PL184516B1 - Dimer peptydu trefoilowego sposób przygotowania dimeru peptydu trefoilowego kompozycja farmaceutyczna i dimer peptydu trefoilowego do zastosowania jako lek - Google Patents
Dimer peptydu trefoilowego sposób przygotowania dimeru peptydu trefoilowego kompozycja farmaceutyczna i dimer peptydu trefoilowego do zastosowania jako lekInfo
- Publication number
- PL184516B1 PL184516B1 PL95318785A PL31878595A PL184516B1 PL 184516 B1 PL184516 B1 PL 184516B1 PL 95318785 A PL95318785 A PL 95318785A PL 31878595 A PL31878595 A PL 31878595A PL 184516 B1 PL184516 B1 PL 184516B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- trefoil
- peptide
- peptide dimer
- dimer
- peptides
- Prior art date
Links
- 102000007641 Trefoil Factors Human genes 0.000 title claims abstract description 115
- 108010007389 Trefoil Factors Proteins 0.000 title claims abstract description 115
- 239000000539 dimer Substances 0.000 title claims abstract description 101
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 46
- 235000004035 Cryptotaenia japonica Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 235000015724 Trifolium pratense Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 claims abstract 2
- 208000018685 gastrointestinal system disease Diseases 0.000 claims abstract 2
- 101100481012 Homo sapiens TFF3 gene Proteins 0.000 claims description 54
- 108010078184 Trefoil Factor-3 Proteins 0.000 claims description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 17
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 9
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 4
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 claims description 3
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000008469 Peptic Ulcer Diseases 0.000 claims description 2
- 102100039145 Trefoil factor 3 Human genes 0.000 claims 13
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 claims 4
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 claims 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims 3
- 229940051875 mucins Drugs 0.000 claims 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims 2
- 125000002697 cystyl group Chemical group 0.000 claims 2
- 230000003205 diastolic effect Effects 0.000 claims 2
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 claims 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims 2
- 206010061172 Gastrointestinal injury Diseases 0.000 claims 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims 1
- 101000889485 Homo sapiens Trefoil factor 3 Proteins 0.000 claims 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 claims 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 claims 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 claims 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 claims 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 claims 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 claims 1
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 claims 1
- 210000005081 epithelial layer Anatomy 0.000 claims 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 claims 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 claims 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 claims 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 claims 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012552 review Methods 0.000 claims 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 claims 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 claims 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 claims 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 abstract description 9
- 101100424932 Rattus norvegicus Tff3 gene Proteins 0.000 description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 31
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 19
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 19
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 102000014456 Trefoil Factor-3 Human genes 0.000 description 15
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 13
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 9
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 9
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 9
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 6
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 5
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 5
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 5
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 5
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 5
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 3
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 3
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 3
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 3
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 4-ethenylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=NC=C1 KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034042 Alcohol dehydrogenase 1C Human genes 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 101000796894 Coturnix japonica Alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 101000780463 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1C Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 2
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 101150046681 atp5if1 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 description 2
- 101150021650 gluA gene Proteins 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800002326 Adipokinetic hormone Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- 101100280051 Brucella abortus biovar 1 (strain 9-941) eryH gene Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101100295959 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) arcB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000125500 Hedypnois rhagadioloides Species 0.000 description 1
- 101000741885 Homo sapiens Protection of telomeres protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000801742 Homo sapiens Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108700001097 Insect Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000235087 Lachancea kluyveri Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000255908 Manduca sexta Species 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100235161 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) lerI gene Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100038745 Protection of telomeres protein 1 Human genes 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101000968489 Rhizomucor miehei Lipase Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101150033985 TPI gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241000223258 Thermomyces lanuginosus Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010088412 Trefoil Factor-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000008817 Trefoil Factor-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 102100033598 Triosephosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034131 VA RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010048241 acetamidase Proteins 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 101150069003 amdS gene Proteins 0.000 description 1
- -1 ammonium sulfate Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 101150008194 argB gene Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- ZNEWHQLOPFWXOF-UHFFFAOYSA-N coenzyme M Chemical compound OS(=O)(=O)CCS ZNEWHQLOPFWXOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N glycerine monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(CO)CO YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHUSDOQQWJGJQS-UHFFFAOYSA-N glycerol 1,2-dioctadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC UHUSDOQQWJGJQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N glycerol monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 101150039489 lysZ gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229960004635 mesna Drugs 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- DJDSLBVSSOQSLW-UHFFFAOYSA-N mono(2-ethylhexyl) phthalate Chemical group CCCCC(CC)COC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O DJDSLBVSSOQSLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 208000011906 peptic ulcer disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 101150080369 tpiA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- TUQOTMZNTHZOKS-UHFFFAOYSA-N tributylphosphine Chemical compound CCCCP(CCCC)CCCC TUQOTMZNTHZOKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
1. Dimer peptydu trefoilowego, znamienny tym, ze dimer ten zawiera dwa mono meryczne peptydy trefoilowe, kazdy obejmujacy jedna domene trefoilowa typu poje- dynczego polaczone razem wiazaniem dwusiarczkowym pomiedzy dwiema resztami cy- sternowymi. 9. Sposób przygotowywania dimeru peptydu trefoilowego zawierajacego dwa mo nomeryczne peptydy trefoilowe, kazdy obejmujacy jedna domene trefoilowa typu poje- dynczego polaczone razem wiazaniem dwusiarczkowym pomiedzy dwiema resztami cy- sternowymi, znamienny tym, ze hoduje sie odpowiednia komórke gospodarza stransfor mowana sekwencja DNA kodujaca peptyd trefoilowy zawierajacy jedna domene trefoli lowa w warunkach sprzyjajacych wytwarzaniu tego peptydu, oddziela sie chromatogra- ficznie od hodowli otrzymany monomer petydu trefoilowego i dimer peptydu trefoilowego i odzyskuje sie dimer peptydu trefoilowego. 10. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia lub zapobiegania zaburzeniem ukladu pokarmowego, zawierajaca substancje czynna oraz farmaceutycznie dopuszczalny nosnik lub rozcienczalnik, znamienna tym, ze jako czynnik aktywny zawiera dimer peptydu trefo- ilowego charakteryzujacy sie tym, ze dimer peptydu zawiera dwa monomeryczne peptydy trefoilowe, kazdy obejmujacy jedna domene trefoilowa typu pojedynczego polaczone wiaza- niem dwusiarczkowym pomiedzy dwiema resztami cysternowymi, w stezeniu od okolo 5% do 100% wagowych. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazkujest dimer peptydu trefoilowego charakteryzujący się tym, że dimer ten zawiera dwa monomeryczne peptydy trefoilowe, każdy obejmujący jedną domenę trefoilową typu pojedynczego połączone razem wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi.
Korzystnie dimer według wynalazku jest jelitowym czynnikiem trefoilowym (ITF), a bardziej korzystnie dimer jest (ITF) człowieka i najbardziej korzystnie dimer według wynalazku posiada przybliżoną masę cząsteczkową 13000.
W innym korzystnym wykonaniu wynalazku ITF składa się z dwóch monomerów ITF połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi w pozycji 57 każdego monomeru.
Dimer według wynalazku jest korzystnie peptydem związanym z rakiem piersi (pS2), ewentualnie także korzystnie jest pS2 człowieka.
W takim przypadku korzystnie dimer peptydu pS2 składa się z dwóch monomerów pS2 połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi w pozycji 58 każdego monomeru.
Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób przygotowywania dimeru peptydu trefoilowego zawierającego dwa monomeryczne peptydy trefoilowe, każdy obejmujący jedną domenę trefoilową typu pojedynczego połączone razem wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysteinowymi, charakteryzujący się tym, że hoduje się odpowiednią komórkę gospodarza stransformowaną sekwencją DNA kodującą peptyd trefoilowy zawierający jedną domenę trefoilową w warunkach sprzyjających wytwarzaniu tego peptydu, oddziela się chromatograficznie od hodowli otrzymany monomer petydu trefoilowego i dimer peptydu trefoilowego i odzyskuje się dimer peptydu trefoilowego.
Kolejnym przedmiotem wynalazkujest kompozycja farmaceutyczna do leczenia lub zapobiegania zaburzeniom układu pokarmowego, zawierającą substancję czynną oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik, charakteryzująca się tym, że jako czynnik aktywny zawiera dimer peptydu trefoilowego, przy czym ten dimer peptydu zawiera dwa monomeryczne peptydy trefoilowe, każdy obejmujący jedną domenę trefoilową typu pojedynczego połączone wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi, w stężeniu od około 5% do 100% wagowych.
W kompozycji według wynalazku korzystnym dimerem peptydu trefoilowego jest jelitowy czynnik trefoilowy (ITF), a bardziej korzystnym dimerem peptydu trefoilowego jest ITF człowieka. Kompozycja farmaceutyczna, według wynalazku może zawierać korzystnie taki dimer peptydu, który ma przybliżoną masę cząsteczkową 13000. W innym bardziej korzystnym rozwiązaniu, kompozycja farmaceutyczna, może zawierać jako dimer peptydu trefoilowego dimer ITF składający się z dwóch monomerów ITF połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi w pozycji 57 każdego monomeru, również
184 516 korzystnie jako dimer peptydu trefoilowego, kompozycja może zawierać peptyd związany z rakiem piersi (pS2), a zwłaszcza może zawierać dimer peptydu trefoilowego będący pS2 człowieka; i w takim przypadku kompozycja farmaceutyczna, według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera pS2 składający się z dwóch monomerów pS2 połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysteinowymi w pozycji 58 każdego monomeru.
Następnym przedmiotem wynalazku jest dimer peptydu trefoilowego zawierający dwa monomeryczne peptydy trefoilowe, każdy obejmujący jedną domenę trefoilową typu pojedynczego połączone wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysteinowymi do zastosowania jako lek.
Korzystnie dimer peptydu trefoilowego, może być stosowany jako lek do leczenia lub zapobiegania zaburzeniom układu pokarmowego.
Dimerem czynnika trefoilowego może być w szczególności dimer jelitowego czynnika trefoilowego (ITF) lub peptydu związanego z rakiem piersi (pS2).
W szczególności, czynnikiem treofilowym jest ludzki ITF, którego sekwencja aminokwasowa monomeru jest następująca:
ZEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFK
PLQEAECTF gdzie Z jest Glu, Gin lub piroGlu, ewentualnie jego homolog zdolny do dimeryzacji i wykazywania podobnej aktywności; lub ludzki pS2, którego sekwencja aminokwasowa monomeru jest następująca:
ZAQTETCTVAPRERQNCGFPGVTPSQCANKGCCFDDTVRGVPWCFYPNTI
DVPPEEECEF gdzie Z jest Glu, Gin lub piroGlu, bądź jego homolog zdolny do dimeryzacji i wykazywania podobnej aktywności.
