CZ289864B6 - Trojlístkový peptid, způsob přípravy, farmaceutický prostředek a pouľití trojlístkového peptidu - Google Patents

Abstract

Trojl stkov² peptid ve skute n ist form obsahuj c intestin ln trojl stkov² faktor - ITF, kter² se skl d ze dvou ITF monomer spojen²ch disulfidickou vazbou mezi dv ma cysteinov²mi zbytky obou monomer v pozici 57 ka d ho monomeru. Zp sob p° pravy trojl stkov ho peptidu a jeho pou it pro p° pravu l iva pro profylaxi nebo l en poruch tr vic soustavy.\

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká troj lístkových peptidů, způsobu jejich přípravy, farmaceutických prostředků, které je obsahují a jejich použití pro léčení gastrointestinálních poruch.

Dosavadní stav techniky

Trojlístkové peptidy tvoří skupinu, která se vyskytuje hlavně ve spojení s gastrointestinálním traktem. Trojlístkové peptidy savců obsahují jednu nebo několik troj lístkových domén (Thimakol. 1989), kde je každá tvořena 38 nebo 39 aminokyselinami, se šesti cysteiny spojenými v konfiguraci 1-5, 2-4 a 3-6 za vzniku charakteristické trojlístkové struktury (Thim 1989).

Dosud známé trojlístkové peptidy savců obsahují jednu nebo dvě trojlístkové domény (přehled viz. Thim, 1994, Poulsom a Wright, 1993, Hoffmann a Hauser, 1993). Jsou popsány žabí (Xenopus leavis) peptidy a proteiny obsahující jednu (Hauser a Hoffmann 1991), dvě (Hauser a kol. 1992a), čtyři (Hoffmann 1988) nebo šest (Hauser a Hoffmann 1992b) trojlístkových domén. Trojlístkové peptidy savců obsahující jednu doménu jsou s rakovinou prsu spojený pS2 peptid lidský (Jakowlev a kol. 1984, Prud homme a kol. 1985) a myší (Lefebvre a kol. 1993), intestinální faktor známý z lidí (Podolsky a kol. 1993, Hauser a kol. 1993) a krys (Suemori a kol. 1991, Chinneiy a kol. 1992). U lidí (Tomasetto a kol. 1990), prasat (Thim a kol. 1982) a myší (Tomasetto a kyol. 1990) byl popsán spasmolytický polypeptid (SP), který obsahuje dvě trojlístkové domény. Za normálních podmínek jsou v lidském gastrointestinálním traktu tvořeny tři trojlístkové peptidy hpS2, hlTF a hSP; hSP a hpS2 ve výstelkové mukózní vrstvě žaludku (Tomasetto a kol. 1990, Rio a kol. 1988) a hlTF ve výstelkové mukózní vrstvě tenkého a tlustého střeva (Podolsky a kol. 1993).

Fyziologická funkce trojlístkových peptidů není dobře známá. Za určitých podmínek jako je např. mukózní poškození při zánětu střev (Rio a kol. 1991, Poulsom a kol. 1992, Wright a kol. 1993) a žaludečních vředech a vředech dvanáctemíku (Rio a kol. 1991, Hanby a kol. 1993, Wright a kol. 1990) byla pozorována zvýšená exprese trojlístkových peptidů v trávicí soustavě. To bylo podnětem pro názor, že trojlístkové peptidy mají mukózní regenerační funkci. Důkaz o tom byl v současné době podán Dignassem a kol. 1994, Playford a kol. 1994 a Babyatsky a kol. 1994. Mechanismus, kterým trojlístkové peptidy uiychlují svou regenerační funkci, může být vazba mezi řetězy mucin-glykoproteinů za vzniku viskózního elastického gelu odolného proti trávicím enzymům (Thim 1994, Gajhede a kol. 1993).

V patentu WO 92/14 837 je popsáno klonování jedné krysí a lidské domény intestinálního trojlístkového faktoru pro léčení poruch trávicí soustavy.

Podstata vynálezu

Trojlístkový peptid v čisté formě obsahuje intestinální trojlístkový faktor - ITF, který se skládá ze dvou ITF monomerů spojených disulfídickou vazbou mezi dvěma cysteinovými zbytky obou monomerů v pozici 57 každého monomeru.

Byla objevena možnost přípravy trojlístkových faktorů s pouze jednou trojlístkovou doménou a se zajímavými farmakologickými vlastnostmi.

-1 CZ 289864 B6

Předkládaný vynález se tedy týká trojlístkových peptidů obsahujících jednu trojlístkovou doménu.

Jak je uvedeno výše, trojlístkové peptidy se považují za příspěvek k léčbě vředů trávicího ústrojí a jiných mukózních poruch, a to stabilizaci mukózní vrstvy v trávicí soustavě. Mechanismus této stabilizace není dosud známý. Rentgenová struktura porcinového pankreatického spasmolytického polypeptidů (PSP) ale ukázala (srov. Gajhede a kol. 1993), že tento má dvě trojlístkové domény a že většina zachovaných zbytků přispívá k 8 až 10 A velké štěrbině, která se nachází v každé trojlístkové doméně. Předběžné spojovací pokusy ukázaly, že se štěrbina může přizpůsobit části olisacharidového řetězce např. připojeného kmucinovému glykoproteinu. Pokud se skutečně jedná o tento případ, PSP se dvěma takovými štěrbinami je schopný spojení řetězců mucinů za pomoci jim k tvorbě ochranného gelu u kraje mukózního epitelu. Dosud není známo, zda trojlístkové peptidy s jednou trojlístkovou doménou (jako ITF a pS2) tvoří in vivo dimery pro uplatnění stejné funkce nebo zda mají různé mechanismy působení. Má se ale za to, že dimery takových trojlístkových peptidů mohou opravu spojovat řetězce mucinů, a tak tvořit aktivní formu peptidu.

V jiném aspektu se předkládaný vynález týká způsobu přípravy trojlístkového peptidu obsahujícího jednu trojlístkovou doménu. Způsob zahrnuje kultivaci vhodných hostitelských buněk transformovaných DNA sekvenčním kódováním trojlístkového peptidu obsahujícího jednu trojlístkovou doménu za podmínek připouštějících produkci peptidu a izolaci vzniklého trojlístkového peptidu z kultury.

V dalším aspektu se předkládaný vynález týká farmaceutického prostředku obsahujícího trojlístkový peptid, obsahující jednu trojlístkovou doménu, spolu s farmaceuticky vhodným ředidlem nebo přísadou.

V dalším aspektu se předkládaný vynález týká trojlístkového peptidu obsahujícího jednu trojlístkovou doménu pro použití jako léku a pro přípravu léků pro profylaxi nebo léčení poruch trávicí soustavy.

Faktor je konkrétně lidský ITF s monomemí aminokyselinovou sekvencí

ZEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPPIVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKPLQEAECT F kde Z je Glu, Gin nebo pyrGlu, nebo jeho homolog schopný dimerace a vykazují podobnou aktivitu, nebo lidský pS2 s monomemí aminokyselinovou sekvencí

ZAQTETCTVAPRERQNCGFPCTVTPSQCANKGCCFDDTVRGVPWCFYPNTID

VPPEEECEF kde Z je Glu, Gin nebo pyrGlu, nebo jeho homolog schopný ace a vykazující podobnou aktivitu.

