CZ289864B6 - Trojlístkový peptid, způsob přípravy, farmaceutický prostředek a pouľití trojlístkového peptidu - Google Patents
Trojlístkový peptid, způsob přípravy, farmaceutický prostředek a pouľití trojlístkového peptidu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ289864B6 CZ289864B6 CZ19993618A CZ361899A CZ289864B6 CZ 289864 B6 CZ289864 B6 CZ 289864B6 CZ 19993618 A CZ19993618 A CZ 19993618A CZ 361899 A CZ361899 A CZ 361899A CZ 289864 B6 CZ289864 B6 CZ 289864B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- peptide
- trefoil
- itf
- ritf
- peptides
- Prior art date
Links
- 108010007389 Trefoil Factors Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 102000007641 Trefoil Factors Human genes 0.000 title claims abstract description 52
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 30
- 102100039145 Trefoil factor 3 Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108010078184 Trefoil Factor-3 Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims abstract description 3
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims abstract description 3
- 102000014456 Trefoil Factor-3 Human genes 0.000 claims abstract 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 57
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 20
- 101000889485 Homo sapiens Trefoil factor 3 Proteins 0.000 claims description 11
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 abstract 1
- 101100424932 Rattus norvegicus Tff3 gene Proteins 0.000 description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 23
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 22
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 21
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 101100481012 Homo sapiens TFF3 gene Proteins 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 235000004035 Cryptotaenia japonica Nutrition 0.000 description 11
- 235000015724 Trifolium pratense Nutrition 0.000 description 11
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 9
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 7
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 6
- 108010056579 pancreatic spasmolytic polypeptide Proteins 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 5
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 5
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- 101150033985 TPI gene Proteins 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 3
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 101150080369 tpiA gene Proteins 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IZHVBANLECCAGF-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-(octadecanoyloxy)propyl octadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC IZHVBANLECCAGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034042 Alcohol dehydrogenase 1C Human genes 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 2
- 101000796894 Coturnix japonica Alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 2
- 206010061459 Gastrointestinal ulcer Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000780463 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1C Proteins 0.000 description 2
- 101000801742 Homo sapiens Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101000800823 Rattus norvegicus Trefoil factor 3 Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 description 2
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 108010088411 Trefoil Factor-2 Proteins 0.000 description 2
- 102100039172 Trefoil factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 2
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 2
- 102100033598 Triosephosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 101150021650 gluA gene Proteins 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 229960004717 insulin aspart Drugs 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 239000001788 mono and diglycerides of fatty acids Substances 0.000 description 2
- VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N novorapid Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N 0.000 description 2
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 108010013137 spasmolytic polypeptide Proteins 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OZDAOHVKBFBBMZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminopentanedioic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)C(N)CCC(O)=O OZDAOHVKBFBBMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 101800002326 Adipokinetic hormone Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000269350 Anura Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 241001367049 Autographa Species 0.000 description 1
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100280051 Brucella abortus biovar 1 (strain 9-941) eryH gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101100295959 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) arcB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000125500 Hedypnois rhagadioloides Species 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 108700001097 Insect Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000235087 Lachancea kluyveri Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000255908 Manduca sexta Species 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100235161 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) lerI gene Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 240000007930 Oxalis acetosella Species 0.000 description 1
- 235000008098 Oxalis acetosella Nutrition 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710180313 Protease 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101000968489 Rhizomucor miehei Lipase Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241000223258 Thermomyces lanuginosus Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 108091034131 VA RNA Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010015780 Viral Core Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010048241 acetamidase Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150069003 amdS gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 101150008194 argB gene Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000008993 bowel inflammation Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940074045 glyceryl distearate Drugs 0.000 description 1
- 229940075507 glyceryl monostearate Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012931 lyophilized formulation Substances 0.000 description 1
- 101150039489 lysZ gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 1
- 229940079889 pyrrolidonecarboxylic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001256 tonic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Trojl stkov² peptid ve skute n ist form obsahuj c intestin ln trojl stkov² faktor - ITF, kter² se skl d ze dvou ITF monomer spojen²ch disulfidickou vazbou mezi dv ma cysteinov²mi zbytky obou monomer v pozici 57 ka d ho monomeru. Zp sob p° pravy trojl stkov ho peptidu a jeho pou it pro p° pravu l iva pro profylaxi nebo l en poruch tr vic soustavy.\
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká troj lístkových peptidů, způsobu jejich přípravy, farmaceutických prostředků, které je obsahují a jejich použití pro léčení gastrointestinálních poruch.
Dosavadní stav techniky
Trojlístkové peptidy tvoří skupinu, která se vyskytuje hlavně ve spojení s gastrointestinálním traktem. Trojlístkové peptidy savců obsahují jednu nebo několik troj lístkových domén (Thimakol. 1989), kde je každá tvořena 38 nebo 39 aminokyselinami, se šesti cysteiny spojenými v konfiguraci 1-5, 2-4 a 3-6 za vzniku charakteristické trojlístkové struktury (Thim 1989).
Dosud známé trojlístkové peptidy savců obsahují jednu nebo dvě trojlístkové domény (přehled viz. Thim, 1994, Poulsom a Wright, 1993, Hoffmann a Hauser, 1993). Jsou popsány žabí (Xenopus leavis) peptidy a proteiny obsahující jednu (Hauser a Hoffmann 1991), dvě (Hauser a kol. 1992a), čtyři (Hoffmann 1988) nebo šest (Hauser a Hoffmann 1992b) trojlístkových domén. Trojlístkové peptidy savců obsahující jednu doménu jsou s rakovinou prsu spojený pS2 peptid lidský (Jakowlev a kol. 1984, Prud homme a kol. 1985) a myší (Lefebvre a kol. 1993), intestinální faktor známý z lidí (Podolsky a kol. 1993, Hauser a kol. 1993) a krys (Suemori a kol. 1991, Chinneiy a kol. 1992). U lidí (Tomasetto a kol. 1990), prasat (Thim a kol. 1982) a myší (Tomasetto a kyol. 1990) byl popsán spasmolytický polypeptid (SP), který obsahuje dvě trojlístkové domény. Za normálních podmínek jsou v lidském gastrointestinálním traktu tvořeny tři trojlístkové peptidy hpS2, hlTF a hSP; hSP a hpS2 ve výstelkové mukózní vrstvě žaludku (Tomasetto a kol. 1990, Rio a kol. 1988) a hlTF ve výstelkové mukózní vrstvě tenkého a tlustého střeva (Podolsky a kol. 1993).
Fyziologická funkce trojlístkových peptidů není dobře známá. Za určitých podmínek jako je např. mukózní poškození při zánětu střev (Rio a kol. 1991, Poulsom a kol. 1992, Wright a kol. 1993) a žaludečních vředech a vředech dvanáctemíku (Rio a kol. 1991, Hanby a kol. 1993, Wright a kol. 1990) byla pozorována zvýšená exprese trojlístkových peptidů v trávicí soustavě. To bylo podnětem pro názor, že trojlístkové peptidy mají mukózní regenerační funkci. Důkaz o tom byl v současné době podán Dignassem a kol. 1994, Playford a kol. 1994 a Babyatsky a kol. 1994. Mechanismus, kterým trojlístkové peptidy uiychlují svou regenerační funkci, může být vazba mezi řetězy mucin-glykoproteinů za vzniku viskózního elastického gelu odolného proti trávicím enzymům (Thim 1994, Gajhede a kol. 1993).
V patentu WO 92/14 837 je popsáno klonování jedné krysí a lidské domény intestinálního trojlístkového faktoru pro léčení poruch trávicí soustavy.
Podstata vynálezu
Trojlístkový peptid v čisté formě obsahuje intestinální trojlístkový faktor - ITF, který se skládá ze dvou ITF monomerů spojených disulfídickou vazbou mezi dvěma cysteinovými zbytky obou monomerů v pozici 57 každého monomeru.
Byla objevena možnost přípravy trojlístkových faktorů s pouze jednou trojlístkovou doménou a se zajímavými farmakologickými vlastnostmi.
-1 CZ 289864 B6
Předkládaný vynález se tedy týká trojlístkových peptidů obsahujících jednu trojlístkovou doménu.
