UA68324C2 - Dimers of "cloverleaf" peptide (variants), method for their production (variants) and pharmaceutical composition (variants) - Google Patents

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение касаєется дилеров "клеверньїх" пептидов, способов получения дилеров "клеверньмх" 2 пептидов, фармацевтических составов, включающих димерь "клеверньх пептидов", и их применения для лечения желудочно-кишечньїх расстройств. "Клевернье" пептидь! образуют семейство пептидов, обнаруживаемьх в основном в желудочно-кишечном тракте. "Клевернье" пептидьї млекопитающих содержат один или более характерньх доменов в форме клеверного листа |1), каждьй из которьїх собран из аминокислотной последовательности, состоящей из 38 или 70 39; аминокислотньїх остатков, в которой б остатков полуцистина соединень в сочетаниий 1-5, 2-4 и 3-6, образуя таким образом характерную структуру в виде клеверного лиота.

Известнье к настоящему времени "клевернье" пептидь! млекопитающих содержат или один, или два домена в форме клеверного листа (см. обзорь! |3-51), в то время как для лягушки Хепориз Іааміз описаньї пептидь и белки, содержащие один |бЇ, два |7|, четьіре |8) или шесть І9Ї доменов в форме клеверного листа. "Клеверньіми" 712 пептидами млекопитающих, содержащими один домен, являются связанньй с раком молочной железь ро2-пептид, известньій к настоящему времени для человека |10, 11) и мьіши (12), и кишечньій "клеверньй" фактор (ІТЕ) человека (13, 14) и крьісьі (15, 16). Для человека |17)" свиньи |18) и мьіши І17| описан спазмолитический полипептид (ЗР), содержащий два домена в форме клеверного листа. у людей все три "клеверньїх" пептида - проа2, ПІТЕ и п5Р - зкспрессируются в норме в желудочно-кишечном тракте: ПОР и Прза2 - в зпителиальном слое слизистой оболочки желудка |17, 19), а ПІТЕ - в зпителиальном слое слизистой оболочки танкой и толстой кишки (131.

Физиологическая роль "клеверньх" пептидов не очень хорошо вьіяснена. Сообщалось об усилений зкспрессии "клеверньх" пептидов в желудочно-кишечном тракте для ряда состояний, связанньх с повреждением слизистой оболочки, таких как воспаление кишечника (20-22), язва желудка и с двенадцатиперстной кишки (20, 23, 24). На оснований зтих данньїх била предложена репаративная функция Ге) "клеверньїх" пептидов (например в |221). Недавно авторами работ (|25-27| бьіло получено доказательство ускорения восстановления поврежденной зпителиальной слизистой оболочки в результате действия "клеверньїх" пептидов. Механизм, с помощью которого "клевернье" пептидь! способствуют вьіполнению их репаративной функции, может заключаться в образований сшивок между муциновьми гликопротеинами с М формированием вязкоупругого глеевого слоя, устойчивого к действию ферментов пищеварения І|З,281І. с

Клонирование однодоменного "клеверного" фактора кишечника крьісьії и человека и его применение для лечения повреждений желудочно-кишечного тракта описань! (291. о

Обнаружена возможность получения димеров "клеверньіїх" факторов, имеющих только один домен в форме о клеверного листа и обладающих интересньіми фармакологическими свойствами.

Зо В соответствии с зтим настоящее изобретение касается "клеверного" пептида, содержащего единственньй о домен в форме клеверного листа и существующего в виде дилера.

Как отмечено вьіше, предполагают, что "клевернье" пептидь! способствуют заживлению пептических язв и других повреждений, относящихся к слизистой оболочке, благодаря стабилизации слизистого слоя кишечного « тракта, механизм подобной стабилизации в настоящее время не известен. Тем не менее рентгено-структурньй З анализ (ср. Ї28)) панкреатического спазмолитического полилептида (РЗР) свиньи, образующего два домена в с форме клеверного листа, показал, что большинство имеющихся в наличии аминокислотньїх остатков принимают

Із» участие в формирований щели шириной 8-10А", обнаруживаемой в каждом таком домене. Предварительнье зксперименть! показали, что зта щель способна вмещать часть олигосахаридной цепи, например углевода, связанного с муциновьім гликопротейином. Если зто так, то РР с двумя подобньми щелями могут сшивать молекуль! муцинов друг с другом, помогая им образовьвать защитньй гель, покривающий зпителий слизистой б оболочки. Сейчас неизвестно, образуют ли іп мімо димерь! для осуществления схожей функции однодоменнье

Ге | "клеверньсе" пептидь! (такие, как ІЕТ и р5З2) или у них другой механизм действия. Тем не менее, в настоящее время считается, что димерь! таких "клеверньїх" пептидов действительно могут сшивать молекуль! муцинов, о являясь позтому активной формой зтих пептидов. ка 20 Другой аспект настоящего изобретения касаєтся способа получения димера "клеверного" пептида, содержащего единичньй домен ов Форме клеверного листа, способ, включающий культивирование

Т» соответствующих клеток-хозяев, трансформированньїх ДНК с последовательностью, кодирующей "клеверньй" пептид, содержащий один домен в форме клеверного листа, в условиях, позволяющих наработку пептида, и вьіделение из культурьї образующегося димера "клеверного" пептида. 25 Следующий аспект настоящего изобретения касается фармацевтических составов, включающих димер

ГФ) "клеверного" пептида, содержащий единственньй домен в форме клеверного листа, совместно с юю фармацевтически приемлемьм разбавителем или носителем.

Еще один аспект настоящего изобретения касается применения димера "клеверного" пептида, содержащего один домен в форме клеверного листа, в качестве лекарства и использования димера "клеверного" пептида, 60 содержащего один домен в форме клеверного листа, для получения лекарства с целью профилактики и лечения желудочно-кишечньїх расстройств.

Димером "клеверного" фактора может бьїть, в частности, димер кишечного "клеверного" фактора (ІТЕ) или пептида, связанного с раком молочной железь (рзг).

В частности, "клеверньім"' фактором является человеческий ІТЕ, последовательность аминокислот 62 мономера которого вьіглядит следующим образом:

2ЕХМУСІ ЗАМОСАМРАКОКМОСОУРНМУТРКЕСМ

МАОСССЕРОЗКІРОМРУУСРКРІ ОБЕАЕСТЕ, где 7 представляєт собой остаток Сі, Сіп или ругОїІШ, или его гомолог, способньій димеризоваться и проявляющий схожую активность; или человеческий "р52, последовательность аминокислот мономера которого вьіглядит следующим образом: 2АОТЕТСТМАРКЕКОМСОЕРОМТРЗОСАМКОСС

ЕООТУКОМУРУСЕУРМТІОУРРЕЕЕСЕРБЕ, где 7 представляеєет собой остаток СіІШ, (іп или ругОІШ, или его гомолог, способньійй димеризоваться и 7/0 проявляющий схожую активность.

Гомологи ІТЕ и р52 охватьшвают пептидь! с тем же самьм характером расположения остатков цистеина и дмсульфидньїх связей (Фигл1) и оопределенной степенью сгомологии (в смьсле либо идентичности аминокислотньїх остатков в соответствующих положениях, либо наличия консервативньїх замен) в петлях 1,2 и 3. Гомология аминокислотной последовательности в области петель может варьировать в интервале от 1 до 10 /5 аминокислотньх остатков, а число аминокислотньх остатков в каждой петле (кроме остатков цистейна) - от 7 до 12, предпочтительно - от 9 до 10.

Гомологи ІТЕ и рбБ2 могут содержать одну или более аминокислотньїх замен, делеций или вставок.

Преимущественная природа зтих изменений такова, что они не влияют в значительной мере на сворачиваемость и активность белка. Размер небольших делеций обьічно составляет от 1 до З аминокислотньх го остатков в области петель и от і до 10 аминокислотньїх остатков в М- и С-концевьх областях; возможнь одиночнье амино- и карбоксиконцевье добавки, такие как аминоконцевой остаток метионина, небольшой линкерньій пептид до 10 аминокислотньїх остатков или небольшая добавка, облегчающая очистку, такая как полигистидиновьїй тракт, антигенньій зпитоп или связьівающий домен (общие принципь! см. в ІЗОЇ). Примерами консервативньїх замен могут бьіть замень! в райках группь! основньїх аминокислот (например аргинина, лизина, с об ПМотидина), кисльх аминокислот (например глутаминовой и аспарагиновой аминокислот), полярньх аминокислот (например глутамина и аспарагина), гидрофобньїх аминокислот (например лейцина, изолейцина, і) валина), ароматических аминокислот (например фенилаланина, триптофана, тирозина) и аминокислот с небольшим размером бокового радикала (например глицина, аланина, серина, треонина, метионина).

Для специалистов в данной области должно бьіть очевидньїм, что подобнье замень! могут бьіть проведень «Е зо для областей, отвечающих за функцию молекуль, в результате чего получается по-прежнему активньй полипептид, существеннье для активности настоящих "клеверньїх" пептидов аминокислоть! могут бьть с идентифицировань! в соответствии с известньіми специалистам методиками, такими как сайт-специфическийи (су аланин-сканирующий мутагенез ІЗ1). В последнем случав мутации вводят в каждьй из аминокислотньїх остатков молекульь и получаются мутантнье молекульь проверяют на биологическую активность (например, на со з5 Заживление слизистой оболочки, защиту слизистой оболочки, заживление язвь желудка) с целью со идентификации тех аминокислотньїх остатков, которніе отвечают за активность молекуль.