Homologi ITF lub pS2 posiadają ten sam wzór reszt cysteiny i układ mostków dwusiarczkowych (fig. 1) oraz wykazują pewną homologię sekwencji, którą należy rozumieć jako występowanie albo identycznych reszt aminokwasowych w odpowiadających pozycjach, albo podstawień konserwatywnych) w pętlach 1, 2 i 3. Homologia sekwencji w regionach pętli może różnić się od 1 do 10 resztami aminokwasowymi, a ilość reszt aminokwasowych w każdej pętli (poza resztami cystein) może być zróżnicowana od 7 do 12, korzystnie od 9 do 10.
Homologi ITF lub pS2 mogą mięć jedno lub więcej podstawień, delecji lub addycji aminokwasowych. Zmiany te mają korzystnie taki charakter, że podstawienia nie wpływają znacząco na ufałdowanie lub aktywność białka. Niewielkie delecje obejmują zazwyczaj od 1 do 3 aminokwasów w regionach pętli i od 1 do około 10 aminokwasów aminokwasów w regionach N- i C-końcowych; inne zmiany obejmują jedno-aminokwasowe wydłużenia amino- lub karboksylokońcowe, takie jak aminokońcowa reszta metioniny, krótki peptyd łącznikowy o długości do około 10 reszt, bądź krótkie przedłużenie, które ułatwia oczyszczanie, takie jak odcinek polihistydynowy, epitop antygenowy lub domena wiążąca. Dla ogólnej orientacji, patrz Ford i in., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991.
Przykłady podstawień aminokwasowych dotyczą grupy aminokwasów zasadowych (takich jak arginina, lizyna, histydyna), aminokwasów kwaśnych (takich jak kwas glutaminowy i kwas asparaginowy), aminokwasów polarnych (takich jak glutamina i asparagina), aminokwasów hydrofobowych (takich jak leucyna, izoleucyna, walina), aminokwasów hydrofobowych (takich jak fenyloalanina, tryptofan, tyrozyna) i aminokwasów małych (takich jak glicyna, alanina, seryna, treonina, metionina).
Dla specjalistów w tej dziedzinie będzie oczywiste, że takich podstawień można dokonywać poza regionami mającymi zasadnicze znaczenie dla funkcji cząsteczki i w wyniku, których nadal otrzymuje się aktywny polipeptyd. Aminokwasy mające zasadnicze znaczenie dla aktywności niniejszego peptydu trefoilowego, i dlatego korzystnie nie poddawane podstawieniom,
184 516 można zidentyfikować zgodnie z procedurami znanymi w nauce, takimi jak ukierunkowana mutageneza lub mutageneza podstawień alaniną (Cunningham i Wells, Science 244. 1081-1085, 1989). W tej ostatniej technice mutacje wprowadza się do każdej reszty cząsteczki i otrzymane zmutowane cząsteczki testuje się pod względem aktywności biologicznej (np. gojenia śluzówki, ochrony śluzówki, gojenia wrzodów żołądka) w celu zidentyfikowania reszt aminokwasowych, które mają zasadnicze znaczenie dla aktywności cząsteczki.
Homologiem może być wariant alleliczny, tj. alternatywna postać genu, która powstaje poprzez mutację, lub zmieniony peptyd kodowany przez zmutowany gen, ale zasadniczo posiadający taką samą aktywność, jak niniejszy peptyd. A zatem, mutacje mogą być milczące (brak zmiany kodowanego peptydu) lub mogą kodować peptyd o zmienionej sekwencji aminokwasowej.
Homologiem niniejszego peptydu trefoilowego może być również homolog gatunkowy, tj. polipeptyd o podobnej aktywności pochodzący z innego gatunku, np. myszy, szczura, królika, krowy, świni lub żaby.
W korzystnym rozwiązaniu, dimer peptydu trefoilowego według wynalazku posiada masę cząsteczkowa wynosząca około 13000. Dimer składa się z dwóch monomerów peptydów trefoilowych połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy resztami cystein w pozycji 57 monomerów podobnych do ITF lub w pozycji 58 monomerów podobnych do pS2.
Dimer peptydu trefoilowego wytwarza się korzystnie technikami rekombinacji DNA. W tym celu, sekwencję DNA kodującą peptyd trefoilowy można wyizolować przez przygotowanie biblioteki genomowej lub cDNA i przeszukanie pod kątem sekwencji DNA kodujących całość lub część peptydu przez hybrydyzacje z zastosowaniem syntetycznych sond oligonukleotydowych zgodnie ze standardowymi technikami (zobacz, Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy Jork, 1989). Dla celów niniejszego wynalazku, sekwencja DNA kodująca peptyd jest korzystnie pochodzenia ludzkiego, tj. pochodzi z ludzkiej biblioteki genomowej lub biblioteki cDNA.
Sekwencję DNA kodującą peptyd trefoilowy można także przygotować syntetycznie uznanymi standardowymi metodami, np. metodą z wykorzystaniem fosforynoamidów opisaną przez Beaucage i Caruthersa, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 -1869 lub metodą opisaną przez Matthesa i in., EMBO Journal 2 (1984), 801 - 805. Według metody z wykorzystaniem fosforynoamidów syntetyzuje się oligonukleotydy, np. w automatycznym syntezatorze DNA, oczyszcza je, łączy komplementarne nici, liguje i klonuje w odpowiednich wektorach.
Sekwencję DNA można także przygotować poprzez reakcję łańcuchową polimerazy z zastosowaniem specyficznych starterów, na przykład jak opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 683 202, Saiki i in., Science 239 (1988), 487 - 491 lub Sambrook i in., supra.
Sekwencję DNA kodującą peptyd trefoilowy zazwyczaj wstawia się w zrekombinowany wektor, którym może być jakikolwiek wektor, który można dogodnie poddawać procedurom rekombinacji DNA, a wybór wektora często zależeć będzie od komórki gospodarza, do której ma być on wprowadzany. A zatem, wektorem może być wektor ulegający autonomicznej replikacji, tj. wektor, który istnieje jako jednostka pozachromosomalna, której replikacja jest niezależna od replikacji chromosomalnej, np. plazmid. Alternatywnie, wektorem może być wektor, który po wprowadzeniu do komórki gospodarza ulega integracji z jej genomem i replikuje się razem z chromosomem(ami), z którymi uległ integracji.
Wektorem jest korzystnie wektor ekspresyjny, w którym sekwencja DNA kodująca peptyd trefoilowy jest połączona w sposób umożliwiający działanie z dodatkowymi odcinkami wymaganymi do transkrypcji DNA. Na ogół, wektor ekspresyjny pochodzi z DNA plazmidowego lub wirusowego lub może zawierać elementy obu typów DNA. Termin „połączona w sposób umożliwiający działanie” wskazuje, że odcinki są ustawione w taki sposób, że działają zgodnie z zamierzonymi celami, np. transkrypcja ulega inicjacji w promotorze i przebiega przez sekwencję DNA kodującą polipeptyd.
184 516
Promotorem może być sekwencja DNA, która wykazuje aktywność transkrypcyjną w wybranej komórce gospodarza i może pochodzić z genów kodujących białka albo homologiczne, albo heterologiczne wobec komórki gospodarza.
Przykładami promotorów odpowiednich do kierowania transkrypcją DNA kodującego peptyd trefoilowy w komórkach ssaków są promotor SV40 (Subramani i in., Mol. Celi Biol. 1 (1981), 854 - 864), promotor MT-1 (genu metalotioneiny) (Palmiter i in., Science 222 (1983), 809- 814) lub główny późny promotor adenowirusa 2.
Przykładem promotora odpowiedniego do stosowania w komórkach owadów jest promotor poliedryny opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 745 051; Vasuvedan i in., FEBS Lett. 311, (1992) 7 - 11), promotor P10 (J.M. Vlak i in., L Gen. Virology £2, 1988, str. 765-776), promotor białka basic wirusa poliedrozy Autographa californica (europejski opis patentowy numer 397 485), promotor natychmiastowego wczesnego genu 1 bakulowirusa (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 155 037; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 162 222) lub promotor opóźnionego wczesnego genu 39 K bakulowirusa (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 155 037; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 162 222).
Przykłady promotorów odpowiednich do stosowania w drożdżowych komórkach gospodarza obejmują promotory genów glikolitycznych drożdży (Hitzeman i in., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber i Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434) lub genów dehydrogenaz alkoholowych (Young i in., w: Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (red. Hollaender i in.). Plenum Press, Nowy Jork, 1982) lub promotory TPI1 (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 599 311) bądź ADH2-4c (Russell i in., Nature 304 (1983), 652 - 654).
Przykładami promotorów odpowiednich do stosowania w komórkach gospodarza grzybów nitkowatych są, na przykład, promotor ADH3 (McKnight i in., The EMBO J. 4. (1985), 2093 - 2099) lub promotor tpiA. Przykładami innych użytecznych promotorów są te pochodzące z genów kodujących amylaze TAKA A. oryzae, proteinaze aspartylowa Rhizomucor miehei., obojętną α-amylaze A. niger, stabilną w środowisku kwaśnym α-amylaze A· niger lub glukoamylazę (gluA) A. awamori, lipazę Rhizomucor miehei, proteazę alkaliczną A. oryzae, izomerazę triozofosforanową A. oryzae lub ac-etamidazę A. nidulans. Preferowane są promotory amylazy TAKA i gluA. Odpowiednie promotory wymieniono m.in. w europejskim opisie patentowym numer 238 023 i europejskim opisie patentowym numer 383 779.
Sekwencja DNA kodująca peptyd trefoilowy może również być, jeśli jest to konieczne, połączona w sposób umożliwiający działanie z odpowiednim terminatorem, takim jak terminator ludzkiego hormonu wzrostu (Palmiter i in., Science 222. 1983, str. 809-814) lub (dla gospodarzy grzybowych) terminatory TPPI1 (Alber i Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, str. 419-434) lub ADH3 (McKnight i in., The EMBO J. 4, 1985, str. 2093-2099). Wektor może ponadto obejmować takie elementy, jak sygnały poliadenylacji (np. z SV40 lub regionu Elb adeno-wirusa 5), sekwencje wzmacniające transkrypcję (np. sekwencja wzmacniająca SV40) i sekwencje wzmacniające translację (np. sekwencje kodujące RNA VA adenovirusa).
Zrekombinowany wektor może ponadto zawierać sekwencję DNA umożliwiającą jego replikację w będącej przedmiotem zainteresowania komórce gospodarza. Przykładem takiej sekwencji (gdy komórką gospodarza jest komórka ssaka) jest miejsce początku replikacji SV40. Gdy komórką gospodarza jest komórka drożdżowa, odpowiednimi sekwencjami umożliwiającymi replikację wektora są geny replikacji REP 1-3 i miejsce początku replikacji drożdżowego plazmidu 2μ.