Homology ITF nebo pS2 obsahují stejný cysteinový vzor a disulfídové uspořádání (obr. 1) a vykazují některé homologní sekvence (myslí se v odpovídajících pozicích buď identické aminokyseliny nebo tradiční substituce) v místě 1, 2 a 3. Stejné sekvence v aktivních místech obsahují 1 až 10 aminokyselinových zbytků a počet aminokyselinových zbytků v každém místě (nehledě na cystein) je 7 až 12, s výhodou 9 až 10.

-2CZ 289864 B6

Homolog pS2 má jednu nebo několik substituovaných, vynechaných nebo přidaných aminokyselin. Tyto změny jsou výhodně takové, aby substituce významně neovlivnila stavbu a aktivitu proteinu. Typické je vynechání 1 až 3 aminokyselin v aktivním místě a 1 až 10 aminokyselin v N a C koncových částech, přidání jedné amino nebo karboxy koncovky (jako aminokoncový methionin, malý spojovací peptid do 10 aminokyselin nebo malá část, která usnadňuje čištění jako polyhistidinová oblast), antigenního epitopu nebo vazebné domény (Ford a kol., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991). Příklady konzervativní substituce jsou v rámci bázických aminokyselin (arginin, lysin, histidin), kyselých (glutamová a asparagová kyselina), polárních (glutamin a asparagin), hydrofobních (leucin, izoleucin, valin), aromatických (fenylalanin, tryptofan, tyrosin) a malých aminokyselin (glycin, alanin, serin, threonin, methionin).

Odborníkům v této oblasti je zřejmé, že takovou substituci lze provést mimo rozhodující oblasti pro funkci molekuly a tak, aby výsledný polypeptid neztratil aktivitu. Aminokyseliny nezbytné pro aktivitu předkládaných troj lístkových polypeptidů, a tedy nesubstituovatelné se stanoví známými postupy jako je lokální mutageneze nebo alaninová skenovací mutageneze (Canningham a Wells, Science 244, 1081-1085, 1989). Podle novější techniky se pro každou aminokyselinu v molekule připraví mutace a produkt se testuje na biologickou aktivitu (např. mukózní léčba a léčba vředů trávicí soustavy) za stanovení aminokyselin rozhodujících pro aktivitu molekuly.

Homology jsou buď allelové varianty (tj. alternativní forma genu, která vzniká mutací) nebo změněné peptidy kódované mutovaných genem, ale s téměř stejnou aktivitou jako původní peptid. Proto může být mutace latentní (bez změn kódovaného peptidu), nebo kóduje peptidy se změněnými aminokyselinovými sekvencemi.

Homology předkládaného trojlístkového peptidu mohou být i druhové homology, tj. polypeptidy s podobnou aktivitou odvozené od jiných druhů, např. myší, krys, králíků, krav, prasat nebo žab.

Při výhodném provedení má trojlístkový peptid v souladu s předkládaným vynálezem přibližnou molekulovou hmotnost 13 000 a skládá se ze dvou monomemích troj lístkových peptidů spojených disulfidickou vazbou mezi dvěma cysteiny v pozici 58 monomeru typu pS2.

Trojlístkové peptidy se s výhodou připravují rekombinací DNA. DNA sekvence kódující troj lístkové peptidy lze izolovat přípravou genomické nebo cDNA knihovny a vyhledáním DNA sekvencí kódujících celý nebo část peptidu hybridizací s použitím syntetických oligonukleotidových sond podle standardních technik (srov. Sambrook a kol., Molecular Clonning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1989). Pro naše účely je DNA sekvence k'dující peptid s výhodou lidského původu, tj. odvozena z lidské genomické DNA nebo cDNA knihovny.

DNA sekvenci kódující trojlístkový peptid lze také připravit standardními metodami synteticky, např. fosfoamiditovou metodou (Beaucage a Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 18591869 nebo Matthes a kol., EMBO Joumal 3 (1984), 801-805). Fosfoamiditovou metodou se připraví oligonukleotidy (čištění, ztužení, vázání, klonování na vhodné vektory v automatickém DNA syntetizátoru).

DNA sekvenci lze také připravit polymerační řetězovou reakcí s použitím specifických základů (např. US 4 683 302, Saiki a kol., Science 239 (1988), 487-491 nebo Sambrook a kol. supra.)

DNA sekvence kódující trojlístkový peptid se obvykle zavádí do rekombinantního vektoru (jakýkoliv vektor, který může být snadno podroben rekombinačním postupům DNA). Výběr vektore často záleží na hostitelských buňkách, do kterých se má zavádět. Vektor tak může být autonomně replikační (existuje jako extrachromozomální jednotka, jejíž replikace je nezávislá na replikaci chromozomu), např. plazmid, nebo je, pokud se zavádí do hostitelských buněk,

-3CZ 289864 B6 integrován do genomu hostitelských buněk a replikován spolu s chromozomy, do kterých byl zaveden.

S výhodou se zde jedná o expresní vektor, kde je DNA sekvence kódující trojlístkový peptid operativně spojena s dalším segmentem nutným pro transkripci DNA. Obecně je expresní vektor odvozen od plazmidu nebo virové DNA, nebo obsahuje prvky obou. Termín „operativně spojena“ znamená, že jsou segmenty uspořádány tak, že je jejich funkce správná pro jejich účel určení, tj. transkripce začíná v promotoru a pokračuje přes DNA sekvenci kódující polypeptid.

Promotorem může být jakákoliv DNA sekvence s transkripční aktivitou ve vybrané hostitelské buňce a může být odvozena z genů kódujících homologní nebo heterologní bílkoviny hostitelské buňky.

Příklady vhodných promotorů pro řízení transkripce DNA kódující trojlístkový peptid jsou SV40 promotor (Subramani a kol., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864). MT-1 promotor (metalothioneinový gen) (Palmiter a kol., Science 222 (1983), 809-914) nebo hlavní promotor adenoviru 2.

Příklady vhodných promotorů pro použití v buňkách hmyzu jsou polyhedrinový promotor (US 4 745 051; Vasuvedan a kol., FEBS Lett. 311, (1992) 7-11), P10 promotor (J. M. Vlak a kol., J. Gen. Virology 69,1988, 765-775), Autograplza enlifomiea promotor základního proteinu polyhidrózního viru Autographa califomica (EP 397 485), promotor přímého raného genu 1 baciloviru (US 5 155 037; US 5 162 222) nebo promotor zpožděného raného genu baciloviru 39K (US 5 155 037; US 5 162 222).

Příklady vhodných promotorů pro použití v buňkách kvasinek zahrnují promotory zglykolytických genů kvasinek (Hitzeman a kol., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073 -12080; Alber a Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419 -434) nebo geny alkoholdehydrogenázy (Young a kol., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender a kol., eds.), Plenům Press, New York, 1982) nebo TPI1 (US 4,599,311) nebo ADH2-4c (Russell a kol., Nátuře 304 (1983), 652 - 654) promotory.

