JP2002191385A - 三つ葉状のペプチド２量体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ２量体の形になっていることを特徴とする、
唯一の三つ葉状のドメインを含有する三つ葉状のペプチ
ド。 【解決手段】 １つの三つ葉状単量体をコードする DNA
配列で形質転換された適当な宿主細胞を、上記ペプチド
の生産を許容する条件下で培養し、回収することにより
製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は三つ葉状の(trefoi
l) ペプチド２量体、三つ葉状のペプチドの２量体を調
製する方法、三つ葉状のペプチド２量体を含む医薬組成
物及びそれらの胃腸疾患の治療における使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】三つ葉状のペプチドは主に胃腸管と関連
して見い出されるペプチドのファミリーを形成する。哺
乳類の三つ葉状のペプチドは１またはそれよりも多い特
徴的な三つ葉状のドメイン (Thim他、1989年）を含有
し、その各々は、６つの半−シスチン残基が配置１−
５，２−４及び３−６で結合している、38または39アミ
ノ酸残基の配列からなり、したがって特徴的な三つ葉状
の構造を形成している (Thim, 1989年) 。

【０００３】現在公知の哺乳類の三つ葉状のペプチドは
１または２のいずれかの三つ葉状のドメインを含有する
のに対し（復習のためにThim, 1994年；Poulson 及びWr
ight, 1993年；Hoffmann及びHauser. 1993年) 、１（Ha
user及びHoffmann, 1991年)、２（Hauser他、1992年ａ)
、４（Hoffmann, 1998年) または６（Hauser及びHoffm
ann, 1993年ｂ) 三つ葉状のドメインを含有する、かえ
る (Xenopus laevis) のペプチド及びタンパク質が記
載された。１つのドメインを含有する哺乳類の三つ葉状
のペプチドは、これまでヒト（Jakowlev他、1984年；Pr
ud'homme他、1985年) 及びマウス (Lefebvre他、1993
年）に公知の乳がんに関係するpS２ペプチド並びにこれ
までヒト (Podolsky他、1993年；Hauser他、1993年) 及
びラット(Suemori他、1991年、 Chinery他、1992年) に
公知の腸の三つ葉状の因子である。２つの三つ葉状のド
メインを含有する鎮痙性ポリペプチド（SP）はヒト(Tom
asetto他、1990年) 、ブタ (Thim他、1982年) 及びマウ
ス(Tomasetto他、1990年) について記載されている。ヒ
トでは３つの三つ葉状のペプチド、 hpS２、hITF及びhS
Pはすべて通常の状態で胃腸管中に、すなわち hSP及び
hps２は胃の上皮粘膜層中に(Tomasetto他、1990年； Ri
o他、1988年) 並びにhITFは小腸及び結腸の上皮粘膜層
中に(Podolsky 他、1993年) 発現されている。

【０００４】三つ葉状のペプチドの生理的機能は非常に
よくは分かっていない。胃腸管における三つ葉状のペプ
チドの増大した発現が粘膜損傷、たとえば炎症性の腸の
病気(Rio他、1991年； Poulson他、1992年；Wright他、
1993年) 及び胃及び十二指腸における潰瘍(Rio他、1991
年； Hanby他、1993年；Wright他、1990年) を含むいく
つかの状態で報告されている。結果的に、三つ葉状のペ
プチドの粘膜修復機能が示唆された (たとえば、Wright
他、1993年) 。三つ葉状のペプチドが損傷後の粘膜の上
皮の復旧を促進するという証拠は最近 Dignass他 (1994
年) 、Playford他 (1994年) 及び Babyatsky他 (1994
年) が示した。三つ葉状のペプチドがその修復機能を促
進するメカニズムは、ムチン−糖タンパク質を交叉結合
させて消化酵素耐性の粘弾性ゲル層を生成させることか
もしれない (Thim, 1994年； Gajhede他、1993年) 。

【０００５】ラットとヒトの単一ドメインの腸の三つ葉
状の因子のクローン化及び腸の三つ葉状の因子を胃腸の
損傷の治療に用いることは国際特許出願公開第92／1483
7 号に記載されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】今や、唯一の三つ葉状のドメインを有し、興味
深い薬理的性質を有する三つ葉状の因子の２量体の調製
が可能であることを見い出した。

【０００７】従って、本発明は唯一の三つ葉状のドメイ
ンを含有する三つ葉状のペプチドであって、２量体の形
になっていることを特徴とするペプチドに関する。

【０００８】上記のように、三つ葉状のペプチドは腸管
の粘膜層を安定化することによって消化性潰瘍及び他の
粘膜の損傷の治癒に貢献することは確かだと思われる。
この安定化のメカニズムは現在分かってはいない。しか
しながら、２つの三つ葉状のドメインを有するブタの膵
臓の鎮痙性ポリペプチド(PSP) のＸ線構造(Gajhede他、
1993年参照) は、大部分の保存された残基は、８〜10Å
幅の裂け目を与え、各々の三つ葉状のドメインに見い出
されることを示した。予備的な短かく切る実験はその裂
け目はオリゴサッカリド鎖の一部、たとえばムチン糖タ
ンパク質に結合した炭水化物に一致するだろうことを示
した。もし、これが事実なら、２つの上記裂け目をもつ
PSPはムチンを交叉結合して、粘膜上皮上に保護ゲルを
形成するのを助けるだろう。現在では唯一の三つ葉状の
ドメイン (たとえば ITF及びpS２）をもつ三つ葉状のペ
プチドが生体内で２量体を形成して同様な機能を働かせ
るのか、またはそれが、異ったメカニズムの作用を有す
るのかは分かっていない。しかしながら、現在は、この
ような三つ葉状のペプチドの２量体は本当にムチンを交
叉結合し、したがって、活性型のペプチドであると確信
されている。

【０００９】本発明の他の面は唯一の三つ葉状のドメイ
ンを含有する三つ葉状のペプチドの２量体を調製する方
法であって、そのペプチドの産生を可能とする条件下で
１つの三つ葉状のドメインを含有する三つ葉状のペプチ
ドをコードする DNA配列で形質転換された適当な宿主細
胞を培養し、その培養から結果として生じる三つ葉状の
ペプチド２量体を回収することを含む方法に関する。

【００１０】本発明の更なる面は、医薬として許容し得
る希釈剤または媒体と共に唯一の三つ葉状のドメインを
含有する三つ葉状のペプチドの２量体を含む医薬組成物
に関する。

【００１１】本発明のなお、更なる面は薬剤として用い
るための１つの三つ葉状のドメインを含有する三つ葉状
のペプチドの２量体及び胃腸疾患の予防または治療用の
薬剤の調製のための１つの三つ葉状のドメインを含有す
る三つ葉状のペプチドの２量体の使用に関する。

