PL184516B1

PL184516B1 - Dimer peptydu trefoilowego sposób przygotowania dimeru peptydu trefoilowego kompozycja farmaceutyczna i dimer peptydu trefoilowego do zastosowania jako lek

Info

Publication number: PL184516B1
Application number: PL95318785A
Authority: PL
Inventors: Thim@Lars; Wöldike@Helle@Fabricius; Nielsen@Per@Franklin
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1994-08-26
Filing date: 1995-08-25
Publication date: 2002-11-29
Also published as: ES2267104T3; NO323642B1; HU226921B1; CZ54897A3; FI970783A; DE69535060T2; CN1156459A; FI119989B; WO1996006861A1; PL318785A1; HUT77917A; BR9508773A; MX9701239A; DK0777687T3; DE69535060D1; JPH10504720A; UA68324C2; AU3341595A; EP1739091A1; RU2162857C2

Abstract

1. Dimer peptydu trefoilowego, znamienny tym, ze dimer ten zawiera dwa mono meryczne peptydy trefoilowe, kazdy obejmujacy jedna domene trefoilowa typu poje- dynczego polaczone razem wiazaniem dwusiarczkowym pomiedzy dwiema resztami cy- sternowymi. 9. Sposób przygotowywania dimeru peptydu trefoilowego zawierajacego dwa mo nomeryczne peptydy trefoilowe, kazdy obejmujacy jedna domene trefoilowa typu poje- dynczego polaczone razem wiazaniem dwusiarczkowym pomiedzy dwiema resztami cy- sternowymi, znamienny tym, ze hoduje sie odpowiednia komórke gospodarza stransfor mowana sekwencja DNA kodujaca peptyd trefoilowy zawierajacy jedna domene trefoli lowa w warunkach sprzyjajacych wytwarzaniu tego peptydu, oddziela sie chromatogra- ficznie od hodowli otrzymany monomer petydu trefoilowego i dimer peptydu trefoilowego i odzyskuje sie dimer peptydu trefoilowego. 10. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia lub zapobiegania zaburzeniem ukladu pokarmowego, zawierajaca substancje czynna oraz farmaceutycznie dopuszczalny nosnik lub rozcienczalnik, znamienna tym, ze jako czynnik aktywny zawiera dimer peptydu trefo- ilowego charakteryzujacy sie tym, ze dimer peptydu zawiera dwa monomeryczne peptydy trefoilowe, kazdy obejmujacy jedna domene trefoilowa typu pojedynczego polaczone wiaza- niem dwusiarczkowym pomiedzy dwiema resztami cysternowymi, w stezeniu od okolo 5% do 100% wagowych. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazkujest dimer peptydu trefoilowego charakteryzujący się tym, że dimer ten zawiera dwa monomeryczne peptydy trefoilowe, każdy obejmujący jedną domenę trefoilową typu pojedynczego połączone razem wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi.

Korzystnie dimer według wynalazku jest jelitowym czynnikiem trefoilowym (ITF), a bardziej korzystnie dimer jest (ITF) człowieka i najbardziej korzystnie dimer według wynalazku posiada przybliżoną masę cząsteczkową 13000.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku ITF składa się z dwóch monomerów ITF połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi w pozycji 57 każdego monomeru.

Dimer według wynalazku jest korzystnie peptydem związanym z rakiem piersi (pS2), ewentualnie także korzystnie jest pS2 człowieka.

W takim przypadku korzystnie dimer peptydu pS2 składa się z dwóch monomerów pS2 połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi w pozycji 58 każdego monomeru.

Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób przygotowywania dimeru peptydu trefoilowego zawierającego dwa monomeryczne peptydy trefoilowe, każdy obejmujący jedną domenę trefoilową typu pojedynczego połączone razem wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysteinowymi, charakteryzujący się tym, że hoduje się odpowiednią komórkę gospodarza stransformowaną sekwencją DNA kodującą peptyd trefoilowy zawierający jedną domenę trefoilową w warunkach sprzyjających wytwarzaniu tego peptydu, oddziela się chromatograficznie od hodowli otrzymany monomer petydu trefoilowego i dimer peptydu trefoilowego i odzyskuje się dimer peptydu trefoilowego.

Kolejnym przedmiotem wynalazkujest kompozycja farmaceutyczna do leczenia lub zapobiegania zaburzeniom układu pokarmowego, zawierającą substancję czynną oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik, charakteryzująca się tym, że jako czynnik aktywny zawiera dimer peptydu trefoilowego, przy czym ten dimer peptydu zawiera dwa monomeryczne peptydy trefoilowe, każdy obejmujący jedną domenę trefoilową typu pojedynczego połączone wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi, w stężeniu od około 5% do 100% wagowych.

W kompozycji według wynalazku korzystnym dimerem peptydu trefoilowego jest jelitowy czynnik trefoilowy (ITF), a bardziej korzystnym dimerem peptydu trefoilowego jest ITF człowieka. Kompozycja farmaceutyczna, według wynalazku może zawierać korzystnie taki dimer peptydu, który ma przybliżoną masę cząsteczkową 13000. W innym bardziej korzystnym rozwiązaniu, kompozycja farmaceutyczna, może zawierać jako dimer peptydu trefoilowego dimer ITF składający się z dwóch monomerów ITF połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi w pozycji 57 każdego monomeru, również

184 516 korzystnie jako dimer peptydu trefoilowego, kompozycja może zawierać peptyd związany z rakiem piersi (pS2), a zwłaszcza może zawierać dimer peptydu trefoilowego będący pS2 człowieka; i w takim przypadku kompozycja farmaceutyczna, według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera pS2 składający się z dwóch monomerów pS2 połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysteinowymi w pozycji 58 każdego monomeru.

Następnym przedmiotem wynalazku jest dimer peptydu trefoilowego zawierający dwa monomeryczne peptydy trefoilowe, każdy obejmujący jedną domenę trefoilową typu pojedynczego połączone wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysteinowymi do zastosowania jako lek.

Korzystnie dimer peptydu trefoilowego, może być stosowany jako lek do leczenia lub zapobiegania zaburzeniom układu pokarmowego.

Dimerem czynnika trefoilowego może być w szczególności dimer jelitowego czynnika trefoilowego (ITF) lub peptydu związanego z rakiem piersi (pS2).

W szczególności, czynnikiem treofilowym jest ludzki ITF, którego sekwencja aminokwasowa monomeru jest następująca:

ZEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFK

PLQEAECTF gdzie Z jest Glu, Gin lub piroGlu, ewentualnie jego homolog zdolny do dimeryzacji i wykazywania podobnej aktywności; lub ludzki pS2, którego sekwencja aminokwasowa monomeru jest następująca:

ZAQTETCTVAPRERQNCGFPGVTPSQCANKGCCFDDTVRGVPWCFYPNTI

DVPPEEECEF gdzie Z jest Glu, Gin lub piroGlu, bądź jego homolog zdolny do dimeryzacji i wykazywania podobnej aktywności.

Homologi ITF lub pS2 posiadają ten sam wzór reszt cysteiny i układ mostków dwusiarczkowych (fig. 1) oraz wykazują pewną homologię sekwencji, którą należy rozumieć jako występowanie albo identycznych reszt aminokwasowych w odpowiadających pozycjach, albo podstawień konserwatywnych) w pętlach 1, 2 i 3. Homologia sekwencji w regionach pętli może różnić się od 1 do 10 resztami aminokwasowymi, a ilość reszt aminokwasowych w każdej pętli (poza resztami cystein) może być zróżnicowana od 7 do 12, korzystnie od 9 do 10.

Homologi ITF lub pS2 mogą mięć jedno lub więcej podstawień, delecji lub addycji aminokwasowych. Zmiany te mają korzystnie taki charakter, że podstawienia nie wpływają znacząco na ufałdowanie lub aktywność białka. Niewielkie delecje obejmują zazwyczaj od 1 do 3 aminokwasów w regionach pętli i od 1 do około 10 aminokwasów aminokwasów w regionach N- i C-końcowych; inne zmiany obejmują jedno-aminokwasowe wydłużenia amino- lub karboksylokońcowe, takie jak aminokońcowa reszta metioniny, krótki peptyd łącznikowy o długości do około 10 reszt, bądź krótkie przedłużenie, które ułatwia oczyszczanie, takie jak odcinek polihistydynowy, epitop antygenowy lub domena wiążąca. Dla ogólnej orientacji, patrz Ford i in., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991.

Przykłady podstawień aminokwasowych dotyczą grupy aminokwasów zasadowych (takich jak arginina, lizyna, histydyna), aminokwasów kwaśnych (takich jak kwas glutaminowy i kwas asparaginowy), aminokwasów polarnych (takich jak glutamina i asparagina), aminokwasów hydrofobowych (takich jak leucyna, izoleucyna, walina), aminokwasów hydrofobowych (takich jak fenyloalanina, tryptofan, tyrozyna) i aminokwasów małych (takich jak glicyna, alanina, seryna, treonina, metionina).

