaansaamiseksi. Tämän integroimisen katsotaan yleensä olevan eduksi, koska DNA-rakenne säilyy todennäköisemmin stabii-5 listi solussa. DNA-rakenteiden integroiminen isäntäkromosomeihin voidaan suorittaa konventionaalisilla menetelmillä, esimerkiksi homologisella tai heterologisella rekombinaatiolla.

Hyönteissolujen transformointi ja heterologisten polypeptidien tuottaminen niissä voidaan suorittaa patenteissa US 4 745 051, US 4 879 236, US 5 155 037 10 5 162 222 ja EP 397 485, jotka kaikki sisällytetään tähän viitejulkaisuina, kuvatulla tavalla. Isäntänä käytetty hyönteissolulinja voi sopivasti olla jokin Lepidoptera-so-lulinja, kuten Spodoptera frugiperda -solut tai Trichoplusia ni -solut (vrt. US 5 077 214). Viljelyolosuhteet voivat olla sopivasti kuten kuvataan esimerkiksi julkaisussa WO 89/01029 tai WO 89/01028, tai missä tahansa edellä mainituista 15 viitejulkaisuista.

Edellä kuvattuja transformoituja tai transfektoituja isäntäsoluja viljellään sitten jossakin sopivassa ravintonesteessä olosuhteissa, joissa apilapeptidi voi ilmentyä, minkä jälkeen koko saatu peptidi tai osa siitä voidaan ottaa talteen viljelmästä di-meerimuodossa. Solujen viljelyyn käytetty väliaine voi olla mikä tahansa tavan- • · · : V 20 omainen väliaine, joka soveltuu isäntäsolujen kasvattamiseen, kuten minimikas-• · vatusiiuos tai kompleksinen kasvatusliuos, johon on lisätty sopivia aineita. Sopivia väliaineita on saatavissa kaupallisilta toimittajilta tai niitä voidaan valmistaa jul-kaistujen reseptien mukaan (esimerkiksi American Type Culture Collectionin luet- • · · :\t teloissa). Solujen tuottama apilapeptidi voidaan sitten ottaa talteen viljelyliuok- 25 sesta tavanomaisilla menettelyillä mukaanlukien isäntäsolujen erottaminen väliai- • · · neesta sentrifugoimalla tai suodattamalla, seostamalla supernatantin tai suodok- . . sen proteiinipitoiset komponentit jonkin suolan, esimerkiksi ammoniumsulfaatin, • · · ‘l,l avulla, puhdistaminen erilaisilla kromatografisilla menetelmillä, esimerkiksi ionin- • · *·»' vaihtokromatografialla, geelisuodatuskromatografialla, affiniteettikromatografialla :\i 30 tai vastaavalla, kysymyksessä olevan polypeptidin tyypistä riippuen.

Keksinnön mukaisessa farmaseuttisessa seoksessa apilapeptididimeeri voidaan formuloida millä tahansa vakiintuneella farmaseuttisten seosten formulointimene-*:·*: telmällä, esimerkiksi kuten kuvataan julkaisussa Remington's Pharmaceutical

Sciences, 1985. Seos voi olla muodossa, joka soveltuu systeemiseen injektioon 12 tai infuusioon ja se voidaan sellaisena formuloida steriilin veden tai jonkin isotonisen keittosuolaliuoksen tai glukoosiliuoksen kanssa. Koostumukset voidaan steriloida konventionaalisilla sterilointimenetelmillä, joita alalla tunnetaan. Saatu vesipitoinen liuos voidaan pakata käyttöä varten tai suodattaa aseptisissa olosuh-5 teissä ja lyofilisoida, jolloin lyofilisoitu valmiste yhdistetään steriiliin vesiliuokseen ennen antoa. Koostumus voi sisältää farmaseuttisesti hyväksyttäviä apuaineita, joita vaaditaan, jotta valmiste on lähellä fysiologisia olosuhteita, kuten puskuriai-neita, toonisuutta sääteleviä aineita ja vastaavia, esimerkiksi natriumasetaatti, nat-riumlaktaattia, natriumkloridia, kaliumkloridia, kalsiumkloridia, jne.

10 Esillä olevan keksinnön mukaiset farmaseuttiset seokset voidaan sovittaa myös nenän kautta, ihon läpi tai rektaaliseen antoon. Farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja tai laimenne, jota seoksessa käytetään, voi olla mikä tahansa konventionaalinen kiinteä kantaja. Esimerkkejä kiinteistä kantajista ovat laktoosi, terra alba, sakkaroosi, talkki, gelatiini, agar-agar, pektiini, akaasia, magnesiumstearaatti ja 15 steariinihappo. Kantaja tai laimenne voi samoin sisältää mitä tahansa alalla tunnettua ainetta, joka vapauttaa lääkeainetta säädellystä kuten glyseryylimonostea-raattia tai glyseryylidistearaattia, yksinään tai johonkin vahaan sekoitettuna. Kiinteän kantajan määrä voi vaihdella laajoissa rajoissa, mutta tavallisesti se on noin 25 mg:sta noin 1 g:aan.

• · · : *.·* 20 Apilapeptidin pitoisuus seoksessa voi vaihdella kovasti, so. noin 5 paino-%:sta :V: noin 100 paino-%:iin. Edullinen pitoisuus on 50 - 100 paino-%. Yksikköannos seosta sisältää noin 1 mg - noin 200 mg, edullisesti noin 25 mg - noin 75 mg, :***: erityisesti noin 50 mg peptidiä.

• · · • · • ·

Kuten edellä mainittiin, keksinnön mukaisen apilapeptididimeerin uskotaan olevan *·' * 25 peptidin aktiivinen muoto. Sellaisena sitä ajatellaan olevan edullista käyttää gastrointestinaalisten häiriöiden ehkäisyyn tai hoitoon. Tarkemmin sanoen sitä • ♦ ajatellaan voitavan käyttää mahahaavan tai peptisten haavaumien, suolitulehdus- ten, Crohnin taudin tai suoliston alueella esiintyvien sädehoidon, bakteeri- tai mui- .·) : den infektioiden jne. aiheuttamien vaurioiden hoitoon. Potilaalle annettava poly- • ♦ · 30 peptidiannos voi vaihdella hoidettavan tilan tyypin ja vakavuuden mukaan, mutta yleensä se on 0,1 -1,0 mg/painokilo.