Возможен аллельньй вариант гомолога, т.е. альтернативная форма гена, которая получается в результате мутации, или измененньій пептид, кодируемьй мутантньм геном, но обладающий по существу такой же активностью как настоящий пептид. Следовательно, мутации могут бьїть "молчащие" (никаких изменений в « Кодируемом пептиде) или могут кодировать пептид с измененной аминокислотной последовательностью. в с Гомологом настоящего "клеверного" пептида кроме зтого может бьіть видовой гомолог, т.е. полипептид со

Й схожей активностью, происходящий из другого вида, например из мьіши, крьісьі, кролика, коровьі, свиньи или и?» лягушки.

В предпочтительной воплощениий динар "клеверного" пептида по изобретению имеет значение Молекулярного веса приблизительно 13000. Димер состоит из двух мономерньїх "клеверньїх" пептидов,

Ге» связанньїх дисульфидной связью между двумя остатками цистеина в положений 57 для ІГЕ-подобньх мономеров или в положений 58 для ре2-подобньїх мономеров. со Предпочтительньм является получение димера "клеверного" пептида с помощью технологий 2) рекомбинантной ДНК. С зтой целью последовательность ДНК, кодирующая "клеверньій" пептид, может бьть Ввіделена посредством создания библиотеки геномной или кКДНК и поиска в соответствии со стандартньми о методиками с помощью гибридизации с синтетическими олигонуклеотидньяй зондами І|З2| последовательности ї» ДНК, кодирующей пептид целиком или частично. Предпочтительной в рамках настоящего изобретения является кодирующая пептид последовательность ДНК человеческого происхождения, т.е. из биолиотеки геномной ДНК или КДНК человека.

Последовательность ДНК, кодирующую "клеверньй" пептид, также можно получить путем химического синтеза с помощью традиционньїх стандартньїх методов, например фосфоамида(и)тного метода, описанного в

Ф) ЇЗЗЇ, или метода, изложенного в |З4)Ї. В соответствий с фосфоамида(и)тньм методом олигонуклеотидь! ка синтезируются, например, в автоматическом ДНК-синтезаторе, затем очищаются, отжигаются, лигируются и клонируются в подходящих векторах. 60 Последовательность ДНК также может бьть получена с помощью полимеразной цепной реакции с применением специфических праймеров, как например описано в |З5, 36) или упомянутой вьіше работе |З21.

Последовательность ДНК, кодирующую "клеверньй" пептид, обьічно вводят в реконбинантньїй вектор, представляющий собой любой из векторов, пригодньїх для проведения процедур с рокомбинантной ДНК, и вьібор вектора часто зависит от природь! клетки-хозяина, в которую он должен бьїть введен. Так данньїй вектор б5 Может бьїть автономно реплицирующимся вектором, например, существуя вне хромосомь! и реплицируясь независимо от хромосомальной репликации, т.е. бьіть плазмидой. С другой стороньі, вектором может бьіть один из тех векторов, которне, попадая в клетку-хозяина, интегрируются в геном клетки-хозяина и реплицируются совместно с хромосомой(ами), в которую они интегрировань.

Предпочтительно, чтобьі вектор являлся зкспрессируемьм вектором, в котором последовательность ДНК, Кодирующая "клеверньй" пептид, оперативно соединена с дополнительньми участками, необходимьми для транскрипции ДНК. В общем случає зкспрессируемьй вектор происходит из плазмидной или вирусной ДНК или содержит злементьі обоих. Термин "операбельно соединена" означает, что участки организовань! таким образом, что функционируют во взаймодействий друг с другом для вьіполнения предназначенньїхх целей, т.е. транскрипция начинается на промоторе и проходит на всем участке ДНК, кодирующем полипептид. 70 Промотором может бьіть любая последовательность ДНК, демонстрирующая транскрипционную активность в вьбранной клетке-хозяине, происходящая из генов, кодирующих белки как гомологичнье, так и гетерологичнье клетке-хозяину.

Примерами подходящих для проведения транскрипции ДНК, кодирующей "клевернье" пептидьї, в клетках млекопитающих промоторов являются промотор 5М40 ІЗ7)Ї, промотор МТ-1 (промотор гена металлотионеина) 7/5 ІЗВ| или главньій поздний промотор аденовируса 2.

Примером соответствующего промотора для использования в клетках насекомьїх является полиздриновьй промотор ІЗ9, 40), Р1О-промотор (41), промотор основного белка вируса полиздроза Аціодгарна саїїогпіса І421, промотор "бьістрого" раннего гена і бакуловируса |43, 44| или промотор замедленного раннего гена бакуловируса ЗОК (43, 44).

Соответствующими промоторами для использования в дрожжевьїх клетках-хозяевах являются промоторь дрожжевьх гликолитических генов |45, 46), или генов алкогольдегидрогеназь! І47|Ї), или ТР11- |48), или

Арнг-4с-промоторь! |49).

Примерами подходящих для использования в нитчатьїх грибах как клетках-хозяевах промоторов являются, например, АОНЗ-промотор |50)Ї или (ріА-промотор. В качестве примеров других полезньїх промоторов можно сч ов привести промоторьі генов ТАКА-амилазь из А. огугаеє, аспарагиновой протеиназьй из КПіготисог тіепеї, нейтральной о-амилазь из І підег, кислотостабяльной о-амилазь! из А. підег, глюкоамилаз. (дІША) из А.підег і) или А. ажатогі, липазьі из Кпіготисог тіейпеї, щелочной протеазь из А. огугае, триозофосфатизамеразь из А. огулае или ацетамидазь из А. піди-І(апз. Предпочтительньми являются промоторьї! генов ТАКА-амилазь и дічА 7

Соответствующие промоторь указаньї, например, в (511 и 521. «І

Последовательность ДНК, кодирующая "клеверньй" пептид, кроме того, при необходимости может бьть оперативно связана с подходящим терминатором, таким как терминатор гена гормона роста человека |53| или, сч когда в качестве клеток-хозяев используются грибьї, терминаторь! ТРІ! І46Ї или АОСНЗ |50). Вектор также может со включать такие злементьї, как полиаденилатнье сигналь! (например из ЕІр-области 5М40 или аденовируса 5), последовательности, усиливающие транскрипцию (например знхансер 5М40), и последовательности, со усиливающие трансляцию (такие, например, как кодирующие РНКЬь аденовируса МА). Ге)

Рекомбинантньй вектор также может включать последовательность ДНК, дающую возможность вектору реплицироваться в рассматриваемой клетке-хозлине. Примерок подобной последовательности (когда клеткой-хозяином является клетка млекопитающего) является ориджин репликации ЗМ40.

Когда клеткой-хозяином является дрожжевая клетка, сосоответствующими последовательностями, дающими « возможность вектору реплицироваться, являются геньі репликации КЕР 1-3 и ориджин репликации дрожжевой 8 с плазмидь! ги. ц Вектор также может содержать селективньій маркер, например ген, продукт которого дополняет дефект "» клетки-хозяина, такой как ген дегидрофолатредуктазьі (ОНЕК) или ТРІ-ген Зспігозасспа-готусез ротбре (описанньій в І54Ї), либо ген, придающий устойчивость к лекарствам, например ампициллину, канамицину, тетрациклину, хлорамфениколу, неомицину, гигромицину или метотрексату. Для нитчатьїх грибов селективнье

Ге) маркерь! включают атабх, ругО, агов, піа) или 5с.

Для того чтобьї направить "клеверньїй" пептид, описанньій в настоящем изобретенийи, по секреторному пути со клетки-хозяина, в рекомбинантньй вектор может бьіть введена секреторная сигнальная последовательность 9) (известная также как лидерная последовательность, предпро-последовательность или предпоследовательность). Секреторная сигнальная последовательность присоединяется к последовательности о ДНК, кодирующей "клеверньй" пептид, в корректной рамке считьшания. Обьчно сигнальная «з» последовательность располагается с 5-конца последовательности ДНК, кодирующей пептид. В качестве секреторной сигнальной последовательности может применяться сигнальная последовательность, в норме ассоциированная с данньім пептидом, либо последовательность гена, кодирующего другой секреторньй белок.

Для секреции из дрожжевьїх клеток секреторная сигнальная последовательность может кодировать любой сигнальньій пептид, обеспечивающий зффективное направление зкспрессированного "клеверного" пептида в і) секреторньіїй путь клетки. Сигнальньмм пептидом может бьіть от природьї имеющийся сигнальньй пептид (либо іме) его функциональная часть) или синтетический пептид. Бьіло установлено, что соответствующими сигнальньми пептидами являются сигнальньй пептид о-фактора |54)|, сигнальньй пептид амилазьії слюнь! мьіши (55), 60 модифицированньій сигнальньй пептид карбоксипептидазь! (56), сигнальньій пептид ВАКІ дрожжей І|57| или сигнальньїй пептид дрожжевой аспарагиновой протеазь З (УАРЗ) І571.