【００１２】

【発明の実施の形態】三つ葉状の因子の２量体は特に腸
の三つ葉状の因子(ITF) または乳がんに関係するペプチ
ド (pS２）であり得る。

【００１３】特に、三つ葉状の因子はヒトの ITF単量体
状アミノ酸配列であって、 ZEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKP LQEAECTF （配列番号１） （式中、ＺはGlu, GlnまたはpyrGlu) もしくは２量体化
可能で同様な活性を示すその同族体またはヒトのpS２単
量体状アミノ酸配列であって、 ZAQTETCTVAPRERQNCGFPGVTPSQCANKGCCFDDTVRGVPWCFYPNTID VPPEEECEF （配列番号２） （式中、ＺはGlu, GlnまたはpyrGlu) もしくは２量体化
可能で同様な活性を示すその同族体である。

【００１４】ITF またはpS２の同族体は同じシステイン
型及びジスルフィド配列（図１）を含み、ループ１，２
及び３において特定の配列相同性（対応する位置での同
一のアミノ酸または保存的置換のいずれかを意味する）
を示す。ループ領域の配列相同性は１〜10までのアミノ
酸残基を変更し、各ループ中のアミノ酸残基の数（シス
テインは別にして）は７〜12、好ましくは９〜10まで変
更し得る。

【００１５】ITF またはpS２の同族体は１以上のアミノ
酸置換、欠失または付加を有し得る。これらの変化は好
ましくは置換がそのタンパク質の折りたたみまたは活性
に実質的に影響を与えないような性質のものである。小
さな欠失は典型的にはループ領域の１〜約３アミノ酸並
びにＮ−及びＣ−末端領域の１〜約10アミノ酸、１個の
アミノ末端もしくはカルボキシ末端延長、たとえばアミ
ノ末端メチオニン残基、約10残基までの小さいリンカー
ペプチドまたは精製を容易にさせる小さい延長、たとえ
ばポリヒスチジン区域、抗原エピトープもしくは結合ド
メインである。一般的にはFord他の「Protein Expressi
on and Purification 」２：第95〜107頁（1991年）参
照。保存的置換の例は塩基性アミノ酸（たとえばアルギ
ニン、リシン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（たとえば
グルタミン酸及びアスパルチン酸）、極性アミノ酸（た
とえばグルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸
（たとえばロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族
アミノ酸（たとえばフェニルアラニン、トリプトファ
ン、チロシン）及び小さいアミノ酸（たとえばグリシ
ン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）の範
囲内である。

【００１６】上記置換は分子の機能に決定的な領域以外
の領域でなされ、なお活性なポリペプチドを生じること
ができることは当業者に明らかであろう。この三つ葉状
のペプチドの活性に必須の、したがって、好ましくは置
換を受けていないアミノ酸は、当業界で公知の方法、た
とえば部位特異的変異誘発またはアラニン走査変異誘発
に従って同定されるだろう (Cunningham及び Wells「Sc
ience 」244 、等1081〜1085頁、1989年) 。後者の技術
では変異は分子中のすべての残基に導入され、結果的に
生じた変異分子を生理的活性について試験し (たとえ
ば、粘膜の治癒、粘膜の保護、胃潰瘍の治癒) 、分子の
活性に決定的であるアミノ酸残基を同定する。

【００１７】同族体はアレレ変異体、すなわち、変異に
より生じた遺伝子の別の形または変異した遺伝子により
コードされた変更されたペプチドであるが本ペプチドと
実質的に同じ活性を有するペプチドであってもよい。し
たがって、変異は無症状（コードされたペプチドに変化
がない）であり得るか、または別のアミノ酸配列を有す
るペプチドをコードするかもしれない。

【００１８】三つ葉状のペプチドの同族体は相同の種、
すなわち、他の種、たとえばマウス、ラット、ウサギ、
ウシ、ブタまたはかえるから得る同様な活性をもつポリ
ペプチドであってもよい。

【００１９】好ましい態様では、本発明の三つ葉状のペ
プチド２量体は約13000 の分子量を有している。その２
量体は ITF様単量体の位置57またはpS２様単量体の位置
58における２つのシステイン残基の間のジスルフィド結
合によって結合された２つの三つ葉状のペプチド単量体
からなる。

【００２０】三つ葉状のペプチド２量体は好ましくは組
換えDNA 技術によって製造される。三つ葉状のペプチド
をコードする DNA配列は、ゲノムまたはcDNAライブラリ
ーを調製し、標準技術 (Sambrook他「Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual」 Cold Spring Harbor Labora
tory, Cold Spring Harbor、ニューヨーク州、1989年)
に従って、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるハ
イブリダイズにより、ペプチドのすべてまたは一部をコ
ードする DNA配列についてスクリーニングすることによ
って、最後には単離し得る。この目的のためには、その
ペプチドをコードする DNA配列は好ましくはヒトからの
もの、すなわち、ヒトゲノムDNA またはcDNAライブラリ
ー由来のものである。

【００２１】その三つ葉状のペプチドをコードする DNA
配列も、標準方法たとえばボケージ及びカルーサーズ
(Beaucage及び Caruthers「Tetrahedron Letters 」22,
1981年、第1859〜1869頁によって記載されたホスホア
ミダイト法またはマッテス他 (Matthes et al,「EMBO J
ournal」３，1984年、第 801〜805 頁) に記載された方
法によって合成的に製造してもよい。ホスホアミダイト
法に従って、オリゴヌクレオチドをたとえば自動 DNA合
成機中で合成し、精製し、アニールし、結合させ、適当
なベクター中でクローン化する。

【００２２】DNA 配列を特異的プライマーを用いるポリ
メラーゼ連鎖反応、たとえば米国特許第 4,683,202号、
サイキ(saiki) 他の「Scennce 」239 , 1988年、第 487
〜489 頁、またはサムブルック他の上記に記載されたよ
うな方法によっても製造し得る。

【００２３】三つ葉状のペプチドをコードする DNA配列
は通常、適宜組換えDNA 方法を受け得るいかなるベクタ
ーであってもよい組換えベクターに挿入され、ベクター
の選択はしばしば導入されるべき宿主細胞に依存するだ
ろう。したがって、ベクターは自己複製ベクター、すな
わち、染色体外の存在として存在し、その複製は染色体
の複製とは独立であるベクター、たとえばプラスミドで
あり得る。代りに、ベクターは、宿主細胞に導入された
時に宿主細胞ゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体
と共に複製されるものであり得る。

【００２４】ベクターは、好ましくは三つ葉状のペプチ
ドをコードする DNA配列が DNAの転写に必要な付加的な
セグメントに作用可能に結合された発現ベクターであ
る。一般に発現ベクターはプラスミドまたはウイルス性
DNA から得るか、または両方の要素を含有してもよい。
用語「作用可能に結合された」は、そのセグメントが、
それらがそれらの意図された目的のために協力して作用
するように、たとえば転写がプロモーター中で開始し、
ポリペプチドをコードする DNA配列を通って進行するよ
うに配置されていることを表わす。

【００２５】プロモーターは選択された宿主細胞中で転
写活性を示すいかなる DNA配列であってもよく、宿主細
胞に相同または異種性のいずれかであるタンパク質をコ
ードする遺伝子から得ることができる。