• « • · 13

Lyhyt piirustusten kuvaus

Esillä olevaa keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin esimerkissä, jossa viitataan liitteenä oleviin piirustuksiin, joissa:

Kuvio 1 Ihmisen intestinaalisen apilatekijän ITF ehdotettu rakenne. Primaarinen 5 aminohapposekvenssi on otettu Hauserilta et ai., 1993, ja disulfidisidokset on sijoitettu homologisesti PSP:n ja pS2:n kanssa (Thim, 1988).

Kuvio 2 Hiivakannasta HW756, joka ilmentää rotan ITF:ä, saadun supernatantin käänteisfaasi-HPLC Vydac 214TP54-kolonnilla.

Kuvio 3 Osittain puhdistetun ihmisen ITF:n ioninvaihtokromatografia Fast Flow 10 SP-Sepharose -kolonnilla. hlTF:n (monomeerin) ja hlTF:n (dimeeri) määrä määritettiin analyyttisellä HPLC:llä. Palkit esittävät fraktioita, jotka koottiin monomeeri-ja dimeerimuotojen puhdistamiseksi edelleen. Katkoviiva osoittaa NaCI-pitoisuutta eluointiliuotteessa.

Kuvio 4 Käänteisfaasi-HPLC Vydac 214TP54 C4 -kolonnilla puhdistetusta rotan 15 ITF:stä, dimeeristä (A), ihmisen ITF:stä (monomeeri B) ja ihmisen ITF:stä (dimeeri C). Katkoviiva esittää asetonitriilin pitoisuutta eluointiliuotteessa.

Kuvio 5 Rekonstruoitu massaspektri puhdistetusta rotan ITF:stä (dimeeri, A), ! v. ihmisen ITF:stä (monomeeri, B) ja ihmisen ITF:stä (dimeeri, C).

• · · • · • · : '·· Kuvio 6 Ihmisen ITF:n dimeerimuodon rakenne.

• · · • · • · 20 Kuvio 7 Plasmidi KFN 1003:n restriktiokartta.

• · · • · · v 1 Kuvio 8 Plasmidi pHW756:n rakenne.

.y. Kuvio 9 Plasmidi pHW1066:n rakenne.

• · • · · • · • · • · · • · • · · • · · • · • · • · · 14

Esimerkki

Materiaalit ia menetelmät

Rotan ITF:n (rITF) ia ihmisen ITF:n (hITR kloonaus

Rotan ja ihmisen ITF:n kloonaus suoritettiin julkaisussa WO 92/14837 kuvatulla 5 tavalla ja kuten Suemori et ai., 1991, ja Chinery et ai., 1992 (rotan ITF) ja Podolsky et ai., 1993, ja Hauser et ai., 1993 (ihmisen ITF) ovat kuvanneet.

rlTF:n ia hlTF:n ilmentämisplasmidien rakentaminen llmentämisplasmidit pHW756 rotan ITF:n erittämistä varten ja pHW1066 ihmisen ITF:n erittämistä varten rakennettiin kuvioissa 7-9 hahmotellulla tavalla. Hiivail-10 mentämisvektori pKFN1003 (kuvattu WO 90/10075:ssä) on johdos plasmidista CPOT (Kawasaki, G., International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, 17-.24. syyskuuta, 1984, Edinburgh, Skotlanti, Abstr. P15.). Siinä on Schizosaccharomyces pombe TPI geeni (POT) selektiomarkkerina [Russell, P.R., Gene 40 (1985) 125-130] ja S. cerevisiae trioosifosfaatti-isomeraasi (TPI) pro-15 moottorina ja terminaattorina ilmentämisen säätelyä varten [Alber, T. ja Kawasaki, G., J. Mol. Appi. Genet. 1 (1982) 419-434].

Rotan ITF-geeni kloonattiin aluksi Bluescript II KS(-):een (Stratagene), josta se *·.·. propagoitiin kuvion 8 mukaisesti. Auttajavektori pSX54, joka tuo käyttökelpoisia • · · .1/ kloonauskohtia, muodostuu pUC18:sta ja pDN1050:stä [Diderichsen, B., Poulsen, 20 G.B., Joergensen, S.T., Plasmid 30 (1993), 312-315]. Synteettisellä DNA-kytkijällä • · *···* Nco1-PflM1 :llä on seuraava sekvenssi: ·· • · • · · 1858: 5-CAT GGCT GAAAGATT GGAAAAGAGACAAGAGTT CGTT GGTTT GT CTCCATCCCAATGT-3' 58 emäsparia • ·

1862: 5'-TT GGG AT GGAGACAAACCAACGAACT CTT GT CT CTTTT CCAAT C

··· 25 TTTCAGC-3' 51 emäsparia * * · • · ♦ ’* ‘i Kytkijä koodaa johtosekvenssin 8 C-terminaalista aminohappoa, kuten kuvaavat

Thim, L, Norris, K., Norris, F., Nielsen, P.F., Bjorn, S., Christensen, M., Petersen, *:**: J., FEBS Lett. 318 (1993) 345-352, muutamin muutoksin kodonien valinnassa ja ·:··: rotan ITF-geenin N-terminaalisessa osassa: QEFVGLSPSQC. Signaalin ja johta- 30 jän aminohapposekvenssi on kuten kuvataan ibid.: 15 MKAVFLVLSLIGFCWAQPVTGDESSVEIPEESLIIAENTTLANVAMAERLEKR.

Ihmisen ITF-geeni kloonattiin PUC19:ään ja propagoitiin, kuten kuviossa 9 on esitetty. Synteettisellä DNA-linkkerillä Nco1-BsaA1:llä on seuraava sekvenssi: 2292: 5'-CATGGCTGAAAGATTGGAAAAGAGAGAAGAATAC-3' 34 emäsparia 5 2287: 5'-GTATTCTTCTCTCTTTTCCAATCTTTCAGC-3' 30 emäsparia.

