JP2003520946A - 皮膚に対する効果に関して、化合物を評価する方法。 - Google Patents

皮膚に対する効果に関して、化合物を評価する方法。

Info

Publication number
JP2003520946A
JP2003520946A JP2001521146A JP2001521146A JP2003520946A JP 2003520946 A JP2003520946 A JP 2003520946A JP 2001521146 A JP2001521146 A JP 2001521146A JP 2001521146 A JP2001521146 A JP 2001521146A JP 2003520946 A JP2003520946 A JP 2003520946A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
promoter
transgenic
skin
preferred
reporter gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2001521146A
Other languages
English (en)
Inventor
バージェソン，ロバート
アマノ，サトシ
キシモト，ジロウ
ニシヤマ，トシロウ
エハマ，リツコ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
General Hospital Corp
Original Assignee
General Hospital Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/393,483 external-priority patent/US6689936B1/en
Application filed by General Hospital Corp filed Critical General Hospital Corp
Publication of JP2003520946A publication Critical patent/JP2003520946A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6448—Elastases, e.g. pancreatic elastase (3.4.21.36); leukocyte elastase (3.4.31.37)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12N9/6491—Matrix metalloproteases [MMP's], e.g. interstitial collagenase (3.4.24.7); Stromelysins (3.4.24.17; 3.2.1.22); Matrilysin (3.4.24.23)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/108—Swine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、皮膚に対する効果に関して、処置について評価する方法を提供する。また、本発明は、皮膚代謝プロモーターに結合したレポーター遺伝子を包含する、例えばマウス等の非ヒトトランスジェニック動物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 本発明は、例えばバーシカン(versican)、ＶＥＧＦ、またはＭＭＰプロモータ
ーのような皮膚の健康、老化、または外観に関連する遺伝子のプロモーターに結
合したレポーター遺伝子を発現するトランスジェニック動物、および例えば化合
物等の処置の皮膚に対する効果の評価においてそのような動物を用いる方法に関
するものである。
【０００２】 発明の概要 本発明者は、レポーター遺伝子に結合した皮膚−代謝プロモーターを包含する
１つ以上の構成物を有するトランスジェニック動物を用いることによって、皮膚
の健康または外観の増強において用いるための例えば毛抜きまたは毛剃りによる
脱毛あるいは化合物投与等の処置を評価できることを発見した。
【０００３】 従って、本発明は、皮膚に対する効果に関して、例えば毛抜きまたは毛剃りに
よる脱毛または化合物投与等の処置を評価する方法に関する。本発明は： 皮膚代謝関連プロモーター、好ましくはヒトプロモーターに結合したレポータ
ー遺伝子を包含するトランスジェニック動物を提供し； そのトランスジェニック動物またはその組織に対して処置を施し；さらに、 レポーター遺伝子の発現を評価して、それによって皮膚に対する処置の効果に
関してその処置を評価する： 各工程を含む。
【０００４】 生きた動物に、化合物投与等の処置を施すことができる。他の実施形態におい
て、化合物投与等の処置をトランスジェニック動物から採取した例えば細胞等の
組織に施しても差し支えない。
【０００５】 化合物投与等の処置の効果を、生きたトランスジェニック動物、死んだトラン
スジェニック動物、あるいは生きたまたは死んだトランスジェニック動物から採
取した組織において、評価することができる。
【０００６】 好ましい実施形態において、評価は、共焦点顕微鏡による、例えば蛍光信号等
の信号の検出を含む。
【０００７】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子の発現の評価工程は動物の生涯
の間に少なくとも1回反復される。最初と次の評価工程は、１、１０、３０、６
０、９０、１８０、３６５、または７００日程度まで間隔が空いていて差し支え
ない。最初と次の評価工程はいずれも、例えば共焦点顕微鏡を用いて、生きた動
物において実施することができる。
【０００８】 好ましい実施形態において、処置は化合物の投与を含み、さらに、化合物は：
トランスジェニック動物の皮膚に化合物を適用し；化合物を全身投与し；化合物
を経口投与し；あるいは化合物を好ましくは皮膚または皮下に注射する：ことに
よって投与される。好ましい実施形態において、例えばＳＤＳまたはＤＭＳＯを
含む製剤化等、皮膚の透過性を高める界面活性剤または物質等の適切な運搬手段
を用いて化合物を投与する。
【０００９】 好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は非ヒトトランスジェニ
ック動物である。例えば、トランスジェニック動物は、トランスジェニックミニ
ブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例え
ばヘアレスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウス
（Takeda et al., 1991, L. Am. Geriatr. 39: 911-919を参照）、もしくは促進
老化の表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等のトランスジェニ
ックマウスであって差し支えない。最も好ましい動物はマウスである。
【００１０】 好ましい実施形態において、プロモーターはトランスジェニック動物に対して
異種であって差し支えなく、すなわち、プロモーターは別の種に由来して差し支
えない。他の好ましい実施形態において、プロモーターはトランスジェニック動
物と同じ種に由来する。特に好ましい実施形態において、皮膚代謝関連プロモー
ターは、ヒト皮膚代謝関連プロモーターである。
【００１１】 特に好ましい実施形態において、皮膚代謝関連プロモーターは：例えばバーシ
カンプロモーター等のプロテオグリカンプロモーターのような、膜貫通タンパク
質または細胞外マトリックス成分をコードする遺伝子由来のプロモーター；例え
ばＭＭＰ1、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ４、ＭＭＰ５、ＭＭＰ６、ＭＭＰ７、
ＭＭＰ８またはＭＭＰ９プロモーター等のマトリックスメタロプロテイナーゼ（
ＭＭＰ）プロモーターのような皮膚において発現されているプロテアーゼ由来の
プロモーター；例えば血管内皮細胞増殖因子プロモーター等の血管機能に影響を
及ぼす遺伝子由来のプロモーター；例えばヒアルロン酸シンターゼ１プロモータ
ー、ヒアルロン酸シンターゼ２プロモーター、またはヒアルロン酸シンターゼ３
プロモーター等のヒアルロン酸シンターゼプロモーター；例えばＭＭＰ２または
ＭＭＰ９、好ましくはＭＭＰ９プロモーター等の皮膚において発現されているコ
ラゲナーゼのためのプロモーター；好中球エラスターゼプロモーターである。
【００１２】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、例えば着色または発光産物
を産生する酵素のような酵素等の比較的容易に検出できる産物を産生する。特に
好ましい実施形態において、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、
ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質遺伝子、アルカリホスファター
ゼ遺伝子、西洋ワサビペロキシダーゼ遺伝子、またはクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子であって差し支えない。
【００１３】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子評価を行う前に、反復して処置
を施す。
【００１４】 好ましい実施形態において、処置は化合物の投与を含み、本方法はさらに１回
以上のトランスジェニック動物への化合物の次の投与を含む。好ましい実施形態
において、１、２、３または４週間以上の間隔でトランスジェニック動物に化合
物を投与する。化合物は、一定のレベルで投与しても、様々なレベル範囲で投与
しても差し支えない。好ましい実施形態において、ＵＶ照射または他の皮膚に損
傷を与える処置の前、間、または後に、トランスジェニック動物に化合物を投与
する。
【００１５】 好ましい実施形態において、本方法は、例えば未処置トランスジェニック動物
におけるレポーター遺伝子の発現レベルのような対照値に対して、レポーター遺
伝子の発現を比較する工程をさらに含む。
【００１６】 好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は、第２皮膚代謝関連プ
ロモーターに結合した第２レポーター遺伝子をさらに包含しており、その第２皮
膚代謝関連プロモーターは第１皮膚代謝関連プロモーターと異なっている。第１
プロモーターに結合したレポーター遺伝子は、第２プロモーターに結合したレポ
ーター遺伝子と同じであっても異なっていても差し支えない。例えば、トランス
ジェニック動物は：バーシカンプロモーターに結合した第１レポーター遺伝子、
および血管内皮細胞増殖因子プロモーターに結合した第２レポーター遺伝子；バ
ーシカンプロモーターに結合した第１レポーター遺伝子、およびヒアルロン酸シ
ンターゼプロモーターに結合した第２レポーター遺伝子；ヒアルロン酸シンター
ゼプロモーターに結合した第１レポーター遺伝子、および血管内皮細胞増殖因子
プロモーターに結合した第２レポーター遺伝子；マトリックスメタロプロテイナ
ーゼ（ＭＭＰ）プロモーターに結合した第１レポーター遺伝子、およびＭＭＰ２
またはＭＭＰ９、好ましくはＭＭＰ９プロモーターに結合した第２レポーター遺
伝子；マトリックスプトテイナーゼ（ＭＭＰ）プロモーターに結合した第１レポ
ーター遺伝子、および好中球エラスターゼプロモーターに結合した第２レポータ
ー遺伝子；ＭＭＰ２またはＭＭＰ９、好ましくはＭＭＰ９プロモーターに結合し
た第１レポーター遺伝子、および好中球エラスターゼプロモーターに結合した第
２レポーター遺伝子：を包含していて差し支えない。好ましい実施形態において
、トランスジェニック動物は、その両方がアップレギュレートされている２つの
構成物を包含していて差し支えない。好ましい実施形態において、トランスジェ
ニック動物は、その両方がダウンレギュレートされている２つの構成物を包含し
ていて差し支えない。
【００１７】 好ましい実施形態において、本方法は、第２皮膚代謝関連プロモーターに結合
したレポーター遺伝子の発現を評価することをさらに含む。
【００１８】 好ましい実施形態において、化合物は：化粧品；非毒性物質；１つ以上の管轄
においてヒト用の薬物または化粧用途で認可されている物質；それらのレチノイ
ドまたは誘導体；ＴＧＦβ；ＴＧＦαである。
【００１９】 好ましい実施形態において、本方法は、トランスジェニック動物に第２の処置
を施す工程をさらに含む。第２の処置は、皮膚に傷をつけまたは損傷を与え、皮
膚細胞を殺すような処置であって差し支えなく、あるいは例えば毛抜き、毛剃り
、または脱毛剤の塗布による脱毛を含んでいて差し支えなく、あるいは通常、望
ましくない皮膚の状態をもたらす。第２の処置は、水、乾燥剤、刺激剤、炎症性
物質、光またはＵＶ照射の適用であって差し支えない。第２処置を与えた場合に
おける、処置に反応したレポーター遺伝子発現を特定し、さらに必要に応じて第
２処置を与えなかった場合の反応と比較する。
【００２０】 別の態様において、本発明は、皮膚に対する効果に関して、例えば毛抜きまた
は毛剃りによる脱毛あるいは化合物投与等の処置を評価する方法に関する。本方
法は： 好ましくはヒトの、バーシカンプロモーターに結合したレポーター遺伝子を包
含する、例えばマウス等のトランスジェニック動物を提供し； トランスジェニック動物またはそれらから採取した組織に、例えば毛抜きまた
は毛剃り等による脱毛あるいは化合物投与等の処置を施し；さらに、 レポーター遺伝子の発現を評価し、それによって皮膚の老化に対する効果に関
してその処置を評価する；各工程を含む。
【００２１】 生きた動物に、化合物投与等の処置を施して差し支えない。他の実施形態では
、例えばトランスジェニック動物から採取した組織に、化合物投与等の処置を施
す。
【００２２】 生きたトランスジェニック動物、死んだトランスジェニック動物、あるいは生
きたまたは死んだトランスジェニック動物から採取した組織において、化合物投
与等の処置の効果を評価することができる。
【００２３】 好ましい実施形態において、評価は、共焦点顕微鏡による、例えば蛍光信号等
の信号の検出を含む。
【００２４】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子の発現の評価工程は動物の生涯
の間に少なくとも1回反復される。最初と次の評価工程は、１、１０、３０、６
０、９０、１８０、３６５、または７００日程度まで間隔が空いていて差し支え
ない。最初と次の評価工程はいずれも、例えば共焦点顕微鏡を用いて、生きた動
物において実施することができる。
【００２５】 好ましい実施形態において、処置は化合物の投与を含み、さらに化合物は：ト
ランスジェニック動物の皮膚に化合物を適用し；化合物を全身投与し；化合物を
経口投与し；あるいは化合物を好ましくは皮膚または皮下に注射する：ことによ
って投与される。好ましい実施形態において、例えばＳＤＳまたはＤＭＳＯを含
む製剤化等、皮膚の透過性を高める界面活性剤または物質等の適切な運搬手段を
用いて化合物を投与する。
【００２６】 好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は非ヒトトランスジェニ
ック動物である。例えば、トランスジェニック動物は、トランスジェニックミニ
ブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例え
ばヘアレスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウス
、もしくは促進老化の表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等の
トランスジェニックマウスであって差し支えない。最も好ましい動物はマウスで
ある。
【００２７】 好ましい実施形態において、バーシカンプロモーターはヒトバーシカンプロモ
ーターである。
【００２８】 好ましい実施形態において、レポーターは、例えばグリーン蛍光タンパク質の
ような、好ましくは外因性基質または補因子の添加無しに発光しまたは蛍光を発
するような発光または蛍光産物である。
【００２９】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、例えば着色または発光産物
を産生する酵素のような酵素等の比較的容易に検出できる産物を産生する。特に
好ましい実施形態において、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、
ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質遺伝子、アルカリホスファター
ゼ遺伝子、西洋ワサビペロキシダーゼ遺伝子、またはクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子であって差し支えない。
【００３０】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子評価を行う前に、反復して処置
を施す。
【００３１】 好ましい実施形態において、処置は化合物の投与を含み、本方法はさらに１回
以上のトランスジェニック動物への化合物の次の投与を含む。好ましい実施形態
において、１、２、３または４週間以上の間隔でトランスジェニック動物に化合
物を投与する。化合物は、一定のレベルで投与しても、異なるレベル範囲で投与
しても差し支えない。好ましい実施形態において、ＵＶ照射または他の皮膚に損
傷を与える処置の前、間、または後に、トランスジェニック動物に化合物を投与
する。
【００３２】 好ましい実施形態において、本方法はさらに、例えば未処置トランスジェニッ
ク動物におけるレポーター遺伝子の発現レベルのような対照値に対して、レポー
ター遺伝子の発現を比較する工程を含む。
【００３３】 好ましい実施形態において、本方法はさらに、第２皮膚代謝関連プロモーター
に結合したレポーター遺伝子の発現を評価することを含む。
【００３４】 好ましい実施形態において、化合物は：化粧品；非毒性物質；１つ以上の管轄
においてヒト用薬物または化粧用途で認可されている物質；それらのレチノイド
または誘導体；ＴＧＦβ；ＴＧＦαである。
【００３５】 好ましい実施形態において、本方法はさらに、トランスジェニック動物に第２
の処置を施す工程を含む。第２の処置は、皮膚に傷をつけまたは損傷を与え、皮
膚細胞を殺すような処置であって差し支えなく、あるいは例えば毛抜き、毛剃り
、または脱毛剤の塗布による脱毛を含んでいて差し支えなく、あるいは通常、望
ましくない皮膚の状態をもたらす。第２の処置は、水、乾燥剤、刺激剤、炎症性
物質、光またはＵＶ照射の適用であって差し支えない。第２処置を与えた場合に
おける処置に反応したレポーター遺伝子発現を特定し、さらに必要に応じて第２
処置を与えなかった場合の反応と比較する。
【００３６】 別の態様において、本発明は、皮膚に対する効果に関して、例えば毛抜きまた
は毛剃りによる脱毛あるいは化合物投与等の処置を評価する方法に関する。本方
法は： 好ましくはヒトの、マトリックスメタロプロテイナーゼプロモーターに結合し
たレポーター遺伝子を包含する、例えばマウス等のトランスジェニック動物を提
供し； トランスジェニック動物またはそれらから採取した組織に処置を施し；さらに
、 レポーター遺伝子の発現を評価し、それによって皮膚の老化に対する効果に関
してその処置を評価する；各工程を含む。
【００３７】 生きた動物に、化合物投与等の処置を施して差し支えない。他の実施形態では
、例えばトランスジェニック動物から採取した組織に、化合物投与等の処置を施
す。
【００３８】 生きたトランスジェニック動物、死んだトランスジェニック動物、あるいは生
きたまたは死んだトランスジェニック動物から採取した組織において、化合物投
与等の処置の効果を評価することができる。
【００３９】 好ましい実施形態において、評価は、共焦点顕微鏡による、例えば蛍光信号等
の信号の検出を含む。
【００４０】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子の発現の評価工程は動物の生涯
の間に少なくとも1回反復される。最初と次の評価工程は、１、１０、３０、６
０、９０、１８０、３６５、または７００日程度まで間隔が空いていて差し支え
ない。最初と次の評価工程はいずれも、例えば共焦点顕微鏡を用いて、生きた動
物において実施することができる。
【００４１】 好ましい実施形態において、処置は化合物の投与を含み、さらに化合物は：ト
ランスジェニック動物の皮膚に化合物を適用し；化合物を全身投与し；化合物を
経口投与し；あるいは化合物を好ましくは皮膚または皮下に注射する：ことによ
って投与される。好ましい実施形態において、例えばＳＤＳまたはＤＭＳＯを含
む製剤化等、皮膚の透過性を高める界面活性剤または物質等の適切な運搬手段を
用いて化合物を投与する。
【００４２】 好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は非ヒトトランスジェニ
ック動物である。例えば、トランスジェニック動物は、トランスジェニックミニ
ブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例え
ばヘアレスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウス
、もしくは促進老化の表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等の
トランスジェニックマウスであって差し支えない。最も好ましい動物はマウスで
ある。
【００４３】 好ましい実施形態において、マトリックスメタロプロテイナーゼプロモーター
はヒトマトリックスメタロプロテイナーゼプロモーターである。
【００４４】 好ましい実施形態において、レポーターは、例えばグリーン蛍光タンパク質の
ような、好ましくは外因性基質または補因子の添加無しに発光しまたは蛍光を発
するような発光または蛍光産物である。
【００４５】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、例えば着色または発光産物
を産生する酵素のような酵素等の比較的容易に検出できる産物を産生する。特に
好ましい実施形態において、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、
ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質遺伝子、アルカリホスファター
ゼ遺伝子、西洋ワサビペロキシダーゼ遺伝子、またはクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子であって差し支えない。
【００４６】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子評価を行う前に、反復して処置
を施す。
【００４７】 好ましい実施形態において、処置は化合物の投与を含み、本方法はさらに１回
以上のトランスジェニック動物への化合物の次の投与を含む。好ましい実施形態
において、１、２、３または４週間以上の間隔でトランスジェニック動物に化合
物を投与する。化合物は、一定のレベルで投与しても、異なるレベル範囲で投与
しても差し支えない。好ましい実施形態において、ＵＶ照射または他の皮膚に損
傷を与える処置の前、間、または後に、トランスジェニック動物に化合物を投与
する。
【００４８】 好ましい実施形態において、本方法は、例えば未処置トランスジェニック動物
におけるレポーター遺伝子の発現レベルのような対照値に対して、レポーター遺
伝子の発現を比較する工程をさらに含む。
【００４９】 好ましい実施形態において、本方法は、第２皮膚代謝関連プロモーターに結合
したレポーター遺伝子の発現を評価することをさらに含む。
【００５０】 好ましい実施形態において、化合物は：化粧品；非毒性物質；１つ以上の管轄
においてヒト用薬物または化粧用途で認可されている物質；それらのレチノイド
または誘導体；ＴＧＦβ；ＴＧＦαである。
【００５１】 好ましい実施形態において、本方法はさらに、トランスジェニック動物に第２
の処置を施す工程を含む。第２の処置は、皮膚に傷をつけまたは損傷を与え、皮
膚細胞を殺すような処置であって差し支えなく、あるいは例えば毛抜き、毛剃り
、または脱毛剤の塗布による脱毛を含んでいて差し支えなく、あるいは通常、望
ましくない皮膚の状態をもたらす。第２の処置は、水、乾燥剤、刺激剤、炎症性
物質、光またはＵＶ照射の適用であって差し支えない。第２処置を与えた場合に
おける処置に反応したレポーター遺伝子発現を特定し、さらに必要に応じて第２
処置を与えなかった場合の反応と比較する。
【００５２】 別の態様において、本発明は、皮膚に対する効果に関して、例えば毛抜きまた