Кроме зтого для зффективной секреции в дрожжах между сигнальной последовательностью и последовательностью ДНК, кодирующей "клеверньй" пептид, может бьть введена последовательность, кодирующая лидерньй пептид. Функция лидерного пептида заключается в том, что он позволяет 65 зкспрессированному пептиду направляться из зндоплазматического ретикулума в комплекс Гольджи и далее в секреторнье визикульї для секреций в культуральную среду (те. направляет зкспорт "клеверного" пептида через клеточную стенку или, по меньшей мере, через клеточную мембрану в периплазматическое пространство дрожжевой клетки). В качестве лидерного пептида может вьіступать лидерньій пептид дрожжевого о-фактора (его использование описано например в (54, 59-631). С другой стороньії, лидерньій пептид может бьть искусственньім, иньіми словами, не природньм. Синтетический лидерньй пептид может, например, бьть сконструирован, как описано в Іб64| или (65).

С целью использования в нитчатьїх грибах сигнальньій пептид можно удобно получать из гена, коюдирующего амилазу или глюкоамилазу из Азрегаїйиз вр., гена, кюдирующего липазу или протеазу из Кпіготисог тіепеї или липазу из Нитісоїа Іапидіпоза. Предпочтительньм является сигнальньій пептид гена, кодирующего 7/0 ТАКА-амилазу из А. огугає, нейтральную о-амилазу из А. підег, кислотостабильную о-амилазу из А. підег или глюкоамилазу иа А. підег. Соответствующие сигнальнье пептидь описань в (51) и |6б).

Для использования в клетках насекомьх такой сигнальньй пептид может бьіть получен на основе гена насекомого (ср. |67)), как, например, сигнальньй пептид предшественника адипокинетического гормона чешуекрьілого Мападиса зехіа (ср. |681).

Методики, применяемье для лигирования последовательностей ДНК, кодирующих "клеверньій" пептид, промотор и возможно терминатор и/или секреторную сигнальную последовательность, соответственно, и введения их в подходящие вектора, содержащие информацию, необходимую для репликации, хорошо известнь! специалистам в даной области (ср. например (|З21).

Клетка-хозяин, в которую вводят последовательность ДНК, кодирующую "клеверньй" пептид, может представлять собой любую клетку, способную продуцировать данньй пептид в димерной форме, включая клетки дрожжей, грибов и вьісших зукариотов.

Примерами соответствующих клеточньїх линий млекопитающих являются клеточньіе линий СОЗ (АТСС СК. 1650), ВНК (АТС СТІ 1632, АТСС ССІ 10), СНІ (АТСС ССІ 39) или СНО (АТСС СС 61). Способь трансфекции клеток млекопитающих и зкспрессии, введенньїх в них последовательностей ДНК описань в су работах (69-75).

Примерь соответствующих дрожжевьх клеток включают клетки Засспаготусез врр. или о

Зспігозасспаготусез звзрр. в особенности штаммь Засспаготусез сегемізіде или Засспаготусез Кіпйумегі.

Способьї трансформации дрожжевьх клеток гетерологичной ДНК и продуцирования в них гетерологичньїх полипептидов описаньії, например в |ІЗ8, 54, 76-78), каждьій из которьїх, таким образом, приведен в ссьілках. «І Трансформированнье клетки отбирают по фенотипу, определяемому по селективному маркеру, обьічно по устойчивости к лекарственному препарату или способности расти в отсутствий определенного компонента сч питательной средьії, например, лейцина. Предпочтительньім для использования в дрожжах является вектор со

РОТІ, описанньїй в (76). Последовательности ДНК, кодирующей "клеверньій" пептид, может предшествовать сигнальная последовательность, а возможно и лидерная последовательность, как, например, описано вьіше. со

Другими примерами соответствующих дрожжевьх клеток являются штаммь! Кісумеготусез, такие как К.Іасіів, Ге)

Напгзепшціа, например Н.роІутогрпа, или Ріспіа, например Р. равіогіз (ср. І79, 801).

Примерами других грибньїх клеток являются клетки нитчатьїх грибов, например Азрегайиз зрр., Мецйгозрога взрр.., Еизагішт зрр. или Ттгісподегта зрр. в особенности А. огугає, А. піди-(апа, А. підег. Применение «

Азрегоайиз зрр для зкспрессии белков описано, например, в (51, 81, 82), Трансформация Р.охузрогит может, например, бьіть проведена. Как описано в |83), а Тгісподегта зрр. - как в 84). - с Когда в качестве клетки-хозяина используется клетка нитчатого гриба, она может бьіть трансформирована ц сконструированной по настоящему изобретению ДНК посредством интеграции последней в хромосому "» клетки-хозлина для получения рекомбинантной клетки-хозяина. Как правило, считается, что подобная интеграция имеет то преиймущество, что введенная последовательность ДНК будет более стабильно поддерживаться в клетке. Мнтеграция сконструированньх последовательностей ДНК в хромосому

Ге») клетки-хозяина может бьіть осуществлена в соответствии с общепринятьми способами, например посредством гомологичной или гетерологичной рекомбинации. со Трансформация клеток насекомьх и продукция в них гетерологичньїх полипептидов может бьть о осуществлена, как описано в патентах |З39, 42-44, 85), включенньїх здесь в список литературь». В качестве Кклеточньїх линий насекомьїх, используемьх как клетки-хозяева, подходит клеточная линия І ерідоріега, о например клетки Зродоріега їидірегда или клетки Тгіспоріивіа пі (ср.І86Ї). Для культивирования подходят «з» условия, описанньсе, например, в І87| или 88) либо в любой из виішеупомянутьх ссьлок.

Подвергнутье трансформации или трансфекции описаннье вьше клетки-хозяева далее культивируют в соответствующей питательной среде в условиях, допускающих зкспрессию "клеверного" пептида, после чего образовавшийся пептид полностью или частично может бьть вьіделен из культурь в димерной форме. В качестве средьі культивирования можно использовать любую общепринятую среду, пригодную для роста і) клеток-хозяев, например минимальную или комплексную среду, содержащую соответствующие добавки. іме) Подходящие средьй являются коммерчески доступньми или их можно приготовить в соответствии с опубликованньми рецептами (например в соответствии с каталогами Атегісап Туре Сийиге Со! Іесііоп). бо Продуцируемьй клетками "клеверньій" пептид далее может бьїіть вьіделен из культуральной средь! с помощью общепринятьїх методик, включающих отделение клеток-хозяев от средьі посредством центрифугирования или фильтрования, осаждение белковьїх компонентов супернатанта или фильтрата с помощью соли, например сульфата аммония, очистку с использованием разнообразньх хроматографических методик, например ионообменной хроматографии, гель-фильтрации, аффинной хроматографии или им подобньх в зависимости от 65 типа рассматриваемого полипептида.

Димер "клеверного" пептида можно вводить в фармацевтический состав по изобретению согласно любому из устоявшихся методов приготовления фармацевтических составов, например, как описано в |89). Такой состав может бьїть изготовлен в пригодной для систематических иньекций или инфузий форме и таким образом может включать стерильную воду или изотонический раствор соли либо глюкозьі. Составьії можно стерилизовать о помощью стандартньїх методик стерилизации, хорошо известньїх специалистам в данной области. Полученнье воднье растворьї можно сразу упаковать для использования или профильтровать в асептических условиях и вьісушить лиофильно; лиофилизованньій препарат перед введением смешивают со стерильньм водньм раствором. Фармацевтический состав может содержать фармацевтически приемлемье добавочнье вещества, необходимье для приближения к физиологическим условиям, такие как забуферивающие агенть, 7/0 регулирующие тонус вещества и им подобньєе, например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и т.д.

Фармацевтический состав по настоящему изобретению также может бьїть адаптирован для назального, трансдермального и ректального введения. Фармацевтически приемлемьй наполнитель или разбавитель, используемьій в состава, может представлять собой любой традиционньій твердьій наполнитель. Примерами /5 твердьх наполнителей являются лактоза, терра альба, сахароза, тальк, желатин, агар, пектин, аравийская камедь, стеарат магния и стеариновая кислота. Подобньмм же образом наполнитель или разбавитель может включать любой известньй специалистам способствующий вьіведению материал, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, один либо в снеси с парафином. Содержание твердого наполнителя будет широко варьировать, однако обьічно будет находиться в интервале от 25мг до г.

Концентрация "клеверного" пептида в таком составе может изменяться в широких пределах, например от приблизительно 5956 до приблизительно 10095 по весу. Предпочтительная концентрация лежит в области 50-10095 по весу. Стандартная доза для такого состава обьічно может содержать от приблизительно 1мг до приблизительно 20О0мг, предпочтительно от приблизительно 25мМг до приблизительно 75мг, в частности, приблизительно 5Омг пептида. сч

Согласно указанному вьіше считается, что представляемьй в данном изобретениий димер "клеверного" пептида является активной формой указанного пептида. В связи с зтим предполагается, что он будет полезнь!м і) в случае применения его с целью предупреждения или лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта.

Более конкретно предполагается использование его для лечения желудочньїх или пептических язв, воспалительньх заболеваний кишечника, болезни крона или повреждений кишечного тракта, вьзванньх «Кк зо радиационной терапией, бактериальньми либо другими инфекциями и т.д. Доза полипептида, вводимого пациенту, будет изменяться в зависимости от типа и тяжести состояния лечащегося, но обьічно лежит в с интервале 0,1-1,Омг/кг веса тела. с

Дальнейшие детали настоящего изобретения описьіваются в примере со ссьілками на прилагаемьсе рисунки, где со

Фиг.1 Предполагаемая структура кишечного "клеверного" фактора (ІТЕ) человека, первичная «о аминокислотная последовательность взята из работь! (14), а дисульфиднье связи расставлень! исходя из гомологии с РР и рБіа2 |З.