Linkkeri koodaa johtosekvenssin 8 C-terminaalista aminohappoa, kuten kuvataan rITF.n yhteydessä ja hITF-geenin 3 N-terminaalista aminohappoa: EEY. Signaali ja johtopeptidi ovat samat kuin edellä.

Ilmentämisplasmidit transformoitiin S. cerevisiae -kantaan MT 663 (E2-7B X 10 E11-36 a/α, Atpi/Atpi, pep 4-3/pep 4-3) seulomalla käyttäen kriteerinä kasvua glukoosilla ainoana hiilenlähteenä.

Hiivatransformantit, jotka ilmensivät rotan ITF:ä ja ihmisen ITF:ä, nimettiin HW756:ksi ja HW1066:ksi, vastaavassa järjestyksessä.

15 Fermentoinnit

Edellä kuvattuja transformantteja viljeltiin 30 °C:ssa 72 tuntia hiivapeptonideks- • ♦ troosi (YPD)-liuoksessa (Sherman et ai., 1981), johon oli lisätty lisähiivaekstraktia :·.* (60 g/l). OD-arvot aallonpituudella 660 nm 153 ja 232 HW756:lle (rITF) ja • · · HW1066:lle (hITF), vastaavassa järjestyksessä, saavutettiin fermentointien loll*** 20 pussa. pH säädettiin 2,5:teen 1M fosforihapolla fermentaation lopussa ja hii- • · vasolut poistettiin sentrifugoimalla nopeudella 3000 kierrosta minuutissa 15 mi- • · · ’·* * nuuttia.

• · • · · • · ·

Yhdistelmä-rlTF:n puhdistaminen • · • · • · · : 25 rlTF:n pitoisuus hiivafermentointiliemessä ja puhdistuksen aikana saaduissa frakti- oissa mitattiin analyyttisellä HPLC:llä. Eriä (tavallisesti 50 - 200 pl) ruiskutettiin . Vydac 214TP54 käänteisfaasi C4 HPLC -kolonniin (0,46 x 25 cm), joka oli tasapai- notettu 30 °C:ssa virtausnopeudella 1,5 ml/min käyttäen 0,1 % (v/v) TFA 15 % *”" (v/v) asetonitriilissä. 10 minuutin isokraattisen eluution jälkeen asetonitriilin pitoi- 30 suus eluointiliuotteessa nostettiin 55 %:ksi 40 minuutin ajaksi. Absorbanssi mitat- 16 tiin aallonpituudella 214 nm. Kolmen piikin, jotka eluoituivat 26,5 minuutin, 27,3 minuutin ja 28,2 minuutin kohdalla (kuvio 2), todettiin edustavan rlTF:n dimeeri-muotoja. Peptidit kvantifioitiin käyttämällä kalibroitua hSP-standardia (Thim et ai., 1993).

5 Yhdistelmä-rlTF:n ilmentymistaso kysymyksessä olevassa hiivasysteemissä oli 113 mg/l.

10 litran fermentointilaitteesta eristettiin 8,7 I fermentointilientä sentrifugoimalla. Supernatantti laimennettiin 14,8 litralla tislattua vettä johtokyvyn alentamiseksi. Näyte pumpattiin Fast Flow S-Sepharose (Pharmacia) kolonniin (5 x 42 cm) vir-10 tausnopeudella 600 ml/h. Ennen käyttöä kolonni tasapainotettiin 50 mM muura-haishappopuskurilla, pH 3,7. Rotan ITF eluoitiin kolonnista 50 mM muurahaishapolla, pH 3,7, joka sisälsi 50 mM NaCI. 100 ml:n fraktioita koottiin virtausnopeudella 600 ml/h ja niistä analysoitiin rITF-pitoisuus. Edellisestä vaiheesta saatuja fraktioita, jotka sisälsivät rITF, koottiin yhteen (2,3 I) ja pumpattiin Amberchrome-15 kolonniin (G-71) (5x10 cm). Ennen käyttöä kolonni tasapainotettiin 10 mM am-moniumasetaattipuskurilla, pH 4,8, virtausnopeudella 0,5 l/h. Käytön jälkeen kolonni pestiin 0,5 litralla tasapainotuspuskuria ja eluoitiin 10 mM ammoniumase-taattipuskurilla, pH 4,8, joka sisälsi 60 % (v/v) etanolia, virtausnopeudella 0,1 l/h. Kerättiin 10 ml:n fraktioita ja ne koottiin yhteen niiden rITF-pitoisuuden perusteella.

• · · • V 20 Etanolipitoisuus poolissa nostettiin 60 %:sta (v/v) 87 %:iin (v/v) lisäämällä 2 tila- :V: vuutta etanolia (99,9 %, v/v) ja rITF seostettiin jäähdyttämällä saatu seos -25 °C:seen 16 tunniksi.

• · · • · [”·* Sakka koottiin sentrifugoimalla 1 tunti nopeudella 10 000 g -25 °C:ssa ja liuotettiin • · : ” uudelleen huoneenlämpötilassa 130 ml:aan 20 mM muurahaishappoa, pH 3,0.

v : 25 Näyte pumpattiin Fast Flow SP-Sepharose (Pharmacia) -kolonniin (5 x 20 cm) virtausnopeudella 50 ml/h. Ennen käyttöä kolonni tasapainotettiin 20 mM muura-v.: haishapolla, pH 3,0. Peptidit eluoitiin kolonnista käyttäen lineaarista gradienttia 1,5 [: I 50 mM muurahaishappoa, pH 3,0 -» 1,5 I muurahaishappoa, pH 3,0, joka sisälsi ; 0,5 mM NaCI. Fraktioita (10 ml) koottiin virtausnopeudella 80 ml/h ja absorbanssi ^ | 30 mitattiin aallonpituudella 280 nm. Fraktioista tutkittiin rITF-pitoisuus. rlTF:ä vastaa vat fraktiot koottiin yhteen. Rotan ITF puhdistettiin edelleen preparatiivisella *:**: HPLC:llä. Kootut fraktiot (900 ml) pumpattiin Vydac 214TP1022 C4 preparatiivi- *:··: seen HPLC-kolonniin (2,2 x 25 cm), joka oli tasapainotettu 0,1 %:lla (v/v) TFA:lla.