は毛剃りによる脱毛あるいは化合物投与等の処置を評価する方法に関する。本方
法は： 好ましくはヒトの、血管内皮細胞増殖因子プロモーターに結合したレポーター
遺伝子を包含する、例えばマウス等のトランスジェニック動物を提供し； トランスジェニック動物に処置を施し；さらに、 レポーター遺伝子の発現を評価し、それによって皮膚の老化に対する効果に関
してその処置を評価する；各工程を含む。
【００５３】 生きた動物に、化合物投与等の処置を施して差し支えない。他の実施形態では
、例えばトランスジェニック動物から採取した組織に、化合物投与等の処置を施
す。
【００５４】 生きたトランスジェニック動物、死んだトランスジェニック動物、あるいは生
きたまたは死んだトランスジェニック動物から採取した組織において、化合物投
与等の処置の効果を評価することができる。
【００５５】 好ましい実施形態において、評価は、共焦点顕微鏡による、例えば蛍光信号等
の信号の検出を含む。
【００５６】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子の発現の評価工程は動物の生涯
の間に少なくとも1回反復される。最初と次の評価工程は、１、１０、３０、６
０、９０、１８０、３６５、または７００日程度まで間隔が空いていて差し支え
ない。最初と次の評価工程はいずれも、例えば共焦点顕微鏡を用いて、生きた動
物において実施することができる。
【００５７】 好ましい実施形態において、処置は化合物投与を含み、さらに化合物は：トラ
ンスジェニック動物の皮膚に化合物を適用し；化合物を全身投与し；化合物を経
口投与し；あるいは化合物を好ましくは皮膚または皮下に注射する：ことによっ
て投与される。好ましい実施形態において、例えばＳＤＳまたはＤＭＳＯを含む
製剤化等、皮膚の透過性を高める界面活性剤または物質等の適切な運搬手段を用
いて化合物を投与する。
【００５８】 好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は非ヒトトランスジェニ
ック動物である。例えば、トランスジェニック動物は、トランスジェニックミニ
ブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例え
ばヘアレスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウス
、もしくは促進老化の表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等の
トランスジェニックマウスであって差し支えない。最も好ましい動物はマウスで
ある。
【００５９】 好ましい実施形態において、血管内皮細胞増殖因子プロモーターはヒト血管内
皮細胞増殖因子プロモーターである。
【００６０】 好ましい実施形態において、レポーターは、例えばグリーン蛍光タンパク質の
ような、好ましくは外因性基質または補因子の添加無しに発光しまたは蛍光を発
するような発光または蛍光産物である。
【００６１】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、例えば着色または発光産物
を産生する酵素のような酵素等の比較的容易に検出できる産物を産生する。特に
好ましい実施形態において、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、
ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質遺伝子、アルカリホスファター
ゼ遺伝子、西洋ワサビペロキシダーゼ遺伝子、またはクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子であって差し支えない。
【００６２】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子評価を行う前に、反復して処置
を施す。
【００６３】 好ましい実施形態において、処置は化合物投与を含み、本方法はさらに１回以
上のトランスジェニック動物への化合物の次の投与を含む。好ましい実施形態に
おいて、１、２、３または４週間以上の間隔でトランスジェニック動物に化合物
を投与する。化合物は、一定のレベルで投与しても、異なるレベル範囲で投与し
ても差し支えない。好ましい実施形態において、ＵＶ照射または他の皮膚に損傷
を与える処置の前、間、または後に、トランスジェニック動物に化合物を投与す
る。
【００６４】 好ましい実施形態において、本方法はさらに、例えば未処置トランスジェニッ
ク動物におけるレポーター遺伝子の発現レベルのような対照値に対して、レポー
ター遺伝子の発現を比較する工程を含む。
【００６５】 好ましい実施形態において、本方法はさらに、第２皮膚代謝関連プロモーター
に結合したレポーター遺伝子の発現を評価することを含む。
【００６６】 好ましい実施形態において、化合物は：化粧品；非毒性物質；１つ以上の管轄
においてヒト用薬物または化粧用途で認可されている物質；それらのレチノイド
または誘導体；ＴＧＦβ；ＴＧＦαである。
【００６７】 好ましい実施形態において、本方法はさらに、トランスジェニック動物に第２
の処置を施す工程を含む。第２の処置は、皮膚に傷をつけまたは損傷を与え、皮
膚細胞を殺すような処置であって差し支えなく、あるいは例えば毛抜き、毛剃り
、または脱毛剤の塗布による脱毛を含んでいて差し支えなく、あるいは通常、望
ましくない皮膚の状態をもたらす。第２の処置は、水、乾燥剤、刺激剤、炎症性
物質、光またはＵＶ照射の適用であって差し支えない。第２処置を与えた場合に
おける処置に反応したレポーター遺伝子発現を特定し、さらに必要に応じて第２
処置を与えなかった場合の反応と比較する。
【００６８】 別の態様において、本発明は、皮膚に対する効果に関して、例えば毛抜きまた
は毛剃りによる脱毛あるいは化合物投与等の処置を評価する方法に関する。本方
法は： 好ましくはヒトの、ヒアルロン酸シンターゼプロモーターに結合したレポータ
ー遺伝子を包含する、例えばマウス等のトランスジェニック動物を提供し； トランスジェニック動物に処置を施し；さらに、 レポーター遺伝子の発現を評価し、それによって皮膚の老化に対する効果に関
してその処置を評価する；各工程を含む。
【００６９】 生きた動物に、化合物投与等の処置を施して差し支えない。他の実施形態では
、例えばトランスジェニック動物から採取した組織に、化合物投与等の処置を施
す。
【００７０】 生きたトランスジェニック動物、死んだトランスジェニック動物、あるいは生
きたまたは死んだトランスジェニック動物から採取した組織において、化合物投
与等の処置の効果を評価することができる。
【００７１】 好ましい実施形態において、評価は、共焦点顕微鏡による、例えば蛍光信号等
の信号の検出を含む。
【００７２】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子の発現の評価工程は動物の生涯
の間に少なくとも1回反復される。最初と次の評価工程は、１、１０、３０、６
０、９０、１８０、３６５、または７００日程度まで間隔が空いていて差し支え
ない。最初と次の評価工程はいずれも、例えば共焦点顕微鏡を用いて、生きた動
物において実施することができる。
【００７３】 好ましい実施形態において、処置は化合物投与を含み、さらに化合物は：トラ
ンスジェニック動物の皮膚に化合物を適用し；化合物を全身投与し；化合物を経
口投与し；あるいは化合物を好ましくは皮膚または皮下に注射する：ことによっ
て投与される。好ましい実施形態において、例えばＳＤＳまたはＤＭＳＯを含む
製剤化等、皮膚の透過性を高める界面活性剤または物質等の適切な運搬手段を用
いて化合物を投与する。
【００７４】 好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は非ヒトトランスジェニ
ック動物である。例えば、トランスジェニック動物は、トランスジェニックミニ
ブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例え
ばヘアレスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウス
、もしくは促進老化の表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等の
トランスジェニックマウスであって差し支えない。最も好ましい動物はマウスで
ある。
【００７５】 好ましい実施形態において、ヒアルロン酸シンターゼプロモーターはヒトヒア
ルロン酸シンターゼプロモーターである。
【００７６】 好ましい実施形態において、レポーターは、例えばグリーン蛍光タンパク質の
ような、好ましくは外因性基質または補因子の添加無しに発光しまたは蛍光を発
するような発光または蛍光産物である。
【００７７】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、例えば着色または発光産物
を産生する酵素のような酵素等の比較的容易に検出できる産物を産生する。特に
好ましい実施形態において、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、
ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質遺伝子、アルカリホスファター
ゼ遺伝子、西洋ワサビペロキシダーゼ遺伝子、またはクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子であって差し支えない。
【００７８】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子評価を行う前に、反復して処置
を施す。
【００７９】 好ましい実施形態において、処置は化合物投与を含み、本方法はさらに１回以
上のトランスジェニック動物への化合物の次の投与を含む。好ましい実施形態に
おいて、１、２、３または４週間以上の間隔でトランスジェニック動物に化合物
を投与する。化合物は、一定のレベルで投与しても、異なるレベル範囲で投与し
ても差し支えない。好ましい実施形態において、ＵＶ照射または他の皮膚に損傷
を与える処置の前、間、または後に、トランスジェニック動物に化合物を投与す
る。
【００８０】 好ましい実施形態において、本方法はさらに、例えば未処置トランスジェニッ
ク動物におけるレポーター遺伝子の発現レベルのような対照値に対して、レポー
ター遺伝子の発現を比較する工程を含む。
【００８１】 好ましい実施形態において、本方法はさらに、第２皮膚代謝関連プロモーター
に結合したレポーター遺伝子の発現を評価することを含む。
【００８２】 好ましい実施形態において、化合物は：化粧品；非毒性物質；１つ以上の管轄
においてヒト用薬物または化粧用途で認可されている物質；それらのレチノイド
または誘導体；ＴＧＦβ；ＴＧＦαである。
【００８３】 好ましい実施形態において、本方法はさらに、トランスジェニック動物に第２
の処置を施す工程を含む。第２の処置は、皮膚に傷をつけまたは損傷を与え、皮
膚細胞を殺すような処置であって差し支えなく、あるいは例えば毛抜き、毛剃り
、または脱毛剤の塗布による脱毛を含んでいて差し支えなく、あるいは通常、望
ましくない皮膚の状態をもたらす。第２の処置は、水、乾燥剤、刺激剤、炎症性
物質、光またはＵＶ照射の適用であって差し支えない。第２処置を与えた場合に
おける処置に反応したレポーター遺伝子発現を特定し、さらに必要に応じて第２
処置を与えなかった場合の反応と比較する。
【００８４】 別の態様において、本発明は、皮膚に対する効果に関して、例えば毛抜きまた
は毛剃りによる脱毛あるいは化合物投与等の処置を評価する方法に関する。本方
法は： 好ましくはヒトの、ＭＭＰ２またはＭＭＰ９、好ましくはＭＭＰ９プロモータ
ーに結合したレポーター遺伝子を包含する、例えばマウス等のトランスジェニッ
ク動物を提供し； トランスジェニック動物またはそれらから採取した組織に処置を施し；さらに
、 レポーター遺伝子の発現を評価し、それによって皮膚の老化に対する効果に関
してその処置を評価する；各工程を含む。
【００８５】 生きた動物に、化合物投与等の処置を施して差し支えない。他の実施形態では
、例えばトランスジェニック動物から採取した組織に、化合物投与等の処置を施
す。
【００８６】 生きたトランスジェニック動物、死んだトランスジェニック動物、あるいは生
きたまたは死んだトランスジェニック動物から採取した組織において、化合物投
与等の処置の効果を評価することができる。
【００８７】 好ましい実施形態において、評価は、共焦点顕微鏡による、例えば蛍光信号等
の信号の検出を含む。
【００８８】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子の発現の評価工程は動物の生涯
の間に少なくとも1回反復される。最初と次の評価工程は、１、１０、３０、６
０、９０、１８０、３６５、または７００日程度まで間隔が空いていて差し支え
ない。最初と次の評価工程はいずれも、例えば共焦点顕微鏡を用いて、生きた動
物において実施することができる。
【００８９】 好ましい実施形態において、処置は化合物投与を含み、さらに化合物は：トラ
ンスジェニック動物の皮膚に化合物を適用し；化合物を全身投与し；化合物を経
口投与し；あるいは化合物を好ましくは皮膚または皮下に注射する：ことによっ
て投与される。好ましい実施形態において、例えばＳＤＳまたはＤＭＳＯを含む
製剤化等、皮膚の透過性を高める界面活性剤または物質等の適切な運搬手段を用
いて化合物を投与する。
【００９０】 好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は非ヒトトランスジェニ
ック動物である。例えば、トランスジェニック動物は、トランスジェニックミニ
ブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例え
ばヘアレスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウス
、もしくは促進老化の表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等の
トランスジェニックマウスであって差し支えない。最も好ましい動物はマウスで
ある。
【００９１】 好ましい実施形態において、ＭＭＰ２またはＭＭＰ９、好ましくはＭＭＰ９プ
ロモーターはヒトＭＭＰ２またはＭＭＰ９、好ましくはＭＭＰ９プロモーターで
ある。
【００９２】 好ましい実施形態において、レポーターは、例えばグリーン蛍光タンパク質の
ような、好ましくは外因性基質または補因子の添加無しに発光しまたは蛍光を発
するような発光または蛍光産物である。
【００９３】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、例えば着色または発光産物
を産生する酵素のような酵素等の比較的容易に検出できる産物を産生する。特に
好ましい実施形態において、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、
ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質遺伝子、アルカリホスファター
ゼ遺伝子、西洋ワサビペロキシダーゼ遺伝子、またはクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子であって差し支えない。
【００９４】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子評価を行う前に、反復して処置
を施す。
【００９５】 好ましい実施形態において、処置は化合物投与を含み、本方法はさらに１回以
上のトランスジェニック動物への化合物の次の投与を含む。好ましい実施形態に
おいて、１、２、３または４週間以上の間隔でトランスジェニック動物に化合物
を投与する。化合物は、一定のレベルで投与しても、異なるレベル範囲で投与し
ても差し支えない。好ましい実施形態において、ＵＶ照射または他の皮膚に損傷
を与える処置の前、間、または後に、トランスジェニック動物に化合物を投与す
る。
【００９６】 好ましい実施形態において、本方法はさらに、例えば未処置トランスジェニッ
ク動物におけるレポーター遺伝子の発現レベルのような対照値に対して、レポー
ター遺伝子の発現を比較する工程を含む。
【００９７】 好ましい実施形態において、本方法はさらに、第２皮膚代謝関連プロモーター
に結合したレポーター遺伝子の発現を評価することを含む。
【００９８】 好ましい実施形態において、化合物は：化粧品；非毒性物質；１つ以上の管轄
においてヒト用薬物または化粧用途で認可されている物質；それらのレチノイド
または誘導体；ＴＧＦβ；ＴＧＦαである。
【００９９】 好ましい実施形態において、本方法はさらに、トランスジェニック動物に第２
の処置を施す工程を含む。第２の処置は、皮膚に傷をつけまたは損傷を与え、皮
膚細胞を殺すような処置であって差し支えなく、あるいは例えば毛抜き、毛剃り
、または脱毛剤の塗布による脱毛を含んでいて差し支えなく、あるいは通常、望
ましくない皮膚の状態をもたらす。第２の処置は、水、乾燥剤、刺激剤、炎症性
物質、光またはＵＶ照射の適用であって差し支えない。第２処置を与えた場合に
おける処置に反応したレポーター遺伝子発現を特定し、さらに必要に応じて第２
処置を与えなかった場合の反応と比較する。
【０１００】 別の態様において、本発明は、皮膚に対する効果に関して、例えば毛抜きまた
は毛剃りによる脱毛あるいは化合物投与等の処置を評価する方法に関する。本方
法は： 好ましくはヒトの、好中球エラスターゼプロモーターに結合したレポーター遺
伝子を包含する、例えばマウス等のトランスジェニック動物を提供し； トランスジェニック動物またはそれらから採取した組織に処置を施し；さらに
、 レポーター遺伝子の発現を評価し、それによって皮膚の老化に対する効果に関
してその処置を評価する： 各工程を含む。
【０１０１】 生きた動物に、化合物投与等の処置を施して差し支えない。他の実施形態では
、例えばトランスジェニック動物から採取した組織に、化合物投与等の処置を施
す。
【０１０２】 生きたトランスジェニック動物、死んだトランスジェニック動物、あるいは生
きたまたは死んだトランスジェニック動物から採取した組織において、化合物投
与等の処置の効果を評価することができる。
【０１０３】 好ましい実施形態において、評価は、共焦点顕微鏡による、例えば蛍光信号等
の信号の検出を含む。
【０１０４】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子の発現の評価工程は動物の生涯
の間に少なくとも1回反復される。最初と次の評価工程は、１、１０、３０、６
０、９０、１８０、３６５、または７００日程度まで間隔が空いていて差し支え
ない。最初と次の評価工程はいずれも、例えば共焦点顕微鏡を用いて、生きた動
物において実施することができる。
【０１０５】 好ましい実施形態において、処置は化合物投与を含み、さらに化合物は：トラ
ンスジェニック動物の皮膚に化合物を適用し；化合物を全身投与し；化合物を経
口投与し；あるいは化合物を好ましくは皮膚または皮下に注射する：ことによっ
て投与される。好ましい実施形態において、例えばＳＤＳまたはＤＭＳＯを含む
製剤化等、皮膚の透過性を高める界面活性剤または物質等の適切な運搬手段を用
いて化合物を投与する。
【０１０６】 好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は非ヒトトランスジェニ
ック動物である。例えば、トランスジェニック動物は、トランスジェニックミニ
ブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例え
ばヘアレスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウス
、もしくは促進老化の表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等の
トランスジェニックマウスであって差し支えない。最も好ましい動物はマウスで
ある。
【０１０７】 好ましい実施形態において、好中球エラスターゼプロモーターはヒト好中球エ
ラスターゼプロモーターである。
【０１０８】 好ましい実施形態において、レポーターは、例えばグリーン蛍光タンパク質の
ような、好ましくは外因性基質または補因子の添加無しに発光しまたは蛍光を発
するような発光または蛍光産物である。
【０１０９】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、例えば着色または発光産物
を産生する酵素のような酵素等の比較的容易に検出できる産物を産生する。特に
好ましい実施形態において、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、
ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質遺伝子、アルカリホスファター
ゼ遺伝子、西洋ワサビペロキシダーゼ遺伝子、またはクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子であって差し支えない。
【０１１０】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子評価を行う前に、反復して処置
を施す。
【０１１１】 好ましい実施形態において、処置は化合物投与を含み、本方法はさらに１回以
上のトランスジェニック動物への化合物の次の投与を含む。好ましい実施形態に
おいて、１、２、３または４週間以上の間隔でトランスジェニック動物に化合物
を投与する。化合物は、一定のレベルで投与しても、異なるレベル範囲で投与し
ても差し支えない。好ましい実施形態において、ＵＶ照射または他の皮膚に損傷
を与える処置の前、間、または後に、トランスジェニック動物に化合物を投与す
る。
【０１１２】 好ましい実施形態において、本方法はさらに、例えば未処置トランスジェニッ
ク動物におけるレポーター遺伝子の発現レベルのような対照値に対して、レポー
ター遺伝子の発現を比較する工程を含む。
【０１１３】 好ましい実施形態において、本方法はさらに、第２皮膚代謝関連プロモーター
に結合したレポーター遺伝子の発現を評価することを含む。
【０１１４】 好ましい実施形態において、化合物は：化粧品；非毒性物質；１つ以上の管轄
においてヒト用薬物または化粧用途で認可されている物質；それらのレチノイド
または誘導体；ＴＧＦβ；ＴＧＦαである。
【０１１５】 好ましい実施形態において、本方法はさらに、トランスジェニック動物に第２
の処置（化合物以外）を施す工程を含む。第２の処置は、皮膚に傷をつけまたは
損傷を与え、皮膚細胞を殺すような処置であって差し支えなく、あるいは例えば
毛抜き、毛剃り、または脱毛剤の塗布による脱毛を含んでいて差し支えなく、あ
るいは通常、望ましくない皮膚の状態をもたらす。第２の処置は、水、乾燥剤、
刺激剤、炎症性物質、光またはＵＶ照射の適用であって差し支えない。第２処置
を与えた場合における処置に反応したレポーター遺伝子発現を特定し、さらに必
要に応じて第２処置を与えなかった場合の反応と比較する。
【０１１６】 別の態様において、本発明は、例えばバーシカンプロモーターに結合したレポ
ーター遺伝子を包含するトランスジェニック動物のような、この中に記載の非ヒ
トトランスジェニック動物に関する。
【０１１７】 好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は非ヒトトランスジェ
ニック動物である。例えば、トランスジェニック動物は、トランスジェニックミ
ニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例
えばヘアレスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウ
ス（Takeda et al., 1991, L. Am. Geriatr. 39: 911-919を参照）、もしくは促
進老化の表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等のトランスジェ
ニックマウスであって差し支えない。最も好ましい動物はマウスである。
【０１１８】 好ましい実施形態において、バーシカンプロモーターはヒトバーシカンプロモ
ーターである。
【０１１９】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、例えば着色または発光産物
を産生する酵素のような酵素等の比較的容易に検出できる産物を産生する。特に
好ましい実施形態において、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、
ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質遺伝子、アルカリホスファター