Jak je uvedeno výše, trojlístkové peptidy se považují za příspěvek k léčbě vředů trávicího ústrojí a jiných mukózních poruch, a to stabilizaci mukózní vrstvy v trávicí soustavě. Mechanismus této stabilizace není dosud známý. Rentgenová struktura porcinového pankreatického spasmolytického polypeptidů (PSP) ale ukázala (srov. Gajhede a kol. 1993), že tento má dvě trojlístkové domény a že většina zachovaných zbytků přispívá k 8 až 10 A velké štěrbině, která se nachází v každé trojlístkové doméně. Předběžné spojovací pokusy ukázaly, že se štěrbina může přizpůsobit části olisacharidového řetězce např. připojeného kmucinovému glykoproteinu. Pokud se skutečně jedná o tento případ, PSP se dvěma takovými štěrbinami je schopný spojení řetězců mucinů za pomoci jim k tvorbě ochranného gelu u kraje mukózního epitelu. Dosud není známo, zda trojlístkové peptidy s jednou trojlístkovou doménou (jako ITF a pS2) tvoří in vivo dimery pro uplatnění stejné funkce nebo zda mají různé mechanismy působení. Má se ale za to, že dimery takových trojlístkových peptidů mohou opravu spojovat řetězce mucinů, a tak tvořit aktivní formu peptidu.
V jiném aspektu se předkládaný vynález týká způsobu přípravy trojlístkového peptidu obsahujícího jednu trojlístkovou doménu. Způsob zahrnuje kultivaci vhodných hostitelských buněk transformovaných DNA sekvenčním kódováním trojlístkového peptidu obsahujícího jednu trojlístkovou doménu za podmínek připouštějících produkci peptidu a izolaci vzniklého trojlístkového peptidu z kultury.
V dalším aspektu se předkládaný vynález týká farmaceutického prostředku obsahujícího trojlístkový peptid, obsahující jednu trojlístkovou doménu, spolu s farmaceuticky vhodným ředidlem nebo přísadou.
V dalším aspektu se předkládaný vynález týká trojlístkového peptidu obsahujícího jednu trojlístkovou doménu pro použití jako léku a pro přípravu léků pro profylaxi nebo léčení poruch trávicí soustavy.
Faktor je konkrétně lidský ITF s monomemí aminokyselinovou sekvencí
ZEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPPIVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKPLQEAECT F kde Z je Glu, Gin nebo pyrGlu, nebo jeho homolog schopný dimerace a vykazují podobnou aktivitu, nebo lidský pS2 s monomemí aminokyselinovou sekvencí
ZAQTETCTVAPRERQNCGFPCTVTPSQCANKGCCFDDTVRGVPWCFYPNTID
VPPEEECEF kde Z je Glu, Gin nebo pyrGlu, nebo jeho homolog schopný ace a vykazující podobnou aktivitu.
Homology ITF nebo pS2 obsahují stejný cysteinový vzor a disulfídové uspořádání (obr. 1) a vykazují některé homologní sekvence (myslí se v odpovídajících pozicích buď identické aminokyseliny nebo tradiční substituce) v místě 1, 2 a 3. Stejné sekvence v aktivních místech obsahují 1 až 10 aminokyselinových zbytků a počet aminokyselinových zbytků v každém místě (nehledě na cystein) je 7 až 12, s výhodou 9 až 10.
-2CZ 289864 B6
Homolog pS2 má jednu nebo několik substituovaných, vynechaných nebo přidaných aminokyselin. Tyto změny jsou výhodně takové, aby substituce významně neovlivnila stavbu a aktivitu proteinu. Typické je vynechání 1 až 3 aminokyselin v aktivním místě a 1 až 10 aminokyselin v N a C koncových částech, přidání jedné amino nebo karboxy koncovky (jako aminokoncový methionin, malý spojovací peptid do 10 aminokyselin nebo malá část, která usnadňuje čištění jako polyhistidinová oblast), antigenního epitopu nebo vazebné domény (Ford a kol., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991). Příklady konzervativní substituce jsou v rámci bázických aminokyselin (arginin, lysin, histidin), kyselých (glutamová a asparagová kyselina), polárních (glutamin a asparagin), hydrofobních (leucin, izoleucin, valin), aromatických (fenylalanin, tryptofan, tyrosin) a malých aminokyselin (glycin, alanin, serin, threonin, methionin).
Odborníkům v této oblasti je zřejmé, že takovou substituci lze provést mimo rozhodující oblasti pro funkci molekuly a tak, aby výsledný polypeptid neztratil aktivitu. Aminokyseliny nezbytné pro aktivitu předkládaných troj lístkových polypeptidů, a tedy nesubstituovatelné se stanoví známými postupy jako je lokální mutageneze nebo alaninová skenovací mutageneze (Canningham a Wells, Science 244, 1081-1085, 1989). Podle novější techniky se pro každou aminokyselinu v molekule připraví mutace a produkt se testuje na biologickou aktivitu (např. mukózní léčba a léčba vředů trávicí soustavy) za stanovení aminokyselin rozhodujících pro aktivitu molekuly.
Homology jsou buď allelové varianty (tj. alternativní forma genu, která vzniká mutací) nebo změněné peptidy kódované mutovaných genem, ale s téměř stejnou aktivitou jako původní peptid. Proto může být mutace latentní (bez změn kódovaného peptidu), nebo kóduje peptidy se změněnými aminokyselinovými sekvencemi.
Homology předkládaného trojlístkového peptidu mohou být i druhové homology, tj. polypeptidy s podobnou aktivitou odvozené od jiných druhů, např. myší, krys, králíků, krav, prasat nebo žab.
Při výhodném provedení má trojlístkový peptid v souladu s předkládaným vynálezem přibližnou molekulovou hmotnost 13 000 a skládá se ze dvou monomemích troj lístkových peptidů spojených disulfidickou vazbou mezi dvěma cysteiny v pozici 58 monomeru typu pS2.
Trojlístkové peptidy se s výhodou připravují rekombinací DNA. DNA sekvence kódující troj lístkové peptidy lze izolovat přípravou genomické nebo cDNA knihovny a vyhledáním DNA sekvencí kódujících celý nebo část peptidu hybridizací s použitím syntetických oligonukleotidových sond podle standardních technik (srov. Sambrook a kol., Molecular Clonning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1989). Pro naše účely je DNA sekvence k'dující peptid s výhodou lidského původu, tj. odvozena z lidské genomické DNA nebo cDNA knihovny.
DNA sekvenci kódující trojlístkový peptid lze také připravit standardními metodami synteticky, např. fosfoamiditovou metodou (Beaucage a Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 18591869 nebo Matthes a kol., EMBO Joumal 3 (1984), 801-805). Fosfoamiditovou metodou se připraví oligonukleotidy (čištění, ztužení, vázání, klonování na vhodné vektory v automatickém DNA syntetizátoru).
DNA sekvenci lze také připravit polymerační řetězovou reakcí s použitím specifických základů (např. US 4 683 302, Saiki a kol., Science 239 (1988), 487-491 nebo Sambrook a kol. supra.)
DNA sekvence kódující trojlístkový peptid se obvykle zavádí do rekombinantního vektoru (jakýkoliv vektor, který může být snadno podroben rekombinačním postupům DNA). Výběr vektore často záleží na hostitelských buňkách, do kterých se má zavádět. Vektor tak může být autonomně replikační (existuje jako extrachromozomální jednotka, jejíž replikace je nezávislá na replikaci chromozomu), např. plazmid, nebo je, pokud se zavádí do hostitelských buněk,
-3CZ 289864 B6 integrován do genomu hostitelských buněk a replikován spolu s chromozomy, do kterých byl zaveden.
S výhodou se zde jedná o expresní vektor, kde je DNA sekvence kódující trojlístkový peptid operativně spojena s dalším segmentem nutným pro transkripci DNA. Obecně je expresní vektor odvozen od plazmidu nebo virové DNA, nebo obsahuje prvky obou. Termín „operativně spojena“ znamená, že jsou segmenty uspořádány tak, že je jejich funkce správná pro jejich účel určení, tj. transkripce začíná v promotoru a pokračuje přes DNA sekvenci kódující polypeptid.
Promotorem může být jakákoliv DNA sekvence s transkripční aktivitou ve vybrané hostitelské buňce a může být odvozena z genů kódujících homologní nebo heterologní bílkoviny hostitelské buňky.
Příklady vhodných promotorů pro řízení transkripce DNA kódující trojlístkový peptid jsou SV40 promotor (Subramani a kol., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864). MT-1 promotor (metalothioneinový gen) (Palmiter a kol., Science 222 (1983), 809-914) nebo hlavní promotor adenoviru 2.
Příklady vhodných promotorů pro použití v buňkách hmyzu jsou polyhedrinový promotor (US 4 745 051; Vasuvedan a kol., FEBS Lett. 311, (1992) 7-11), P10 promotor (J. M. Vlak a kol., J. Gen. Virology 69,1988, 765-775), Autograplza enlifomiea promotor základního proteinu polyhidrózního viru Autographa califomica (EP 397 485), promotor přímého raného genu 1 baciloviru (US 5 155 037; US 5 162 222) nebo promotor zpožděného raného genu baciloviru 39K (US 5 155 037; US 5 162 222).