Фиг.2 Обращенно-фазная ВЗЖХ супернатанта из дрожжевого штамма НМУ756, зкспрессирующего ІТЕ крьсь, на колонке Мудас 214ТРБА. «

Фиг.3 Монообменная хроматография частично очищенного ІТЕ человека на колонке с Раві Ріо з с ЗР-Сефарозой. Количество мономера и димера ІТЕ человека определяли с помощью аналитической ВЗЖХ.

Окрашеннье прямоугольники указьівают фракции, собраннье для дальнейшей очистки мономерной и димерной ;» форм. Пунктирная линия соответствует концентрации Масі в злюирующем растворителе.

Фиг.4 Обращенно-фазная ВЗЖХ очищенньх димера ІТЕ крьсь (А), мономера ІТЕ человека (В) и димера ІТЕ человека (С) на колонке Мудас 214ТР54 С4. Пунктирная линия показьівает концентрацию ацетонитрила в б злюирующем растворителе.

Фиг.5 Масс-спектрьї очищенньх ІТЕ крьсь (димера) (А), ІТЕ человека (мономера) (В) и ІТЕ человека (димера) со (С). 2) Фиг.6 Структура димерной форми ІТЕ человека.

Фиг.7 Рестрнкционная карта плазмидьі КЕМ 1003. ю Фиг.8 Конструкция плазмидьі рНМУУ756. ї» Фиг.9 Конструкция плазмидьі рНУУ1о66.

Пример

Материаль и методь

Клонирование ІТЕ крьгсь (гІТЕ) и ІТЕ челолвека (ПІТЕ)

Клонирование ІТЕ крьсь и человека вьіполняли, как описано в |15, 16, 29) (пе) и (13, 14) (ПІТЕР).

Ф) Конструирование плазмид, зкспрессирующих гіТЕ и пІТЕ ка Согласно схемам, приведенньїм на Фиг.7-9, били сконструированьії зкспрессирующие плазмидь! рНУУ756 для секреции ІТЕ крьісьї и рНУУ1066 для секреции ІТЕ человека. Зкспрессирующий дрожжевой вектор РКЕМ1О0О0З бо (описан в І90)) представляет собой производную плазмидь! СРОТ (91). Он содержит в качестве селективного маркера ТРІ-ген Зспігозасспаготусез ротбре (РОТ) І5ЗІ, промотор триозофосфатизомеразь 5. сегемівіае (ТРІ) и терминатор, контролирующий зкспрессию |4610

Ген ІТЕ крьіїсьї первоначально клонировали в Віцезсгірі І Ке(-) (5ігаїадепе), из которого его размножали в соответствии с Фиг.8. Вспомогательньй вектор раХ54, обеспечивающий полезнье для клонирования сайтьї, б5 боставлен из рОсС18 и рОМІТО50 192). Синтетический ДНК-линкер Мсо1-РЯМІ имеет следующую последовательность нуклеотидов:

1858: 5-САТООСТОАААСАТТОСААААСАСАСААО

АСТТСОТТОСТТТОТСТССАТССС ААТОТ-3 58 н.п. 1862: 5-ТТООбАТОСАСАСААДАССААСОААСТСТТО

ТСТСТТТТССТСТТТСАСС -3 51 н.п.

Линкер кодирует 8 С-концевьїх аминокислот лидерной последовательности, как описано в (93), с несколькими изменениями в вьборе кодонов, а М-концевая часть гена ІТЕ крьісьь имеет следующую последовательность: ОБЕМОЇ 5РБОС, Сигнальная и лидеркая аминокислотньюе последовательности описань там же: 70 МКАМЕРІ МІ. ЗГІВЕСМАОРМТООЕБЗМЕІРЕЕБІШАЕ

МТТГАММАМАЕКГЕКНК.

Ген человеческого (ТЕ клонировали в РИОС19 и размножали в соответствии с Фиг.9. Синтетический

ДНК-линкер Мсо1-ВзаА! имеет следующую последовательность: 2292: 5-САТООСТОАААСАТТОСААААСАСА

СААСААТАС-3' 34 н.п. 2287: 5-СТАТТСТТСТСТСТТТТССААТСТТТСА

СО-3 30 н.п.

Линкер кодирует в С-концевьїх аминокислот лидерной последовательности, как описано для конструкции

ПТБ, а тремя М-концевьіми аминокислотами гена ПІТЕР являются ЕЕМ. Сигнальная и лидерная го последовательности такие же, как и ранее.

Зкспрессирующими плазмидами трансформировали штамм 5. сегемізіае МТ 663 (Е2-78 Х Е11-36 а/о, бірі/5ірі, рер 4-3/рер 4-3) с селекцией по росту на глюкозе в качестве единственного источника углерода.

Дрожжевье трансформанть!, зкспрессирующие ІТЕ крьісьї и человека, бьіли названьі НУМУ75б и НУУ1066, соответственно. Га

Ферментации

Описаннье вьіше трансформанть! культивировали в течение 72ч. при З0"С в дрожжевой пептон-декстрозной і) (УРО) среде (94), дополненной дрожжевьм зкстрактом (бОг/л). По окончаний ферментации бьіли достигнуть значения оптических плотностей при ббоОнм равнье 153 МИ 232 для НУУ75б6 (ПТЕР) и НМУУ1ТО66 (ПІТЕР), соответственно. По окончанимй ферментации рН подводили до 2,5 с помощью 1М фосфорной кислотьі и «Ж дрожжевне клетки удаляли центрифугированием при З00боб/мин в течений 15мин.

Очистка ракомбинантного гІТЕ с

Концентрацию "ТЕ в дрожжевой ферментационной питательной среде и фракциях, полученньїх во время со очистки, измеряли с помощью аналитической ВОЗЖХ. Аликвоть! (обьічно 50-200мкл) наносили на С4

ВаЖХ-колонку (0,46х25см) Мудас 214ТРБ4 для обращенно-фазной хроматографии, уравновешенную 0,190 (м/м) со ТЕА в 1595 (М/М) ацетонитриле, при З0"С и скорости потока 1,5мл/мин. После 1Омин изократического «о злюирования концентрацию ацетонитрила в злюирующем растворителе увеличивали в течение 40мин. до 5595.

Измеряли поглощение при 214нм. Вьіли обнаруженьі три пика, злюирующиеся с временами удерживания 26,Бмин., 27,3мин. и 28,2мин. (Фиг.2), представляющие собой димернье формь! гТЕ. Количество пептидов « определяли, используя калибровочньій пЗР-стандарт (931.

Уровень зкспрессии рекокбинантного ІТЕ крьїсь! в данной дрожжевой системе составлял 113Змг/л. - с С помощью центрифугирования из ферментера вместимостью 10л бьіло вьіделено 8,7л ферментационного ц бульона. Для понижения проводимости супернатант бьіл разбавлен 14,8л дистиллированной водьі, образец "» наносили на колонку (5х42см) с ЗР-Сефарозой Раві Ріомж/ (Рпаптасіа) при скорости потока бООмл/ч. Перед использованием колонку уравновешивали 5Омм формиатньїм буфером рн 3,7. ІТЕ крьісьї злюировали с колонки

БОмм муравьиной кислотой рН 3,7, содержащей 50МмМ Масі. В процессе хроматографии при скорости потока

Ге) бООмл/ч отбирали фракции обьемом по 10Омл, которне анализировали на содержание гіТЕ. Фракции с предьідущей стадии, содержащие гіТЕ, обьединяли (2,3л) и наносили на колонку (5Хх1Осм) с Атбрегайготе

Ме (0-71). Перед использованием колонку уравновешивали 10ММ аммоний-ацетатньм буфером рН. 4,8 при о скорости потока 0,б5л/ч. После нанесения колонку промьівали О0,5л уравновешивающего буфера и злюировали 1ОнМ аммоний-ацетатньм буфером рН 4,8, содержащим 6095 (М/М) зтанола, при скорости потока 0,1л/ч. о Отбирали фракции, содержащие гІТЕ, обьемом 1Омл. Концентрацию зтанола в обьединенньїх фракциях

ГТ» повьшали от 6095 (М/М) до 87905 (М/М) добавлением 2 обьемов зтанола (99,995, М/М) и, охлаждая полученную смесь до температурь! минус 257С в течение 16ч., осаждали гіІТЕ.

Осадок собирали центрифугированием в течение 1ч. при 100009 и -257С и перерастворяли при комнатной температуре в 130мл 20мМ муравьиной кислоть рН 3,0. Образец наносили на колонку (5х20см) с ЗР-Сефарозой

Раві Ріож/ (Ріпагтасіа) при скорости потока 5Омл/ч. Перед использованием колонку уравновешивали 20мММ і) муравьиной кислотой рН 3,0. Пептидьі! злюировали с колонки с помощью линейного градиента, составленного из ко 1,5л 5ОММ муравьиной кислоть, рН 3,0 и 1,5л муравьиной кислоть, рН 3,0, содержащей 0,5М Масі. В процессе хроматографии при скорости потока 8Омл/ч отбирали фракции (1Омл), в которьїх измеряли оптическую бо плотность при длине волньі 280нм. В отобранньїх фракциях измеряли содержание гІТЕ, после чего фракции, содержащие гІТЕ, обьединяли. Дальнейшую очистку ІТЕ крьісьі проводили с помощью препаративной ВОЖХ. обьединеннье фракции (90Омл) наносили на препаративную С4 ВЗЖХ-колонку (2,2х25см) Мудас 214ТР1022, уравновешенную 0,195 (м/м) ТЕА. Пептидьії злюировали при 25"С и скорости потока 5мл/мин с помощью линейного градиента (540мл), составленного из МесмМм/Н»О/ТРА (10:89,9:0,1 у/м/м) и Месм/НьоО/ТРА (65:34,9:0,1 65 М/М/М). Регистрировали поглощение в ультрафиолетовой области при длине волньі! 280нм, отбирали фракции обьемом 10мл и анализировали их на содержание гІТЕ. Содержащие гІТР фракции обьединяли, и полученньй раствор уменьшали в обьеме до 3095 центрифугированием под вакуумом. Окончательное вьіделение гіТЕ осуществляли лиофилизацией. Общее количество гІТЕ, полученное из 8,7л ферментационной средь, составило 23бмг, что соответствует общему 2495 вьіходу по всем зтапам очистки.