【００２６】哺乳類細胞中で三つ葉状のペプチドをコー
ドする DNAの転写を指示するための適当なプロモーター
の例はSV40プロモーター（Subraman他「Mol. Cell Bio
l. 」１ (1981年) 第 854〜864 頁) 、MT−１（メタロ
チオネイン遺伝子）プロモーター（Palmiter他「Scienc
e」222 (1983年) 第 809〜814 頁) またはアデノウイル
ス２主要後期プロモーターである。

【００２７】昆虫の細胞で用いるための適当なプロモー
ターの例は多角体（polyhedrin) プロモーター (米国特
許第 4,745,051号明細書、 Vasuvedan他「FEBS Lett.
311第７〜11頁）、Ｐ10プロモーター（J. M. Vlak他
「J. Gen. Virology」69，1988年、第 765〜776 頁) 、
オートグラファ カリホルニカ 多面体(Autographa ca
lifornicapolyhedrosis)ウイルス性塩基性タンパク質プ
ロモーター（欧州特許第397485号) 、バキュロウイルス
即時初期遺伝子１プロモーター（米国特許第 5,155,037
号、米国特許第 5,162,222号) またはバキュロウイルス
遅延された初期遺伝子プロモーター (米国特許第 5,15
5,037号、米国特許第 5,162,222号) である。

【００２８】酵母宿主細胞において用いる適当なプロモ
ーターの例は、解糖遺伝子 (Hitzeman他「J. Biol. Che
m.」255 （1980年) 第 12073〜12080 頁、 Alber及びKa
wasaki「J. Mol. Appl. Gen.」１ (1982年）第 419〜43
4 頁) もしくはアルコール脱水素酵素遺伝子(Young他
「Genetic Engineering of Microorganisms for Chemic
als(Hollaender他編) 」中に、Plenum Press、ニューヨ
ーク州、1982年) からのプロモーターまたはTPI １ (米
国特許第 4,599,311号) もしくは ADH２−４ｃ(Russell
他「Nature」304 （1983年) 第 652〜654 頁)プロモー
ターを含む。

【００２９】糸状菌宿主細胞に用いるのに適当なプロモ
ーターの例は、たとえばADH ３プロモーター (McKnight
他「The EMBO J. 」４（1985年）第2093〜2099頁）また
はtpiAプロモーターである。他の有用なプロモーターの
例は、Ａ．オリザエTAKAアミラーゼ、リゾムコル ミエ
ヘイ(Rhizomucor miehei) アスパルチン プロテイナー
ゼ、Ａ．ニガー(niger) 中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガ
ー酸安定α−アミラーゼ、Ａ．ニガーもしくはＡ．アワ
モリグルコアミラーゼ（gluA) 、リゾムコルミエヘイ
リパーゼ、Ａ．オリザエ アルカリ性プロテアーゼ、
Ａ．オリザエトリオースホスフェートイソメラーゼまた
はＡ．ニドラン（nidulans) アセタミダーゼから得たも
のである。TAKA−アミラーゼとgluAプロモーターが好ま
しい。適当なプロモーターはたとえば欧州特許第238023
号及び欧州特許第383779号に記載されている。

【００３０】三つ葉状のペプチドをコードする DNA配列
は適当なターミネーター、たとえばヒト成長ホルモンタ
ーミネーター (Palmiter他「Science 」222 , 1983年、
第 809〜814 頁) または (真菌宿主のために)TPI１（Al
ber 及びKawasaki「J. Mol.Appl. Gen.」１, 1982年、
第 419〜434 頁）もしくはADH ３（McKnight他「TheEMB
O J. 」４，1985年、第2093〜2099頁）ターミネータ
ー、にも必要ならば作用可能に結合してもよい。

【００３１】ベクターは、更に要素、たとえばポリアデ
ニル化シグナル（たとえばSV40またはアデノウイルスの
５Elb 領域) 、転写エンハンサー配列（たとえばSV40エ
ンハンサー) 及び翻訳エンハンサー配列（たとえばアデ
ノウイルスVA RNAをコードするもの）を含み得る。

【００３２】組換えベクターは更にベクターを問題の宿
主細胞中に複製できるようにする DNA配列を含み得る。
そのような配列の例は（宿主細胞が哺乳類細胞のと
き）、SV40複製開始点である。

【００３３】宿主細胞が酵母細胞のとき、ベクターを複
製できるようにする適当な配列は酵母プラスミド２μ複
製遺伝子 REP１−３及び複製開始点である。

【００３４】ベクターは選択マーカー、たとえば、その
産生物が宿主細胞の欠損を捕捉する遺伝子、たとえばジ
ヒドロホレート レダクターゼ（DHFR) またはシゾサッ
カロミセス ポンベ (Schizosaccharomycespombe) TPI
遺伝子（P. R. Russellによって、「Gene」40, 1985
年、第 125〜130 頁に記載されている) または薬物、た
とえば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリ
ン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイ
シンもしくはメトトレキサートに対する耐性を与える遺
伝子も含み得る。糸状菌については、選択マーカーはam
dS, pyrG, argB, niaDまたはsCを含む。

【００３５】本発明の三つ葉状のペプチドを宿主細胞の
分泌経路に向けるために、分泌シグナル配列 (リーダー
配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られてい
る）を組換えベクター中に提供し得る。分泌シグナル配
列を、正しいリーディグフレーム中に三つ葉状のペプチ
ドをコードする DNA配列に結合する。分泌シグナル配列
は一般にペプチドをコードする DNA配列に対し５′に位
置する。分泌シグナル配列は普通にはペプチドと関連す
る配列であるか、他の分泌されたタンパク質をコードす
る遺伝子からであり得る。

【００３６】酵母細胞からの分泌について、分泌シグナ
ル配列はその細胞の分泌経路への発現された三つ葉状の
ペプチドの効率的な指示を保証するどのようなシグナル
ペプチドをコードするものでよい。シグナルペプチドは
天然のシグナルペプチドもしくはそれらの機能的な部分
であるか、または合成ペプチドでもよい。適当なシグナ
ルペプチドは、α−因子シグナルペプチド（米国特許第
4,870,008号参照) 、マウスの唾液のアミラーゼのシグ
ナルペプチド (O. Hagenbuchle他「Nature」289 , 1981
年、第 643〜646 頁参照) 、修飾されたカルボキシペプ
チダーゼシグナルペプチド (L. A. Vall他「Cell」48,1
987年、第 887〜897 頁参照) 、酵母BAR１シグナルペプ
チド（国際特許出願公開第87／02670 号参照) または酵
母アスパルチン プロテアーゼ３(YAP３）シグナルペプ
チド(M. Egel−Mitani他「Yeast 」６，1990年、第 127
〜137 頁参照) であることを見い出した。