Příklady vhodných promotorů pro použití v buňkách kvasinek zahrnují promotory zglykolytických genů kvasinek (Hitzeman a kol., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073 -12080; Alber a Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419 -434) nebo geny alkoholdehydrogenázy (Young a kol., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender a kol., eds.), Plenům Press, New York, 1982) nebo TPI1 (US 4,599,311) nebo ADH2-4c (Russell a kol., Nátuře 304 (1983), 652 - 654) promotory.
Příklady vhodných promotorů pro použití v buňkách vláknitých hub jsou např. promotor ADH3 (McKnight a kol., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099) nebo tpiA promotor. Příklady vhodných promotorů jsou tyto odvozené od genu kódujícího A. oryzae TAKA amylázu, Rhizomucor miehei aspartovou proteinázu, A. niger neutrální -amylázu, A. niger kyselinovzdomou a-amylázu, A. niger nebo A. awamori glukoamylázu (gluA), Rhizomucor miehei Iipasue, A. oryzae alkalickou proteázu, A. oryzae triosa-fosfát izomerázu nebo A. nidulans acetamidázu. Vhodné jsou promotory TAKA-amylázy a gluA (uvedeny např. v EP 238 023 a EP 383 779).
DNA sekvence kódující trojlístkový peptid může být také spojena s vhodným ukončením jako je ukončení lidského růstového hormonu (Palmiter a kol., Science 222, 1983, 809-814) nebo (pro houbovité hostitele) TPI1 (Alber a Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, 419-434) nebo ADH3 (McKnight a kol., The Embo J. 4, 1985, 2093-2099) ukončení. Vektory mohou dále obsahovat prvky jako polyadenylační signály (např. z oblasti SV40 nebo adenoviru 5 Elb), sekvenci transkripčního zlepšení (např. SV40 promotor) a translačního zlepšení (např. kódující RNA adenoviru VA RNA).
Rekombinované vektory dále obsahují DNA sekvence umožňující vektoru replikaci v příslušných hostitelských buňkách. Příkladem takové sekvence (pro savčí buňky) je SV40 počátek replikace SV40.
Pokud jsou hostitelské buňky kvasinky, jsou vhodné sekvence umožňující vektoru replikaci kvasinkové plazmidy 2 replikačního genu REP 1-3 a počátek replikace.
-4CZ 289864 B6
Vektor také obsahuje volitelný značkovač (např. gen, jehož produkt doplňuje defekt v hostitelských buňkách) jako gen kódující dihydrofolátreduktázu (DHFR) nebo Schizosaccharomyces pombe TPI gen (viz. P. R: Russell, Gene 40, 1985, 125-130) nebo gen způsobující odolnost proti lékům např. ampicillinu, kanamycinu, tetracyklinu, chloramfenykolu, neomycinu, hygromycinu nebo methotrexatu. Pro vláknité houby jsou volitelné značkovače amdS, pyrG, argB, nieD nebo sC.
Pro zavedení troj lístkového peptidu v souladu s předkládaným vynálezem do sekrečního kanálu hostitelské buňky lze v rekombinačním vektoru zajistit sekreční signální sekvenci (známou i jako řídicí, repro nebo pre sekvenci). Tato sekreční signální sekvence je spojena s DNA sekvencí kódující troj lístkový peptid ve správné čtecí části. Sekreční signální sekvence je obyčejně v pozici 5 k DNA sekvence kódující peptid. Sekreční signální sekvence může být normálně spojena s peptidem, nebo tvořit gen kódující jiný sekreční protein.
Produkci kvasinkami kóduje sekreční signální sekvence jakýmkoliv signálním peptidem, který zajišťuje účinné zavedení troj lístkového peptidu do sekrečního kanálu buňky. Signální peptid je přírodní forma, jeho část nebo syntetický peptid. Vhodné signální peptidy jsou -faktor signální peptidy (srovnej US 4 870 008), signální peptid amylázy myších slin (srovnej O. Hagenbuchle a kol., Nátuře 289, 1981, 643-646), modifikovaný signální peptid karboxypeptidázy (L. A. Vallas a kol., Cell 48, 1987, 887-897), signální peptid kvasinek BARI (WO 87/02670) nebo signální peptid aspartové proteázy 3 kvasinek (YAP3) (M. Egel-Mitani a kol., Yeast 6, 1990, 127-137).
Pro účinnou produkci kvasinkami lze sekvenci kódující řídicí peptid zavést i za signální sekvenci a nad DNA sekvenci kódující trojlístkový peptid. Funkce řídicího peptidu je produkovaný peptid zavést z endoplazmatického retikula do Golgiho aparátu a dále do sekreční dutiny pro sekreci do kultivačního média (tj. export troj lístkového peptidu přes buněčnou stěnu nebo alespoň přes buněčnou membránu do periplazmatického prostoru buňky kvasinky). Řídicí peptid je např. -faktor řídicí peptid kvasinek (jehož použití je popsáno např. v US 4 546 082, US 4 870 008, EP 16 201, EP 123 294, EP 123 544 a EP 163 529). Alternativně je řídicí peptid syntetický, tj. nevyskytující se v přírodě. Syntetický řídicí peptid lze konstruovat např. podle WO 89/02 463 nebo WO 92/11 378.
Pro použití u vláknitých hub lze signální peptid pohodlně odvodit od genu kódujícího Aspergillus sp. a amylázu nebo glukoamylázu, genu kódujícího Rhizomucor miehei lipázu nebo proteázu nebo Humicola lanuginosa lipázu. Signální peptid je s výhodou odvozen od genu kódujícího A. oryzae TAKA amylázu, A. niger neutrální -amylázu, A. niger kyselinostálou amylázu nebo A. niger glukoamylázu. Vhodné signální peptidy jsou uvedeny např. v EP 238 023 a EP 215 594.
Pro použití v buňkách hmyzu lze signální peptid pohodlně odvodit od genu hmyzu (WO 90/05783) jako je adipokinetický hormonální prekurzor signálního genu motýla Manduca sexta (US 5 023 328).
Postupy použité pro vázání DNA sekvencí kódujících trojlístkový peptid, promotoru a volitelně ukončení a/nebo sekreční signální sekvence a jejich zavedení do vhodného vektoru obsahujícího informaci nezbytnou pro replikaci jsou odborníkům v této oblasti dobře známé (např. Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Hostitelská buňka, do které se zavádí DNA sekvence kódující trojlístkový peptid, je jakákoliv buňka schopná produkce peptidu v její formě a zahrnuje buňky kvasinek, hub a vyšší eukaryotické buňky.
Příklady vhodných spojení savčích buněk jsou COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL (ATCCCCL39) nebo CHO (ATCC CCL 61). Způsoby transfekce savčích buněk a exprese DNA sekvencí zavedených do buněk popsali např.
-5CZ 289864 B6
Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621; Southem a Berg, J. Mol. Appl. Genet.l 1982), 327-341; Loyter a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422 - 426; Wigler a kol., Cell 14 (1978), 725; Corsaro a Pearson Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham a van der Eb, Virology 52 (1993), 456; a Neumann a kol., EMBO J. 1 (1982), 841-845.
Příklady vhodných buněk kvasinek jsou Saccharomyces spp. nebo Schizosacharomyces spp., zejména pak kolonie Saccharomyces cerevisiae nebo Saccharomyces kluyveri. Způsoby transformace kvasinek heterologní DNA a následná produkce heterologních polypeptidů je popsána v US 4 599 311, US 4 931 373, US 4 870 008, 5 037 743 a US 4 845 075 uvedených zde jako reference. Transformované buňky se vyberou podle fenotypu stanoveného volitelným značkovačem, běžné odolnosti proti lékům a schopnosti růstu bez přítomnosti jednotlivých živin, např. leucinu. Výhodný vektor pro použití u kvasinek je POTÍ uvedený v US 4 931 373. DNA sekvence kódující trojlístkový peptid je předcházena signální sekvencí a volitelně např. výše zmíněnou řídicí sekvencí. Další příklady vhodných kvasinek jsou kolonie Kluyveromyces jako K. lactis, Hansenula, např. H. polymorpha nebo Pichia, např. P. pastoris (Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, 3459-3465; US 4,882,279).
Dalšími příklady jsou vláknité houby, např. Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarim spp. nebo Trichoderma spp., zejména kolonie A. oryzae, A. nidulans nebo A. niger. Použití Aspergillus spp. pro expresi proteinů je popsáno např. v EP 272 277, EP 238 023, EP 184 438. Transformaci F. oxysponum lze např. provést podle Malardiera a kol., 1989, Gene 78: 147-136. Transformaci Trichoderma spp. lze např. provést podle EP 244 234.