ゼ遺伝子、西洋ワサビペロキシダーゼ遺伝子、またはクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子であって差し支えない。
【０１２０】 別の態様において、本発明は、例えばマトリックスメタロプロテイナーゼプロ
モーターに結合したレポーター遺伝子を包含する、例えばマウスのような非ヒト
トランスジェニック動物またはそれらから採取した組織に関する。
【０１２１】 好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は非ヒトトランスジェ
ニック動物である。例えば、トランスジェニック動物は、トランスジェニックミ
ニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例
えばヘアレスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウ
ス、もしくは促進老化の表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等
のトランスジェニックマウスであって差し支えない。最も好ましい動物はマウス
である。
【０１２２】 好ましい実施形態において、マトリックスメタロプロテイナーゼプロモーター
はヒトマトリックスメタロプロテイナーゼプロモーターである。
【０１２３】 好ましい実施形態において、レポーターは、例えばグリーン蛍光タンパク質の
ような、好ましくは外因性基質または補因子の添加無しに発光しまたは蛍光を発
するような発光または蛍光産物である。
【０１２４】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、例えば着色または発光産物
を産生する酵素のような酵素等の比較的容易に検出できる産物を産生する。特に
好ましい実施形態において、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、
ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質遺伝子、アルカリホスファター
ゼ遺伝子、西洋ワサビペロキシダーゼ遺伝子、またはクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子であって差し支えない。
【０１２５】 別の態様において、本発明は、例えば血管内皮細胞増殖因子プロモーターに結
合したレポーター遺伝子を包含する、例えばマウスのような非ヒトトランスジェ
ニック動物またはそれらから採取した組織に関する。
【０１２６】 好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は非ヒトトランスジェ
ニック動物である。例えば、トランスジェニック動物は、トランスジェニックミ
ニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例
えばヘアレスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウ
ス、もしくは促進老化の表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等
のトランスジェニックマウスであって差し支えない。最も好ましい動物はマウス
である。
【０１２７】 好ましい実施形態において、血管内皮細胞増殖因子プロモーターはヒト血管内
皮細胞増殖因子プロモーターである。
【０１２８】 好ましい実施形態において、レポーターは、例えばグリーン蛍光タンパク質の
ような、好ましくは外因性基質または補因子の添加無しに発光しまたは蛍光を発
するような発光または蛍光産物である。
【０１２９】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、例えば着色または発光産物
を産生する酵素のような酵素等の比較的容易に検出できる産物を産生する。特に
好ましい実施形態において、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、
ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質遺伝子、アルカリホスファター
ゼ遺伝子、西洋ワサビペロキシダーゼ遺伝子、またはクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子であって差し支えない。
【０１３０】 別の態様において、本発明は、例えばヒアルロン酸シンターゼプロモーターに
結合したレポーター遺伝子を包含する、例えばマウスのような非ヒトトランスジ
ェニック動物またはそれらから採取した組織に関する。
【０１３１】 好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は非ヒトトランスジェ
ニック動物である。例えば、トランスジェニック動物は、トランスジェニックミ
ニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例
えばヘアレスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウ
ス、もしくは促進老化の表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等
のトランスジェニックマウスであって差し支えない。最も好ましい動物はマウス
である。
【０１３２】 好ましい実施形態において、ヒアルロン酸シンターゼプロモーターはヒトヒア
ルロン酸シンターゼプロモーターである。
【０１３３】 好ましい実施形態において、レポーターは、例えばグリーン蛍光タンパク質の
ような、好ましくは外因性基質または補因子の添加無しに発光しまたは蛍光を発
するような発光または蛍光産物である。
【０１３４】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、例えば着色または発光産物
を産生する酵素のような酵素等の比較的容易に検出できる産物を産生する。特に
好ましい実施形態において、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、
ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質遺伝子、アルカリホスファター
ゼ遺伝子、西洋ワサビペロキシダーゼ遺伝子、またはクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子であって差し支えない。
【０１３５】 別の態様において、本発明は、例えばＩＶ型コラゲナーゼプロモーターに結合
したレポーター遺伝子を包含する、例えばマウスのような非ヒトトランスジェニ
ック動物またはそれらから採取した組織に関する。
【０１３６】 好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は非ヒトトランスジェ
ニック動物である。例えば、トランスジェニック動物は、トランスジェニックミ
ニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例
えばヘアレスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウ
ス、もしくは促進老化の表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等
のトランスジェニックマウスであって差し支えない。最も好ましい動物はマウス
である。
【０１３７】 特に好ましい実施形態において、ＭＭＰ２またはＭＭＰ９、好ましくはＭＭＰ
９プロモーターはヒトＭＭＰ２またはＭＭＰ９、好ましくはＭＭＰ９プロモータ
ーである。
【０１３８】 好ましい実施形態において、レポーターは、例えばグリーン蛍光タンパク質の
ような、好ましくは外因性基質または補因子の添加無しに発光しまたは蛍光を発
するような発光または蛍光産物である。
【０１３９】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、例えば着色または発光産物
を産生する酵素のような酵素等の比較的容易に検出できる産物を産生する。特に
好ましい実施形態において、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、
ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質遺伝子、アルカリホスファター
ゼ遺伝子、西洋ワサビペロキシダーゼ遺伝子、またはクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子であって差し支えない。
【０１４０】 別の態様において、本発明は、例えば好中球エラスターゼプロモーターに結合
したレポーター遺伝子を包含する、例えばマウスのような非ヒトトランスジェニ
ック動物またはそれらから採取した組織に関する。
【０１４１】 好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は非ヒトトランスジェ
ニック動物である。例えば、トランスジェニック動物は、トランスジェニックミ
ニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例
えばヘアレスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウ
ス、もしくは促進老化の表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等
のトランスジェニックマウスであって差し支えない。最も好ましい動物はマウス
である。
【０１４２】 好ましい実施形態において、好中球エラスターゼプロモーターはヒト好中球エ
ラスターゼプロモーターである。
【０１４３】 好ましい実施形態において、レポーターは、例えばグリーン蛍光タンパク質の
ような、好ましくは外因性基質または補因子の添加無しに発光しまたは蛍光を発
するような発光または蛍光産物である。
【０１４４】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、例えば着色または発光産物
を産生する酵素のような酵素等の比較的容易に検出できる産物を産生する。特に
好ましい実施形態において、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、
ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質遺伝子、アルカリホスファター
ゼ遺伝子、西洋ワサビペロキシダーゼ遺伝子、またはクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子であって差し支えない。
【０１４５】 別の態様において、本発明は、この中に記載されているプロモーター−レポー
ター遺伝子構成物に関する。
【０１４６】 別の態様において、本発明は、組織におけるＧＦＰの存在または分布を分析す
る方法に関する。本方法は： ＧＦＰを含有する例えば組織切片等の組織試料を提供し； 蛍光発光または蛍光発光の欠損を評価または検出し、その検出工程が水溶液で
の洗浄または固定の前になされ； それによって組織中のＧＦＰを分析する；各工程を含む。
【０１４７】 好ましい実施形態において、検出工程前に組織を凍結する。検出前に試料を固
定剤と接触させない。
【０１４８】 好ましい実施形態において、組織は、例えば、トランスジェニックミニブタ、
トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例えばヘア
レスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウス（Take
da et al., 1991, L. Am. Geriatr. 39: 911-919を参照）、もしくは促進老化の
表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等のトランスジェニックマ
ウスに由来し；ＧＦＰは、ＧＦＰをコードする導入遺伝子配列から発現され、ま
たは例えば導入遺伝子のプロモータ−またはエンハンサー等の導入遺伝子の調節
要素の制御下で発現される。
【０１４９】 好ましい実施形態において、プロモーターはヒトプロモーターである。
【０１５０】 好ましい実施形態において、検出工程は、例えば蛍光またはエピ蛍光(epi-flu
orescent)顕微鏡のような顕微鏡を用いた試料の検査を含む。
【０１５１】 好ましい実施形態において、評価工程は、共焦点顕微鏡を用いた、例えば蛍光
信号等の信号の検出を含む。
【０１５２】 本方法において、この中に記載の動物を用いることができる。
【０１５３】 別の態様において、本発明は、例えば毛嚢の外側毛根鞘のような毛嚢において
レポーター分子を発現する動物において、毛周期の段階を特定する方法に関する
。本方法は、レポーター発現の存在または不在を評価または検出することを含み
、存在することは成長毛周期（発育相）に関連し、かつ不在は休止毛周期（テロ
ゲンおよびカトゲン(catogen)）に関連する。
【０１５４】 好ましい実施形態において、レポーター分子は、例えば外側毛根鞘等の毛嚢に
おいて発現されているプロモーターの制御下にある。
【０１５５】 好ましい実施形態において、プロモーターはヒトプロモーターである。
【０１５６】 好ましい実施形態において、レポーターは、例えばグリーン蛍光タンパク質の
ような、好ましくは外因性基質または補因子の添加無しに発光しまたは蛍光を発
するような発光または蛍光産物である。
【０１５７】 好ましい実施形態において、レポーター分子はＧＦＰである。
【０１５８】 好ましい実施形態において、動物は、例えば、トランスジェニックミニブタ、
トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例えばヘア
レスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウス、もし
くは促進老化の表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等のトラン
スジェニックマウスのような、トランスジェニック動物である。
【０１５９】 本方法において、この中に記載の動物を用いることができる。
【０１６０】 好ましい実施形態において、プロモーターは、ＶＥＧＦプロモーター、バーシ
カンプロモーター、またはこの中に記載の他のプロモーターである。
【０１６１】 別の態様において、本発明は、創傷治癒を分析する方法に関する。本方法は：
ＶＥＧＦプロモーターの制御下でレポーター分子を発現する動物を提供し；創傷
におけるレポーター分子の存在または不在を検出し；それによって創傷治癒を分
析する；各工程を含む。
【０１６２】 好ましい実施形態において、検出工程は記録される。
【０１６３】 好ましい実施形態において、動物または動物由来の組織に、化合物投与等の処
置を施す。そのような実施形態において、本方法を用いて、創傷治癒に対する処
置の効果を評価することができる。処置対象または組織からの結果と、未処置対
象または組織からの結果とを比較するのが望ましい。
【０１６４】 好ましい実施形態において、レポーターは、例えばグリーン蛍光タンパク質の
ような、好ましくは外因性基質または補因子の添加無しに発光しまたは蛍光を発
するような発光または蛍光産物である。
【０１６５】 好ましい実施形態において、レポーター分子はＧＦＰである。
【０１６６】 好ましい実施形態において、動物は、例えば、トランスジェニックミニブタ、
トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例えばヘア
レスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウス、もし
くは促進老化の表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等のトラン
スジェニックマウスのような、トランスジェニック動物である。
【０１６７】 本方法において、この中に記載の動物を用いることができる。
【０１６８】 好ましい実施形態において、プロモーターはヒトプロモーターである。
【０１６９】 別の態様において、本発明は、ＧＦＰ導入遺伝子を包含するトランスジェニッ
ク動物におけるＧＦＰを分析する方法に関する。本方法は： 動物または動物由来の組織中におけるＧＦＰの存在または不在を評価または検
出する第１工程；および（必要に応じて）、 動物または動物由来の組織中におけるＧＦＰの存在または不在を評価または
検出する第２工程；さらに、 それによってＧＦＰ発現を分析する；各工程を含む 。
【０１７０】 好ましい実施形態において（本方法またはこの中に記載の他の方法における）
、ＧＦＰはレッドシフトＧＦＰである。
【０１７１】 好ましい実施形態において、動物は、例えば、トランスジェニックミニブタ、
トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例えばヘア
レスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウス、もし
くは促進老化の表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等のトラン
スジェニックマウスのような、トランスジェニック動物である。本方法において
、この中に記載の動物を用いることができる。
【０１７２】 好ましい実施形態において、第１工程と第２工程の間に、１、５、１０、２０
、３０、６０、１８０、３６５日以上経過する。
【０１７３】 好ましい実施形態において、組織は皮膚組織である。
【０１７４】 好ましい実施形態において、検出工程は生きた動物において実施される。
【０１７５】 好ましい実施形態において、プロモーターはヒトプロモーターである。
【０１７６】 好ましい実施形態において、評価工程は、共焦点顕微鏡を用いた、例えば蛍光
信号等の信号の検出を含む。
【０１７７】 別の態様において、本発明は、例えばトランスジェニックマウスまたはブタの
ようなトランスジェニック動物における導入遺伝子の発現を分析する方法に関す
る。本方法は： 生きたトランスジェニック動物を提供し； 導入遺伝子配列によってコードされたまたは例えばプロモーターまたはエンハ
ンサー等の導入遺伝子の調節要素の制御下にある、例えばＧＦＰ等のレポーター
遺伝子の存在または不在を評価または検出し； それによって導入遺伝子の発現を分析する；各工程を含む 。
【０１７８】 好ましい実施形態において、動物は、例えば、トランスジェニックミニブタ、
トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例えばヘア
レスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウス、もし
くは促進老化の表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等のトラン
スジェニックマウスのような、トランスジェニック動物である。本方法において
、この中に記載の動物を用いることができる。
【０１７９】 好ましい実施形態において、レポーターは、ＶＥＧＦプロモーターまたはこの
中に記載の別のプロモーターの制御下にある。
【０１８０】 好ましい実施形態において、プロモーターはヒトプロモーターである。
【０１８１】 好ましい実施形態において、皮膚において発現されているプロモーターである
。
【０１８２】 好ましい実施形態において、評価工程は、共焦点顕微鏡を用いた、例えば蛍光
信号等の信号の検出を含む。
【０１８３】 好ましい実施形態において、組織は皮膚組織である。
【０１８４】 好ましい実施形態において、検出工程は生きた動物において実施される。
【０１８５】 好ましい実施形態において、本方法は動物の生涯の間に少なくとも1回反復され
る。本方法の最初と次の評価工程は、１、１０、３０、６０、９０、１８０、３
６５、または７００日程度まで間隔が空いていて差し支えない。
【０１８６】 好ましい実施形態において、レポーターは、例えばグリーン蛍光タンパク質の
ような、好ましくは外因性基質または補因子の添加無しに発光しまたは蛍光を発
するような発光または蛍光産物である。
【０１８７】 別の態様において、本発明は、生きた動物における遺伝子発現を評価する方法
に関する。本方法は： 例えばレッドシフトＧＦＰのようなＧＦＰ等のレポーター遺伝子を含む導入遺
伝子を包含する、生きたトランスジェニック動物を提供し； 生きたトランスジェニック動物における、例えばＧＦＰ等のレポーター分子の
存在または不在を評価または検出し、それによって生きた動物における遺伝子発
現を分析する；各工程を含む 。
【０１８８】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子をコードする配列は、例えばヒ
トプロモーターのような予め選択されたプロモーターの制御下にある。予め選択
されたプロモーターは、例えば：バーシカンプロモーター等のプロテオグリカン
プロモーターのような、膜貫通タンパク質または細胞外マトリックス成分をコー
ドする遺伝子由来のプロモーター；ＭＭＰ1、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ４、
ＭＭＰ５、ＭＭＰ６、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８またはＭＭＰ９プロモーター等のマト
リックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）プロモーターのような皮膚において発
現されているプロテアーゼ由来のプロモーター；血管内皮細胞増殖因子プロモー
ター等の血管機能に影響を及ぼす遺伝子由来のプロモーター；ヒアルロン酸シン
ターゼ１プロモーター、ヒアルロン酸シンターゼ２プロモーター、またはヒアル
ロン酸シンターゼ３プロモーター等のヒアルロン酸シンターゼプロモーター；Ｍ
ＭＰ２またはＭＭＰ９、好ましくはＭＭＰ９プロモーター等の皮膚において発現
されているコラゲナーゼのためのプロモーター；あるいは好中球エラスターゼプ
ロモーターのような、皮膚代謝関連プロモーターであって差し支えない。
【０１８９】 ＶＥＧＦプロモーターは好ましいプロモーターである。好ましい実施形態にお
いて、プロモーターは、炎症性血管新生、または腫瘍増殖においてアップレギュ
レートまたはダウンレギュレートされているプロモーターである。
【０１９０】 好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は非ヒトトランスジェニ
ック動物である。例えば、トランスジェニック動物は、トランスジェニックミニ
ブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、または例え
ばヘアレスマウス、ヌードマウス、例えばＳＡＭマウスのような老化促進マウス
、もしくは促進老化の表現型を示すトランスジェニックミュータントマウス等の
トランスジェニックマウスであって差し支えない。最も好ましい動物はマウスで
ある。
【０１９１】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子の発現の評価の前、間、または
後に、処置を動物に施す。処置は化合物投与であって差し支えない。化合物は：
トランスジェニック動物の皮膚に化合物を適用し；化合物を全身投与し；化合物
を経口投与し；あるいは化合物を好ましくは皮膚または皮下に注射する：ことに
よって投与される。好ましい実施形態において、例えばＳＤＳまたはＤＭＳＯを
含む製剤化等、皮膚の透過性を高める界面活性剤または物質等の適切な運搬手段
を用いて化合物を投与する。
【０１９２】 好ましい実施形態において、評価は、共焦点顕微鏡による、例えば蛍光信号等
の信号の検出を含む。
【０１９３】 好ましい実施形態において、レポーター遺伝子の発現の評価工程は動物の生涯
の間に少なくとも１回反復される。最初と次の評価工程は、１、１０、３０、６
０、９０、１８０、３６５、または７００日程度まで間隔が空いていて差し支え
ない。最初と次の評価工程はいずれも、例えば共焦点顕微鏡を用いて、生きた動
物において実施することができる。
【０１９４】 好ましい実施形態において、レポーターは、例えばグリーン蛍光タンパク質の
ような、好ましくは外因性基質または補因子の添加無しに発光しまたは蛍光を発
するような発光または蛍光産物である。
【０１９５】 動物全体を用いたin vivoで、あるいはこの中に記載のトランスジェニック動
物に由来する例えば皮膚等の組織または細胞、または皮膚−代謝プロモーター／
レポーター遺伝子構成物で形質転換した細胞由来の細胞（好ましくは皮膚細胞も
しくは組織）を用いたin vitroで、本発明の方法を実施して差し支えない。
【０１９６】 この中で用いているように、「トランスジェニック動物」は、１つ以上の、好