【００３７】酵母における効率的な分泌のために、リー
ダーペプチドをコードする配列をシグナル配列の下流及
び三つ葉状のペプチドをコードする DNA配列の上流に挿
入してもよい。リーダーペプチドの機能は発現されたペ
プチドを小泡体からゴルジ装置に、そして更に培地中へ
の分泌のために分泌小泡へ誘導させること（すなわち、
三つ葉状のペプチドを細胞壁を通して、または少くとも
細胞膜を通して酵母細胞の細胞周辺腔へ運び出すこと）
である。リーダーペプチドは酵母α−因子リーダー（そ
れを用いることは、たとえば米国特許第 4,546,082号、
米国特許第 4,870,008号、欧州特許第 16201号、欧州特
許第123294号、欧州特許第123544号及び欧州特許第1635
29号に記載されている）であってもよい。代りに、リー
ダーペプチドは、合成リーダー（すなわち、天然にはな
いリーダーペプチド）であってもよい。合成リーダーペ
プチドは、たとえば国際特許出願公開第89／02463 号ま
たは国際特許出願第92／11378 号に記載されているよう
に構築してもよい。

【００３８】糸状菌に用いるために、シグナルペプチド
をアスペルギルス種アミラーゼもしくはグルコアミラー
ゼをコードする遺伝子、リゾムコル ミエヘイ リパー
ゼもしくはプロテアーゼまたはフミコーララヌギノサ
リパーゼをコードする遺伝子から適宜得てもよい。シグ
ナルペプチドは好ましくは、Ａ．オリザエ TAKAアミラ
ーゼ、Ａ．ニガー中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安
定アミラーゼまたはＡ．ニガー グルコアミラーゼをコ
ードする遺伝子から得られる。適当なシグナルペプチド
は、たとえば欧州特許第238023号及び欧州特許第215594
号に記載されている。

【００３９】昆虫の細胞で用いるためには、シグナルペ
プチドは適宜昆虫の遺伝子（国際特許第90／05783
号）、たとえば鱗翅目のマンズカ セクスタ(Manduca s
exta) 脂質動員ホルモン前駆体シグナルペプチド (米国
特許第 5,023,328号) から得てもよい。

【００４０】三つ葉状のペプチドをコードする DNA配
列、プロモーター及び任意にターミネーター及び／また
は分泌シグナル配列をそれぞれ結合し、複製のために必
要な情報を含有する適当なベクターにそれらを挿入する
のに用いられる方法は当業者によく知られている（たと
えば、Sambrook他「Molecular Cloning: A LaboratoryM
anual」Cold Spring Harbor、ニューヨーク州 (1989年)
参照) 。

【００４１】三つ葉状のペプチドをコードする DNA配列
を導入する宿主細胞は、ペプチドを２量体の形で産生可
能ないかなる細胞でもよく、酵母、真菌及びより高級な
真核細胞を含む。

【００４２】適当な哺乳類細胞系の例は、COS(ATCC CRL
1650), BHK(ATCC CRL 1632, ATCCCCL 10), CHL(ATCC C
CL 39) またはCHO(ATCC CCL 61)細胞系である。哺乳類
細胞をトランスフェクトし、細胞内に導入された DNA配
列を発現する方法は、たとえば、 Kaufman及び Sharpの
「J. Mol. Biol. 」159 （1982年) 第 601〜621 頁、So
uthern及びBergの「J. Mol. Appl. Genet.」１ (1982
年) 第 327〜341 頁、Loyter他の「Proc. Nath. Acad.
Sci. USA」79 (1982年) 第 422〜426 頁、Wigler他の
「Cell」14 (1978年) 第 725頁、 Corsar 及びPeasonの
「Somatic Cell Genetics 」７ (1981年) 第 603頁、Gr
aham及びvan der Ebの「Virology」52 (1973年) 第 456
頁及び Neumann他の「EMBO J. 」１ (1982年) 第 841〜
845 頁に記載されている。

【００４３】適当な酵母細胞の例はサッカロミセス種ま
たはシゾサッカロミセス種、特にサッカロミセス セレ
ビシアエまたはサッカロミセスクルイベリの株である。
酵母細胞を異種DNA で形質転換し、それから異種ポリペ
プチドを産生する方法は、たとえば、米国特許第 4,59
9,311号、米国特許第 4,931,373号、米国特許第 4,870,
008号及び米国特許第 4,845,075号に記載されており、
これらのすべては参照により本明細書に組み入れられ
る。形質転換された細胞は選択マーカー、一般に薬剤耐
性または特定の栄養素、たとえばロイシンの不存在で増
殖する能力によって決定される表現型により選択され
る。酵母で用いるのに好ましいベクターは、米国特許第
4,931,373号に記載されている POT１ベクターである。
シグナル配列及び任意にリーダー配列（たとえば上記の
ような）は三つ葉状のペプチドをコードする DNA配列の
先に立つ。更に適当な酵母細胞の例は、クルイベロミセ
スの株、たとえば、Ｋ．ラクチス (lactis) 、ハンセヌ
ラ (Hansenula)、たとえば、Ｈ．ポリモルファ (polymo
rpha) またはピチア (Pichia) 、たとえばＰ．パストリ
ス(pastoris) である(Gleeson他「J. Gen. Microbio
l.」132 , 1986年、第3459〜3465頁、米国特許第 4,88
2,279号参照) 。

【００４４】他の真菌細胞の例は、糸状菌、たとえばア
スペルギルス種、ニューロスポラ (Neurospora) 種、フ
サリウム (Fusarium) 種またはトリコデルマ(Trichoder
ma)種、特にＡ．オリザエ、Ａ．ニドランまたはＡ．ニ
ガーの細胞である。タンパク質の発現のためにアスペル
ギルス種を用いることは、たとえば欧州特許第272277
号、欧州特許第184438号に記載されている。Ｆ．オキシ
スポルム(oxysporum) の形質転換は、たとえば、 Malar
dier他 (「Gene」78, 1989年、第 147〜156 頁)により
記載されているように実施する。トリコデルマ種の形質
転換は、たとえば欧州特許第244234号に記載されている
ように実施し得る。

【００４５】糸状菌を宿主細胞として用いる時は、適宜
DNA構成物を宿主の染色体に組み込み、組換え宿主細胞
を得ることにより、本発明の DNA構成物で形質転換し得
る。この組込みは、 DNA配列が細胞中により安定に維持
されるようであるので、一般に利点と考えられている。
DNA構成物の宿主染色体への組込みは慣用の方法、たと
えば相同の、または異種性の組換えによって実施し得
る。

【００４６】昆虫細胞の形質転換及びその中での異種ポ
リペプチドの産生は、米国特許第 4,745,051号、米国特
許第 4,879,236号、米国特許第 5,155,037号、米国特許
第 5,162,222号及び欧州特許第 397,485号 (参照により
すべてが本明細書に組み入れられる）に記載されている
ように実施する。宿主として用いられる昆虫細胞系は適
切には、レピドプテラ(Lepidoptera) 細胞系、たとえば
スポドプテラ フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)
細胞、またはトリコプルシア ニ(Trichoplusia ni) 細
胞 (米国特許第 5,077,214号) であり得る。培養条件は
適切には、たとえば国際出願公開第89／01029 号もしく
は国際出願公開第89／01028 号または前述の参照文献に
記載されているものでよい。