Wektor może również zawierać marker selekcyjny, np. gen, którego produkt uzupełnia braki komórki gospodarza, taki jak gen kodujący reduktazę dihydrofolianową (DHFR) lub gen TPI Schizosaccharomyces pombe (opisany przez P.R. Russella, Gene 40, 1985, str. 125-130), lub taki, który nadaje oporność na lek, np. ampicylinę, kanamycynę, tetracyklinę, chloramfenikol, neomycynę, hygromycynę lub metotreksat. Markery selekcyjne dla grzybów nitkowatych obejmują amdS, pyrG, argB, niaD lub sC.
Do kierowania peptydu trefoilowego na drogę sekrecyjną w komórkach gospodarza, w zrekombinowanym wektorze można dostarczyć sekrecyjną sekwencję sygnałową (nazywana
184 516 także sekwencją liderową, sekwencjjąprepro lub sekwencjąpre). Sekrecyjną sekwencję sygnałową łączy się we właściwej ramce odczytu z sekwencją DNA kodującą peptyd trefoilowy. Sekrecyjne sekwencje sygnałowe zazwyczaj umiejscawia się w kierunku 5' od sekwencji kodującej peptyd. Sekrecyjną sekwencją sygnałową może być ta normalnie towarzysząca peptydowi lub może ona pochodzić z genu kodującego inne białko ulegające sekrecji.
Dla zapewnienia sekrecji z komórek drożdżowych, sekrecyjną sekwencja sygnałowa może kodować jakikolwiek peptyd sygnałowy, który zapewnia wydajne kierowanie w komórce ulegającego ekspresji peptydu trefoilowego na drogę sekrecyjną. Peptydem sygnałowym może być naturalnie występujący peptyd sygnałowy, jego funkcjonalna część, bądź może nim być peptyd syntetyczny. Stwierdzono, że odpowiednimi peptydami sygnałowymi są peptyd sygnałowy czynnika a; (wg O. Hagenbuchle i in. Nature 289. 1981, str. 643-646), zmodyfikowany peptyd sygnałowy karboksypeptydazy (wg L.A. Valls i in. Cell 48, 1987, str. 887-897), drożdżowy peptyd sygnałowy BAR 1 (wg światowego opisu patentowego numer WO 87/02670 lub peptyd sygnałowy drożdżowej proteazy aspartylowej 3 (YAP3) (wg M. Egel-Mitani i in., Yeast 6, 1990, str. 127-137).
Dla zapewnienia wydajnej sekrecji u drożdży, za sekwenccą sygnałową, a przed sekwencją DNA kodującą peptyd trefoilowy można także wstawić sekwencję kodującą peptyd liderowy. Funkcja peptydu liderowego polega na umożliwieniu kierowania ulegającego ekspresji peptydu z retikulum endoplazmatycznego do aparatu Golgi’ego i dalej do pęcherzyków sekrecyjnych w celu sekrecji do podłoża hodowlanego (tj. przeniesienia peptydu trefoilowego przez ścianę komórkową, lub przynajmniej błonę komórkową do przestrzeni peryplaz.matycznej komórki drożdżowej). Peptydem liderowym może być lider drożdżowego czynnika a (którego stosowanie opisano np. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 546 082, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 870 008, europejskim opisie patentowym numer 16 201, europejskim opisie patentowym numer 123 294, europejskim opisie patentowym numer 123 544 i europejskim opisie patentowym numer 163 529). Alternatywnie, peptydem liderowym może być syntetyczny peptyd liderowy, który jest peptydem liderowym nie występującym w przyrodzie. Syntetyczne peptydy liderowe można konstruować na przykład jak opisano w światowym opisie patentowym numer 89/02463 lub światowym opisie patentowym numer 92/11378.
Do stosowania w grzybach nitkowatych, peptyd sygnałowy można dogodnie otrzymać z genu kodującego amylazę lub glukoamylazę Aspergillus sp., genu kodującego lipazę lub proteazę Rhizomucor miehei bądź lipazę Humicola lanuginosa. Korzystne jest, jeśli peptyd sygnałowy pochodzi z genu kodującego amylazę TAKA A. oryzae, obojętną α-amylazę A. niger, stabilną w środowisku kwaśnym amylazę A. niger lub glukoamylazę A. niger. Odpowiednie peptydy sygnałowe ujawniono np. w europejskim opisie patentowym numer 238 023 i europejskim opisie patentowym numer 215 594.
Do stosowania w komórkach owadów, peptyd sygnałowy może dogodnie pochodzić z genu owada (wg światowego opisu patentowego numer 90/05783), tak jak peptyd sygnałowy prekursora hormonu adypokinetycznego motyla Manduca sexta (wg opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 023 328).
Procedury stosowane do ligacji sekwencji DNA kodujących peptyd trefoilowy, promotor i ewentualnie terminator i/lub sekrecyjną sekwencję sygnałowa, odpowiednio, oraz do ich wstawiania do odpowiednich wektorów zawierających informację konieczną do replikacji, są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie (zobacz, na przykład, Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Nowy Jork, 1989).
Komórką gospodarza, do której wprowadza się sekwencję kodującą peptyd trefoilowy, może być jakakolwiek komórka, która jest zdolna do wytwarzania peptydu w postaci dimeru i która jest komórką drożdżową, grzybową lub wyższego organizmu eukariotycznego.
Przykładami odpowiednich linii komórek ssaków są linie komórkowe COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL (ATCC CCL39) lub CHO (ATCC CCL 61). Metody transfekowania komórek ssaków i uzyskiwania ekspresji sekwencji DNA wprowadzanych do komórek opisano np. w Kaufman i Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601 - 621; Southern i Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327 - 341; Loyter i in., Proc. Natl.
184 516
Acad. Sci, USA 79 (1982), 422 - 426; Wigier i in., Cell 14, (1978), 725; Corsaro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham i van der Eb, Virol0gy_52 (1973), 456 oraz Neumann i in., EMBO J. 1 (1982), 841 - 845.
Przykłady odpowiednich komórek drożdżowych obejmują komórki Saccharomyces spp. lub Schizosaccharomyces spp., szczególnie szczepy Saccharomyces cerevisiae lub Saccharomyces kluyveri. Metody transformowania komórek drożdżowych heterologicznym DNA i wytwarzania w nich heterologicznych polipeptydów opisano np. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 599 311, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 931 373, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 870 008, 5 037 743 i opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 845 075, z których wszystkie włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe. Stransformowane komórki selekcjonuje się dzięki fenotypowi określanemu przez marker selekcyjny, zwykle oporności na lek lub zdolności do wzrostu w nieobecności określonego składnika odżywczego, np. leucyny. Korzystnym wektorem do stosowania w drożdżach jest wektor POT1 ujawniony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 931 373. Sekwencję DNA kodującą peptyd trefoilowy może poprzedzać sekwencja sygnałowa i, ewentualnie, sekwencja liderowa, np. jak opisane powyżej. Dalszymi przykładami odpowiednich komórek drożdżowych są szczepy Kluyveromyces, takie jak K. lactis, Hansenula, np. H. polymorpha, lub Pichia, np. P. pastoris (wg. Gleeson i in., J. Gen. Microbiol. 132. 1986, str. 3459-3465; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 882 279.
Przykładami innych komórek grzybowych są grzyby nitkowate, np. Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. lub Trichoderma spp., zwłaszcza A. oryzae, A. nidulans lub A. niger·. Zastosowanie Aspergillus spp. do ekspresji białek opisano np. w europejskich opisach patentowych o numerach EP 272 277, EP 238 023 i EP 184 438. Transformację F. oxysporum można przeprowadzić na przykład w sposób opisany przez Malardiera i in., 1989, Gene 78: 147-156. Transformację Trichoderma spp. można przeprowadzić na przykład jak opisano w europejskim opisie patentowym numer EP 244 234.
Gdy jako komórkę gospodarza stosuje się grzyba nitkowatego, dla otrzymania zrekombinowanej komórki gospodarza można ją stransformować konstrukcją DNA według wynalazku, dogodnie przez integrację konstrukcji DNA z chromosomem gospodarza. Integrację taką generalnie uważa się za zaletę, ponieważ bardziej prawdopodobne jest stabilne utrzymywanie sekwencji DNA w komórce. Integrację konstrukcji DNA z chromosomem gospodarza można przeprowadzić zgodnie z metodami konwencjonalnymi, np. przez rekombinację homologiczną lub heterologiczną.
Transformację komórek owadów i wytwarzanie w nich polipeptydów heterologicznych można przeprowadzić jak opisano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach US 4 475 051, Us 4 879 236, US 5 155 037, 5 162 222 i europejskim opisie patentowym numer EP 397 485, z których wszystkie włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe. Odpowiednimi liniami komórek owadów zastosowanymi jako komórki gospodarza mogą być linie komórek Lepidoptera, takie jak komórki Spodoptera frugiperda lub komórki Trichoplusia ni (wg opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki numer US 5 077 214). Odpowiednie warunki hodowli mogą być takie, jak opisano na przykład w światowych opisach patentowych o numerach WO 89/01029 lub Wo 89/01028 bądź w którymkolwiek z wyżej wymienionych odnośników.
Opisane powyżej stransformowane lub stransfekowane komórki gospodarza hoduje się następnie w odpowiednim podłożu odżywczym w warunkach umożliwiających ekspresję peptydu trefoilowego, po czym całość lub część uzyskanego peptydu odzyskuje się z hodowli w postaci dimeru. Podłożem zastosowanym do hodowli komórek może być jakiekolwiek podłoże konwencjonalne odpowiednie do wzrostu komórek gospodarza, takie jak minimalne lub złożone podłoże zawierające odpowiednie dodatki. Odpowiednie podłoża dostępne są od dostawców, lub można je przygotować zgodnie z opublikowanymi przepisami (np. w katalogach American Type Culture Collection). Wytworzony przez komórki peptyd trefoilowy można następnie odzyskać z podłoża hodowlanego przez wirowanie lub sączenie, wytrącenie składników białkowych supematantu lub przesączu solą, np. siarczanem amonowym, oczyszczanie różnymi
184 516 procedurami chromatograficznymi, np. chromatografię jonowymienna, sączenie molekularne, chromatografię powinowactwa i podobne, w zależności od rodzaju interesującego nas polipeptydu.
