NO323642B1 - Trekloverpeptiddimer, fremgangsmate for fremstilling derav, farmasoytisk preparat som omfatter en slik, og anvendelse av en trekloverpeptiddimer til fremstilling av et medikament for profylakse eller behandling av mave- og tarmkanalsykdommer - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører trekløverpeptid-dimerer, en fremgangsmåte for fremstilling av trekløverpeptid-dimerer, farmasøytisk preparat som omfatter trekløverpeptid-dimerer, og anvendelse derav til fremstilling av medikamenter for profylakse og behandling av mave- og tarmkanalsykdommer.

Oppfinnelsens bakgrunn

Trekløverpetiddimerer danner en familie av peptider som finnes hovedsakelig i forbindelse med mave- og tarmkanalen. Pattedyrtrekløverpeptider inneholder et eller flere karakteristiske trekløverdomener (Thim et al., 1989) som hvert består av en sekvens med 38 eller 39 aminosyrerester hvor 6 halv-cysteinrester er bundet i konfigurasjonen 1-5, 2-4 og 3-6 og således danner en karakteristisk trekløverstruktur (Thim, 1989).

Pattedyrtrekløverpeptidene som for tiden er kjent, inneholder enten ett eller to trekløverdomener (for en over-sikt, se Thim, 1994: Poulsom & Wright, 1993; Hoffmann &

Hauser, 1993) mens det for frosken, Xenopus laevis er blitt beskrevet peptider og proteiner som inneholder ett (Hauser & Hoffmann, 1991), to (Hauser et al., 1992a), fire (Hoffman,

1988) eller seks (Hauser & Hoffmann, 1992b) trekløverdomener. Pattedyrtrekløverpeptidene som inneholder ett domene, er brystkreftforbundet pS2-peptid, hittil kjent fra menneske (Jakowlev et al., 1984, Prud'homme et al., 1985) og mus (Lefebvre et al., 1993), og tarmtrekløverfaktor, hittil kjent fra menneske (Podolsky et al., 1993, Hauser et al., 1993) og rotte (Suemori et al., 1991, Chinery et al., 1992). Spasmolytisk polypeptid (SP) som inneholder to trekløverdomener, er blitt beskrevet fra menneske (Tomasetto et al., 1990), gris (Thim et al., 1982) og mus (Tomasetto et al., 1990). Hos men-nesker uttrykkes de tre trekløverpeptidene hpS2, hlTF og hSP alle under normale betingelser i mave- og tarmkanalen: hSP og hps2 i mavesekkens epitelslimhinnelag (Tomasetto et al., 1990, Rio et al., 1988) og hITF i epitelslimhinnelaget til tynntarmen og tykktarmen (Podolsky et al., 1993).

Den fysiologiske virkning av trekløverpeptidene er ikke svært godt forstått. Forøkt ekspresjon av trekløverpep-tider i mave- og tarmkanalen er rapportert ved flere forskjellige tilstander, deriblant slimhinneskade, slik som inflammatorisk tarmsykdom (Rio et al., 1991, Poulsom et al., 1992 og Wright et al., 1993), og sårdannelse i mavesekken og tolv-fingertarmen (Rio et al., 1991, Hanby et al., 1993, Wright et al., 1990). Følgelig er det blitt foreslått en slimhinnerepa-rasjonsfunksjon av trekløverpeptidene (f eks Wright et al., 1993). Bevismaterialet for at trekløverpeptider fremmer slim-hinneepitelrestitusjon etter skade er nylig blitt gitt av Dignass et al., 1994, Playford et al., 1994 og Babyatsky et al., 1994. Mekanismen hvorved trekløverpeptider fremmer sin repara-sjonsfunksjon, kan være å kryssbinde mucin-glykoproteiner slik at det dannes viskoelastiske gellag som er resistente overfor fordøyelsesenzymer (Thim, 1994, Gajhede et al., 1993).

Kloningen av rotte- og menneskeenkeltdomenetarmtre-kløverfaktor og anvendelse av tarmtrekløverfaktoren ved behandling av mave- og tarmkanalskade er beskrevet i WO 92/14837.

Oppsummering av oppfinnelsen

Det er nå blitt funnet mulig å fremstille dimerer av trekløverfaktorer som bare har ett trekløverdomene, og som har interessante farmakologiske egenskaper.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en tre-kløverpeptiddimer som er kjennetegnet ved at den er en dimer form av en trekløverpeptidmonomer, hvor monomeren inneholder et eneste trekløverdomene.

Som angitt ovenfor antas trekløverpeptider å bidra til helingen av peptiske sår og andre slimhinneskader ved å stabilisere slimhinnelaget i tarmkanalen. Mekanismen ved denne stabilisering er for tiden ukjent. Røntgenstrukturen til por-cint pankreatisk spasmolytisk polypeptid (PSP) (jf Gajhede et al., 1993), som har to trekløverdomener, viser imidlertid at flesteparten av konserverte rester bidrar til en kløft, 8-10 Å bred, som finnes i hvert av trekløverdomenene. Foreløpige be-skjæringsforsøk har vist at kløften vil kunne være behjelpelig med en del av en oligosakkaridkjede, f eks karbohydratet festet til et mucinglykoprotein. Dersom dette er tilfellet, vil PSP med to slike kløfter kunne kryssbinde muciner, for derved å hjelpe dem til å danne en beskyttende gel over slim-hinneepitelet. Det er for tiden ikke kjent hvorvidt trekløver-peptider med e.t ^eneste trekløverdomene (slik som ITF og pS2) danner dimerer in vivo for å utøve en lignende funksjon eller hvorvidt de har en annen virkningsmekanisme. Man tror imidlertid for tiden at dimerer av slike trekløverpeptider virkelig kan kryssbinde muciner og derfor være den aktive form av peptidene.. .Ved e-t annet aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av én trekløverpeptiddimer som er kjennetegnet ved at den er en dimerform av en trekløverpeptidmohoraer, hvor monomeren inneholder et eneste trekløverdomene, hvor "fremgangsmåten omfatter at en egnet vertscelle som er transformert med en DNA-sekvens som koder for en trekløverpeptidmonomer som inneholder ett trekløver-domene, dyrkes under betingelser som muliggjør fremstilling av peptidet, den resulterende trekløverpeptidmonomer og tre-kløverpetiddimer skilles fra kulturen ved hjelp av en kromatografisk fremgangsmåte, og trekløverpeptiddimeren utvinnes.

Ved et ytterligere aspekt vedrører oppfinnelsen et farmasøytisk preparat som omfatter en trekløverpeptiddimer som er kjennetegnet ved å være en dimerform av en trekløver-peptidmonomer, hvor monomeren inneholder et eneste trekløver-domene, sammen med en farmasøytisk akseptabel fortynner eller bærer.

Ved nok-et ytterligere aspekt vedrører oppfinnelsen en trekløverpeptiddimer som er kjennetegnet ved å være en dimerform av en trekløverpeptidmonomer, hvor monomeren inneholder et eneste trekløverdomene, for anvendelse som et medikament, og anvendelse av en trekløverpeptiddimer som er kjennetegnet ved å være en dimerform av en trekløverpeptid-monomer, hvor monomeren inneholder et eneste trekløverdomene, til fremstilling av et medikament for profylakse eller behandling av mave- og tarmkanalsykdommer.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Trekløverpeptiddimeren kan særlig være en dimer av tarmtrekløverfaktor (ITF) eller brystkreftforbundet peptid (pS2).

Trekløverpeptiddimeren er særlig en dimer av human-ITF, hvis monomere aminosyresekvens

hvor Z er Glu, Gin eller pyrGlu,

eller en homolog derav som er i stand til dimerisering, og som oppviser en lignende aktivitet, eller

human-pS2, hvis monomere aminosyresekvens er

hvor Z er Glu, Gin eller pyrGlu,

eller en homolog derav som er i stand til dimerisering, og som oppviser en lignende aktivitet.