Peptidit eluoitiin 25 °C:ssa ja virtausnopeudella 5 ml/min käyttäen lineaarista gra- 17 dienttia (540 ml), joka muodostui MeCN/H20/TFA:sta (10:89,9:0,1, v/v/v) ja MeCN/H20/TFA:sta (65:34,9:0,1, v/v/v). UV-absorptiota monitoroitiin aallonpituudella 280 nm ja fraktiot, jotka vastasivat 10 ml, koottiin ja niiden rITF-pitoisuus tutkittiin. rlTF:ä sisältävät fraktiot koottiin yhteen ja niiden tilavuus pienennettiin 5 30 %:ksi tyhjiösentrifugoimalla. Saadusta poolista rITF eristettiin lyofilisoimalla.

rlTF:n kokonaissaanto 8,7 litrasta fermentointiväliainetta oli 236 mg, joka vastasi 24 %:n kokonaispuhdistussaantoa.

Yhdistelmä-hlTF:n puhdistaminen 10 hlTF:n pitoisuus hiivafermentointiliemessä ja fraktiossa, joka saatiin puhdistuksen aikana, mitattiin FILPC-systeemillä, joka oli samanlainen kuin rlTF:n yhteydessä kuvattu. Tässä systeemissä kahden piikin, jotka eluoituivat 21,2 minuutin ja 27,1 minuutin kohdalla, todettiin massaspektrometrialla ja sekvenssianalyysillä edustavan hlTF:n yhtä dimeerimuotoa ja yhtä monomeerimuotoa. Yhdistelmä-hlTF:n 15 ilmentymistaso kysymyksessä olevassa hiivasysteemissä oli 90 mg/l.

10 litran fermentointisäiliöstä eristettiin 8,0 litraa fermentointilientä sentrifugoimal-

la. Näyte dialysoitiin 3 kertaa (kullakin kerralla 24 tuntia) 40 litraa vastaan 10 mM

muurahaishappoa, pH 2,5. Näyte pumpattiin (0,25 l/h) SP-Sepharose Fast Flow .. . (Pharmacia) -kolonniin (5 x 40 cm). Kolonni pestiin 5 litralla 20 mM muurahaishap-

‘‘ 20 poa, pH 2,5, ja eluoitiin lineaarisella gradientilla, joka muodostui 5 l:sta 20 mM

• · ·

]·'·’ muurahaishappoa, pH 2,5, ja 5 l:sta muurahaishappoa, pH 2,5, joka sisälsi 1 M

: '·* NaCI.

• · · • · • · • · · :·. 100 ml:n fraktioita koottiin ja niiden hITF-pitoisuus analysoitiin (kuvio 3). Kaksi ]·:·. hlTF:n muotoa eluoitui kolonnista: toinen edusti hlTF:n monomeerimuotoa (eluoi- • · * 25 tui kohdassa 0,5 M NaCI) ja toinen edusti hlTF:n dimeerimuotoa (eluoitui koh-. . dassa 0,78 M NaCI). Näitä kahta muotoa vastaavat fraktiot koottiin erikseen yh- teen.

• · · • · • · • · · ,·[ . Kukin fraktio jaettiin kolmeen yhtä suureen osaan (tilavuus: noin 700 ml) ja pum- ^ pattiin Vydac 214TP1022 C4 -kolonniin (2,2 x 25 cm), joka oli tasapainotettu, 30 0,1 %:isessa (v/v) TFA:ssa. Peptidit eluoitiin virtausnopeudella 4 ml/min lineaari-

·:**: sella gradientilla (540 ml) MeCN/H20/TFA (10:89,9:0,1, v/v/v) - MeCN/H20/TFA

·:·*: (65:34,9:0,1, v/v/v). UV-absorptiota monitoroitiin aallonpituudella 280 nm ja 10 ml:a vastaavat fraktiot koottiin ja niiden hITF-pitoisuus analysoitiin.

18

Edellisestä vaiheesta saadut fraktiot, jotka sisälsivät hITF (monomeeria) ja hITF (dimeeriä), koottiin erikseen yhteen ja pH säädettiin 3,0:aan. Näytteet ajettiin erikseen SP-Sepharose HiLoad 16/10 (Pharmacia) -kolonniin (1,6 x 10 cm), joka oli tasapainotettu, 20 mM muurahaishapossa, pH, joka sisälsi 40 % (v/v) etanolia. 5 Kolonni pestiin 80 milliä tasapainotuspuskuria ja eluoitiin virtausnopeudella 4 ml/min lineaarisella gradientilla 200 ml 20 mM muurahaishappoa, pH 3,0, 40 % (v/v) etanolia - 200 ml 20 mM muurahaishappoa, pH 3,0, 40 %(v/v), joka sisälsi 1 M NaCI. Fraktioita (5 ml) otettiin talteen ja niiden hITF-pitoisuus tutkittiin.

Fraktiot, jotka sisälsivät hITF (monomeeria) ja hITF (dimeeriä), vastaavassa järjes-10 tyksessä, koottiin ja peptidisisältö seostettiin säätämällä etanolipitoisuus 90 %:ksi (v/v) ja jäähdyttämällä seos 72 tunniksi -25 °C:seen. Sakka koottiin sentrifugoi-malla ja lyofilisoitiin. Kokonaissaanto 8 litrasta fermentointilientä oli 256 mg hITF (monomeeria) ja 133 mg hITF (dimeeriä), minkä vastasi 50 %:n ja 65 %:n, vastaavassa järjestyksessä, kokonaispuhdistussaantoa monomeerimuodosta ja dimee-15 rimuodosta.