Příklady vhodných promotorů pro použití v buňkách vláknitých hub jsou např. promotor ADH3 (McKnight a kol., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099) nebo tpiA promotor. Příklady vhodných promotorů jsou tyto odvozené od genu kódujícího A. oryzae TAKA amylázu, Rhizomucor miehei aspartovou proteinázu, A. niger neutrální -amylázu, A. niger kyselinovzdomou a-amylázu, A. niger nebo A. awamori glukoamylázu (gluA), Rhizomucor miehei Iipasue, A. oryzae alkalickou proteázu, A. oryzae triosa-fosfát izomerázu nebo A. nidulans acetamidázu. Vhodné jsou promotory TAKA-amylázy a gluA (uvedeny např. v EP 238 023 a EP 383 779).

DNA sekvence kódující trojlístkový peptid může být také spojena s vhodným ukončením jako je ukončení lidského růstového hormonu (Palmiter a kol., Science 222, 1983, 809-814) nebo (pro houbovité hostitele) TPI1 (Alber a Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, 419-434) nebo ADH3 (McKnight a kol., The Embo J. 4, 1985, 2093-2099) ukončení. Vektory mohou dále obsahovat prvky jako polyadenylační signály (např. z oblasti SV40 nebo adenoviru 5 Elb), sekvenci transkripčního zlepšení (např. SV40 promotor) a translačního zlepšení (např. kódující RNA adenoviru VA RNA).

Rekombinované vektory dále obsahují DNA sekvence umožňující vektoru replikaci v příslušných hostitelských buňkách. Příkladem takové sekvence (pro savčí buňky) je SV40 počátek replikace SV40.

Pokud jsou hostitelské buňky kvasinky, jsou vhodné sekvence umožňující vektoru replikaci kvasinkové plazmidy 2 replikačního genu REP 1-3 a počátek replikace.

-4CZ 289864 B6

Vektor také obsahuje volitelný značkovač (např. gen, jehož produkt doplňuje defekt v hostitelských buňkách) jako gen kódující dihydrofolátreduktázu (DHFR) nebo Schizosaccharomyces pombe TPI gen (viz. P. R: Russell, Gene 40, 1985, 125-130) nebo gen způsobující odolnost proti lékům např. ampicillinu, kanamycinu, tetracyklinu, chloramfenykolu, neomycinu, hygromycinu nebo methotrexatu. Pro vláknité houby jsou volitelné značkovače amdS, pyrG, argB, nieD nebo sC.

Pro zavedení troj lístkového peptidu v souladu s předkládaným vynálezem do sekrečního kanálu hostitelské buňky lze v rekombinačním vektoru zajistit sekreční signální sekvenci (známou i jako řídicí, repro nebo pre sekvenci). Tato sekreční signální sekvence je spojena s DNA sekvencí kódující troj lístkový peptid ve správné čtecí části. Sekreční signální sekvence je obyčejně v pozici 5 k DNA sekvence kódující peptid. Sekreční signální sekvence může být normálně spojena s peptidem, nebo tvořit gen kódující jiný sekreční protein.

Produkci kvasinkami kóduje sekreční signální sekvence jakýmkoliv signálním peptidem, který zajišťuje účinné zavedení troj lístkového peptidu do sekrečního kanálu buňky. Signální peptid je přírodní forma, jeho část nebo syntetický peptid. Vhodné signální peptidy jsou -faktor signální peptidy (srovnej US 4 870 008), signální peptid amylázy myších slin (srovnej O. Hagenbuchle a kol., Nátuře 289, 1981, 643-646), modifikovaný signální peptid karboxypeptidázy (L. A. Vallas a kol., Cell 48, 1987, 887-897), signální peptid kvasinek BARI (WO 87/02670) nebo signální peptid aspartové proteázy 3 kvasinek (YAP3) (M. Egel-Mitani a kol., Yeast 6, 1990, 127-137).

Pro účinnou produkci kvasinkami lze sekvenci kódující řídicí peptid zavést i za signální sekvenci a nad DNA sekvenci kódující trojlístkový peptid. Funkce řídicího peptidu je produkovaný peptid zavést z endoplazmatického retikula do Golgiho aparátu a dále do sekreční dutiny pro sekreci do kultivačního média (tj. export troj lístkového peptidu přes buněčnou stěnu nebo alespoň přes buněčnou membránu do periplazmatického prostoru buňky kvasinky). Řídicí peptid je např. -faktor řídicí peptid kvasinek (jehož použití je popsáno např. v US 4 546 082, US 4 870 008, EP 16 201, EP 123 294, EP 123 544 a EP 163 529). Alternativně je řídicí peptid syntetický, tj. nevyskytující se v přírodě. Syntetický řídicí peptid lze konstruovat např. podle WO 89/02 463 nebo WO 92/11 378.

Pro použití u vláknitých hub lze signální peptid pohodlně odvodit od genu kódujícího Aspergillus sp. a amylázu nebo glukoamylázu, genu kódujícího Rhizomucor miehei lipázu nebo proteázu nebo Humicola lanuginosa lipázu. Signální peptid je s výhodou odvozen od genu kódujícího A. oryzae TAKA amylázu, A. niger neutrální -amylázu, A. niger kyselinostálou amylázu nebo A. niger glukoamylázu. Vhodné signální peptidy jsou uvedeny např. v EP 238 023 a EP 215 594.

Pro použití v buňkách hmyzu lze signální peptid pohodlně odvodit od genu hmyzu (WO 90/05783) jako je adipokinetický hormonální prekurzor signálního genu motýla Manduca sexta (US 5 023 328).

Postupy použité pro vázání DNA sekvencí kódujících trojlístkový peptid, promotoru a volitelně ukončení a/nebo sekreční signální sekvence a jejich zavedení do vhodného vektoru obsahujícího informaci nezbytnou pro replikaci jsou odborníkům v této oblasti dobře známé (např. Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Hostitelská buňka, do které se zavádí DNA sekvence kódující trojlístkový peptid, je jakákoliv buňka schopná produkce peptidu v její formě a zahrnuje buňky kvasinek, hub a vyšší eukaryotické buňky.

Příklady vhodných spojení savčích buněk jsou COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL (ATCCCCL39) nebo CHO (ATCC CCL 61). Způsoby transfekce savčích buněk a exprese DNA sekvencí zavedených do buněk popsali např.

-5CZ 289864 B6

Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621; Southem a Berg, J. Mol. Appl. Genet.l 1982), 327-341; Loyter a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422 - 426; Wigler a kol., Cell 14 (1978), 725; Corsaro a Pearson Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham a van der Eb, Virology 52 (1993), 456; a Neumann a kol., EMBO J. 1 (1982), 841-845.