Очистка рекоибинантного ПІТЕ

Концентрацию ПІТЕ в дрожжевой ферментационной питательной среде и фракциях, полученньїх во время очистки, измеряли с помощью системьї ВЗЖХ, идентичной описанной для гІТР. Бьіли обнаружень! два пика, злюирующиеся с временами удерживания 21,2мин. и 27,1мин. (Фиг.2), представляющие собой по данньім масс-спектрометрийи и анализу последовательностей димерную и мономерную формь! ПІТЕР. Уровень зкспрессии 70 рекомбинантного ІТЕ человека в данной дрожжевой системе составил З9Омг/л.

С помощью центрифугирования из ферментера вместимостью 10л бьіло вьіделено 8,0л ферментационного бульона. Образец диализовали против З смен (каждая длительностью 24ч.) по 40л 10ММ муравьиной кислоть, рн 2,5. образец наносили (0,25бл/ч) на колонку (5х4О0см) с 5Р-сефарозой Раві Ріом/ (Рпаптасіа), колонку промьівали бл 20мММ муравьиной кислотьії, рн 2,5 и бл муравьиной кислотьї, рн 2,5, содержащей 1М Масі.

Отбирали фракции обьемом по 100мл и анализировали их на содержание ПІТЕ (Фиг.3). С колонки бьіли злюированьї две формь! ПІТЕ, одна из которьїх представляла мономерную форму (злюируется при 0,5М масі), а другая - динер ПІТЕ (злюируется при 0,78М Масі). Фракции, соответствующие каждой из форм, обьединяли по отдельности.

Каждую из двух обьединенньїх фракций долили на три равнье части (обьеемом примерно по 7О0мл) и 2о наносили на колонку С4 Мудас 214ТР1022 (2,2х25см), уравновешенную 0,195 (м/у) ТРА. Пептидь! злюировали при 257"С и скорости потока 4мл/мин с помощью линейного градиента (540мл), составленного из Месм/Ньо/ ТЕА (10:89,9:0,1 М/М/М) и Месм/НьО/ТРА (65:34,9:0,1 м/м/м). Поглощение в ультрафиолетовой области регистрировали при длине волньі 280нм, отбирали фракции обьемом 1Омл и анализировали их на содержание

ПІТЕ. с

Фракции, содержащие ПІТЕ (мономер) и ПІТЕ (димер), соответственно, обьеединяли и осаждали пептидьі, добавляя зтанол до концентрации 9095 (М/М) и ввідерживая смесь в течение 72ч. при -257С. Осадок собирали і) центрифугированием и лиофилизовали. Общее количество, полученное из 8,0л ферментационной средь, составило 256бмг для мономера ПІТЕ и 13Змг для димера ПІТЕ, что соответствует общему вьіходу по всем зтапам очистки в 5095 и 6595 для мономерной и димерной форм, соответственно. «г зо Характеристика реконбинантньх гІТЕ и пІТЕ

После гидролиза в ЄМ НСЇ в вакуумированньїх запаянньїх ампулах в течение 24, 48 и 96 ч образць (5Омкг) с бьіли проанализированьії на автоматическом аминокислотном анализаторе фирмь! ВесКтап (Моде! 121 МВ). с

Количество остатков полуцистина определяли в виде 5-8-(4-пиридилотил)производного после восстановления дисульфидньїх связей трибутилфосфинон І95| с последующий взаймодействием с 4-винилпиридином (961. со

Гидролиз образцов, обработанньїх 4-виниллпиридином, проводили в 4М метансульфоновой кислоте или ЗМ «о меркаптозтансульфоновой кислоте при 1107С в течение 24ч., как описано ранее. Анализ аминокислотной последовательности проводили с помощью автоматической процедурь! деградации по Здману, исльзования газо-фазовьйй секванатор Моде! 470А фирмь Арріїед Віозузіецп (971.

Масс-спектрометрический анализ осуществляли на системе АРІ І І! С/М5/М5 (Зсіех, ТпогппіїЇ, Опі, Сапада). « Тройной квадрупольньій прибор, позволяющий определить значение отношения массь к заряду (т/72) в в с интервале до 2400, соединен с интерфейсом для пневмозлектроспрея (назьіваемого также ион-спреем) (98, 991.

Введение образца осуществляли с помощью шприцевого инфузионного насоса (Заде Іпзігитепів, Сатрбгіаде, ;» МА) через вставной капилляр (внутр. д. 75мкм) при скорости подачи жидкости 0,5-1мкл/мин. Шкала т/2 прибора бьіла откалибрована с помощью однозарядньїх ионов аммониевого аддукта полипропиленгликолей (РРО) при единичном разрешении. Точность измерения масс обьічно превосходит 0,0290.

Ге» На фиг.4 показань! результатьї аналитической ВЗЖХ для очищенньїх НТЕ (фиг.4А) и ПІТЕ (фиг.4В и 4С).

Рекомбинантньійй НТЕ содержит смесь трех близких пептидов, для разделения которьїх не бьіло предпринято со никаких попьіток. В результате масс-спектрометрического анализа бьіли установлень! три основньїх значения 2) молекулярньїх весов - 13112,2; 13096, и 13078,8 (фиг.5А). Расчетное значение молекулярного веса для мономерной формь! ІТЕ крьісьі, в которой Суз-57 имеет свободную -ЗН группу, составляет 6558,3. Расчетное ю значение молекулярного веса для димерной формь ІТЕ крьсь (например, с 5-5 мостиком между двумя Суз-57) ї» составляет 13114,6. Из значений молекулярньїх весов, найденньїх для рекомбинантного ІТЕ крьсь, ясно, что все три пептида представляют собой димерную форму НТЕ. Для других "клеверньїх" пептидов, в которьйх

М-концевьім аминокислотньім остатком является СіІп, например РБР (17, 100), известно, что данньїй остаток в имеет тенденцию к циклизации с образованием пирролидонкарбоновой кислоть! (ругОІшШ). Для ІТЕ крьсь, имеющего предсказанную М-концевую последовательность (С1Іп-СІШ-РПе-МаІ-сІу, разумно предположить, что

Ф) М-концевой остаток Сіп также способен циклизоваться с образованием ругсіш. Подобное гіревращаниб будет ка приводить к уменьшению значения молекулярного веса ІТЕ крьісь! (динер) на 17 (один ругОіІй) или 34 (два ругОІш) единиц массьі, соответственно. Наблюдаемье значения молекулярньїх весов в 13096, и 13078,8 бо (Фиг.5А) соответствуют димерной форме ІТЕ крьсь, в которой один и, соответственно, два М-концевьїх остатка

СіІп зациклизованьї. Расчетнье значения молекулярньїх весов для зтих форм составляют 13097,6 и 13080,6, что находится в хорошем соответствии с зкспериментально полученньіми величинами. Таким образом, из данньїх

ВЗЖХ (Фиг.4А) и масс-спектрометрического анализа (Фиг.5А) вьітекает, что рекомбинантньй ІГР криьсь включает З различнье димернье формь!: одну, содержащую 2М-концевьх Сп; одну - с 1М-концевьм Сп и 65 1М-концевьїм ругоін; и одну - с 2М-концевьіми ругоіІй. В Таблице 1 приведен аминокислотньй состав ІТЕ крьсь, находящийся в хорошем соответствии с ожидаемьми величинами.

Фиг4В МИ 4С демонстрируют чистоту ПІТЕР (мономера) и ПІТЕ (димера), соответственно, по данньм аналитической ВОЖХ. Димерная форма (Фиг.4С) вьіглядит относительно чистой, в то время как для кономерной (Фиг.А4В8) создается видимость загрязнения материалом, злюирующимся перед пептидом. Однако при Вехроматографии материала основного пика получаєтся аналогичньй вид хроматограммь: (даннье не приводятся). По-видимому, зто в большей степени указьівает на нетипичное поведение ПІТЕ (мономера) при обращенно-фазной хроматографии, нежели на наличие примесей. Похожее поведение ранее мь! наблюдали для вьісокоочищенного Р5Р свиньи, а также оно отмечалось для рекомбинантного П5Р вьісокой степени очистки

І9ЗІ. 70 С помощью масс-спектрометрического анализа основного пика ПІТЕ (мономера) бьіло установлено значение молекулярного веса равное 6694,0 (Фиг.58). Значение молекулярного веса, рассчитанное на оснований аминокислотной" последовательности (Фиг.1), составляет 65744 в предположений, что Сувг-57 находится в -ЗН форме. Даннье секвенирования (Табл.Ії) показьівают наличие ожидаемой М-концевой последовательности: сіш-сІ-Туг-МаІ-СіІу-. Даннье аминокислотного анализа (Табл.І) показьвают ожидаєемье величиньі за /5 Мсключением наличия 7,3 (8) остатков цистеина. Наличие дополнительного остатка цистеина, соединенного с

Сув-57, может увеличивать значение молекулярного веса до 6694,7, что очень близко к величине, найденной с помощью масс-спектрометрии (6694,0). Ввиду зтого можно полагать, что в ЛІТЕ (мономере) остаток Сув-57 связан дисульфидной связью с дополнительнь!м остатком цистеина. Минорньій пик (Фиг.58) в масс-спектре может представлять собой другую производную Сувз-57 или может бьть обусловлен наличием в препарате 20 примеси.