W kompozycji farmaceutycznej według wynalazku, dimerowi peptydu trefoilowego można nadać postać zgodnie z jakąkolwiek z ustalonych metod nadawania postaci kompozycjom farmaceutycznym, np. jak opisane w Remington^ Pharmaceutical Science. 1985. Kompozycja może mieć postać odpowiednią do iniekcji lub infuzji ogólnoustrojowej i może, jako taka, być przeprowadzona w odpowiednią postać jałową wodą, izotonicznym roztworem soli fizjologicznej lub roztworem glukozy. Kompozycję można wyjaławiać konwencjonalnymi technikami wyjaławiania, które są dobrze znane w nauce. Otrzymane roztwory wodne można pakować do stosowania lub sączyć w warunkach aseptycznych i liofilizować, liofilizowany preparat będzie łączony przed podawaniem z jałowym roztworem wodnym. Kompozycja może zawierać farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze, jeśli jest to wymagane do stworzenia warunków fizjologicznych, takie jak czynniki buforujące, czynniki regulujące ciśnienie osmotyczne i podobne, na przykład octan sodowy, mleczan sodowy, chlorek sodowy, chlorek potasowy, chlorek wapniowy itp.
Kompozycję farmaceutyczną według niniejszego wynalazku można także dostosować do podawania donosowego, przezskórnego lub doodbytniczego. Farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem wykorzystywanym w kompozycji może być każdy konwencjonalny nośnik stały. Przykładami stałych nośników są laktoza, kaolin, sacharoza, talk, żelatyna, agar, pektyna, guma arabska, stearynian magnezowy i kwas stearynowy. Podobnie, nośnik lub rozcieńczalnik może obejmować każdy znany w tej dziedzinie odpowiedni materiał uwalniający, taki jak monostearynian glicerolu lub distearynian glicerolu, sam lub zmieszany z woskiem. Ilość stałego nośnika może być szeroko zróżnicowana, ale zazwyczaj będzie wynosić od około 25 mg do około 1 g.
Stężenie peptydu trefoilowego w kompozycji może być szeroko zróżnicowane, tj. od około 5% do około 100% wagowych. Korzystne stężenie pozostaje w zakresie 50-100% wagowych. Jednostka dawkowania kompozycji może typowo zawierać od około 1 mg do około 200 mg, korzystnie od około 25 mg do około 75 mg, w szczególności około 50 mg peptydu.
Jak wskazano powyżej, uważa się, że dimer peptydu trefoilowego jest aktywną postacią peptydu. Jako taki jest uważany za korzystny do stosowania do zapobiegania lub leczenia zaburzeń układu pokarmowego. Bardziej szczegółowo, rozważa się go do stosowania w leczeniu wrzodów żołądka lub wrzodów trawiennych, zapalenia jelita, choroby Crohna lub uszkodzeń przewodu pokarmowego spowodowanych radioterapią, infekcjami bakteryjnymi lub innymi itp. Dawka polipeptydu podawanego pacjentowi będzie zróżnicowana w zależności od rodzaju i stanu zaawansowania leczonego stanu, ale na ogół pozostaje w zakresie 0,1-1,0 mg/kg masy ciała.
KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW
Niniejszy wynalazek opisano bardziej szczegółowo w przykładzie, odnoszącym się do dołączonych rysunków, gdzie
Figura 1 Proponowana struktura ludzkiego jelitowego czynnika trefoilowego ITF. Sekwencję aminokwasowa podano według Hausera i in., 1993, a wiązania dwusiarczkowe umieszczono przez homologię do PSP i pS2 (Thim, 1988).
Figura 2 HPLC z odwróconymi fazami supernatantu z hodowli szczepu drożdżowego HW756, w którym zachodzi ekspresja ITF, na kolumnie Vydac 214TP542.
Figura 3 Chromatografia jonowymienna częściowo oczyszczonego ludzkiego ITF na kolumnie Fast Flow SP-Sepharose. Ilość hITF (monomeru) i hITF (dimeru) określono przez analityczną HPLC. Czarne pasy wskazują frakcje zebrane do dalszego oczyszczania postaci monomeru i dimeru. Linia przerywana przedstawia stężenie NaCl w rozpuszczalniku eluującym.
Figura 4 HPLC z odwróconymi fazami oczyszczonego dimeru ITF szczura (A), monomeru ITF człowieka (B) i dimeru ITF człowieka (C) na kolumnie Vydac 214TP54. Linie przerywane przedstawiają stężenie acetonitrylu w rozpuszczalniku eluującym.
Figura 5 Zrekonstruowane widma masowe oczyszczonego ITF szczura (dimer) (A), ITF człowieka (monomer) (B) i ITF człowieka (dimer) (C).
Figura 6 Struktura postaci dimeru ITF człowieka.
184 516
Figura 7 Mapa restrykcyjna plazmidu KFN 1003.
Figura 8 Konstruowanie plazmidu pHW756.
Figura 9 Konstruowanie plazmidu pHW1066.
Przykład
MATERIAŁY i METODY
Klonowanie ITF szczura (rITF) i ITF człowieka (hITF)
Klonowanie ITF szczura i człowieka przeprowadzono jak opisano w światowym opisie patentowym numer WO 92/14837 oraz jak opisali Suemori i in., 1991, Chinery i in., 1992 (ITF szczura) oraz Podolsky i in., 1993 i Hauser i in., 1993 (ITF człowieka).
Konstruowanie plazmidów ekspresyjnych rITF i hITF
Plazmidy ekspresyjne pHW756 do sekrecji ITF szczura ipHW1066 do sekrecji ITF człowieka skonstruowano jak przedstawiono na fig. 7-9. Drożdżowy wektor ekspresyjny pKFN1003 (opisany w światowym opisie patentowym numer WO 90/10075) jest pochodną plazmidu CPOt (Kawasaki, G. International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, 17-24 września 1984, Edynburg, Szkocja, streszczenie P15.). Posiada on gen TPI SehizQsacharomy£ęs_pombe (POT) jako marker selekcyjny (Russell, P.R., Gene 40 (1985), 125-130) oraz promotor i terminator izomerazy triozofosforanowej (TPI) S. cerevisiae do kontroli ekspresji (Alber, T. i Kawasaki, G. J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 419-434).
Gen ITF szczura sklonowano początkowo w Bluescript II KS(-) (Stratagene), z którego namnożono go zgodnie z fig. 8. Wektor pomocniczy pSX54, zapewniające użyteczne miejsca klonowania, składa się zpUC18 ipDN1050 (Diderichsen, B., Poulsen, G.B., Jorgensen, S.T. Plasmid 30 (1993), 312-315). Syntetyczny łącznik DNA Ncol-PflMl posiada następującą sekwencję:
1858: 5'-CATGGCTGAAAGATTGGAAAAGAGACAAGAGTTCGTTGGTTTGTCT
CCATCCCAATGT-3’ 58 bp
1862: 5'-TTGGGATGGAGACAAACCAACGAACTCTTGTCTCTTTTCCAATCTT
TCAGC-3' 51 bp
Łącznik koduje 8 C-końcowych aminokwasów sekwencji liderowej, jak opisano w Thim, L., Norris, K., Norris, F., Nielsen, P.F., Bjorn, S., Christensen, M., Petersen, J. FEBS Lett. 318. (1993), 345-352, z nielicznymi zmianami w wyborze kodonów, oraz N-końcową część genu ITF szczura: QEFvGlSPSQC.
Sekwencja aminokwasowa peptydu sygnałowego i liderowego jest taka, jak opisano tamże:
MKAVFLVLSLIGFCWAQPVTGDESSVEIPEESLIIAENTTLANVAMAERLEKR.
Gen ITF człowieka sklonowano w PUC 19 i namnożono jak opisano na fig. 9. Łącznik syntetycznego DNA Ncol-BsaAl posiada następującą sekwencję:
2292: 5'-CATGGCTGAAAGATTGGAAAAGAGAGAAGAATAC-3' 34pp
2287: 5'-GTATTCTTCTCTCTTTTCCAATCTTTCAGC-3' 30pp
Łącznik koduje 8 C-końcowych aminokwasów lidera, jak opisano dla konstrukcji rITF, oraz 3 N-końcowe aminokwasy genu hITF:
EEY. Peptydy sygnałowy i liderowy są takie same jak powyżej.
Plazmidami ekspresyjnymi stransformowano szczep MT 663 (E2-7B X El 1-36 a/α, Atpi/Atpi, pep 4-3/pep 4-3) S. cerevisiae. przeprowadzając selekcję pod kątem wzrostu na glukozie jako jedynym źródle węgla.
Transformanty, w których zachodziła ekspresja ITF szczura i ITF człowieka, nazwano odpowiednio HW756 i HW1066.
184 516
Fermentacje
Opisane powyżej transformanty hodowano w temperaturze 30°C wciągu 72 godzin w podłożu ekstrakt drożdżowy-pepton-dekstroza (YPD) (Sherman i in., 1981) uzupełnionym dodatkowym ekstraktem drożdżowym (60 g/litr). Pod koniec fermentacji wartości OD przy długości fali 660 nm osiągnęły odpowiednio 153 i 232 dla HW756 (rITF) i HW1066 (hITF). Po zakończeniu fermentacji pH doprowadzono do 2,5 1 M kwasem fosforowym i komórki drożdżowe usunięto przez wirowanie przy 3000 obrotów na minutę w ciągu 15 minut.
Oczyszczanie zrekombinowanego rITF
Stężenie rITF w drożdżowej brzeczce fermentacyjnej i frakcjach otrzymanych podczas oczyszczania mierzono metodą analitycznej HPLC. Próbki (zazwyczaj o objętości 50-200 μΐ) wstrzykiwano na kolumnę HPLC C4 z odwróconymi fazami Vydac 214TP54 (0,46 x 25 cm) zrównoważoną w temperaturze 30°C przy szybkości przepływu 1,5 ml/minutę 0,1% (v/v) TFA w 15% (v/v) acetonitrylu. Po 10 minutach elucji izokratycznej, stężenie acetonitrylu w rozpuszczalniku eluującym zwiększano w ciągu 40 minut do 55%. Absorbancję mierzono przy długości fali 214 nm. Stwierdzono, że ulegające elucji w 26,5 minucie, 27,3 minucie i 28,2 minucie trzy piki (fig. 2) odpowiadają postaciom dimerów rITF. Peptydy oznaczano ilościowo używając określonych ilości standardu hSP (Thim i in., 1993).
Poziom ekspresji zrekombinowanego ITF szczura w niniejszym układzie drożdżowym wynosił 113 mg/ml.