Yhdistelmä-rlTF:n ja -hlTF:n karakterisointi

Hydrolysoinnin jälkeen 6 M HCI:ssa 110 °C:ssa tyhjiösuljetuissa putkissa 24, 48 ja 96 tuntia, näytteet (50 pg) analysoitiin Beckman (Model 121 MB) automaattisessa ; 20 aminohappoanalysaattorissa. Puoli-kystiini määritettiin S-P-(4-pyridyylietyyli)-joh- • · · [;*·* dokseksi, kun disulfidisidokset oli pelkistetty tributyylifosfiinilla (ROegg & Rudinger, : ** 1974) ja sen jälkeen kytketty 4-vinyylipyridiinillä (Friedman et ai., 1970). 4-vinyyli- ··· pyridyylillä käsiteltyjen näytteiden hydrolysointi suoritettiin 4 M metaanisulfoniha- • *♦· polla tai 3 M merkaptoetaanisulfonihapolla 110 °C:ssa 24 tuntia, kuten edellä ku- :T: 25 vattiin. Aminohapposekvenssianalyysi suoritettiin automaattisella Edman-degra- daatiolla käyttäen Applied Biosystems Model 470A kaasufaasisekvensaattoria (Thimefa/., 1987).

• · • · · • · *···' Massaspektrometria-analyysi suoritettiin käyttämällä API III LC/MS/MS-systeemiä (Sciex, Thornhill, Ontario, Kanada). Kolmoiskvadrupolilaitteen massa/varausalue 30 (m/z) oli 2400 ja siihen sovitettiin pneumaattinen sähkösumutusinterfaasi (kutsu- * . taan myös ionisumutukseksi) (Bruins et ai., 1987; Covey et ai., 1988). Näyte syö- ] tettiin ruiskuinfuusiopumpulla (Sage Instruments, Cambridge, MA) fuusiokapiilaa- * * rin läpi (75 pm, i.d.) ja nesteen virtausnopeus säädettiin 0,5 -1 piiksi minuutissa.

Laitteen m/z-skaala kalibroitiin polypropeeniglykolien (PPGit) yksivarauksisilla 19 ammoniumaddukti-ioneilla yksikköresoluutiolla. Massamääritysten tarkkuus on yleensä parempi kuin 0,02 %.

Kuvio 4 esittää analyyttisiä HPLC-kromatogrammeja, jotka saatiin puhdistetusta rlTF:stä (kuvio 4A) ja hlTF:stä (kuvio 4B ja 4C). Yhdistelmä-rlTF sisältää 3 lähei- 5 sesti toisiaan muistuttavan peptidin seoksen eikä näitä muotoja yritetty erottaa.

Sähkösumutusionisointimassaspektrometrialla analysoitaessa todettiin kolme hallitsevaa molekyylipainoa, jotka olivat: 13112,2, 13096,6 ja 13078,8 (kuvio 5A).

Rotan ITF:n laskettu molekyylipaino monomeerimuodossa, jossa Cys-57 sisältää vapaan -SFI-ryhmän, on 6558,3. Rotan ITF:n laskettu molekyylipaino dimeerimuo- 10 dossa (esimerkiksi S-S-silta on todettu kahden Cys-57:n välillä) on 13114,6. Yh- distelmä-rlTF:n todettujen molekyylipainojen perusteella on selvää, että kaikki kolme peptidiä edustavat rlTF:n dimeerimuotoja. Kolmesta muusta apilapeptidistä, joissa N-terminaalinen aminohappotähde on Gin, esimerkiksi PSP (Thim et ai., 1985 ja Tomasetto et ai., 1990), tiedetään, että tällä tähteellä on taipumus sykli- 15 soitua, jolloin muodostuu pyrrolidonikarboksyylihappo (pyrGlu). Mikäli rotan ITF:llä on ennakoitu N-terminaalinen sekvenssi Gln-Glu-Phe-Val-Gly, näyttää järkevältä olettaa, että N-terminaalinen Gin voisi sekin syklisoitua muodostaakseen pyrGlu:n.

Sellaisen derivatisaation tuloksena rotan ITF:n (dimeerin) molekyylipaino pienenisi 17 (yksi pyrGlu) tai 34 (kaksi pyrGlu) massayksiköllä, vastaavassa järjestyksessä.

.. . 20 Todetut molekyylipainot 13096,6 ja 13078,8 (kuvio 5A) vastaavat rotan ITF:n di- • · · ;* meerimuotoa, jossa yksi, vastaavasti kaksi N-terminaalista Gln-tähdettä on sykli- soitunut. Näiden muotojen lasketut molekyylipainot ovat 13097,6 ja 13080,6 ja ne • · : ’·· ovat sangen yhdenmukaiset kokeellisesti määritettyjen arvojen kanssa. Niinpä • · · FIPLC- ja massa-analyyseistä (kuvio 5A) päätellään, että rotan ITF muodostuu 3 25 eri dimeerimuodosta: yksi sisältää 2 N-terminaalista Gln:ä, yksi sisältää 1 N-termi-naalisen Gln:n ja 1 N-terminaalisen pyrGlu:n ja yksi sisältää 2 N-terminaalista pyrGlu:ta. Taulukko 1 osoittaa rotan ITF:n aminohappokoostumuksen olevan var-sin yhdenmukainen odotettujen arvojen kanssa.

• · · • · • · ·

Kuviot 5A ja 5B esittävät hlTF:n (monomeerin) ja hlTF:n (dimeerin) puhtautta, 30 vastaavassa järjestyksessä, analyyttisellä HPLC:llä tutkittuna. Dimeerimuoto (ku- • · ....: vio 5C) vaikuttaa suhteellisen puhtaalta, kun sen sijaan monomeerimuoto (kuvio • , 5B) näyttää kontaminoituneen materiaalilla, joka eluoituu peptidin edellä. Kun * ’ pääpiikissä eluoitunut materiaali kromatografoitiin uudelleen, saatiin samanlainen kromatogrammi (tuloksia ei esitetty). Tämä näyttäisi ennemminkin osoittavan 35 hlTF:n (monomeerin) epätyypillistä käyttäytymistä käänteisfaasikolonneissa kuin 20 epäpuhtauksia. Olemme aikaisemmin havainneet samankaltaista käyttäytymistä erittäin puhtaalla sian PSP:llä sekä myös erittäin puhtaalla yhdistelmä-hSP:llä (Thim et ai., 1993).