Pokud se jako hostitelské buňky použijí vláknité houby, mohou být transformovány pomocí DNA v souladu s předkládaným vynálezem, a to pohodlně integrací konstrukční DNA chromozomu hostitelské buňky za získání rekombinované formy. Tato integrace je výhodná, protože DNA sekvence je pak v hostitelské buňce stabilnější. Integraci konstrukční DNA hostitelského chromozomu lze provést konvenčně např. homologní nebo heterologní rekombinací.
Transformaci buněk hmyzu a produkci heterologních polypeptidů lze pak provádět podle US 4 745 051; US 4 879 236; US 5 155 037; 5 162 222; EP 397 485, které jsou zde uvedeny jako reference. Buňky hmyzu, které lze použít jsou např. Lepidoptera jako Spodoptera fugiperda nebo Trichoplusia ni (US 5,077,214). Vhodné podmínky kultivace jsou uvedeny např. v WO 89/01 029 nebo WO 89/01 028 nebo v dříve uvedených pracích.
Výše popsané transformované hostitelské buňky se pak kultivují ve vhodné výživě za podmínek dovolujících expresi troj lístkového peptidů. Potom lze veškeiý nebo část výsledného peptidů získat z kultuiy v její formě. Médium použité pro kultivaci buněk je běžný materiál -jednoduché nebo složené médium obsahující vhodné doplňky. Vhodná média jsou komerčně dostupná nebo připravitelná podle publikovaných předpisů (např. Američan Type Culture Collection). Trojlístkový peptid vyprodukovaný buňkami se pak z kultury získává běžnými postupy zahrnujícími separaci hostitelských buněk z média odstředěním nebo filtrací, srážení bílkovinných složek roztoku nebo filtrátu solemi (např. síran amonný) a čištění různými chromatografickými technikami (např. iontově výměnná, gelová, afínitní, atd. chromatografie) podle příslušného typu polypeptidu.
Ve farmaceutickém prostředku v souladu s předkládaným vynálezem je trojlístkový peptid v různých farmaceutických formách popsaných např. v Remington s Pharmaceutical Science, 1985. Prostředek je ve formě vhodné pro soustavné podávání v injekcích nebo infuzích, a tedy se sterilní vodou nebo izotonickým nebo glukózovým roztokem. Prostředky lze sterilizovat běžnými technikami. Výsledný vodný roztok lze balit pro použití nebo filtrovat za aseptických podmínek a lyofílizovat. Lyofilizovaný prostředek lze před podáváním kombinovat se sterilním vodným roztokem. Prostředek obsahuje farmaceuticky vhodné přísady podle požadavků na napodobení
-6CZ 289864 B6 fyziologických podmínek jako pufry, tonika, atd. např. octan sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, atd.
Farmaceutický prostředek v souladu s předkládaným vynálezem lze přizpůsobit i pro nosní, transdermální a rektální podávání. Jako farmaceuticky vhodný nosič nebo ředidlo prostředku lze použít jakýkoliv běžný pevný nosič. Příklady pevných nosičů jsou laktóza, terra alba, sacharóza, mastek, želatina, agar, pektin, klovatina, stearát hořečnatý a kyselina stearová. Nosič nebo ředidlo podobně obsahuje živiny uvolňující látky jako glycerylmonostearát nebo glyceryldistearát nebo jejich směs s voskem. Množství pevného nosiče je 25 mg až 1 g.
Koncentrace troj lístkového peptidu v prostředku je 5 až 100% hmotnostních. Výhodná je koncentrace 50 až 100 % hmotnostních. Podávaná jednotka prostředkuje 1 až 200 mg, s výhodou 25 až 75 mg, nejvýhodněji 50 mg peptidu.
Jak je uvedeno výše, trojlístkový peptid v souladu s předkládaným vynálezem se považuje za aktivní formu peptidu, a takto se považuje za výhodné jeho použití pro prevenci nebo léčení poruch trávicí soustavy. Konkrétněji je určen pro léčení žaludečních vředů a vředů trávicího ústrojí, zánětu střev, Crohnovy choroby nebo poruch trávicího ústrojí způsobených léčením zářením, bakteriálních nebo jiných infekcí atd. Dávkování polypeptidů podávaného pacientům záleží na typu a závažnosti léčených poruch, ale obecně je 0,1 až 1 mg na kg váhy těla.
Přehled obrázků na výkresech
Předkládaný vynález je dále detailněji popsán na příkladech s odkazem na připojené obrázky, kde je:
Obr. 1 navržená struktura lidského troj lístkového faktoru ITF. Primární aminokyselinová sekvence je převzata od Hausera a kol., 1993, a disulfidická vazba umístěna homologně podle PSP a pS2 (Thim, 1988).
Obr. 2 HPLC roztoku z kvasinek HW756 pro expresi krysího ITF na reverzní fázi-koloně Vydac 214TP54
Obr. 3 iontově výměnná chromatografie na Fast Flow SP-sefaróze částečně čištěného lidského ITF. Množství hlTF (monomeru) a hlTF (u) bylo stanoveno analytickou HPLC. Čárky značí frakce spojené pro další čištění monomemí a jiné formy. Čárkovaná čára značí koncentraci NaCl v elučním roztoku.
Obr. 4 reverzní HPLC čištěného krysího ITF (A), lidského ITF monomeru (B) a lidského ITF (C) na koloně Vydac 214TP54 C4. Čárkované čáry značí koncentraci acetonitrilu v elučním roztoku.
Obr. 5 rekonstruované hmotnostní spektrum čištěného krysího ITF (A), lidského ITF monomeru (B) a lidského ITF (C).
Obr. 6 struktura formy lidského ITF.
Obr. 7 mapa omezení plazmidu KFN 1003.
Obr. 8 struktura plazmidu pHW756.
Obr. 9 struktura plazmidu pHW1066.
Příklady provedení vynálezu
Materiály a metody
Klonování krysího ITF (rITF) a lidského ITF (hlTF)
Klonování krysího a lidského ITF bylo prováděno podle WO 92/14837 a Suemori a kol., 1991 a Chineri a kol., 1992 (krysí ITF) a Podolsky a kol., 1993 a Hauser a kol., 1993 (lidský ITF).
Tvorba rITF a hlTF expresních plazmidů
Expresní plazmidy pHW756 pro sekreci krysího ITF a pHW 1066 pro sekreci lidského ITF byly vytvořeny jak je uvedeno na obr. 7-9. Kvasinkový expresní vektor pKFN1003 (WO 90/10 075) je odvozen od plazmidu CPOT (Kawasaki, G. Intemational Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Sept. 17-24, 1984, Edinburgh, Scotland, Abstr. str. 15.). Jako výběrový značkovač (Russell, P. R., Gene 40 (1985), 125-130) má Schizosaccharomyces pombe TPI gen (POT), jako promotor S.cerevisiae triosafosfátizomerázu (TPI) a ukončení pro kontrolu exprese (Alber, T. and Kawasaki, G. J. Mol. Appl. Genet.l (1982), 419-434).
Krysí ITF gen byl nejdříve klonován do Bluescript II KS(-) (Stratagene), ze kterého byl propagován podle obr. 8. Pomocný vektor pSX54 zajišťující klonovací polohy se skládá zpUClB a pDN1050 (Diderichsen, B., Poulsen, G. B., Jorgensen, S. T. Plasmid 30 (1993), 312-315). Syntetická DNA spojka Ncol-PflMl má následující sekvenci:
1858 : 5'-CATGGCTGAA.AGATTGGAAAAGAGACAAGAGTTCGTTGGTTTGTCTCCATCCCAATGT-3' 58 bp
1862 : 5'-TTGrGGATGGAGACAAACCAACGAACTCTTGTCTCTTTCCAATCTTTCAGC3' 52 bp
Spojka kóduje C-koncové (8) aminokyseliny pro řídicí sekvenci jak popsali Thim, L., Norris, K., Norris, F., Nielsen, P. F., Bjom, S., Christensen, M., Petersen, J. FEBS Lett. 318, (1993), 345352, s několika změnami ve výběru kodónu a N-koncovou část kiysího ITF genu: QEFVGLSPSQC. Řídicí a signální aminokyselinová sekvence je popsána tamtéž.:
MKAVFLVLSLIGFCWAQPVTGDESSVEIPEESLIIAEMAERLEKR.
Lidský ITF gen byl klonován do PUC 19 a propagován podle obr. 9.