Расчетное значение молекулярного веса ПІТЕ (димера), в котором два мономера соединеньї дисульфидной связью между двумя остатками Сув-57, составляет 13146,8. Зто значение находится в хорошем соответствии с величиной, определенной с помощью масс-спектрометрии (13147, Фиг.5С). Другой пик (13169) вероятно представляет собой Мав аддукт ПІТЕ (димера). Результатьь анализа аминокислотной последовательности сч 25 (Табл.Ії) и состава (Табл.І) также находятся в хорошем соответствии с ожидаемьми величинами.

Таблица 1 о

Аминокислотньй состав ІТЕ крион (димера), ІТР человека (моно- мера) и ІТЕ человека (динера) (кислота щі (динер) | 0 (мономер) | (димер). | с 5| Ах пе пз | яв Оп со

Тве 800 | (8) 2.03 (2 401 (9 со

Зег 9851 (10) 204 (2) «01 (4). 35 Сх 15.981.. (16) 6.92 (7 1400 (13) ке,

Рі 12.48 (1) пд (6) п.аг (п «-ю бу 603 | (6) 420 (3 8.09 (8) дів з (3 351 (4) 7-90 (В) «

Уа 11.92 (1) 4.92 (533 9.86 (103 ю Ме: 180 (3 0.00 (0) 0.00 (0) З с Пе 1.98 (3) 117 (7 213 (3 . 15 І го 3.92 (4) 2.03 (2) 3.89 (9 » те 3021 (3 194 (2 3.92 (3.

Рле 7.88 (8) 2.93 (З 5.24 Ї68)

Гу 14 (23 3.07 (3) 6.09 (6)

Ф Ні: бо 1 (0) 0.99 (» 03 ро (З

Тв тб (3 пд: (у пд: (23 со Ага 394 (9 2.96 (З 6.05 (6) о РЕ-Сує 12.70 (13 7.30 (п 13.80 (14) 4 ! т | Всего | 1 аз | (583. | (119)

Значения в скобках установлень на оснований «ДНК: ІТЕ крись (16), ІТР человека (141. І 8, Определено зкстраполяцией к нулевому времени гидролиза.

Ф) в) Определено с помощью гидролиза в 4 М метансульфокислоте. о що Не определено. 60 б5

Таблица ЇЇ

Результат автоматической деградации по Зздману ІТЕ крися (ди-

Мера), ІТЕ человека (мономера) М ІТЕ человека (димера) помер ІТР криси ІТЕ человека ІТЕ человека ! цикла (динер) (кононерв) шк димер) т 4

РТА-А,А. | Виход РТН-А.А, Ввиход вход (поль ! 70 ї і Г:мель)! | (пмоль) ; г 1 а 989 С 1517 ств 2227 2 Січ ті Сім 1998..| Сів 2361 к! Рне 967 Тут 2205 Туг 2528 то І Уа! 1072 Уа 2409 Уа 2431 51 5 Су 701 слу 1625 слу 1805 5 ги 855 Тем 2318 Іеч 2253 ! 7 Зег 491 бег 852 Зет 904 8 го 965 Аа 1729 Аа ПЗ 720 9 чег 406 Ап 1394 Авт БІ 10 сій 820 Сп 1494 са 1499 !

М (Суз) п.й. (Ст) п.д. (Суб) па. 12 Ме: 581 Аа 1243 Аа пт

Уаї 971 Уа 1458 Уа) 1350 | с 29 о Ртго 962 Рго 1223 Рго 1195 | о 15115 Аа 529 Ав 1248 Ав 1209 16 Авп 191 Їх 1270 Гу 1050. 17 ма 952 дер 937 Ар 991

ІВ Аго 331 Ав 891 Аге 964 « 30 19 Уаї 956 чаї 1002 Уа 1059 сч

М Ар 476 Азр 847 Ар 932 з | (у п.д. (Су) п.4. Суз па. со

Таблица Її со 35 Результати автоматичеаскай даградации по Зднану ІТЕ крнсь (ди- (Се) нера), ІТЕ человека (мономера) н ІТЕ человека (дикера) н ІТЕ криси | ІТЕ. человека | ОтТТЕ человека | « опер (динер) | (мономер) (димер) - 40 ! цик/их Р еестаннтннкккинятни ї Й с г і тн-А.А.| Виход | РТА-А.А. | Вшход | Виход (пноль) я 177 волю МАМО (поль) 2 сту 381 Суу 709 Су 703 45 23 Ту: 352 Тут 894 ти 792 о 24 Рго 37 |в 166 Рго хі

Таг 498 Ні: 309 Ні 236 со 26 Уа! 812 Уві 755 Маї 670 с 27 Тег 50 тв 365 Таг 516 й ре 23 ет 25 Ріо 458 Рго 473 г) 23 Сів 398 НК 444 ж 121

І» ки Сій 499, 3. Сів 219 Си зи 23 (Суг) п-д. (Сух) п.й. (Суб) па. рі дал 5 Ат 3Із Ап ХО ря 2 п 591 , Ап 464 Ап 301 й А 196 А 325 Аге 294 о 1515 су 222 |: Фу 239 сту 23 юю 35 (Ст) по, (Суз) п.д. (Суз) па. 37 (Су) п. (Су) п.й. (Суб) па їв Рне 335 Рне 189 РЕе 17 60 5 Ахр 275 вар 133 Ар 137 0 Зе: 154 ет 49 Зег 43 ми ше ША | 9525 92595 65 пинннанення пра нні Кв ин Ева ТЕ поли

Литература

1. Твіт, Г., Напзеп, М.Т., Могтів, К., Ноеодп, !І., Воеї, Е., Рогвігот, уУ., Аттегег, О., 5 Рі, Г. (1986) Ргос,

Май. Асад. Зої. 83, 6766-6770. 2. Тпіт, І. (1989) РЕВ5З І ей. 250. 85-50.

З. Тпіт, І. (1994) Оідевійоп 55, 353-360, 4. Роцізот, К., 5 МУгідчНі, М.А. (1993) Ат. 9. РНузіої!. 565, 5205-(3213. 5. Ноїйтапп, МУ., 5 Нашзег, Р. (1993) Ттепаз Віоспет. Зсі. 7, 239-243. 6. Нашзег, Р., 5 Ноїйтапп, МУ. (1991) 3. Віої, Спет, 266, 21206-21309. 7. Нашзег, Р., Коереп, С., 5 Ноїтапп, МУ. (1992а) 9. Віої. Спет. 267,14451-14455. 70 8. Нойтапп, МУ. (1988) У, ВіоІ. Снет, 263, 7686-7690. 9. Наийзег, Е., 4 Нойтапп, МУ. (199265) 9. Віо!Ї. Снет. 267, 24620-24624. 10. Чакомем, 5.В., Вгеаійпаси, К., Уеїесп, 9.-М., МавзіакомувКкі, Р., Спатроп, Р. (1984) Мисієвіїс Асіа Кез, 12, 2861 -2878. 11. Ра потіпе, 9.Р., ЕгідіІапеКку, Р., Ге Сипії, М., Адег, М., Мегсіег-Водаг, С., Ріспоп, М.-Р., 5 Міідгот, Е. (1985) ОМА 4, 11-21. 12. Іетермге, О., Мої, С., Кедіпдег, М., Спепага, М.-Р., Тотазецно, С., Спатброп, Р., 5 Кіо, М.С. (1993) 3.

