JP2008037866A - 腸三葉型蛋白質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】腸三葉型因子(ITF)は、消化管の破壊に抵抗性であり、消化性潰瘍疾患、炎症性腸疾患、およびその他の傷害の治療に使用することができる医薬組成物。ポリペプチドが、マーカーをさらに含む三葉型ポリペプチド。検出可能な標識を施された三葉型ポリペプチドに組織を接触させる段階と、該組織に結合した検出可能な標識を施された三葉型ポリペプチドのレベルを測定する段階とを含むITFレセプターを検出する方法。
【選択図】図5
Description
本発明の分野は、胃腸の疾患に関連するものを含む創傷の診断、予防、または治療に有用なペプチドである。
ジョージェンセンら(Jorgensen)Regulatory Peptides 3:231, 1982
第一の局面において、本発明は、腸三葉型因子(ITF)をコードする精製された核酸を特徴とする。
好ましい態様において、腸三葉型因子は、哺乳動物腸三葉型因子、好ましくはヒト、ラット、ウシ、またはブタの腸三葉型因子である。別の好ましい態様において、腸三葉型因子をコードする精製核酸は、ベクターの内部に存在する。
関連する局面において、本発明は、腸三葉型因子をコードするベクターを含む細胞を特徴とする。
別の関連する局面において、本発明は、実質的に純粋な腸三葉型因子を特徴とする。好ましい態様において、そのポリペプチドは検出可能な標識を施されている。関連する局面において、本発明は、腸三葉型因子と薬学的に許容される担体とを含む治療用組成物を特徴とする。
関連する局面において、本発明は、ヒト患者においてヒト腸三葉型因子を検出するための方法を特徴とする。本方法には、腸三葉型因子に選択的に結合するモノクローナル抗体と患者から採取された生物学的試料とを接触させる段階、およびモノクローナル抗体と形成された免疫複合体を検出する段階が含まれる。好ましい態様において、生物学的試料は、腸の掻き取った粘膜または血清である。
別の局面において、本発明は、患者において腸三葉型因子に結合する部位を検出するための方法を特徴とする。該方法には、該因子と患者から採取された生物学的試料とを接触させる段階、および該試料において結合部位が存在する指標として、該生物学的試料に結合された該因子を検出する段階が含まれる。本明細書で用いられる「結合部位」とは、腸三葉型因子蛋白質、因子、または類似体に結合するあらゆる抗体またはレセプターを意味する。結合部位の検出または定量化は、胃腸管の異常を反映しており有用であると考えられる。
「腸三葉型因子」(「ITF」)とは、ラット腸三葉型因子(図2;配列番号:2)に実質的に相同であり、小腸、大腸、結腸以外の組織で発現されるよりも、大腸、小腸、または結腸で多く発現される、あらゆる蛋白質を意味する。また以下のものも含まれる:対立遺伝子変異体;天然の変異体;誘導変異体;天然の物質から採取された核酸をコードするITFに、高ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするDNAにコードされる蛋白質;およびITFに対する抗血清、特にITFの活性部位または結合ドメインに対する抗血清で回収されたポリペプチドまたは蛋白質。また、この用語には、ITFを含むその他のキメラポリペプチドも含まれる。
本発明のその他の特徴および利点は、その好ましい態様に関する以下の記述、および請求の範囲から明らかとなると思われる。
rITFの精製およびクローニング
ヒト乳癌由来BT-20細胞(ATCC HTB79)による軟寒天コロニー形成の阻害剤は、細胞学的に陽性のヒト悪性滲出物から単離した(ポドルスキーら(Podolsky)、Cancer Res.48:418、1988)。因子はまた、ヒト結腸癌由来HCT15細胞(ATCC-CCL225)による軟寒天コロニー形成を阻害した。阻害は、ポリオーマ、およびマウス肉腫ウイルスによって形質転換した齧歯類繊維芽細胞株については認められなかった。単離した因子(形質転換した細胞増殖阻害因子、またはTGIF)は、見かけの分子量が110,000 Daで、スルフヒドリル結合によって連結された2つの55,000 Daサブユニットからなると考えられた。