hlTF:n (monomeerin) massaspektrometria-analyysi osoittaa hallitsevan piikin 5 molekyylipainon vastaavan 6694,0 (kuvio 5B). Molekyylipaino on aminohapposekvenssistä laskettuna (kuvio 1) 6574,4 olettaen, että Cys-57 on -SH-muodossa. Aminohapposekvenssianalyysissä (taulukko 2) näkyy odotettu N-terminaalinen sekvenssi Glu-Glu-Tyr-Val-Gly. Aminohappokoostumuksen analyysissä (taulukko 1) näkyvät odotetut arvot lukuunottamatta 7,3 (8) kysteiinin läsnäoloa. Lisäkysteiini 10 kytkeytyneenä hlTF:n Cys-57:ään nostaisi molekyylipainon 6694,7:ään, mikä on hyvin lähellä massaspektrometrialla määritettyä arvoa (6694,0). Sen vuoksi oletetaan, että hlTF:ssä (monomeerissa) Cys-57 on kytkeytyneenä disulfidilla lisäkyste-iiniin. Pienempi molekyylipainopiikki massaspektrissä (kuvio 5B) saattaa edustaa jotakin toista Cys-57:n johdosta tai se saattaa olla jokin epäpuhtaus valmisteessa.

15 hlTF:n (dimeerin), jossa kaksi monomeeria on disulfidisidoksella kytkeytyneenä kahden Cys-57-tähteen väliin, laskettu molekyylipaino on 13146,8. Tämä on hyvin yhdenmukainen massaspektrometrialla määritellyn arvon kanssa (13147, kuvio 5C). Toinen massaspektrissä esiintyvä piikki (13169) edustaa luultavasti hlTF:n (dimeerin) Na+-adduktia. Sekvenssianalyysi (taulukko 1) samoin kuin j V 20 aminohappokoostumuksen analyysi (taulukko 2) ovat nekin hyvin yhdenmukaiset :Y: laskettujen arvojen kanssa.

·· • · • 1 · • · · • · • · ··· ·· • · • · · • · · • · · • · · • · • · · • · · • · • · · • · • · • · · • · • · · • · · • · • · • · · 21

Taulukko 1

Rotan ITF:n (dimeerin), ihmisen ITF:n (monomeerin) ja ihmisen ITF:n (dimeerin) aminohappokoostumus___

Aminohappo Rotan ITF (dimeeri) Ihmisen tTF (monomeeri) Ihmisen ITF (dimeeri)

Asx 11,92 (12) 6,00 (6) 12,01 (12)

Thr3 8,00 (8) 2,03 (2) 4,01 (4)

Ser3 9,86 (10) 2,04 (2) 4,01 (4)

Glx 15,98 (16) 6,92 (7) 14,00 (14)

Prob 12,48 (12) n.d.c (6) n.d.c (12)

Gly 6,02 (6) 4,20 (4) 8,09 (8)

Ala 2,04 (2) 3,91 (4) 7,90 (8)

Vai 11,92 (12) 4,92 (5) 9,86 (10)

Met 1,80 (2) 0,00 (0) 0,00 (0)

Ile 1,98 (2) 1,17 (1) 2,13 (2)

Leu 3,92 (4) 2,03 (2) 3,99 (4)

Tyrb 2,02 (2) 1,94 (2) 3,92 (4)

Phe 7,88 (8) 2,93 (3) 5,94 (6)

Lys 2,14 (2) 3,07 (3) 6,09 (6)

His 0,00 (0) 0,99 (1) 2,03 (2)

Trp 2,16 (2) n.d.c (1) n.d.c (2) il’** Arg 3,94 (4) 2,96 (3) 6,05 (6) ·*..[* PE-Cysb 12,70 (14) 7,30_J7)_ 13,80 (14)_ • · • · ··« [*·.. Yhteensä _1(118) _|_(59)__(118) • · · • t ·

Sulkeissa olevat arvot koskevat cDNA:sta johdettuja: rotan ITF (Chinery et ai., 5 1992) ihmisen ITF (Hauser et ai., 1993).

• · · « · · • · 3 :***: ) Määritetty ekstrapoloimalla hydrolyysin nolla-aikaan.

• · · • · k ) Määritetty hydrolysoimalla 4M metaanisulfonihapossa.

• · • ^ c) Ei määritetty.

• · • · 22

Taulukko 2

Rotan ITF (dimeeri), ihmisen ITF (monomeeri) ja ihmisen ITF (dimeeri) automaatti-nen Edman-degradaatio___

Jakso Rotan ITF (dimeeri) Ihmisen ITF (monomeeri) Ihmisen ITF (dimeeri) n:o PTA-AA Saanto PTH-AA Saanto (pmol) Saanto (pmol) __(pmol) _ 1 Gin |989 ~Gki 1517 ~G\u 2227 2 Glu 731 Glu 1998 Glu 2361 3 Phe 967 Tyr 2205 Tyr 2528 4 Vai 1072 Vai 2409 Vai 2431 5 Gly 701 Gly 1625 Gly 1803 6 Leu 838 Leu 2318 Leu 2253 7 Ser 497 Ser 852 Ser 904 8 Pro 965 Ala 1729 Ala 1712 9 Ser 406 Asn 1394 Asn 1518 10 Gin 820 Gin 1494 Gin 1499 11 (Cys) n.d. (Cys) n.d. (Cys) n.d.

12 Met 581 Ala 1243 Ala 1377 13 Vai 971 Vai 1468 Vai 1356 14 Pro 962 Pro 1223 Pro 1195 15 Ala 529 Ala 1248 Ala 1249 16 Asn 791 Lys 1270 Lys 1050 17 Vai 952 Asp 937 Asp 991 18 Arg 331 Arg 891 Arg 964 19 Vai 956 Vai 1002 Vai 1069 :*·[: 20 Asp 476 Asp 847 Asp 932 ]·.·. 21 (Cys) n.d. (Cys) n.d. Cys n.d.