Příklady vhodných buněk kvasinek jsou Saccharomyces spp. nebo Schizosacharomyces spp., zejména pak kolonie Saccharomyces cerevisiae nebo Saccharomyces kluyveri. Způsoby transformace kvasinek heterologní DNA a následná produkce heterologních polypeptidů je popsána v US 4 599 311, US 4 931 373, US 4 870 008, 5 037 743 a US 4 845 075 uvedených zde jako reference. Transformované buňky se vyberou podle fenotypu stanoveného volitelným značkovačem, běžné odolnosti proti lékům a schopnosti růstu bez přítomnosti jednotlivých živin, např. leucinu. Výhodný vektor pro použití u kvasinek je POTÍ uvedený v US 4 931 373. DNA sekvence kódující trojlístkový peptid je předcházena signální sekvencí a volitelně např. výše zmíněnou řídicí sekvencí. Další příklady vhodných kvasinek jsou kolonie Kluyveromyces jako K. lactis, Hansenula, např. H. polymorpha nebo Pichia, např. P. pastoris (Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, 3459-3465; US 4,882,279).

Dalšími příklady jsou vláknité houby, např. Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarim spp. nebo Trichoderma spp., zejména kolonie A. oryzae, A. nidulans nebo A. niger. Použití Aspergillus spp. pro expresi proteinů je popsáno např. v EP 272 277, EP 238 023, EP 184 438. Transformaci F. oxysponum lze např. provést podle Malardiera a kol., 1989, Gene 78: 147-136. Transformaci Trichoderma spp. lze např. provést podle EP 244 234.

Pokud se jako hostitelské buňky použijí vláknité houby, mohou být transformovány pomocí DNA v souladu s předkládaným vynálezem, a to pohodlně integrací konstrukční DNA chromozomu hostitelské buňky za získání rekombinované formy. Tato integrace je výhodná, protože DNA sekvence je pak v hostitelské buňce stabilnější. Integraci konstrukční DNA hostitelského chromozomu lze provést konvenčně např. homologní nebo heterologní rekombinací.

Transformaci buněk hmyzu a produkci heterologních polypeptidů lze pak provádět podle US 4 745 051; US 4 879 236; US 5 155 037; 5 162 222; EP 397 485, které jsou zde uvedeny jako reference. Buňky hmyzu, které lze použít jsou např. Lepidoptera jako Spodoptera fugiperda nebo Trichoplusia ni (US 5,077,214). Vhodné podmínky kultivace jsou uvedeny např. v WO 89/01 029 nebo WO 89/01 028 nebo v dříve uvedených pracích.

Výše popsané transformované hostitelské buňky se pak kultivují ve vhodné výživě za podmínek dovolujících expresi troj lístkového peptidů. Potom lze veškeiý nebo část výsledného peptidů získat z kultuiy v její formě. Médium použité pro kultivaci buněk je běžný materiál -jednoduché nebo složené médium obsahující vhodné doplňky. Vhodná média jsou komerčně dostupná nebo připravitelná podle publikovaných předpisů (např. Američan Type Culture Collection). Trojlístkový peptid vyprodukovaný buňkami se pak z kultury získává běžnými postupy zahrnujícími separaci hostitelských buněk z média odstředěním nebo filtrací, srážení bílkovinných složek roztoku nebo filtrátu solemi (např. síran amonný) a čištění různými chromatografickými technikami (např. iontově výměnná, gelová, afínitní, atd. chromatografie) podle příslušného typu polypeptidu.

Ve farmaceutickém prostředku v souladu s předkládaným vynálezem je trojlístkový peptid v různých farmaceutických formách popsaných např. v Remington s Pharmaceutical Science, 1985. Prostředek je ve formě vhodné pro soustavné podávání v injekcích nebo infuzích, a tedy se sterilní vodou nebo izotonickým nebo glukózovým roztokem. Prostředky lze sterilizovat běžnými technikami. Výsledný vodný roztok lze balit pro použití nebo filtrovat za aseptických podmínek a lyofílizovat. Lyofilizovaný prostředek lze před podáváním kombinovat se sterilním vodným roztokem. Prostředek obsahuje farmaceuticky vhodné přísady podle požadavků na napodobení

-6CZ 289864 B6 fyziologických podmínek jako pufry, tonika, atd. např. octan sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, atd.

Farmaceutický prostředek v souladu s předkládaným vynálezem lze přizpůsobit i pro nosní, transdermální a rektální podávání. Jako farmaceuticky vhodný nosič nebo ředidlo prostředku lze použít jakýkoliv běžný pevný nosič. Příklady pevných nosičů jsou laktóza, terra alba, sacharóza, mastek, želatina, agar, pektin, klovatina, stearát hořečnatý a kyselina stearová. Nosič nebo ředidlo podobně obsahuje živiny uvolňující látky jako glycerylmonostearát nebo glyceryldistearát nebo jejich směs s voskem. Množství pevného nosiče je 25 mg až 1 g.

Koncentrace troj lístkového peptidu v prostředku je 5 až 100% hmotnostních. Výhodná je koncentrace 50 až 100 % hmotnostních. Podávaná jednotka prostředkuje 1 až 200 mg, s výhodou 25 až 75 mg, nejvýhodněji 50 mg peptidu.

Jak je uvedeno výše, trojlístkový peptid v souladu s předkládaným vynálezem se považuje za aktivní formu peptidu, a takto se považuje za výhodné jeho použití pro prevenci nebo léčení poruch trávicí soustavy. Konkrétněji je určen pro léčení žaludečních vředů a vředů trávicího ústrojí, zánětu střev, Crohnovy choroby nebo poruch trávicího ústrojí způsobených léčením zářením, bakteriálních nebo jiných infekcí atd. Dávkování polypeptidů podávaného pacientům záleží na typu a závažnosti léčených poruch, ale obecně je 0,1 až 1 mg na kg váhy těla.

Přehled obrázků na výkresech

Předkládaný vynález je dále detailněji popsán na příkladech s odkazem na připojené obrázky, kde je:

Obr. 1 navržená struktura lidského troj lístkového faktoru ITF. Primární aminokyselinová sekvence je převzata od Hausera a kol., 1993, a disulfidická vazba umístěna homologně podle PSP a pS2 (Thim, 1988).

Obr. 2 HPLC roztoku z kvasinek HW756 pro expresi krysího ITF na reverzní fázi-koloně Vydac 214TP54

Obr. 3 iontově výměnná chromatografie na Fast Flow SP-sefaróze částečně čištěného lidského ITF. Množství hlTF (monomeru) a hlTF (u) bylo stanoveno analytickou HPLC. Čárky značí frakce spojené pro další čištění monomemí a jiné formy. Čárkovaná čára značí koncentraci NaCl v elučním roztoku.

Obr. 4 reverzní HPLC čištěného krysího ITF (A), lidského ITF monomeru (B) a lidského ITF (C) na koloně Vydac 214TP54 C4. Čárkované čáry značí koncentraci acetonitrilu v elučním roztoku.

Obr. 5 rekonstruované hmotnostní spektrum čištěného krysího ITF (A), lidského ITF monomeru (B) a lidského ITF (C).

Obr. 6 struktura formy lidského ITF.

Obr. 7 mapa omezení plazmidu KFN 1003.

Obr. 8 struktura plazmidu pHW756.

Obr. 9 struktura plazmidu pHW1066.

Příklady provedení vynálezu

Materiály a metody

Klonování krysího ITF (rITF) a lidského ITF (hlTF)

Klonování krysího a lidského ITF bylo prováděno podle WO 92/14837 a Suemori a kol., 1991 a Chineri a kol., 1992 (krysí ITF) a Podolsky a kol., 1993 a Hauser a kol., 1993 (lidský ITF).