Homologer av ITF eller pS2 omfatter det samme cyste-inmønster og det samme disulfidarrangement (Fig. 1) og oppviser en lignende sekvenshomologi (som er forstått å bety enten identiske aminosyrer i tilsvarende stillinger eller konservative substitusjoner) i sløyfe 1, 2 og 3. Sekvenshomolo-gien i sløyfeområdet kan variere fra- 1 til 10 aminosyrerester og antallet aminosyrerester i hver sløyfe (bortsett fra cyste-inene) kan variere fra 7 til 12, fortrinnsvis fra 9 til 10.

Homologer av ITF eller pS2 kan. ha en eller flere ami-nosyresubstitusjoner, -delesjoner eller -addisjoner'. Disse endringene er fortrinnsvis av en slik type at substitusjonen ikke på signifikant måte påvirker foldingen eller aktiviteten av proteinet. Små delesjoner er vanligvis fra 1 til ca 3 aminosyrer i sløyfeområdene, og fra 1 til ca 10 aminosyrer i de N- og C-terminale områder; enkeltstående amino- eller kar-boksylendeforlengelser, slik som en aminoterminal metionin-rest, et lite linkerpeptid på opp til ca 10 rester, eller en liten forlengelse som letter rensing, slik som et polyhisti-dinområde, en antigenepitop eller et bindingsdomene. Se generelt Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Eksempler på konservative substitusjoner er innen-for gruppen av basiske aminosyrer (slik som arginin, lysin, histidin), sure aminosyrer (slik som glutaminsyre og aspara-ginsyre), polare aminosyrer (slik som glutamin og asparagin) , hydrofobe aminosyrer (slik som leucin, isoleucin, valin), aromatiske aminosyrer (slik som fenylalanin, tryptofan, tyro-sin) og små aminosyrer (slik som glysin, alanin, serin,

treonin, metionin).

For fagfolk innen området vil det være åpenbart at slike substitusjoner kan gjøres utenfor området som er av av-gjørende betydning for molekylets funksjon, og fortsatt resultere i et aktivt polypeptid. Aminosyrer som er essensielle for aktiviteten til det foreliggende trekløverpeptid, og som derfor fortrinnsvis ikke er gjenstand for substitusjon, kan iden-tifiseres i henhold til de fremgangsmåter som er kjent innen teknikken, slik som seterettet mutagenese eller alanin-scan-ningsmutagenese (Cunningham and Wells, Science 244, 1081-1085, 1989). Ved den sistnevnte teknikk innføres mutasjoner på hver rest i molekylet og de resulterende mutantmolekyler testes med hensyn på biologisk aktivitet (f eks slimhinneheling, beskyt-telse av slimhinne, mavesårheling) for å identifisere aminosyrerester som er av avgjørende betydning for aktiviteten til molekylet.

Homologen kan være en allelvariant, det vil si en alternativ form av et gen som oppstår gjennom mutasjon, eller et endret peptid som kodes av det muterte genet, men har i det vesentlige samme aktivitet som det foreliggende peptid. Mutasjoner kan følgelig være stille (ingen endring i det kodede peptid) eller kan kode for peptider med endret aminosyresekvens. Homologen til foreliggende trekløverpeptid kan også være en artshomolog, det vil si et polypeptid med en lignende aktivitet avledet fra en annen art, f eks mus, rotte, kanin, ku, gris eller frosk.

Ved en foretrukket utførelsesform har trekløverpep-tiddimeren ifølge oppfinnelsen en omtrentlig molekylvekt på 13000. Dimeren er sammensatt av to trekløverpeptidmonomerer bundet sammen ved hjelp av en disulfidbinding mellom to cysteinrester i 57-stilling i ITF-lignende monomerer eller i 58-stilling i pS2-lignende monomerer.

Trekløverpeptiddimeren fremstilles fortrinnsvis ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker. For dette formål kan en DNA-sekvens som koder for trekløverpeptidet, isoleres ved å fremstille et genbm- eller cDNA-bibliotek, og screene med hensyn på DNA-sekvenser som koder for hele eller en del av peptidet, ved hybridisering under anvendelse av syntetiske oligo-nukleotidprober i overensstemmelse med standardteknikker (jf Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). For det foreliggende formål er DNA-sekvensen som koder for peptidet, fortrinnsvis av human opprinnelse, det vil si avledet fra et humangenom-DNA- eller -cDNA-bibliotek.

DNA-sekvensen som koder for trekløverpeptidet kan også fremstilles syntetisk ved hjelp av etablerte standardmetoder, f eks fosfoamiditmetoden beskrevet av Beau-cage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22, (1981), 1859-1869, eller metoden beskrevet av Matthes et al., EMBO Journal 3

(1984), 801-805. Ifølge fosfoamiditmetoden syntetiseres oligo-nukleotider f eks i et automatisk DNA-synteseapparat, renses, annealeres, ligeres og klones i egnede vektorer.

DNA-sekvensen kan også fremstilles ved hjelp av poly-merasekjedereaksjon under anvendelse av spesifikke primere, f eks som beskrevet i US 4.683.202, Saiki et al., Science 239

(1988), 487-491, eller Sambropk et al., supra.

DNA-sekvensen som koder for trekløverpeptidet, innføyes vanligvis i en rekombinant vektor som kan være hvilken som helst vektor, som på passende måte kan underkastes rekombinante DNA-fremgangsmåter, og valget av vektor vil ofte avhenge av vertscellen hvor den skal innføres. Vektoren kan således være en autonomt replikerende vektor, det vil si en vektor som foreligger som en ekstrakromosomal enhet hvis re-plikasjonen er uavhengig av kromosomal replikasjon, f eks et plasmid. Alternativt vil vektoren kunne være en som, når den innføres i en vertscelle, integreres i vertscellegenomet og replikerer sammen med kromosomet eller kromosomene som den er blitt integrert i.

Vektoren er fortrinnsvis en ekspresjonsvektor hvor DNA-sekvensen som koder for trekløverpeptidet er operativt bundet til ytterligere segmenter som kreves for transkripsjon av DNA-en. Generelt er ekspresjonsvektoren avledet fra plasmid- eller virus-DNA, eller kan inneholde elementer fra begge. Uttrykket "operativt bundet" indikerer at segmentene er arran-gert slik at de virker sammen for sine påtenkte formål, f eks initieres transkripsjonen i en promoter og fortsetter gjennom DNA-sekvensen som koder for polypeptidet.

Promoteren kan være en hvilken som helst DNA-sekvens som oppviser transkripsjonsaktivitet hos den utvalgte vertscelle, og kan være avledet fra gener som koder for proteiner som enten er homologe eller heterologe til vertscellen.

Eksempler på egnede promotere for styring av transkripsjon av den DNA som koder for trekløverpeptidet i pattedyrceller, er SV40-promoteren (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864), MT-1-(metallotioneingen) promoteren (Palmiter et al., Science 222 (1983), 809-814), eller den sene adenovirus 2-hovedpromoter.

Et eksempel på en egnet promoter for anvendelse i insektceller er polyhedrinpromoteren (US 4.745.051; Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992) 7-11), P10-promoteren (J.M. Vlak et al., J. Gen. Viroloqy 69, 1988, s. 865-776), Auto-grapha cal i fornica-polyhedrosevirus-grunnproteinpromoteren (EP 397 485), den umiddelbart tidlige gen 1-promoter fra baculovi-rus (US 5.155.037; US 5.162.222) eller den forsinkede tidlige genpromoter 39K fra baculoviruset (US 5.155.037; US 5.162.222).