22 Gly 381 Gly 709 Gly 703 ·*·.. 23 Tyr 352 Tyr 894 Tyr 792 *... 24 Pro 927 Pro 766 Pro 701 25 Thr 498 His 309 His 236 26 Vai 812 Vai 755 Vai 670 27 Thr 510 Thr 505 Thr 576 : 28 Ser 225 Pro 458 Pro 473 29 Glu 398 Lys 444 Lys 321 30 Gin 499 Glu 219 Glu 304 V.; 31 (Cys) n.d. (Cys) n.d. (Cys) n.d.

.···. 32 Asn 557 Asn 312 Asn 300 *···* 33 Asn 591 Asn 464 Asn 503 : 34 Arg 196 Arg 325 Arg 294 ’· *| 35 Gly 222 Gly 239 Gly 223 *:**: 36 (Cys) n.d. (Cys) n.d. (Cys) n.d.

• 37 (Cys) n.d. (Cys) n.d. (Cys) n.d.

·:··: 38 Phe 335 Phe 189 Phe 174 39 Asp 275 Asp 133 Asp 137 * ; 40_Ser 164_Ser_[49_Ser 43_ R Y- 97,0 % 93,2% 92,5 % 23

Viitejulkaisut

Babyatsky, M.W., Thim, L, Podolsky, D.K. (1994) Gastroenterology 106, A43 (tiivistelmä)

Bruins, A.P., Covey, T.R. & Henion, J.D. (1987) Anal. Chem. 59, 2642-2646.

5 Chinery, R., Poulsom, R., Rogers, L.A., Jeffery, R.E., Longcroft, J,M„ Hanby, A.M. ja Wright, N.A. (1992) Biochem. J. 285, 5-8.

Covey, T.R., Bonner, R.F., Shushan, B.I., ja Henion, J.D. (1988) Rapid Commun. Mass Spectrom. 2, 249-256.

Dignass, A., Lynch-Devaney, K. Kindon, H., Thim, L. ja Podolsky, D.K. (1994) J. 10 Clin. Invest, (lehdistössä).

Friedman, M., Krull, L.H., Cavins, J.F. (1970), J. Biol. Chem. 245, 3868-3871.

Gajhede, M., Petersen, T.N., Henriksen, A., Petersen, J.F.W., Dauter, Z., Wilson, K.S. ja Thim, L. (1993) Structure 1, 253-262.

Hanby, A.M., Poulsom, R., Elia, G., Singh, S., Longcroft, J.M. ja Wright, N.A. 15 (1993) J. Pathol. 169, 355-360.

Hauser, F. ja Hoffmann, W. (1991) J. Biol. Chem. 266, 21206-21309.

Hauser, F., Roeben, C. ja Hoffmann, W. (1992a) J. Biol. Chem. 267, j’V 14451-14455.

• t *·*·* Hauser, F. ja Hoffmann, W. (1992b) J. Biol. Chem. 267, 24620-14624.

• · • · 20 Hauser, F., Poulsom, R., Chinery, R., Rogers, L.A., Hanby, A.M., Wright, N.A. ja ]···* Hoffmann, W. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 6961-6965.

♦ · j..!’ Hoffmann, W. (1988) J. Biol. Chem. 263, 7686-7690.

• · ·

Hoffmann, W. ja Hauser, F. (1993) Trends Biochem. Sci. 7, 239-243.

:V: Jakowlew, S.B., Breathnach, R., Jetsch, J-M., Masiakowski, P. Chambon, P.

:***: 25 (1984) Nucleic Acid Res. 12, 2861-2878.

• · ·

Lefebvre, 0., Wolf, C., Kedinger, M., Chenard, M.-P., Tomasetto, C., Chambon, ....: P„ ja Rio, M.C., (1993) J. Cell Biol. 122, 191-198.

Playford, R.J., Marchbank, T., Chinery, R., Evison, R., Pignatelli, M., Bolton, R., ..... Thim, L., ja Hanby, A.M. (1994) Gastroenterology (lehdistössä).

• · 24

Podolsky, D.K., Lynch-Devaney, K., Stow, L.J., Oates, P., Murgue, B., DeBeau-mont, M., Sands, B.E. ja Kakida, Y.R. (1993) J. Biol. Chem. 268, 6694-6702.

Poulsom, R., Chinery, R., Sarraf, C., Lalani, E.-N., Stamp, E., Elia, G., Wright, N. (1992) Gastroenterology 27, 17-28.

5 Poulsom, R„ ja Wright, N.A. (1993) Am. J. Physiol. 265, G205-G213.

Prud'homme, J.F., Fridlansky, F., Le Cunff, M., Atger, M., Mercier-Bodart, C., Pichon, M.-F. ja Milgrom, E. (1985) DNA 4, 11-21.

Rio, M.C., Belloq, J.P., Daniel, J.Y., Tomasetto, C., Lathe, R., Chenard, M.P., Bat-zenschlager, A., ja Chambon, P. (1988) Science 241, 705-708.

10 Rio, M.C., Chenard, M.-P., Wolf, C., Marcellin, L., Tomasetto, C., Lathe, R., Bel-locq, J.-P. ja Chambon, P. (1991) Gastroenterology 100, 375-379.

ROegg, U. Th. ja Rudinger, J. (1974) Isr. J. Chem. 12, 391-401.

Sherman, F., Fink, G.R. ja Hicks, J.B. (1981) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

15 Suemori, S., Lynch-Devaney, K. ja Podolsky, D.K. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11017-11021.

Thim, L., Joergensen, K.H. ja Joergensen, K.D. (1982) Regul. Peptides 3, 221-230.

• · • ♦

Thim, L., Thomsen, J., Christensen, M., ja Joergensen, K.H. (1985) Biochem. 20 Biophys. Acta 827, 410-418.

♦ ··

Thim, L., Hansen, M.T., Norris, K., Hoegh, L, Boel, I., Forstrom, J., Ammerer, G., ja Fill, L. 1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 6766-6770.