rITFのカルボキシ末端のアミノ酸21個に対応するペプチドを合成して、ウシ血清アルブミン(BSA)とカップリングさせた。この共役物(および非共役ペプチド)を用いて、ウサギにおいてポリクローナル抗体を作製した。全ての技法は、アウスベルら(Ausubel、前記)が記述したような標準プロトコルであった。ラット組織におけるrITFの可視化のため、抗rITF抗体を間接免疫蛍光アッセイにおいて用いた。ラット組織の凍結切片は、定法を用いて調製し、フルオレセイン標識ヤギ抗ウサギモノクローナル抗体(標識抗体は、カークガード&ペリー・ラボラトリーズ、ガイサースバーグ、メリーランド州;およびバイオプロダクツ・フォア・サイエンス、インク、インジアナポリス、インジアナ州のような供給業者から入手する)を用いて、ウサギ抗rITF抗体の結合を検出した。この分析により、rITFは小腸の杯状細胞に存在するが、胃または膵臓には存在しないと考えられる。
ラット腸三葉型因子をコードするDNAを用いて、ヒト腸三葉型因子(rITF)をコードするcDNAクローンを同定することができる。これは、rITFに由来するプローブ、またはhITF遺伝子の一部に由来するプローブによって、ヒト結腸cDNAライブラリをスクリーニングすることによって達成されうる。後者のプローブは、hITF遺伝子の一部を単離するために、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ヒト結腸または腸cDNAから得ることができる。次に、このプローブは、hITF遺伝子の全てをコードするクローンの同定のための特異的プローブとして機能しうる。
λgt10もしくはλgt11、またはその他の適したベクター内部のヒト結腸または腸のcDNAライブラリは、hITFの単離に有用である。そのようなライブラリは、購入してもよい(クロンテック・ラボラトリーズ、パロ・アルト、カリフォルニア州;HLI034a、HLI0346b)。または、ライブラリはヒト結腸または腸からの粘膜擦過標本を用いて作製ことができる。簡潔に述べると、本質的には、チャーグィンら((Chirgwin)、Biochemistry 18;5294、1979;アウスベルら(Ausubel)前記もまた参照)が記述したように、総RNAを組織から単離する。次に、オリゴ(dT)カラムを用いて、アビブら((Aviv)、J.Mol.Biol.134:743、1972;アウスベルら(Ausubel)前記もまた参照)の方法によって、ポリ(A)+ RNAを単離する。次に、オリゴ(dT)12-18またはランダム6量体プライマー(またはその両者)を用いて、逆転写により二本鎖cDNAを産生させる。次に、RNAアーゼHおよび大腸菌DNApolIを用いてRNA鎖を第二のDNA鎖に置換する。その後の段階において、大腸菌DNAリガーゼおよびT4 DNAポリメラーゼを用いて第二のDNA鎖におけるギャップを閉じ、平滑末端を作製する。一般に、作製されたcDNAを次に、EcoRIメチラーゼ用いてメチル化し、EcoRIリンカーを加える(用いるベクターに応じてその他のリンカーを用いることができる)。その後の段階において、制限酵素消化によって過剰なリンカーを除去し、cDNA断片を望ましいベクターにインサートする。詳しいプロトコルに関しては、アウスベルら(Ausubel)前記およびサムブルックら((Sambrook)(1989)、「分子クローニング:実験マニュアル」(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)CSHラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク(1990))を参照のこと。
ライブラリをスクリーニングするためには、それが適当な宿主株上(例えば、λgt10ライブラリに関してはY1090またはY1088、λgt10ライブラリに関してはC600hflA)になければならない。ファージをプレーティングした後、プラークをニトロセルロースまたはナイロン濾紙に移す(アウスベルら(Ausubel、前記)およびサムブルックら(Sambrook、前記)参照)。次に、濾紙をrITFに由来するニックトランスレーションを行ったα-32P標識プローブで調べた。プローブは、三葉型構造をコードするrITF DNAの領域の一部(配列番号:2のシステイン32〜フェニルアラニン71までをコードする、配列番号:1のヌクレオチド114位〜230位)を用いて作製することが好ましい。この領域は、rITF、pS2およびPSPの間で保存されており、またこの領域はrITFとhITFの間で保存されている可能性がある。プラークを同定した後、hITFをコードする純粋なクローンを単離するためには、プラーク精製のいくつかのサイクルを必要とする。