Dla specjalistów w tej dziedzinie będzie oczywiste, że takich podstawień można dokonywać poza regionami mającymi zasadnicze znaczenie dla funkcji cząsteczki i w wyniku, których nadal otrzymuje się aktywny polipeptyd. Aminokwasy mające zasadnicze znaczenie dla aktywności niniejszego peptydu trefoilowego, i dlatego korzystnie nie poddawane podstawieniom,

184 516 można zidentyfikować zgodnie z procedurami znanymi w nauce, takimi jak ukierunkowana mutageneza lub mutageneza podstawień alaniną (Cunningham i Wells, Science 244. 1081-1085, 1989). W tej ostatniej technice mutacje wprowadza się do każdej reszty cząsteczki i otrzymane zmutowane cząsteczki testuje się pod względem aktywności biologicznej (np. gojenia śluzówki, ochrony śluzówki, gojenia wrzodów żołądka) w celu zidentyfikowania reszt aminokwasowych, które mają zasadnicze znaczenie dla aktywności cząsteczki.

Homologiem może być wariant alleliczny, tj. alternatywna postać genu, która powstaje poprzez mutację, lub zmieniony peptyd kodowany przez zmutowany gen, ale zasadniczo posiadający taką samą aktywność, jak niniejszy peptyd. A zatem, mutacje mogą być milczące (brak zmiany kodowanego peptydu) lub mogą kodować peptyd o zmienionej sekwencji aminokwasowej.

Homologiem niniejszego peptydu trefoilowego może być również homolog gatunkowy, tj. polipeptyd o podobnej aktywności pochodzący z innego gatunku, np. myszy, szczura, królika, krowy, świni lub żaby.

W korzystnym rozwiązaniu, dimer peptydu trefoilowego według wynalazku posiada masę cząsteczkowa wynosząca około 13000. Dimer składa się z dwóch monomerów peptydów trefoilowych połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy resztami cystein w pozycji 57 monomerów podobnych do ITF lub w pozycji 58 monomerów podobnych do pS2.

Dimer peptydu trefoilowego wytwarza się korzystnie technikami rekombinacji DNA. W tym celu, sekwencję DNA kodującą peptyd trefoilowy można wyizolować przez przygotowanie biblioteki genomowej lub cDNA i przeszukanie pod kątem sekwencji DNA kodujących całość lub część peptydu przez hybrydyzacje z zastosowaniem syntetycznych sond oligonukleotydowych zgodnie ze standardowymi technikami (zobacz, Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy Jork, 1989). Dla celów niniejszego wynalazku, sekwencja DNA kodująca peptyd jest korzystnie pochodzenia ludzkiego, tj. pochodzi z ludzkiej biblioteki genomowej lub biblioteki cDNA.

Sekwencję DNA kodującą peptyd trefoilowy można także przygotować syntetycznie uznanymi standardowymi metodami, np. metodą z wykorzystaniem fosforynoamidów opisaną przez Beaucage i Caruthersa, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 -1869 lub metodą opisaną przez Matthesa i in., EMBO Journal 2 (1984), 801 - 805. Według metody z wykorzystaniem fosforynoamidów syntetyzuje się oligonukleotydy, np. w automatycznym syntezatorze DNA, oczyszcza je, łączy komplementarne nici, liguje i klonuje w odpowiednich wektorach.

Sekwencję DNA można także przygotować poprzez reakcję łańcuchową polimerazy z zastosowaniem specyficznych starterów, na przykład jak opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 683 202, Saiki i in., Science 239 (1988), 487 - 491 lub Sambrook i in., supra.

Sekwencję DNA kodującą peptyd trefoilowy zazwyczaj wstawia się w zrekombinowany wektor, którym może być jakikolwiek wektor, który można dogodnie poddawać procedurom rekombinacji DNA, a wybór wektora często zależeć będzie od komórki gospodarza, do której ma być on wprowadzany. A zatem, wektorem może być wektor ulegający autonomicznej replikacji, tj. wektor, który istnieje jako jednostka pozachromosomalna, której replikacja jest niezależna od replikacji chromosomalnej, np. plazmid. Alternatywnie, wektorem może być wektor, który po wprowadzeniu do komórki gospodarza ulega integracji z jej genomem i replikuje się razem z chromosomem(ami), z którymi uległ integracji.

Wektorem jest korzystnie wektor ekspresyjny, w którym sekwencja DNA kodująca peptyd trefoilowy jest połączona w sposób umożliwiający działanie z dodatkowymi odcinkami wymaganymi do transkrypcji DNA. Na ogół, wektor ekspresyjny pochodzi z DNA plazmidowego lub wirusowego lub może zawierać elementy obu typów DNA. Termin „połączona w sposób umożliwiający działanie” wskazuje, że odcinki są ustawione w taki sposób, że działają zgodnie z zamierzonymi celami, np. transkrypcja ulega inicjacji w promotorze i przebiega przez sekwencję DNA kodującą polipeptyd.

184 516

Promotorem może być sekwencja DNA, która wykazuje aktywność transkrypcyjną w wybranej komórce gospodarza i może pochodzić z genów kodujących białka albo homologiczne, albo heterologiczne wobec komórki gospodarza.

Przykładami promotorów odpowiednich do kierowania transkrypcją DNA kodującego peptyd trefoilowy w komórkach ssaków są promotor SV40 (Subramani i in., Mol. Celi Biol. 1 (1981), 854 - 864), promotor MT-1 (genu metalotioneiny) (Palmiter i in., Science 222 (1983), 809- 814) lub główny późny promotor adenowirusa 2.

Przykładem promotora odpowiedniego do stosowania w komórkach owadów jest promotor poliedryny opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 745 051; Vasuvedan i in., FEBS Lett. 311, (1992) 7 - 11), promotor P10 (J.M. Vlak i in., L Gen. Virology £2, 1988, str. 765-776), promotor białka basic wirusa poliedrozy Autographa californica (europejski opis patentowy numer 397 485), promotor natychmiastowego wczesnego genu 1 bakulowirusa (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 155 037; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 162 222) lub promotor opóźnionego wczesnego genu 39 K bakulowirusa (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 155 037; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 162 222).

Przykłady promotorów odpowiednich do stosowania w drożdżowych komórkach gospodarza obejmują promotory genów glikolitycznych drożdży (Hitzeman i in., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber i Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434) lub genów dehydrogenaz alkoholowych (Young i in., w: Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (red. Hollaender i in.). Plenum Press, Nowy Jork, 1982) lub promotory TPI1 (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 599 311) bądź ADH2-4c (Russell i in., Nature 304 (1983), 652 - 654).

Przykładami promotorów odpowiednich do stosowania w komórkach gospodarza grzybów nitkowatych są, na przykład, promotor ADH3 (McKnight i in., The EMBO J. 4. (1985), 2093 - 2099) lub promotor tpiA. Przykładami innych użytecznych promotorów są te pochodzące z genów kodujących amylaze TAKA A. oryzae, proteinaze aspartylowa Rhizomucor miehei., obojętną α-amylaze A. niger, stabilną w środowisku kwaśnym α-amylaze A· niger lub glukoamylazę (gluA) A. awamori, lipazę Rhizomucor miehei, proteazę alkaliczną A. oryzae, izomerazę triozofosforanową A. oryzae lub ac-etamidazę A. nidulans. Preferowane są promotory amylazy TAKA i gluA. Odpowiednie promotory wymieniono m.in. w europejskim opisie patentowym numer 238 023 i europejskim opisie patentowym numer 383 779.

Sekwencja DNA kodująca peptyd trefoilowy może również być, jeśli jest to konieczne, połączona w sposób umożliwiający działanie z odpowiednim terminatorem, takim jak terminator ludzkiego hormonu wzrostu (Palmiter i in., Science 222. 1983, str. 809-814) lub (dla gospodarzy grzybowych) terminatory TPPI1 (Alber i Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, str. 419-434) lub ADH3 (McKnight i in., The EMBO J. 4, 1985, str. 2093-2099). Wektor może ponadto obejmować takie elementy, jak sygnały poliadenylacji (np. z SV40 lub regionu Elb adeno-wirusa 5), sekwencje wzmacniające transkrypcję (np. sekwencja wzmacniająca SV40) i sekwencje wzmacniające translację (np. sekwencje kodujące RNA VA adenovirusa).

Zrekombinowany wektor może ponadto zawierać sekwencję DNA umożliwiającą jego replikację w będącej przedmiotem zainteresowania komórce gospodarza. Przykładem takiej sekwencji (gdy komórką gospodarza jest komórka ssaka) jest miejsce początku replikacji SV40. Gdy komórką gospodarza jest komórka drożdżowa, odpowiednimi sekwencjami umożliwiającymi replikację wektora są geny replikacji REP 1-3 i miejsce początku replikacji drożdżowego plazmidu 2μ.

Wektor może również zawierać marker selekcyjny, np. gen, którego produkt uzupełnia braki komórki gospodarza, taki jak gen kodujący reduktazę dihydrofolianową (DHFR) lub gen TPI Schizosaccharomyces pombe (opisany przez P.R. Russella, Gene 40, 1985, str. 125-130), lub taki, który nadaje oporność na lek, np. ampicylinę, kanamycynę, tetracyklinę, chloramfenikol, neomycynę, hygromycynę lub metotreksat. Markery selekcyjne dla grzybów nitkowatych obejmują amdS, pyrG, argB, niaD lub sC.