ましくは実質的に全ての、その動物中の細胞が導入遺伝子を包含するような、例
えばミニブタ、モルモット、またはマウスもしくはラット等の齧歯動物のような
、非ヒト動物等の動物である。導入遺伝子は、直接的に、あるいはマイクロイン
ジェクション、トランスフェクション、または例えば組換えウィルスを用いたイ
ンジェクションのようなインジェクションによる細胞前駆体への導入によって間
接的に、細胞に導入することができる。遺伝子操作の用語は、組換えＤＮＡ分子
の導入を称する。組換えＤＮＡ分子は、染色体内に組み込まれても差し支えなく
、あるいは染色体外で複製するＤＮＡであっても差し支えない。
【０１９７】 トランスジェニック動物は、例えば導入遺伝子に対してヘテロ接合性であって
もホモ接合性であっても差し支えない。
【０１９８】 この中で用いられている「齧歯動物」の用語は、齧歯目系統の全ての動物を称
する。
【０１９９】 この中で用いられている「レポーター遺伝子」は、その発現がプロモーターに
制御されるように、皮膚代謝関連プロモーターの下流に融合している核酸配列を
称する。レポーター遺伝子は、通常、その活性を容易に測定できるタンパク質を
コードする。例えば、レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシ
フェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質遺伝子、アルカリホスファターゼ遺
伝子、西洋ワサビペロキシダーゼ遺伝子、またはクロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ遺伝子等の、その細胞において自然では認められない、例え
ば酵素のような測定可能なタンパク質をコードする遺伝子であって差し支えない
。好ましい実施形態において、レポーター産物は、それが結合しているプロモー
ターの活性を示唆する信号を提供できる。好ましいレポーターは、発光しまたは
蛍光を発するようなものである。好ましいレポーターは、外因性基質の添加無し
に、in vivoで発光しまたは蛍光を発することができる。特に適切なレポーター
は、グリーン蛍光タンパク質である。例えば、ＥＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＹＦＰ、
ｄ２ＥＧＦＰ、ＥＣＦＰ、ＧＦＰｕｖのようなグリーン蛍光タンパク質の修飾変
異体は、グリーン蛍光タンパク質の用語に含まれる。ＥＧＦＰは特に好ましい。
それらＧＦＰの変異体は、CLONTECH, Laboratories, Inc. Palo Alto, CA.によ
って市販されている。さらには、ＧＦＰおよびその変異体は、以下の引例におい
て提供されており、それら引例の全てが参照によってこの中に組み込まれている
：Chalfie, M. et al. (1994) Science 263: 802-805; Prasher, D.C., et al.
(1992) Gene 111: 229-233; Inouye, S. & Tsuji, F.I. (1994) FEBS Letters 3
41: 277-280; Wang, S. & Hazelrigg, T. (1994) Nature 369: 400-403; Cody,
C.W., et al. (1993) Biochemistry 32: 1212-1218; Inouye & Tsuji, F.I. (19
94) FEBS Letters 351: 211-214; Heim, R., et al. (1994) Proc. Natl. Acad.
Sci., USA 91: 12501-12504; Yang, T.T., et al. (1996) Nucleic Acids Res.
24 (22): 4592-4593; Cormack, B.P., et al. (1996) Gene 173: 33-38; Crame
ri, A., et al. (1996) Nature Biotechnol. 12: 315-319; Haas, J. et al., (
1996) Curr. Biol. 6: 315-324; Galbraith, D.W., et al. (1995) Methods Cel
l Biol. 50: 1-12; Living Colors Destabilized EGFP Vectors (April 1998) C
LONTECHniques XIII(2): 16-17, Living Colors pEBFP Vector (April 1997) CL
ONTECHniques XII(2): 16-17; Heim, R & Tsien, R.Y. (1996) Curr. Biol. 6:
178-182; Ormo, et al. (1996) Science 273: 1392-1395; Mitra, R.D. et al.
(1996) Gene 173: 13-17。
【０２００】 この中で用いられている「皮膚代謝関連プロモーター」の用語は、皮膚におい
て転写的に活性であるプロモーターを称する。それは皮膚特異的である必要はな
い。そのようなプロモーターが自然に認められる遺伝子は、皮膚の維持または適
切な機能に関連する遺伝子である。例えば、そのような遺伝子は細胞外マトリッ
クスの一部であるタンパク質、細胞外マトリックスの維持または分解に関連する
タンパク質、あるいは皮膚への栄養の供給に関連するタンパク質をコードする遺
伝子であって差し支えない。例えばバーシカンプロモーターの活性断片のような
、この中で挙げられているプロモーターの活性断片または類似物を、本発明の方
法、組成物、および動物において用いることができる。ヒトゲノムＤＮＡ由来の
機能的ヒトバーシカンプロモーターの839bp断片(-559から+280)(Naso, M.F., Zi
mmermann, D.R. & Iozzo, R.V. (1994) J. Biol. Chem., 269, 32999-33008)を
、バーシカンプロモーターを用いる方法において使用することができる。
【０２０１】 本発明の実施形態は、生きた動物において、in situで、導入遺伝子発現を評
価することを可能とする。例えばＧＦＰレポーター分子のような発光または蛍光
レポーターは、そのような実施形態において特に好都合である。
【０２０２】 この中で用いられている「動物に化合物を投与する」とは、動物または細胞に
処置を施し、送達し、または適用することを称する。投与は、局所適用によって
、非経口または経口経路によって、筋肉注射、皮下／皮内注射、静脈注射、口腔
内投与によって、経皮送達によって、あるいは経鼻または気道経路による投与に
よって、行うことができる。最も好ましい投与は、局所適用、あるいは皮下また
は皮内注射である。
【０２０３】 本発明の方法は、皮膚に対する効果に関して、化合物を迅速かつ効率的に評価
することを可能とする。
【０２０４】 本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および請求項から明らかで
ある。
【０２０５】 発明の詳細な説明 プロモーター 本発明の方法は、皮膚に対する効果に関して、化合物を評価することを可能と
する。本発明の方法を用いて、例えば化粧品としての使用のため、皮膚の健康ま
たは外観に対する効果に関して化合物を評価することができる。皮膚に対する効
果は、通常、皮膚代謝関連プロモーターの制御下にある遺伝子の発現に対する効
果として特定される。そのようなプロモーターとして：例えば真皮または表皮等
の皮膚の成分である産物；皮膚の水分補給または栄養摂取に影響を与える産物；
皮膚成分の合成または分解を促進させる産物；皮膚の脈管構造に影響を及ぼす産
物；毛嚢代謝に影響を与える産物；皮膚腺構造に影響を与える産物；皮下筋肉組
織に影響を与える産物；脂肪組織に影響を与える産物；あるいは皮神経に影響を
与える産物：の発現を調節するようなものが挙げられる。
【０２０６】 本発明の方法は、例えば皮膚の弾力性、皮膚に皺が寄る傾向、例えば光または
ＵＶによる損傷等の損傷に抵抗しまたはそれらを修復する皮膚の能力、増殖循環
(growth cycling)または色素沈着を含む毛嚢の代謝、皮下筋肉の正常な緊張およ
び機能、あるいは皮神経による神経伝達のような、皮膚の外観または健康に関連
するパラメーターに対する効果について、化合物を評価するのに有用である。一
般的に、それらパラメーターに対する効果は、例えば任意のそれらパラモーター
に影響を与える産物をコードする遺伝子に通常結合しているプロモーターの制御
下に置かれたレポーター遺伝子の発現に対する効果によって、間接的に評価され
る。
【０２０７】 そのような皮膚代謝関連プロモーターの例として、バーシカンプロモーター；
マトリックスメタロプロテイナーゼプロモーター；血管内皮細胞増殖因子プロモ
ーター；ヒアルロン酸シンターゼプロモーター；例えばＭＭＰ２またはＭＭＰ９
、好ましくはＭＭＰ９プロモーター；好中球エラスターゼプロモーター：が挙げ
られる。
【０２０８】 バーシカンプロモーターは、バーシカン遺伝子の発現を調節し、Naso M. F. e
t al. (1994) J. Biol. Chem. 269 (52): 32999-33008に記載されており、その
内容の全てが参照によってこの中に組み込まれる。バーシカンは、皮膚の真皮お
よび表皮において発現されている大きなモジュールのコンドロイチン硫酸プロテ
オグリカンである。バーシカンは細胞外マトリックスに付着し続けている間、大
量の水と結合し、それによって皮膚に水分を補給しかつ満たす。従って、本遺伝
子のアップレギュレーションをもたらす化合物が好ましい。
【０２０９】 マトリックスメタロプロテイナーゼプロモーターは、マトリックスメタロプロ
テイナーゼ遺伝子の発現を調節する。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭ
Ｐｓ）は、細胞外マトリックスプトテアーゼのファミリーに属しており、Mauch
C. et al. (1994) Arch. Dermatol. Res. 287: 107-114に記載されている。その
名前が意味するように、それらマトリックスメタロプロテイナーゼは、例えば皮
膚の真皮および表皮における細胞外マトリックスの分解に関連する。従って、本
遺伝子のダウンレギュレーションをもたらす化合物が好ましい。
【０２１０】 血管内皮細胞増殖因子プロモーターは、血管内皮細胞増殖因子遺伝子の発現を
調節し、例えば、Tisher E. (1991) J. Biol. Chem. 266 (18): 11947-11954に
記載されており、その内容は参照によってこの中に組み込まれる。血管内皮細胞
増殖因子は、血管内皮細胞のためのマイトジェンであり、結果として、皮膚の下
の微小血管系の増殖を誘導し、さらに血管透過性を高めることができる。微小血
管系および血管の透過性の亢進は、皮膚のより良好な栄養供給（例えば真皮およ
び表皮へのより良好な栄養運搬）および水分補給を可能とする。従って、本遺伝
子のアップレギュレーションをもたらす化合物が好ましい。
【０２１１】 ヒアルロン酸シンターゼ（ＨＡＳ１−３）プロモーターは、ヒアルロン酸シン
ターゼ（ＨＡＳ１−３）遺伝子の発現を調節し、Itano N. et al. (1996) BBRC
222: 816-820; Watanabe K. (1996) J. Biol. Chem. 271 (38): 22945-22948;
およびSpicer A. P. (1997) J. Biol. Chem. 272 (14): 8957-8961にそれぞれ記
載されており、それらの内容は参照によってこの中に組み込まれる。ヒアルロン
酸シンターゼは、その名前が意味するように、直鎖の未分枝グリコサミノグリカ
ンであるヒアルロン酸の合成に関連する。ヒアルロン酸はバーシカンに結合し、
通常他のプロテオグリカンのためのアンカーとして作用し、プロテオグリカン「
ネットワーク」の安定化につながる。結果として、ヒアルロン酸は（バーシカン
と同様に）、皮膚に水分を補給しかつ満たすのを助ける。従って、本遺伝子のア
ップレギュレーションをもたらす化合物が好ましい。
【０２１２】 ＩＶ型コラゲナーゼプロモーターは、ＩＶ型コラゲナーゼ遺伝子の発現を調節
し、Huhtala P. (1991) J. Biol. Chem. 266 (36): 16485-16490に記載されてお
り、その内容の全てが参照によってこの中に組み込まれる。ＩＶ型コラゲナーゼ
は、細胞外マトリックスプロテアーゼファミリーの別のメンバーであり、例えば
皮膚の真皮および表皮における細胞外マトリックスの種々の成分の分解に関連す
る。従って、本遺伝子のダウンレギュレーションをもたらす化合物が好ましい。
【０２１３】 好中球エラスターゼプロモーターは、好中球エラスターゼ遺伝子の発現を調節
し、Takahashi H. (1988) J. Biol. Chem. 263 (29): 14739-14747に記載されて
おり、その内容の全てが参照によってこの中に組み込まれる。好中球エラスター
ゼは、例えば皮膚の真皮および表皮において、細胞外マトリックスのほとんどの
タンパク質成分（エラスチンを含む）を切断することができる強力なセリンプロ
テアーゼである。従って、本遺伝子のダウンレギュレーションをもたらす化合物
が好ましい。
【０２１４】 トランスジェニック動物 本発明の方法において用いることができるトランスジェニック動物として、例
えばミニブタ、モルモット等のブタ；あるいは、例えばヘアレスマウス(例えば
、Begona M. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 7717-7721に記載)、
ヌードマウス、老化促進マウス（例えば、Takeda et al., 1991, L. Am. Geriat
r. 39: 911-919に記載）、もしくは促進老化の表現型を示すトランスジェニック
ミュータントマウス等のマウスまたはラット等の齧歯動物のような非ヒト動物が
挙げられ；それら動物中の１つ以上、好ましくは実質的に全ての細胞が導入遺伝
子を包含する。トランスジェニック動物は導入遺伝子に対してモノ接合性であっ
てもヘテロ接合性であっても差し支えない。マウスが好ましい対象動物である。
【０２１５】 トランスジェニック動物の構築 例えばマウスのようなトランスジェニック動物を作る方法は、当業界で公知で
ある。１つの方法を以下に記載する。
【０２１６】 胚の注入／移植 胚の操作およびマイクロインジェクションの方法が、例えばマウスの胚を操作
するために記載されている(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sprin
g Harbor, NY., 1986, その内容は参照によってこの中に組み込まれる)。妊馬血
清（ＰＭＳ）およびその４８時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピンで、過剰排卵さ
せた６週令メスマウスからマウス接合子を採取することができる。処置されたメ
スマウスをオスマウスと一緒に置き、翌朝、膣栓を確認した。発情のために擬妊
娠メスマウスを選択し、確認済み精管切除オスマウスと一緒に置き、レシピエン
トとして用いた。接合子を採取し、卵丘細胞を除去する。さらに、未分化胚芽細
胞を回収することができる。オスマウスと交尾したメスマウスから前核胚を回収
する。妊馬血清（ＰＭＳ）でメスマウスを処置して、卵胞増殖およびヒト絨毛性
ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を誘導し、排卵を誘導する。ダルベッコの改良リン酸
緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中に胚を回収し、さらに、１０％ウシ胎仔血清を補
足したダルベッコの改良必須培地（ＤＭＥＭ）中において維持した。
【０２１７】 顕微鏡に接続した標準のマイクロマニピュレーターを用いて、導入遺伝子構成
物のマイクロインジェクションを実施する。例えば、通常、マイクロインジェク
ション操作の間、油の下の１００マイクロリットルのＤＰＢＳ中に胚を保持する
。ＤＮＡ溶液を雄性前核にマイクロインジェクションする。前核の隆起によって
注入の成功をモニターする。同様の技術を用いて、未分化胚芽細胞に組換えＥＳ
細胞を注入することができる。注入後直ぐに、例えば精管切除オスマウスと交尾
した成熟マウスのようなレシピエントのメスに胚を移植する。一般的なプロトコ
ルにおいて、レシピエントのメスに麻酔し、卵管を露出させるため腰部付近(par
alumbar)を切開し、卵管の膨大部に胚を移植する。体壁を縫合し、創傷クリップ
で皮膚を閉じた。
【０２１８】 標的構成物の存在に関するスクリーニング 標準プロトコルによって、出生後、トランスジェニック動物を特定することが
できる。サザンブロットおよび／またはＰＣＲを用いて標的構成物の存在に関し
て、尾組織からのＤＮＡをスクリーニングすることができる。生殖細胞系中に標
的構成物を担持すると思われる場合には、モザイクのように思われる子孫をさら
にお互いに交配させて、ホモ接合性トランスジェニック動物を作る。子孫が生殖
細胞系伝達を有するか否かが不明である場合には、親の種または他の種と交尾さ
せて、ヘテロ接合性に関して子孫をスクリーニングして差し支えない。ＤＮＡの
サザンブロットおよび／またはＰＣＲ増幅によってヘテロ接合体を特定する。
【０２１９】 ヘテロ接合体をさらにお互いに交配させて、ホモ接合性トランスジェニック子
孫を作ることができる。交配の産物であるマウス、ならびにヘテロ接合体である
ことが分かっているマウスおよび野生型マウスに由来する当量のゲノムＤＮＡの
サザンブロットによってホモ接合体を特定することができる。サザンブロットを
スクリーニングするためのプローブは、上記のように設計することができる。
【０２２０】 トランスジェニック子孫を特定および特徴付けする他の手段は当業界で公知で
ある。例えば、ノーザンブロットを用いて、レポーター遺伝子をコードする転写
体の存在または不在に関して、ｍＲＮＡを検証することができる。さらには、ウ
ェスタンブロットを用いて、導入遺伝子によってコードされるタンパク質に対す
る抗体またはマーカー遺伝子産物に対する抗体を用いてウェスタンブロットを検
証することによって、導入遺伝子が発現されているそれら子孫の様々な組織中に
おける導入遺伝子の発現レベルを評価することができる。最後に、適切な抗体を
用いて、子孫由来の様々な細胞のin situ 分析（例えば細胞を固定しさらに抗体
で標識する）および／またはＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取器）分析を実施して
、導入遺伝子産物の存在または不在を調べることができる。
【０２２１】 他のトランスジェニック動物 本発明の方法において、他のトランスジェニック動物を用いても差し支えない
。様々な動物を作る方法は当業界で公知である。トランスジェニックブタを作る
プロトコルは、White and Yannoutsos, Current Topics in Complement Researc
h: 64th Forum in Immunology, pp. 88-94; 米国特許第5,523,226号；米国特許
第5,573,933号；国際特許出願公開第WO95/04744号に記載されている。トランス
ジェニックラットを作るプロトコルは、Bader and Ganten, Clinical and Exper
imental Pharmacology and physiology, Supp. 3: S81-S87, 1996に記載されて
いる。トランスジェニックウシを作るプロトコルは、Transgenic Animal Techno
logy, A Handbook, 1994, ed., Carl A. Pinkert, Academic Press, Inc.に記載
されている。トランスジェニックヒツジを作るプロトコルは、Transgenic Anima
l Technology, A Handbook, 1994, ed., Carl A. Pinkert, Academic Press, In
c.に記載されている。全ての特許および引例が参照によってこの中に組み込まれ
る。
【０２２２】 レポーター遺伝子 本発明の方法は、少なくとも部分的に、皮膚代謝に関連する遺伝子のプロモー
ターに対して結合したレポーター遺伝子に基づく。レポーター遺伝子は、検出可
能な産物、好ましくは、例えば蛍光を発する遺伝子産物のような比較的容易に検
出され得る産物、あるいは着色産物の形成によって検出され得る反応を触媒する
産物をコードする任意の遺伝子であって差し支えない。例えば、レポーター遺伝
子は、着色または蛍光産物のような検出可能な産物を産生する酵素のような酵素
をコードするものであって差し支えない。レポーター遺伝子は当業界で公知であ
り、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパ
ク質遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペロキシダーゼ遺伝子
、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられる
。レポーター遺伝子は、例えば、Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis,
T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cols Spring Harbor, NY
, 1989に記載されている。
【０２２３】 実施例 実施例１：導入遺伝子の構築 導入遺伝子を構築するため、当業界で公知のＰＣＲに基づく技術を用いて、ヒ
トバーシカンプロモーターの839 bp断片（ヌクレオチド-559から+280；転写開始
位置は+1）をヒトゲノムＤＮＡから得た。図１に示すようにXhoI-EcoRIで制限切
断することによって線状化されたpNASSbetaベクター（Clontech）に、バーシカ
ンプロモーター断片を挿入した。そのベクターは、β-ガラクトシダーゼレポー
ター遺伝子（lacZ）、ならびにポリアデニル酸シグナルを包含する。そのベクタ
ーは、高レベルの導入遺伝子発現の可能性を最適化するため、ＲＮＡスプライス
供与および受容配列も包含する。前核注入のための線状導入遺伝子ＤＮＡ断片を
得るため、EcoRIおよびXbaI酵素でベクターを切断した。線状導入遺伝子ＤＮＡ
断片は4732 bpの長さである。
【０２２４】 実施例２：トランスジェニックマウスの作成 線状導入遺伝子ＤＮＡ断片を、DBA2ｘC57BL6(DBF1)マウス(Charles River, Bo
ston)の受精卵母細胞に注入し、さらにその卵を擬似妊娠代理母に移植した。サ
ザンブロットによって、ヒトバーシカンプロモーター断片の染色体組込みに関し
て子孫（Ｆ０）を調べた。簡単に説明すると、３週令マウスの尾からゲノムＤＮ
Ａを単離し、BamHIまたはPstIの何れかの制限エンドヌクレアーゼで消化した。
ゲル上でＤＮＡ断片を分離し、次にナイロン膜上に移した。トランスジェニック
マウスを作るのに用いられたヒトバーシカン導入遺伝子の1.3 bp BamHI-EcoRV断
片を用いて、膜をハイブリダイズさせた。サザン分析によって、７つの独立した
系列が導入遺伝子挿入を示した。導入遺伝子のコピー数は、１から１０以上の範
囲で異なっていた。
【０２２５】 実施例３：β-ガラクトシダーゼ組織化学分析 様々な発生段階(E11.5dからE17.5d)の採取したマウス胚を、胚の段階に応じて
３０分から１２時間に亘り、ＰＢＳ中の0.5％グルタールアルデヒドで固定し、
３０％スクロースに移し、さらにＯＣＴ(Tissue Tek, CA)化合物中において凍結
した。１５μmの厚さの切片を調製してスライドに載せた。同じ固定液で５分間
切片を再固定し、ＰＢＳで１回、次に洗剤洗浄液で１０分間洗浄した。１mg/ml
のＸ-ｇａｌ(Sigma)、１０mMのフェロシアン化物、および１０mMのフェリシアン
化を含有する反応バッファー中において染色を行った。３７℃で３−６時間イン
キュベーションを行った。ＰＢＳで洗浄後、切片を標本にするかあるいはエオシ
ンで対比染色した。成体組織のため、同じ固定液をマウスに環流させて、所望の
臓器を切開し、後の固定を行い、スクロースに浸し、さらにＯＣＴ化合物で凍結
させた。皮膚組織のため、背部の皮膚組織ブロックの５mmストリップを１５分か
ら１時間固定し、上記のように３−６時間Ｘ-ｇａｌで染色した。洗浄後、皮膚
組織ストリップをパラフィン包埋し、さらにマイクロトームを用いて８μｍの切
片に切った。
【０２２６】 実施例４：in situハイブリダイゼーション 当業界で公知の方法を用いて、３’末端標識オリゴヌクレオチドプローブを用
いた放射活性in situハイブリダーゼーションを実施した。過剰な非標識オリゴ
ヌクレオチドの存在下、標識オリゴヌクレオチドでいくつかの切片をハイブリダ
