KR100255911B1

KR100255911B1 - 트레포일펩티드다이머

Info

Publication number: KR100255911B1
Application number: KR1019970700968A
Authority: KR
Inventors: 라르스 팀; 헬레 파브리시우스 윌디케; 페르 프랑클린 니엘센
Original assignee: 한센 핀 베네드, 안네 제헤르; 노보 노르디스크 에이/에스
Priority date: 1994-08-26
Filing date: 1995-08-25
Publication date: 2000-05-01
Also published as: CN1070867C; ATE329929T1; PL318785A1; ES2267104T3; HUT77917A; PT777687E; EP1739091A1; FI970783A; AU3341595A; HU226921B1; FI119989B; BR9508773A; NO323642B1; DE69535060D1; CA2196876C; FI970783A0; JP2007161720A; RU2162857C2; WO1996006861A1; EP0777687A1

Abstract

다이머 형태인 것을 특징으로 하는 단일 트레포일 도메인을 함유하는 트레포일 펩티드.

Description

트레포일 펩티드 다이머{TREFOIL PEPTIDE DIMER}

트레포일 펩티드는 위장관에 관련하여 주로 발견되는 펩티드의 족을 형성한다. 포유동물 트레포일 펩티드는 하나 이상의 특징적 트레포일 도메인을 함유하며(Thim et al., 1989), 이들 각각은 38 또는 39 아미노산 잔기의 서열로 이루어지고, 여기서 6개의 반-시스틴 잔기가 구조 1-5, 2-4 및 3-6으로 연결되어 특징적 트레포일 구조를 형성한다(Thim et al., 1989).

현재 알려진 포유동물 트레포일 펩티드는 한 개 또는 두 개의 트레포일 도메인을 함유하는 반면(Thim, 1994; Poulsom & Wright, 1993; Hoffmann & Hauser, 1993 참조), 개구리, Xenopus, laevis 는 한 개(Hauser & Hoffmann, 1991), 두 개(Hauser et al., 1992a), 4개 (Hoffmann, 1988) 또는 6개(Hauser & Hoffmann, 1992b) 트레포일 도메인을 함유하는 펩티드 및 단백질이 기술되었다. 한 개 도메인을 함유하는 포유동물 트레포일 펩티드는 인간(Jakowlev et al., 1984, Prud'homme et al., 1985) 및 마우스(Lefebvre et al., 1993)에서 지금까지 알려진 유방암 관련 pS2 펩티드와 인간(Podolsky et al., 1993; Hauser et al., 1993) 및 래트(Suemori et al., 1991; Chinery et al., 1992)에서 지금까지 알려진 장내 트레포일 인자이다.

두 개의 트레포일 도메인을 함유하는 진경(Spasmolytic) 폴리펩티드(SP)가 인간(Tomasetto et al., 1990), 돼지(Thim et al., 1982) 및 마우스(Tomasetto et al., 1990)에서 기술되었다. 인간에서 3가지 트레포일 펩티드 hpS2-hITF 및 hSP는 모두 위장관에서 정상 조건하에 발현된다: hSP 및 hpS2는 위(Stomach)의 상피 점막층에서(Tomasetto et al., 1990; Rio et al., 1988) 그리고 hITF는 소장 및 결장의 상피 점막층에서(Podolsky et al., 1993) 발현된다.

트레포일 펩티드의 생리학적 기능은 매우 잘 이해되지 않는다. 위장관에서 트레포일 펩티드의 증가된 발현은 염증성 내장 질환과 같은 점막손상(Rio et al., 1991; Poulsom et al., 1992; Wright et al., 1993)과 위 및 십이지장의 궤양(Rio et al., 1991; Hanby et al., 1993; Wright et al., 1990). 결과적으로 트레포일 펩티드의 점막 치료기능이 제시되었다(예컨대 Wright et al., 1993). 트레포일 펩티드가 손상후 점막상피 회복을 촉진한다는 증거는 Dignass et al., 1994, Playford et al., 1994 및 Babyatsky et al., 1994에 의해 최근 주어졌다. 트레포일 펩티드가 그들의 치료기능을 촉진하는 메카니즘은 뮤신-당단백질을 가교결합시켜 소화효소에 내성인 점탄성 겔층을 형성하는 것일 것이다(Thim, 1994; Gajhede et al., 1993).

래트 및 인간 단일-도메인 장내 트레포일 인자의 클로닝과 장내 트레포일 인자의 위장 손상치료에의 사용은 WO 92/14837 에 기재되어 있다.

(발명의개요)

흥미로운 약리학적 성질을 가지고 오직 한 개의 트레포일 펩티드 도메인을 가지는 트레포일 인자의 다이머를 제조하는 것이 가능하다고 현재 밝혀졌다.

따라서 본발명은 단일 트레포일 도메인을 함유하는 트레포일 펩티드로서 다이머 형태로 있는 것을 특징으로 하는 펩티드에 관한 것이다.

상기와 같이, 트레포일 펩티드는 장관의 점막층을 안정화시킴으로써 소화성 궤양 및 다른 점막손상의 치료에 공헌하는 것으로 믿어진다. 이 안정화 메카니즘은 현재 알려지지 않는다. 그러나 두 개의 트레포일 도메인을 갖는 돼지 췌장 진경 폴리펩티드(PSP)의 X-선 구조(Gajhede et al., 1993 참조)는 보존 잔기의 대부분이 각 트레포일 도메인에서 발현되는 8-10Å폭의 틈새에 기여한다는 것을 보여준다. 예비 도킹 실험에서 틈새가 올리고당류 사슬의 일부, 예컨대 뮤신 당단백질에 부착된 탄수화물을 수용할수 있다는 것을 보여주었다. 만약 그렇다면, 두 개의 그러한 틈새를 갖는 PSP는 뮤신을 가교 결합하여 그것들이 점막 상피상에 보호겔을 형성하도록 도울수 있다. 단일 트레포일 도메인을 갖는 트레포일 펩티드(ITF 및 pS2와 같은)가 생체내에서 다이머를 형성하여 유사한 기능을 발휘할 것인지 또는 그것들이 다른 작용 메카니즘을 가지는지는 현재 알려지지 않는다. 그러나 그러한 트레포일 펩티드의 다이머가 정말로 뮤신을 가교 결합시킬수 있으므로 펩티드의 활성형이라고 현재 믿어진다.