Syntetická DNA spojka Ncol-BsaAl má následující sekvenci:
2292 : 5'-CATGGCTGAAAGATTGGAAAAGAGAAGAATAC-3' 34 bp
2287 : 5'-GTATTCTTCTCTCTTTTCCAATCZ'TTCAGC-3' 30 bp
Spojka kóduje C-koncové (8) aminokyseliny pro řídicí sekvenci, jak je popsáno pro rITF tvorbu a 3 N-koncové aminokyseliny pro hlTF gen: EEY. Řídicí a signální aminokyselinová sekvence je stejná jako výše.
Expresní plazmidy byly transformovány do S.cerevisiae MT 663 (E2-7B X El 1-36 a/, tpi/tpi, pep 4-3/pep 4-3) výběrem pro růst na glukóze jako živné půdě.
Transformované kvasinky pro expresi krysího a lidského ITF byly nazvány W756 a HW 1066.
-8CZ 289864 B6
Fermentace
Výše popsané transformované buňky byly kultivovány při 30 °C, 72 h ve kvasinkové peptonové dextróze (Sherman a kol., 1981), doplněné dalším kvasinkovým extraktem (60 g/1). Na konci fermentace byly dosaženy pro HW756 (rITF) a HW1066 (hlTF) OD hodnoty 153 a 232 při 660 nm. na konci fermentace bylo pH upraveno pomocí 1M kyseliny fosforečné na 2,5 a kvasinky byly separovány odstředěním při 3000 ot/min. po dobu 15 min.
Čištění recombinantu rITF
Koncentrace rITF ve fermentačním extraktu kvasinek a frakcích získaných během čištění byla měřena analytickou HPLC. Alikvoty (obvykle 50-200 1) byla nastřikovány na Vydac 214TP54 reverzní C4 HPLC kolonu (0,46 x 25 cm) temperovanou na 30 °C při průtoku 1,5 ml/min s 0,1 % (objemově) TFA v 15 % (objemově) acetonitrilu. Po 10 min. izokratické eluce byla koncentrace acetonitrilu v elučním roztoku zvýšena během 40 min na 55 % objemových. Absorbance byla měřena při 214 nm, formu rITF reprezentovaly tři pík}’ (26,5 min, 27,3 min, 28,2 min), viz. obr. 2. Kvantita byla stanovena pomocí kalibrovaného hSP standardu (Thim a kol., 1993).
Expresní úroveň pro rekombinant krysího ITF byla v předkládaném systému 113 mg/1.
Z 10 1 fermentoru bylo odstředěním získáno 8,7 1 fermentačního roztoku, který byl zředěn 14,8 1 destilované vody na menší vodivost. Vzorek byl čerpán na Fast Flow S-sefarázovou kolonu (Pharmacia) 5 x 42 cm při průtoku 600 ml/h. Před použitím byla kolona vyrovnána 50 mM pufrem (kyselina mravenčí) na pH 3,7. Krysí ITF byl vymýván z kolony 50 mM kyselinou mravenčí (pH 3,7) obsahující 50 mM NaCl. Při průtoku 600 m/h byly odebírány a na obsah rITF analyzovány 100 ml frakce. Frakce z předešlého kroku obsahující rITF byly spojeny (2,3 1) a čerpány na Amberchromovou (G—71) kolonu 5 x 10 cm. Před použitím byla kolona vyrovnána při průtoku 0,1 1/h na pH 4,8 pomocí 10 mM (octan amonný) pufru obsahujícího 60 % objemových ethanolu. Byly odebírány 10 ml frakce a spojeny podle obsahu rITF. Koncentrace ethanolu byla ve spojeném roztoku přidáním dvou objemů ethanolu (99,99 % objemových) zvýšena ze 60 % objemových na 87 % objemových a rITF byl vysrážen ochlazením směsi na-25 °C po dobu 16 h.
Sraženina byla odstředěna (lh, 10 000 g, - 25 °C) a při laboratorní teplotě rozpuštěna ve 130 ml mravenčí kyseliny (20 mM) s pH 3,0. Vzorek byl čerpán na Fast Flow S-sefarózovou kolonu (Pharmacia) 5 x 20 cm při průtoku 50 ml/h. Před použitím byla kolona vyrovnána na pH 3,0 pomocí 20 mM kyseliny mravenčí. Peptidy byly z kolony vymyty lineárním gradientem (1,5 1 50mM kyseliny mravenčí, pH 3,0 až 1,5 1 50mM kyseliny mravenčí, pH 3,0 obsahující 0,5 M NaCl). Při průtoku 80 ml/h byly odebírány 10 ml frakce a absorbance byla měřena při 280 nm. Frakce byly testovány na obsah rITF a podle něj spojeny. Krysí ITF byl dále čištěn preparativní HPLC. Spojené frakce (900 ml) byly čerpány na preparativní HPLC kolonu Vydac 214TP54 C4 (2,2 x 25 cm) vyrovnanou v 0,1 0 (objemových) TFA. Peptidy byly vymyty při 25 °C a průtoku 5 ml/min lineárním gradientem (540 ml) vytvořeným z MeCN/H2O/TFA (10 : 89,9: 0,1 objemově) a MeCN/H2O/TFA (65 : 34,9 : 0,1 objemově). UV absorpce byla sledována při 280 nm a byly odebírány frakce po 10 ml a analyzovány na obsah rITF. Frakce obsahující rITF byly spojeny a objem zmenšen vakuovou centrifugou na 30 %. Z výsledného roztoku byl rITF izolován lyofilizací. Celkový výtěžek rITF z 8,7 1 fermentačního média byl 236 mg odpovídající celkovému výtěžku čištění 24 %.
-9CZ 289864 B6
Čištění rekombinantu hlTF
Koncentrace rITF ve fermentačním extraktu kvasinek a frakcích získaných během čištění byla měřena HPLC systémem stejným jako u rITF. Pomocí tohoto systému byly hmotnostní spektrometrií a sekvencí analýzou identifikovány dva píky (21,2 min. a 27,1 min.) jako a monomer hlTF. Expresní úroveň pro rekombinant lidského ITF byla v předkládaném systému 90 mg/1.
Z 101 fermentoru bylo odstředěním získáno 8,0 1 fermentačního roztoku. Vzorek byl třikrát dialyzován (vždy 24 h) proti 401 10 mM kyseliny mravenčí spH2,5. Vzorek byl čerpán (0,25 1/h) na Fast Flow S-sefarázovou kolonu (Pharmacia) 5 x 40 cm při průtoku 600 ml/h. Kolona byla promyta 5 1 20 mM pufru (kyselina mravenčí) s pH 2,5 a vymyta lineárním gradientem tvořeným 5 1 20 mM pufru (kyselina mravenčí) s pH 2,5 a 5 1 20 mM pufru (kyselina mravenčí) s pH 2,5 obsahující 1 M NaCl. Byly odebírány a na obsah hlTF analyzovány 100 ml frakce (obr. 3). Z kolony byly vymyty dvě formy hlTF: jedna reprezentovala monomer hlTF (vymyta 0,5 M NaCl) a druhá (vymyta 0,78 M NaCl). Frakce obsahující stejnou formu byly spojeny.
Každá frakce byla rozdělena na tři stejné díly po 700 ml a čerpána na kolonu Vydac 214TP54 C4 (2,2 x 25 cm) vyrovnanou v 0,1 % objemově TFA. Peptidy byly vymyty při průtoku 4 ml/min lineárním gradientem (540 ml) vytvořeným z MeCN/H2O/TFA (10: 89,9: 0,1 objemově) a MeCN/H2O/TFA (65 :34,9 : 0,1 objemově). UV absorpce byla sledována při 280 nm a byly odebírány frakce po 10 ml a analyzovány na obsah hlTF.
Frakce z předešlého kroku obsahující hlTF (monomer) a hlTF dimer byly odděleně spojeny a pH upraveno na 3,0. Vzorky byly odděleně čerpány na SP-sefarázovou HiLoad 16/10 (Pharmacia) kolonu (1,6 x 10 cm) pomocí 20 mM kyseliny mravenčí (pH 3,0) obsahující 40 % objemových ethanolu. Kolona byla promyta 80 ml vyrovnávacího pufru a vymyta lineárním gradientem při 4 ml/min tvořeným 200 ml 20 mM kyseliny mravenčí s pH 3,0; 40 % objemových ethanolu a 200 ml 20 mM kyseliny mravenčí s pH 3,0; 40 % objemových ethanolu obsahující 1 M NaCl. Byly odebírány a na obsah hlTF analyzovány 5 ml frakce.
Frakce obsahující stejnou formu byly spojeny a peptid vysrážen zvýšením koncentrace ethanolu na 90 % objemových a ochlazením směsi na - 25 °C po dobu 72 h. Sraženina byla odstředěna a lyofílizována. Celkový výtěžek z 8 1 fermentačního roztoku byl 256 mg hlTF (monomer) a 133 mg hlTF (), což odpovídá celkovému výtěžku čištění 50 % pro monomer a 65 % pro ().