【００４７】上記形質転換またはトランスフェクトされ
た宿主細胞を、次いで三つ葉状のペプチドの発現を許容
する条件下で適当な栄養培地中で培養し、その後生じた
ペプチドのすべてまたは一部を２量体の形で培養から回
収し得る。細胞を培養するのに用いられる条件は、宿主
細胞を増殖させるのに適当ないかなる慣用の培地、たと
えば、適当な補足を含有する最小培地または複合培地で
ある。適当な培地は営利供給者から得られるか、または
出版された処方箋（たとえば、American TypeCulture C
ollection中の) にしたがって調製し得る。細胞により
産生された三つ葉状のペプチドを、次いで遠心分離また
はろ過による培地からの宿主細胞の分離上清またはろ液
のタンパク質成分の塩、たとえば硫酸アンモニウムの手
段による沈殿、種々のクロマトグラフ手段、問題のポリ
ペプチドの型に依存して、たとえばイオン交換クロマト
グラフ、ゲルろ過クロマトグラフ、アフィニティークロ
マトグラフまたはその他同様なものによる精製を含む慣
用の方法により培地から回収し得る。

【００４８】本発明の医薬組成物では、三つ葉状のペプ
チド２量体を医薬組成物を処方する任意の確立された方
法、たとえば「Remington's Pharmaceutical sciences
」 (1985年) に記載されたように処方し得る。その組
成物は全身注射または点滴に適する形でよく、それ自
体、滅菌水または等張塩類液またはグルコース溶液で処
方し得る。組成物は当業界で良く知られた慣用の殺菌技
術により殺菌し得る。生じる水溶液を使用のために包装
するか、または無菌条件下でろ過し、凍結乾燥してもよ
く、凍結乾燥された調製物は殺菌された水溶液と投与の
前に結合させる。組成物は医薬として許容し得る、およ
その生理的条件に必要な補助物質、たとえば緩衝剤、張
性調整剤及び同様なもの、たとえば酢酸ナトリウム、乳
酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カ
ルシウム等を含有し得る。

【００４９】本発明の医薬組成物は経鼻、経皮または経
腸投与にも用い得る。前記組成物に用い得る医薬として
許容し得る担体または希釈剤は、いかなる慣用の固体担
体でもよい。固体担体の例は、ラクトース、白土、ショ
糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ス
テアリン酸マグネシウム及びステアリン酸である。同様
に、担体または希釈剤は当業界で公知の任意の持続性放
出物質、たとえばモノステアリン酸グリセロールまたは
ジステアリン酸グリセロール (単独でまたはワックスと
混合して) を包含し得る。固体担体の量は非常に大きく
変化するが、通常、約25mg〜約１ｇであろう。

【００５０】組成物中の三つ葉状のペプチドの濃度は広
く、すなわち、約５％〜約 100重量％に変化し得る。好
ましい濃度は50〜100 重量％の範囲である。組成物の単
位投薬量は典型的には約１mg〜約 200mg、好ましくは約
25mg〜約75mg、特に約50mgのペプチドを含有し得る。

【００５１】上記のように、本発明の三つ葉状の２量体
は前記ペプチドの活性型であると確信された。それ自体
胃腸疾患の予防または治療のために用いることは有利で
あると考える。より詳細には、胃もしくは消化性潰瘍、
炎症性の腸の病気、クローン病または放射線療法、細菌
もしくは他の感染により生じた腸管の損傷等の治療に用
いることが考えられる。患者に投与されるポリペプチド
の用量は治療される状態の型及び重症度により広く変化
するだろうが、一般に 0.1〜1.0mg ／kg体重の範囲であ
る。

【００５２】本発明を添付した図面と関連して例におい
てさらに詳細に記載する。 例 物質及び方法ラットのITF(rITF) 及びヒトのITF(hITF) のクローン化 ラット及びヒトの ITFのクローン化を国際特許出願公開
第92／14837 号に記載されたように及び Suemori他 (19
91年) 及び Chinery他 (1992年)(ラットのITF)並びにPo
dolsky他 (1993年) 及びHauser他 (1993年)(ヒトのITF)
により記載されたように実施した。rITF及びhITF発現プラスミドの構築 ラットの ITFの分泌のための発現プラスミドpHW756及び
ヒトの ITFの分泌のための発現プラスミド pHW1066を図
７〜９に概説したように構築した。酵母発現ベクターpK
FN1003 (国際特許出願公開90／10075 号に記載されてい
る）はプラスミドCPOT(Kawasaki, G「International Co
nference on Yeast Genetics and Molecular Biology」
1984年９月17日〜24日、エジンバラ・スコットランド要
約第15頁）の誘導体である。それは選択マーカーとして
のシゾサッカロミセス ポンベ TPI遺伝子(POT) (Russe
ll, P.R.「Gene」40 (1985 年) 第 125〜130 頁) 及び
発現の調節のためにＳ．セレビシアエトリホースホスフ
ェート イソメラーゼ(TPI) プロモーター及びターミネ
ーターを有している (Alber, T及びKawasaki, G.「J. M
ol. Appl. Genet.」１ (1982年) 第 419〜434 頁) 。

【００５３】ラットの ITF遺伝子は最初にBluescript I
I KS (−)(Stratagene) 中にクローン化され、それから
図８に従って増殖させる。有用なクローン化部位を提供
するヘルパーベクターpSX54 は pUC18及びpDN1050 から
成る (Diderichsen, B；Poulsen, G. B., Jorgensen,
S. T.「Plasmid 」30 (1993年) 第 312〜315 頁) 。合
成DNA リンカーNco １−PflMI は次の式を有する。 1858： 5′-CATGGCTGAAAGATTGGAAAAGAGACAAGAGTTCGTTGGTTTGT CTCCATCCCAATGT-3′58bp （配列番号３） 1862： 5 ′-TTGGGATGGAGACAAACCAACGAACTCTTGTCTCTTTTCCAAT CTTTCAGC- ３′ 51bp （配列番号４） 前記リンカーはコドンの選択にいくつかの変化を有する
Thim, L., Norris, K., Nielsen, P.F., Bjorn, S., Ch
ristensen, M., Petersen J.の「FEBS Lett.」318 （19
93年) 第 345〜352 頁に記載されたリーダー配列のＣ−
末端８−アミノ酸及びラットの ITF遺伝子Ｎ−末端部、
すなわち QEFVGLSPSQCをコードしている。シグナル及び
リーダーのアミノ酸配列は同所に記載されている。

【００５４】 MKAVFLVLSLIGFCWAQPVTGDESSVEIPEESLIIAENTTLANVAMAERLEKR. （配列番号５） ヒトの ITF遺伝子を PUC19中にクローン化し、図９に記
載したように増殖させた。合成DNA リンカーNcol１−Bs
aAl は次の配列を有している。 2292： 5′-CATGGCTGAAAGATTGGAAAAGAGAGAAGAATAC-3′ 34bp （配列番号６） 2287： 5′-GTATTCTTCTCTCTTTTCCAATCTTTCAGC-3′ 30bp （配列番号７） 前記リンカーはrITF構築について記載されたＣ−末端８
−アミノ酸のリーダー及びhITF遺伝子のＮ−末端３アミ
ノ酸： EEYをコードする。シグナル及びリーダーは上記
と同じである。