Tvorba rITF a hlTF expresních plazmidů

Expresní plazmidy pHW756 pro sekreci krysího ITF a pHW 1066 pro sekreci lidského ITF byly vytvořeny jak je uvedeno na obr. 7-9. Kvasinkový expresní vektor pKFN1003 (WO 90/10 075) je odvozen od plazmidu CPOT (Kawasaki, G. Intemational Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Sept. 17-24, 1984, Edinburgh, Scotland, Abstr. str. 15.). Jako výběrový značkovač (Russell, P. R., Gene 40 (1985), 125-130) má Schizosaccharomyces pombe TPI gen (POT), jako promotor S.cerevisiae triosafosfátizomerázu (TPI) a ukončení pro kontrolu exprese (Alber, T. and Kawasaki, G. J. Mol. Appl. Genet.l (1982), 419-434).

Krysí ITF gen byl nejdříve klonován do Bluescript II KS(-) (Stratagene), ze kterého byl propagován podle obr. 8. Pomocný vektor pSX54 zajišťující klonovací polohy se skládá zpUClB a pDN1050 (Diderichsen, B., Poulsen, G. B., Jorgensen, S. T. Plasmid 30 (1993), 312-315). Syntetická DNA spojka Ncol-PflMl má následující sekvenci:

1858 : 5'-CATGGCTGAA.AGATTGGAAAAGAGACAAGAGTTCGTTGGTTTGTCTCCATCCCAATGT-3' 58 bp

1862 : 5'-TTGrGGATGGAGACAAACCAACGAACTCTTGTCTCTTTCCAATCTTTCAGC3' 52 bp

Spojka kóduje C-koncové (8) aminokyseliny pro řídicí sekvenci jak popsali Thim, L., Norris, K., Norris, F., Nielsen, P. F., Bjom, S., Christensen, M., Petersen, J. FEBS Lett. 318, (1993), 345352, s několika změnami ve výběru kodónu a N-koncovou část kiysího ITF genu: QEFVGLSPSQC. Řídicí a signální aminokyselinová sekvence je popsána tamtéž.:

MKAVFLVLSLIGFCWAQPVTGDESSVEIPEESLIIAEMAERLEKR.

Lidský ITF gen byl klonován do PUC 19 a propagován podle obr. 9.

Syntetická DNA spojka Ncol-BsaAl má následující sekvenci:

2292 : 5'-CATGGCTGAAAGATTGGAAAAGAGAAGAATAC-3' 34 bp

2287 : 5'-GTATTCTTCTCTCTTTTCCAATCZ'TTCAGC-3' 30 bp

Spojka kóduje C-koncové (8) aminokyseliny pro řídicí sekvenci, jak je popsáno pro rITF tvorbu a 3 N-koncové aminokyseliny pro hlTF gen: EEY. Řídicí a signální aminokyselinová sekvence je stejná jako výše.

Expresní plazmidy byly transformovány do S.cerevisiae MT 663 (E2-7B X El 1-36 a/, tpi/tpi, pep 4-3/pep 4-3) výběrem pro růst na glukóze jako živné půdě.

Transformované kvasinky pro expresi krysího a lidského ITF byly nazvány W756 a HW 1066.

-8CZ 289864 B6

Fermentace

Výše popsané transformované buňky byly kultivovány při 30 °C, 72 h ve kvasinkové peptonové dextróze (Sherman a kol., 1981), doplněné dalším kvasinkovým extraktem (60 g/1). Na konci fermentace byly dosaženy pro HW756 (rITF) a HW1066 (hlTF) OD hodnoty 153 a 232 při 660 nm. na konci fermentace bylo pH upraveno pomocí 1M kyseliny fosforečné na 2,5 a kvasinky byly separovány odstředěním při 3000 ot/min. po dobu 15 min.

Čištění recombinantu rITF

Koncentrace rITF ve fermentačním extraktu kvasinek a frakcích získaných během čištění byla měřena analytickou HPLC. Alikvoty (obvykle 50-200 1) byla nastřikovány na Vydac 214TP54 reverzní C4 HPLC kolonu (0,46 x 25 cm) temperovanou na 30 °C při průtoku 1,5 ml/min s 0,1 % (objemově) TFA v 15 % (objemově) acetonitrilu. Po 10 min. izokratické eluce byla koncentrace acetonitrilu v elučním roztoku zvýšena během 40 min na 55 % objemových. Absorbance byla měřena při 214 nm, formu rITF reprezentovaly tři pík}’ (26,5 min, 27,3 min, 28,2 min), viz. obr. 2. Kvantita byla stanovena pomocí kalibrovaného hSP standardu (Thim a kol., 1993).

Expresní úroveň pro rekombinant krysího ITF byla v předkládaném systému 113 mg/1.

Z 10 1 fermentoru bylo odstředěním získáno 8,7 1 fermentačního roztoku, který byl zředěn 14,8 1 destilované vody na menší vodivost. Vzorek byl čerpán na Fast Flow S-sefarázovou kolonu (Pharmacia) 5 x 42 cm při průtoku 600 ml/h. Před použitím byla kolona vyrovnána 50 mM pufrem (kyselina mravenčí) na pH 3,7. Krysí ITF byl vymýván z kolony 50 mM kyselinou mravenčí (pH 3,7) obsahující 50 mM NaCl. Při průtoku 600 m/h byly odebírány a na obsah rITF analyzovány 100 ml frakce. Frakce z předešlého kroku obsahující rITF byly spojeny (2,3 1) a čerpány na Amberchromovou (G—71) kolonu 5 x 10 cm. Před použitím byla kolona vyrovnána při průtoku 0,1 1/h na pH 4,8 pomocí 10 mM (octan amonný) pufru obsahujícího 60 % objemových ethanolu. Byly odebírány 10 ml frakce a spojeny podle obsahu rITF. Koncentrace ethanolu byla ve spojeném roztoku přidáním dvou objemů ethanolu (99,99 % objemových) zvýšena ze 60 % objemových na 87 % objemových a rITF byl vysrážen ochlazením směsi na-25 °C po dobu 16 h.