또 다른 양태에서 본발명은 단일 트레포일 도메인을 함유하는 트레포일 펩티드의 다이머의 제조방법에 있어서, 한 개의 트레포일 도메인으로 함유하는 트레포일 펩티드를 암호화하는 DNA 서열로 형질전환된 적합한 숙주세포를 펩티드의 생산을 허용하는 조건하에 배양하고 배양물로부터 결과의 트레포일 펩티드를 회수하는 것으로 이루어지는 방법에 관한 것이다.

또다른 양태에서, 본발명은 단일 트레포일 도메인을 함유하는 트레포일 펩티드의 다이머와 함께 약학적으로 허용되는 희석제 또는 부형제로 이루어지는 제약 조성물에 관한 것이다.

또다른 양태에서, 본발명은 약제로서의 사용을 위한 한 개의 트레포일 도메인을 함유하는 트레포일 펩티드의 다이머와 한 개의 트레포일 도메인을 함유하는 트레포일 펩티드의 다이머의 위장 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 사용에 관한 것이다.

본발명은 트레포일(trefoil) 펩티드 다이머, 트레포일 펩티드 다이머의 제조방법, 트레포일 펩티드 다이머로 이루어진 제약조성물과 그것의 위장질환 치료에의 사용에 관한 것이다.

본발명은 첨부된 도면을 참조하여 실시예에 더 상세히 설명된다.

도 1은 인간 장내 트레포일 인자 ITF 의 구조이다. 1차 아미노산 서열은 Hauser et al., 1993에서 얻은 것이고, 이황화 결합은 PSP 및 pS2 (Thim, 1988)과 상동적으로 위치한다.

도 2는 래트 ITF를 발현하는 효모균주 HW756 으로 부터의 상청액의 Vydac 214 TP54 칼럼상에서의 역상 HPLC 이다.

도 3은 부분 정제된 인간 ITF 의 패스트 플로우 SP-Sepharose 칼럼상에서의 이온교환 크로마토그래피이다. hITF (모노머) 및 hITF (다이머)의 양은 분석용 HPLC 에 의해 결정되었다. 막대는 모노머 및 다이머 형태의 더 이상의 정제를 위해 모아진 분획을 가리킨다. 점선은 용출용매중 NaCℓ의 농도를 보여준다.

도 4는 정제된 래트 ITF, 다이머(A), 인간 ITF (모노머)B 및 인간 ITF (다이머 C) 의 Vydac 214 TP 54 C4 칼럼상에서의 역상 HPLC 이다. 점선은 용출용매중 아세토니트릴의 농도를 보여준다.

도 5는 정제된 래트 ITF (다이머)(A), 인간 ITF (모노머)(B) 및 인간 ITF (다이머)(C)의 재구성된 질량 스펙트럼이다.

도 6은 인간 ITF의 다이머 형태의 구조이다.

도 7은 플라스미드 KFN1003의 제한지도이다.

도 8은 플라스미드 pHW756 의 구조이다.

도 9는 플라스미드 pHW1066 의 구조이다.

트레포일 인자의 다이머는 특히 장내 트레포일 펩티드 인자(ITF) 또는 유방암 관련 펩티드(pS2)의 다이머일수 있다.

구체적으로 트레포일 인자는 다음 서열:

(여기서, Z는 Glu, Gln 또는 pyrGlu 이다)의 모노머 아미노산 서열을 갖는 인간 ITF 또는 다이머형성 및 유사한 활성을 나타낼수 있는 그것의 상동체이거나; 또는 다음서열:

(여기서, Z는 Glu, Gln 또는 pyrGlu 이다)의 모노머 아미노산 서열을 갖는 인간 pS2 또는 다이머형성 및 유사한 활성을 나타낼수 있는 그것의 상동체이다.

ITF 또는 pS2 의 상동체는 동일한 시스테인 패턴 및 이황화물 배열을 가지며(도 1), 루프 1,2 및 3에서 일정한 서열 상동성을 나타낸다(해당 위치의 동일한 아미노산 또는 보존적 치환을 의미함). 루프 영역에서 서열 상동성은 1내지 10 아미노산 잔기가 변할수 있고, 각 루프(시스테인에서 떨어짐)에서 아미노산 잔기수는 7내지 12, 바람직하게는 9내지 10이 변할수 있다.

ITF 또는 pS2의 상동체는 하나이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 가질수 있다. 이들 변화는 치환이 단백질의 접힘(folding) 또는 활성에 크게 영향을 주지 않는 성질이 바람직하다. 작은 결실은 전형적으로 루프 영역에서 1내지 약3 아미노산과 N- 및 C-말단 영역에서 1내지 약 10 아미노산이고; 아미노-말단 메티오닌 잔기와 같은 단일 아미노-또는 카르복실-말단연장, 약10 잔기 까지의 작은 링커펩티드, 또는 항원 결정기 또는 결합도메인인 폴리-히스티딘 트랙과 같은 정제를 용이하게 하는 작은 연장이 있다. 일반적으로 Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991를 참조. 보존적 치환기의 예는 염기성 아미노산(아르기닌, 리신, 히스티딘과 같은), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산과 같은), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴과 같은), 소수성 아미노산(루신, 이소루신, 발린과 같은), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판, 티로신과 같은) 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌과 같은)의 군에 속한다.

그러한 치환은 분자의 기능에 중요한 영역의 외부에서 만들어져서 여전히 활성 폴리펩티드를 초래할수 있다는 것은 당업계의 기술자에게 자명할 것이다. 본 트레포일 펩티드의 활성에 필수적이어서 치환되지 않는 것이 바람직한 아미노산은 부위-지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발(Cunningham 및 Wells, Science 244, 1081-1085, 1989)과 같은 당업계에 공지된 방법에 따라 확인될수 있다. 후자 방법에서 돌연변이를 분자의 모든 잔기에 도입하고, 결과의 돌연변이 분자를 생물학적 활성(예컨대 점막치료, 점막보호, 위궤양 치료)에 대해 시험하여 분자 활성에 중요한 아미노산 잔기를 확인한다.

상동체는 대립(allelic) 변이체, 즉 돌연변이를 통해 발생하는 유전자의 선택적 형태이거나 또는 돌연변이 유전자에 의해 암호화되나 본 펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 변화된 펩티드일수 있다. 따라서 돌연변이는 침묵형(암호화된 펩티드에 변화없음)이거나 변화된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 암호화할수 있다.