【００５５】唯一の炭素源としてのグルコースでの増殖
についての選択により、発現プラスミドをＳ．セレビシ
アエ株MT663(Ｅ２−７B X E11 −36ａ／α, Δtpi ／Δ
tpi,pep４−３／pep ４−３）に形質転換した。

【００５６】ラットの ITF及びヒトの ITFを発現する酵
母形質転換体をそれぞれ HW756及びHW1067と名づけた。発酵 上記形質転換体を追加の酵母抽出物 (60ｇ／Ｌ）を補足
した酵母ペプトンデキストロース(YPD) 培地(Sherman
他、1981年) 中で30℃で72時間培養した。発酵の終りに
660nmでのOD価はHW756(rITF) 及びHW1066 (hITF) につ
いて、それぞれ、153及び 232に達した。発酵の終りにp
Hを１Ｍリン酸で 2.5に調整し、酵母細胞を 3000rpm、1
5分間の遠心分離により除去した。組換えrITFの精製 酵母発酵肉汁培地及び精製の間に得られた分画における
rITFの濃度を分析的HPLCにより測定した。30℃で平衡化
されたVydac214TP54逆相C4 HPLC カラム (0.46×25cm)
にアリコート (通常50〜200 μＬ) を15％（ｖ／ｖ）の
アセトニトリル中の 0.1％ (ｖ／ｖ）の TFAと共に流量
1.5mL／分で注入した。10分間の定組成溶離の後、溶離
溶媒中のアセトニトリルの濃度は40分にわたって55％に
上昇した。吸収は 214nmで測定した。26.5分、27.3分及
び２８．２分で溶離する３つのピーク（図２）はrITFの
２量体型を表わすことを見い出した。計算された hSP標
準(Thim他、1993年) を用いて、そのペプチドの量を測
った。

【００５７】本酵素系中の組換えラットITF の発現レベ
ルは 113mg／Ｌであった。

【００５８】10Ｌの発酵槽から、遠心分離により 8.7Ｌ
の発酵肉汁培地を分離した。上清を14.8Ｌの蒸留水で希
釈し伝導率を下げた。その試料をFast Flow S-Sepharos
e (Pharmacia) カラム (５×42cm) に流量 600mL／時間
でポンプで注入した。適用の前にカラムを50mMの50mMの
NaClを含有する、ギ酸緩衝液、 pH3.7中で平衡化させ
た。 600mL／時間の流量で 100mLの分画を収集し、rITF
の量について分析した。rITFを含有する前の段階の分画
を貯留し(2.3Ｌ) 、Amberchrome(Ｇ−71）カラム（５×
10cm) にポンプで注入した。適用の前に、10mM酢酸アン
モニウム緩衝液 pH4.8で流量 0.5Ｌ／時間でカラムを平
衡化した。適用後、カラムを 0.5Ｌの平衡緩衝液で洗浄
し、60％ (ｖ／ｖ）のエタノールを含有する。pH4.8 の
10mM酢酸アンモニウムで、流量 0.1Ｌ／時間で溶離させ
た。10mLの分画を収集し、rITFの量に従って貯留した。
貯留中のエタノール濃度は２容積のエタノール（99.9
％、ｖ／ｖ）を加えることによって60％（ｖ／ｖ）から
87％（ｖ／ｖ）に増加し、結果として生じた混合物を−
25℃に16時間冷却することによりrITFは沈殿した。

【００５９】沈殿物を10,000ｇで、−25℃で１時間の遠
心分離により収集し、室温で 130mLの20mMギ酸 pH3.0に
再溶解した。試料を Fast Flow SP-Sepharose (Pharmac
ia)カラム（５×20cm) に流量50mL／時間でポンプで注
入した。適用の前にカラムを20mMギ酸 pH3.0で平衡化し
た。 1.5Ｌの50mMぎ酸 pH3.0及び 0.5Ｍ NaClを含有す
る 1.5Ｌのギ酸 pH3.0の間の直線グラジエントによりペ
プチドをカラムから溶離した。分画 (10mL) を流量80mL
／時間で収集し、 280nmで吸収を測定した。分画はrITF
の量について分析した。rITFに相当する分画を貯留し
た。ラットの ITFをさらに予備的HPLCで精製した。貯留
された分画(900mL) を 0.1％（ｖ／ｖ)TFAで平衡化し
た、Vydac214TP1022C4予備的HPLCカラム(2.2×25cm) に
ポンプで注入した。ペプチドを、MeCN／H₂O ／TFA(10：
89.9：0.1 ，ｖ／ｖ／ｖ）及びMeCN／H₂O ／TFA(65：3
4.9：0.1 ，ｖ／ｖ／ｖ）から形成した直線グラジエン
ト(540mL) を用いて、25℃で流量５mL／分で溶離した。
UV吸収を 280nmで監視し、10mLに相当する分画を収集
し、rITFの量について分析した。rITFを含有する分画を
貯留し、真空遠心分離によって容積を30％に減少させ
た。生じた貯留から、rITFを凍結乾燥により単離した。
8.7Ｌの発酵培地からのrITFの全収量は 236mgであっ
て、全精製収率24％に相当した。組換えhITFの精製 酵母発酵肉汁培地及び精製の間に得られた分画中のhITF
の濃度をrITFについて記載したものと同一のHPLC系で測
定した。この系においては、質量スペクトル及びシーク
エンス分析により、２つの溶離ピークが21.2分及び27.1
分で見い出され、hITFの２量体型及び単量体型を表わ
す。この酵母系における組換えヒト ITFの発現レベルは
90mg／Ｌであった。

【００６０】10Ｌの発酵槽から、 8.0Ｌの肉汁培地が遠
心分離によって分離された。試料を40Ｌの10mMギ酸、 p
H2.5に対して３回（各回24時間で）透析した。試料をSP
-Sepharose Fast Flow (Pharmacia)カラム（５×40cm)
にポンプで注入した (0.25Ｌ／時間）。カラムを５Ｌの
20mMギ酸、 pH2.5で洗浄し、５Ｌの20mMギ酸、 pH2.5及
び５Ｌの１ＭのNaClを含有するギ酸、 pH2.5で形成した
直線グラジエントで溶離した。 100mLの分画を収集し、
hITFの量について分析した（図３）。hITFの２つの型が
カラムから溶離し、１つはhITFの単量体型(0.5ＭのNaCl
で溶離) を表わし、１つはhITFの２量体型（0.78ＭのNa
Clで溶離) を表わした。２つの型に相当する分画を別々
に貯留した。

【００６１】各分画を３つの等しい分量（容積：約 700
mL) に分割し、 0.1％ (ｖ／ｖ)TFA中で平衡化したVyda
c214TP1022 C4 カラム(2.2×25cm) にポンプで注入し
た。ペプチドはMeCN／H₂O ／TFA(10：89.9：0.1 ，ｖ／
ｖ／ｖ）及びMeCN／H₂O ／TFA(65：34.9：0.1 ，ｖ／ｖ
／ｖ）の間の直線グラジエント(540mL) を用いて、流量
４mL／分で溶離した。UV吸収を 280nmで監視し、10mLに
相当する分画を収集し、hITFの量について分析した。