イズさせることによって、in situシグナルの特異性を調べた。
【０２２７】 lacZおよび内因性マウスバーシカンプローブを用いたトランスジェニック胚切
片(E13.5)のin situハイブリダイゼーションによって、導入遺伝子の発現パター
ンを調べた。何れかのプローブを用いて、発生中の肢芽、腎臓、脳、および軟骨
において発現が観察された。E13.5、E15.5、E17.5胚、７日、４０日の新生マウ
ス、さらには４ヶ月（成体）トランスジェニックマウスの切片における、β-ガ
ラクトシダーゼ組織化学分析によってLacZ発現を調べた。早くもE13.5dにおいて
、腎臓、脳、軟骨、および肢芽で強い間充織発現が観察された。発現レベルは出
生まで一定に維持された。出生後７日のマウスにおいて、胚性組織と比較して、
β-ガラクトシダーゼ染色が低下し、成体組織では殆ど全く発現が観察されなか
った。他の組織とは対照的に、出生後３０日のマウス由来の真皮乳頭（発育相の
毛周期）は再び極めて強いβ-ガラクトシダーゼ染色を示し、２毛周期の間、同
じβ-ガラクトシダーゼレベルを発現し続けた。
【０２２８】 皮膚組織において、毛芽（毛嚢中の将来の真皮乳頭）はE15.5dにおいて強いβ
-ガラクトシダーゼ活性を発現し、出生後７日まで（最初の毛周期の間）その活
性が維持された。E15.5d−新生マウスの皮膚においても、真皮線維芽細胞で時々
β-ガラクトシダーゼ染色が観察された。しかしながら、β-ガラクトシダーゼ染
色は、出生後７日の皮膚組織において低下した。
【０２２９】 実施例５：ＵＶ照射 密接に離間させたずらりと並んだ５つのＰＵＶＡランプを用いて、ＵＶＡでの
照射を実施した。ＵＶＡ検出器を用いて、それらランプの配列から３０cmでの出
力を測定した。
【０２３０】 出生後４日のバーシカントランスジェニックマウスの背部皮膚に３０J/cm2 Ｕ
ＶＡで照射した。β-ガラクトシダーゼ染色のため、２４時間後、背部皮膚組織
生検試料を処理し、トランスジェニックマウス由来の未処置対照皮膚組織と比較
した。β-ガラクトシダーゼ組織化学分析は、対照と比較して、ＵＶＡ照射皮膚
の上部真皮において、β-ガラクトシダーゼ染色の増強を示した。
【０２３１】 実施例６：ＶＥＧＦ−ＧＦＰトランスジェニックマウス in vivoでのヒトＶＥＧＦ遺伝子発現の調節機構を解明するため、ヒトＶＥＧ
Ｆのプロモーター領域（図２に示されている）の3kbp断片によって駆動されるグ
リーン蛍光タンパク質レポーター構成物を包含するトランスジェニックマウスを
作った。培養されたヒトケラチノサイトにおけるトランスフェクション測定法に
よって、その構成物がin vitroで機能的であることを確認した。ＶＥＧＦ−ＧＦ
Ｐの３つの独立したトランスジェニック系列が得られかつＰＣＲ分析によって確
認された。構成的な内皮細胞発現、および創傷皮膚におけるケラチノサイト誘導
ＶＥＧＦ発現を調べるため、背部皮膚に２mmの皮膚穿孔を行い、４８時間後に生
検試料を採取した。直ぐに組織を４％パラフォルムアルデヒドで固定し、蛍光お
よび共焦点顕微鏡で、凍結切片を調べた。ＶＥＧＦ−ＧＦＰトランスジェニック
系列は、表皮および上部真皮の下ならびに時折さらに深部の真皮における、新生
微小血管網で、明るいＧＦＰ蛍光を示した。いくつかの組織において、毛嚢も陽
性であった。創傷組織において、表皮の創傷境界において連続的なＧＦＰ発現が
観察されたが、非創傷領域ではケラチノサイト発現は観察されず、創傷治癒にお
けるＶＥＧＦ発現の誘導可能性を確認した。ＶＥＧＦ−ＧＦＰトランスジェニッ
ク系列から調製した初代培養ケラチノサイトも培養３日後ＧＦＰ蛍光を示した。
それら結果を合わせると、ＧＦＰは、in vitroおよびin vivoでのＶＥＧＦ発現
を調べるための潜在的に有用な手段である。本研究を以下にさらに詳細に説明す
る。
【０２３２】 トランスジェニックマウスの皮膚における、ヒト血管内皮細胞増殖因子プロモ
ーターによって駆動されるグリーン蛍光タンパク質の発現の劇的な変化を以下の
ように分析した。
【０２３３】 トランスジェニックマウスを用いた遺伝子発現研究は、３つの古典的なレポー
ター遺伝子−lacZ(β-ガラクトシダーゼ)、ルシフェラーゼ、またはＣＡＴ(クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)の内の１つを用いることが最も
一般的である。レポーター遺伝子活性の検出は、通常、lacZの場合における組織
染色のため、またはルシフェラーゼおよびＣＡＴのための複雑な測定法のために
、組織を動物から取り出すことが必要であり、生きた動物における遺伝子調節の
変化を見る可能性を排除または少なくとも困難にする。
【０２３４】 最近、代わりの蛍光レポーター分子である、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ
）(Chalfee M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW and Prasher DC: Green fluoresc
ent protein as a marker for gene expression. Science 263: 802-5, 1994)、
または修飾ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）(Zhang G. Gurtu V and Kain SR: An enhanced g
reen fluorescent protein allows sensitive detection of gene transfer in
mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun 227: 707-11, 1996)が開発され
た。ＧＦＰはそれ自体本質的に蛍光を発し、処置を施すことなく信号が目に見え
る(Misteli T and Spector DL: Applications of the green fluorescent prote
in in cell biology and biotechnology. Nat Biotechnol 15: 961-4, 1997)。
ＧＦＰが表皮において誘導された場合、動物を屠殺することなく、共焦点レーザ
ー顕微鏡を用いて、遺伝子発現の変化を観察することが可能である。in vivoで
悪性腫瘍組織における血管新生および血管透過性を誘導する血管因子であるヒト
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のプロモーターを用いて、トランスジェニッ
クマウスの皮膚においてレポーター遺伝子としてＧＦＰを発現させる。表皮のケ
ラチノサイトにおけるＶＥＧＦ発現は、表皮の創傷治癒の境界においてアップレ
ギュレートされており、さらに例えばＴＰＡのようなホルボールエステルの局所
適用によってもアップレギュレートされる。
【０２３５】 トランスジェニックマウスにおける、ヒトＶＥＧＦ−ＧＦＰの遺伝子活性の信
号変化でのＧＦＰの発現および反応性を以下に説明する。発現パターンは内因性
ＶＥＧＦのパターンと一致し、さらに、切除術の後に何ら処理することなく、そ
のままの組織において、共焦点顕微鏡を用いて、ＧＦＰ−派生蛍光を局在化およ
び可視化することができる。
【０２３６】 導入遺伝子構成物 ＧＣに富むＶＥＧＦプロモーターのＰＣＲに基づく増幅は困難なことが多いた
め、プローブとしてＲＴ−ＰＣＲによって得た500bp ｃＤＮＡ断片を用いて、ヒ
トゲノムライブラリー(Clontech, CA)から、ヒトＶＥＧＦの５’−フランキング
ＤＮＡを含むＶＥＧＦゲノムクローンの5.0kb断片を単離した。制限酵素消化に
よって特定クローンを分析し、次に、2453 bp EcoRI-Agel断片(-2271から+91)(T
ischer E, Michell R, Harman T, Silva M, Gospodarowicz D, Fiddes JC and A
braham JA: The human gene for vascular endothelial growth factor. Multip
le protein forms are encoded through alternative exon splicing. J Biol C
hem 266: 11947-54, 1991)をアガロースゲルから切り出した。そのプロモーター
断片をＧＦＰベクター(pEGFP-1 cut EcoRI and XmaI)中に挿入した。発現効率を
最大にするため、16s/19sスプライス供与および受容シグナルもプロモーターと
ＧＦＰ遺伝子との間に挿入した。
【０２３７】 ＧＦＰベクターのin vitro発現 得られた哺乳類発現ベクター中の導入遺伝子を、まず培養ヒトケラチノサイト
中にトランスフェクトして、選択された遺伝子領域がＶＥＧＦ発現を促進させて
いることを確認した。ＶＥＧＦ−ＧＦＰベクターまたはＣＭＶプロモーター−駆
動ＧＦＰ対照ベクター(pEGFP-N1; Clontech)のどちらかを初代培養ヒトケラチノ
サイトにトランスフェクトした。全てのトランスフェクションにおいてポリブレ
ンおよびＤＭＳＯ法を用いた。
【０２３８】 トランスジェニックマウスの作成 EcoRIおよびAfIIIを用いて前核注入のための線状断片（その断片はポリアデニ
ル酸シグナル配列も含む）を切り出した。次に、その導入遺伝子配列を、DBA2ｘ
C57Bl6(DBF1)マウス(Charles River Laboratories, Boston, MA)の受精卵母細胞
に注入し、さらにその卵を擬似妊娠代理母に移植した。ゲノムＰＣＲによって、
導入遺伝子の染色体組込みに関して子孫（Ｆ０）を調べた。全ての実験はＦ１ま
たはＦ２子孫マウスを用いて行った。
【０２３９】 そのままの皮膚組織の共焦点顕微鏡観察のため、トランスジェニック初代マウ
スとSKH-1ヘアレスマウス(Charles River Laboratories)とを交配させることに
よって、ヘアレスの遺伝的背景のＶＥＧＦ−ＧＦＰトランスジェニックマウスを
作った。したがって、オスのヘミ接合性トランスジェニックマウス(v/-HH)をメ
スのヘアレスマウス(-/-hh)と交配させて、ＰＣＲ検出およびそのヘアレス発現
型によって容易に選択できるＦ２世代のＶＥＧＦ−ＧＦＰヘアレスマウス(v/-hh
)を得た。
【０２４０】 ＧＦＰ検出ための組織調製、およびＧＦＰ発現部位からの不鮮明なまたは拡散
したＧＦＰ派生蛍光のエピ顕微鏡観察の解決法 最終的に、新鮮に切断しかつ固定していない組織ブロックを、クリオスタット
を用いて直接１２μmの厚さの凍結切片にスライスした。培地を載せたり長期間
スライドを保存することなく、切片を作成後直ぐに、FITC/TRITC二重励起、およ
び発光フィルター(Chroma, *VT)を用いてエピ蛍光顕微鏡観察を実施し、組織自
己発光からのＧＦＰ派生蛍光信号を顕著にした。
【０２４１】 創傷およびＴＰＡ処置の方法 ４−６週令の若い成体トランスジェニックマウスの剃った背部皮膚に２mm生検
穿孔で皮膚傷を作った。４８時間後、正常組織および創傷組織を採取し、ドライ
アイス上で直ぐに凍結させた。
【０２４２】 ＴＰＡによるＶＥＧＦ ｍＲＮＡの誘導のため、アセトン中の単一量の５μＴＰ
Ａをトランスジェニックマウスの背部皮膚に局所適用し、さらに１２時間後皮膚
生検試料を採取した。
【０２４３】 全ての動物処置は、ＭＧＨ動物管理および使用協会(Animal Care and Use Comm
ittee)の認可を有する。
【０２４４】 抗ＶＥＧＦおよび抗ＧＦＰ免疫組織化学分析 ＰＢＳ(pH 7.2)中の４％パラホルムアルデヒドを用いて、室温で５分間、トラ
ンスジェニックマウスの皮膚の凍結切片を固定した。製品(Vectpr Labs. UK)に
記載されているＡＢＣ法を用いて、スライドに載せた切片において免疫組織化学
染色を実施し、着色基質としてＤＡＢを用いるペロキシダーゼ反応によって可視
化させた。
【０２４５】 共焦点顕微鏡 共焦点顕微鏡観察のため、組織の上に直接カバースリップを置いた。帯域通過
フィルター530/30nmを有するLeica TCSNT4D共焦点顕微鏡システムを用い、515−
545nmの間の波長で発光を検出して、切片またはそのままの組織試料を分析した
。核を可視化するため、５μg/mlの７−アミノアクチノマイシンＤ(SIGMA, USA)
溶液を用いて周囲温度で２０分間対比染色し、ＰＢＳで洗浄し、さらにフルオロ
マウント−Ｇ(Southern Biotechnology, AL)で標本にした。
【０２４６】 ヒトケラチノサイトにおけるＶＥＧＦプロモーター駆動ＧＦＰ発現 内因性ＶＥＧＦのための機能的プロモーター活性の領域はあまり特徴付けされ
ていないため、まず2.5kbのヒトＶＥＧＦの５’−フランキングＤＮＡをＧＦＰ
哺乳類ベクターに挿入し、さらにトランスフェクトされた初代培養ヒトケラチノ
サイトにおいてモニターした。対照培養はＣＭＶプロモーター駆動ＧＦＰベクタ
ーでトランスフェクトした。ＶＥＧＦ−ＧＦＰ蛍光は、トランスフェクションの
４８時間後初めて現れ、さらにほんのわずかな割合（％）の細胞のみが陽性であ
った。ＣＭＶ−ＧＦＰ蛍光は、２４時間以内に現れ、さらに殆ど全ての細胞が陽
性であった。ＶＥＧＦ−ＧＦＰ信号はＣＭＶ-ＧＦＰ対照の信号に強さにおいて
類似しており、その構成物がin vitro培養系において機能的であることを確実に
した。（陽性対照としてのヒトサイトメガロウィルス(CMV)前初期プロモーター
駆動ＧＦＰでトランスフェクトした培養ケラチノサイトにおいて、ならびにＶＥ
ＧＦ−ＧＦＰでトランスフェクトした培養ケラチノサイトにおいて、トランスフ
ェクションの４８時間後蛍光を観察した）。
【０２４７】 トランスジェニックマウスにおけるＧＦＰの発現 ３０匹の初代マウスにおいて、導入遺伝子染色体組込みに関して陽性である４
つの系列をＰＣＲ分析によって検出した。尾組織のエピ蛍光顕微鏡によって調べ
、陰性の野生型マウスと比較した結果、それら系列の内の３系列が、表皮中にお
いて検出可能なＧＦＰ派生蛍光信号を示した。新生トランスジェニックマウスに
おけるＧＦＰ発現を特定した（ＶＥＧＦ−ＧＦＰトランスジェニックマウス由来
の尾から、および陰性野生型の同腹子由来の類似組織から採取した、新鮮な固定
していない組織において蛍光を特定した）。また、新生ＶＥＧＦ−ＧＦＰトラン
スジェニックマウスから採取した組織：肺（肺胞中に蛍光が見られる）；脳の側
脳室（側面上皮において蛍光が観察される）；および脊椎軟骨；（心臓上皮）を
含む：において蛍光が特定された。それら３系列のＦ１新生マウスにおいてＶＥ
ＧＦプロモーターの発現パターンを評価した。in situハイブリダイゼーション
研究においてＶＥＧＦを発現することが既に分かっている肺、腎、および脳を、
ＧＦＰ蛍光に関して調べるために選択した。予想通り、肺胞および脳の側脳室壁
においてＧＦＰ発現が観察された。腎臓の糸球体においてＧＦＰ信号を検出する
ことは困難であった。ＧＦＰ蛍光は、発生中の軟骨組織（例えば脊椎軟骨）の軟
骨細胞においても検出可能であった。
【０２４８】 ＧＦＰは創傷治癒の境界において発現される 未刺激の正常表皮ケラチノサイトは弱いＧＦＰ蛍光のみを示すため、創傷治癒
の間におけるＶＥＧＦ-駆動ＧＦＰの誘導性について調べた。皮膚生検組織を取
り出した４８時間後に、かさぶたの下の創傷治癒表皮は、隣接する傷つけられて
いない表皮と比較して、非常に強くかつ顕著な蛍光信号を示した。その蛍光信号
は、隣接切片における、抗ＧＦＰおよび抗ＶＥＧＦ免疫組織化学分析によって検
出されるＶＥＧＦ／ＧＦＰ発現と相関した。ＧＦＰ発現は皮膚の創傷治癒によっ
て誘導される（ＶＥＧＦ−ＧＦＰトランスジェニックマウスに穿孔生検によって
傷をつけた。蛍光顕微鏡による評価のため、傷部分から組織を採取した。（ａ）
生検の４８時間後の創傷治癒境界において、かさぶたの下の上皮において強い蛍
光が観察された。（ｂ）隣接切片を抗ＧＦＰ抗体と反応させた。（ｃ）抗マウス
ＶＥＧＦ抗体で隣接切片を免疫染色した。対照切片を正常ヤギ血清で処理した。
非特異的ペロキシダーゼ染色が、かさぶた、ならびに（ｂ）および（ｃ）におい
て観察された）。
【０２４９】 ＴＰＡ処置によるＧＦＰの誘導 ホルボールエステルの適用による表皮ＧＦＰの誘導についても調べた。トラン
スジェニックマウスの皮膚にＴＰＡを適用した１２時間後に蛍光信号の蓄積が観
察されたが、アセトンのみで処置した場合にはＧＦＰ発現の基底レベルを示した
のみである。その信号は、ケラチノサイトの細胞質ゾルまたは核よりもむしろ上
皮のバソプレート(basoplateral)表面に局在化することが分かった。抗ＧＦＰ免
疫染色は、基底細胞の細胞質ゾルにおいて信号を産生し、ＧＦＰが基底細胞を起
源としかつ少なくとも一部のＧＦＰタンパク質が細胞内に残っていることを示唆
する。
【０２５０】 共焦点顕微鏡によるＧＦＰの直接的検出 より正確にＧＦＰ蛍光信号を局在化させるため、新鮮な凍結切片を固定し、さ
らに核対比染色のために7-ＡＡＤと共にインキュベートし、レーザー共焦点顕微
鏡下で観察した。予想通り、分散可能なＧＦＰの殆どがその工程の間に失われた
が、創傷治癒−誘導−表皮発現は影響を受けないで維持された。傷が付けられて
いない表皮において時折蛍光が検出され、我々の観察において、蛍光は基底細胞
の外側に局在化しているように見えた。固定および激しい洗浄後でさえ、毛嚢の
外側毛根鞘においてＧＦＰ由来の蛍光は変化しないで維持された。毛嚢のより高
い倍率での観察において、蛍光ＧＦＰ信号が核マーカーと完全に一緒に局在化し
ていることが分かり、毛嚢のＧＦＰが核内に安定に残っていることを示唆する。
このことは、脊椎軟骨における軟骨細胞にも該当する。
【０２５１】 共焦点顕微鏡によるそのままの表皮におけるＧＦＰの直接検出 生きたＧＦＰトランスジェニックマウスの皮膚においてＧＦＰが検出される可
能性を調べるため、共焦点イメージングによって、切開したヘアレスマウスの皮
膚を調べた。生きた表皮の光学的横断面は明るい蛍光を示した。対応する凍結切
片は、その蛍光が基底細胞に由来することを示した。より高い倍率で、ＧＦＰが
ケラチノサイトの周りの細胞外空間に局在することが示された。Ｘ−Ｚ共焦点イ
メージングによって、そのシグナルが表皮の基底層内にあることを確かめた。新
鮮な固定していないトランスジェニックマウスの皮膚の生検組織を採取し、直ぐ
にレーザー共焦点顕微鏡を走査させることによって、共焦点顕微鏡によるそのま
まの皮膚におけるＧＦＰ発現の検出を行った。表皮の光学的横断面は、個々の上
皮細胞の周りに蛍光を示す。核を示すため７−ＡＡＤで対比染色した対応皮膚領
域の凍結切片は、真皮―表皮接合部において蛍光を示した。共焦点Ｘ−Ｚイメー
ジは、基底ケラチノサイトの近くで蛍光を示した。
【０２５２】 本研究は、ヒトＶＥＧＦプロモーターによって駆動されるＧＦＰの発現パター
ンが、ｍＲＮＡ検出で認められるものと、空間的および時間的に対応することを
示した。
【０２５３】 サザンブロットまたはゲノムＰＣＲのより退屈な操作無しに、簡単なエピ蛍光
顕微鏡によって、皮膚表皮においてＧＦＰを発現するトランスジェニックマウス
の交配から得られる子を容易に選択した。
【０２５４】 新鮮な未処置の組織ブロックが明るい蛍光を発したとしても、切片におけるＧ
ＦＰ派生蛍光を検出するのは当初の困難があった。様々な方法を調べた後、水溶
液処理が直ぐにＧＦＰ蛍光を洗い流してしまうことが分かった。このことは、凍
結切片を作成する前に組織ブロックを固定することによって部分的に克服される
が、最初に表皮ケラチノサイトに存在していたような、いくつかの部位からの蛍
光は、依然として失われまたはその染色パターンが変化した。固定は、皮膚の微
小血管系において、ＧＦＰによって生じる蛍光から区別できない蛍光を誘導した
。その部位における蛍光は、固定していない組織ではみられず、in situハイブ
リダイゼーション法を用いた研究において、微小血管系ではＶＥＧＦ発現は報告
されていない。従って、元のＧＦＰ信号を保つための最も効果的な方法は、ＯＣ
Ｔ化合物無しに、新鮮に切開した皮膚から直ぐに凍結切片を作成し、その後すば
やく蛍光顕微鏡によって調べる方法である。その不測の困難性は、ＧＦＰトラン
スジェニックマウスの成功の報告が現在までに非常に少ないことを説明する。
【０２５５】 in situ ハイブリダイゼーションによって、肺、および脳の側脳室において、
顕著なＶＥＧＦ発現が報告されている。ＶＥＧＦ−ＧＦＰマウスの組織の評価は
、それら知見を確認している。腎臓の糸球体に蛍光が観察されないのは、トラン
スジェニックマウスを作るためにここで用いられているＶＥＧＦ ＤＮＡの2.2kb
の５’−フランキング領域に対する組織特異的反応要素を欠くせいであるか、あ
るいは検出限界以下の信号のせいであろう。
【０２５６】 １週令の子から採取した皮膚において、正常な表皮ケラチノサイトは、基底レ
ベルのＧＦＰ発現を示したが、毛嚢の外側毛根鞘では明るい蛍光が観察された。
週令が上のマウスの皮膚は、毛嚢において同等のＧＦＰ発現を示さず、従って、
毛嚢におけるＶＥＧＦ発現は毛周期依存的であろう。脊椎において認められかつ
以前報告されているように、毛嚢および軟骨細胞における蛍光は特に印象的であ
る。それら信号は肺または脳において観察される信号よりもかなり強いものであ
る。レーザー共焦点顕微鏡観察は、それら位置におけるＧＦＰが核内に限定され
ていることを示した。そのような核局在化は、組織処理の間における蛍光産物の
拡散を減らす傾向があるため、見かけの信号を強くすることができる。ある組織
では核に局在化するが他の組織では局在化しない理由はまだ説明できないが、導
入遺伝子中に核局在化コンセンサス配列が含まれていることが有用であると予測
される。
【０２５７】 創傷治癒モデルの間およびＴＰＡ処置の後にＧＦＰタンパク質が誘導されるこ
とがこの中に示されており、レポーターＧＦＰ発現パターンが、高度に、ＶＥＧ
Ｆプロモーター依存的であることを確認している。また、ショウジョウバエの胚
において報告されているような(Davis I, Girdham CH, O’Farrell PH “A nucl
ear GFP that marks nuclei in living Drosophila embryos; Dev. Biol. 170:
726-9 (1995))、ゆっくりの発色団形成による蛍光信号産生の潜在的遅延の問題
をそれらデータは無視している。そのような困難性を見越して、ＧＦＰのレッド
−シフト変異体をそれら研究のために選択し、さらに、皮膚ならびより内部の組
織において、発色団の正確な折り畳みが生じていると思われる。また、長期間の
遺伝子発現をモニターするためにレポーターを用いることを妨害するような、皮
膚における長期間の半減期をＧＦＰが有する問題がある。より週令の高いトラン
スジェニックマウスの皮膚の毛嚢における蛍光の消失は、ＧＦＰタンパク質が妥
当な半減期を有することを示唆する。
【０２５８】 ＧＦＰ信号の検出のための無傷皮膚のレーザー共焦点顕微鏡評価は、ＧＦＰが
表皮内において容易に検出されることを示唆する。それら結果は、in vivoでの
長期間の遺伝子発現の非侵襲的モニタリングためにＧＦＰトランスジェニックマ
ウスを用い得ることを示唆する。生きたマウスの皮膚の顕微鏡評価のための技術
はすでに用いられている。トランスジェニックＧＦＰレポーター遺伝子の使用と
組み合わせる場合、使用する動物の数を減らし、簡単なモニターシステムを使用
し、さらに同じ個体における遺伝子発現の変化を長期間モニターすることを可能
とするため、そのようなシステムは従来のトランスジェニックレポーター遺伝子
動物法を超える大きな利点を有する。トランスジェニックマウスの皮膚における
ＧＦＰのin vivo発現の我々の成功は、有用なモニターおよびスクリーニング手
段を提供することによって、皮膚におけるＶＥＧＦ遺伝子発現の理解を高めるで
あろう。ＶＥＧＦ発現に関連すると考えられる表現型を有するマウスに育てた場
合に特に魅力的である。本モデルは老化過程の間における皮膚の恒常性に焦点を
合わせた研究においても利点を有する。
【０２５９】 実施例７：トランスジェニックマウスの皮膚および毛真皮乳頭におけるヒトバ
ーシカンプロモーター活性の発達および加齢に伴う変化 特に皮膚組織における、ヒトバーシカンの時間的−空間的発現パターンをさら
に調べるため、ヒトバーシカンのコアタンパク質のための機能的プロモーターに
よって駆動されるlacZレポーター構成物を包含するトランスジェニックマウスを
作り、さらに、胚から、新生マウス、生体段階までの、得られたトランスジェニ
ックマウス由来の組織切片をβ−ガラクトシダーゼ組織化学分析によって調べた
。
【０２６０】 導入遺伝子の構築 ＰＣＲに基づく技術によってヒトゲノムＤＮＡから、エキソン１；(Naso MF, Z
immermann DR and Iozzo RV, “Characterization of the complete genomic st
ructure of the human versican gene and functional analysis of its promot