• · · *♦* * Thim, L., Hansen M.T. ja Soerensen, A.R. (1987) FEBS Lett. 212, 307-312.

Thim, L, (1989) FEBS Lett. 250, 85-90.

• · · • · · .···. 25 Thim, L., Norris, K., Norris, F., Nielsen, P.F., Bjorn, S.E., Christensen, M., Peter- ’t* sen, J. (1993) FEBS Lett. 318, 345-352.

• · « *; J Thim, L, (1994) Digestion 55, 353-360.

• · * . Tomasetto, C., Rio, M., Gautier, C., Wolf, C., Hareuveni, M., Chambon, P. ja

Lathe, R. (1990) EMBO J. 9, 407-414.

30 Wright, N.A., Pike, C. ja Elia, G. (1990) Nature 343, 82-85.

25

Wright, N.A., Poulsom, R., Stamp, G., van Norden, S., Sarraf, C., Elia, G., Ahnen, D., Jeffery, R., Longcroft, J., Pike, C., Rio, M. ja Chambon, P. (1993) Gastroenterology 104, 12-20.

• · · • · · • · • · • · • · · • · · • · • · • · • · · • · · • · • · • · · • · • · • · · • · · • · · • · · • · • · · • · · • · • · · • 1 • · • · · • · • · · • · · • · • · • · ·

Claims (19)

26 Patentti vaati m u kset

1. Apilapeptididimeeri, tunnettu siitä, että se on apilapeptidimonomeerin dimeerimuoto, joka monomeeri sisältää yhden ainoan apiladomainin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen apilapeptididimeeri, tunnettu siitä, että, 5 että sen likimääräinen molekyylipaino on 13000.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen apilapeptididimeeri, tunnettu siitä, että se on intestinaalisen apilatekijän (ITF) dimeeri.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 3 mukainen apilapeptididimeeri, tunnettu siitä, että se on ihmisen ITF:n dimeeri.

5 Crohnin tauti ja suoliston alueella esiintyvä sädehoidon, bakteeri- tai muiden infektioiden aiheuttama vaurio.

5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen apilapeptididimeeri, tunnettu siitä, että ITF-dimeeri muodostuu kahdesta ITF-monomeerista, jotka ovat kytkeytyneet disulfidisidoksella kahden kysteiinitähteen väliin kunkin monomeerin asemassa 57.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen apilapeptididimeeri, tunnettu siitä, että se 15 on rintasyöpään liittyvän peptidin (pS2) dimeeri.

.. . 7. Patenttivaatimuksen 1 tai 6 mukainen apilapeptididimeeri, tunnettu siitä, i että se on ihmisen pS2:n dimeeri. • · · • · · • ·

8. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen apilapeptididimeeri, tunnettu siitä, :***: että pS2-dimeeri muodostuu kahdesta pS2-monomeerista, jotka ovat kytkeytyneet • · · :\a 20 disulfidisidoksella kahden kysteiinitähteen väliin kunkin monomeerin asemassa !·:·. 58. • · · ♦

9. Menetelmä apilapeptididimeerin valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista, • » että se on apilapeptidimonomeerin dimeerimuoto, joka monomeeri sisältää yhden ainoan apiladomainin, tunnettu siitä, että viljellään jotakin sopivaa isäntäsolua, X ; 25 joka on transformoitu DNA-sekvenssillä, joka koodaa apilapeptidimonomeeriä, « *· [ joka sisältää yhden apiladomainin, olosuhteissa, jotka tekevät mahdolliseksi pep- . * tidin tuotannon, saatu apilapeptidimonomeeri ja apilapeptididimeeri erotetaan viljelmästä kromatografisella menetelmällä, ja apilapeptididimeeri otetaan talteen. • · 27

10. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää apilapeptididimeerin, jolle on tunnusomaista, että se on apilapeptidimonomeerin dimeerimuoto, joka monomeeri sisältää yhden ainoan apiladomainin, yhdessä jonkin farmaseuttisesti hyväksyttävän laimentimen tai kantajan kanssa.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksen 2-8 mukaisen apilapeptididimeerin.

12. Apilapeptididimeeri, jolle on tunnusomaista, että se on apilapeptidimonomeerin dimeerimuoto, joka monomeeri sisältää yhden ainoan 10 apiladomainin, käytettäväksi lääkkeenä.

13. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 2-8 mukainen apilapeptididimeeri käytettäväksi lääkkeenä.

14. Apilapeptididimeeri, jolle on tunnusomaista, että se on apilapeptidimonomeerin dimeerimuoto, joka monomeeri sisältää yhden ainoan 15 apiladomainin, käytettäväksi gastrointestinaalisten häiriöiden ehkäisyyn tai hoitoon.

15. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 2-8 mukainen apilapeptididimeeri käy- ·· · : V tettäväksi gastrointestinaalisten häiriöiden ehkäisyyn tai hoitoon. • · • · · • · · ··,* 16. Patenttivaatimuksen 14 tai 15 mukainen apilapeptididimeeri, jossa gastroin- • · · 20 testinaalinen häiriö on valittu joukosta: ];··* mahahaava ja pohjukaissuolihaava, • · : ** suolitulehdus, • · · v : Crohnin tauti ja suoliston alueella esiintyvä sädehoidon, bakteeri- tai muiden infektioiden aiheut- :V: 25 tama vaurio. • · · • · * ·

17. Apilapeptididimeerin, jolle on tunnusomaista, että se on V*: apilapeptidimonomeerin dimeerimuoto, joka monomeeri sisältää yhden ainoan apiladomainin, käyttö valmistettaessa gastrointestinaalisten häiriöiden ehkäisyyn tai hoitoon tarkoitettua lääkettä. • · ♦ * * 30 18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen käyttö, jossa apilapeptididimeeri on minkä tahansa patenttivaatimuksen 2-8 mukainen apilapeptididimeeri. 28

19. Patenttivaatimuksen 17 tai 18 mukainen käyttö, jossa gastrointestinaalinen häiriö on valittu joukosta: mahahaava ja pohjukaissuolihaava, suolitulehdus,

10 Patentkrav