ファージDNAを単離し、制限マッピングおよびシークエンシングのため、適当なベクターにcDNAインサートをサブクローニングすることができる。ファージベクターが登録商標ラムダZAP IIの場合、ヘルパーファージに同時に感染させると、cDNAを中に含むpBluescript SK-ファージミドベクター(ストラタジーン、ラホヤ、カリフォルニア州)の検出および再環状化が可能になる;または、ファージクローンを精製して、制限マッピングおよびシークエンシングに適したベクターにcDNAインサートをサブクローニングする。クローンが全hITF遺伝子を含んでいない場合(rITFとの相同性と開始および停止コドンの存在によって評価)、最初のrITFプローブを用いて、好ましくは得られたhITFクローンから生じたプローブによって、ライブラリを再度スクリーニングすることができる。いずれのクローンも完全な遺伝子を含んでいない場合、hITFの重なり合う断片を有するクローンから、クローンを再構築することができる。
パッケージングしたライブラリまたはcDNAから直接、hITF遺伝子の一部を単離することが可能である。パッケージングしたライブラリから直接hITFの一部を単離するためには、1対のオリゴヌクレオチドプライマーとTaqポリメラーゼを用いて、hITF遺伝子に対応するDNAを増幅する。用いるプライマーの長さは、およそ15〜20ヌクレオチドで、rITFコード配列の最も5'のおよび最も3'の部分までの配列に対応する。フリードマンら(Friedman)(「PCRプロトコル:方法と応用のための手引き」イニスら(Innis)編、アカデミック・プレス、サンジエゴ、カリフォルニア州)は、そのような増幅のための手順について記述している。簡潔に述べると、ファージ粒子を加熱して破壊する;Taqポリメラーゼ、プライマー(それぞれ300 pmol)、dNTP、およびTaqポリメラーゼ緩衝液を加える;ならびに混合液をサーマルサイクルしてDNAを増幅する。増幅されたDNAをアガロースゲル電気泳動によって単離する。断片の末端は、適当なベクターの中にライゲーションするために、それらをT4ポリメラーゼで平滑化し、必要に応じて、リンカーを加えることによって準備する。または、制限部位は、その配列を消化した場合に適当な付着末端を生じるような配列を5'末端に加えたプライマーを用いることによって、断片の中に操作して加えてもよい。例えば、配列:5'-GGGCGGCCGC-3'(配列番号:4)は、各プライマーの5'末端に加えることができる。この配列は、配列:GCによって5'末端に隣接するNotI制限部位を含む。さらなるヌクレオチドがあれば、5'末端の変性を防止し、NotIによるその後の制限酵素消化の妨害が防止される。適当な大きさのゲル精製DNAを次に、シークエンシングおよび制限マッピングのためにクローニングベクターにクローニングする。このクローンは、全hITF配列を有するのではなく、むしろhITF(プライマーに対応する配列間の領域)とrITF(プライマー配列に対応する5'末端と3'末端)の組み合わせであろう。しかし、このDNAは、正しいrITF配列であるため、cDNAが最初に単離されたライブラリの高ストリンジェンシー・スクリーニングにおいて用いることができる標識プローブ(ニックトランスレーションまたはランダムプライマー標識によって生じる)を作製するために用いることができる。もう一つのアプローチにおいて、cDNAは、上記技法においてパッケージングライブラリの代わりに用いることができる。これにより、cDNAパッケージングおよびライブラリ増幅と共に、ベクターへの挿入のためのcDNAの修飾段階が省略される。アウスベルら(Ausubel、前記)は、cDNAから直接的に特定のDNA断片を増幅するプロトコルおよびポリ(A)+ RNAからの増幅プロトコルを提供している。
rITF cDNAに由来するニックトランスレーションを行ったプローブ(配列番号:1のヌクレオチド1位〜431位に対応)を、ヒト腸粘膜擦過標本に由来するポリ(A)+ RNAのノザンブロット分析に用いた。プローブのハイブリダイゼーションおよびブロット洗浄は、定法に従って実施した。プローブ(5×105 cpm/mlハイブリダイゼーション緩衝液)を45℃で30%ホルムアミドを含む5×SSC中で濾紙にハイブリダイズさせた。次に、濾紙を60℃で40%ホルムアミドを含む5×SSC中で洗浄した。このプロトコルを用いて、濾紙を強化スクリーンに一晩暴露するとバンドが明確に可視化された。この結果は、rITFとhITFの間には、rITF遺伝子配列に由来するプローブをhITF遺伝子の同定に用いることができるほど十分な相同性が存在することを示している。