er”, J. Biol. Chem. 269: 32999-33008(1994))を含む、機能的ヒトバーシカン
プロモーターの839bp断片(転写開始位置を+1として、-559から+280)を得て、直
接配列決定によって、正確な配列を確認した。ポリアデニル酸シグナルを有する
β-ガラクトシダーゼレポーター遺伝子(lacZ)供給源としてpNASS2βベクター(Cl
ontech)を用いた。高レベルの導入遺伝子発現の可能性を最適化するため、その
ベクターはＲＮＡスプライス供与および受容配列も包含する。XhoI-EcoRI制限部
位を用いて、スプライス供与／受容配列の前にバーシカンプロモーター断片を挿
入した。EcoRI-XbaI 4732 bp断片として、前核注入のための線状導入遺伝子ＤＮ
Ａを得た。
【０２６１】 トランスジェニック動物の作成 線状構成物を、DBA2ｘC57BL6(DBF１)マウス(Charles River, Boston)の受精
卵母細胞に注入し、さらにその卵を擬似妊娠代理母に移植した。サザンハイブリ
ダイゼーションによって、ヒトバーシカンプロモーター構成物の染色体組込みに
関して子孫（Ｆ０）を調べた。３週令マウスの尾からゲノムＤＮＡを単離し、Ba
mHIまたはPstIの何れかの制限エンドヌクレアーゼで消化した。トランスジェニ
ックマウスを作るのに用いられたヒトバーシカン導入遺伝子の1.3 bp BamHI-Eco
RV断片を用いて、ナイロン膜上の分画ＤＮＡ断片をハイブリダイズさせた。サザ
ン分析によって、単一の挿入から１０以上の範囲の異なるコピー数を有する７つ
の独立した系列が導入遺伝子挿入を示した。
【０２６２】 β-ガラクトシダーゼ組織化学分析 採取した初期から中期 (E11.5dからE15.5d)のマウス胚を、胚の段階に応じて
３０分から１２時間に亘りＰＢＳ中の0.5％グルタールアルデヒドで固定し、３
０％スクロースに移し、さらにＯＣＴ化合物中において凍結した。１５μmの厚
さの切片を調製してスライドに載せた。同じ固定液で５分間切片を再固定し、Ｐ
ＢＳで１回、次に洗剤洗浄液で１０分間洗浄した。１mg/mlのＸ-ｇａｌ(Sigma)
、１０mMのフェロシアン化物、および１０mMのフェリシアン化を含有する反応バ
ッファー中において染色を行った。３７℃で３−６時間インキュベーションを行
った。ＰＢＳで洗浄後、切片を標本にするかあるいはエオシンで対比染色した。
成体組織のため、同じ固定液をマウスに環流させて、所望の臓器を切開し、後の
固定を行い、スクロースに浸し、さらにＯＣＴ化合物で凍結させた。より良好な
形態を保つため、いくつかの初期から中期の胚(E11.5dからE15.5d)にパラフィン
切片処理を施した。皮膚組織のため、背部の皮膚組織ブロックの５mmストリップ
を１５分から１時間固定し、上記のように３−６時間Ｘ-ｇａｌで染色した。洗
浄後、皮膚組織ストリップをパラフィン包埋し、さらにマイクロトームを用いて
８μｍの切片に切った。
【０２６３】 in situハイブリダイゼーション in situハイブリダイゼーション用の胚性組織を新鮮に調製したＤＥＰＣ-処理
ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、脱水させ、RNaseを含まない条
件下で、標準パラフィン包埋プロトコルによって処理した。以前記載のように(K
ishimoto J. Cox H, Deverne EB, and Emson PC “Cellular Localization of P
utative Odorant Receptor Messenger RNAs in Olfactory and Chemosensory Ne
urons- A Non Radioactive In situ Hybridization Study” Molecular Brain R
esearch 23: 33-39 (1994))、E13.5d胚の８μm切片において、ジゴキシゲニン標
識非放射性in situハイブリダイゼーションを実施した。ＰＣＲによって、LacZ
用のｃＤＮＡおよびマウスバーシカンアンチセンスプローブを調製し、さらにpB
luescriptII(strantagene)中にサブクローン化した。製品の使用説明書基づいて
、ＲＮＡ標識キット(Boehringer)を用いてジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを
調製した。スライド上のパラフィン切片をキシレン中においてすばやく脱ロウ処
理し、１００％、９０％、７０％エタノールによって脱水させ、0.1M ＰＢＳ(pH
7.5)で洗浄し、さらに0.2Nの塩酸で１０分間処理した。0.02％ペプシン(0.2N HC
l中)を用いて、３７℃で３０分間切片を処理し、その後、４％パラホルムアルデ
ヒドで酵素を不活性化した。0.2％グリシン溶液(ＰＢＳ中)で３回すすいだ後、0
.1Mトリエタノールアミン中の0.25％無水酢酸／0.9％ NaCl中において室温で１
０分間スライドをアセチル化し、さらに７０％、８０％、９０％エタノールによ
って部分的に脱水しかつ簡単に乾燥させた。約0.1μg/mlのジゴキシゲニン標識
ＲＮＡプローブ(使用前に沸騰によって変性させた)をハイブリダーゼーションバ
ッファー(５０％ 脱イオンホルムアルデヒド、４ｘＳＳＣ、１０％硫酸デキスト
ラン、１ｘDenhardt’s溶液)に加え、カバースリップ下で、５５℃において、１
６−１８時間スライドをインキュベートした。カバースリップを注意深く取り除
き、２ｘＳＳＣ／0.1％ＳＤＳ中において室温で３０分間切片を洗浄し、続いて
、0.1ｘＳＳＣ／0.1％ＳＤＳ中において６０℃で３０分間、２回洗浄した。ハイ
ブリダイズしたプローブを可視化するための免疫組織化学法は、抗体結合アルカ
リホスファターゼを用いた。比色反応は、ニトロブルーテトラゾリウム(Boehrin
ger)および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート(Boehringe
r)を添加することによって開始し、室温で６−２４時間インキュベートした。グ
リセリンゼリーでスライドを埋め込み、４℃で保存した。
【０２６４】 以前記載のように(Kishimoto J. Keverne EB, Hardwick J, Emson PC, “Local
ization of nitric oxide synthase in the mouse olfactory and vomeronasal
system: a histochemical, immunological and in situ hybridization study”
European J. of Neuroscience 5: 1684-1694 (1993))、３’末端標識オリゴヌ
クレオチドプローブを用いた放射活性in situハイブリダーゼーションを実施し
た。マウスバーシカンアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブは、５’−ＣＣ
ＧＴＴＣＴＧＧＧＣＣＡＣＣＡＡＧＡＣＡＧＴＣＧＴＣＴＣＣ−３’、５’−Ｔ
ＧＡＣＣＧＣＣＣＣＧＡＴＡＴＣＣＡＡＡＣＡＡＧＣＣＴＧＴＴ−３’、５’−
ＴＣＣＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＴＡＡＴＣＧＣＡＴＴＧＧＴＣＡ−３’であっ
た。過剰な非標識オリゴヌクレオチドの存在下、標識オリゴヌクレオチドでいく
つかの切片をハイブリダイズさせることによって、in situシグナルの特異性を
調べた。
【０２６５】 細胞培養 トランスジェニックマウスの皮膚由来の繊維芽細胞初代培養のため、新生トラ
ンスジェニックマウスの皮膚を採取し、0.25％トリプシン中において１８時間イ
ンキュベートした。処理された表皮シートおよび真皮をさらにコラゲナーゼで1
時間消化した。ＭＥＤＭ培地(GIBCO)＋１０％ＦＣＳ中に細胞を拡散させ、トリ
プシン処理後３日ごとに継代した。β―ガラクトシダーゼ組織化学分析のため、
培養繊維芽細胞をＰＢＳ中の0.2％グルタールアルデヒドで２分間固定し、続い
て、洗剤洗浄液で５分間洗浄し、さらに染色反応を３０℃で１８時間実施した。
反応を止めた後、５μg/mlの７−アミノアクチノマイシンＤ(SIGMA, USA)溶液を
用いて室温で２０分間対比染色し、ＰＢＳで洗浄し、さらにフルオロマウント−
Ｇ(Southern Biotechnology, AL)で埋め込んだ。
【０２６６】 バーシカン−lacZトランスジェニックへアレスマウスの作成 バーシカンプロモーター活性の加齢に伴う変化を調べる目的で毛嚢のlacZ発現
を評価するため、トランスジェニック初代マウスとSKH-1マウス(Charles River
Laboratories)とを交配させることによって、ヘアレス遺伝的背景のバーシカン
−lacZトランスジェニックマウスを得た。従って、オスのヘミ接合性トランスジ
ェニックマウス(v/-HH)をメスのヘアレスマウス(-/-hh)と交配させて、ゲノムＰ
ＣＲによって選択された導入遺伝子陽性の子(v/-Hh)を再びヘアレスマウスに戻
し交配させて、ＰＣＲ検出およびそのヘアレス外観の組合せによって容易に選択
できるＦ２世代のバーシカン−lacZヘアレスマウス(v/-hh)を得た。
【０２６７】 バーシカン−lacZトランスジェニックマウスの作成 導入遺伝子挿入に関して、ＰＣＲおよびサザンブロッティング分析の両方によ
って、全部で２７匹の初代マウスの内６匹の陽性系列が検出された。導入遺伝子
のコピー数は、細胞当たり、１から２０コピーを超える範囲であった。尾皮膚で
のＸ−ｇａｌ組織化学反応を用いて、lacZ染色に関してそれらマウスをさらにス
クリーニングした。尾におけるLacZ染色の強さは、導入遺伝子のコピー数と相関
しなかった。A4681(１−２コピー)およびA4688(２０コピーを超える)は尾毛にお
いて同程度の強さのlacZ染色を示し、２０コピーを超えるコピー数を有するA467
9は尾においてわずかに薄い染色を示したのみである。尾皮膚における染色が最
も強くかつ良好な繁殖挙動を有するため、将来の研究のためにトランスジェニッ
ク系列A4681を選択した。全ての将来の分析は、DBA/2系統と交配させることによ
って得られたＦ１−Ｆ３子孫において実施した。
【０２６８】 胚性組織におけるlacZ発現の分布 間充織凝縮(mesenchymal condensation)領域内の発生中の前および後ろ肢(E13
.5)、および外胚葉において、非常に強い染色が観察された。外胚葉の発現は肢
の先端に限定されていた。放射標識アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたin
situ ハイブリダイゼーションは、肢芽の凝縮間充織において、同様の内因性マ
ウスバーシカンｍＲＮＡを発現した。
【０２６９】 E15.5胚において、腎糸球体、嗅上皮の間充織組織、舌の間充織組織および筋
肉、ならびに顎下腺において、強いlacZ染色が観察された。軟骨の周りの軟骨膜
細胞、血管、発生中の後脳および前脳の縁、平滑筋も陽性であった。
【０２７０】 LacZ、および内因性マウスバーシカンプローブならびに対照センスプローブを
用いた、トランスジェニック胚切片(E13.5)でのジゴキシゲニン非放射性in situ
ハイブリダイゼーションによって、肢を除いて、予測された発現パターンを確認
した。腎臓、嗅上皮、前肢の骨の軟骨、および脊椎軟骨において、両方でｍＲＮ
Ａ発現が観察され、導入遺伝子の妥当な発現パターンおよびタイミングを確認し
た。
【０２７１】 胚性皮膚におけるヒトバーシカン活性 Ｘ−ｇａｌ組織化学分析によって、E13.5、E14.5、E15.5、およびE17.5の胚由
来の発生中の皮膚において、LacZ発現を調べた。E13.5dでは、後ろおよび前肢を
除いて外胚葉全体において基本的に全く染色が観察されず、凝縮の最も早い段階
であると思われる単一の間充織細胞において、時折のわずかなLacZ染色が認めら
れた。ひげの毛芽はその段階で既にlacZ染色を示した。E14.5において、外胚葉
プラコード(毛穴)の下に結合した凝縮間充織細胞は明らかにlacZ陽性であり、完
全に陰性である周りの散在間充織細胞と非常に対照的であった。位相差写真は、
個々のβ-ｇａｌ陽性凝縮間充織細胞を示した。それら陽性部位の数は、全胚性
組織の矢状−中期の胚切片当たり４−５であった。E15.5において、毛穴の下の
それら陽性凝縮間充織細胞は、さらに強さを増し、かつ容積（すなわち細胞数）
が増加した。E17.5において、lacZ陽性の真皮乳頭の数および強さは劇的に高ま
ったが、それでもまだ、将来の真皮乳頭内に高度に限定されていた。わずかな表
皮プラコード（すなわち上皮ケラチノサイト）がそれ自体lacZ染色を示したが、
大部分が間充織細胞にまだ限定されていた。
【０２７２】 トランスジェニックマウスの皮膚における毛周期依存的ヒトバーシカン活性 出生後７日から、１４日、２８日、４０日、４ヶ月までの週令のトランスジェ
ニックマウスの皮膚切片においてlacZ染色を調べた。後期胚性皮膚における毛真
皮乳頭細胞での強いlacZ染色は、新生マウスの皮膚まで続き、さらに最初の発育
相の毛周期の間続いた。真皮乳頭細胞内に強い染色が限定された。興味深いこと
として、出生後７日の中期から後期の発育相段階において、比較的強い染色が内
部毛根鞘においても観察された。しかしながら、後期の発育相段階において、la
cZ染色は再び真皮乳頭細胞にのみ限定された。また、テロゲン毛の後期において
、棍毛ではlacZ染色は観察されなかった。第２の毛周期において、増殖している
真皮乳頭（第２の発育相の毛周期）は再び強いlacZ染色を示し、さらに、第２の
発育相の毛周期の後、毛真皮乳頭におけるlacZ活性は、長いテロゲン毛周期に亘
って、ほぼ完全に低下した。
【０２７３】 培養繊維芽細胞におけるヒトバーシカン活性 新生トランスジェニック系列の真皮繊維芽細胞由来の初代培養真皮繊維芽細胞
は、特定集団の細胞および毛クランプ(hair clamp)の中央（明らかに真皮乳頭）
においてのみlacZ染色を示した。全ての強く染色された細胞は円形であったため
、それらは毛真皮乳頭由来であろう。しかしながら、最初の継代後、陽性細胞の
形状は多様化しかつ円形に限定されず、２継代において、樹状突起を有する典型
的な繊維芽細胞様の細胞を含んでいた。それら陽性細胞集団は、最初の継代後少
なくとも６継代まで維持されたが、ある数の細胞（全細胞数を明確に指示する対
比核染色によって特定された）は継代の間中全く染色されなかった。陽性細胞の
おおよその数は５０％を越えなかった。染色の強さは継代と共に次第に衰えた。
【０２７４】 トランスジェニックマウスの皮膚におけるヒトバーシカン活性の加齢に伴う変
化 ｘ−ｇａｌ染色のための反応時間を１８時間まで長くすると、若年から生体ま
でのトランスジェニックマウスの皮膚において、毛真皮乳頭以外の上部真皮で、
より強い染色を示した。そのような長時間のインキュベーション条件下での新生
マウスの皮膚において、毛嚢を有するほとんどの真皮（ヘアレスマウスは最初の
周期においてのみ正常な毛を有している）がかなりの検出可能な染色を示した。
若年マウスの皮膚は、上部真皮において差別的に、線維芽細胞にのみ由来する拡
散染色を示し、一方、高齢マウスはかすかな染色を示すのみであり、トランスジ
ェニックマウスの皮膚におけるヒトバーシカンプロモーター活性が加齢と共に低
下することを示唆する。
【０２７５】 実施例８：生きた動物におけるレポーター遺伝子発現の評価 方法： 共焦点顕微鏡 共焦点顕微鏡を用いて生きたトランスジェニックマウスでの完全なそのままの
皮膚を調べるため、アバーティンの腹腔内投与によってヘアレスＶＥＧＦ−ＧＦ
Ｐトランスジェニックマウスを麻酔した。仰臥位でペトリディッシュに直接マウ
スを置いた。上記と同じように、皮膚の定位を容易にするためインクで処置領域
に印をつけて、ＴＰＡまたはアセトン処理を背部皮膚に行った。帯域通過フィル
ター530/30nmを有するLeica TCSNT4D共焦点顕微鏡システムを用い、515−545nm
の間の波長で発光を検出して、マウスの皮膚切片またはそのままの皮膚を分析し
た。
【０２７６】 共焦点顕微鏡による生きたトランスジェニックヘアレスマウスのそのままの皮 膚の表皮におけるＧＦＰの直接検出 ＧＦＰ誘導を生きたＶＥＧＦ−ＧＦＰトランスジェニックマウスの皮膚におい
て直接検出できるか否かを調べるため、アセトンまたはＴＰＡを施したトランス
ジェニックヘアレスマウス（同じ個体）の皮膚を麻酔条件下で共焦点イメージン
グで直接調べた。正常な生きた表皮を貫く光学的横断面は検出可能な蛍光を示し
、さらにＴＰＡで処置した皮膚は１２時間後、蛍光陽性領域の拡大を示した。非
トランスジェニック野生型の同腹子は、検出可能な特異的蛍光を全く示さなかっ
た。より高い倍率で、ＴＰＡ処置皮膚は、ＧＦＰがケラチノサイトの周りの細胞
外空間に局在化することを示した。Ｘ−Ｚ共焦点イメージングは、その信号が表
皮の基底層内にあることを確認した。
【０２７７】 生きたトランスジェニックマウスのそのままの皮膚のＧＦＰ信号の検出のため
のレーザー共焦点顕微鏡評価は、ＧＦＰが表皮内において容易に検出されること
を示唆する。それら結果は、in vivoでの長期間の遺伝子発現の非侵襲的モニタ
リングのためにＧＦＰトランスジェニックマウスを用い得ることを示唆する。ト
ランスジェニックＧＦＰレポーター遺伝子を共焦点顕微鏡のような顕微鏡評価の
技術と組み合わせる場合、使用する動物の数を減らし、簡単なモニターシステム
を使用し、さらに同じ個体における遺伝子発現の変化を長期間モニターすること
を可能とするため、そのようなシステムは従来のトランスジェニックレポーター
遺伝子動物法を超える大きな利点を有する。
【０２７８】 トランスジェニックマウスの皮膚におけるＧＦＰのin vivo発現の我々の成功は
、有用なモニターおよびスクリーニング手段を提供することによって、例えば炎
症性および新生物性の皮膚疾患等におけるＶＥＧＦ遺伝子発現の調節の理解を高
めるであろう。ＶＥＧＦ発現に関連すると考えられる発現型を有するマウスに育
てた場合に特に魅力的である。そのような新規な実験モデルは、ＶＥＧＦ遺伝子
の調節に関するin vivo研究も可能とする。また、トランスジェニック動物での
そのようなＧＦＰレポーターシステムは、老化過程の間における皮膚の恒常性に
焦点を合わせた研究においても利点を有する。
【０２７９】 実施例９：ヒトＭＭＰ９トランスジェニックマウス ＭＭＰ９(ゼラチナーゼＢ、92kD、ＩＶ型コラゲナーゼは、細胞外マトリックス
(ＥＣＭ)成分を分解できるマトリックスメタロプロテイナーゼのメンバーの１つ
である。本酵素(ＭＭＰ９)は、ＩＶ型およびＶ型コラゲナーゼ、ゼラチンおよび
エラスチンを分解することが分かっている。光老化を生じさせるＵＶＢによって
誘導されることも分かっている(Fisher, G.J., Nature 379, 335, 1996)。その
遺伝子の５’フランキング領域(-670配列位置から+1転写開始位置まで)は、HT10
80細胞のレポーター遺伝子(CAT)の発現を駆動するのに十分である(Sato, H., On
cogene 8, 395, 1993)。
【０２８０】 導入遺伝子の構築 導入遺伝子を構築するため、当業界で公知のＰＣＲに基づく技術を用いて、ヒ
トＭＭＰ９プロモーターの733 bp断片（ヌクレオチド-714から+19；転写開始位
置は+1）をヒトゲノムＤＮＡから得た。２つの異なるレポーター遺伝子、β―ガ
ラクトシダーゼレポーター遺伝子(lacZ)およびグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ
）遺伝子を構築のために用いた。
【０２８１】 β―ガラクトシダーゼレポーター遺伝子(lacZ)を含む構成物を構築するため、
好中球エラスターゼプロモーターが挿入されかつBg1 II 部位を有する修飾pNASS
betaベクター（Clontech）をBg1 II-XhoIで制限切断して線状化し、ＭＭＰ９プ
ロモーター断片を挿入した。前核注入のための導入遺伝子ＤＮＡ断片を得るため
、Bg1 IIおよびHind III酵素でベクターを切断した。線状導入遺伝子ＤＮＡ断片
は4630 bpの長さであった。
【０２８２】 グリーン蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）遺伝子を含む構成物を構築するため
、pEGFP-1(Clontech)をベースとするスプライス供与／受容を有する修飾ベクタ
ーpEGFP-1-SVをHind III-Kpn Iで制限切断して線状化し、同じＭＭＰ９プロモー
ター断片を挿入した。前核注入のための導入遺伝子ＤＮＡ断片を得るため、Hind
IIIおよびAf1 II酵素でベクターを切断した。線状導入遺伝子ＤＮＡ断片は1928
bpの長さであった。
【０２８３】 トランスジェニックマウスの作成 線状導入遺伝子ＤＮＡ断片を、ヘアレスマウス(SKH 1; Charles River, Bosto
n)の受精卵母細胞に注入した。その卵を擬似妊娠代理母に移植した。サザンブロ
ットによって、lacZまたはＧＦＰ断片の染色体組込みに関して子孫（Ｆ０）を調
べた。lacZ導入遺伝子の検出のため、尾から抽出したゲノムＤＮＡをNci Iで消
化し、ゲル上で分離し、次にナイロン膜上に移した。Nci Iで消化した導入遺伝
子ＤＮＡ断片をプローブに用いた。２つの独立した系列が導入遺伝子挿入を示し
た。ＧＦＰ導入遺伝子の検出のため、尾ゲノムＤＮＡをHinc IIで消化した。２
つの独立した系列が導入遺伝子挿入を示した。
【０２８４】 β-ガラクトシダーゼ組織化学分析 初代（Ｆ０）から得たＦ１マウスをβ―ガラクトシダーゼ組織化学分析のため
に用いた。２週令マウスの後ろ肢の骨をＰＢＳ中の0.5％グルタールアルデヒド
で３０分間固定した。ＰＢＳで３回および洗剤洗浄液で１回洗浄後、１mg/mlの
Ｘ-ｇａｌ(Sigma)、１０mMのフェロシアン化物、および１０mMのフェリシアン化
を含有する反応バッファーと共に３７℃でインキュベーションを行った。２時間
インキュベートした後、導入遺伝子を有するＦ１マウスにおいて青い染色が観察
されたが、導入遺伝子を包含しない兄弟では全く染色が観察されなかった。それ
らの結果は、in situハイブリダイゼーションにおいて２週令マウスの骨でＭＭ
Ｐ９が発現していることを示した報告と一致する(Reponen, P., Journal of Cel
l Biology 124, 1091, 1994)。
【０２８５】 実施例１０：ヒト好中球エラスターゼトランスジェニックマウス 好中球エラスターゼは広範囲のタンパク質を攻撃できる強力なセリンプロテア
ーゼである。本酵素を欠くヘアレスマウスは、ＵＶＢ照射によって生じる光老化
の１つの兆候である弾性線維症に罹らない(Starcher, B., Connective Tissue R
esearch, 31, 133, 1995)。従って、好中球エラスターゼは光老化において重要
な役割を果たすと考えられる。
【０２８６】 導入遺伝子の構築 導入遺伝子を構築するため、当業界で公知のＰＣＲに基づく技術を用いて、ヒ
ト好中球エラスターゼの1299 bp断片（ヌクレオチド-1280から+19；転写開始位
置は+1）をヒトゲノムＤＮＡから得た。EcoRI-XhoIで制限切断して線状化された
pNASSbetaベクター（Clontech）に、その好中球エラスターゼプロモーター断片
を挿入した。前核注入のための導入遺伝子ＤＮＡ断片を得るため、EcoRIおよびX
baI酵素でベクターを切断した。線状導入遺伝子ＤＮＡ断片は5179 bpの長さであ
った。
【０２８７】 等価物 当業者は、日常的な実験のみを用いて、この中に記載の本発明の特定実施形態
の多くの等価物を認識または考えつくであろう。そのような等価物は以下の請求
項によって包含されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ヒトバーシカン−lacZ導入遺伝子の構築の略図
【図２】 図２は、血管内皮細胞増殖因子−グリーン蛍光タンパク質［ＶＥＧＦ−ＧＦＰ
］導入遺伝子構成物の略図
【図３】 図３は、5069pb ＭＭＰ９プロモーター−ＧＦＰ構成物のヌクレオチド配列で
ある
【図４】 図４は、7383bp ＭＭＰ９プロモーター−β-Ｇａｌ構成物のヌクレオチド配列
である
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 キシモト，ジロウ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02181 ウェレスリー ウスター ストリ ート 353 (72)発明者 ニシヤマ，トシロウ 神奈川県横浜市金沢区福浦２−12−１ (72)発明者 エハマ，リツコ 神奈川県横浜市金沢区福浦２−12−１ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA11 CB01 CB09 FA11 FB02 FB03 GC15 4B024 AA11 CA04 EA04 FA02 GA11 HA12 4B063 QA07 QQ02 QR32 QS05 QS34