Do kierowania peptydu trefoilowego na drogę sekrecyjną w komórkach gospodarza, w zrekombinowanym wektorze można dostarczyć sekrecyjną sekwencję sygnałową (nazywana

184 516 także sekwencją liderową, sekwencjjąprepro lub sekwencjąpre). Sekrecyjną sekwencję sygnałową łączy się we właściwej ramce odczytu z sekwencją DNA kodującą peptyd trefoilowy. Sekrecyjne sekwencje sygnałowe zazwyczaj umiejscawia się w kierunku 5' od sekwencji kodującej peptyd. Sekrecyjną sekwencją sygnałową może być ta normalnie towarzysząca peptydowi lub może ona pochodzić z genu kodującego inne białko ulegające sekrecji.

Dla zapewnienia sekrecji z komórek drożdżowych, sekrecyjną sekwencja sygnałowa może kodować jakikolwiek peptyd sygnałowy, który zapewnia wydajne kierowanie w komórce ulegającego ekspresji peptydu trefoilowego na drogę sekrecyjną. Peptydem sygnałowym może być naturalnie występujący peptyd sygnałowy, jego funkcjonalna część, bądź może nim być peptyd syntetyczny. Stwierdzono, że odpowiednimi peptydami sygnałowymi są peptyd sygnałowy czynnika a; (wg O. Hagenbuchle i in. Nature 289. 1981, str. 643-646), zmodyfikowany peptyd sygnałowy karboksypeptydazy (wg L.A. Valls i in. Cell 48, 1987, str. 887-897), drożdżowy peptyd sygnałowy BAR 1 (wg światowego opisu patentowego numer WO 87/02670 lub peptyd sygnałowy drożdżowej proteazy aspartylowej 3 (YAP3) (wg M. Egel-Mitani i in., Yeast 6, 1990, str. 127-137).

Dla zapewnienia wydajnej sekrecji u drożdży, za sekwenccą sygnałową, a przed sekwencją DNA kodującą peptyd trefoilowy można także wstawić sekwencję kodującą peptyd liderowy. Funkcja peptydu liderowego polega na umożliwieniu kierowania ulegającego ekspresji peptydu z retikulum endoplazmatycznego do aparatu Golgi’ego i dalej do pęcherzyków sekrecyjnych w celu sekrecji do podłoża hodowlanego (tj. przeniesienia peptydu trefoilowego przez ścianę komórkową, lub przynajmniej błonę komórkową do przestrzeni peryplaz.matycznej komórki drożdżowej). Peptydem liderowym może być lider drożdżowego czynnika a (którego stosowanie opisano np. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 546 082, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 870 008, europejskim opisie patentowym numer 16 201, europejskim opisie patentowym numer 123 294, europejskim opisie patentowym numer 123 544 i europejskim opisie patentowym numer 163 529). Alternatywnie, peptydem liderowym może być syntetyczny peptyd liderowy, który jest peptydem liderowym nie występującym w przyrodzie. Syntetyczne peptydy liderowe można konstruować na przykład jak opisano w światowym opisie patentowym numer 89/02463 lub światowym opisie patentowym numer 92/11378.

Do stosowania w grzybach nitkowatych, peptyd sygnałowy można dogodnie otrzymać z genu kodującego amylazę lub glukoamylazę Aspergillus sp., genu kodującego lipazę lub proteazę Rhizomucor miehei bądź lipazę Humicola lanuginosa. Korzystne jest, jeśli peptyd sygnałowy pochodzi z genu kodującego amylazę TAKA A. oryzae, obojętną α-amylazę A. niger, stabilną w środowisku kwaśnym amylazę A. niger lub glukoamylazę A. niger. Odpowiednie peptydy sygnałowe ujawniono np. w europejskim opisie patentowym numer 238 023 i europejskim opisie patentowym numer 215 594.

Do stosowania w komórkach owadów, peptyd sygnałowy może dogodnie pochodzić z genu owada (wg światowego opisu patentowego numer 90/05783), tak jak peptyd sygnałowy prekursora hormonu adypokinetycznego motyla Manduca sexta (wg opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 023 328).

Procedury stosowane do ligacji sekwencji DNA kodujących peptyd trefoilowy, promotor i ewentualnie terminator i/lub sekrecyjną sekwencję sygnałowa, odpowiednio, oraz do ich wstawiania do odpowiednich wektorów zawierających informację konieczną do replikacji, są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie (zobacz, na przykład, Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Nowy Jork, 1989).

Komórką gospodarza, do której wprowadza się sekwencję kodującą peptyd trefoilowy, może być jakakolwiek komórka, która jest zdolna do wytwarzania peptydu w postaci dimeru i która jest komórką drożdżową, grzybową lub wyższego organizmu eukariotycznego.

Przykładami odpowiednich linii komórek ssaków są linie komórkowe COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL (ATCC CCL39) lub CHO (ATCC CCL 61). Metody transfekowania komórek ssaków i uzyskiwania ekspresji sekwencji DNA wprowadzanych do komórek opisano np. w Kaufman i Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601 - 621; Southern i Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327 - 341; Loyter i in., Proc. Natl.

184 516

Acad. Sci, USA 79 (1982), 422 - 426; Wigier i in., Cell 14, (1978), 725; Corsaro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham i van der Eb, Virol0gy_52 (1973), 456 oraz Neumann i in., EMBO J. 1 (1982), 841 - 845.

Przykłady odpowiednich komórek drożdżowych obejmują komórki Saccharomyces spp. lub Schizosaccharomyces spp., szczególnie szczepy Saccharomyces cerevisiae lub Saccharomyces kluyveri. Metody transformowania komórek drożdżowych heterologicznym DNA i wytwarzania w nich heterologicznych polipeptydów opisano np. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 599 311, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 931 373, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 870 008, 5 037 743 i opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 845 075, z których wszystkie włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe. Stransformowane komórki selekcjonuje się dzięki fenotypowi określanemu przez marker selekcyjny, zwykle oporności na lek lub zdolności do wzrostu w nieobecności określonego składnika odżywczego, np. leucyny. Korzystnym wektorem do stosowania w drożdżach jest wektor POT1 ujawniony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 931 373. Sekwencję DNA kodującą peptyd trefoilowy może poprzedzać sekwencja sygnałowa i, ewentualnie, sekwencja liderowa, np. jak opisane powyżej. Dalszymi przykładami odpowiednich komórek drożdżowych są szczepy Kluyveromyces, takie jak K. lactis, Hansenula, np. H. polymorpha, lub Pichia, np. P. pastoris (wg. Gleeson i in., J. Gen. Microbiol. 132. 1986, str. 3459-3465; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 882 279.

Przykładami innych komórek grzybowych są grzyby nitkowate, np. Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. lub Trichoderma spp., zwłaszcza A. oryzae, A. nidulans lub A. niger·. Zastosowanie Aspergillus spp. do ekspresji białek opisano np. w europejskich opisach patentowych o numerach EP 272 277, EP 238 023 i EP 184 438. Transformację F. oxysporum można przeprowadzić na przykład w sposób opisany przez Malardiera i in., 1989, Gene 78: 147-156. Transformację Trichoderma spp. można przeprowadzić na przykład jak opisano w europejskim opisie patentowym numer EP 244 234.

Gdy jako komórkę gospodarza stosuje się grzyba nitkowatego, dla otrzymania zrekombinowanej komórki gospodarza można ją stransformować konstrukcją DNA według wynalazku, dogodnie przez integrację konstrukcji DNA z chromosomem gospodarza. Integrację taką generalnie uważa się za zaletę, ponieważ bardziej prawdopodobne jest stabilne utrzymywanie sekwencji DNA w komórce. Integrację konstrukcji DNA z chromosomem gospodarza można przeprowadzić zgodnie z metodami konwencjonalnymi, np. przez rekombinację homologiczną lub heterologiczną.

Transformację komórek owadów i wytwarzanie w nich polipeptydów heterologicznych można przeprowadzić jak opisano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach US 4 475 051, Us 4 879 236, US 5 155 037, 5 162 222 i europejskim opisie patentowym numer EP 397 485, z których wszystkie włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe. Odpowiednimi liniami komórek owadów zastosowanymi jako komórki gospodarza mogą być linie komórek Lepidoptera, takie jak komórki Spodoptera frugiperda lub komórki Trichoplusia ni (wg opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki numer US 5 077 214). Odpowiednie warunki hodowli mogą być takie, jak opisano na przykład w światowych opisach patentowych o numerach WO 89/01029 lub Wo 89/01028 bądź w którymkolwiek z wyżej wymienionych odnośników.

Opisane powyżej stransformowane lub stransfekowane komórki gospodarza hoduje się następnie w odpowiednim podłożu odżywczym w warunkach umożliwiających ekspresję peptydu trefoilowego, po czym całość lub część uzyskanego peptydu odzyskuje się z hodowli w postaci dimeru. Podłożem zastosowanym do hodowli komórek może być jakiekolwiek podłoże konwencjonalne odpowiednie do wzrostu komórek gospodarza, takie jak minimalne lub złożone podłoże zawierające odpowiednie dodatki. Odpowiednie podłoża dostępne są od dostawców, lub można je przygotować zgodnie z opublikowanymi przepisami (np. w katalogach American Type Culture Collection). Wytworzony przez komórki peptyd trefoilowy można następnie odzyskać z podłoża hodowlanego przez wirowanie lub sączenie, wytrącenie składników białkowych supematantu lub przesączu solą, np. siarczanem amonowym, oczyszczanie różnymi

184 516 procedurami chromatograficznymi, np. chromatografię jonowymienna, sączenie molekularne, chromatografię powinowactwa i podobne, w zależności od rodzaju interesującego nas polipeptydu.