単離したhITF遺伝子は、蛋白質発現のために、哺乳類発現ベクターにクローニングすることができる。適当なベクターは、デキサメタゾン誘発可能なMMTV-LTRプロモーターに連結したRSV-LTRエンハンサーを提供するpMAMneo(クロンテック、パロアルト、カリフォルニア州)、SV40複製起点(COS細胞における複製を可能にする)、ネオマイシン遺伝子、およびSV40スプライシングおよびポリアデニル化部位を含む。このベクターは、COS細胞、CHO細胞、またはマウス繊維芽細胞における蛋白質の発現に用いることができる。遺伝子はまた、バキュロウイルス発現系を用いて、キイロショウジョウバエ細胞に発現させるために、ベクターにクローニングしてもよい。
腸三葉型因子は、ITFを発現するヒト、ラットまたはその他の種の腸粘膜擦過標本(ブタおよびウシはITF源を提供する可能性がある)から精製することができる。PSPに用いた精製技法は、蛋白質は相同である可能性があるため、ITFの精製にとっても有用であろう。ジョージェンセンら(Jorgensen)は、PSPの精製法を記述している(Regulatory Peptides 3:207、1982)。好ましい方法は、ヨーゲンセンら(Jorgensen、前記)が記述した第二のアプローチである。この方法は、酸性緩衝液中でのSP-セファデックスC-25およびQAEセファデックスA-25カラム(シグマ、セントルイス、ミズーリ州)のクロマトグラフィーを含む。
抗腸三葉型因子モノクローナル抗体は、その配列がクローニングしたhITFの推定アミノ酸配列(配列番号:3)に基づく合成ペプチドに対して作製することができる。最も一般的なペプチドは、関係蛋白質(ここでは、hITF)のアミノ末端またはカルボキシ末端のアミノ酸10〜20個に基づく。ペプチドは通常、ウシ血清アルブミンまたはキーホール・リンペット・ヘモシアニンのような担体分子に化学的にクロスリンクさせる。本来のhITFと交叉反応する抗体を製造する目的で、ペプチドを選択する。したがって、ペプチドは関係ペプチドの抗原性領域に対応するはずである。これは、(1)表面が暴露された、例えば、疎水性領域、または(2)比較的柔軟な、例えば、ループ領域またはβ-ターン領域、である蛋白質の領域を選択することによって得られる。いずれにせよ、ペプチドが担体にカップリングするならば、カップリング反応に関与することができる側鎖を有するアミノ酸を有するに違いない。抗原性ペプチドの選択に関係する問題の考察に関しては、ホップら(Hopp)(Mol.Immunol.20:483、1983;J.Mol.Biol.157:105、1982)を参照のこと。次に検討することは、免役すべき動物におけるhITFと相同な蛋白質の存在である。そのような蛋白質が存在する場合、その相同体と高度に相同でないhITFの領域を選択することが重要である。
上記のように、ITFは、胃腸管の粘膜表面に特異的かつ豊富に発現される三葉型蛋白質ファミリーのメンバーである。このファミリーのその他のメンバーは、ほぼ胃の小窩細胞によってのみ発現されるpS2(マシアコフスキーら(Masiakowski)、Nucl. Acids. Res.10:7896、1982;ヨーゲンセンら(Jorgensen)、Regulatory Peptides 3:231、1982)、および膵臓および胃前庭部によって発現される膵臓の鎮痙性ペプチド(SP)(ヨーゲンセンら(Jorgensen)、前記)を含む。上記のように、これらの蛋白質の発現は損傷した腸の近位では増強される。ITFのインビボでの役割を調べるために、マウスにおける標的破壊によって遺伝子を非機能的にした。
マウスITF遺伝子は、ラットITF cDNA配列をプローブとして用いて、ファージゲノムライブラリから単離し、定法を用いてヌクレオチドシークエンシングによって、その同一性を確認した(マシモら(Mashimo)、Biochem.Biophys.Res.Comm.210:31、1995)。