본 트레포일 펩티드의 상동체는 또한 종간 상동체, 즉 다른 종, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 소, 돼지 또는 개구리에서 유래된 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드일수 있다.

바람직한 구체예에서 본발명중의 트레포일 펩티드 다이머는 약 13000의 분자량을 가진다. 다이머는 ITF-유사 모노머의 위치 57에서 또는 pS2-유사 모노머의 위치 58에서 두 개의 시스테인 잔기들 사이의 이황화 결합에 의해 연결된 두 개의 트레포일 펩티드 모노머로 구성된다.

트레포일 펩티드 다이머는 바람직하게는 재조합 DNA 기술에 의해 생성된다. 이를 위해, 표준기술(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989)에 따라 게놈 또는 cDNA 도서관을 제조하고 합성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 혼성화에 의해 펩티드의 전부 또는 일부를 암호화하는 DNA 서열에 대해 스크리닝함으로써 트레포일 펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 분리할수 있다. 본 목적을 위해서는 펩티드를 암호화하는 DNA 서열이 인간기원, 즉 인간 게놈 DNA 또는 cDNA 도서관에서 유래되는 것이 바람직하다.

또한 트레포일 펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 확립된 표준방법, 예컨대 Beaucage 및 Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869에 기재된 포스포아미다이트 방법 또는 Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801-805에 기재된 방법에 의해 합성적으로 제조할수 있다. 포스포아미다이트 방법에 따르면, 올리고뉴클레오티드를 예컨대 자동 DNA 합성기에서 합성하고, 정제하고, 어닐링하고, 라이게이션한후, 적합한 벡터에 클로닝한다.

또한 DNA 서열은 특이적 프라이머, 예컨대 US 4,683,202, Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491 또는 Sambrook et al., 상기에 기재된 것을 사용하여 중합효소 연쇄반응에 의해 제조할수도 있다.

트레포일 펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 일반적으로 재조합 DNA 기술에 사용하기 용이한 어떤 벡터도 될 수있는 재조합 벡터내로 삽입되며, 벡터의 선택은 종종 그것이 도입될 숙주 세포에 의존할 것이다. 따라서 벡터는 자율 복제 벡터, 즉 염색체외 물질로서 존재하고 그것의 복제는 염색체 복제와 독립적인 벡터, 예컨대 플라스미드일수 있다. 이와 선택적으로 벡터는 숙주세포에 도입시 숙주세포 게놈내로 통합되어 그것이 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일수도 있다.

벡터는 바람직하게는 트레포일 펩티드를 암호화하는 DNA 서열이 DNA 의 전사에 필요한 추가적 절편에 작동가능하게 연결된 발현 벡터이다. 일반적으로 발현벡터는 플라스미드 또는 비루스 DNA에서 유래되거나, 또는 둘다의 요소를 함유할수도 있다. 용어 "작동가능하게 연결된"이란 절편들이 그들의 의도된 목적을 위해 제휴하여 기능하도록, 예컨대 전사가 프로모터에 개시되어 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 통해 진행하도록 배열되는 것을 의미한다.

프로모터는 선택의 숙주세포에서 전사활성을 보이는 어떤 DNA 서열도 될 수있고, 숙주세포에 상동적 또는 비상동적인 단백질을 암호화하는 유전자에서 유래될수도 있다.

포유동물 세포에서 트레포일 펩티드를 암호화하는 DNA 의 전사를 지시하는 적합한 프로모터의 예는 SV40 프로모터(Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864), MT-1 (메탈로티오네인 유전자) 프로모터 (Palmiter et al., Science 222 (1983), 809-814) 또는 아데노비루스 2 주요 후기 프로모터이다.

곤충 세포에서 사용하기 적합한 프로모터의 예는 폴리헤드린 프로모터(US 4,745,051; Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992) 7-11), P10 프로모터(J. M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, pp. 765-776), Autographa californica 폴리헤드로시스 비루스 기초 단백질 프로모터(EP 397 485), 바큘로비루스 즉시 초기 유전자1 프로모터(US 5,155,037; US 5,162,222) 또는 바큘로비루스 39K 후반초기 유전자 프로모터(US 5,155,037; US 5,162,222)이다.

효모 숙주세포에서 사용하기 적합한 프로모터의 예는 효모 해당(glycolytic)유전자(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber 및 Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434) 또는 알코올 탈수소효소 유전자(Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al., eds.), Plenum Press, New York, 1982)의 프로모터, 또는 TPI1, (US 4,599,311) 또는 ADH2-4c (Russell et al., Nature 304 (1983), 652-654) 프로모터를 포함한다.

사상균 숙주 세포에서 사용하기 적합한 프로모터의 예는 예컨대 ADH3 프로모터(McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099) 또는 tpiA 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터의 예는 A. oryzae TAKA 아밀라제, Rhizomucor miehei 아스파르트 프로테인아제, A. niger 중성 α-아밀라제, A. niger 산안정성 α-아밀라제, A. niger 또는 A. awamori 글루코아밀라제(gluA), Rhizomucor miehei 리파제, A. oryzae 알칼리성 프로테아제, A. oryzae 인산 3탄당 이소머라제 또는 A. nidulans 아세타미다제를 암호화하는 유전자에서 유래된 것이다.

또한 트레포일 펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 필요시 인간 성장 호르몬 터미네이터(Palmiter et al., Science 222, 1983, pp. 809-814) 또는 (균류 숙주를 위한) TPI1 (Alber 및 Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434) 또는 ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), pp.2093-2099) 터미네이터와 같은 적합한 터미네이터에 작동가능하게 연결될수 있다. 벡터는 또한 폴리아데닐화 신호(예컨데 SV40 또는 아데노비루스 5E1b 영역으로부터), 전사 엔핸서 서열(예컨대 SV40 엔핸서) 및 번역 엔핸서 서열(예컨대 아데노비루스 VA RNAs를 암호화하는 것)과 같은 요소를 더 포함할수 있다.

재조합 벡터는 벡터가 의문의 숙주 세포에서 복제할수 있도록 해주는 DNA 서열을 더 포함할 수 있다. 그러한 서열의 예는(숙주 세포가 포유동물세포일 때) SV40 복제기원이다.

숙주세포가 효모세포일 때, 벡터가 복제할수 있도록 해주는 적합한 서열은 효모 플라스미드 2μ 복제 유전자 REP1-3 및 복제기원이다.