Hmotnostní spektra byla měřena na API III LC/MS/MS (Sciex, Thomhill, Ont., Canada). Přístroj s trojitým kvadrupólem má m/z rozsah 2400 a je osazen pneumatickým elektrosprej (ion-sprej) interface (Bruins et al., 1987; Covey a kol., 1988). Vzorky byly nastřikovány stříkačkovou infuzní pumpou (Sage Instruments, Cambridge, MA) přes žhavenou kapiláru (75 m) při průtoku kapaliny 0,5 až 1 1/min. Stupnice (m/z) přístroje byla kalibrována amonným aduktem polypropylenglykolů (PPG) s nábojem 1 při jednotkovém rozlišení. Přesnost měření hmotnosti je obecně lepší než 0,02 %.
Obr. 4 uvádí analytické HPLC chromatogramy čištěného rITF (obr. 4A) a hlTF (obr. 4B a 4C). Rekombinovaný rITF obsahuje směs 3 velmi příbuzných peptidů, které jsme se nepokoušeli rozdělit. Při analýze elektrosprejovou MS byly nalezeny tři hlavní molámí hmotnosti odpovídající 13112,2; 13096,6 a 13078,8 (obr. 5A). Vypočtena molámí hmotnost monomem rITF, kde Cys-57 obsahuje volnou SH skupinu, je 6558,3. Vypočtená molámí hmotnost u rITF (s S-S můstkem mezi Cys-57) je 13114,5. Z nalezených molámích hmotností rekombinovaného rITF je zřejmé, že všechny 3 peptidy reprezentují dimemí formu rITF. Z jiných trojlístkových peptidů s Gin jako N-koncovou aminokyselinu např. PSP (Thim a kol., 1985 a Tomasetto a kol., 1990) je známé, že tyto zbytky mají tendenci kcyklizaci za vzniku pyrrolidonové karboxylové
-10CZ 289864 B6 kyseliny (pyrGlu). V případě rITF s předpovídanou N-koncovou sekvencí Gln-Glu-Phe-ValGly se jeví logické předpokládat, že N-koncový Gin mohl rovněž cyklizovat na pyrGlu formu. Taková změna by vedla ke snížení molámí hmotnosti rITF o 17 (1 pyrGlu) nebo 34 (2 pyrGlu) jednotek. Pozorované molámí hmotnosti 13096,6 a 13078,8 (obr. 5) odpovídají rITF sjednán resp. dvěma zcyklizovanými N-koncovými Gin. Vypočtená molámí hmotnost těchto forem je 13097,6 a 13080,6 a je v dobré shodě s experimentálními údaji. Závěrem z HPLC (obr. 4A) a MS analýzy (obr. 5A) tedy je, že rekombinovaný rITF obsahuje 3 různé dimery: první s dvěma N-koncovými Gin, druhý s jedním N-koncovým Gin a jedním N-koncovým pyrGln a třetí se dvěma N-koncovými pyrGln. Tabulka I uvádí aminokyselinové složení rITF v dobré shodě s očekávanými hodnotami. Obr. 5A a 5B ukazují čistotu monomeru a hlTF podle analytické HPLC (obr. 5C) jenž je poměrně čistý, zatímco monomer (obr. 5B) vykazuje znečištění látkami vymytými před peptidem, ale i po opětovné chromatografií látky s hlavním pikem byl získán podobný chromatogram (není uveden). To ukazuje spíše než na nečistoty na atypické chování monomeru hlTF na nevezní fázi. Dříve jsme pozorovali podobné chování vysoce čištěného porcinu PSP a rekombinovaného hSP (Thim a kol., 1993).
MS analýza monomeru ITF molámí hmotnost hlavního píku 6694,0 (obr. 5B). Molámí hmotnost vypočtená pro aminokyselinovou sekvenci (obr. 1) s předpokladem volné SH skupiny na Cys-57 je 6574,4. Analýza aminokyselinové sekvence v tabulce II ukazuje očekávanou N-koncovou sekvenci Glu-Glu-Tyr-Val-Gly. Analýza aminokyselinového složení (tabulka I) ukazuje kromě přítomnosti 7,3 (8) cysteinů očekávané hodnoty. Další cystein připojený k Cys-57 hlTF monomem zvýší molámí hmotnost na 6694,7, což je velmi blízko experimentální hodnotě 6694,0. Proto předpokládáme disulfidické spojení Cys-57 monomem hlTF s dalším cysteinem. Minoritní pík v hmotnostním spektru (obr. 5B) může reprezentovat jiný derivát Cys-57 nebo nečistotu.
Vypočítaná molámí hmotnost u hlTF, kde jsou dva y spojeny disulfídickou vazbou mezi dvěma Cys-57 zbytky je 13146,8. To je v dobré shodě s experimentální hodnotou 13147 (obr. 5C). Další pík v hmotnostním spektru (13169) pravděpodobně reprezentuje Na+ adukt u hlTF. Sekvenční analýza (tabulka I) i analýza aminokyselinového složení (tabulka II) jsou rovněž v dobré shodě s očekávanými hodnotami.
-11 CZ 289864 B6
Tabulka I
Aminokyselinové složení dimeru rITF, monomeru hlTF a dimeru hlT
| Aminokys. | rITFí | dimer) | hlTF (m | onomer) | hlTF (d | imer) |
| Asx | 11.92 | (12) | 6.00 | (6) | 12.01 | (12) |
| Thra | 8.00 | (8) | 2.03 | (2) | 4.01 | (4) |
| Sera | 9.86 | (10) | 2.04 | (2) | 4.01 | (4) |
| Glx | 15.98 | (16) | 6.92 | (7) | 14.00 | (14) |
| Prob | 12.48 | (12) | n.d.c | (6) | n.d.c | (12) |
| Gly | 6.02 | (6) | 4.20 | (4) | 8.09 | (8) |
| Ala | 2.04 | (2) | 3.91 | (4) | 7.90 | (8) |
| Val | 11.92 | (12) | 4.92 | (5) | 9.86 | (10) |
| Met | 1.80 | (2) | 0.00 | (0) | 0.00 | (0) |
| lle | 1.98 | (2) | 1.17 | (1) | 2.13 | (2) |
| Leu | 3.92 | (4) | 2.03 | (2) | 3.99 | (4) |
| Tyrb | 2.02 | (2) | 1.94 | (2) | 3.92 | (4) |
| Phe | 7.88 | (8) | 2.93 | (3) | 5.94 | (6) |
| Lys | 2.14 | (2) | 3.07 | (3) | 6.09 | (6) |
| His | 0.00 | (0) | 0.99 | (1) | 2.03 | (2) |
| Trp | 2.16 | (2) | n.d.c | (1) | n.d.c | (2) |
| Arg | 3.94 | (4) | 2.96 | (3) | 6.05 | (6) |
| PE-€ysb | 12.70 | (14) | 7.30 | (7) | 13.80 | (14) |
| Celkem | (H8) | (59) | (118) |
Hodnoty v závorkách jsou odvozeny zcDNA: rITF (Chinery a kol., 1992), hlTF (Hauser a kol., 1993), io ^stanoveno extrapolací na počátek hydrolýzy, b)stanoveno hydrolýzou ve 4 M methansulfonové kyselině, '^nebylo stanoveno.