ITFの発現は変異マウスにおいて失われているが、その他の三葉型遺伝子の発現は保存されている。ノザンブロット分析は、ITF(スエモリら(Suemori)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:11017、1991)、SP(ジェフリーら(Jeffrey)、Gastroenterology 106:336、1994)、および陽性対照としてグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)に対するcDNAプローブを用いて実施した。マウスpS2に対する核酸プローブは、発表されたマウスpS2 cDNA配列(ゲンバンク寄託番号:Z21858)に基づいて合成されたオリゴヌクレオチド対:5'-GAGAGGTTGCTGTTTTGATGACA-3'(配列番号:13)および5'-GCCAAGTCTTGATGTAGCCAGTT-3'(配列番号:14)を用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって作製した。GeneAmp RNA PCRキット(パーキン・エルマー)を、登録商標pCR II(インビトロゲン)クローニングベクターと共に、製造元の指示に従って用いた。RNAは野生型およびITF欠損(ノックアウト)マウスの双方の以下の組織から抽出した:胃、十二指腸、末端回腸、右結腸、虫垂、横行結腸、左結腸および直腸。各試料からの総RNA 15μgを1%アガロースゲル上で電気泳動しニトロセルロース紙に移した。ハイブリダイゼーション、洗浄、およびオートラジオグラフィー後、野生型のマウスは正常と思われる組織発現パターンを示した:ITFは小腸および結腸に発現され、これはラットおよびヒトにおけるITFについて認められた発現パターンと同じであった。変異マウスの分析により、胃腸管におけるITF発現の欠如を確認した。対照的に、その他の三葉型蛋白質である、SPおよびpS2の発現は、変異マウスの胃腸管において不変である。SPは胃において発現され、より低いレベルでは、野生型および変異マウスの双方の十二指腸に発現された。同様に、pS2は野生型およびITF欠損マウスの双方の胃に発現された。
ITFノックアウトマウスでは、ITF蛋白質が発現されていないことを確認するため、免疫細胞化学を以下のように実施した。結腸および小腸からの組織を還流の過程において固定し、4%パラホルムアルデヒドに浸して(マックリーンら(McLean)、J.Histochem.Cytochem.22:1077、1974)、パラフィンに抱埋した。切片を回収して、マウスITFのカルボキシ末端の予想されるアミノ酸18個からの合成ペプチドに対して作製されたポリクローナル抗体、または結腸ムチンに対するモノクローナル抗体(ポドルスキーら(Podolsky)、J.Clin.Invest.77:1263、1986)のいずれかによって染色した。一次抗体結合は、製造元の指示に従って、ビオチン化二次抗体、アビジンDH、ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼH、およびジアミノベンジジン4塩酸試薬によって可視化した(ベクタステイン(Vectastain)ABC、ベクター・ラボラトリーズ、ビューリンガム、カリフォルニア州)。免疫細胞化学の後、切片をヘマトキシリンで対染色して観察した。野生型マウスの結腸における杯状細胞は、両抗体に対して免疫反応性で、ITFおよびムチンに対して陽性染色反応を示した。対照的に、ITF欠損マウスの結腸における杯状細胞は検出可能なITFを欠損しているが、結腸ムチンは発現し続けた。
各ESクローンに由来するITF欠損マウスは、正常に発育するように思われれ、ヘテロ接合マウスおよび野生型の同腹子の兄弟たちと外観は区別がつかない。彼らの成長は遅延せず、明確な下痢または便潜血もなく成熟に達した。しかし、ITF欠損マウスの結腸は、野生型マウスの結腸より損傷を受けやすい可能性がある。この仮説を調べるため、マウスにおいて潰瘍化を伴う軽度の結腸上皮損傷を再現性よく生じる(キムら(Kim)、Scand.J.Gastroent.27:529、1992;ウェルズら(Wells)、J.Acquired Immune Deficiency Syndrome 3:361、1990;オカヤスら(Okayasu)、Gastroenterology 98:694、1990)デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を、動物の飲料水に混ぜて投与した。比較可能な野生型マウスにおけるDSSの効果の標準化後、野生型マウス20匹およびITF欠損マウス20匹(ヘテロ接合交配からの同腹子兄弟、各体重>20 g)の群を2.5%DSSを飲料水に混ぜて9日間処置した。