벡터는 또한 선택성 마커, 예컨대 디히드로폴레이트 환원효소 암호화유전자(DHFR) 또는 Schizosaccharomyces pombe TR1 유전자(P. R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130 에 기재)와 같은 숙주세포의 결함을 상보하는 산물의 유전자, 또는 암피실린, 카나마이신, 테트라마이신, 클로람페니콜, 네오마이신, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약제에 내성을 부여하는 유전자를 포함할수 있다. 사상균의 경우 선택성 마커는 amdS, pyrG, argB, niaD 또는 sC 를 포함한다.

본발명의 트레포일 펩티드를 숙주세포의 분비경로로 유도하기 위해, 분비신호서열(또한 리더서열, 프리프로서열 또는 프리서열로도 알려짐)이 재조합 벡터에 제공될수 있다. 분비신호서열은 올바른 해독틀안에서 트레포일 펩티드를 암호화하는 DNA 서열과 연결된다. 분비신호서열은 보통 펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 5' 에 위치한다. 분비신호서열은 펩티드와 정상적으로 연합된 것이거나, 또는 다른 분비 단백질을 암호화하는 유전자에서 유래된 것일수도 있다.

효모세포로 부터의 분비를 위해, 분비신호서열은 발현 트레포일 펩티드를 세포의 분비경로로 효율적으로 유도시키는 어떤 신호펩티드를 암호화할수 있다. 신호펩티드는 천연 발생 신호펩티드 또는 그것의 기능적 부분이거나, 또는 합성 펩티드일수도 있다. 적합한 신호펩티드는 α-인자 신호펩티드(US 4,870,008 참조),마우스 침샘 아밀라제의 신호펩티드(O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp. 643-646 참조), 변형 카르복시펩티다제 신호펩티드(L. A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897 참조), 효모 BAR1 신호펩티드(WO87/02670 참조), 또는 효모 아스파르트 프로테아제3 (YAP3) 신호펩티드(M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127-137 참조)라고 밝혀졌다.

효모에서의 효율적인 분비를 위해, 리더펩티드 암호화 서열이 또한 신호서열의 하류 및 트레포일 펩티드 암호화 DNA 서열의 상류에 삽입될수 있다. 리더펩티드의 기능은 발현 펩티드가 소포체로부터 골지장치로 또한 배양배지로의 분비(즉 효모세포의 주변질 공간으로 세포벽을 통한 또는 적어도 세포막을 통한 트레포일 펩티드의 수송)를 위한 분비낭으로 유도되도록 하는 것이다. 리더펩티드는 효모 α-인자 리더일수 있다(그것의 사용은 예컨대 US 4,546,082, US 4,870,008, EP 16 201, EP 123 294, EP 123 544 및 EP 163 529).

이와 선택적으로 리더펩티드는 합성 리더펩티드,즉 자연계에서 발견되지 않는 리더펩티드 일수 있다. 합성 리더펩티드는 예컨대 WO 89/02463 또는 WO 92/11378 에 기재된대로 구성할수 있다.

사상균에서의 사용을 위해, 신호 펩티드는 편리하게는 Aspergillus sp. 아밀라제 또는 글루코아밀라제를 암호화하는 유전자, Rhizomucor miehei 라파제 또는 프로테아제 또는 Humicola lanuginosa 리파제를 암호화하는 유전자에서 유래될수 있다. 신호펩티드는 바람직하게는 A. oryzae TAKA 아밀라제, A. niger 중성 α-아밀라제, A. niger 산안정성 아밀라제 또는 A. niger 글루코아밀라제를 암호화하는 유전자에서 유래된다. 적합한 신호펩티드 예컨대 EP 238 023 및 EP 215 594에 개시된다.

곤충세포에서의 사용을 위해, 신호펩티드는 편리하게는 레피돕테란 Manduca sexta 지방동역학 호르몬 전구체 신호펩티드(US 5,023,328 참조)와 같은 곤충 유전자(WO 90/05783 참조)에서 유래될수 있다.

트레포일 펩티드 암호화 DNA 서열, 프로모터 및 임의로 터미네이터 및/또는 분비신호서열을 각각 라이게이션하고, 그것들을 복제에 필요한 정보를 함유하는 적합한 벡터에 삽입하는데 사용되는 방법은 당업계의 기술자에게 잘 알려져 있다(에컨대 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

트레포일 펩티드 암호화 DNA 서열이 도입될 숙주세포는 펩티드를 다이머 형태로 생성할수 있는 어떤 세포도 될 수 있으며, 효모, 균류 및 고등 진핵 세포를 포함한다.

적합한 포유동물 세포주의 예는 COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL (ATCC CCL 39) 또는 CHO (ATCC CCL 61) 세포주이다. 포유동물세포를 형질감염시키고 세포에 도입된 DNA 서열을 발현시키는 방법은 예컨대 Kaufman 및 Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621; Southern 및 Berg. J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro 및 Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham 및 van der Eb, Virology 52 (1973), 456; 및 Neumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841-845. 에 기재되어 있다.

적합한 효모세포의 예는 Saccharomyces spp. 또는 Schizosaccharomyces spp. 의 세포, 특히 Schizosaccharomyces cerevisiae 또는 Saccharomyces Kluyveri의 특정 균주를 포함한다. 효모세포를 비상동적 DNA 로 형질전환시키고 그들로부터 비상동적 폴리펩티드를 생산하는 방법은 예컨대 US 4,599,311; US 4,931,373; US 4,870,008; 5,037,743 및 4,845,075 에 기재되며, 이들은 모두 여기에 참고문헌으로 포함된다. 형질전환된 세포는 선택성 마커에 의해 결정되는 표현형, 일반적으로 약제 내성 또는 루신 같은 특정 영양소의 부재하에 성장할수 있는 능력에 의해 선택된다. 효모에서의 사용에 바람직한 벡터는 US 4,931,373에 개시된 POT1 벡터이다. 트레포일 펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 예컨대 상기와 같은 신호서열 및 임의로 리더서열에 의해 선행될수 있다. 적합한 효모세포의 또다른 예는 K. lactis Kluyveromyces, H. polymorpha 같은 Hansenula, 또는 P. pastoris 같은 Pichia 의 균주이다(Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, pp. 3459-3465: US 4,882,279).

다른 균류 세포의 예는 사상균, 예컨대 Aspergillus spp. Neurospora spp. Fusarium spp. 또는 Trichoderma spp. 의 세포, 특히 A. oryzae, A. nidulans 또는 A. niger 의 균주이다. 단백질의 발현을 위한 Aspergillus spp. 의 사용은 예컨대 EP 272 277, EP 238 023, EP 184 438에 기재되어 있다. F. oxysporum의 형질전환은 예컨대 Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156에 기재된대로 수행할 수 있다.