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 皮膚に対する効果に関して、処置を評価する方法であって： 皮膚代謝関連プロモーターに結合したレポーター遺伝子を包含するトランスジ
    ェニック動物を提供し、ここで該レポーター遺伝子が発光または蛍光産物をコー
    ドしており； 前記トランスジェニック動物に対して処置を施し；さらに、 前記レポーター遺伝子の発現を評価して、それによって皮膚に対する処置の効
    果に関して前記処置を評価する；各工程を含むことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 前記処置が化合物を含み、該化合物を前記トランスジェニッ
    ク動物の皮膚に適用することによって化合物を投与することを特徴とする請求項
    １記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記トランスジェニック動物が、トランスジェニックミニブ
    タ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット、またはトラン
    スジェニックマウスより成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の
    方法。
  4. 【請求項４】 前記皮膚代謝関連プロモーターが、ヒト皮膚代謝関連プロモ
    ーターであることを特徴とする請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記皮膚代謝関連プロモーターが、細胞外マトリックスタン
    パク質の代謝を制御するプロモーター、バーシカンプロモーター、マトリックス
    メタロプロテイナーゼプロモーター、血管内皮細胞増殖因子プロモーター、ヒア
    ルロン酸シンターゼプロモーター、ＭＭＰ２またはＭＭＰ９プロモーター、およ
    び好中球エラスターゼプロモーターよりなる群から選択されることを特徴とする
    請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェ
    ラーゼ、グリーン蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペロキ
    シダーゼ、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードす
    る遺伝子よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記処置を続いて施す工程をさらに含むことを特徴とする請
    求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記レポーター遺伝子の発現を対照値と比較する工程をさら
    に含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記トランスジェニック動物が、第２皮膚代謝関連プロモー
    ターに結合したレポーター遺伝子を包含しており、該第２皮膚代謝プロモーター
    が第１皮膚代謝関連プロモーターと異なっていることを特徴とする請求項１記載
    の方法。
  10. 【請求項１０】 前記レポーター遺伝子発現の評価工程が、動物の生涯の間
    に少なくとも１回反復されることを特徴とする請求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】 最初と次の評価工程が、１、１０、３０、６０、９０、１
    ８０、３６５、または７００日ほども間隔が空けられることを特徴とする請求項
    １０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記最初と次の評価工程が、生きた動物において実施され
    ることを特徴とする請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 皮膚代謝関連プロモーターに結合したレポーター遺伝子を
    包含する非ヒトトランスジェニック動物であって、該レポーター遺伝子が発光ま
    たは蛍光産物をコードすることを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物。
  14. 【請求項１４】 前記皮膚代謝関連プロモーターが、バーシカンプロモータ
    ー、マトリックスメタロプロテイナーゼプロモーター、血管内皮細胞増殖因子プ
    ロモーター、ヒアルロン酸シンターゼプロモーター、ＭＭＰ２またはＭＭＰ９プ
    ロモーター、および好中球エラスターゼプロモーターよりなる群から選択される
    ことを特徴とする請求項１３記載の非ヒトトランスジェニック動物。
  15. 【請求項１５】トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現を分析す
    る方法であって： 生きたトランスジェニック動物を提供し； 導入遺伝子配列によってコードされたまたは導入遺伝子の調節要素の制御下に
    ある、レポーター遺伝子の存在または不在を、前記生きたトランスジェニック動
    物において評価し、該レポーター遺伝子が発光または蛍光産物をコードしており
    ； それによって導入遺伝子の発現を分析する；各工程を含むことを特徴とする方
    法。
  16. 【請求項１６】 レポーターがＧＦＰであることを特徴とする請求項１５記
    載の方法。
  17. 【請求項１７】 評価工程が、動物の生涯の間に少なくとも１回反復される
    ことを特徴とする請求項１５記載の方法。
JP2001521146A 1999-09-10 2000-09-08 皮膚に対する効果に関して、化合物を評価する方法。 Withdrawn JP2003520946A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/393,483 US6689936B1 (en) 1997-12-17 1999-09-10 Method for evaluating a compound for its effect on skin
US09/393,483 1999-09-10
PCT/US2000/024637 WO2001017343A1 (en) 1999-09-10 2000-09-08 Methods for evaluating a compound for its effect on skin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003520946A true JP2003520946A (ja) 2003-07-08