W kompozycji farmaceutycznej według wynalazku, dimerowi peptydu trefoilowego można nadać postać zgodnie z jakąkolwiek z ustalonych metod nadawania postaci kompozycjom farmaceutycznym, np. jak opisane w Remington^ Pharmaceutical Science. 1985. Kompozycja może mieć postać odpowiednią do iniekcji lub infuzji ogólnoustrojowej i może, jako taka, być przeprowadzona w odpowiednią postać jałową wodą, izotonicznym roztworem soli fizjologicznej lub roztworem glukozy. Kompozycję można wyjaławiać konwencjonalnymi technikami wyjaławiania, które są dobrze znane w nauce. Otrzymane roztwory wodne można pakować do stosowania lub sączyć w warunkach aseptycznych i liofilizować, liofilizowany preparat będzie łączony przed podawaniem z jałowym roztworem wodnym. Kompozycja może zawierać farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze, jeśli jest to wymagane do stworzenia warunków fizjologicznych, takie jak czynniki buforujące, czynniki regulujące ciśnienie osmotyczne i podobne, na przykład octan sodowy, mleczan sodowy, chlorek sodowy, chlorek potasowy, chlorek wapniowy itp.

Kompozycję farmaceutyczną według niniejszego wynalazku można także dostosować do podawania donosowego, przezskórnego lub doodbytniczego. Farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem wykorzystywanym w kompozycji może być każdy konwencjonalny nośnik stały. Przykładami stałych nośników są laktoza, kaolin, sacharoza, talk, żelatyna, agar, pektyna, guma arabska, stearynian magnezowy i kwas stearynowy. Podobnie, nośnik lub rozcieńczalnik może obejmować każdy znany w tej dziedzinie odpowiedni materiał uwalniający, taki jak monostearynian glicerolu lub distearynian glicerolu, sam lub zmieszany z woskiem. Ilość stałego nośnika może być szeroko zróżnicowana, ale zazwyczaj będzie wynosić od około 25 mg do około 1 g.

Stężenie peptydu trefoilowego w kompozycji może być szeroko zróżnicowane, tj. od około 5% do około 100% wagowych. Korzystne stężenie pozostaje w zakresie 50-100% wagowych. Jednostka dawkowania kompozycji może typowo zawierać od około 1 mg do około 200 mg, korzystnie od około 25 mg do około 75 mg, w szczególności około 50 mg peptydu.

Jak wskazano powyżej, uważa się, że dimer peptydu trefoilowego jest aktywną postacią peptydu. Jako taki jest uważany za korzystny do stosowania do zapobiegania lub leczenia zaburzeń układu pokarmowego. Bardziej szczegółowo, rozważa się go do stosowania w leczeniu wrzodów żołądka lub wrzodów trawiennych, zapalenia jelita, choroby Crohna lub uszkodzeń przewodu pokarmowego spowodowanych radioterapią, infekcjami bakteryjnymi lub innymi itp. Dawka polipeptydu podawanego pacjentowi będzie zróżnicowana w zależności od rodzaju i stanu zaawansowania leczonego stanu, ale na ogół pozostaje w zakresie 0,1-1,0 mg/kg masy ciała.

KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW

Niniejszy wynalazek opisano bardziej szczegółowo w przykładzie, odnoszącym się do dołączonych rysunków, gdzie

Figura 1 Proponowana struktura ludzkiego jelitowego czynnika trefoilowego ITF. Sekwencję aminokwasowa podano według Hausera i in., 1993, a wiązania dwusiarczkowe umieszczono przez homologię do PSP i pS2 (Thim, 1988).

Figura 2 HPLC z odwróconymi fazami supernatantu z hodowli szczepu drożdżowego HW756, w którym zachodzi ekspresja ITF, na kolumnie Vydac 214TP542.

Figura 3 Chromatografia jonowymienna częściowo oczyszczonego ludzkiego ITF na kolumnie Fast Flow SP-Sepharose. Ilość hITF (monomeru) i hITF (dimeru) określono przez analityczną HPLC. Czarne pasy wskazują frakcje zebrane do dalszego oczyszczania postaci monomeru i dimeru. Linia przerywana przedstawia stężenie NaCl w rozpuszczalniku eluującym.

Figura 4 HPLC z odwróconymi fazami oczyszczonego dimeru ITF szczura (A), monomeru ITF człowieka (B) i dimeru ITF człowieka (C) na kolumnie Vydac 214TP54. Linie przerywane przedstawiają stężenie acetonitrylu w rozpuszczalniku eluującym.

Figura 5 Zrekonstruowane widma masowe oczyszczonego ITF szczura (dimer) (A), ITF człowieka (monomer) (B) i ITF człowieka (dimer) (C).

Figura 6 Struktura postaci dimeru ITF człowieka.

184 516

Figura 7 Mapa restrykcyjna plazmidu KFN 1003.

Figura 8 Konstruowanie plazmidu pHW756.

Figura 9 Konstruowanie plazmidu pHW1066.

Przykład

MATERIAŁY i METODY

Klonowanie ITF szczura (rITF) i ITF człowieka (hITF)

Klonowanie ITF szczura i człowieka przeprowadzono jak opisano w światowym opisie patentowym numer WO 92/14837 oraz jak opisali Suemori i in., 1991, Chinery i in., 1992 (ITF szczura) oraz Podolsky i in., 1993 i Hauser i in., 1993 (ITF człowieka).

Konstruowanie plazmidów ekspresyjnych rITF i hITF

Plazmidy ekspresyjne pHW756 do sekrecji ITF szczura ipHW1066 do sekrecji ITF człowieka skonstruowano jak przedstawiono na fig. 7-9. Drożdżowy wektor ekspresyjny pKFN1003 (opisany w światowym opisie patentowym numer WO 90/10075) jest pochodną plazmidu CPOt (Kawasaki, G. International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, 17-24 września 1984, Edynburg, Szkocja, streszczenie P15.). Posiada on gen TPI SehizQsacharomy£ęs_pombe (POT) jako marker selekcyjny (Russell, P.R., Gene 40 (1985), 125-130) oraz promotor i terminator izomerazy triozofosforanowej (TPI) S. cerevisiae do kontroli ekspresji (Alber, T. i Kawasaki, G. J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 419-434).

Gen ITF szczura sklonowano początkowo w Bluescript II KS(-) (Stratagene), z którego namnożono go zgodnie z fig. 8. Wektor pomocniczy pSX54, zapewniające użyteczne miejsca klonowania, składa się zpUC18 ipDN1050 (Diderichsen, B., Poulsen, G.B., Jorgensen, S.T. Plasmid 30 (1993), 312-315). Syntetyczny łącznik DNA Ncol-PflMl posiada następującą sekwencję:

1858: 5'-CATGGCTGAAAGATTGGAAAAGAGACAAGAGTTCGTTGGTTTGTCT

CCATCCCAATGT-3’ 58 bp

1862: 5'-TTGGGATGGAGACAAACCAACGAACTCTTGTCTCTTTTCCAATCTT

TCAGC-3' 51 bp

Łącznik koduje 8 C-końcowych aminokwasów sekwencji liderowej, jak opisano w Thim, L., Norris, K., Norris, F., Nielsen, P.F., Bjorn, S., Christensen, M., Petersen, J. FEBS Lett. 318. (1993), 345-352, z nielicznymi zmianami w wyborze kodonów, oraz N-końcową część genu ITF szczura: QEFvGlSPSQC.

Sekwencja aminokwasowa peptydu sygnałowego i liderowego jest taka, jak opisano tamże:

MKAVFLVLSLIGFCWAQPVTGDESSVEIPEESLIIAENTTLANVAMAERLEKR.

Gen ITF człowieka sklonowano w PUC 19 i namnożono jak opisano na fig. 9. Łącznik syntetycznego DNA Ncol-BsaAl posiada następującą sekwencję:

2292: 5'-CATGGCTGAAAGATTGGAAAAGAGAGAAGAATAC-3' 34pp

2287: 5'-GTATTCTTCTCTCTTTTCCAATCTTTCAGC-3' 30pp

Łącznik koduje 8 C-końcowych aminokwasów lidera, jak opisano dla konstrukcji rITF, oraz 3 N-końcowe aminokwasy genu hITF:

EEY. Peptydy sygnałowy i liderowy są takie same jak powyżej.

Plazmidami ekspresyjnymi stransformowano szczep MT 663 (E2-7B X El 1-36 a/α, Atpi/Atpi, pep 4-3/pep 4-3) S. cerevisiae. przeprowadzając selekcję pod kątem wzrostu na glukozie jako jedynym źródle węgla.

Transformanty, w których zachodziła ekspresja ITF szczura i ITF człowieka, nazwano odpowiednio HW756 i HW1066.

184 516

Fermentacje

Opisane powyżej transformanty hodowano w temperaturze 30°C wciągu 72 godzin w podłożu ekstrakt drożdżowy-pepton-dekstroza (YPD) (Sherman i in., 1981) uzupełnionym dodatkowym ekstraktem drożdżowym (60 g/litr). Pod koniec fermentacji wartości OD przy długości fali 660 nm osiągnęły odpowiednio 153 i 232 dla HW756 (rITF) i HW1066 (hITF). Po zakończeniu fermentacji pH doprowadzono do 2,5 1 M kwasem fosforowym i komórki drożdżowe usunięto przez wirowanie przy 3000 obrotów na minutę w ciągu 15 minut.