Trichoderma spp. 의 형질전환은 예컨대 EP 244 234 에 기재된대로 수행할수 있다.

사상균이 숙주세포로서 사용되는 경우 그것은 편리하게는 DNA 구조물을 숙주염색체에 통합시켜 재조합 숙주세포를 얻음으로써 본발명의 DNA 구조물로 형질전환될수 있다. 이러한 통합은 DNA 서열이 세포내에 안정하게 유지되기 더 쉽기 때문에 일반적으로 유리하다고 여겨진다. 숙주 염색체내로 DNA 구조물의 통합은 종래방법, 예컨대 상동적 또는 비상동적 재조합에 의해 수행할수 있다.

곤충 세포의 형질전환과 그안에서 비상동적 폴리펩티드의 생성은 여기에 모두 참고문헌으로 포함된 US 4,745,051; US 4,879,236; US 5,155,037; US 5,162,222; EP 397,485 에 기재된대로 수행할수 있다. 숙주로서 사용되는 곤충 세포주는 적합하게는 Spodoptera frugiperda 세포 또는 Trichoplusia ni 세포(US 5,077,214 참조)와 같은 Lepidoptera 세포주일 수 있다. 배양조건은 적합하게는 예컨대 WO 89/01029 또는 WO 89/01028 또는 상기 참고문헌중 어떤것에 기재된 것과 같을 수 있다.

상기 형질전환 또는 형질감염 숙주 세포는 그 다음 트레포일 펩티드의 발현을 허용하는 조건하에 적합한 영양배지에서 배양된후, 결과의 펩티드의 전부 또는 일부가 다이머 형태로 배양물로부터 회수될수 있다. 세포를 배양하는데 사용되는 배지는 적당한 보충물을 함유하는 최소 또는 복합배지와 같은 숙주세포의 성장에 적합한 어떤 종래 배지도 될 수 있다.

적합한 배지는 상업적 공급처에서 구입할수 있거나, 발행처방법(예컨대 American Type Culture Collection 의 카탈로그)에 따라 제조될수 있다. 그 다음 세포에 의해 생성된 트레포일 펩티드는 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 숙주세포를 분리하고, 황산암모늄과 같은 염에 의해 상청액 또는 여액의 단백질 성분을 침전시키고, 의문의 폴리펩티드 유형에 따라 이온교환 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 다양한 크로마토그래피 방법에 의해 정제하는 것을 포함하는 종래 방법에 의해 배양배지로부터 회수될수 있다.

본발명의 제약 조성물에서, 트레포일 펩티드 다이머는 예컨대 Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985 에 기재된 바와같은 제약조성물의 확립된 조제방법중 어떤 것에 의해 조제될수 있다. 조성물은 전신성 주사 또는 주입에 적합한 형태일수 있고, 멸균수 또는 등장 염수 또는 글루코스 용액으로 조제될수 있다. 조성물은 당업계에 주지된 종래 멸균방법에 의해 멸균될수 있다. 결과의 수용액은 사용을 위해 포장되거나 무균 조건하에 여과되고 동결 건조될수 있으며, 동결 건조된 제제는 투여전에 멸균 수용액과 조합된다. 조성물은 완충제, 삼투압 조정제 등, 예컨대 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘등과 같은 생리조건에 근접시키기 위해 필요한 약학적으로 수용가능한 보조물질을 함유할수 있다.

본발명의 제약 조성물은 또한 경비, 경피 또는 직장 투여에 적용할수도 있다. 조성물에 사용되는 약학적으로 수용가능한 담체 또는 희석제는 어떤 종래의 고상 담체도 될 수 있다. 고상 담체의 예는 락토스, 테라 알바, 수크로스, 활석, 겔라틴, 아가, 펙틴, 아카시아, 스테아르산마그네슘 및 스테아르산이다. 유사하게 담체 또는 희석제는 단독으로 또는 왁스와 혼합된 모노스테아르산글리세릴 또는 디스테아르산 글리세릴과 같은 당업계에 공지된 어떤 지속 방출 물질도 포함할수 있다. 고상 담체의 양은 변할수 있으나 일반적으로 약 25mg 내지 약 1g 일 것이다.

조성물중 트레포일 펩티드의 농도는 넓게, 즉 약 5중량% 내지 약 100중량% 까지 변할수 있다. 바람직한 농도는 50-100중량% 범위내이다. 조성물의 단위 투여량은 전형적으로 약 1mg 내지 약 200mg, 바람직하게는 약 25mg 내지 약 75mg, 특히 약 50mg 의 펩티드를 함유할수 있다.

상기와 같이, 본발명의 트레포일 펩티드 다이머는 펩티드의 활성형이라고 믿어진다. 그와같이 위장 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 유리하다고 생각된다. 더 구체적인 그것은 위 또는 소화성 궤양, 염증성 내장 질환, Crohn's 질병 또는 방사선 요법, 세균 또는 다른 감염등으로 인한 장관 손상의 치료에 사용하기 유리하다고 여겨진다. 환자에 투여되는 폴리펩티드의 투여량은 치료될 상태의 유형 및 중한 정도에 따라 변할수 있으나, 일반적으로 0.1-1.0 mg/kg 체중의 범위에 속한다.

(재료 및 방법)

래트 ITF (rITF) 및 인간 ITF (hITF)의 클로닝

래트 및 인간 ITF 의 클로닝은 WO92/14837에 기재된대로 그리고 Suemori et al., 1991 및 Chinery et al., 1992 (래트 ITF) 및 Podolsky et al., 1993 및 Hauser et al., 1993 (인간 ITF)에 의해 기재된대로 수행하였다.

rITF 및 hITF 발현 플라스미드의 구성

래트 ITF 의 분비를 위한 발현 플라스미드 pHW756 과 인간 ITF 의 분비를 위한 pHW1066은 도 7 내지 도 9에 요약된대로 구성하였다. 효모 발현 벡터 pKFN1003 (WO90/10075에 기재)은 플라스미드 CPOT 의 유도체이다(Kawasaki G. International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Sept. 17-24, 1984, Edinburgh, Scotland, Abstr. p15.). 그것은 선택 마커로서 Schizosaccharomyces pombe TPI 유전자 (POT) (Russell, P.R. Gene 40 (1985), 125-130)와 발현의 조절을 위한 S. cerevisiae 인산 3 탄당 이소머라제 (TPI) 프로모터와 터미네이터(Alber, T. 및 Kawasaki, G. J. Mol.Appl. Genet. 1 (1982), 419-434)를 가진다.