Sraženina byla odstředěna (lh, 10 000 g, - 25 °C) a při laboratorní teplotě rozpuštěna ve 130 ml mravenčí kyseliny (20 mM) s pH 3,0. Vzorek byl čerpán na Fast Flow S-sefarózovou kolonu (Pharmacia) 5 x 20 cm při průtoku 50 ml/h. Před použitím byla kolona vyrovnána na pH 3,0 pomocí 20 mM kyseliny mravenčí. Peptidy byly z kolony vymyty lineárním gradientem (1,5 1 50mM kyseliny mravenčí, pH 3,0 až 1,5 1 50mM kyseliny mravenčí, pH 3,0 obsahující 0,5 M NaCl). Při průtoku 80 ml/h byly odebírány 10 ml frakce a absorbance byla měřena při 280 nm. Frakce byly testovány na obsah rITF a podle něj spojeny. Krysí ITF byl dále čištěn preparativní HPLC. Spojené frakce (900 ml) byly čerpány na preparativní HPLC kolonu Vydac 214TP54 C4 (2,2 x 25 cm) vyrovnanou v 0,1 0 (objemových) TFA. Peptidy byly vymyty při 25 °C a průtoku 5 ml/min lineárním gradientem (540 ml) vytvořeným z MeCN/H2O/TFA (10 : 89,9: 0,1 objemově) a MeCN/H₂O/TFA (65 : 34,9 : 0,1 objemově). UV absorpce byla sledována při 280 nm a byly odebírány frakce po 10 ml a analyzovány na obsah rITF. Frakce obsahující rITF byly spojeny a objem zmenšen vakuovou centrifugou na 30 %. Z výsledného roztoku byl rITF izolován lyofilizací. Celkový výtěžek rITF z 8,7 1 fermentačního média byl 236 mg odpovídající celkovému výtěžku čištění 24 %.

-9CZ 289864 B6

Čištění rekombinantu hlTF

Koncentrace rITF ve fermentačním extraktu kvasinek a frakcích získaných během čištění byla měřena HPLC systémem stejným jako u rITF. Pomocí tohoto systému byly hmotnostní spektrometrií a sekvencí analýzou identifikovány dva píky (21,2 min. a 27,1 min.) jako a monomer hlTF. Expresní úroveň pro rekombinant lidského ITF byla v předkládaném systému 90 mg/1.

Z 101 fermentoru bylo odstředěním získáno 8,0 1 fermentačního roztoku. Vzorek byl třikrát dialyzován (vždy 24 h) proti 401 10 mM kyseliny mravenčí spH2,5. Vzorek byl čerpán (0,25 1/h) na Fast Flow S-sefarázovou kolonu (Pharmacia) 5 x 40 cm při průtoku 600 ml/h. Kolona byla promyta 5 1 20 mM pufru (kyselina mravenčí) s pH 2,5 a vymyta lineárním gradientem tvořeným 5 1 20 mM pufru (kyselina mravenčí) s pH 2,5 a 5 1 20 mM pufru (kyselina mravenčí) s pH 2,5 obsahující 1 M NaCl. Byly odebírány a na obsah hlTF analyzovány 100 ml frakce (obr. 3). Z kolony byly vymyty dvě formy hlTF: jedna reprezentovala monomer hlTF (vymyta 0,5 M NaCl) a druhá (vymyta 0,78 M NaCl). Frakce obsahující stejnou formu byly spojeny.

Každá frakce byla rozdělena na tři stejné díly po 700 ml a čerpána na kolonu Vydac 214TP54 C4 (2,2 x 25 cm) vyrovnanou v 0,1 % objemově TFA. Peptidy byly vymyty při průtoku 4 ml/min lineárním gradientem (540 ml) vytvořeným z MeCN/H₂O/TFA (10: 89,9: 0,1 objemově) a MeCN/H₂O/TFA (65 :34,9 : 0,1 objemově). UV absorpce byla sledována při 280 nm a byly odebírány frakce po 10 ml a analyzovány na obsah hlTF.

Frakce z předešlého kroku obsahující hlTF (monomer) a hlTF dimer byly odděleně spojeny a pH upraveno na 3,0. Vzorky byly odděleně čerpány na SP-sefarázovou HiLoad 16/10 (Pharmacia) kolonu (1,6 x 10 cm) pomocí 20 mM kyseliny mravenčí (pH 3,0) obsahující 40 % objemových ethanolu. Kolona byla promyta 80 ml vyrovnávacího pufru a vymyta lineárním gradientem při 4 ml/min tvořeným 200 ml 20 mM kyseliny mravenčí s pH 3,0; 40 % objemových ethanolu a 200 ml 20 mM kyseliny mravenčí s pH 3,0; 40 % objemových ethanolu obsahující 1 M NaCl. Byly odebírány a na obsah hlTF analyzovány 5 ml frakce.

Frakce obsahující stejnou formu byly spojeny a peptid vysrážen zvýšením koncentrace ethanolu na 90 % objemových a ochlazením směsi na - 25 °C po dobu 72 h. Sraženina byla odstředěna a lyofílizována. Celkový výtěžek z 8 1 fermentačního roztoku byl 256 mg hlTF (monomer) a 133 mg hlTF (), což odpovídá celkovému výtěžku čištění 50 % pro monomer a 65 % pro ().

Hmotnostní spektra byla měřena na API III LC/MS/MS (Sciex, Thomhill, Ont., Canada). Přístroj s trojitým kvadrupólem má m/z rozsah 2400 a je osazen pneumatickým elektrosprej (ion-sprej) interface (Bruins et al., 1987; Covey a kol., 1988). Vzorky byly nastřikovány stříkačkovou infuzní pumpou (Sage Instruments, Cambridge, MA) přes žhavenou kapiláru (75 m) při průtoku kapaliny 0,5 až 1 1/min. Stupnice (m/z) přístroje byla kalibrována amonným aduktem polypropylenglykolů (PPG) s nábojem 1 při jednotkovém rozlišení. Přesnost měření hmotnosti je obecně lepší než 0,02 %.

Obr. 4 uvádí analytické HPLC chromatogramy čištěného rITF (obr. 4A) a hlTF (obr. 4B a 4C). Rekombinovaný rITF obsahuje směs 3 velmi příbuzných peptidů, které jsme se nepokoušeli rozdělit. Při analýze elektrosprejovou MS byly nalezeny tři hlavní molámí hmotnosti odpovídající 13112,2; 13096,6 a 13078,8 (obr. 5A). Vypočtena molámí hmotnost monomem rITF, kde Cys-57 obsahuje volnou SH skupinu, je 6558,3. Vypočtená molámí hmotnost u rITF (s S-S můstkem mezi Cys-57) je 13114,5. Z nalezených molámích hmotností rekombinovaného rITF je zřejmé, že všechny 3 peptidy reprezentují dimemí formu rITF. Z jiných trojlístkových peptidů s Gin jako N-koncovou aminokyselinu např. PSP (Thim a kol., 1985 a Tomasetto a kol., 1990) je známé, že tyto zbytky mají tendenci kcyklizaci za vzniku pyrrolidonové karboxylové

-10CZ 289864 B6 kyseliny (pyrGlu). V případě rITF s předpovídanou N-koncovou sekvencí Gln-Glu-Phe-ValGly se jeví logické předpokládat, že N-koncový Gin mohl rovněž cyklizovat na pyrGlu formu. Taková změna by vedla ke snížení molámí hmotnosti rITF o 17 (1 pyrGlu) nebo 34 (2 pyrGlu) jednotek. Pozorované molámí hmotnosti 13096,6 a 13078,8 (obr. 5) odpovídají rITF sjednán resp. dvěma zcyklizovanými N-koncovými Gin. Vypočtená molámí hmotnost těchto forem je 13097,6 a 13080,6 a je v dobré shodě s experimentálními údaji. Závěrem z HPLC (obr. 4A) a MS analýzy (obr. 5A) tedy je, že rekombinovaný rITF obsahuje 3 různé dimery: první s dvěma N-koncovými Gin, druhý s jedním N-koncovým Gin a jedním N-koncovým pyrGln a třetí se dvěma N-koncovými pyrGln. Tabulka I uvádí aminokyselinové složení rITF v dobré shodě s očekávanými hodnotami. Obr. 5A a 5B ukazují čistotu monomeru a hlTF podle analytické HPLC (obr. 5C) jenž je poměrně čistý, zatímco monomer (obr. 5B) vykazuje znečištění látkami vymytými před peptidem, ale i po opětovné chromatografií látky s hlavním pikem byl získán podobný chromatogram (není uveden). To ukazuje spíše než na nečistoty na atypické chování monomeru hlTF na nevezní fázi. Dříve jsme pozorovali podobné chování vysoce čištěného porcinu PSP a rekombinovaného hSP (Thim a kol., 1993).