Eksempler på egnede promoterer for anvendelse i gjær-vertsceller omfatter promotere fra glykolytiske gjærgener (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber og Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434) eller alkoholdehydrogenasegener (Young et al., i Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al., red.), Plenum Press, New York, 1982), eller TPI1-(US 4.599.311) eller ADH2- 4C-(Russel et al., Nature 304 (1983), 652-654} promote-rene.

Eksempler på egnede promotere for anvendelse i filamentære soppvertceller er f eks ÅDH3-promoteren (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099) eller tpiA-promoteren. Eksempler på andre anvendbare promotere er de som er avledet fra genet som koder for A. oryzae TAKA-amylase, Rhizomucor miehei asparaginsyreproteinase, A. niger nøytral a-amylase, A. niger syrestabil a-amylase, A. niger eller A. awamori glukoamylase (gluA), Rhizomucor miehei lipase, A. oryzae alka-lisk protease A. oryzae, triosefosfatisomerase eller A. nidulans acetamidase. Foretrukket er TAKA-amylasen og gluA-promotere. Egnede promotere er nevnt i f eks EP 238 023 og EP 383 779.

DNA-sekvensen som koder for trekløverpeptidet, kan også om nødvendig være operativt forbundet med en egnet termi-nator, slik som humanveksthormonterminatoren (Palmiter et al., Science 222, 1983, s. 809-814) eller (for soppverter) TPI1-(Alber og Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, s. 419-434)

eller ADH3-(McKnight et al., The EMBO J. 4, 1985, s. 2093-2099) terminatorene. Vektoren kan videre omfatte slike elementer som polyadenyleringssignaler (f eks fra SV40 eller adenovirus 5-Elb-området), transkripsjonsfremmersekvenser (f eks SV40-fremmeren) og translasjonsfremmersekvenser (f eks de som koder for adenovirus VA-RNA-er).

Den rekombinante vektoren kan videre omfatte en DNA-sekvens som gjør det mulig for vektoren å replikere i den aktuelle vertscelle. Et eksempel på en slik sekvens (når vertscellen er en pattedyrcelle) er SV40-replikasjonsopprinnelsen.

Når vertscellen er en gjærcelle, er egnede sekvenser som gjør det mulig for vektoren å replikere, gjærplasmid 2p-replikasjonsgenene REP 1-3 og replikasjonsopprinnelsen.

Vektoren kan også omfatte en selekterbar markør, f eks et gen hvis produkt kompi einen terer en defekt i vertscellen, slik som genet som koder for dihydrofolatreduktase '

(DHFR) eller Schizosaccharomyces pombe- TPI-genet (beskrevet av P.R. Russel, Gene 40, 1985, s. 125-130), eller ett som gir resistens mot et legemiddel, f eks ampicillin, kanamycin, tetrasyklin, kloramfenikol, neomycin, hygromycin eller metotrexat) . For filamentære sopper omfatter selekterbare markører amdS, pyrG, argB, niaD og sC.

For å styre en trekløverpeptiddimer ifølge foreliggende oppfinnelse inn i det sekretoriske reaksjonsspor til vertscellene, kan den rekombinante vektor utstyres med en sekresjonssignalsekvens (også kjent som en ledersekvens, prepro-sekvens eller pre-sekvens). Sekresjonssignalsekvensen er bundet sammen med DNA-sekvensen som koder for trekløver-peptidet, i den korrekte leseramme. Sekresjonssignalsekvenser er vanligvis plassert 5' i forhold til DNA-sekvensen som koder for peptidet. Sekresjonssignalsekvensen kan være den som normalt er bundet med peptidet eller kan være fra et gen som koder for et annet utskilt protein.

For sekresjon fra gjærceller kan sekresjonssignalsekvensen kode for et hvilket som helst signalpeptid som sikrer virkningsfull styring av det uttrykte trekløverpeptid i sekre-• sjonssporet til cellen. Signalpeptidet kan være naturlig fore-kommende signalpeptid eller en funksjonell dei derav, eller det-kan, være syntetisk peptid. Egnede signalpeptider er blitt funnet å være a-faktorsignalpeptidet (jr US 4.870.008), signalpeptidet for musespyttamylase (jf 0. Hagenbuchle et al., Nature 289, .1981, s..643-646),. et modifisert karboksypepti-dasesignalpéptid. (jf L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, s. 887-897),,.qjær- BÅRl-signalpeptidet (jf WO 87/02670), eller gjær-asparagihsyreprotease 3-(YAP3)-signalpeptidet (jf M. Egel-Mitani et alV, Yeast 6, 1990, s. 127-137).

For virkningsfull sekresjon, i gjær kan en sekvens som koder for ét lederpepfid også innføyes nedstrøms for signalse-kvensen og oppstrøms for DNA-sekvensen som koder for tre-kløverpeptidet. Funksjonen til lederpeptidet er å la det uttrykte peptid bli styrt fra det endoplasmatiske retikulum til Golgi-apparatet og videre til en sekretorisk vesikkel for ut-skillelse i dyrkningsmediet (det vil si utføring av trekløver-peptidet gjennom celleveggen eller i det minste gjennom cel-lemembranen og inn i det periplasmatiske rom i gjærcellen). Lederpeptidet kan være gjær-a-faktorlederen (hvis anvendelse er beskrevet f eks i US 4.546.082, US 4.870.008, EP 16 201, EP 123 529, EP 123 544 og EP 163 529). Alternativt kan lederpeptidet være et syntetisk lederpeptid, det vil si et lederpeptid som ikke finnes i naturen. Syntetiske lederpeptider kan f eks konstrueres- som beskrevet i WO 89/02463 eller WO 92/11378.

For anvendelse i filamentære sopper kan signalpeptidet på passende måte være avledet fra et gen som koder for en Aspergillus sp. amylase eller glukoamylase, et gen som koder for en Rhizomucor miehei lipase eller protease, eller en

Humicola lanugihosa lipase. Signalpeptidet er.fortrinnsvis avledet fra en gen som koder for A. oryzae TAKA-amylase, A. niger nøytral a-amylase, A. niger syrestabil amylase, eller A. niger glukoamylase. Egnede signalpeptider er beskrevet f eks i EP 238 023 og EP 215 594.

For anvendelse i insektceller kan signalpeptidet passende være avledet fra et insektgen (jf WO 90/05783), slik som det adipokinetiske hormonforløpersignalpeptid fra sommer-

fuglen Manduca sexta (jf US 5.023.328).

Fremgangsmåtene som anvendes for å ligere henholdsvis DNA-sekvensene som koder for trekløverpeptidet, promoteren og eventuelt terminatoren, og/eller sekresjonssignalsekvensen, og for å innføre dem i egnede vektorer som inneholder den nød-vendige informasjon for replikasjon, er godt kjent for fagfolk innen teknikken (jf f eks Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989),

Vertscellen som DNA-sekvensen som koder for tre-kløverpeptidet, innføres i, kan være hvilken som helst celle som er i stand til produsere peptidet 'i dimer form, og omfatter gjær-, sopp- og høyere eukaryote celler.

Eksempler på egnede pattedyrceller er cellelinjene COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL (ATCC CCL 39) eller CHO (ATCC CCL 61). Fremgangsmåter for transfeksjon av pattedyrceller og uttrykking av DNA-sekvenser innført i cellene, er beskrevet i f eks Kaufmån og Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621; Southern og Berg, , J. Mol. Appl. Genet 1, (1982), 327-341; Loyter et al.,: Froc. Nati. Acad. Sei. USA 79 (1982), 422-426, Wigler et al., Ceil 14

(1978), 725, Corsaro og Pearson, Somatic Cell Genetics 7,

(1981), 603, Graham og van der Eb, Virology 52 (1973), 456; og Neumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841-845.