래트 ITF 유전자는 처음 Bluescript II KS(-) (Stratagene) 내로 클로닝되고, 그로부터 그것이 도 8에 따라 증식되었다. 유용한 클로닝 부위를 제공하는 헬퍼 벡터 pSX54는 pUC18 및 pDN1050 으로 이루어진다(Diderichsen, B., Poulsen, G. B., Jrgensen, S. T. Plasmid 30 (1993), 312-315). 합성 DNA 링커 Nco1-PflM1은 다음 서열을 가진다:

링커는 Thim, L. Norris, K., Norris, F., Nielsen, P.F. Bjrn, S., Christensen, M., Petersen, J. FEBS Lett. 318, (1993), 345-352에 기재된 리더 서열의 C-말단 8 아미노산(코돈 선택에 약간의 변화있음)과 래트 ITF 유전자의 N-말단 부분: QEFVGLSPSQC을 암호화한다. 신호 및 리더의 아미노산 서열은 다음과 같다:

인간 ITF 유전자를 PUC19내로 클로닝하고, 도 9에 기재된대로 증식시켰다. 합성 DNA 링커 Nco1-BsaA1 은 다음 서열을 가진다:

링커는 rITF 구성을 위해 설명된대로 리더의 C-말단 8아미노산과 hITF 유전자의 N-말단 3아미노산: EEY를 암호화한다. 신호 및 리더는 상기와 같다.

발현 플라스미드를 단독 탄소원으로서 글루코스상에서의 성장에 대한 선택에 의해 S. cerevisiae 균주 MT 663 (E2-7B X E11-36 a/α, Δtpi/Δtpi, pep 4-3/pep 4-3)내로 형질전환하였다.

래트 ITF 및 인간 ITF를 발현하는 효모 형질전환체는 각각 HW756 및 HW1066 으로 칭하였다.

발효

상기 형질전환체를 추가적 효모추출물(60그램/L)로 보충된 효모 펩톤 덱스트로스(YPD) 배지(Sherman et al., 1981)에서 72시간동안 30℃로 배양하였다. 발효가 끝났을 때 HW756 (rITF) 및 HW1066 (hITF)에 대해 각각 153 및 232의 660nm 에서의 OD 값에 도달했다. 발효의 마지막에 1M 인산으로 pH를 2.5로 조정하고, 15분간 3000rpm 에서의 원심분리에 의해 효모세포를 제거하였다.

재조합 rITF 의 정제

효모 발효액과 정제도중 얻어진 분획에서 rITF 의 농도를 분석용 HPLC 에 의해 측정하였다. 분액(일반적으로 50-200μL)을 15% (v/v) 아세토니트릴중 0.1% (v/v) TFA로 1.5mL/분의 유속으로 30℃에서 평형화된 Vydac 214 TP54 역상 C4 HPLC칼럼(0.46 X 25cM)상에 주사하였다. 10분간의 이소크라틱 용출후에, 용출용매중 아세토니트릴의 농도는 40분에 걸쳐 55% 로 상승하였다. 흡광도를 214nm에서 측정하였다. 26.5분, 27.3분 및 28.2분에서 용출하는 3개의 피크(도 2)는 rITF의 다이머 형태를 나타낸다고 밝혀졌다. 보정된 hSP표준 (Thim et al., 1993)을 이용하여 펩티드를 정량하였다.

본 효모시스템에서 재조합 래트 ITF 에 대한 발현 레벨은 113mg/L 이었다.

10L 발효조로부터, 8.7L 의 발효액을 원심분리에 의해 분리하였다. 상청액을 14.8L 의 증류수로 희석하여 전도성을 낮추었다. 샘플을 600 mL/h 의 유속으로 패스트 플로우 S-Sepharose (Pharmacia) 칼럼 (5 X 42 cM) 상에 주입하였다. 적용전에, 칼럼을 50mM 포름산 완충액, pH 3.7에서 평형화하였다. 래트 ITF를 50mM NaCℓ을 함유하는 50mM 포름산, pH3.7에 의해 칼럼으로부터 용출하였다. 100mL 의 분획을 600 mL/h 의 유속에서 수집하고, rITF 의 함량에 대해 분석하였다. rITF를 함유하는 전단계로부터의 분획을 모으고(2.3L), Amberchrome (G-71) 칼럼(5 X 10cM) 상에 주입하였다. 적용전에 칼럼을 0.5L/h 의 유속으로 10mM 아세트산암모늄 완충액, pH4.8에서 평형화시켰다. 적용후에 칼럼을 0.5L 의 평형 완충액으로 세척하고, 0.1L/h 의 유속에서 60% (v/v) 의 에탄올을 함유하는 10mM 아세트산 암모늄 완충액 pH4.8로 용출하였다. 10mL 의 분획을 수집하고 그들의 rITF 의 함량에 따라 모았다. 푸울(pool)중 에탄올 농도를 2부피의 에탄올(99.9%, v/v) 첨가에 의해 60% (v/v)에서 87% (v/v)로 증가시켰고, 16시간동안 결과의 혼합물을 마이너스 25℃로 냉각시킴으로써 rITF를 침전시켰다.