DSS(2.5%w/v)による処置の7日後、野生型およびITF欠損マウスの結腸を組織学的に調べた。左結腸の横断面を4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに抱埋して、ヘマトキシリン・エオジンで染色した。ITF欠損マウスの結腸には、明確な潰瘍化および出血を示す多数の部位が存在したのに対し、ほとんどの野生型マウスの結腸は、無処置マウスの結腸と肉眼的に区別がつかなかった。DSS処置ITF欠損結腸の組織学的検査により、多数のびらんおよび腺窩膿瘍を含む強度の炎症性変化の存在が確認された。損傷は遠位結腸、すなわち下行結腸、S字結腸、および直腸ではより顕著で、ここでは、大きい広範囲の粘膜潰瘍化を含んだ。同様に検査すると、粘膜のびらんはDSS処置野生型マウスの80%の組織においても認められたが、ほとんどが治癒するように思われる小さい病変で、ほとんどの病変の完全な再上皮形成を認めた。DSSに暴露したITF欠損マウスの結腸では再上皮形成の徴候を認めなかった。
所定の蛋白質(または蛋白質の断片または変異体)がピロリ菌感染症に関連した疾患の予防または治療に有用であるか否かを調べる一つの方法は、ピロリ菌感染症の確立された動物モデルにおいてそれを調べることである。そのようなモデルの一つが最近、フォークら((Falk)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:1515〜1519、1995)によって開発された。このモデルは、酵素α-1,3/4-フコシルトランスフェラーゼを発現し、その結果、ピロリ菌の臨床単離菌に結合する粘膜細胞の表面上にLebを発現するするトランスジェニックマウスを用いることを含む。ITFのような蛋白質をこの系に加えて、粘膜細胞に対するピロリ菌の結合レベルが減少すれば、蛋白質はピロリ菌の阻害剤と見なされるであろう。より詳しく述べると、アッセイは以下のように実施することができる。例えば、ピロリ菌を胃潰瘍または慢性活動性胃炎の患者から採取し、定常期まで増殖させ、例えば、ジゴキシゲニンまたはフルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)で標識する。次に、標識した菌を関係蛋白質と共に、成獣のトランスジェニックマウス(上記)の胃、十二指腸、または肝臓から調製した凍結切片に暴露する。対照として、野生型同腹子兄弟からの組織を用いて実験を平行に実施することができる。切片を氷冷メタノールで5分間固定し、洗浄緩衝液(TBS;0.1 mM CaCl2、1 mM MnCl2、1 mM MgCl2;10分/サイクル)で3回すすぎ、ブロッキング緩衝液(ベーリンガー・マンハイム;フォークら(Falk、前記)も参照)で処置する。菌を希釈緩衝液(リューペプチン(1μg/ml)、アプロチニン(1μg/ml)、[-1-p-トシルアミド-2-フェニルエチル・クロロメチルケトン(100 μg/ml)]、フェニルメチルスルフォニルフルオライド(100 μg/ml)、およびペプスタチンA(1μg/ml)を含むTBS;0.1 mM CaCl2、1 mM MnCl2、1 mM MgCl2)でOD600が0.05となるまで希釈し、湿潤チャンバー内で室温で2時間切片上に重層する。次にスライドを回転プラットフォーム(室温で5分/サイクル)上で洗浄緩衝液で6回洗浄する。ジゴキシゲニン標識細菌を、洗浄したスライド上で、組織ブロッキング緩衝液で1:100に希釈したFITC結合ヒツジ抗ジゴキシゲニン免疫グロブリン(ベーリンガー・マンハイム)で可視化する。核はビスベンズイミド(シグマ)で染色した。ブロッキング対照として、ジゴキシゲニンに結合した定常期の菌をOD600が0.05となるように希釈緩衝液中に懸濁し、室温で1時間Leb-HSAまたはLea-HSA(最終濃度、50 μg/ml;反応混合液、200 μl)の有無によらず振盪した。次に懸濁液をメタノール固定凍結切片上に重層する。
本発明の実践において、ITFは下記のように、消化性潰瘍疾患、炎症性腸疾患を治療するために、細菌感染症、放射線障害、またはその他の障害によって引き起こされる損傷から腸管を保護するために、投与してもよい。消化管の一部でない組織もまた治療することができる。これらの組織は、皮膚、眼の角膜表面、ならびに呼吸器および尿生殖管内の組織を含む。ITFの投与、投与量、および剤形の様相は治療すべき疾患に依存するであろう。治療レジメに関するさらなる手引きを下記に示す。さらに、本発明のポリペプチドおよび組成物は保護作用を発揮すると思われるため、損傷が起こる前に治療を始めてもよい。