Oczyszczanie zrekombinowanego rITF

Stężenie rITF w drożdżowej brzeczce fermentacyjnej i frakcjach otrzymanych podczas oczyszczania mierzono metodą analitycznej HPLC. Próbki (zazwyczaj o objętości 50-200 μΐ) wstrzykiwano na kolumnę HPLC C4 z odwróconymi fazami Vydac 214TP54 (0,46 x 25 cm) zrównoważoną w temperaturze 30°C przy szybkości przepływu 1,5 ml/minutę 0,1% (v/v) TFA w 15% (v/v) acetonitrylu. Po 10 minutach elucji izokratycznej, stężenie acetonitrylu w rozpuszczalniku eluującym zwiększano w ciągu 40 minut do 55%. Absorbancję mierzono przy długości fali 214 nm. Stwierdzono, że ulegające elucji w 26,5 minucie, 27,3 minucie i 28,2 minucie trzy piki (fig. 2) odpowiadają postaciom dimerów rITF. Peptydy oznaczano ilościowo używając określonych ilości standardu hSP (Thim i in., 1993).

Poziom ekspresji zrekombinowanego ITF szczura w niniejszym układzie drożdżowym wynosił 113 mg/ml.

Z fermentora o objętości 10 litrów przez wirowanie wydzielono 8,7 litrów brzeczki fermentacyjnej. Supernatant rozcieńczono 14,8 litrami wody destylowanej dla obniżenia przewodności. Próbkę nakładano z zastosowaniem pompy na kolumnę Fast Flow S-Sepharose (Pharmacia) (5 x 42 cm) z szybkością przepływu 60 ml/h. Przed nałożeniem, kolumnę zrównoważono 50 mM buforem kwasu mrówkowego, pH 3,7. ITF szczura wyeluowano z kolumny 50 mM kwasem mrówkowym, pH 3,7, zawierającym 50 mM NaCl. Frakcje o objętości 100 ml zbierano przy szybkości przepływu 600 ml/h i analizowano pod kątem zawartości rITF. Zawierające rITF frakcje zporzedniego etapu połączono (2,3 litra) i nałożono z zastosowaniem pompy na kolumnę Amberchrome (G-71) (5 x 10 cm). Przed nałożeniem, kolumnę zrównoważono 10 mM buforem octanu amonu, pH 4,8, przy szybkości przepływu 0,5 litra/godzinę. Po nałożeniu kolumnę przepłukano 0,5 litra buforu równoważącego i eluowano z szybkością przepływu 0,1 litra/godzinę 10 mM buforem octanu amonu, pH 4,8, zawierającym 60% (v/v) etanol. Zbierano frakcje o objętości 10 ml i połączono te zawierające rITF. Stężenie etanolu w połączonych frakcjach zwiększono z 60% (v/v) do 87% (v/v) przez dodanie 2 objętości etanolu (99,9%, v/v) i rITF wytrącono przez ochładzanie otrzymanej mieszaniny w temperaturze minus 25°C w ciągu 16 godzin.

Wytrącony osad zebrano przez wirowanie wciągu 1 godziny przy 10 000 x g w temperaturze -25°C i ponownie rozpuszczono w temperaturze pokojowej w objętości 130 ml 20 mM kwasu mrówkowego, pH 3,0. Próbkę nałożono z zastosowaniem pompy na kolumnę Fast Flow SP-Sepharose (Pharmacia) (5 x 20 cm) przy szybkości przepływu 50 ml/h. Przed nałożeniem kolumnę zrównoważono 20 mM kwasem mrówkowym, pH 3,0. Peptydy eluowano z kolumny linowym gradientem utworzonym z 1,5 litra 50 mM kwasu mrówkowego, pH 3,0 i 1,5 litrem kwasu mrówkowego, pH 3,0, zawierającego 0,5 M NaCl. Frakcje (10 ml) zebrano przy szybkości przepływu 80 ml/h i absorbancję mierzono przy długości fali 280 nm. We frakcjach oznaczono zawartość rITF. Frakcje zawierające rITF połączono. ITF szczura poddano dalszemu oczyszczaniu metodą preparatywnej HPLC. Połączone frakcje (900 ml) nałożono stosując pompę na preparatywną kolumnę HPLC C4 Vydac 214P1022 (2,2 x 25 cm) zrównoważoną 0,1% (v/v) TFA. Peptydy eluowano w temperaturze 25°C przy szybkości przepływu 5 ml/minutę liniowym gradientem (540 ml) utworzonym z MeCN/H₂O/TFA (10:89,9:0,1, v/v/v) i MeCN/H₂O/TFA (65:34,9:0,1). Absorbcję UV monitorowano przy długości fali 280 nm i zbierano frakcje o objętości 10 ml oraz oznaczono w nich zawartość rITF. Frakcje zawierające rITF połączono i ich objętość zmniejszono do 30% przez wirowanie pod zmniejszonym ciśnieniem. Z otrzymanej puli rITF wydzielono przez liofilizację. Całkowita wydajność rITF z 8,7 litrów podłoża fermentacyjnego wynosiła 236 mg, co odpowiadało całkowitej wydajności oczyszczania 24%.

184 516

Oczyszczanie zrekombinowanego hITF

Stężenie hITF w drożdżowej brzeczce fermentacyjnej i frakcji otrzymanej podczas oczyszczania mierzono w układzie HPLC identycznym z tym opisanym dla rITF. Przez spektrometrię masową i analizę sekwencji stwierdzono, że dwa piki, ulegające w tym układzie elucji w 21,2 minucie i 27,1 minucie, odpowiadają postaci dimeru i monomeru hITF. Poziom ekspresji zrekombinowanego ITF człowieka w niniejszym układzie drożdżowym wynosił 90 mg/ml.

Z fermentora o objętości 10 litrów przez wirowanie wydzielono 8,0 litrów brzeczki fermentacyjnej. Próbę trzy razy dializowano (za każdym razem w ciągu 24 h) wobec 40 litrów 10 mM kwasu mrówkowego, pH 2,5. Próbkę nakładano z zastosowaniem pompy (0/25 litra/godzinę) na kolumnę SP-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) (5 x 40 cm). Kolumnę przemyto 5 litrami 20 mM kwasu mrówkowego i eluowano liniowym gradientem utworzonym z 5 litrów 20 mM kwasu mrówkowego, pH 2,5, oraz 5 litrów kwasu mrówkowego, pH 2,5, zawierającego 1 M NaCl. Frakcje o objętości 100 ml zbierano i analizowano pod kątem zawartości hITF (fig. 3). Z kolumny wyeluowano dwie postacie hITF: jedną odpowiadającą postaci monomeru hITF (ulegającą elucji przy 0,5 M NaCl), i jedną odpowiadającą postaci dimeru hITF (ulegającą elucji przy 0,78 M NaCl). Frakcje odpowiadające obu postaciom połączono oddzielnie.

Każdą frakcję podzielono na trzy równe części (o objętości około 700 ml) i nałożono z zastosowaniem pompy na kolumnę C4 Vydac 214TP1022 (2,2 x 25 cm) zrównoważoną 0,1% (v/v) TFA. Peptydy eluowano przy szybkości przepływu 4 ml/minutę liniowym gradientem (540 ml) utworzonym z MeCN/H₂O/TFA (10:89,9:0,1, v/v/v) i MeCN/H₂O/TFA (65:34,9:0,1, v/v/v). Absorbcję UV monitorowano przy długości fali 280 nm i zbierano frakcje o objętości 10 ml oraz oznaczono w nich zawartość rITF.

Frakcje z poprzedniego etapu zawierające hITF (monomer) i hITF (dimer) połączono oddzielnie i pH doprowadzono do 3,0. Próbki nałożono oddzielnie na kolumnę SP-Sepharose HiLoad 16/10 (Pharmacia) (1,6 x 10 cm) zrównoważoną 20 mM kwasem mrówkowym, pH 3,0, zawierającym 40% (v/v) etanol. Kolumnę przepłukano 80 ml buforu równoważącego i elu-owano przy szybkości przepływu 4 ml/minutę liniowym gradientem utworzonym z 200 ml 20 mM kwasu mrówkowego, pH 3,0, 40% (v/v) etanolu i 200 ml 20 mM kwasu mrówkowego, pH 3,0, 40% (v/v) etanolu, zawierającego 1 M NaCl. Zbierano frakcje (5 ml) i analizowano pod kątem zawartości hITF.

Frakcje zawierające odpowiednio hITF (monomer) i hITF (dimer) połączono i zawarte w nich peptydy wytrącono przez doprowadzenie stężenia etanolu do 90% i chłodzenie mieszaniny w ciągu 72 godzin w temperaturze -25°C. Wytrącony osad zebrano przez odwirowanie i zliofilizowano. Całkowita wydajność z 8,0 litrów brzeczki fermentacyjnej wynosiła 256 mg hITF (monomeru) i 133 mg hITF (dimeru), co odpowiadało całkowitej wydajności oczyszczania odpowiednio 50% i 65% dla postaci monomeru i dimeru.