Family

ID=23554874

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001521146A Withdrawn JP2003520946A (ja) 1999-09-10 2000-09-08 皮膚に対する効果に関して、化合物を評価する方法。

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP1215959A4 (ja)
JP (1) JP2003520946A (ja)
WO (1) WO2001017343A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009512853A (ja) * 2005-10-19 2009-03-26 エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ 動物個体の神経系の非侵襲的インビボ蛍光イメージング

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201700138D0 (en) 2017-01-05 2017-02-22 Senzagen Ab Analytical methods and arrays for use in the same

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999030743A1 (en) * 1997-12-17 1999-06-24 The General Hospital Corporation Methods for evaluating a compound for its effect on skin

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009512853A (ja) * 2005-10-19 2009-03-26 エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ 動物個体の神経系の非侵襲的インビボ蛍光イメージング

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001017343A9 (en) 2002-10-03
EP1215959A4 (en) 2005-02-02
WO2001017343A1 (en) 2001-03-15
EP1215959A1 (en) 2002-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zheng et al. Ligand-dependent genetic recombination in fibroblasts: a potentially powerful technique for investigating gene function in fibrosis
Kishimoto et al. In vivo detection of human vascular endothelial growth factor promoter activity in transgenic mouse skin
Vikstrom et al. Mice expressing mutant myosin heavy chains are a model for familial hypertrophic cardiomyopathy
Blessing et al. Overexpression of bone morphogenetic protein-6 (BMP-6) in the epidermis of transgenic mice: inhibition or stimulation of proliferation depending on the pattern of transgene expression and formation of psoriatic lesions.
Ramírez et al. Sequences 5′ of the bovine keratin 5 gene direct tissue-and cell-type-specific expression of a lacZ gene in the adult and during development
Blessing et al. Transgenic mice as a model to study the role of TGF-beta-related molecules in hair follicles.
Olaopa et al. Pax3 is essential for normal cardiac neural crest morphogenesis but is not required during migration nor outflow tract septation
Prowse et al. Ectopic expression of the nude gene induces hyperproliferation and defects in differentiation: implications for the self-renewal of cutaneous epithelia
Huang et al. Gene targeting and expression analysis of mouse Tem1/endosialin using a lacZ reporter
US7807864B2 (en) Transgenic animal as a model for fibrotic diseases
EP0633315A2 (en) Transgenic animals for the determination of agents which stimulate or repress epidermal hyperproliferation and hair growth
US20070074298A1 (en) Versican and epithelial-mesenchymal interaction
JP4125486B2 (ja) 化合物を皮膚に対するその効果について評価する方法
JP5250810B2 (ja) ユートロフィン遺伝子発現増強物質のスクリーニング
JP2003520946A (ja) 皮膚に対する効果に関して、化合物を評価する方法。
Santos et al. Delays in malignant tumor development in transgenic mice by forced epidermal keratin 10 expression in mouse skin carcinomas
EP1875927B1 (en) Methods for evaluating a compound for its effect on skin
US20030100480A1 (en) Methods and compositions for modulating sebaceous glands
Mahony et al. Analysis of mouse keratin 6a regulatory sequences in transgenic mice reveals constitutive, tissue-specific expression by a keratin 6a minigene
EP2617284B1 (en) Model animal for studying hair growth cycle
JP5274015B2 (ja) サスペースノックアウト動物
WO2001085964A2 (en) Over expression of the whn protein
US20020073440A1 (en) Method for screening and transgenic model
Chandler Identification of an ancient Bmp4 cis-regulatory element using fish and mouse
EP1181352A1 (en) Versican and epithelial-mesenchymal interaction

Legal Events

Date Code Title Description
A300 Withdrawal of application because of no request for examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300

Effective date: 20071204