Z fermentora o objętości 10 litrów przez wirowanie wydzielono 8,7 litrów brzeczki fermentacyjnej. Supernatant rozcieńczono 14,8 litrami wody destylowanej dla obniżenia przewodności. Próbkę nakładano z zastosowaniem pompy na kolumnę Fast Flow S-Sepharose (Pharmacia) (5 x 42 cm) z szybkością przepływu 60 ml/h. Przed nałożeniem, kolumnę zrównoważono 50 mM buforem kwasu mrówkowego, pH 3,7. ITF szczura wyeluowano z kolumny 50 mM kwasem mrówkowym, pH 3,7, zawierającym 50 mM NaCl. Frakcje o objętości 100 ml zbierano przy szybkości przepływu 600 ml/h i analizowano pod kątem zawartości rITF. Zawierające rITF frakcje zporzedniego etapu połączono (2,3 litra) i nałożono z zastosowaniem pompy na kolumnę Amberchrome (G-71) (5 x 10 cm). Przed nałożeniem, kolumnę zrównoważono 10 mM buforem octanu amonu, pH 4,8, przy szybkości przepływu 0,5 litra/godzinę. Po nałożeniu kolumnę przepłukano 0,5 litra buforu równoważącego i eluowano z szybkością przepływu 0,1 litra/godzinę 10 mM buforem octanu amonu, pH 4,8, zawierającym 60% (v/v) etanol. Zbierano frakcje o objętości 10 ml i połączono te zawierające rITF. Stężenie etanolu w połączonych frakcjach zwiększono z 60% (v/v) do 87% (v/v) przez dodanie 2 objętości etanolu (99,9%, v/v) i rITF wytrącono przez ochładzanie otrzymanej mieszaniny w temperaturze minus 25°C w ciągu 16 godzin.
Wytrącony osad zebrano przez wirowanie wciągu 1 godziny przy 10 000 x g w temperaturze -25°C i ponownie rozpuszczono w temperaturze pokojowej w objętości 130 ml 20 mM kwasu mrówkowego, pH 3,0. Próbkę nałożono z zastosowaniem pompy na kolumnę Fast Flow SP-Sepharose (Pharmacia) (5 x 20 cm) przy szybkości przepływu 50 ml/h. Przed nałożeniem kolumnę zrównoważono 20 mM kwasem mrówkowym, pH 3,0. Peptydy eluowano z kolumny linowym gradientem utworzonym z 1,5 litra 50 mM kwasu mrówkowego, pH 3,0 i 1,5 litrem kwasu mrówkowego, pH 3,0, zawierającego 0,5 M NaCl. Frakcje (10 ml) zebrano przy szybkości przepływu 80 ml/h i absorbancję mierzono przy długości fali 280 nm. We frakcjach oznaczono zawartość rITF. Frakcje zawierające rITF połączono. ITF szczura poddano dalszemu oczyszczaniu metodą preparatywnej HPLC. Połączone frakcje (900 ml) nałożono stosując pompę na preparatywną kolumnę HPLC C4 Vydac 214P1022 (2,2 x 25 cm) zrównoważoną 0,1% (v/v) TFA. Peptydy eluowano w temperaturze 25°C przy szybkości przepływu 5 ml/minutę liniowym gradientem (540 ml) utworzonym z MeCN/H2O/TFA (10:89,9:0,1, v/v/v) i MeCN/H2O/TFA (65:34,9:0,1). Absorbcję UV monitorowano przy długości fali 280 nm i zbierano frakcje o objętości 10 ml oraz oznaczono w nich zawartość rITF. Frakcje zawierające rITF połączono i ich objętość zmniejszono do 30% przez wirowanie pod zmniejszonym ciśnieniem. Z otrzymanej puli rITF wydzielono przez liofilizację. Całkowita wydajność rITF z 8,7 litrów podłoża fermentacyjnego wynosiła 236 mg, co odpowiadało całkowitej wydajności oczyszczania 24%.
184 516
Oczyszczanie zrekombinowanego hITF
Stężenie hITF w drożdżowej brzeczce fermentacyjnej i frakcji otrzymanej podczas oczyszczania mierzono w układzie HPLC identycznym z tym opisanym dla rITF. Przez spektrometrię masową i analizę sekwencji stwierdzono, że dwa piki, ulegające w tym układzie elucji w 21,2 minucie i 27,1 minucie, odpowiadają postaci dimeru i monomeru hITF. Poziom ekspresji zrekombinowanego ITF człowieka w niniejszym układzie drożdżowym wynosił 90 mg/ml.
Z fermentora o objętości 10 litrów przez wirowanie wydzielono 8,0 litrów brzeczki fermentacyjnej. Próbę trzy razy dializowano (za każdym razem w ciągu 24 h) wobec 40 litrów 10 mM kwasu mrówkowego, pH 2,5. Próbkę nakładano z zastosowaniem pompy (0/25 litra/godzinę) na kolumnę SP-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) (5 x 40 cm). Kolumnę przemyto 5 litrami 20 mM kwasu mrówkowego i eluowano liniowym gradientem utworzonym z 5 litrów 20 mM kwasu mrówkowego, pH 2,5, oraz 5 litrów kwasu mrówkowego, pH 2,5, zawierającego 1 M NaCl. Frakcje o objętości 100 ml zbierano i analizowano pod kątem zawartości hITF (fig. 3). Z kolumny wyeluowano dwie postacie hITF: jedną odpowiadającą postaci monomeru hITF (ulegającą elucji przy 0,5 M NaCl), i jedną odpowiadającą postaci dimeru hITF (ulegającą elucji przy 0,78 M NaCl). Frakcje odpowiadające obu postaciom połączono oddzielnie.
Każdą frakcję podzielono na trzy równe części (o objętości około 700 ml) i nałożono z zastosowaniem pompy na kolumnę C4 Vydac 214TP1022 (2,2 x 25 cm) zrównoważoną 0,1% (v/v) TFA. Peptydy eluowano przy szybkości przepływu 4 ml/minutę liniowym gradientem (540 ml) utworzonym z MeCN/H2O/TFA (10:89,9:0,1, v/v/v) i MeCN/H2O/TFA (65:34,9:0,1, v/v/v). Absorbcję UV monitorowano przy długości fali 280 nm i zbierano frakcje o objętości 10 ml oraz oznaczono w nich zawartość rITF.
Frakcje z poprzedniego etapu zawierające hITF (monomer) i hITF (dimer) połączono oddzielnie i pH doprowadzono do 3,0. Próbki nałożono oddzielnie na kolumnę SP-Sepharose HiLoad 16/10 (Pharmacia) (1,6 x 10 cm) zrównoważoną 20 mM kwasem mrówkowym, pH 3,0, zawierającym 40% (v/v) etanol. Kolumnę przepłukano 80 ml buforu równoważącego i elu-owano przy szybkości przepływu 4 ml/minutę liniowym gradientem utworzonym z 200 ml 20 mM kwasu mrówkowego, pH 3,0, 40% (v/v) etanolu i 200 ml 20 mM kwasu mrówkowego, pH 3,0, 40% (v/v) etanolu, zawierającego 1 M NaCl. Zbierano frakcje (5 ml) i analizowano pod kątem zawartości hITF.
Frakcje zawierające odpowiednio hITF (monomer) i hITF (dimer) połączono i zawarte w nich peptydy wytrącono przez doprowadzenie stężenia etanolu do 90% i chłodzenie mieszaniny w ciągu 72 godzin w temperaturze -25°C. Wytrącony osad zebrano przez odwirowanie i zliofilizowano. Całkowita wydajność z 8,0 litrów brzeczki fermentacyjnej wynosiła 256 mg hITF (monomeru) i 133 mg hITF (dimeru), co odpowiadało całkowitej wydajności oczyszczania odpowiednio 50% i 65% dla postaci monomeru i dimeru.
Charakterystyka zrekombmowanych rITF i hITF
Po hydrolizie w 6 M HCl w temperaturze 110°C w probówkach zatapianych pod zmniejszonym ciśnieniem w ciągu 24, 48 i 96 godzin, próbki (50 pg) analizowano stosując automatyczny analizator aminokwasów Beckman (model 121 MB). Półcystynę oznaczano jako pochodną S-3-(4-pirydietylową) po redukcji wiązań dwusiarczkowych tributylofosfiną (Riiegg i Rudinger, 1974), a następnie sprzęganiu z 4-winylopirydyną (Friedman i in., 1970). Hydrolizę próbek traktowanych 4-winylopirydyną prowadzono w 4 M kwasie metanosulfonowym lub 3 M kwasie merkaptoetanosulfonowym w temperaturze 110°C w ciągu 24 godzin, jak opisano powyżej. Analizę sekwencji aminokwasowej przeprowadzono przez zautomatyzowaną degradację Edmana stosując sekwenator gazowy Applied Biosystems model 470A (Thim i in., 1987).
Analizę przez spektrometrię masową przeprowadzono stosując układ API III LC/MS/MS (Sciex, Thornhill, Ontario, Kanada). Aparat z potrójnym kwadrypolem posiada zakres stosunku masy do ładunku (m/z) 2400 i jest wyposażony w pneumatycznie sterowany układ elektospray (nazywany również jako spray jonowy) (Bruins i in., 1987; Covey i in., 1988). Wprowadzanie próbek przeprowadzano strzykawkową pompą infuzyjną (Sage Instruments, Cambridge, MA) przez kapilarę (średnica wewnętrzna 75 pm) z szybkością przepływu
184 516 płynu ustawioną na 0,5-1 Lil/minutę. Skalę m/z aparatu kalibrowano stosując glikole polipropylenowe (PPG) solwatowane pojedynczym jonem amoniowym, na jednostkę masy. Dokładność pomiarów masy jest na ogół lepsza niż 0,02%.
Figura 4 przedstawia chromatogram analitycznej HPLC otrzymany dla oczyszczonego rITF (fig. 4A) i hITF (fig. 4B i 4C). Zrekombinowany rITF zawiera mieszaninę 3 bardzo zbliżonych peptydów i nie podjęto próby rozdzielenia tych postaci. Podczas analizy przez spektrometrię masową z zastosowaniem elektrospray stwierdzono trzy dominujące masy cząsteczkowe, odpowiadające 13112,2, 13096,6 i 13078,8 (fig. 5A). Obliczona masa cząsteczkowa ITF szczura w postaci monomeru, w której Cys-57 posiada wolną grupę SH, wynosi 6558,3. Obliczona masa cząsteczkowa ITF szczura w postaci dimeru (np. ustalono, że mostek S-S jest pomiędzy dwiema Cys-57) wynosi 13114,6. Na podstawie mas cząsteczkowych stwierdzonych w zrekombinowanym ITF szczura wyraźnie stwierdzono, że wszystkie trzy peptydy mają postać dimerów rITF. Dla innych peptydów trefoilowych, w których N-końcową resztą aminokwasową jest Gln, np. PSP (Thim i in., 1985 oraz Tomasetto i in., 1990) wiadomo, że reszta ta wykazuje tendencję do tworzenia kwas piroglutaminowy (piroGlu). W przypadku ITF szczura o przewidywanej sekwencji N-końcowej Gln-Glu-Phe-Val-Gly, uzasadnione wydaje się założenie, żeN-końcowa reszta Gln również ulega cyklizacji z utworzeniem piroGlu. Wynikiem takiego przejścia w pochodną powinno być zmniejszenie masy cząsteczkowej ITF szczura (dimeru) o odpowiednio 17 (jeden piroGlu) lub 34 (dwa piroGlu) jednostki masy cząsteczkowej. Obserwowane masy cząsteczkowe 13096,6 i 13078,8 (fig. 5A) odpowiadają postaci dimeru ITF szczura, w której odpowiednio jedna lub dwie N-końcowe reszty Gln uległy cyklizacji. Obliczone masy cząsteczkowe tych postaci wynoszą 13097,6 i 13080,6, co pozostaje w dobrej zgodności z wartościami określonymi doświadczalnie. A zatem, na podstawie HPLC (fig. 4A) i analizy masy (fig. 5), wywnioskowano, że zrekombinowany ITF szczura obejmuje trzy różne postacie dimerów: jedną zawierającą 2 N-końcowe Gln, jedną zawierającą 1 N-końcową Gln i 1 N-końcowy piroGlu oraz jedną zawierającą dwa N-końcowe piroGlu. Tabela I przedstawia skład aminokwasowy ITF szczura, pozostający w dobrej zgodności z wartościami oczekiwanymi.