-12CZ 289864 B6
Tabulka II
Automatizované Edman-odbourání dimeru rITF, monomeru hlTF a dimeru hlTF
| Cyklus č. | rITF (dimer) | hlTF (monomer) | hlTF (dimer) | |||
| PTA-A.A. | Výtěžek (pmol) | PTH-A.A. | Výtěžek (pmol) | Výtěžek | (pmol) | |
| 1 | Glu | 989 | Glu | 1517 | Glu | 2227 |
| 2 | Glu | 731 | Glu | 1998 | Glu | 2361 |
| 3 | Phe | 967 | Tyr | 2205 | Tyr | 2528 |
| 4 | Val | 1072 | Val | 2409 | Val | 2431 |
| 5 | Gly | 701 | Gly | 1625 | Gly | 1803 |
| 6 | Leu | 838 | Leu | 2318 | Leu | 2253 |
| 7 | Ser | 497 | Ser | 852 | Ser | 904 |
| 8 | Pro | 965 | Ala | 1729 | Ala | 1712 |
| 9 | Ser | 406 | Asn | 1394 | Asn | 1518 |
| 10 | Gin | 820 | Gin | 1494 | Gin | 1499 |
| 11 | (Cys) | n.d. | (Cys) | n.d. | (Cys) | n.d. |
| 12 | Met | 581 | Ala | 1243 | Ala | 1377 |
| 13 | Val | 971 | Val | 1468 | Val | 1356 |
| 40 | Pro | 962 | Pro | 1223 | Pro | 1195 |
| 15 | Ala | 529 | Ala | 1248 | Ala | 1249 |
| 16 | Asn | 791 | Lys | 1270 | Lys | 1050 |
| 17 | Val | 952 | Asp | 937 | Asp | 991 |
| 18 | Arg | 331 | Arg | 891 | Arg | 964 |
| 19 | Val | 956 | Val | 1002 | Val | 1069 |
| 20 | Asp | 476 | Asp | 847 | Asp | 932 |
| 21 | (Cys) | n.d. | (Cys) | n.d. | Cys | n.d. |
| 22 | Gly | 381 | Gly | 709 | Gly | 703 |
| 23 | Tyr | 352 | Tyr | 894 | Tyr | 792 |
| 24 | Pro | 927 | Pro | 766 | Pro | 701 |
| 25 | Thr | 498 | His | 309 | His | 236 |
| 26 | Val | 812 | Val | 755 | Val | 670 |
| 27 | Thr | 510 | Thr | 505 | Thr | 576 |
| 28 | Ser | 225 | Pro | 458 | Pro | 473 |
| 29 | Glu | 398 | Lys | 444 | Lys | 321 |
| 30 | Gin | 499 | Glu | 219 | Glu | 304 |
| 31 | (Cys) | n.d. | (Cys) | n.d. | (Cys) | n.d. |
| 32 | Asn | 557 | Asn | 312 | Asn | 300 |
| 33 | Asn | 591 | Asn | 464 | Asn | 503 |
| 34 | Arg | 196 | Arg | 325 | Arg | 294 |
| 35 | Gly | 222 | Gly | 239 | Gly | 223 |
| 36 | (Cys) | n.d. | (Cys) | n.d. | (Cys) | n.d. |
| 37 | (Cys) | n.d. | (Cys) | n.d. | (Cys) | n.d. |
| 38 | Phe | 335 | Phe | 189 | Phe | 174 |
| 39 | Asp | 275 | Asp | 133 | Asp | 137 |
| 40 | Ser | 164 | Ser | 49 | Ser | 43 |
| R.Y | 97.0% | 93.2% | 92.5% |
-13CZ 289864 B6
Průmyslová využitelnost
Předkládaný vynález se týká troj lístkových peptidů, způsobu jejich přípravy, farmaceutických prostředků, které je obsahují a jejich použití pro léčení gastrointestinálních poruch. Za určitých podmínek jako je např. mukózní poškození při zánětu střev (Rio a kol. 1991, Poulsom a kol. 1992, Wright a kol. 1993) a žaludečních vředech a vředech dvanáctníku (Rio a kol. 1991, Hanby a kol. 1993, Wright a kol. 1990) byla pozorována zvýšená exprese troj lístkových peptidů v trávicí soustavě. To bylo podnětem pro názor, že trojlístkové peptidy mají mukózní regenerační funkci, o čemž byl v současné době podán důkaz Dignassem a kol. 1994, Playford a kol. 1994 a Babyatsky a kol. 1994.
Odkaz na literaturu
Babyatsky, M. W., Thim, L., Podolsky, D. K. (1994) Gastroenterology 106, A43 (abstract).
Bruins, A. P., Covey, T. R., & Henion, J. D. (19S7) Anal. Chem. 59,2642-2646.
Chinery, R., Poulsom, R., Rogers, L. A., Jeffery, R. E. Longcroft, J. M., Hanby, A. M., & Wright, N. A. (1992) Biochem. J. 285, 5-8.
Covey, T. R., Bonner, R. F., Shushan, B. I., & Henion, J. D. (1988) Rapid Commun. Mass Spectrom. 2,249-256.
Dignass, A., Lynch-Devaney, K., Kindon, H., Thim, L., & Podolsky, D. K. (1994) J. Clin. Invest, (in press).
Friedman, M., Krull, L. H., Cavins, J. F. (1970), J. Biol. Chem. 245, 3868-3871.
Gajhede, M., Petersen, Τ. N., Henriksen, A., Petersen, J. F. W., Dauter, Z., Wilson, K. S., & Thim, L. (1993) Structure 1,253-262.
Hanby, A. M., Poulsom, R., Elia, G., Singh, S., Longcroft, J. M., & Wright, N. A. (1993) J. Pathol. 169, 355-360.
Hauser, F., & Hoffmann, W. (1991) J. Biol. Chem. 266,21206-21309.
Hauser, F„ Roeben, C., & Hoffmann, W. (1992a) J. Biol. Chem. 267, 14451-14455.
Hauser, F., & Hoffmann, W. (1992b) J. Biol. Chem. 267, 24620-24624.
Hauser, F., Poulsom, R., Chinery, R., Rogers, L. A., Hanby, A. M., Wright, N. A., & Hoffmann, W. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. 90, 6961-6965.
Hoffmann, W. (1988) J. Biol. Chem. 263, 7686-7690.
Hoffmann, W., & Hauser, F. (1993) Trends Biochem. Sci. 7,239-243.
Jakowlew, S. B., Breathnach, R., Jeltsch, J.-M., Masiakowski, P., Chambon, P. (1984) Nucleic AcidRes. 12,2861-2878.
Lefebvre, O., Wolf, C., Kedinger, M. Chenard, M.-P., Tomasetto, C., Chambon, P., & Rio, M. C. (1993) J. Cell. Biol. 122,191-198.
- 14CZ 289864 B6
Playford, R. J., Marchbank, T., Chinery, R., Evison, R., Pignattelli, M., Bolton, R., Thim, L., & Hanby, A. M. (1994) Gastroenterology (in press).
Podolsky, D. K., Lynch-Devaney, K., Stow, J. L., Oates, P., Murgue, B., DeBeaumont, M., Sands, Β. E., & Makida, Y. R. (1993) J Biol. Chem. 268, 6694-6702.
Poulsom, R., Chinery, R., Sarraf, C., Lalani, E.-N., Stamp, E., Elia, G., Wright, N. (1992) Gastroenterology 27,11-28.
Poulsom, R., & Wright, N. A. (1993) Am. J. Physiol. 265, G205-G213.
Pruďhomme, J. F., Fridlansky, F., Le Cunff, M., Atger, M., Mercier-Bodart, C., Pichon, MF., & Milgrom, E. (1985) DNA 4,11-21.
Rio, M. C., Bellocq, J. P., Daniel, J. Y., Tomasetto, C., Lathe, R., Chenard, Μ. P., Batzenschlager, A., & Chambon, P. (1988) Science 241, 705-708.
Rio., M.-C., Chenard, M.-P., Wolf, C., Marcellin, L., Tomasetto, C., Lathe, R., Bellocq, JP., & Chambon, P. (1991) Gastroenterology 100,375-379.
Ruegg, U. Th., & Rudinger, J. (1974) Isr. J. Chem 12,391-401.
Sherman, F., Fink, G. R., & Hicks, J. B. (1981) Methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Suemori, S., Lynch-Devaney, K.., & Podolsky, D. K. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. 88, 11017— 11021:
Thim, L., Jorgensen, K. H., & Jorgensen, K. D. (1982) Regál. Peptides 3,221-230.
Thim, L., Thomsen, J., Christensen, M., & Jorgensen, K. H. (1985) Biochem. Biophys. Acta 827, 410-418.
Thim, L., Hansen, Μ. T., Norris, K., Hoegh, I., Boel, E., Forstrom, J., Ammerer, G., & Fiil, L. (1986) Proč. Nati. Acad. Sci. 83, 6766-6770.
Thim, Lk. Hansen, Μ. T., & Soerensen, A. R. (1987) FEBSLett. 212, 307-312.
Thim, L. (1989) FEBSLett. 250, 85-90.
Thim, L., Norris, K., Norris, F., Nielsen, P. F., Bjorn, S. E., Christensen, M., Petersen, J. (1993) FEBSLett. 318,345-352.
Thim, L. (1994) Digestion 55, 353-360.
Tomasetto, C., Rio, M., Gautier, C., Wolf, C., Hareuveni, M., Chambon, P., & Lathe, R. (1990) EMBOJ. 9, 407-414.
Wright, N. A., Pike, C., & Elia, G. (1990) Nátuře 343, 82-85.
Wright, N. A., Poulsom, R., Stamp, G., van Norden, S., Sarraf, C., Elia, G., Ahnen, D., Jeffery, R., Longcroft, J., Pike, C., Rio, M., & Chambon, P. (1993) Gastroenterology 104,12-20.