【００６２】hITF (単量体) 及びhITF（２量体）を含有
する前段階からの分画を別々に貯留し、pHを 3.0に調整
した。試料を別々に、40％（ｖ／ｖ）のエタノールを含
有する20mMのギ酸 pH3.0で平衡化されたSP-Sepharose H
iLoad 16／10(Pharmacia) カラム(1.6×10cm) に適用し
た。カラムを80mMの平衡緩衝液で洗浄し、 200mLの20mM
ギ酸、 pH3.0、40％ (ｖ／ｖ）エタノール及び 200mLの
40％（ｖ／ｖ）の１ＭNaClを含有する20mMギ酸、 pH3.0
の間の直線グラジエントで、流量４mL／分で溶離した。
分画（５mL）を収集し、hITFの量について分析した。

【００６３】hITF（単量体）及びhITF（２量体）をそれ
ぞれ含有する分画を貯留し、エタノール濃度を90％（ｖ
／ｖ）に調節し、混合物を−25℃で72時間冷却すること
によりペプチド含有量を沈殿させた。沈殿物を遠心分離
によって収集し、凍結乾燥した。８Ｌの発酵肉汁培地か
らの総収量は226mg hITF（単量体）及び133mg hITF（２
量体）で総精製収率は単量体型及び２量体型について、
それぞれ50％及び65％であった。組換えrITF及びhITFの特徴づけ 真空密封管内で６Ｍ HClで 110℃で24、48、96時間、加
水分解後、試料 (50μｇ) をベックマン (Model 121 M
B) 自動アミノ酸分析機で分析した。半−シスチンを、
トリブチルホスフィンによるジスルフィド結合の還元
（Rueegg及びRudinger、1974年) に続く４−ビニルピリ
ジンを用いるカップリング (Friedman他、1970年) 後、
Ｓ−β−（４−ピリジルエチル）誘導体として測定し
た。４−ビニルピリジン処理試料の加水分解を４Ｍメタ
ンスルホン酸または３Ｍメルカプトエタンスルホン酸に
より、 110℃で24時間上記のように実施した。アミノ酸
配列分析をApplied Biosystems Model 470A 気相シーク
エンサーを用いて自動化エドマン分解によって測定した
(Thim他、1987年) 。

【００６４】質量スペクトル分析をAPI III LC／MS／MS
システム (Sciex, Thornhill, Ont., Canada) を用いて
実施した。３つの部分からなる四極子器具は2400の質量
対荷電（ｍ／Ｚ）範囲を有しており、空気補助電子スプ
レイ（イオンスプレイともいう）はインターフェースに
はまっている（Bruins他、1987年； Covey他、1988年)
。試料の導入は液体流量 0.5〜１μＬ／分に固定され
た溶融毛細管（内径75μｍ）を通って、シリンジ注入ポ
ンプ(Sage Instruments, Cambridge、マサチュセッツ
州) によって行った。器具のｍ／Ｚの目盛は単位分析の
もとにポリプロピレングリコール (PPGs) の単独に荷電
したアンモニウム付加物イオンで目盛を決めた。質量測
定の精度は一般に0.02％よりも良い。

【００６５】図４は精製rITF（図４Ａ）及びhITF（図４
Ｂ及び４Ｃ）について得られた分析的HPLCクロマトグラ
ムを示す。組換えrITFは３つの密接に関連したペプチド
の混合物を含有し、これらの型を分離する試みはなされ
なかった。電子スプレイ質量分析法により分析した時、
13112.2, 13096.6及び 13078.8に相当する、３つの優位
な分子量が見い出された（図５Ａ）。 Cys−57が遊離SH
基を含有する単量体型におけるラットの ITFの計算され
た分子量は6558.3である。２量体型 (たとえばＳ−Ｓ架
橋が２つの Cys−57の間に確立されている）中のラット
の ITFの計算された分子量は 13114.6である。組換えラ
ットITF について見い出された分子量から、すべての３
つのペプチドはrITFの２量体型を表わすことは明らかで
ある。Ｎ−末端アミノ酸残基が Gln、たとえば PSPであ
る他の三つ葉状のペプチドからは(Thim他、1985年及び
Tomasetto他、1990年) 、この残基は環化してピロリド
ンカルボン酸 (pyrGlu) を形成する傾向がある。予想さ
れたＮ−末端配列である、Gln-Glu-Phe-Val-Glyを有す
るラットの ITFの場合、Ｎ−末端 Glnも環化してpyrGlu
を形成するだろうと仮定するのが合理的なようである。
このような誘導体化はラットの ITF（２量体）の17（１
つのpyrGlu) または34（２つのpyrGlu) 質量単位のそれ
ぞれの分子量の減少を生ずるだろう。観察された分子量
13096.6及び13078.8 (図５Ａ）は、それぞれ１つ、２
つのＮ−末端 Cln残基が環化された、ラットの ITFの２
量体型に相当する。これらの型の計算分子量は 13097.6
及び 13080.6であって、実験的に測定された値とよく一
致している。このように、HPLC（図４Ａ）及び質量分析
（図５Ａ）から、組換え体ラット ITFは３つの異った２
量体型、すなわち、２つのＮ−末端 Glnを含有するも
の、１つのＮ−末端 Glnと１つのＮ−末端pyrGluを含有
するもの及び２つのＮ−末端pyrGluを含有するものから
なると結論する。表Ｉはラットの ITFのアミノ酸組成を
示し、予想値と良く一致している。

【００６６】図５Ａ及び５Ｂは、分析的HPLCにより分析
した時のhITF (単量体) 及びhITF（２量体）のそれぞれ
の純度を示す。２量体型（図５Ｃ）は、相対的に純粋に
みえるが、単量体型（図５Ｂ）はペプチドの前に溶離す
る物質で汚染されているようである。しかしながら、主
要なピークで溶離する物質の再クロマトグラフィーによ
ると、同様なクロマトグラムが得られた（結果を示して
いない）。これは不純物よりもむしろ逆相カラムでのhI
TF（単量体）の異常行動を示すようである。我々は以前
高度に純粋なブタの PSP並びに高度に純粋な組換え hSP
の同様な行動を観察した (Thim他、1993年) 。

【００６７】hITF（単量体）の質量分析は主要なピーク
の分子量が 6694.0(図５Ｂ）に相当することを示す。ア
ミノ酸配列（図１）から計算すると、分子量は Cys−57
がSH型で存在すると仮定して、6574.4である。アミノ酸
配列分析（表II）は、予想されたＮ−末端配列のGlu-Gl
u-Tyr-Val-Gly-を示す。アミノ酸組成分析（表Ｉ）は、
7.3(８）システインの存在を除いて予想された値を示
す。hITF単量体の Cys−57に結合する追加のシステイン
は質量分析法により測定した値（6694.0）に非常に近
い、6694.7に分子量を増加させるだろう。したがって、
hITF（単量体）では、 Cys−57は追加のシステインにジ
スルフィド結合していると思われる。質量スペクトル
（図５Ｂ）における小さい分子量ピークは他の Cys−57
誘導体を表わすか、調製物中の不純物であるかもしれな
い。