MS analýza monomeru ITF molámí hmotnost hlavního píku 6694,0 (obr. 5B). Molámí hmotnost vypočtená pro aminokyselinovou sekvenci (obr. 1) s předpokladem volné SH skupiny na Cys-57 je 6574,4. Analýza aminokyselinové sekvence v tabulce II ukazuje očekávanou N-koncovou sekvenci Glu-Glu-Tyr-Val-Gly. Analýza aminokyselinového složení (tabulka I) ukazuje kromě přítomnosti 7,3 (8) cysteinů očekávané hodnoty. Další cystein připojený k Cys-57 hlTF monomem zvýší molámí hmotnost na 6694,7, což je velmi blízko experimentální hodnotě 6694,0. Proto předpokládáme disulfidické spojení Cys-57 monomem hlTF s dalším cysteinem. Minoritní pík v hmotnostním spektru (obr. 5B) může reprezentovat jiný derivát Cys-57 nebo nečistotu.

Vypočítaná molámí hmotnost u hlTF, kde jsou dva y spojeny disulfídickou vazbou mezi dvěma Cys-57 zbytky je 13146,8. To je v dobré shodě s experimentální hodnotou 13147 (obr. 5C). Další pík v hmotnostním spektru (13169) pravděpodobně reprezentuje Na⁺ adukt u hlTF. Sekvenční analýza (tabulka I) i analýza aminokyselinového složení (tabulka II) jsou rovněž v dobré shodě s očekávanými hodnotami.

-11 CZ 289864 B6

Tabulka I

Aminokyselinové složení dimeru rITF, monomeru hlTF a dimeru hlT

Aminokys.	rITFí	dimer)	hlTF (m	onomer)	hlTF (d	imer)
Asx	11.92	(12)	6.00	(6)	12.01	(12)
Thra	8.00	(8)	2.03	(2)	4.01	(4)
Sera	9.86	(10)	2.04	(2)	4.01	(4)
Glx	15.98	(16)	6.92	(7)	14.00	(14)
Prob	12.48	(12)	n.d.c	(6)	n.d.c	(12)
Gly	6.02	(6)	4.20	(4)	8.09	(8)
Ala	2.04	(2)	3.91	(4)	7.90	(8)
Val	11.92	(12)	4.92	(5)	9.86	(10)
Met	1.80	(2)	0.00	(0)	0.00	(0)
lle	1.98	(2)	1.17	(1)	2.13	(2)
Leu	3.92	(4)	2.03	(2)	3.99	(4)
Tyrb	2.02	(2)	1.94	(2)	3.92	(4)
Phe	7.88	(8)	2.93	(3)	5.94	(6)
Lys	2.14	(2)	3.07	(3)	6.09	(6)
His	0.00	(0)	0.99	(1)	2.03	(2)
Trp	2.16	(2)	n.d.c	(1)	n.d.c	(2)
Arg	3.94	(4)	2.96	(3)	6.05	(6)
PE-€ysb	12.70	(14)	7.30	(7)	13.80	(14)
Celkem		(H8)		(59)		(118)

Hodnoty v závorkách jsou odvozeny zcDNA: rITF (Chinery a kol., 1992), hlTF (Hauser a kol., 1993), io ^stanoveno extrapolací na počátek hydrolýzy, ^b)stanoveno hydrolýzou ve 4 M methansulfonové kyselině, '^nebylo stanoveno.

-12CZ 289864 B6

Tabulka II

Automatizované Edman-odbourání dimeru rITF, monomeru hlTF a dimeru hlTF

Cyklus č.	rITF (dimer)	hlTF (monomer)	hlTF (dimer)
PTA-A.A.	Výtěžek (pmol)	PTH-A.A.	Výtěžek (pmol)	Výtěžek	(pmol)
1	Glu	989	Glu	1517	Glu	2227
2	Glu	731	Glu	1998	Glu	2361
3	Phe	967	Tyr	2205	Tyr	2528
4	Val	1072	Val	2409	Val	2431
5	Gly	701	Gly	1625	Gly	1803
6	Leu	838	Leu	2318	Leu	2253
7	Ser	497	Ser	852	Ser	904
8	Pro	965	Ala	1729	Ala	1712
9	Ser	406	Asn	1394	Asn	1518
10	Gin	820	Gin	1494	Gin	1499
11	(Cys)	n.d.	(Cys)	n.d.	(Cys)	n.d.
12	Met	581	Ala	1243	Ala	1377
13	Val	971	Val	1468	Val	1356
40	Pro	962	Pro	1223	Pro	1195
15	Ala	529	Ala	1248	Ala	1249
16	Asn	791	Lys	1270	Lys	1050
17	Val	952	Asp	937	Asp	991
18	Arg	331	Arg	891	Arg	964
19	Val	956	Val	1002	Val	1069
20	Asp	476	Asp	847	Asp	932
21	(Cys)	n.d.	(Cys)	n.d.	Cys	n.d.
22	Gly	381	Gly	709	Gly	703
23	Tyr	352	Tyr	894	Tyr	792
24	Pro	927	Pro	766	Pro	701
25	Thr	498	His	309	His	236
26	Val	812	Val	755	Val	670
27	Thr	510	Thr	505	Thr	576
28	Ser	225	Pro	458	Pro	473
29	Glu	398	Lys	444	Lys	321
30	Gin	499	Glu	219	Glu	304
31	(Cys)	n.d.	(Cys)	n.d.	(Cys)	n.d.
32	Asn	557	Asn	312	Asn	300
33	Asn	591	Asn	464	Asn	503
34	Arg	196	Arg	325	Arg	294
35	Gly	222	Gly	239	Gly	223
36	(Cys)	n.d.	(Cys)	n.d.	(Cys)	n.d.
37	(Cys)	n.d.	(Cys)	n.d.	(Cys)	n.d.
38	Phe	335	Phe	189	Phe	174
39	Asp	275	Asp	133	Asp	137
40	Ser	164	Ser	49	Ser	43
R.Y		97.0%		93.2%		92.5%

-13CZ 289864 B6

Průmyslová využitelnost

Předkládaný vynález se týká troj lístkových peptidů, způsobu jejich přípravy, farmaceutických prostředků, které je obsahují a jejich použití pro léčení gastrointestinálních poruch. Za určitých podmínek jako je např. mukózní poškození při zánětu střev (Rio a kol. 1991, Poulsom a kol. 1992, Wright a kol. 1993) a žaludečních vředech a vředech dvanáctníku (Rio a kol. 1991, Hanby a kol. 1993, Wright a kol. 1990) byla pozorována zvýšená exprese troj lístkových peptidů v trávicí soustavě. To bylo podnětem pro názor, že trojlístkové peptidy mají mukózní regenerační funkci, o čemž byl v současné době podán důkaz Dignassem a kol. 1994, Playford a kol. 1994 a Babyatsky a kol. 1994.