Eksempler på egnede gjærceller omfatter celler av Saccharomyces spp. eller Schizosaccharomyces spp., særlig stammer av Saccharomyces cerevisiae eller Saccharomyces kluyveri. Fremgangsmåter for transformering av gjærceller med heterolog DNA og fremstilling av heterologe polypeptider derfra er beskrevet f eks i US 4.599.311, US 4.931.373, US 4.870.008, 5.037.743 og US 4.845.075. Transformerte celler velges ut ved hjelp av en fenotype bestemt ved hjelp av en selekterbar markør, vanlig legemiddelresistens eller evne til å vokse i fravær av et bestemt næringsstoff, f eks leucin. En foretrukket vektor for anvendelse i gjær er POTl-vektoren beskrevet i US patentskrift nr 4.931.373. DNA-sekvensen som koder for trekløverpeptidet, kan komme etter en signalsekvens og eventuelt en ledersekvens, f eks som beskrevet ovenfor. Ytterligere eksempler på egnede gjærceller er stammer av Kluy-veromyces, slik som K. lactis, Hansenula, f eks H. polymorpha, eller Pichia, f eks P. pastoris (jf Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, s. 3459-3465, og US 4.882.279.

Eksempler på andre soppceller er celler av filamentære sopper, f eks Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. eller Trichoderma spp., særlig stammer av A. oryzae, A. nidulans eller A. niger. Anvendelsen av Aspergillus spp. for ekspresjon av proteiner er beskrevet f eks i EP 272 277, EP 238 023 og EP 184 438. Transformasjonen av F. oxysporum kan f eks utføres som beskrevet av Malardier et al., 1989, Gene 78: 147- 156. Transformasjonen av Trichoderma spp. kan utføres f eks som beskrevet i EP 244 234.

Når en filamentær sopp anvendes som vertscelle, kan den transformeres med DNA-konstruksjonen ifølge oppfinnelsen, passende ved å integrere DNA-konstruksjonen i vertskromosomet for å oppnå en rekombinant vertscelle. Denne integrasjonen anses generelt for å være en fordel ettersom det er mer sann-synlig at DNA-sekvensen vil bli stabilt opprettholdt i cellen. Integrasjon av DNA-konstruksjonene i vertskromosomet kan ut-føres i henhold til vanlige metoder, f eks ved hjelp av homow log eller heterolog rekombinasjon.

Transformasjon av insektceller og fremstilling av heterologe polypeptider i disse kan utføres som beskrevet i US 4.745.051, US 4.879.236, US 5.155.037, 5.162.222 og EP

397.485. Insektcellelinjen som anvendes som vert, kan passende være en Lepidpptera-cellelinje, slik som Spodoptera frugiper-da- celler eller Trichoplusia ni-celler (jf US 5.077.214). Kul-turbetingelser kan passende være som beskrevet i f eks WO 89/01029 eller WO 89/01028, eller i hvilken som helst av de ovenfor nevnte referanser.

Den transformerte eller transfekterte vertscelle som er beskrevet ovenfor, dyrkes så i et egnet næringsmedium under betingelser som muliggjør ekspresjon av trekløverpeptidet, hvoretter alt eller en del av det resulterende peptid kan utvinnes fra kulturen i dimer form. Mediet som anvendes til å dyrke cellene, og kan være hvilket som helst vanlig medium som er egnet for å dyrke vertscellene, slik som minimale eller komplekse medier som inneholder passende supplementer. Egnede medier er tilgjengelige fra kommersielle leverandører, eller de kan fremstilles i henhold til publiserte resepter (f eks i kataloger fra American Type Culture Collection). Trekløverpep-tidet fremstilt ved hjelp av cellene kan så utvinnes fra kul-turmediet ved hjelp av vanlige* fremgangsmåter, inkludert sepa-rasjon av vertscellene fra mediet ved sentrifugering eller filtrering, utfelling de av proteinholdige komponentene i supernatanten eller filtratet ved hjelp av et salt, f eks ammoniumsulfat, rensing ved hjelp av mange forskjellige kroma-tografiske fremgangsmåter, f eks ionebyttekromatografi, gel-filtreringskromatografi, affinitetskromatografi eller lignende, avhengig av den aktuelle polypeptidtype.

I det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen kan trekløverpeptiddimeren formuleres ved hjelp av hvilken som helst av de etablerte fremgangsmåter for formulering av far-masøytiske preparater, f eks som beskrevet i Remington' s Phar-maceutical Sciences, 1985. Preparatet kan være i en form som er egnet for systemisk injeksjon eller infusjon, og kan som sådan formuleres med sterilt vann eller en isoton saltoppløs-ning eller glukoseoppløsning. Preparatene kan steriliseres ved hjelp av vanlige steriliseringsteknikker som er godt kjent innen fagområdet. De resulterende vandige oppløsninger kan emballeres for anvendelse eller filtreres under aseptiske betingelser, idet det lyofiliserte preparat kombineres med den sterile vandige oppløsning før administrering. Preparatet kan inneholde farmasøytisk akseptable hjelpestoffer etter behov for å tilnærme seg fysiologiske betingelser, slik som buffer-midler, tonisitetsregulerende midler og lignende, f eks natri-umacetat, natriumlaktat, natriumklorid, kaliumklorid, kalsium-klorid etc.

Det farmasøytiske preparat ifølge foreliggende oppfinnelse kan også tilpasses for nasal, transdermal eller rek-tal administrering. Den farmasøytisk akseptable bærer eller fortynner som anvendes i preparatet, kan være hvilken som helst vanlig fast bærer. Eksempler på faste bærere er laktose, terra alba, sukrose, talkum, gelatin, agar, pektin, akasie, magnesiumstearat og stearinsyre. Likeledes kan bæreren eller fortynneren omfatte hvilket som helst materiale for forsinket frigjørelse som er kjent innen teknikken, slik som glyseryl-monostearat eller glyseryldistearat, alene eller blandet med en voks. Mengden av fast bærer vil variere bredt, men vil van-

ligvis være fra ca 25 mg til ca 1 g.

Konsentrasjonen av trekløverpeptidet i preparatet kan variere mye, det vil si fra ca 5 til ca 100 vektprosent. En foretrukket konsentrasjon er i området 50-100 vektprosent. Enhetsdosering av preparatet kan vanligvis inneholde fra ca 1 mg til ca 200 mg, fortrinnsvis fra ca 25 mg til ca 75 mg, særlig ca 50 mg av peptidet.

Som angitt ovenfor antas trekløverpeptiddimeren ifølge oppfinnelsen å være den aktive form av peptidet. Som sådant menes den å være fordelaktig for bruk ved forhindring eller behandling av mave- og tarmkanalsykdommer. Nærmere bestemt er den ment for bruk ved behandlingen av mave- eller peptiske sår, inflammatorisk tarmsykdom, Crohns sykdom eller skade på tynntarmen forårsaket av strålingsterapi, bakterielle eller andre infeksjoner etc. Doseringen av polypeptidet som administreres til en pasient, vil variere med typen og alvor-ligheten i tilstanden som behandles, men er generelt i området 0,1-1,0 mg/kg kroppsvekt.