-25℃에서 10,000g 으로 1시간 동안 원심분리하여 침전물을 수집하고, 130mL의 20mL 포름산 pH 3.0에 실온에서 재용해시켰다. 샘플을 50mL/h 의 유속으로 패스트 플로우 SP-Sepharose (Pharmacia) 칼럼 (5 X 20cM) 상에 주입하였다. 적용전에, 칼럼을 20mM 포름산, pH3.0으로 평형화하였다. 펩티드를 0.5M NaCℓ을 함유하는 1.5L 포름산, pH3.0내지 1.5L 의 포름산, pH3.0 사이의 선형 구배에 의해 칼럼으로부터 용출하였다. 분획(10mL)을 80mL/h 의 유속으로 수집하고, 흡광도를 280nm에서 측정하였다. 분획을 rITF 의 함량에 대해 분석하였다. rITF 에 해당하는 분획을 모았다. 래트 ITF를 조제용 HPLC 에 의해 더 정제하였다. 모아진 분획(900mL)을 0.1% (v/v) TFA에서 평형화된 Vydac 214 TP1022 C4 조제용 HPLC 칼럼(2.2 X 25cM) 상에 주입하였다. 펩티드를 MeCN/H₂O/TFA (10: 89.9: 0.1, v/v/v) 및 MeCN/H₂O/TFA (65: 34.9: 0.1, v/v/v) 로부터 형성된 선형구배(540mL)로 25℃에서 5mL/분의 유속으로 용출시켰다. UV 흡광도를 280nm에서 모니터하고, 10mL 해당하는 분획을 수집하고, rITF의 함량에 대해 분석하였다. rITF를 함유하는 분획을 모으고, 진공 원심분리에 의해 부피를 30%로 감소시켰다. 결과의 푸울로부터 rITF를 동결건조에 의해 분리하였다. 8.7L의 발효배지로부터 rITF의 총 수율은 236mg 으로서 24% 의 총 정제수율에 해당한다.

재조합 hITF 의 정제

효모 발효액과 정제도중 얻어진 분획중 hITF의 농도는 rITF 에 대해 설명된 것과 동일한 HPLC 시스템에서 측정하였다. 이 시스템에서 21.2분 및 27.1분에서 용출하는 두 개의 피크는 질량 분광법 및 서열분석에 의해 hITF 의 다이머 및 모노머 형태를 나타낸다고 밝혀졌다. 본 효모 시스템에서 재조합 인간 ITF 에 대한 발현 레벨은 90mg/ℓ이었다.

10L 발효조로부터 8.0L 의 발효액으로 원심분리기에 의해 분리하였다. 샘플을 40L 의 10mM 포름산, pH2.5에 대해 3회(각회 24시간) 투석하였다. 샘플을 SP-Sepharose 패스트 플로우(Pharmacia) 칼럼(5 X 40cM)상에 주입하였다(0.25L/h). 칼럼을 5L 의 20mM 포름산, pH2.5로 세척하고, 1M 의 NaCℓ을 함유하는 5L 의 20mM 포름산, pH2.5 및 5L의 포름산, pH2.5에 의해 형성된 선형 구배로 용출하였다. 100mL의 분획을 수집하고 hITF 의 함량에 대해 분석하였다(도 3). hITF 의 두가지 형태를 칼럼으로부터 용출하였다: 하나는 hITF의 모노머 형태를 나타내고(0.5M의 NaCℓ에서 용출), 하나는 hITF 의 다이머 형태를 나타낸다(0.78M 의 NaCℓ에서 용출). 두가지 형태에 해당하는 분획을 분리하여 모았다.

각 분획을 3개의 동일부분(부피: 약 700mL)으로 나누고, 0.1% (v/v) TFA에서 평형화된 Vydac 214TP1022 C4 칼럼(2.2 X 25cM)상에 주입하였다. 펩티드를 MeCN/H₂O/TFA (10: 89.9: 0.1, v/v/v) 및 MeCN/H₂O/TFA (65: 34.9: 0.1, v/v/v) 사이의 선형구배(540mL)로 4mL/분의 유속에서 용출시켰다. UV 흡광도를 280nm에서 모니터하고, 10mL 해당하는 분획을 수집하고, hITF의 함량에 대해 분석하였다.

hITF(모노머) 및 hITF(다이머)를 함유하는 전단계로부터의 분획을 따로 모으고, pH를 3.0으로 조정하였다. 샘플을 40% (v/v) 에탄올을 함유하는 20mM 포름산, pH3.0에서 평형화된 SP-Sepharose HiLoad 16/10 (Pharmacia) 칼럼 (1.6 X 10cM)상에 따로 적용하였다. 칼럼을 80mL 의 평형 완충액으로 세척하고, 1M NaCℓ을 함유하는 200mL의 20mM 포름산, pH3.0, 40% (v/v) 에탄올 내지 200mL 포름산, pH3.0, 40% (v/v)사이의 선형 구배로 4mL/분의 유속에서 용출시켰다. 분획(5mL)을 수집하고 hITF 의 함량에 대해 분석하였다.

hITF(모노머) 및 hITF(다이머)를 함유하는 분획을 각각 모으고, 에탄올 농도를 90% (v/v)로 조정하고 혼합물을 -25℃에서 72시간 냉각함으로써 펩티드 성분을 침전시켰다. 원심분리 및 동결건조에 의해 침전물을 수집하였다. 8L 의 발효액으로부터의 총수율은 각각 모노머 및 다이머 형태에 대해 50% 및 65%의 총 정제수율에 해당하는 256mg hITF (모노머) 및 133mg hITF (다이머)이었다.

재조합 rITF 및 hITF 의 특성화

24.48 및 96시간동안 진공-밀봉 튜브중 110℃ 의 6M HCℓ에서 가수분해한후, 샘플(50㎍)을 Beckman (모델 121MB) 자동 아미노산 분석기상에서 분석하였다. 트리부틸포스핀(Regg & Rudinger, 1974) 으로 이황화 결합을 환원하고 4-비닐피리딘(Friedman et al., 1970)과 커플링 한후, 반-시스틴을 S-β-(4-피리딘에틸) 유도체로서 결정하였다. 4-비닐피리딘-처리된 샘플의 가수분해는 상기와 같이 24시간동안 110℃에서 4M 메탄술폰산 또는 3M 메르캅토에탄술폰산에 의해 수행하였다. 아미노산 서열분석은 Applied Biosystems Model 470A 기상 서열결정기(Thim et al., 1987)를 이용한 자동 Edman 분해법에 의해 결정하였다.

질량 분광분석은 API Ⅲ LC/MS/MS 시스템 (Sciex, Thornhill, Ont., Canada)을 이용하여 수행하였다. 3중 사중극장치는 2400 의 질량-대-전하(m/z)범위를 가지며, 압축공기식 전하스프레이 (이온스프레이라고도함) 인터페이스(Bruins et al., 1987; Covey et al., 1988)와 결합된다. 샘플 도입은 0.5-1㎕/분으로 조정된 유속을 갖는 융합 모세관(75μm 내경)을 통해 주사기 주입펌프(Sage Instruments, Cambridge, MA)에 의해 실행하였다. 장치 m/z 눈금은 단위 분해능하에 폴리(프로필렌글리콜) (PPGs)의 1가 전하 암모늄 부가물 이온으로 보정하였다. 질량 측정의 정확도는 일반적으로 0.02% 이상이다.