Claims (6)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Trojlístkový peptid v čisté formě obsahující intestinální trojlístkový faktor -ITF, který se skládá ze dvou ITF monomerů spojených disulfidickou vazbou mezi dvěma cysteinovými zbytky obou monomerů v pozici 57 každého monomeru.
- 2. Peptid podle nároku 1, kterým je lidský intestinální trojlístkový faktor - ITF.
- 3. Způsob přípravy troj lístkového peptidů podle nároku 1,vyznačující se tím, že se kultivují vhodné hostitelské buňky transformované DNA sekvencí kódující trojlístkový peptid obsahující jednoduchou troj lístkovou doménu a získá se vzniklý dimemí trojlístkový peptid z kultury.
- 4. Farmaceutický prostředek, vy znač u j í cí se tí m , že obsahuje trojlístkový peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 spolu s farmaceuticky vhodným ředidlem nebo přísadou.
- 5. Trojlístkový peptid podle nároku 1 pro použití jako léčivo.
- 6. Použití troj lístkového peptidů podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro profylaxi nebo léčení poruch trávicí soustavy.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK98394 | 1994-08-26 | ||
| CZ1997548A CZ289705B6 (cs) | 1994-08-26 | 1995-08-25 | Trojlístkový peptid, způsob přípravy, farmaceutický prostředek a pouľití trojlístkového peptidu |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ289864B6 true CZ289864B6 (cs) | 2002-04-17 |
Family
ID=8099704
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1997548A CZ289705B6 (cs) | 1994-08-26 | 1995-08-25 | Trojlístkový peptid, způsob přípravy, farmaceutický prostředek a pouľití trojlístkového peptidu |
| CZ19993618A CZ289864B6 (cs) | 1994-08-26 | 1999-10-13 | Trojlístkový peptid, způsob přípravy, farmaceutický prostředek a pouľití trojlístkového peptidu |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1997548A CZ289705B6 (cs) | 1994-08-26 | 1995-08-25 | Trojlístkový peptid, způsob přípravy, farmaceutický prostředek a pouľití trojlístkového peptidu |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0777687B1 (cs) |
| JP (3) | JPH10504720A (cs) |
| KR (1) | KR100255911B1 (cs) |
| CN (1) | CN1070867C (cs) |
| AT (1) | ATE329929T1 (cs) |
| AU (1) | AU694796B2 (cs) |
| BR (1) | BR9508773A (cs) |
| CA (1) | CA2196876C (cs) |
| CZ (2) | CZ289705B6 (cs) |
| DE (1) | DE69535060T2 (cs) |
| DK (1) | DK0777687T3 (cs) |
| ES (1) | ES2267104T3 (cs) |
| FI (1) | FI119989B (cs) |
| HU (1) | HU226921B1 (cs) |
| MX (1) | MX9701239A (cs) |
| NO (1) | NO323642B1 (cs) |
| PL (1) | PL184516B1 (cs) |
| PT (1) | PT777687E (cs) |
| RU (1) | RU2162857C2 (cs) |
| UA (1) | UA68324C2 (cs) |
| WO (1) | WO1996006861A1 (cs) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6221840B1 (en) * | 1991-02-14 | 2001-04-24 | The General Hospital Corporation | Intestinal trefoil proteins |
| US6063755A (en) | 1991-02-14 | 2000-05-16 | The General Hospital Corporation | Intestinal trefoil proteins |
| US6337195B1 (en) | 1995-06-06 | 2002-01-08 | Human Genome Sciences, Inc. | Colon specific genes and proteins |
| US6525018B1 (en) | 1999-05-17 | 2003-02-25 | The General Hospital Corp. | Treating eye disorders using intestinal trefoil proteins |
| WO1999010377A1 (en) | 1997-08-25 | 1999-03-04 | The General Hospital Corporation | Receptor for intestinal trefoil factor |
| AU2001265239B2 (en) * | 2000-05-26 | 2006-05-25 | Diadexus, Inc. | Method of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating colon cancer |
| EP1341817A2 (en) * | 2000-12-08 | 2003-09-10 | Novo Nordisk A/S | Tff peptides |
| MXPA03009772A (es) * | 2001-04-24 | 2004-02-23 | Gen Hospital Corp | Metodos y composiciones para tratar lesiones orales y del esofago. |
| EP1842858A3 (en) * | 2001-04-24 | 2008-04-02 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions for treating oral and esophageal lesions |
| US7538082B2 (en) | 2001-04-24 | 2009-05-26 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions for treating oral and esophageal lesions |
| EP1401481A1 (en) * | 2001-06-14 | 2004-03-31 | Novo Nordisk A/S | Mucosal repair by tff dimer peptides |
| RU2224797C2 (ru) * | 2002-04-04 | 2004-02-27 | Эльдаров Михаил Анатольевич | Рекомбинантная плазмидная днк pacyclans для переноса и экспрессии в клетках escherichia coli гена l-аспарагиназы erwinia carotovora (ecar-lans) и способ получения рекомбинантной ecar-lans из биомассы штамма e.coli-продуцента |
| AU2003205555A1 (en) * | 2002-02-11 | 2003-09-04 | Novo Nordisk A/S | Management of mucosal viscosity by tff monomer peptides |
| JP2005527547A (ja) * | 2002-03-26 | 2005-09-15 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション | トレフォイル・ペプチドを使用した組み合わせ療法 |
| MXPA06008209A (es) | 2004-01-21 | 2006-08-31 | Novo Nordisk As | Conjugacion de peptidos mediada por transglutaminasa. |
| US20130274171A1 (en) | 2010-06-04 | 2013-10-17 | Trifoilium Aps | Trefoil factors (tff) for the treatment of chronic pulmonary diseases |
| CN102526702A (zh) * | 2010-12-23 | 2012-07-04 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 小肽tff3治疗代谢综合征的用途 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NO884054D0 (no) * | 1988-09-13 | 1988-09-13 | Bio Tech As | Nytt pentapeptid og fremgangsmaate for fremstilling derav. |
| EP0573544B1 (en) * | 1991-02-14 | 2002-05-29 | The General Hospital Corporation | Intestinal trefoil proteins |
-
1995
- 1995-08-25 PT PT95929783T patent/PT777687E/pt unknown
- 1995-08-25 JP JP8508422A patent/JPH10504720A/ja not_active Ceased
- 1995-08-25 MX MX9701239A patent/MX9701239A/es active IP Right Grant
- 1995-08-25 CZ CZ1997548A patent/CZ289705B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-08-25 CN CN95194798A patent/CN1070867C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-08-25 DE DE69535060T patent/DE69535060T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-25 ES ES95929783T patent/ES2267104T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-25 KR KR1019970700968A patent/KR100255911B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1995-08-25 EP EP95929783A patent/EP0777687B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-25 UA UA97020840A patent/UA68324C2/uk unknown
- 1995-08-25 CA CA002196876A patent/CA2196876C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-08-25 AU AU33415/95A patent/AU694796B2/en not_active Ceased
- 1995-08-25 HU HU9801427A patent/HU226921B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-08-25 BR BR9508773A patent/BR9508773A/pt not_active IP Right Cessation
- 1995-08-25 WO PCT/DK1995/000343 patent/WO1996006861A1/en active IP Right Grant
- 1995-08-25 AT AT95929783T patent/ATE329929T1/de active
- 1995-08-25 EP EP06115209A patent/EP1739091A1/en not_active Withdrawn
- 1995-08-25 RU RU97104484/13A patent/RU2162857C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-08-25 PL PL95318785A patent/PL184516B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-08-25 DK DK95929783T patent/DK0777687T3/da active
-
1997
- 1997-02-25 FI FI970783A patent/FI119989B/fi not_active IP Right Cessation
- 1997-02-25 NO NO19970844A patent/NO323642B1/no not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-10-13 CZ CZ19993618A patent/CZ289864B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-11-28 JP JP2001363220A patent/JP4156829B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-12-20 JP JP2006343522A patent/JP2007161720A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100611130B1 (ko) | 식욕억제펩티드로이루어진약학적조성물의사용 | |
| US5912229A (en) | Use of a pharmaceutical composition comprising an appetite-suppressing peptide | |
| CZ289864B6 (cs) | Trojlístkový peptid, způsob přípravy, farmaceutický prostředek a pouľití trojlístkového peptidu | |
| Thim et al. | Characterization of human and rat intestinal trefoil factor produced in yeast | |
| US20030032585A1 (en) | Mucosal repair by TFF2 peptides | |
| CN113396157A (zh) | 具有降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物 | |
| US20080261871A1 (en) | Y2/Y4 Selective Receptor Agonists for Therapeutic Interventions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20130825 |