Charakterystyka zrekombmowanych rITF i hITF

Po hydrolizie w 6 M HCl w temperaturze 110°C w probówkach zatapianych pod zmniejszonym ciśnieniem w ciągu 24, 48 i 96 godzin, próbki (50 pg) analizowano stosując automatyczny analizator aminokwasów Beckman (model 121 MB). Półcystynę oznaczano jako pochodną S-3-(4-pirydietylową) po redukcji wiązań dwusiarczkowych tributylofosfiną (Riiegg i Rudinger, 1974), a następnie sprzęganiu z 4-winylopirydyną (Friedman i in., 1970). Hydrolizę próbek traktowanych 4-winylopirydyną prowadzono w 4 M kwasie metanosulfonowym lub 3 M kwasie merkaptoetanosulfonowym w temperaturze 110°C w ciągu 24 godzin, jak opisano powyżej. Analizę sekwencji aminokwasowej przeprowadzono przez zautomatyzowaną degradację Edmana stosując sekwenator gazowy Applied Biosystems model 470A (Thim i in., 1987).

Analizę przez spektrometrię masową przeprowadzono stosując układ API III LC/MS/MS (Sciex, Thornhill, Ontario, Kanada). Aparat z potrójnym kwadrypolem posiada zakres stosunku masy do ładunku (m/z) 2400 i jest wyposażony w pneumatycznie sterowany układ elektospray (nazywany również jako spray jonowy) (Bruins i in., 1987; Covey i in., 1988). Wprowadzanie próbek przeprowadzano strzykawkową pompą infuzyjną (Sage Instruments, Cambridge, MA) przez kapilarę (średnica wewnętrzna 75 pm) z szybkością przepływu

184 516 płynu ustawioną na 0,5-1 Lil/minutę. Skalę m/z aparatu kalibrowano stosując glikole polipropylenowe (PPG) solwatowane pojedynczym jonem amoniowym, na jednostkę masy. Dokładność pomiarów masy jest na ogół lepsza niż 0,02%.

Figura 4 przedstawia chromatogram analitycznej HPLC otrzymany dla oczyszczonego rITF (fig. 4A) i hITF (fig. 4B i 4C). Zrekombinowany rITF zawiera mieszaninę 3 bardzo zbliżonych peptydów i nie podjęto próby rozdzielenia tych postaci. Podczas analizy przez spektrometrię masową z zastosowaniem elektrospray stwierdzono trzy dominujące masy cząsteczkowe, odpowiadające 13112,2, 13096,6 i 13078,8 (fig. 5A). Obliczona masa cząsteczkowa ITF szczura w postaci monomeru, w której Cys-57 posiada wolną grupę SH, wynosi 6558,3. Obliczona masa cząsteczkowa ITF szczura w postaci dimeru (np. ustalono, że mostek S-S jest pomiędzy dwiema Cys-57) wynosi 13114,6. Na podstawie mas cząsteczkowych stwierdzonych w zrekombinowanym ITF szczura wyraźnie stwierdzono, że wszystkie trzy peptydy mają postać dimerów rITF. Dla innych peptydów trefoilowych, w których N-końcową resztą aminokwasową jest Gln, np. PSP (Thim i in., 1985 oraz Tomasetto i in., 1990) wiadomo, że reszta ta wykazuje tendencję do tworzenia kwas piroglutaminowy (piroGlu). W przypadku ITF szczura o przewidywanej sekwencji N-końcowej Gln-Glu-Phe-Val-Gly, uzasadnione wydaje się założenie, żeN-końcowa reszta Gln również ulega cyklizacji z utworzeniem piroGlu. Wynikiem takiego przejścia w pochodną powinno być zmniejszenie masy cząsteczkowej ITF szczura (dimeru) o odpowiednio 17 (jeden piroGlu) lub 34 (dwa piroGlu) jednostki masy cząsteczkowej. Obserwowane masy cząsteczkowe 13096,6 i 13078,8 (fig. 5A) odpowiadają postaci dimeru ITF szczura, w której odpowiednio jedna lub dwie N-końcowe reszty Gln uległy cyklizacji. Obliczone masy cząsteczkowe tych postaci wynoszą 13097,6 i 13080,6, co pozostaje w dobrej zgodności z wartościami określonymi doświadczalnie. A zatem, na podstawie HPLC (fig. 4A) i analizy masy (fig. 5), wywnioskowano, że zrekombinowany ITF szczura obejmuje trzy różne postacie dimerów: jedną zawierającą 2 N-końcowe Gln, jedną zawierającą 1 N-końcową Gln i 1 N-końcowy piroGlu oraz jedną zawierającą dwa N-końcowe piroGlu. Tabela I przedstawia skład aminokwasowy ITF szczura, pozostający w dobrej zgodności z wartościami oczekiwanymi.

Figura 5A i 5B przedstawiają odpowiednio czystość hITF (monomeru) i hITF (dimeru) określona przez analityczna EIPLC. Postać dimeru (fig. 5C) wydaje się być względnie czysta, podczas gdy postać monomeru (fig. 5B) wydaje się być zanieczyszczona materiałem ulegającym elucji przed peptydem. Jednakże, po ponownej chromatografii materiału ulegającego elucji w głównym piku, otrzymano podobny chromatogram (wyniki nieprzedstawione). Wydaje się to wskazywać na raczej nietypowe zachowanie hITF (monomeru) na kolumnach z odwróconymi fazami, niż obecność zanieczyszczeń. Uprzednio obserwowaliśmy podobne zachowanie oczyszczonego w wysokim stopniu PSP świni, jak również oczyszczonego w wysokim stopniu zrekombinowanego hSP (Thim i in., 1993).

Analiza przez spektrometrię masową hITF (monomeru) wykazała, że masa cząsteczkowa głównego piku odpowiada 6694.0 (fig. 5B). Masa cząsteczkowa obliczona na podstawie sekwencji aminokwasowej (fig. 1) wynosi 6574.4, zakładając, że Cys-57 występuje w formie -SH. Analiza sekwencji aminokwasowej (tabela II) wykazała oczekiwaną sekwencję N-końcową Glu-Glu-Tyr-Val-Gly-. Analiza składu aminokwasowego (tabela I) wykazuje oczekiwane wartości, z wyjątkiem obecności 7,3 (8) cystein. Dodatkowa cysteina połączona z Cys-57 monomeru hITF powinna zwiększyć masę cząsteczkową do 6694,7, co jest wartością bardzo bliską wartości określonej przez spektrometrię masową (6694,0). Dlatego też zakłada się, że w hITF (monomerze) Cys-57 połączona jest wiązaniem dwusiarczkowym z dodatkową cysteiną. Mniejszy pik masy cząsteczkowej w widmie masowym (fig. 5B) może odpowiadać innej pochodnej, lub zanieczyszczeniu preparatu.

Obliczona masa cząsteczkowa hITF (dimeru), w której dwa monomery połączone są wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy resztami Cys-57, wynosi 13146,8. Pozostaje to w dobrej zgodności z wartością określoną przez spektrometrię masową (13147, fig. 5C). Inny pik w widmie masowym (13169) prawdopodobnie odpowiada adduktowi dimeru hITF z jonem Na+. Analiza sekwencji (tabela I), jak również analiza składu aminokwasowego (tabela II) również pozostają w dobrej zgodności z wartościami oczekiwanymi.

184 516

Tabela I

Skład aminokwasowy ITF szczura (dimeru), ITF człowieka (monomeru) i ITF człowieka (dimeru)

Aminokwas	ITF szczura (dimer)	ITF człowieka (monomer)	ITF człowieka (dimer)
Asx	11,92	(12)	6,00	(6)	12,01	(12)
Thr³	8,00	(8)	2,03	(2)	4,01	(4)
Ser³	9,86	(10)	2,04	(2)	4,01	(4)
Glx	15,98	(16)	6,92	(7)	14,00	(14)
Prob	12,48	(12)	n.o.c	(6)	n. o.c	(12)
Gly	6,02	(6)	4,20	(4)	8,09	(8)
Ala	2,04	(2)	3,91	(4)	7,90	(8)
Val	11,92	(12)	4,92	(5)	9,86	(10)
Met	1,80	(2)	0,00	(0)	0,00	(0)
Ile	1,98	(2)	1,17	(1)	2,13	(2)
Leu	3,92	(4)	2,03	(2)	3,99	(4)
Tyrb	2,02	(2)	1,94	(2)	3,92	(4)
Phe	7,88	(8)	2,93	(3)	5,94	(6)
Lys	2,14	(2)	3,07	(3)	6,09	(6)
His	0,00	(0)	0,99	(1)	2,03	(2)
Trp	2,16	(2)	n.o.c	(1)	n.o.c	(2)
Arg	3,94	(4)	2,96	(3)	6,05	(6)
PE-Cysb	12,70	(14)	7,30	(7)	13,80	(14)
Łącznie		(118)		(59)		(118)

Wartości w nawiasach przewidziane na podstawie cDNA ITF szczura (Chinery i in., 1992) i ITF człowieka (Hauser i in./ 1993).

’) Oznaczone przez ekstrapolacją do zerowego czasu hydrolizy.

^b) Oznaczone przez hydrolizą w 4 M kwasie metanosulfonowym.

^c) Nie oznaczano.