Kort beskrivelse av tegningene

Foreliggende oppfinnelse er beskrevet nærmere i ek-semplet under henvisning til de ledsagende tegninger som viser: Fig. 1 Foreslått struktur for human tarmtrekløverfaktor ITF. Den primære aminosyresekvens er tatt fra Hauser et al., 1993, og disulfidbindingene er plassert i homo-logi med PSP og pS2 (Thim, 1988). Fig. 2 Reversfase-HPLC på en Vydac 214TP54-kolonne med supernatant fra gjærstammen HW756 som uttrykker rotte-ITF. Fig. 3 Ionebyttekromatografi på en "Fast Flow SP-Sepharose"-kolonne av delvis renset human-ITF. Mengden av hITF (monomer) og hITF (dimer) ble bestemt ved hjelp av analytisk HPLC. Stolpene indikerer fraksjonene som er slått sammen for videre rensing av monomer- og dimer-formene. Den prikkede linje viser konsentrasjonen av NaCl i det eluerende oppløsningsmiddel. Fig. 4 Reversfase-HPLC på en Vydac 214TP54 C4-kolonne av renset rotte-ITF, dimer, (A), human-ITF monomer (B) og human-ITF dimer (C). De prikkede linjene viser konsentrasjonen av acetonitril i det eluérende oppløs- ningsmiddel. Fig. 5 Rekonstruerte massespektra for renset rotte-ITF

(dimer) (A), human-ITF (monomer) (B) og human-ITF " V (dimer) (C)..

Fig. 6 Struktur for dimerformen av human-ITF.

Fig. 7 Restriksjonskart for plasmid KFN 1003.

Fig. 8 Konstruksjon av plasmid pHW756.

Fig. 9 Konstruksjon av plasmid pHW1066.

EKSEMPEL

MATERIALER OG METODER

Kloning av rotte- ITF ( rITF) og human- ITF ( hITF)

Kloningen av rotte- og human-ITF ble utført som beskrevet i WO 92/14837 og som beskrevet av Suemori et al., 1991, og Chinery et al., 1992 (rotte-ITF), og Podolsky et al., 1993, og Hauser et al., 1993, (human-ITF).

Konstruksjon av rITF-. oq hlTF- ekspreslonsplasmider

Ekspresjonsplasmidene pHW756 for sekresjon av rotte-ITF og pHW1066 for sekresjon av human-ITF ble konstruert som skissert i figurene 7-9. Gjærekspresjonsvektoren pKFN1003 (beskrevet i WO 90/10075) er et derivat av plasmid CPOT (Kawasaki, G. international Conference on Yeast Genétics and Molecular Biology, 17.-24. september 1984, Edinburg, Skott-land, sammendrag P15). Det har Schizosaccharomvces <p>ombe TPI-gen (POT) som seleksjonsmarkør (Russel, P.R., Gene 40 (1985), 125-130), og S. Cerevisiae triosefosfatisomerase-(TPI-)promoteren og terminatoren for regulering av ekspresjon (Alber, T. og Kawasaki, G. J. Mol. A<pp>I. Genet. 1 (1982), 419-434).

Rotte-ITF-genet ble først klonet inn Bluesckript II

KS(-MStratagene), hvorfra det ble propagert 1 henhold til

Figur 8. Hjelpevektoren pSX54 som sørger for anvendbare kloningsseter, er sammensatt av pUC18 og pDN1050 (Diderichsen, B. Poulsen, G.B., Jørgensen, S.T. Plasmid 30 (1993), 312-315). Den syntetiske DNA-linker Ncoll-PflMl har den følgende sekvens:

Linkeren koder for de C-terminale 8 aminosyrene i ledersekvensen som beskrevet i Thim, L., Norris, K., Norris F., Nielsen, P.F., Bjørn, S., Christensen,. M., Petersen, J. FEBS Lett. 318. (1993), 345-352, med noen få endringer i kodonvalg, og den N-terminale del av rotte-ITF-genet QEFVGLSPSQC. Aminosyresekvensen til signalet og lederen er som beskrevet nedenunder:

Human-ITF-genet ble klonet i PUC19 og propagert som beskrevet i Figur 9. Den syntetiske DNA-linker Ncol-BsaAl har den følgende sekvens:

Linkeren koder for de C-terminale 8 aminosyrene i lederen som beskrevet for rITF-konstruksjonen for de N-terminale 3 aminosyrene i hITF-genet: EEY. Signalet og lederen er det samme som ovenfor.

Ekspresjonsplasmidene ble transformert i S. cerevisiae stamme MT 663 (E2-7B X Ell-36 a/a, Atpi/Atpi, pep 4-3/pep 4-3) ved hjelp av seleksjon med hensyn på vekst på glukose som den eneste karbonkilde.

Gjærtransformantene som uttrykker rotte-ITF og human-ITF, ble kalt henholdsvis HW756 og HW1066.

Fermentas1oner

Transformantene som er beskrevet ovenfor, ble dyrket ved 30 "C i 72 timer 1 gjærpeptondekstrosemedium (YPD-medium)

(Sherman et al., 1981) supplert med ytterligere gjærekstrakt (60 gram/l). OD-verdier ved 600 nm på 153 og 232 for henholdsvis HW756 (rITF) og HW1066 (hITF), ble nådd ved slutten av fermentasjonene. pH ble regulert til 2,5 med IM fosforsyre ved slutten av ferment as jonen og gjærcellene ble fjernet ved sen-trifuger ing ved 3000 rpn i 15 minutter.

Rensing av rekombinant riTF

Konsentrasjonen av rITF i gjærfermentasjonsvæsken og fraksjonene som ble oppnådd under rensingen ble målt ved hjelp av analytisk MPCL. Aliquoter (vanligvis 50-200 pl) ble in-jisert i en Vydac 214TP54 reversfase C4 HPLC-kolonne (0,46 x 25 cm) ekvilibrert ved 30 "C med en gjennomstrømningshastighet på 1,5 ml/min. med 0,1 % (volum/volum) TFA i 15 % (volum/volum) acetonitril. Etter 10 min. med isokratisk eluering ble konsentrasjonen av acetonitril i det eluerende oppløs-ningsmiddel økt til 55 % i løpet av 40 min.. Absorbans ble målt til 214 nm. Tre topper som eluerte ved 26,5 min., 27,3 min. og 28,2 min. (Fig. 2), ble funnet å representere dimer-formene for rITF. Peptidene ble kvantifisert ved å bruke en kalibrert hSP-standard (Thim et al., 1993).

Ekspresjonsnivået for rekombinant rotte-ITF 1 det foreliggende gjærsystem var 113 mg/l.

Fra en 10 1 fermentor ble 8,7 1 fermentasjonsvæske isolert ved sentrifugering. Supernatanten ble fortynnet med 14,8 1 destillert vann for å redusere ledningsevnen. Prøven ble pumpet på en kolonne med "Fast Flow S-Sepharose"

(Pharmacia) (5 x 42 cm) med en strømningshastignet på 600 ml/time. Før påføringen ble kolonnen ekvilibrert i 50 mM maur-syrebuffer, pH 3,7. Rotte-ITF ble eluert fra kolonnen ved hjelp av 50 mM maursyre, pH 3,7, inneholdende 50 mM NaCl. Fraksjoner av 100 ml ble samlet opp ved en strømningshastignet på 600 ml/time og analysert med hensyn på innhold av r ITF. Fraksjoner fra det forutgående trinn som inneholdt rITF, ble slått sammen (2,3 1) og pumpet til en Amberchrome (6-71) ko-

lonne (5 x 10 cm). Før påføringen ble kolonnen ekvilibrert 1 10 mM ammoniumacetatbuffer, pH 4,8, ved strømningshastignet på 0,5 l/time. Etter påføring ble kolonnen vasket med 0,5 1 ekvi-libreringsbuffer og eluert med 10 mM ammoniumacetatbuffer pH 4,8, inneholdende 60 % (volum/volum) etanol ved en strømnings-hastignet på 0,1 l/time. Fraksjoner å 10 ml ble samlet opp og

slått sammen i henhold til sitt innhold av r ITF. Etanolkonsentrasjonen 1 blandingen hadde økt fra 60 % (volum/volum) til 87 % (volum/volum) ved tilsetting av 2 volumdeler etanol (99,9 %, volum/volum) og rITF ble ut f elt ved å avkjøle den resulterende blanding til minus 25 "C i 16 timer.