Figura 5A i 5B przedstawiają odpowiednio czystość hITF (monomeru) i hITF (dimeru) określona przez analityczna EIPLC. Postać dimeru (fig. 5C) wydaje się być względnie czysta, podczas gdy postać monomeru (fig. 5B) wydaje się być zanieczyszczona materiałem ulegającym elucji przed peptydem. Jednakże, po ponownej chromatografii materiału ulegającego elucji w głównym piku, otrzymano podobny chromatogram (wyniki nieprzedstawione). Wydaje się to wskazywać na raczej nietypowe zachowanie hITF (monomeru) na kolumnach z odwróconymi fazami, niż obecność zanieczyszczeń. Uprzednio obserwowaliśmy podobne zachowanie oczyszczonego w wysokim stopniu PSP świni, jak również oczyszczonego w wysokim stopniu zrekombinowanego hSP (Thim i in., 1993).
Analiza przez spektrometrię masową hITF (monomeru) wykazała, że masa cząsteczkowa głównego piku odpowiada 6694.0 (fig. 5B). Masa cząsteczkowa obliczona na podstawie sekwencji aminokwasowej (fig. 1) wynosi 6574.4, zakładając, że Cys-57 występuje w formie -SH. Analiza sekwencji aminokwasowej (tabela II) wykazała oczekiwaną sekwencję N-końcową Glu-Glu-Tyr-Val-Gly-. Analiza składu aminokwasowego (tabela I) wykazuje oczekiwane wartości, z wyjątkiem obecności 7,3 (8) cystein. Dodatkowa cysteina połączona z Cys-57 monomeru hITF powinna zwiększyć masę cząsteczkową do 6694,7, co jest wartością bardzo bliską wartości określonej przez spektrometrię masową (6694,0). Dlatego też zakłada się, że w hITF (monomerze) Cys-57 połączona jest wiązaniem dwusiarczkowym z dodatkową cysteiną. Mniejszy pik masy cząsteczkowej w widmie masowym (fig. 5B) może odpowiadać innej pochodnej, lub zanieczyszczeniu preparatu.
Obliczona masa cząsteczkowa hITF (dimeru), w której dwa monomery połączone są wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy resztami Cys-57, wynosi 13146,8. Pozostaje to w dobrej zgodności z wartością określoną przez spektrometrię masową (13147, fig. 5C). Inny pik w widmie masowym (13169) prawdopodobnie odpowiada adduktowi dimeru hITF z jonem Na+. Analiza sekwencji (tabela I), jak również analiza składu aminokwasowego (tabela II) również pozostają w dobrej zgodności z wartościami oczekiwanymi.
184 516
Tabela I
Skład aminokwasowy ITF szczura (dimeru), ITF człowieka (monomeru) i ITF człowieka (dimeru)
| Aminokwas | ITF szczura (dimer) | ITF człowieka (monomer) | ITF człowieka (dimer) | |||
| Asx | 11,92 | (12) | 6,00 | (6) | 12,01 | (12) |
| Thr3 | 8,00 | (8) | 2,03 | (2) | 4,01 | (4) |
| Ser3 | 9,86 | (10) | 2,04 | (2) | 4,01 | (4) |
| Glx | 15,98 | (16) | 6,92 | (7) | 14,00 | (14) |
| Prob | 12,48 | (12) | n.o.c | (6) | n. o.c | (12) |
| Gly | 6,02 | (6) | 4,20 | (4) | 8,09 | (8) |
| Ala | 2,04 | (2) | 3,91 | (4) | 7,90 | (8) |
| Val | 11,92 | (12) | 4,92 | (5) | 9,86 | (10) |
| Met | 1,80 | (2) | 0,00 | (0) | 0,00 | (0) |
| Ile | 1,98 | (2) | 1,17 | (1) | 2,13 | (2) |
| Leu | 3,92 | (4) | 2,03 | (2) | 3,99 | (4) |
| Tyrb | 2,02 | (2) | 1,94 | (2) | 3,92 | (4) |
| Phe | 7,88 | (8) | 2,93 | (3) | 5,94 | (6) |
| Lys | 2,14 | (2) | 3,07 | (3) | 6,09 | (6) |
| His | 0,00 | (0) | 0,99 | (1) | 2,03 | (2) |
| Trp | 2,16 | (2) | n.o.c | (1) | n.o.c | (2) |
| Arg | 3,94 | (4) | 2,96 | (3) | 6,05 | (6) |
| PE-Cysb | 12,70 | (14) | 7,30 | (7) | 13,80 | (14) |
| Łącznie | (118) | (59) | (118) |
Wartości w nawiasach przewidziane na podstawie cDNA ITF szczura (Chinery i in., 1992) i ITF człowieka (Hauser i in./ 1993).
’) Oznaczone przez ekstrapolacją do zerowego czasu hydrolizy.
b) Oznaczone przez hydrolizą w 4 M kwasie metanosulfonowym.
c) Nie oznaczano.
Tabela II
Zautomatyzowana degradacja Edmana ITF szczura (dimeru), ITF człowieka (monomeru) i ITF człowieka (dimeru)
| Numer cyklu | ITF szczura (dimer) | ITF człowieka (monomer) | ITF człowieka (dimer) | |||
| PTA- aminokwasy | Wydajność (pmole) | PTA- aminokwasy | Wydajność (pmole) | PTA- aminokwasy | Wydajność (pmole) | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 1 | Gln | 989 | Glu | 1517 | Glu | 2227 |
| 2 | Glu | 731 | Glu | 1998 | Glu | 2361 |
| 3 | Phe | 967 | Tyr | 2205 | Tyr | 2528 |
| 4 | Val | 1072 | Val | 2409 | Val | 2431 |
184 516
c.d. tabeli II
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 5 | Gly | 701 | Gly | 1625 | Gly | 1803 |
| 6 | Leu | 838 | Leu | 2318 | Leu | 2253 |
| 7 | Ser | 497 | Ser | 852 | Ser | 904 |
| 8 | Pro | 965 | Ala | 1729 | Ala | 1712 |
| 9 | Ser | 406 | Asn | 1394 | Asn | 1518 |
| 10 | Gln | 820 | Gln | 1494 | Gln | 1499 |
| 11 | (Cys) | n.o. | (Cys) | .n.o. | (Cys) | n.o. |
| 12 | Met | 581 | Ala | 1243 | Ala | 1377 |
| 13 | Val | 971 | Val | 1468 | Val | 1356 |
| 14 | Pro | 962 | Pro | 1223 | Pro | 1195 |
| 15 | Ala | 529 | Ala | 1248 | Ala | 1249 |
| 16 | Asn | 791 | Lys | 1270 | Lys | 1050 |
| 17 | Val | 952 | Asp | 937 | Asp | 991 |
| 18 | Arg | 331 | Arg | 891 | Arg | 964 |
| 18 | Arg | 331 | Arg | 891 | Arg | 964 |
| 19 | Val | 956 | Val | 1002 | Val | 1069 |
| 20 | Asp | 476 | Asp | 847 | Asp | 932 |
| 21 | (Cys) | n.o. | (Cys) | n.o. | Cys | n.o. |
| 22 | Gly | 381 | Gly | 709 | Gly | 703 |
| 23 | Tyr | 352 | Tyr | 894 | Tyr | 792 |
| 24 | Pro | 927 | Pro | 766 | Pro | 701 |
| 26 | Thr | 498 | His | 309 | His | 236 |
| 26 | Val | 812 | Val | 755 | Val | 670 |
| 27 | Thr | 510 | Thr | 505 | Thr | 576 |
| 28 | Ser | 225 | Pro | 458 | Pro | 473 |
| 29 | Glu | 398 | Lys | 444 | Lys | 321 |
| 30 | Gln | 499 | Glu | 219 | Glu | 304 |
| 31 | (Cys) | n.o. | (Cys) | n.o. | (Cys) | n.o. |
| 32 | Asn | 557 | Asn | 312 | Asn | 300 |
| 33 | Asn | 591 | Asn | 464 | Asn | 503 |
| 34 | Arg | 196 | Arg | 325 | Arg | 294 |
| 35 | Gly | 222 | Gly | 239 | Gly | 223 |
| 36 | (Cys) | n.o. | (Cys) | n.o. | (Cys) | n.o. |
| 37 | (Cys) | n.o. | (Cys) | n.o. | (Cys) | n.o. |
184 516
c.d. tabeli II
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 38 | Phe | 335 | Phe | 189 | Phe | 174 |
| 39 | Asp | 275 | Asp | 133 | Asp | 137 |
| 40 | Ser | 164 | Ser | 49 | Ser | 43 |
| R.Y. | 97,0% | 93,2% | 92,5% |
184 516
PIŚMIENNICTWO
Babyatsky, M., W., Thim, L., Podolsky. D.K., (1994), Gastroenterology 106, A43 (streszczenie).
Bruins, A.P., Covey, T.R., Henion, J.D. (1987), Anad.Chem. 59, 2642-2646.
Chinery, R., Poulsom, R., Rogers, L. A., Jeffery, R. E.
Longeroft, J.M., Hanby, A.M., Wright, N.A. (1992) Biochem. J. 285, 5-8.
Covey, T.R., Bonner, R.F., Shushan, B.I., Henion, J.D. (1988) Rapid Commun. Mass Spectrom.. 2, 249-256.
Dignass, A., Lynch-Devaney, K., Kindon, H., Thim, L., Podolsky, D.K. (1994) J. Clin. Invest, (w druku).
Friedman, M., Krull, L.H., Cavins, J.F. (1970), J. Biol. Chem. 245, 3868-3871.
Gajhede, M., Petersen, T.N., Henriksen, A., Petersen, J.F.W., Dauter, Z., Wilson, K.S., Thim, L. (1993) Structure 1, 253-262.
Hanby, A.M., Poulsom, R., Elia, G., Singh, S., Longcroft, J.M., Wright, N.A. (1993) J Pathol. 169, 355-360.