도 4는 정제된 rITF (도 4a) 및 hITF (도 4b 및 4c)상에서 얻어진 분석용 HPLC 크로마토그램을 보여준다. 재조합 rITF는 3가지 밀접하게 관련된 펩티드의 혼합물을 함유하고, 이들 형태를 분리하려는 시도는 하지 않았다. 전하 스프레이 질량 분광 분석법에 의해 분석하였을 때, 3가지 주요 분자량은 13112.2, 13096.6 및 13078.8 에 해당한다고 밝혀졌다(도 5a). Cys-57 이 유리-SH 기를 함유하는 모노머 형태의 래트 ITF 의 계산 분자량은 6558.3이다. 다이머 형태(예컨대 S-S 다리가 두 개의 Cys-57 사이에 설립됨)의 래트 ITF 의 계산 분자량은 13114.6이다. 재조합 래트 ITF 에 대해 밝혀진 분자량으로부터 모든 3가지 펩티드가 rITF 의 다이머 형태를 나타낸다는 것이 명백하다. N-말단 아미노산 잔기가 Gln 인 다른 트레포일 펩티드, 예컨대 PSP (Thim et al., 1985 및 Tomasetto et al., 1990) 로부터 이 잔기가 고리화하여 피롤리돈 카르복실산(pyr Glu)을 형성하는 경향이 있다는 것이 알려진다. Gln-Glu-Phe-Val-Gly 의 예상 N-말단 서열을 갖는 래트 ITF 의 경우에, N-말단 Gln 도 또한 고리화하여 pyr Glu를 형성할수 있다고 추정하는 것이 합리적이다. 그러한 유도체화는 각각 17 (한개 pyr Glu) 또는 34 (두개 pyr Glu)상에 래트 ITF (다이머)의 분자량의 감소를 초래할 것이다. 13096.6 및 13078.8 (도 5a)상에 관찰된 분자량은 한 개, 각각 두 개, N-말단 Gln 잔기가 고리화된 래트 ITF 의 다이머 형태에 해당한다. 이들 형태의 계산된 분자량은 13097.6 및 13080.6으로서 실험값과 잘 일치한다. 따라서 HPLC (도 4a) 및 질량분석(도 5a)으로부터, 재조합 래트 ITF가 3가지 서로 다른 다이머 형태로 구성된다고 결론내린다: 2N-말단 Gln을 함유하는 한 개, 1N-말단 Gln 및 1N-말단 pyr Glu를 함유하는 한 개, 및 2N-말단 pyr Glu를 함유하는 한 개. 표 1은 기대값과 잘 일치하는 래트 ITF 의 아미노산 조성을 보여준다.

도 5a 및 5b 는 분석용 HPLC 에 의해 분석된 각각 hITF(모노머) 및 hITF(다이머)의 순도를 보여준다. 다이머 형태(도 5c)는 비교적 순수하게 보이는 반면, 모노머 형태(도 5b)는 펩티드전의 용출물질로 오염된 것으로 보인다. 그러나 주 피크에서의 용출물질을 재크로마토그래피하였을 때, 유사한 크로마토그램이 얻어졌다(결과 도시안됨). 이것은 불순물보다 오히려 역상 칼럼상의 hITF(모노머)의 이상 행위를 가리키는 것으로 보인다. 우리는 이전에 고정제 재조합 hSP(Thim et al., 1993) 뿐만아니라 고정제 돼지 PSP 의 유사한 행위를 관찰하였다.

hITF (모노머)의 질량 분광분석은 6694.0 에 해당하는 주요 피크의 분자량을 보여준다(도 5b). 아미노산 서열(도 1)로부터 계산된 분자량은 Cys-57 이 -SH 형태상에 존재한다는 가정하에 6574.4이다. 아미노산 서열분석(표 2)은 Glu-Glu-Tyr-Val-Gly-의 예상 N-말단 서열을 보여준다. 아미노산 조성분석(표 1)은 7.3(8) 시스테인의 존재를 제외하고 기대값을 보여준다. hITF 모노머의 Cys-57에 연결된 추가적 시스테인은 분자량을 6694.7로 증가시킬 것이며, 이것은 질량 분광분석에 의해 결정된 값(6694.0) 에 매우 근사하다. 그러므로 hITF(모노머)에서 Cys-57은 추가적 시스테인에 이황화 결합되어 있다고 추정된다. 질량 스펙트럼(도 5b)에서 부 분자량 피크는 Cys-57의 또다른 유도체를 나타내거나, 또는 제제내 불순물일 것이다.

두 개의 모노머가 두 개의 Cys-57 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 연결되는 hITF (다이머)의 계산 분자량은 13146.8 이다. 이것은 질량 분광분석에 의해 결정된 값(13147, 도 5c)과 잘 일치한다. 질량 스펙트럼에서의 다른 피크(13169)는 아마도 hITF (다이머) Na⁺부가물을 나타낼 것이다. 서열분석(표 1) 뿐만아니라 아미노산 조성분석(표 2)도 또한 기대값과 잘 일치한다.

<참고문헌>

Claims

다이머 형태인 것을 특징으로 하는 단일 트레포일 도메인을 함유하는 트레포일 펩티드.
제 1 항에 있어서, 장내 트레포일 인자(ITF)인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 2 항에 있어서, 인간 ITF인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 2 항에 있어서, 약 13000의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 2 항에 있어서, ITF 다이머는 각 모노머의 위치 57에 있는 두 개의 시스테인 잔기들 사이의 이황화 결합에 의해 연결된 두 개의 ITF 모노머로 이루어지는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 1 항에 있어서, 유방암 관련 펩티드(pS2)인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 6 항에 있어서, 인간 pS2인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 7 항에 있어서, pS2 다이머는 각 모노머의 위치 58에 있는 두 개의 시스테인 잔기들 사이의 이황화 결합에 의해 연결된 두 개의 pS2 모노머로 이루어지는 것을 특징으로 하는 펩티드.
단일 트레포일 도메인을 함유하는 트레포일 펩티드의 다이머의 제조방법에 있어서, 한 개의 트레포일 도메인을 함유하는 트레포일 펩티드를 암호화하는 DNA서열로 형질전환된 적합한 숙주세포를 펩티드의 생성을 허용하는 조건하에 배양하고, 배양물로부터 결과의 트레포일 펩티드를 회수하는 것으로 이루어지는 방법.