Utfellingen ble samlet sammen ved sentrifugering i 1 time ved 10.000 g ved -25 "C og på nytt oppløst ved rom-temperatur i 130 ml 20 mM maur syre, pH 3,0. Prøven ble pumpet over på en kolonne med "Fast Flow SP-Sepharose" (Pharmacia) (5 x 20 cm) med en strømningshasrtighet på 50 ml/time. Før på-føringen ble kolonnen ekvilibrert med 20 mM maur syre, pH 3,0. Peptider ble eluert fra kolonnen ved hjelp av en lineær gra-, dient mellom 1,5 1 50 mM maursyre, pH 3,0 og 1,5 1 maursyre pH 3,0 inneholdende 0,5 m NaCl. Fraksjoner (10 ml) ble samlet opp ved en strømningshastighet på 80 ml/time og absorbansen ble målt ved 280 nm. Fraksjoner ble analysert med hensyn på innhold av rITF. Fraksjoner som tilsvarer rITF ble slått sammen. Rotte-ITF ble renset ytterligere ved hjelp av preparat!v HPLC. Sammenslåtte fraksjoner (900 ml) ble pumpet til en Vydac 214TP1022 C4 preparativ HPLC-kolonne (2,2 x 25 cm) ekvilibrert 1 0,1 % (volum/volum) TFA. Peptidene ble eluert ved 25 'C og ved en strømningshastighet på 5 ml /minutt med en lineær gradient (540 ml) dannet fra MeCN/Ha0/TFA (10:89,9:0,1 volum/volum/volum) og MeCN/H20/TFA (65:34,9:0,1 volum/volum/volum). UV-absorpsjonen ble overvåket ved 280 nm og fraksjoner som tilsvarer 10 ml, ble samlet og ble analysert med hensyn på innhold av rITF. Fraksjoner som inneholdt rITF ble slått sammen og volumet redusert til 30 % ved hjelp av vakuumsentrifuge-ring. Fra den resulterende blanding ble rITF isolert ved hjelp av lyofilisering. Det totale utbyttet av rITF fra 8,7 1 fer-mentasjonsmedium var 236 mg, noe som tilsvarer et totalt renseutbytte på 24 %.

Rensing av rekombinant hlTF

Konsentrasjonen av hITF i gjærfermentasjonsvæsken og -fraksjonen, erholdt under rensing, ble målt i et HPLC-system som er identisk med det som er beskrevet for rITF. I dette systemet ble to topper som eluerte ved 21,2 min. og 27,1 min., ved hjelp av massespektrometri og sekvensanalyse funnet å representere en dimer og en monomer form av hITF. Ekspresjonsnivået for rekombinant human-ITF i det foreliggende gjærsystem var 90 mg/l.

Fra en 10 1 fermentor ble 8,0 1 fermentasjonsvæske isolert ved sentrifugering. Prøven ble dialysert 3 ganger (hver gang i 24 timer) mot 40 1 10 mM maursyre, pH 2,5. Prøven ble pumpet (0,25 l/time) på en kolonne av "SP-Sepharose Fast Flow" (Pharmacia) (5 x 40 cm). Kolonnen ble vasket med 5 1 20 mM maursyre, pH 2,5 og eluert med en lineær gradient dannet ved hjelp av 5 1 20 mM maursyre, pH 2,5 og 5 1 maursyre, pH 2,5 inneholdende 1 M NaCl. Fraksjoner av 100 ml ble samlet og analysert med hensyn på innhold av hlTF (Fig. 3). To former av hl TF ble eluert fra kolonnen: en som utgjør en monomer form av hITF (som eluerer ved 0,5 M NaCl) og en som utgjør en dimer form av hITF (som eluerer ved 0,78 NaCl). Fraksjoner som tilsvarer de to formene ble slått sammen separat.

Hver fraksjon ble delt opp i tre like deler (volum: 700 ml) og pumpet til en Vydac 214TP1022 C4-kolonne (2,2 x 25 cm) ekvilibrert i 0,1 % (volum/volum) TFA. Peptidene ble eluert ved en strømningshastighet på 4 ml/min. med en lineær gradient (540 ml) mellom MeCN/H20/TFA (10:89,9:0,1, volum/volum/- volura) og MeCN/H20/TFA (65:34,9:0,1, volum/volum/volum). UV-absorpsjon ble overvåket ved 280 nm og fraksjoner som tilsvarer 10 ml ble samlet opp og analysert med hensyn på innhold av hITF.

Fraksjoner fra det forutgående trinn inneholdende hITF (monomer) og hITF (dimer) ble slått sammen hver for seg og pH regulert til 3,0. Prøvene ble ført separat til en kolonne med "SP-Sepharose HiLoad 16/10" (Pharmacia) (1,6 x 10 cm) ekvilibrert i 20 mM maursyre, pH 3,0, inneholdende 40 %

(volum/volum) etanol. Kolonnen ble vasket med 80 ml ekvilibre-ringsbuffer og eluert med en strømningshastighet på 4 ml/min. med en lineær gradient mellom 200 ml 20 mM maursyre, pH 3,0, 40 % (volum/volum) etanol og 200 ml 20 mM maursyre, pH 3,0, 40 % (volum/volum) Inneholdende 1 M-vNaCl. Fraksjoner (5 ml) ble samlet opp og "analysert med hensyn på innhold av hlTF.

Fraksjoner som inneholdt henholdsvis hITF (monomer) og hITF (dimer) ble slått sammen og peptidinnholdet utfelt ved å regulere etanolkonsentrasjonen til 90 % (volum/volum) og avkjøle blandingen i 72 timer ved -25 <*>C. Utfellingen ble samlet opp ved sentrifugering og lyofilisert. Det totale utbyttet fra '8_1 fermentas jons væske var 256 mg hITF (monomer) og 133 mg hITF (dimer) som svarer til en totalt renseutbytte på henholdsvis 50 og 65 % for monomer- og dimerformen.

Karakteriserina av rekombinant riTF oo hITF

Etter hydrolyse i 6 M HC1 ved 110 'Ci vakuum-lukkete rør i 24, 48 og 96 timer ble prøvene (50 ug) analysert på et Beckman (modell 121 MB) automatisk aminosyreanalyseapparat. Halv-cysteln ble bestemt som S-p-(4-pyridyletyl)-derivat etter reduksjon av disulfidbinding ved hjelp av tributylfosfin (Rttegg & Rudinger 1974), etterfulgt av sammenkobling med 4-vinylpyridin (Friedman et al., 1970). Hydrolyse av 4-vinyl-pyridin-behandlede prøver ble gjennomført ved hjelp av 4 M metansulfonsyre eller 3 M merkaptoetansulfonsyre ved 110 °C i 24 timer som beskrevet ovenfor. Aminosyresekvensanalyse ble bestemt ved hjelp av automatisert Edman-nedbrytning ved anvendelse av et Applied Biosystems Modell 470A gassfasesekvense-ringsapparat (Thim et al., 1987).