Сеї, Віої. 122, 191-198. 13. Родоїзку, О.К., Її упсп-Оемапеу, К., Бім, 9.Ї., Оайез, Р., Мигдце, В., ОеВеашйтопі, М., Запаз, В.Е., 5

Макіаа, У.К. (1993) 9. Віої, Спнет. 268, 6694-6702. 14. Нашзгзег, Е., Роцізот, К., СВпіпегу, К., Кодегз, Г.А., Напру, А.М., МУгідні, М.А., Нойтапп, МУ. (1993) 15. бетогі, 5., упсп-ЮОемапеу, К., 5 РодоїзКу, О.К. (1991) Ргос, Маїй).. Асад. 5сі. 88, 11017-11021. 16. Спіпегу, К., Роцівот, К-, Кодегв, Г.А., УеПегу, К.Е., Гопдогой, У.М., Напру, А.М.. 5 МУгпідні, К.А. (1992)

Віоспет. .). 285, 5-8. 17. Тотазено, С., Кіо, М., Сашіег, С, Мої, С., Нагешцмепі. М., Спатбоп, Р., б І аїйпе, К. (1990) ЕМВО У. 9, сч 407-414. 18. Тіт, Г., дУогдепвеп, К.Н., 5 догдепзеп, К.О. (1982) Кеди. Реріідез 3, 221-230. (8) 19. Кіо, М.С., Веїоса, 9.Р., Юапіеї, 9У,М., Тотазецо, С., І аїпе, К., Спепага, М.Р., Ваїгепзспіадег. А., 5 Спатрбоп,

Р. (1988) 5сіепсе 241, 705-708, 20. Кіо, М.-С., Спепага, М.-Р., Мої, С., Магсейп, Г., Тотазено, С., І аї(йе, К., Веїоса, 9У.-Р., « Спатброп, Р. «г 1991) Савігоепіегоіоду 100, 375-379. 21. Роцівот, К., СПіпегу, К., затаї, С., Іаїапі, Е.-М., ейатр, Е., ЄЕїПа, (с., Мугідні М.А. (1992) с

Савзігоепіегоіоду 27, 17-28. с 22. ММпдні, М.А., Роцівот, К., 5іатр, с., мап Ногдеп, 5., Заїтаї, С, ЕМПа, с, Аппеп, О., деПегу, К.,

Ї опдсгоїї, У., Ріке, С., Кіо, М.С., Спатрбоп. Р. (1993) Савігоепіегоіоду 104, 12-20. со 23. Напру, А.М., Роцізот, К.,ЕїЇа, с., Зіпдй, 5., опдсгоїй, 9У.М., 5 Мугідні, М.А. (1993) 9. Раїйої. 169, 355-360. «о 24. МУП9Н, М.А., Ріке, С., б. ЕІа, О. (1990) Майшге 343, 82-85. 25. Відпазе, А., І упсп-ЮОемапеу, К., Кіпаоп, Н., Тіт, Г.., «« РодоїзКу, О.К. (1994) .). Сііп. Іпмеві, (в печати). 26. Ріаутюга, К.)., Магспрапк, Т., Спіпегу«х К., Емівоп, К., Рідпанеїйїї, М., ВоМоп, К., Тіт, Ї., 5 Напбру, А.М. (1994) СавігоепіегоІоду (в печати). « 27. Вабуагаку, ММУ., Тпіт, І. , Родоїзку, О.К. (1994) Савігоепіегоіоду 106, А43З (резюме). з с 28. Са|пнеде, М., Реїбегзеп, Т.М., Непгікзеп, А., Ребфезеп, 9У.Е.МУ., ОЮашіег, 2., МУйвоп, К.5., 5 Тіт, ГГ. (1993) . Бігисіцге 1, 253-262. а 29. МО 92/14837.

ЗО. Рога, ейаі. (1991) Ргоїеіп Ехргезвіоп апа Ригіїісайоп 2, 95-107. 31. Суппіпапат апа УУеїІз (1989) Зсіепсе 244, 1081-1085.

Ге» 32. ЗатрбгоокК, ейаІ., МоІесшіаг Сіопіпд: А І арогаїогу МапиаІ. Соїй Зргіпд Нагрог Іарогаюгу, Соїд, Зргіпд

Нагброг, Мем ХогкК, 1989. со 33. Веаисаде апа Сагицїпегз (1981) Теігапедгоп І еЦегз 22, 1859-1869. оо 34. Майнез, егаі!. (1984) ЕМВО .). 3, 801-805. 35. 05 4,683,202. ко 36. ЗаїкКі, еїа!. (1988) Зсіепсе 239, 487-491. ї» 37. Зубгатапі, еї.аі. (1981) Мої. Сеї! Віо!. 1, 854-864. 38. РаїІтісег, еїаі!. (1983) Зсіепсе 222, 809-814. 39. 05 4,745,051. 40. Мазимедап, ега). (1992) РЕВЗ ГГ ей. 311. 7-11. 41. Мак, У.М., ейа!. (1988) 93. Сеп. Мігоіоду 69, 765-776. (Ф, 42. ЕР 397 485. ка 43. 05 5,155,037. 44. 05 5,162,222. 60 45. Нігетанп, еї.а!. (1980) 9. Вісі. Спеп. 255, 12073-12080. 46. АІрег апа Камазакі (1982) 9. Мої. Аррі. Сап. 1, 419-434. 47. Моцпду, екаім. Сепеїйс Епдіпеегіпд ої Місгоогдапізте їог СПетісаю (НоМапдег ейаї., едв.), Ріепит

Ргезз, Мем/ ХогКк, 1982. 48. 05 4,599,311. 65 49. Киззеї, есаї. (1983) Майшге 304, 652-654. 50. МеКпіоні, есаї!. (1985) ЕМВО )). 4, 2093-2099.

51. ЕР 238 023. 52. ЕР 383 779. 53. Киззеї, Р.К. (1985) Сепе 40, 125-130. 54. 5 4,870,008. 55. Надеприспіе, О., еї.аі. (1981) Майшге 289, 643-646, 56. МаїІв, І..А., ейаі. (1987) Сеї! 48, 887-897, 57. МО 87/02670. 58. ЕдеІ-Мійапі, М., еїаіІ. (1990) Меаві 6, 127-137. 70 59. 05 4,546,082. 60. ЕР 16 201. 61. ЕР 123 294. 62. ЕР 123 544. 63. ЕР 163 529. 64. МО 89/02463. 65. МО 92/11378. 66. ЕР 215 594. 67. МО 50/05753. 68. 5 5,023,328. 69. Кацїтап апа Зпагр (1982) У, МІ. Віої. 159, 601-621. 70. оцет апа Вего (1982) 9. Мої. Аррі. Сепеї. 1, 327-341. 71. І субег, ейа). (1982) Ргос. Маї). Аеад. Зсі. ОБА 79, 422-426. 72. ММідіег, ега1!. (1978) Сеї! 14, 725. 73. Соггаго апа Реаггоп (1981) Ботаїйс СеїЇ Сепеїйісв 7, 603. сч 74. Стаійат апа мап дег ЕБ (1973) Мігоіоду 52, 456. 75. Метапп еї.аі!. (1982) ЕМВО .1,, 841-845. о 76. 005 4,931,373. 77. 05 5,037,743. 78. 005 4,845,075. «Е зо 79. СіІеезоп, ега!. (1986) 3. Сеп. Місгобріо!. 132, 3459-3465. 80. 05 4,882,279. с 81. ЕР 272 277. со 82. ЕР 184 438. 83. Маїагаїйег, еїаіІ. (1989) Сепе 78, 147-156. со 84. ЕР 244 234. со 85. 5 4,879,236. 87. МО 89/01029. 88. МО 89/01028. 89. Кетіпдіоп'є Рпагтасеціїса!| Зсіепсев, 1985. « 90. МО 90/10075. в с 91. КауазакКкі, с, Іпіегпайопа! Сопієгепсе оп МУеаві Сепейсв ап Моїіесшіаг Віоіоду, бЗері.17-24, 1984, . Едіпригой, 5сойМапа, Абзвіг. Р15. и? 92. Відегіснзеп, В., Роцівеп, 5.В-, догдепвеп, 5.Т. (1993) Ріаетіа 30, 312-315. 93. Тіт, ., Моїтів, К., Могтів, К., Міеізеп, Р.Р., Віогп, З.Е., СПгіеїепзеп, М., Рейегвзеп, .). (1993)

ЕЕВЗ І еїї. 318, 345-352.

Ге» 94. ЗПпептап, Р., Ріпк, С.К., 5 Ніскв, 9У.В. Меїйодз іп уеаві депеїйісв, СоЇй Зргіпд Нагрог І арогагу Ргезв.

Соа 5ргіпд Нагрог, МУ. со 95. Киедад, О.ТА., « Киаїіпдег, 9. (1974) Івг. 9. Спему. 12, 391-401. оо 96. Егіеатап, М., Кгиїї, Г.В., Саміпв, У, Р. (1970) 9. ВіоЇ. Спет. 245, 3868-3871. 97. Тпіп, Г., Напзеп, М.Т., 5 оегепзеп, А.К. (1987) РЕВЗ5 ГІ ей, 212, 307-312. де 98. Вгиїпв, А.Р., Сомеу, Т.К., 5 Непіоп, |.О, (1987) Апа). Спет. 59. 2642-2646. ї» 99. Сомеу, Т.К., Воппег, К.Р., Зпизпап, В.І., «« Непіоп, 9.0. (1988) Каріа Соттип. Мавв Зресігот, 2, 249-256. 100. Тпіт, Г., Тпотвзгеп, І., Снгівіепзеп, М., « догдепзеп, К.Н. (1985) Віоспет. Віорпув. Асіа 827, 410-418. (Ф) ко бо б5

; пк Я: Ше зо ох ово, ; оно я зв З Ф но се 5

«є "тийгиногайч - -

Гн о . в Ге

Ф с г -Н-- Гі й Фю х / щ ж х . 70 м ж ї м і. ж у я Я - з г) х тв Ж т

Е СДррнлявя

Кі х о ід й гч р. х г їх " й х З з гве . щ а є

Еш : «9 й -- 25 М Е о т

Ф х а о " о м с у - 30 ій се і ' | со ! (ге)

З

35 ! - (Се) ї ' Ш і 1 ' « 1 40 нин як с Ге! - г ;» в о З 5 ни РТ ий зинашоглон о --..0.000

Ге) Й . со ФИГО (95) ще

Я» (Ф) ко 6о 65

(Чуя/ти) еханопанв дтт х---х с з

Га т- - 2 о о х лк х к щі х в / у 4 10 х Ж , х очі Щі . х ї

І і г»: ШИ з х ст . І і 15 х В - х е- іч Фо ь Г- з

Ж

ТЯ

20 -о 5 іш - жк | т 9 ся Фо см 25 - у 9 о «в х х іх

Та З : І г М 1 ї.- 30 х ід х й

Б - й, о - ч - (ге) де

Ге) -8 ш « - 5 с

М о У а в.ли Го

Ф (и) Ттоем кипейтнепноя - 0. со . о о ге) Ф мо ву - їз» нн ов: ий зинепоузої ---..