Tabela II

Zautomatyzowana degradacja Edmana ITF szczura (dimeru), ITF człowieka (monomeru) i ITF człowieka (dimeru)

Numer cyklu	ITF szczura (dimer)	ITF człowieka (monomer)	ITF człowieka (dimer)
PTA- aminokwasy	Wydajność (pmole)	PTA- aminokwasy	Wydajność (pmole)	PTA- aminokwasy	Wydajność (pmole)
1	2	3	4	5	6	7
1	Gln	989	Glu	1517	Glu	2227
2	Glu	731	Glu	1998	Glu	2361
3	Phe	967	Tyr	2205	Tyr	2528
4	Val	1072	Val	2409	Val	2431

184 516

c.d. tabeli II

1	2	3	4	5	6	7
5	Gly	701	Gly	1625	Gly	1803
6	Leu	838	Leu	2318	Leu	2253
7	Ser	497	Ser	852	Ser	904
8	Pro	965	Ala	1729	Ala	1712
9	Ser	406	Asn	1394	Asn	1518
10	Gln	820	Gln	1494	Gln	1499
11	(Cys)	n.o.	(Cys)	.n.o.	(Cys)	n.o.
12	Met	581	Ala	1243	Ala	1377
13	Val	971	Val	1468	Val	1356
14	Pro	962	Pro	1223	Pro	1195
15	Ala	529	Ala	1248	Ala	1249
16	Asn	791	Lys	1270	Lys	1050
17	Val	952	Asp	937	Asp	991
18	Arg	331	Arg	891	Arg	964
18	Arg	331	Arg	891	Arg	964
19	Val	956	Val	1002	Val	1069
20	Asp	476	Asp	847	Asp	932
21	(Cys)	n.o.	(Cys)	n.o.	Cys	n.o.
22	Gly	381	Gly	709	Gly	703
23	Tyr	352	Tyr	894	Tyr	792
24	Pro	927	Pro	766	Pro	701
26	Thr	498	His	309	His	236
26	Val	812	Val	755	Val	670
27	Thr	510	Thr	505	Thr	576
28	Ser	225	Pro	458	Pro	473
29	Glu	398	Lys	444	Lys	321
30	Gln	499	Glu	219	Glu	304
31	(Cys)	n.o.	(Cys)	n.o.	(Cys)	n.o.
32	Asn	557	Asn	312	Asn	300
33	Asn	591	Asn	464	Asn	503
34	Arg	196	Arg	325	Arg	294
35	Gly	222	Gly	239	Gly	223
36	(Cys)	n.o.	⁽Cy^s)	n.o.	(Cys)	n.o.
37	(Cys)	n.o.	(Cys)	n.o.	(Cys)	n.o.

184 516

c.d. tabeli II

1	2	3	4	5	6	7
38	Phe	335	Phe	189	Phe	174
39	Asp	275	Asp	133	Asp	137
40	Ser	164	Ser	49	Ser	43
R.Y.		97,0%		93,2%		92,5%

184 516

PIŚMIENNICTWO

Babyatsky, M., W., Thim, L., Podolsky. D.K., (1994), Gastroenterology 106, A43 (streszczenie).

Bruins, A.P., Covey, T.R., Henion, J.D. (1987), Anad.Chem. 59, 2642-2646.

Chinery, R., Poulsom, R., Rogers, L. A., Jeffery, R. E.

Longeroft, J.M., Hanby, A.M., Wright, N.A. (1992) Biochem. J. 285, 5-8.

Covey, T.R., Bonner, R.F., Shushan, B.I., Henion, J.D. (1988) Rapid Commun. Mass Spectrom.. 2, 249-256.

Dignass, A., Lynch-Devaney, K., Kindon, H., Thim, L., Podolsky, D.K. (1994) J. Clin. Invest, (w druku).

Friedman, M., Krull, L.H., Cavins, J.F. (1970), J. Biol. Chem. 245, 3868-3871.

Gajhede, M., Petersen, T.N., Henriksen, A., Petersen, J.F.W., Dauter, Z., Wilson, K.S., Thim, L. (1993) Structure 1, 253-262.

Hanby, A.M., Poulsom, R., Elia, G., Singh, S., Longcroft, J.M., Wright, N.A. (1993) J Pathol. 169, 355-360.

Hauser, F., Hoffmann, W. (1991) J. Biol.. Chem. 266, 21206-21309.

Hauser, F., Roeben, C., Hoffmann, W. (1992a) J. Biol. Chem. 267, 14451-14455.

Hauser, F., Hoffmann, W. (1992b) J. Biol. Chem. 267, 24620-24624.

Hauser, F., Poulsom, R., Chinery, R., Rogers, L.A., Hanby, A.M., Wright, N.A., Hoffmann, W. (1993) Proc. Acad. Sci. 90, 6961-6965.

Hoffmann, W. (1988)7. Biol. Chem. 263, 7686-7690.

Hoffmann, W., Hauser, F. (1993) Trends Biochem. Sci.. 7, 239-243.

Jakowlew, S.B., Breathnach, R., Jeltsch, J.-M., Masiakowski, P., Chambon, P. (1984) Nucleic Acid Res. 12, 2861-2878.

Lefebvre, O., Wolf, C., Kedinger, M., Chenard, M.-P., Tomasetto, C., Chambon, P., Rio, M.C. (1993) J. Cell.. Biol. 122, 191-198.

Playford, R.J., Marchbank, T., Chinery, R., Evison, R., Pignattelli, M., Bolton, R., Thim,

L. , Hanby, A.M. (1994) Gastroenterology (w druku).

Podolsky, D.K., Lynch-Devaney, K., Stow, J.L., Oates, P., Murgue, B., DeBeaumont,

M. , Sands, B.E., Makida, Y.R. (1993) J. Biol. Chem. 268, 6694-6702.

184 516

Poulsom, R., Chinery, R., Sarraf, C., Lalani, E.-N., Stamp, E., Elia, G., Wright, N. (1992) Gastroenterology 27, 17-28.

Prud'homme, J.F., Fridlansky, F., Le Cunff, M., Atger, M., Mercier-Bodart, C., Pichon, M.-F., Milgrom, E. (1985), DNA 4, 11-21.

Rio, M.C., Bellocq, J.P., Daniel, J.Y., Tomasetto, C., Lathe, R., Chenard, M.P., Bat zenschlager, A., Chambon, P. (1988) Science 241, 705-708.

Rio, M.-C., Chenard, M.-P., Wolf, C., Marcellin, L., Tomasetto, C., Lathe, R., Bellocq, J.-P., Chambon, P. (1991) Gastroenterology 100, 375-379.

Ruegg, U.Th., Rudinger, J. (1974) Isr.J.Chem. 12, 391-401.

Sherinan, F., Fink, G.R., Hicks, J.B. (1981) Methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Suemori, S., Lynch-Devaney, K., Podolsky, D.K. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. 88, 11017-11021.

Thim, L., Jorgensen, K.H., Jorgensen, K.D. (1982) Regul. Peptides 3, 221-230.

Thim, L., Thomsen, J., Christensen, M., Jorgensen, K. H. (1985) Biochem. Biophys. Acta 827, 410-418.

Thim, L., Hansen, M.T., Norris, K., Hoegh, I., Boel, E., Forstrom, J., Ammerer, G., Fiil, L. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. 83, 6766-6770.

Thim, L., Hansen, M.T., Soerensen, A.R. (1987) FEBS Lett. 212, 307-312.

Thim, L. (1989) FEBS Lett. 250, 85-90.

Thim, L., Norris, K., Norris, F., Nielsen, P.F., Bjorn, S.E., Christensen, M., Petersen, J. (1993) FEBS Lett. 318, 345-352.

Thim, L. (1994) Digestion 55, 353-360.

Tomasetto, C., Rio, M., Gautier, C., Wolf, C., Hareuveni, M., Chambon, P., Lathe, R. (1990) EMBOJ. 9, 407-414.

Wright, N.A., Pike, C., Elia, G. (1990) Nature 343, 82-85.

Wright, N.A., Poulsom, R., Stamp, G., van Norden, S., Sarraf, C., Elia, G., Ahnen, D., Jeffery, R., Longcroft, J., Pike, C., Rio, M., Chambon, P. (1993) Gastroenterology 104, 12-20.