Massespektrometrianalyse ble utført ved å anvende et API III LC/MS/MS-system (Sciex, Thornhill, Ont., Kanada). Det tredoble kvadrupolinstrument har et masse-til-ladningsområde (m/z) på 2400 og er utstyrt med en pneumatisk assistert elek-trospraygrenseflate (også henvist til som ionespray) (Bruins et al., 1987; Covey et al., 1988). Innføring ble gjort ved hjelp av en sprøyteinfusjonspumpe (Sage Instruments, Cam-bridge, MA) gjennom et sammensmeltet kapillarrør (75 pm indre diameter) med en væskestrømningshastighet innstilt på 0,5-1 pl/min. Instrumentets m/z-skala var kalibrert med de enkelt-ladede ammoniumadduktionene av poly(propylenglykoler) (PPG<*>er) under enhetsoppløsning. Nøyaktigheten ved massemålingene er generelt bedre énn 0,02 %. Fig. 4 viser de analytiske HPLC-kromatogrammene som ble oppnådd på den rensede rITF (Fig. 4A) og hITF (Fig. 4B og 4C). Rekombinant ri TF inneholder en blanding av 3 nært beslek-tede peptider og det ble ikke gjort noen forsøk på å separere disse formene. Når de ble analysert ved hjelp av elektrospray-massespektrometri ble tre dominerende molekylvekter funnet, tilsvarende 13112,2, 13096,6 og 13078,8 (Fig. 5A). Den beregnede molekylvekt for rotte-ITF i en monomer form hvor Cys-57 inneholder en fri -SH-gruppe er 6558,3. Den beregnede molekylvekt for rotte-ITF i en dimerform (f eks etableres en S-S-bru mellom to Cys-57) er 13114,6. Fra molekyl vekt som ble funnet for den rekombinante rotte-ITF, er det klart at alle tre peptidene utgjør dimerformer av rITF. Fra andre trekløverpeptider hvor den N-terminale amlnosyrerest er Gin, f eks PSP (Thim et al., 1985 og Tomasetto et al., 1990), er det kjent at denne resten har en tilbøyelighet til å ringsluttes slik at det dannes en pyrrolidonkarboksylsyre (pyrGlu). I tilfellet med rotte-ITF som har en forutsagt N-terminal sekvens med Gln-Glu-Phe-Val-Gly synes det rimelig å anta at den N-terminale Gin også kunne ringsluttes slik. at det dannes pyrGlu. En slik derivat!sering ville resultere i eri reduksjon i molekylvekten til en rotte-ITF (dimer) på henholdsvis 17 (en pyrGlu) eller 34 (to pyrGlu) masseenheter. De observerte molekyl vekter på 13096,6 og 13076,8 (Fig. 5A) tilsvarer dimerformen av rotte-ITF hvor en, henholdsvis to N-terminale Gln-rester er blitt ringsluttet. Den beregnede molekylvekt til disse formene er 13097,6 og 13080,6, noe som er i god overensstemmelse med de eksperimentelt bestemte verdier. Fra HPLC (Fig. 4A) og masse-analyse (Fig. 5A) konkluderes det således med at den rekombinante rotte-ITF består av 3 forskjellige dimerformer: en som inneholder 2 N-terminale Gin, én som inneholder én N-terminal Gin og 1 N-terminal pyrGlu, og en som inneholder 2 N-terminale pyrGlu. Tabell I viser aminosyresammensetningen av rotte-ITF som er i god overensstemmelse med de forventede verdier. Figurene 5A og 5B viser renheten til henholdsvis hlTF (monomer) og hITF (dimer) slik den ble analysert ved hjelp av analytisk HPLC. Dimerformen (Fig. 5C) ser forholdsvis ren ut, mens monomer formen (Fig. 5B) synes å være forurenset med mate-rialet som eluerer foran peptid. Etter rekromatografi av mate-rialet som eluerer i hovedtoppen, ble det imidlertid oppnådd et lignende kromatogram (resultater er ikke vist). Dette synes å indikere en atypisk oppførsel av hITF (monomer) på revers-fasekolonner, snarere enn urenheter. Vi har tidligere obser-vert en lignende oppførsel av høyrenset porcin-PSP, samt høy-renset rekombinant hSP (Thim et al., 1993).

Massespektrometrianalyse av hl TF (monomer) viser en molekyl vekt i den dominerende topp som tilsvarer 6694,0 (Fig. 5B). Molekylvekten, som beregnet ut fra aminosyresekvensen (Fig. 1) er 6574,4 idet man antar at Cys-57 foreligger på -SH-form. Aminosyresekvensanalysen (Tabell II) viser den forventede N-terminale sekvens med Glu-Glu-Tyr-Val-Gly-. Aminosyre-sammensetningsanalysen (Tabell I) viser de forventede verdier bortsett fra tilstedeværelsen av 7,3 (8) cysteiner. En ytterligere cystein bundet til Cys-57 i hITF-monomer ville øke molekyl vekten til 6694,7, som er svært nært den verdi som ble bestemt ved hjelp av massespektrometri (6694,0). Det antas derfor at Cys-57 i hlTF (monomer) er disulfidbundet til en ytterligere cystein. Den minste molekylvektstoppen i massespekteret (Fig. 5B) kan utgjøre et derivat av Cys-57 eller kan være en urenhet i preparatet.

Den beregnede molekylvekt til hITF (dimér) hvor to monomerer er bundet sammen ved hjelp av én disulfidbinding mellom to Cys-57-rester, er 13146,8. Dette er i god overensstemmelse med verdien som ble bestemt ved hjelp av massespektrometri (13147, Flg. 5C). Den andre toppen i massespekteret

(13169) utgjør sannsynligvis Na<*->adduktet av hlTF (dimer). Sekvensanalysen (Tabell I) samt aminosyresammensetningsana-lysen (Tabell II) er også i god overensstemmelse med de forventede verdier.

LITTERATURHENVISNINGER

Babyatsky, M.W., Thim, L., Podolsky, D.K. (1994) Gastroenterologi} 106, A43 (sammendrag)

Bruins, A.P., Covey, T.R., & Henion, J.D. (1987) Anal. Chem. 59, 2642-2646.

Chinery, R., Poulsom, R., Rogers, L.A., Jeffery, R.E. Longcroft, J.M., Hanby, A.M., & Wright, N.A. (1992) Blochem. 3. 285,5-8.

Covey, T.R., Bonner, R.F., Shushan, B.I., & Henion, J.D.

(1988) Rapid Commun. Mass Speetrom. 2, 249-256.

Dignass, A., Lynch-Devaney, K., Kindon, H., Thim, L., & Podolsky, D.K. (1994) J. Clin. Invest, (under trykking).

Friedman, M., Krull, L.H., Cavins, J.F., (1970), J. Biol. Chem. 245, 3868-3871 i

Gajhede, M., Petersen, T.N., Henriksen, A., Petersen, J. F.W., Dauter, Z., Wilson, K.S., & Thim, L., (1993) Structure 1, 253-262.

Hanby, A.M., Poulsom, R., Elia, G., Singh, S., Longcroft, J.M., & Wright, N.A. (1993) J. Pathol. 169, 355-360.

Hauser, F., & Hoffmann, W. (1991) J. Biol. Chem 266, 21206-21309.

Hauser, F., Roeben, C. & Hoffmann, W. (1992a) J. Biol. Chem. 267, 14451-14455.

Hauser, F., & Hoffmann, W. (1992b) J. Biol. Chem. 267, 24620-24624.

Hauser, F., Poulsom, R., Chinery, R., Rogers, L.A., Hanby,

A.M., Wright, N.A. & Hoffmann, W. (1993) Proe. Nati. Rc ad. Sei. 90, 6961-6965.

Hoffmann, W. (1988) J. Biol. Chem. 263, 7686-7690.

Hoffmann, W., & Hauser, F. (1993) Trends Biochem. Sei. 7,239-243.

Jakowlew, S.B., Breathnacn, R., Jeitsch, J.-M., Masiakowskl, P., Chambon, P. (1984) Nucleic Reid Res. 12, 2861-2878.