抗体の製造
ITFは、間接イムノアッセイを用いて腸組織または血清中にITFを検出するためにモノクローナル抗体を製造するために用いてもよい。ITFは、ITF結合部位を検出するために、検出可能に標識してインサイチューハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いてもよい。標識は、フルオレスセインまたは放射性リガンドを含んでもよいがこれに限定しない。
ITF、その類似体、および断片と共に、SP(鎮痙性ポリペプチド)およびpS2のようなその他の三葉型因子を含む本発明のポリペプチドは、消化管内部に認められない組織の保護または治療に用いることができる。例えば、ポリペプチドは病変、潰瘍、火傷、または皮膚の剥離、眼の表面(すなわち角膜)、もしくは呼吸器または尿生殖管内のような、いかなる種類の創傷も治療するために用いることができる。損傷の正確な特性および損傷の原因は正確に定義する必要はない。
その他の態様は以下の請求の範囲内である。
Claims (33)
- 病変の形成の治療または阻害のための、三葉型ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を含むポリペプチド。
- 三葉型ポリペプチドがヒト三葉型ポリペプチドである、請求項1記載のポリペプチド。
- 三葉型ポリペプチドが腸三葉型ポリペプチド(ITF)である、請求項1記載のポリペプチド。
- 三葉型ポリペプチドが鎮痙性ポリペプチド(SP)である、請求項1記載のポリペプチド。
- 三葉型ポリペプチドがPS2である、請求項1記載のポリペプチド。
- 病変が消化管内にある、請求項1記載のポリペプチド。
- 病変が患者の口内にある、請求項6記載のポリペプチド。
- 病変が患者の食道内にある、請求項6記載のポリペプチド。
- 病変が患者の胃の内部にある、請求項6記載のポリペプチド。
- 病変が患者の腸内にある、請求項6記載のポリペプチド。
- 患者が、癌の治療のため放射線治療を受けている、請求項6記載のポリペプチド。
- 患者が、癌の治療のため化学療法を受けている、請求項6記載のポリペプチド。
- 患者が、消化管に損傷を与える薬物を受けている、請求項6記載のポリペプチド。
- 患者が消化性疾患に罹患している、請求項6記載のポリペプチド。
- 消化性疾患が、非潰瘍性消化不良である、請求項14記載のポリペプチド。
- 消化性疾患が胃炎である、請求項14記載のポリペプチド。
- 消化性疾患が胃食道逆流性障害である、請求項14記載のポリペプチド。
- 消化性疾患が、消化性潰瘍または十二指腸潰瘍である、請求項14記載のポリペプチド。
- 投与が経口投与である、請求項6記載のポリペプチド。
- 経口投与が、約10ミリグラム〜約100ミリグラムのポリペプチドの投与を含む、請求項6記載のポリペプチド。
- 病変が、消化管の組織以外の組織の内部にある、請求項1記載のポリペプチド。
- 組織が皮膚である、請求項21記載のポリペプチド。
- 投与が局所的投与である、請求項22記載のポリペプチド。
- 局所的投与が、約1 mg/ml〜約10 mg/mlのポリペプチドを含む軟膏の投与を含むものである、請求項23記載のポリペプチド。
- 組織に、眼の角膜表面が含まれる、請求項21記載のポリペプチド。
- 組織に、気道の組織が含まれる、請求項21記載のポリペプチド。
- 組織に、尿生殖管の組織が含まれる、請求項21記載のポリペプチド。
- 患者の組織における病変の形成を治療または阻害するための三葉型ポリペプチドを含む組成物。
- 患者の組織における病変の治療を目的とする医薬品の製造における、請求項28記載の組成物の使用。
- ポリペプチドが、マーカーをさらに含む、請求項1記載の三葉型ポリペプチド。
- マーカーが造影剤を含む、請求項30記載の三葉型ポリペプチド。
- ある組織においてITFレセプターを検出するための方法であって、検出可能な標識を施された三葉型ポリペプチドに該組織を接触させる段階と、該組織に結合した検出可能な標識を施された三葉型ポリペプチドのレベルを測定する段階とを含む方法。
- ある組織において三葉型ポリペプチドを検出するための方法であって、該三葉型ポリペプチドに特異的に結合する抗体に該組織を接触させる段階を含む方法。
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