Hauser, F., Hoffmann, W. (1991) J. Biol.. Chem. 266, 21206-21309.
Hauser, F., Roeben, C., Hoffmann, W. (1992a) J. Biol. Chem. 267, 14451-14455.
Hauser, F., Hoffmann, W. (1992b) J. Biol. Chem. 267, 24620-24624.
Hauser, F., Poulsom, R., Chinery, R., Rogers, L.A., Hanby, A.M., Wright, N.A., Hoffmann, W. (1993) Proc. Acad. Sci. 90, 6961-6965.
Hoffmann, W. (1988)7. Biol. Chem. 263, 7686-7690.
Hoffmann, W., Hauser, F. (1993) Trends Biochem. Sci.. 7, 239-243.
Jakowlew, S.B., Breathnach, R., Jeltsch, J.-M., Masiakowski, P., Chambon, P. (1984) Nucleic Acid Res. 12, 2861-2878.
Lefebvre, O., Wolf, C., Kedinger, M., Chenard, M.-P., Tomasetto, C., Chambon, P., Rio, M.C. (1993) J. Cell.. Biol. 122, 191-198.
Playford, R.J., Marchbank, T., Chinery, R., Evison, R., Pignattelli, M., Bolton, R., Thim,
L. , Hanby, A.M. (1994) Gastroenterology (w druku).
Podolsky, D.K., Lynch-Devaney, K., Stow, J.L., Oates, P., Murgue, B., DeBeaumont,
M. , Sands, B.E., Makida, Y.R. (1993) J. Biol. Chem. 268, 6694-6702.
184 516
Poulsom, R., Chinery, R., Sarraf, C., Lalani, E.-N., Stamp, E., Elia, G., Wright, N. (1992) Gastroenterology 27, 17-28.
Prud'homme, J.F., Fridlansky, F., Le Cunff, M., Atger, M., Mercier-Bodart, C., Pichon, M.-F., Milgrom, E. (1985), DNA 4, 11-21.
Rio, M.C., Bellocq, J.P., Daniel, J.Y., Tomasetto, C., Lathe, R., Chenard, M.P., Bat zenschlager, A., Chambon, P. (1988) Science 241, 705-708.
Rio, M.-C., Chenard, M.-P., Wolf, C., Marcellin, L., Tomasetto, C., Lathe, R., Bellocq, J.-P., Chambon, P. (1991) Gastroenterology 100, 375-379.
Ruegg, U.Th., Rudinger, J. (1974) Isr.J.Chem. 12, 391-401.
Sherinan, F., Fink, G.R., Hicks, J.B. (1981) Methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Suemori, S., Lynch-Devaney, K., Podolsky, D.K. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. 88, 11017-11021.
Thim, L., Jorgensen, K.H., Jorgensen, K.D. (1982) Regul. Peptides 3, 221-230.
Thim, L., Thomsen, J., Christensen, M., Jorgensen, K. H. (1985) Biochem. Biophys. Acta 827, 410-418.
Thim, L., Hansen, M.T., Norris, K., Hoegh, I., Boel, E., Forstrom, J., Ammerer, G., Fiil, L. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. 83, 6766-6770.
Thim, L., Hansen, M.T., Soerensen, A.R. (1987) FEBS Lett. 212, 307-312.
Thim, L. (1989) FEBS Lett. 250, 85-90.
Thim, L., Norris, K., Norris, F., Nielsen, P.F., Bjorn, S.E., Christensen, M., Petersen, J. (1993) FEBS Lett. 318, 345-352.
Thim, L. (1994) Digestion 55, 353-360.
Tomasetto, C., Rio, M., Gautier, C., Wolf, C., Hareuveni, M., Chambon, P., Lathe, R. (1990) EMBOJ. 9, 407-414.
Wright, N.A., Pike, C., Elia, G. (1990) Nature 343, 82-85.
Wright, N.A., Poulsom, R., Stamp, G., van Norden, S., Sarraf, C., Elia, G., Ahnen, D., Jeffery, R., Longcroft, J., Pike, C., Rio, M., Chambon, P. (1993) Gastroenterology 104, 12-20.
184 516 rITF (dimer)
Fig-2
184 516
Fig. 3
184 516 ο
ο
Czas (min)
Fig. 4
184 516
Fig- 5
184 516
COOH COOH
Fig. 6
184 516
1 Promotor TPI z S.cerevisiae
2. Syntetyczny gen sygnałowo-łiderowy
3. Syntetyczny gen aprotyniny
4. Terminator TPI z S.cerevisiae
Gen TPI z S.pombe
Sekwencje z plazmidów E.coli pBR322 i pUC13
7. Sekwencje z plazmidu 2 u S.cerevisiae
8. Sekwencja łącznikowa z plazmidu pBR322 E.coli
Fig. 7
184 516
+ łącznik 5658/1862 Nco J-PfiM I 58/51 bp
Fig. 8
184 516
Fig. 9
184 516
COOH
NH,
Fig. 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.
Cena 4,00 zł.
Claims (19)
- Zastrzeżenia patentowe1. Dimer peptydu trefoilowego, znamienny tym, że dimer ten zawiera dwa monomeryczne peptydy trefoilowe, każdy obejmujący jedną domenę trefoilową typu pojedynczego połączone razem wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi.
- 2. Dimer peptydu według zastrz. 1, znamienny tym, że jest jelitowym czynnikiem trefoilowym (ITF).
- 3. Dimer peptydu według zastrz. 2, znamienny tym, że jest (ITF) człowieka.
- 4. Dimer peptydu według zastrz. 3, znamienny tym, że posiada przybliżoną masę cząsteczkową 13000.
- 5. Dimer peptydu według zastrz. 3, znamienny tym, że ITF składa się z dwóch monomerów ITF połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi w pozycji 57 każdego monomeru.
- 6. Dimer peptydu według zastrz. 1, znamienny tym, że jest peptydem związanym z rakiem piersi (pS2).
- 7. Dimer peptydu według zastrz. 6, znamienny tym, że jest pS2 człowieka.
- 8. Dimer peptydu według zastrz. 6, znamienny tym, że pS2 składa się z dwóch monomerów pS2 połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi w pozycji 58 każdego monomeru.
- 9. Sposób przygotowywania dimeru peptydu trefoilowego zawierającego dwa monomeryczne peptydy trefoilowe, każdy obejmujący jedną domenę trefoilową typu pojedynczego połączone razem wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi, znamienny tym, że hoduje się odpowiednią komórkę gospodarza stransformowaną sekwencją DNA kodującą peptyd trefoilowy zawierający jedną domenę trefolilową w warunkach sprzyjających wytwarzaniu tego peptydu, oddziela się chromatograficznie od hodowli otrzymany monomer petydu trefoilowego i dimer peptydu trefoilowego i odzyskuje się dimer peptydu trefoilowego.
- 10. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia lub zapobiegania zaburzeniem układu pokarmowego, zawierająca substancję czynną, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik, znamienna tym, że jako czynnik aktywny zawiera dimer peptydu trefoilowego charakteryzujący się tym, że dimer peptydu zawiera dwa monomeryczne peptydy trefoilowe, każdy obejmujący jedną domenę trefoilową typu pojedynczego połączone wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi, w stężeniu od około 5% do 100% wagowych.
- 11. Kompozycja farmaceutyczna, według zastrz. 10, znamienna tym, że dimerem peptydu trefoilowego jest jelitowy czynnik trefoilowy (ITF).
- 12. Kompozycja farmaceutyczna, według zastrz. 10, znamienna tym, że dimerem peptydu trefoilowego jest ITF człowieka.
- 13. Kompozycja farmaceutyczna, według zastrz. 12, znamienna tym, że zawiera dimer peptydu trefoilowego o przybliżonej masie cząsteczkowej 13000.
- 14. Kompozycja farmaceutyczna, według zastrz. 12, znamienna tym, że jako dimer peptydu zawiera dimer ITF składający się z dwóch monomerów ITF połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi w pozycji 57 każdego monomeru.
- 15. Kompozycja farmaceutyczna, według zastrz. 10, znamienna tym, że jako dimer peptydu trefoilowego zawiera peptyd związany z rakiem piersi (pS2).184 516
- 16. Kompozycja farmaceutyczna, według zastrz. 15, znamienna tym, że dimer peptydu trefoilowego stanowi pS2 człowieka.
- 17. Kompozycja farmaceutyczna, według zastrz. 16, znamienna tym, że pS2 składa się z dwóch monomerów pS2 połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi w pozycji 58 każdego monomeru.
- 18. Dimer peptydu trefoilowego zawierający dwa monomeryczne peptydy trefoilowe, każdy obejmujący jedną domenę trefoilową typu pojedynczego połączone razem wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwiema resztami cysternowymi do zastosowania jako lek.