184 516 rITF (dimer)

Fig-2

184 516

Fig. 3

184 516 ο

ο

Czas (min)

Fig. 4

184 516

Fig- 5

184 516

COOH COOH

Fig. 6

184 516

¹ Promotor TPI z S.cerevisiae

2. Syntetyczny gen sygnałowo-łiderowy

3. Syntetyczny gen aprotyniny

4. Terminator TPI z S.cerevisiae

Gen TPI z S.pombe

Sekwencje z plazmidów E.coli pBR322 i pUC13

7. Sekwencje z plazmidu 2 u S.cerevisiae

8. Sekwencja łącznikowa z plazmidu pBR322 E.coli

Fig. 7

184 516

+ łącznik 5658/1862 Nco J-PfiM I 58/51 bp

Fig. 8

184 516

Fig. 9

184 516

COOH

NH,

Fig. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Dimer peptydu trefoilowego, znamienny tym, że dimer ten zawiera dwa monomeryczne peptydy trefoilowe, każdy obejmujący jedną domenę trefoilową typu pojedynczego połączone razem wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi.
2. Dimer peptydu według zastrz. 1, znamienny tym, że jest jelitowym czynnikiem trefoilowym (ITF).
3. Dimer peptydu według zastrz. 2, znamienny tym, że jest (ITF) człowieka.
4. Dimer peptydu według zastrz. 3, znamienny tym, że posiada przybliżoną masę cząsteczkową 13000.
5. Dimer peptydu według zastrz. 3, znamienny tym, że ITF składa się z dwóch monomerów ITF połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi w pozycji 57 każdego monomeru.
6. Dimer peptydu według zastrz. 1, znamienny tym, że jest peptydem związanym z rakiem piersi (pS2).
7. Dimer peptydu według zastrz. 6, znamienny tym, że jest pS2 człowieka.
8. Dimer peptydu według zastrz. 6, znamienny tym, że pS2 składa się z dwóch monomerów pS2 połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi w pozycji 58 każdego monomeru.
9. Sposób przygotowywania dimeru peptydu trefoilowego zawierającego dwa monomeryczne peptydy trefoilowe, każdy obejmujący jedną domenę trefoilową typu pojedynczego połączone razem wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi, znamienny tym, że hoduje się odpowiednią komórkę gospodarza stransformowaną sekwencją DNA kodującą peptyd trefoilowy zawierający jedną domenę trefolilową w warunkach sprzyjających wytwarzaniu tego peptydu, oddziela się chromatograficznie od hodowli otrzymany monomer petydu trefoilowego i dimer peptydu trefoilowego i odzyskuje się dimer peptydu trefoilowego.
10. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia lub zapobiegania zaburzeniem układu pokarmowego, zawierająca substancję czynną, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik, znamienna tym, że jako czynnik aktywny zawiera dimer peptydu trefoilowego charakteryzujący się tym, że dimer peptydu zawiera dwa monomeryczne peptydy trefoilowe, każdy obejmujący jedną domenę trefoilową typu pojedynczego połączone wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi, w stężeniu od około 5% do 100% wagowych.
11. Kompozycja farmaceutyczna, według zastrz. 10, znamienna tym, że dimerem peptydu trefoilowego jest jelitowy czynnik trefoilowy (ITF).
12. Kompozycja farmaceutyczna, według zastrz. 10, znamienna tym, że dimerem peptydu trefoilowego jest ITF człowieka.
13. Kompozycja farmaceutyczna, według zastrz. 12, znamienna tym, że zawiera dimer peptydu trefoilowego o przybliżonej masie cząsteczkowej 13000.
14. Kompozycja farmaceutyczna, według zastrz. 12, znamienna tym, że jako dimer peptydu zawiera dimer ITF składający się z dwóch monomerów ITF połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi w pozycji 57 każdego monomeru.
15. Kompozycja farmaceutyczna, według zastrz. 10, znamienna tym, że jako dimer peptydu trefoilowego zawiera peptyd związany z rakiem piersi (pS2).

184 516
16. Kompozycja farmaceutyczna, według zastrz. 15, znamienna tym, że dimer peptydu trefoilowego stanowi pS2 człowieka.
17. Kompozycja farmaceutyczna, według zastrz. 16, znamienna tym, że pS2 składa się z dwóch monomerów pS2 połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi w pozycji 58 każdego monomeru.
18. Dimer peptydu trefoilowego zawierający dwa monomeryczne peptydy trefoilowe, każdy obejmujący jedną domenę trefoilową typu pojedynczego połączone razem wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi do zastosowania jako lek.
19. Dimer peptydu trefoilowego, według zastrz. 18, do zastosowania jako lek do leczenia lub zapobiegania zaburzeniom układu pokarmowego.

Niniejszy wynalazek dotyczy dimeru peptydu trefoilowego, sposobu przygotowania dimeru peptydu trefoilowego, kompozycji farmaceutycznej i dimeru peptydu trefoilowego do zastosowania jako lek, zwłaszcza lek do leczenia zaburzeń układu pokarmowego.

Peptydy trefoilowe stanowią rodzinę peptydów występujących przede wszystkim w układzie pokarmowym. Peptydy trefoilowe ssaków zawierają jedną lub więcej charakterystycznych domen (Thim i in., 1989), z których każda obejmuje sekwencje 38 lub 39 reszt aminokwasowych, w których 6 reszt półcystynowych połączonych jest w konfiguracji 1-5, 2-4 i 3-6, w ten sposób tworząc charakterystyczną strukturę trefoilową (Thim, 1989).

Znane obecnie peptydy trefoilowe ssaków zawierają jedną lub dwie domeny trefoilowe (patrz prace przeglądowe Thim, 1994; Poulsom i Wright, 1993; Hoffmann i Hauser, 1993), podczas gdy opisano peptydy i białka żaby Xenopus laevis zawierające jedną (Hauser i Hoffmann, 1991), dwie (Hauser i in., 1992a), cztery (Hoffmann, 1988) lub szereg (Hauser i Hoffmann, 1992b) domen trefoilowych. Peptydami trefoilowymi ssaków zawierającymi jedną domenę są peptyd S2 związany z rakiem piersi, znany dotąd dla człowieka (Jakowlev i in., 1984, Prud'homme i in., 1985) i myszy (Lefebvre i in., 1993) oraz jelitowy czynnik trefoilowy, znany dotąd dla człowieka (Podolsky i in., 1993); Hauser i in., 1993) i szczura (Suemori i in., 1991; Chinery i in., 1992). Polipeptyd rozkurczowy (SP), który zawiera dwie domeny trefoilowe, opisano dla człowieka (Tomasetto i in., 1990), świni (Thim i in., 1982) i myszy (Tomasetto i in., 1990). U ludzi wszystkie trzy peptydy trefoilowe, hpS2, hITF i hSP, w normalnych warunkach ekspresji ulegają w układzie pokarmowym: hSP i hps2 w warstwie nabłonkowej błony śluzowej żołądka (Tomasetto i in., 1990; Rio i in., 1988), aUTF w warstwie nabłonkowej błony śluzowej jelita cienkiego i okrężnicy (Podolsky i in., 1993).

Fizjologiczna funkcja peptydów trefoilowych nie jest w pełni zrozumiała. Donoszono o podwyższonej ekspresji peptydów trefoilowych w układzie pokarmowym w kilku stanach obejmujących uszkodzenie błony śluzowej, takich jak zapalenie jelita (Rio i in., 1991; Poulsom iin., 1992; Wright i in., 1993) i owrzodzenia żołądka i dwunastnicy (Rio i in., 1991); Hańby i in., 1993; Wright i in., 1990). W konsekwencji, sugerowano funkcję naprawczą śluzówki peptydów trefoilowych (np. Wright i in., 1993). Dowody na pobudzanie restytucji nabłonka błony śluzowej przez peptydy trefoilowe po uszkodzeniu podali ostatnio Dignass i in., 1994, Playford i in., 1994 oraz Babyatsky i in., 1994. Mechanizm, dzięki któremu peptydy trefoilowe pobudzają swoje funkcje naprawcze mogą polegać na sieciowaniu glikoprotein mucyny z tworzeniem warstwy, lepkiego elastycznego żelu, odpornej na enzymy trawienne (Thim, 1994; Gajhede i in., 1993).

Klonowanie jednodomenowego jelitowego czynnika trefoilowego szczura i człowieka oraz stosowanie jelitowego czynnika trefoilowego w leczeniu uszkodzeń przewodu pokarmowego opisano w publikacji międzynarodowej numer WO 92/14837.

Obecnie stwierdzono, że możliwe jest przygotowanie dimerów czynników trefoilowych, które mają tylko jedną domenę trefoilową i posiadają interesujące właściwości farmakologiczne.

184 516

A zatem, niniejszy wynalazek dotyczy peptydu trefoilowego zawierającego pojedynczą domenę trefoilową, przy czym peptyd charakteryzuje się tym, że występuje w postaci dimeru.

Jak wskazano powyżej, uważa się, że peptydy trefoilowe uczestniczą w gojeniu się wrzodów trawiennych i innych uszkodzeń błony śluzowej przez stabilizację warstwy śluzówki przewodu pokarmowego. Mechanizm tej stabilizacji jest obecnie nieznany. Jednakże, struktura określona metodą dyfrakcji promieniowania X trzustkowego polipeptydu rozkurczowgo (PSP) świni (wg Gajhede i in., 1993), który posiada dwie domeny trefoilowe, wskazuje, że większość reszt konserwatywnych znajduje się w występującej w każdej z domen trefoilowych szczelinie o szerokości 0,8-1 nm. Wstępne doświadczenia modelowania komputerowego możliwych oddziaływań wykazały, że szczelina może pomieścić część łańcucha oligosacharydowego, na przykład węglowodanu połączonego z glikoproteiną mucyną. Jeżeli tak jest rzeczywiście, PSP z dwiema takimi szczelinami może sieciować mucyny, pomagając tworzyć ochronny żel na nabłonek błony śluzowej. Obecnie nie wiadomo, czy peptydy trefoilowe z pojedynczą domeną trefoilową (takie jak ITF i pS2) tworzą dimery in vivo, aby spełniać podobną funkcję, czy też wykazują odrębny mechanizm działania. Jednakże, uważa się obecnie, że dimery takich peptydów trefoilowych mogą rzeczywiście sieciować mucyny i dlatego stanowią aktywną postać peptydów.