ФиИГ.З (Ф) ко 6о 65 т ч во щ А в: "в ній їй х 0.06 «В тт дк

Е Я дет - е ! с ши ї е 0.04 о і ще ве 205 8 біда ; : « 8 ох о т бо ц - о В с й хо 0.05 одн м й ; т в) о а щи ї х 0.025 пен го Є

З ши : їй ; се зо В 0 й т й (ее) м (Се) х с ц 0 : «

Ф - й ш 2 м 003 що й з В шт 40 і

Е - - « 0.02 п--- З й Е т го ш нн Ж ИН з Б 001 ; (е)) г о (в) й ЕЙ со ЕЕ о с пинржн ие 50 . т Вреня (нин)| ЩІ й ФИГ.4 (Ф. ко бо б5 о і

Ф с т ре ; 2 в їси Е я х ше с

ГА. не шо т й о.

Гак з о т - і ші 5 8 я Фо . Ф о е :

Ех: щ

З ЩЕ

- б З о к 5 се

Ге ШІ

Фо й ва! шо « й - ге Ге) - - Й й

З в й т ц то 5 5 ж 7 о в Й 5 є з т с З й с Щ З . « й

І» 415 5 що Ге

Ф - мя с й со (хі чІронанонагни ЕкенчуавхизонІо (95) ю !

ФИГ.8 |/ їз» (Ф. ко бо б5

ЕХ ХХХІ

! г ва і

Я (т се г) / а 52) 8

Фе 7 8 13/ я че це З й | ія о (о) . НЕЕХЕХЕХЕХЕХЕаХЕК / й

НЕК ХЕ й | є (ад те пера я Фу х що Є ї в 9 в з (22) : (гг) с » 2) ХМ г (5: їй г 2 й ЗУЕХЕКИ : во о (З Е а 55 й що їй й ФИиг.6 | вве 5 -

Есок

Хе! Есов І пит» рРКЕМ1000 Мев 1

Р

ЕсекК І-Хра | Ха ! 70 2.7 кв ів л

Есок І-Хва 1 11329 410 ор

Мсо | Ярини!

Зра я 2И7--Н ні Есой 2 10000 -дйО Бе Мео 1 лх ВІ.

Й (У Хва ' 2090

Х мч

Есов 29 Ват Ге)

Ніла (І

Есоб І

На ві «І | Ніва й І

ЕсоВ | с впро (зе)

ЛЕ й

На шШ ія ба! | ' Ф

У в ній й Ж Ніпд її і 2000 «

Нійй - с Єсок І вобо РК І ;» 1. ТВІ-пронетор нз 6. согечівіао

Ге») 2. Синтетический сигнал-лидернни ген 3. Синтетичеєсєкий ген апротинина со 4. ТРІ-терминатор наз 5. сегеуівіае сю 5. ТРІ-ген из Я. рошоє шо б. Последователькости из плазмид рВК322 и руС1і3 Е. соїї ма 70 7. Последовательности из 2 й плазмидь б. сегечівіасє ! ге 8. Последовательность линкера из плазнидь рак372 Е. соїї о шт |. ко 60 65

. хба !

Бас

Віцевстірі

Мео І

Есок | со . т / Бас рЗХ5а4 х ЕЧТІМ І 70 Ме

Есок і

М Меса І

Меса І-Чос

Есок | 270 во 75 Мсо 1 Мео І-5ас 5.2 кь вкКЕМ'0о0о

Хва 20

Хва

Мео І-Хоа | РЯМ 1-Хво | «ас і 2,9 Кк» 160 Бо с 25 вим І о ч КМса

Щійкег 1858/1862 Мсо І-РЯМ | 38/51 бр « 30 І сч

Мчео

Есок | о

Есов | со 35 мчео | хва (Се)

РМ

« 40 Бас | - с Хвба І з

ЕсокК 1-Хра | ЕсойЯ 1--Мсо 1.7 М

Бо Мсо І-Хра | 9,3 кь

Мео

Ф ЕсокК І (ее) с РАМ му 0 РАМ

Я» , Зас є

Ха І о о ФИГ.8 6о 65 хва - хто |і - ще -к рОС19 ле У й нт Есак 1 / Ме

НІТЕ / рми ЇЇ | рох54 х

ВзаА І щ-е А й Есой | пн

Ніпо ІН Ксеон о Г-кса рай 5-х Мео і 41 - т. в:

ВхоА 1-Єсок | и ЕсоК 475 Вр 75 Мао (еп | нн . 46 ке

ЖПокег 2292/2287 Мсо 1-ВеоА | 34/30 ер ї у | Хва згпта/рму й

Мез | Мео І-оми |Ї

ВеаА | 230 во птах проф ВзеА 1

М руш її ве сч о

Есе соду хво Ї « ів!

Р с

Есой 1 | Есок І о

Мео | мев Мев і со

Вол І «о 1-хВа 1 Ге)

Хва рми П/агла «

ХБа ші с Єсой 1-Хва їз» 450 ьр

Мео | м со |і

Меса ! (ее)

Ха 1 Оз (95) и рАМТОБЕ

І! ва 70 сов Ікс І тре Мило

Її кв Хба ї» Мео 1-Хва 1 8.5 кр о " т ФИГЯ !

Claims (1)

1. Формула винаходу

   1."Клеверньій" пептид, отличающийся тем, что указанньій пептид содержит два "клеверньїх" пептидньйх мономера, каждьй из которьїх содержит единственньй "клеверньй" домен, связаннье между собой 65 дисульфидной связью между двумя остатками цистеина, причем указаннье "клевернье" пептиднье мономерь являются мономерами кишечного "клеверного" фактора (ІТЕ).

   2. Пептид по п. 1, отличающийся тем, что указаннье ІТЕ мономерь! представляют собой ІТЕ мономерь человека.

   3. Пептид по п. 2, отличающийся тем, что его молекулярньй вес составляет приблизительно 13000.

   4. Пептид по п. 2, отличающийся тем, что димер ІТ состоит из двух мономеров ІТЕ, связанньх дисульфидной связью между двумя остатками цистеина в позиции 57 каждого из мономеров.

   5. Пептид по п. 1-4, отличающийся тем, что он предназначен для использования в качестве медикамента.

   6. Пептид по п. 5, отличающийся тем, что он предназначен для использования в качестве медикамента для лечения или профилактики желудочно-кишечньїх растройств. 70 7. "Клеверньій" пептид, отличающийся тем, что указанньій пептид содержит два "клеверньїх" пептидньх мономера, каждьй из которьїх содержит единственньй "клеверньй" домен, связаннье между собой дисульфидной связью между двумя остатками цистеина, причем указаннье "клевернье" пептиднье мономерь являются мономерами пептида, связанного с раком молочной железь (роза).

   8. Пептид по п. 7, отличающийся тем, что указаннье "клевернье" пептидньіе мономерь! представляют собой 7/5 Мономерь рза человека.

   9. Пептид по п. 7, отличающийся тем, что димер рз2 состоит из двух мономеров рз2, связанньмх дисульфидной связью между двумя остатками цистеина в позиции 58 каждого из мономеров.

   10. Пептид по п. 7-9, отличающийся тем, что он предназначен для использования в качестве медикамента.

   11.Способ получения "клеверного" пептидного димера, отличающийся тем, что осуществляют Культивирование подходящей клетки-хозяина, трансформированной ДНК последовательностью, кодирующей мономерь кишечного "клеверного" пептидного фактора (ІТЕ), содержащие единственньй домен в форме клеверного листа, в условиях, позволяющих получение указанного пептида, вьіделение из культурь! полученньйх "клеверного" пептидного мономера и "клеверного" пептидного димера по пп. 1-6 методом хроматографии и извлечение указанного "клеверного" пептидного димера. сч

   12. Способ получения "клеверного" пептидного димера, отличающийся тем, что осуществляют культивирование подходящей клетки-хозяина, трансформированной ДНК последовательностью, кодирующей і) мономер пептида, связанного с раком молочной железь! (ре2), содержащий единственньй домен в форме клеверного листа, в условиях, позволяющих получение указанного пептида, вьіделение из культурь! полученньйх "клеверного" пептидного мономера и "клеверного" пептидного димера по пп. 7-10 методом хромотографии и «г зо извлечение указанного "клеверного" пептидного димера.

   13. Фармацевтическая композиция, содержащая активное соединение вместе с фармацевтически с приемлемьмм разбавителем или носителем, отличающаяся тем, что в качестве активного соединения она со содержит зффективное количество "клеверного" пептида по пп. 1-6.

   14. Фармацевтическая композиция, содержащая активное соединение вместе с фармацевтически со з5 приемлемьм разбавителем или носителем, отличающаяся тем, что в качестве активного соединения она со содержит зффективное количество "клеверного" пептида по пп. 7-10. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2004, М 8, 15.08.2004. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і « Науки України. з

   . и? (о) (ее) (95) іме) с» іме) 60 б5