- 19. Dimer peptydu trefoilowego, według zastrz. 18, do zastosowania jako lek do leczenia lub zapobiegania zaburzeniom układu pokarmowego.Niniejszy wynalazek dotyczy dimeru peptydu trefoilowego, sposobu przygotowania dimeru peptydu trefoilowego, kompozycji farmaceutycznej i dimeru peptydu trefoilowego do zastosowania jako lek, zwłaszcza lek do leczenia zaburzeń układu pokarmowego.Peptydy trefoilowe stanowią rodzinę peptydów występujących przede wszystkim w układzie pokarmowym. Peptydy trefoilowe ssaków zawierają jedną lub więcej charakterystycznych domen (Thim i in., 1989), z których każda obejmuje sekwencje 38 lub 39 reszt aminokwasowych, w których 6 reszt półcystynowych połączonych jest w konfiguracji 1-5, 2-4 i 3-6, w ten sposób tworząc charakterystyczną strukturę trefoilową (Thim, 1989).Znane obecnie peptydy trefoilowe ssaków zawierają jedną lub dwie domeny trefoilowe (patrz prace przeglądowe Thim, 1994; Poulsom i Wright, 1993; Hoffmann i Hauser, 1993), podczas gdy opisano peptydy i białka żaby Xenopus laevis zawierające jedną (Hauser i Hoffmann, 1991), dwie (Hauser i in., 1992a), cztery (Hoffmann, 1988) lub szereg (Hauser i Hoffmann, 1992b) domen trefoilowych. Peptydami trefoilowymi ssaków zawierającymi jedną domenę są peptyd S2 związany z rakiem piersi, znany dotąd dla człowieka (Jakowlev i in., 1984, Prud'homme i in., 1985) i myszy (Lefebvre i in., 1993) oraz jelitowy czynnik trefoilowy, znany dotąd dla człowieka (Podolsky i in., 1993); Hauser i in., 1993) i szczura (Suemori i in., 1991; Chinery i in., 1992). Polipeptyd rozkurczowy (SP), który zawiera dwie domeny trefoilowe, opisano dla człowieka (Tomasetto i in., 1990), świni (Thim i in., 1982) i myszy (Tomasetto i in., 1990). U ludzi wszystkie trzy peptydy trefoilowe, hpS2, hITF i hSP, w normalnych warunkach ekspresji ulegają w układzie pokarmowym: hSP i hps2 w warstwie nabłonkowej błony śluzowej żołądka (Tomasetto i in., 1990; Rio i in., 1988), aUTF w warstwie nabłonkowej błony śluzowej jelita cienkiego i okrężnicy (Podolsky i in., 1993).Fizjologiczna funkcja peptydów trefoilowych nie jest w pełni zrozumiała. Donoszono o podwyższonej ekspresji peptydów trefoilowych w układzie pokarmowym w kilku stanach obejmujących uszkodzenie błony śluzowej, takich jak zapalenie jelita (Rio i in., 1991; Poulsom iin., 1992; Wright i in., 1993) i owrzodzenia żołądka i dwunastnicy (Rio i in., 1991); Hańby i in., 1993; Wright i in., 1990). W konsekwencji, sugerowano funkcję naprawczą śluzówki peptydów trefoilowych (np. Wright i in., 1993). Dowody na pobudzanie restytucji nabłonka błony śluzowej przez peptydy trefoilowe po uszkodzeniu podali ostatnio Dignass i in., 1994, Playford i in., 1994 oraz Babyatsky i in., 1994. Mechanizm, dzięki któremu peptydy trefoilowe pobudzają swoje funkcje naprawcze mogą polegać na sieciowaniu glikoprotein mucyny z tworzeniem warstwy, lepkiego elastycznego żelu, odpornej na enzymy trawienne (Thim, 1994; Gajhede i in., 1993).Klonowanie jednodomenowego jelitowego czynnika trefoilowego szczura i człowieka oraz stosowanie jelitowego czynnika trefoilowego w leczeniu uszkodzeń przewodu pokarmowego opisano w publikacji międzynarodowej numer WO 92/14837.Obecnie stwierdzono, że możliwe jest przygotowanie dimerów czynników trefoilowych, które mają tylko jedną domenę trefoilową i posiadają interesujące właściwości farmakologiczne.184 516A zatem, niniejszy wynalazek dotyczy peptydu trefoilowego zawierającego pojedynczą domenę trefoilową, przy czym peptyd charakteryzuje się tym, że występuje w postaci dimeru.Jak wskazano powyżej, uważa się, że peptydy trefoilowe uczestniczą w gojeniu się wrzodów trawiennych i innych uszkodzeń błony śluzowej przez stabilizację warstwy śluzówki przewodu pokarmowego. Mechanizm tej stabilizacji jest obecnie nieznany. Jednakże, struktura określona metodą dyfrakcji promieniowania X trzustkowego polipeptydu rozkurczowgo (PSP) świni (wg Gajhede i in., 1993), który posiada dwie domeny trefoilowe, wskazuje, że większość reszt konserwatywnych znajduje się w występującej w każdej z domen trefoilowych szczelinie o szerokości 0,8-1 nm. Wstępne doświadczenia modelowania komputerowego możliwych oddziaływań wykazały, że szczelina może pomieścić część łańcucha oligosacharydowego, na przykład węglowodanu połączonego z glikoproteiną mucyną. Jeżeli tak jest rzeczywiście, PSP z dwiema takimi szczelinami może sieciować mucyny, pomagając tworzyć ochronny żel na nabłonek błony śluzowej. Obecnie nie wiadomo, czy peptydy trefoilowe z pojedynczą domeną trefoilową (takie jak ITF i pS2) tworzą dimery in vivo, aby spełniać podobną funkcję, czy też wykazują odrębny mechanizm działania. Jednakże, uważa się obecnie, że dimery takich peptydów trefoilowych mogą rzeczywiście sieciować mucyny i dlatego stanowią aktywną postać peptydów.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK98394 | 1994-08-26 | ||
| PCT/DK1995/000343 WO1996006861A1 (en) | 1994-08-26 | 1995-08-25 | Trefoil peptide dimer |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL318785A1 PL318785A1 (en) | 1997-07-07 |
| PL184516B1 true PL184516B1 (pl) | 2002-11-29 |
Family
ID=8099704
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL95318785A PL184516B1 (pl) | 1994-08-26 | 1995-08-25 | Dimer peptydu trefoilowego sposób przygotowania dimeru peptydu trefoilowego kompozycja farmaceutyczna i dimer peptydu trefoilowego do zastosowania jako lek |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0777687B1 (pl) |
| JP (3) | JPH10504720A (pl) |
| KR (1) | KR100255911B1 (pl) |
| CN (1) | CN1070867C (pl) |
| AT (1) | ATE329929T1 (pl) |
| AU (1) | AU694796B2 (pl) |
| BR (1) | BR9508773A (pl) |
| CA (1) | CA2196876C (pl) |
| CZ (2) | CZ289705B6 (pl) |
| DE (1) | DE69535060T2 (pl) |
| DK (1) | DK0777687T3 (pl) |
| ES (1) | ES2267104T3 (pl) |
| FI (1) | FI119989B (pl) |
| HU (1) | HU226921B1 (pl) |
| MX (1) | MX9701239A (pl) |
| NO (1) | NO323642B1 (pl) |
| PL (1) | PL184516B1 (pl) |
| PT (1) | PT777687E (pl) |
| RU (1) | RU2162857C2 (pl) |
| UA (1) | UA68324C2 (pl) |
| WO (1) | WO1996006861A1 (pl) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6221840B1 (en) | 1991-02-14 | 2001-04-24 | The General Hospital Corporation | Intestinal trefoil proteins |
| US6063755A (en) | 1991-02-14 | 2000-05-16 | The General Hospital Corporation | Intestinal trefoil proteins |
| US6337195B1 (en) | 1995-06-06 | 2002-01-08 | Human Genome Sciences, Inc. | Colon specific genes and proteins |
| US6525018B1 (en) | 1999-05-17 | 2003-02-25 | The General Hospital Corp. | Treating eye disorders using intestinal trefoil proteins |
| US6426404B1 (en) | 1997-08-25 | 2002-07-30 | The General Hospital Corporation | Receptor for intestinal trefoil factor |
| AU6523901A (en) * | 2000-05-26 | 2001-12-11 | Diadexus Inc | Method of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating colon cancer |
| WO2002046226A2 (en) * | 2000-12-08 | 2002-06-13 | Novo Nordisk A/S | Trefoil factor 2 (tff2) peptides with moiety attached to asn15 |
| US7538082B2 (en) | 2001-04-24 | 2009-05-26 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions for treating oral and esophageal lesions |
| JP2005503340A (ja) * | 2001-04-24 | 2005-02-03 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション | 口腔および食道病変の治療のための方法および組成物 |
| EP1842858A3 (en) * | 2001-04-24 | 2008-04-02 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions for treating oral and esophageal lesions |
| JP2004534075A (ja) * | 2001-06-14 | 2004-11-11 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | Ｔｆｆダイマーペプチドによる粘膜修復 |
| RU2224797C2 (ru) * | 2002-04-04 | 2004-02-27 | Эльдаров Михаил Анатольевич | Рекомбинантная плазмидная днк pacyclans для переноса и экспрессии в клетках escherichia coli гена l-аспарагиназы erwinia carotovora (ecar-lans) и способ получения рекомбинантной ecar-lans из биомассы штамма e.coli-продуцента |
| WO2003068817A1 (en) * | 2002-02-11 | 2003-08-21 | Novo Nordisk A/S | Management of mucosal viscosity by tff monomer peptides |
| MXPA04009363A (es) * | 2002-03-26 | 2005-01-25 | Gen Hospital Corp | Terapia de combinacion usando peptidos trifolios. |
| EP2033662B1 (en) | 2004-01-21 | 2012-10-17 | Novo Nordisk Health Care AG | Transglutaminase mediated conjugation of peptides |
| RU2012156256A (ru) | 2010-06-04 | 2014-07-20 | ТРИФОЙЛИУМ АпС | Факторы трилистника (tff) для лечения хронических заболеваний легких |
| CN102526702A (zh) * | 2010-12-23 | 2012-07-04 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 小肽tff3治疗代谢综合征的用途 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NO884054D0 (no) * | 1988-09-13 | 1988-09-13 | Bio Tech As | Nytt pentapeptid og fremgangsmaate for fremstilling derav. |
| WO1992014837A1 (en) * | 1991-02-14 | 1992-09-03 | The General Hospital Corporation | Intestinal trefoil proteins |
-
1995
- 1995-08-25 AU AU33415/95A patent/AU694796B2/en not_active Ceased
- 1995-08-25 MX MX9701239A patent/MX9701239A/es active IP Right Grant
- 1995-08-25 AT AT95929783T patent/ATE329929T1/de active
- 1995-08-25 PL PL95318785A patent/PL184516B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-08-25 KR KR1019970700968A patent/KR100255911B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1995-08-25 CA CA002196876A patent/CA2196876C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-08-25 PT PT95929783T patent/PT777687E/pt unknown
- 1995-08-25 ES ES95929783T patent/ES2267104T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-25 CN CN95194798A patent/CN1070867C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-08-25 HU HU9801427A patent/HU226921B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-08-25 DE DE69535060T patent/DE69535060T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-25 RU RU97104484/13A patent/RU2162857C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-08-25 WO PCT/DK1995/000343 patent/WO1996006861A1/en not_active Ceased
- 1995-08-25 JP JP8508422A patent/JPH10504720A/ja not_active Ceased
- 1995-08-25 CZ CZ1997548A patent/CZ289705B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-08-25 EP EP95929783A patent/EP0777687B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-25 UA UA97020840A patent/UA68324C2/uk unknown
- 1995-08-25 EP EP06115209A patent/EP1739091A1/en not_active Withdrawn
- 1995-08-25 DK DK95929783T patent/DK0777687T3/da active
- 1995-08-25 BR BR9508773A patent/BR9508773A/pt not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-02-25 NO NO19970844A patent/NO323642B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-02-25 FI FI970783A patent/FI119989B/fi not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-10-13 CZ CZ19993618A patent/CZ289864B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-11-28 JP JP2001363220A patent/JP4156829B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-12-20 JP JP2006343522A patent/JP2007161720A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100611130B1 (ko) | 식욕억제펩티드로이루어진약학적조성물의사용 | |
| Thim et al. | Characterization of human and rat intestinal trefoil factor produced in yeast | |
| US5912229A (en) | Use of a pharmaceutical composition comprising an appetite-suppressing peptide | |
| US5783416A (en) | Human spasmolytic polypeptide in glycosylated form | |
| AU694796B2 (en) | Trefoil peptide dimer | |
| EP1341817A2 (en) | Tff peptides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20130825 |