【００６８】２つの単量体が２つの Cys−57残基の間の
ジスルフィド結合によって結合している、hITF（２量
体）の計算分子量は 13146.8である。これは質量分析法
により測定された値(13147、図５Ｃ）と良く一致してい
る。質量スペクトルにおける他のピーク(13169）はたぶ
んhITF (２量体) のNa⁺ 付加物を表わす。配列分析 (表
Ｉ）並びにアミノ酸組成分析（表II）も予想された値と
良く一致している。

【００６９】

【表１】

【００７０】

【表２】

【００７１】

【表３】

【００７２】

【表４】

【００７３】

【表５】

【００７４】

【表６】

【００７５】

【表７】

【００７６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> Trefoil Peptide Dimer <130> B017489 <140> PCT/DK95/00343 <141> 1995-08-25 <150> DK 0983/94 <151> 1994-08-26 <160> 7 <210> 1 <211> 59 <212> PRT <213> Homo Sapiens <223> Xaa=Glu, Gln or pyroGlu <400> 1 Xaa Glu Tyr Val Gly Leu Ser Ala Asn Gln Cys Ala Val Pro Ala Lys 1 5 10 15 Asp Arg Val Asp Cys Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn 20 25 30 Asn Arg Gly Cys Cys Phe Asp Ser Arg Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys 35 40 45 Phe Lys Pro Leu Gln Glu Ala Glu Cys Thr Phe 50 55 <210> 2 <211> 60 <212> PRT <213> Homo Sapiens <223> Xaa=Glu, Gln or pyroGlu <400> 2 Xaa Ala Gln Thr Glu Thr Cys Thr Val Ala Pro Arg Glu Arg Gln Asn 1 5 10 15 Cys Gly Phe Pro Gly Val Thr Pro Ser Gln Cys Ala Asn Lys Gly Cys 20 25 30 Cys Phe Asp Asp Thr Val Arg Gly Val Pro Trp Cys Phe Tyr Pro Asn 35 40 45 Thr Ile Asp Val Pro Pro Glu Glu Glu Cys Glu Phe 50 55 60 <210> 3 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Synthetic DNA linker NcoI-PflMI <400> 3 catggctgaa agattggaaa agagacaaga gttcgttggt ttgtctccat cccaatgt 58 <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Synthetic DNA Linker NcoI-PflMI <400> 4 ttgggatgga gacaaaccaa cgaactcttg tctcttttcc aatctttcag c 51 <210> 5 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Signal and Leader Amino Acid Sequence <400> 5 Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala 1 5 10 15 Gln Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser 20 25 30 Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu 35 40 45 Arg Leu Glu Lys Arg 50 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Synthetic Linker NcoII-BsaAI <400> 6 catggctgaa agattggaaa agagagaaga atac 34 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <223> Synthetic Linker NcoII-BsaAI <400> 7 gtattcttct ctcttttcca atctttcagc 30

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はヒトの腸の三つ葉状の因子ITF の提案さ
れた構造を示す。最初のアミノ酸配列はHauser他 (1993
年) からとり、ジスルフィド結合を PSP及びpS２ (Thi
m, 1988年) に一致させて置いた。

【図２】図２はラットITF を発現している酵母株 HW756
からの上清のVydac214TP54での逆相HPLCを示す。

【図３】図３は部分的に精製されたヒトITF の高速(Fas
t Flow) SP−セファロースカラム上のイオン交換クロマ
トグラフィを示す。hITF (単量体）及びhITF (２量体)
の量を分析的HPLCにより測定した。棒は単量体及び２量
体の形のさらなる精製のために貯留された分画を示す。
点線は溶離液中のNaClの濃度を示す。

【図４】図４は精製されたラットのITF(２量体)(Ａ)、
ヒトのITF(単量体)(Ｂ) 及びヒトのITF(２量体)(Ｃ)の
Vydac214TP54 C4カラムでの逆相HPLCを示す。

【図５】図５は精製されたラットのITF(２量体)(Ａ）、
ヒトのITF(単量体)(Ｂ) 及びヒトのITF(２量体)(Ｃ）の
再構築された質量スペクトルを示す。

【図６】図６はヒトの ITFの２量体の型の構造を示す。

【図７】図７はプラスミド KFN1003の制限マップを示
す。

【図８】図８はプラスミドpHW756の構築を示す。

【図９】図９はプラスミド pHW1066の構築を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴェルディケ，ヘレ ファブリシウス デンマーク国，デーコー−3540 リンゲ, ステンディセバイ 12 (72)発明者 ニールセン，ペル フランクリン デンマーク国，デーコー−3500 ベルレ ス，ヨンフルバッケン ３ゲー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 4B064 AG01 CA19 CC24 DA13 4C084 AA01 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA21 BA26 CA53 DC50 MA17 MA44 MA59 MA60 MA63 MA66 NA14 ZA662 ZA682 4H045 AA10 AA20 BA10 CA40 EA51 FA72 FA74

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 各々が唯一の三つ葉状のドメインを含む
   ２つの三つ葉状のペプチド単量体を含む三つ葉状のペプ
   チドの２量体であって、前記単量体は２つのシステイン
   残基の間のジスルフィド結合によって結合されている前
   記２量体。
2. 【請求項２】 前記三つ葉状のペプチド単量体が腸の三
   つ葉状の因子(ITF）及び乳がんに関係するペプチド（pS
   ２）からなる群から選択されるものである請求項１に記
   載のペプチド。
3. 【請求項３】 ２つの ITF単量体の２量体である請求項
   ２に記載のペプチド。
4. 【請求項４】 前記 ITF単量体がヒトの ITF単量体であ
   る請求項３に記載のペプチド。
5. 【請求項５】 分子量が約 13000である請求項３に記載
   のペプチド。
6. 【請求項６】 前記 ITF２量体が、各単量体の位置57に
   おける２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合に
   よって結合されている請求項３に記載のペプチド。
7. 【請求項７】 ２つのpS２単量体の２量体である請求項
   ２に記載のペプチド。
8. 【請求項８】 前記pS２単量体がヒトのpS２単量体であ
   る請求項７に記載のペプチド。
9. 【請求項９】 前記pS２２量体が、各単量体の位置58に
   おける２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合に
   よって結合されている請求項７に記載のペプチド。
10. 【請求項１０】 各々が唯一の三つ葉状のドメインを含
    む２つの三つ葉状のペプチド単量体を含む三つ葉状のペ
    プチドの２量体を製造する方法であって、１つの三つ葉
    状単量体をコードする DNA配列で形質転換された適当な
    宿主細胞をそのペプチドの生産を許容する条件下で培養
    し、その培養から結果として生ずる三つ葉状のペプチド
    を回収することを含む前記方法。