Odkaz na literaturu

Babyatsky, M. W., Thim, L., Podolsky, D. K. (1994) Gastroenterology 106, A43 (abstract).

Bruins, A. P., Covey, T. R., & Henion, J. D. (19S7) Anal. Chem. 59,2642-2646.

Chinery, R., Poulsom, R., Rogers, L. A., Jeffery, R. E. Longcroft, J. M., Hanby, A. M., & Wright, N. A. (1992) Biochem. J. 285, 5-8.

Covey, T. R., Bonner, R. F., Shushan, B. I., & Henion, J. D. (1988) Rapid Commun. Mass Spectrom. 2,249-256.

Dignass, A., Lynch-Devaney, K., Kindon, H., Thim, L., & Podolsky, D. K. (1994) J. Clin. Invest, (in press).

Friedman, M., Krull, L. H., Cavins, J. F. (1970), J. Biol. Chem. 245, 3868-3871.

Gajhede, M., Petersen, Τ. N., Henriksen, A., Petersen, J. F. W., Dauter, Z., Wilson, K. S., & Thim, L. (1993) Structure 1,253-262.

Hanby, A. M., Poulsom, R., Elia, G., Singh, S., Longcroft, J. M., & Wright, N. A. (1993) J. Pathol. 169, 355-360.

Hauser, F., & Hoffmann, W. (1991) J. Biol. Chem. 266,21206-21309.

Hauser, F„ Roeben, C., & Hoffmann, W. (1992a) J. Biol. Chem. 267, 14451-14455.

Hauser, F., & Hoffmann, W. (1992b) J. Biol. Chem. 267, 24620-24624.

Hauser, F., Poulsom, R., Chinery, R., Rogers, L. A., Hanby, A. M., Wright, N. A., & Hoffmann, W. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. 90, 6961-6965.

Hoffmann, W. (1988) J. Biol. Chem. 263, 7686-7690.

Hoffmann, W., & Hauser, F. (1993) Trends Biochem. Sci. 7,239-243.

Jakowlew, S. B., Breathnach, R., Jeltsch, J.-M., Masiakowski, P., Chambon, P. (1984) Nucleic AcidRes. 12,2861-2878.

Lefebvre, O., Wolf, C., Kedinger, M. Chenard, M.-P., Tomasetto, C., Chambon, P., & Rio, M. C. (1993) J. Cell. Biol. 122,191-198.

- 14CZ 289864 B6

Playford, R. J., Marchbank, T., Chinery, R., Evison, R., Pignattelli, M., Bolton, R., Thim, L., & Hanby, A. M. (1994) Gastroenterology (in press).

Podolsky, D. K., Lynch-Devaney, K., Stow, J. L., Oates, P., Murgue, B., DeBeaumont, M., Sands, Β. E., & Makida, Y. R. (1993) J Biol. Chem. 268, 6694-6702.

Poulsom, R., Chinery, R., Sarraf, C., Lalani, E.-N., Stamp, E., Elia, G., Wright, N. (1992) Gastroenterology 27,11-28.

Poulsom, R., & Wright, N. A. (1993) Am. J. Physiol. 265, G205-G213.

Pruďhomme, J. F., Fridlansky, F., Le Cunff, M., Atger, M., Mercier-Bodart, C., Pichon, MF., & Milgrom, E. (1985) DNA 4,11-21.

Rio, M. C., Bellocq, J. P., Daniel, J. Y., Tomasetto, C., Lathe, R., Chenard, Μ. P., Batzenschlager, A., & Chambon, P. (1988) Science 241, 705-708.

Rio., M.-C., Chenard, M.-P., Wolf, C., Marcellin, L., Tomasetto, C., Lathe, R., Bellocq, JP., & Chambon, P. (1991) Gastroenterology 100,375-379.

Ruegg, U. Th., & Rudinger, J. (1974) Isr. J. Chem 12,391-401.

Sherman, F., Fink, G. R., & Hicks, J. B. (1981) Methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Suemori, S., Lynch-Devaney, K.., & Podolsky, D. K. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. 88, 11017— 11021:

Thim, L., Jorgensen, K. H., & Jorgensen, K. D. (1982) Regál. Peptides 3,221-230.

Thim, L., Thomsen, J., Christensen, M., & Jorgensen, K. H. (1985) Biochem. Biophys. Acta 827, 410-418.

Thim, L., Hansen, Μ. T., Norris, K., Hoegh, I., Boel, E., Forstrom, J., Ammerer, G., & Fiil, L. (1986) Proč. Nati. Acad. Sci. 83, 6766-6770.

Thim, Lk. Hansen, Μ. T., & Soerensen, A. R. (1987) FEBSLett. 212, 307-312.

Thim, L. (1989) FEBSLett. 250, 85-90.

Thim, L., Norris, K., Norris, F., Nielsen, P. F., Bjorn, S. E., Christensen, M., Petersen, J. (1993) FEBSLett. 318,345-352.

Thim, L. (1994) Digestion 55, 353-360.

Tomasetto, C., Rio, M., Gautier, C., Wolf, C., Hareuveni, M., Chambon, P., & Lathe, R. (1990) EMBOJ. 9, 407-414.

Wright, N. A., Pike, C., & Elia, G. (1990) Nátuře 343, 82-85.

Wright, N. A., Poulsom, R., Stamp, G., van Norden, S., Sarraf, C., Elia, G., Ahnen, D., Jeffery, R., Longcroft, J., Pike, C., Rio, M., & Chambon, P. (1993) Gastroenterology 104,12-20.

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Trojlístkový peptid v čisté formě obsahující intestinální trojlístkový faktor -ITF, který se skládá ze dvou ITF monomerů spojených disulfidickou vazbou mezi dvěma cysteinovými zbytky obou monomerů v pozici 57 každého monomeru.
2. 2. Peptid podle nároku 1, kterým je lidský intestinální trojlístkový faktor - ITF.
3. 3. Způsob přípravy troj lístkového peptidů podle nároku 1,vyznačující se tím, že se kultivují vhodné hostitelské buňky transformované DNA sekvencí kódující trojlístkový peptid obsahující jednoduchou troj lístkovou doménu a získá se vzniklý dimemí trojlístkový peptid z kultury.
4. 4. Farmaceutický prostředek, vy znač u j í cí se tí m , že obsahuje trojlístkový peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 spolu s farmaceuticky vhodným ředidlem nebo přísadou.
5. 5. Trojlístkový peptid podle nároku 1 pro použití jako léčivo.
6. 6. Použití troj lístkového peptidů podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro profylaxi nebo léčení poruch trávicí soustavy.