Lefebvre, 0., Wolf, C, Kedinger, M., Chenard, M.-P., Tomasetto, C, Chambom, P., & Rio, M.C. (1993) J. Cell. Biol. 122, 191-198.

Playford, R.J., Marchbank, T., Chinery, R., Evison, R., Pig-natelli, M., Bolton, R., Thim, L., & Hanby, A.M. (1994) Gastroenterologi (under trykking).

Podolsky, D.K., Lynch-Oevaney, K., Stow, J.L., Oates, P., Murgue, B., DeBeaumont, M., Sands, B.E., & Makida, Y.R. (1993) J. Biol. Chem. 268, 6694-6702.

Poulsom, R., Chinery, R., Sarraf, C, Lalani, E.-N., Stamp, E., Elia, G., Wright, N. (1992) Gastroenterologi/ 27, 17-28.

Poulsom, R., & Wright, N.A. (1993) Sm. J. Physiol. 265, G205-G213.

Prud'homme, J.F., Fridlansky, F., Le Cunff, M., Atger, M., Mercier-Bodart, C, Pichon, M.-F., & Milgrom, B. (1985) DNA 4, 11-21.

Rio, M.C, Bellocg, J.P., Daniel, J.Y., Tomasetto, C, Lathe, R., Chenard, M.P., Batzenschlager, A., & Chambon, P. (1988) Science 241, 705-708.

Rio, M.C., Chenard, M.-P., Wolf, C, Marcellin, L., Tomasetto,

C, Lathe, R., Belocq, J.-P., & Chambon, P. (1991) Gastroente-rology 100, 375-379.

Rttegg, U. Th., & Rudinger, J. (1974) Isr. J. Chem. 12, 391-401.

Sherman, F., Fink, 6.R., SL Hicks, J.B. (1981) Methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Suemori, S., Lynch-Devaney, K., & Podolsky, D.K. (1991) Proe. Nati. Acad. Sei. 88, 11017-11021.

Thim, L., Jørgensen, K.H., & Jørgensen, K.D. (1982) Regul. Peptides 3, 221-230.

Thim, L., Thomsen, J., Christensen, M. & Jørgensen, K.H.

(1985) Biochem. Biophys. Acta 827, 410-418.

Thim, L., Hansen, M.T., Norris, K., Hoegh, I., Boel, £., For-strom, J., Ammerer, G., SL Fill, L. (1986) Proe. Nati. Acad. SCi. 83, 6766-6770.

Thim, L., Hansen, M.T., & Soerensen, A.R. (1987) FEBS Lett. 212,307-312.

Thim, L. (1989) FEBS Lett. 250, 85-90.

Thim, L., Norris, K., Norris, F., Nielsen, P.F., Bjørn, S.E., Christensen, M., Petersen, J. (1993) FEBS Lett. 318, 345-352.

Thim, L. (1994) D±gestlons 55, 353-360.

Tomasetto, C, Rio, M., Gau tier, C, Wolf, C., Hareuveni, M., Chambon, P., & Lathe, R. (1990) EMBO J. 9, 407-414.

Wright, N.A., Pike, C., & Elia, G. (1190) Nature 343, 82-85.

Wright, N.A., Poulsom, R., Stamp, G., van Norden, S., Sarraf, C, Elia G., Ahnen D., Jeffery, R., Longcroft, J., Pike, C, Rio, M., & Chambon, P. (1993) Gastroenterologi 104, 12-20.

Claims (19)

1. Trekløverpeptiddimer, karakterisert ved at den er en dimer form av en trekløverpeptidmonomer, hvor monomeren inneholder et eneste trekløverdomene.

2. Trekløverpeptiddimer ifølge krav 1, karakterisert ved at den har en omtrentlig molekylvekt på 13000.

3. Trekløverpeptiddimer ifølge krav 1, karakterisert ved at den er en dimer av tarmtrekløverfaktor (ITF).

4. Trekløverpeptiddimer ifølge krav 1 eller 3, karakterisert ved at den er en dimer av human-ITF.

5. Trekløverpeptiddimer ifølge krav 3 eller 4, karakterisert ved at ITF-dimeren er sammensatt av to ITF-monomerer bundet sammen ved hjelp av en disulfidbinding mellom to cysteinrester i 57-stilling i hver monomer.

6. Trekløverpeptiddimer ifølge krav 1, karakterisert ved at den er en dimer av brystkreftforbundet peptid (pS2).

7. Trekløverpeptiddimer ifølge krav 1 eller 6, karakterisert ved at den er en dimer av human-pS2.

8. Trekløverpeptiddimer ifølge krav 6 eller 7, karakterisert ved at pS2-dimeren er sammensatt av to pS2-monomerer bundet sammen ved hjelp av en disulfidbinding mellom to cysteinrester i 58-stilling i hver mono- . mer.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av en trekløverpeptid-dimer som er-kjennetegnet ved at den er en dimerform av en trekløverpeptidmonomer, hvor monomeren inneholder et eneste trekløverdomene, karakterisert ved at en egnet vertscelle som er transformert med en DNA-sekvens som koder for en trekløver-peptidmonomer som,inneholder ett trekløverdomene, dyrkes under betingelser "som muliggjør fremstilling av peptidet, den resulterende trekløyerpeptidmonomer <p>g trekløverpetiddimer skilles fra kulturen ved hjelp av en kromatografisk fremgangsmåte,. og trekløverpeptiddimeren utvinnes,

10. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en tre-kløverpeptiddimer som er kjennetegnet ved å være en dimerform av en trekløverpeptidmonomer, hvor monomeren inneholder et eneste trekløverdomene, sammen med en farmasøytisk akseptabel fortynner eller bærer.

11. Farmasøytisk preparat ifølge krav 10, karakterisert ved at det omfatter en trekløverpeptiddimer ifølge hvilket som helst av kravene 2-8.

12. Trekløverpeptiddimer som er kjennetegnet ved å være en dimerform av en trekløverpeptidmonomer, hvor monomeren inneholder et eneste trekløverdomene, for anvendelse som et medikament.

13. Trekløverpeptiddimer ifølge hvilket som helst av kravene 2-8, for anvendelse som et medikament.

14. Trekløverpeptiddimer som er kjennetegnet ved å være en dimerform av en trekløverpeptidmonomer, hvor monomeren inneholder et eneste trekløverdomene, for anvendelse ved profylakse eller behandling av mave- og tarmkanalsykdommer.

15. Trekløverpeptiddimer ifølge hvilket som helst av kravene 2-8, for anvendelse ved profylakse eller behandling av mave- og tarmkanalsykdommer.

16. Trekløverpeptiddimer ifølge krav 14 eller 15, hvor mave- og tarmkanalforstyrrelsen er valgt fra: mavesår og sår i fordøyelseskanalen, inflammatorisk tarmsykdom, Crohns sykdom og skade i tarmkanalen forårsaket av strålingsterapi, bakterie-infeksjon eller andre infeksjoner.

17. Anvendelse av en trekløverpeptiddimer som er kjennetegnet ved å være en dimerform av en trekløverpeptidmonomer, hvor monomeren inneholder et eneste trekløverdomene, til fremstilling av et medikament for profylakse eller behandling av mave- og tarmkanalsykdommer.

18. Anvendelse ifølge krav 17, hvor trekløverpeptid-dimeren er en trekløverpeptiddimer ifølge hvilket som helst av kravene 2-8.

19. Anvendelse ifølge krav 17 eller.18, hvor mave- og tarmkanalsykdommen er valgt fra: mavesår og sår i fordøyelseskanalen, inflammatorisk tarmsykdom, Crohns sykdom og skade i tarmkanalen forårsaket av strålingsterapi, bakterie-infeksjon eller andre infeksjoner.