JP5274015B2 - サスペースノックアウト動物 - Google Patents
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Description
Bernard D. et al., J. Invest. Dermatol. 125, 278-287, 2005
その結果、サスペースKOマウスは、生後5週頃から体側に対して平行に無数のしわが観察された。すなわち、サスペースKOマウスは、表皮に原因があるしわの解析モデルとしても有用であることが示唆され、本発明を完成するに到った。
ここでtargeted disruptionは、標的となる遺伝子の塩基配列に変異を導入したDNA、好ましくは選択マーカー、更に好ましくは薬剤に対する耐性遺伝子を挿入したDNAを、細胞に導入し、導入したDNAと標的遺伝子との間で相同組換えを起こした細胞を選択して、標的遺伝子に変異を導入する技術を指す(Suzanne, L. et.al., Nature, 336, 348, 1988)。すなわち、targeted disruptionによりサスペースをコードする遺伝子を欠失させた場合、該遺伝子の一部または全部が、targeted disruptionのために用いた外来核酸に置き換わっている。外来核酸は、単にサスペースをコードする遺伝子を欠失させたゲノム由来の配列であってもよく、あるいは所望の配列を含んでもよい。例えば所望のマーカー遺伝子、好ましくは薬剤に対する耐性遺伝子を含んでいてもよい。targeted disruptionは、サスペースをコードする遺伝子の塩基配列の情報に基づいて該遺伝子を欠失させる技術の例示であり、当該遺伝子の塩基配列の情報に基づいて欠失させたのであれば本発明に含まれるものである。またここで遺伝子を欠失させるとは、遺伝子に変異を導入して、その遺伝子産物の機能を失わせることを意味する。
また、機能を持ったサスペースとは、プロテアーゼ活性を保持したサスペースを言い、機能を持ったサスペースを欠失させたことは、表皮顆粒層の部位に、免疫染色等で見出されるサスペースが実質的に存在しないことにより確認することができる。実質的に存在しないとは、野生型の表皮顆粒層におけるサスペースの検出量に比べ、好ましくは1/5以下、より好ましくは1/10以下、より好ましくは1/20以下、より好ましくは検出限界以下(またはバックグラウンドレベル)であることを言う。
本発明は、機能を持ったサスペースを欠失したマウスが、個体発生して発育し、体側にしわが形成されるというサスペースの欠失に伴った異常を示して、生体におけるサスペースの機能の解析に有用であることを見出したものである。
サスペースをコードする遺伝子あるいは該遺伝子と相同な遺伝子には、配列番号1の塩基配列と高い同一性を有し、プロテアーゼをコードする塩基配列を含むDNAが含まれる。またサスペースをコードする遺伝子あるいは該遺伝子と相同な遺伝子には、配列番号2に記載のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含み、特にプロテアーゼ活性の活性中心、および/またはプロセシングを受ける部位に高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするDNAが含まれる。例えば、プロテアーゼ活性断片をコードする配列番号2の189から324番目のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、より好ましくは配列番号2の84番目から339番目のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、本発明においてサスペースに含まれる。すなわち本発明においてサスペースをコードする遺伝子には、以下の(i)又は(ii)のDNAを含んで成る遺伝子が含まれる。
(i)配列番号2の84から339番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは189から324番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするDNA。
(ii)配列番号2の84から339番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは189から324番目のアミノ酸配列と高い同一性を有し、プロテアーゼ活性を持つポリペプチドをコードするDNA。
(a)配列番号1に記載の塩基配列またはそのコード配列からなるDNA。
(b)配列番号1に記載の塩基配列またはそのコード配列からなるDNAあるいはそれらの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、プロテアーゼをコードするDNA。
またサスペースをコードする遺伝子には、以下の(c)又は(d)のDNAを含んでなる遺伝子も含まれる。
(c)配列番号1の256から1023番目または571から978番目の塩基配列からなるDNA。
(d)(c)のDNAまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、プロテアーゼをコードするDNA。
例えば、配列番号1に記載の塩基配列(例えば1〜1535番目)、好ましくは配列番号1の256から1023番目の塩基配列、より好ましくは配列番号1の571から978番目の塩基配列からなるDNA、あるいはそれらの相補配列からなるDNAから調製したプローブが、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、プロテアーゼをコードするDNAは、本発明においてサスペースをコードする遺伝子に含まれる。プローブの調製は、例えばランダムプライマー法(Feinberg, A. P. and Vogelstein, B., 1983, Anal. Biochem. 132, 6-13; Feinberg, A. P. and Vogelstein, B., 1984, Anal. Biochem. 137, 266-267)を用いることができる(例えば Random Primer DNA Labeling Kit, Takara Bio Inc., Otsu, Japan)。ここでプロテアーゼとは、蛋白質分解活性(プロテアーゼ活性とも言う)を持つポリペプチドを言う。プロテアーゼ活性は、例えば蛍光ラベルした基質に対する蛋白質分解活性を、EnzchekTM Protease Assay Kit (Molecular probe) を用いて蛍光定量法にて測定することができる。基質としては、例えばインスリンまたはカゼインを用いることができるが、これらに限定されない。またここでストリンジェントな条件の例としては、65℃ 4x SSC (1×SSC は 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrateを含む)、7%(W/V) sodium dodecyl sulfate (SDS)、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5×デンハルト液(1×デンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、および0.2%フィコールを含む溶液)中におけるハイブリダイゼーション、次いで60℃で1時間0.5x SSC中での洗浄の洗浄である。より好ましい洗浄の条件は、65℃で1時間0.1x SSC中での洗浄である。また別法としてストリンジェントな条件は、50%ホルムアミド中42℃ 4x SSC中におけるハイブリダイゼーションである。洗浄は、上記と同様の条件で行う。例えば所望の哺乳動物由来のcDNAライブラリーやゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、サスペースをコードする天然のDNAを単離することができる。サスペースをコードする遺伝子としては、例えばAccession No. XM_575593(protein ID XP_575593)、XM_580888(protein ID XP_580888)、XM_538536(protein ID XP_538536)などが例示できる。
また本発明は、サスペースをコードする遺伝子を欠失させた動物を、サスペースが欠失して引き起こされた疾患のモデル動物として、該疾患の解析に使用する方法にも関する。
これに加え本発明は、サスペースをコードする遺伝子を欠失させた動物の、しわを測定する工程を含んで成る、該動物をしわのモデル動物として使用する方法も開示する。ここでしわの測定には、しわの有無の測定、しわの出現時期の測定、およびしわの程度の測定など、しわに関する所望の測定が含まれる。しわの程度の測定には、しわの数、密度、深さ、長さ、たるみ具合、柔軟性などの、程度が比較可能な所望の定性的、定量的、または半定量的なしわの測定が含まれる。具体的なしわの測定方法としては、例えば斜光照明によるシワの画像解析評価法、半透明レプリカ光透過法による解析評価法、あるいは三次元座標計測装置による解析評価法等を用いることができる(日本化粧品工業連合会のシワ評価ガイダンス、香粧会誌Vol.28 No.2 (2004) p.118〜p.128)。
〔1〕サスペースをコードする遺伝子あるいは該遺伝子と相同な遺伝子を欠失し、機能を持ったサスペースを欠失した非ヒト動物、
〔2〕サスペースをコードする遺伝子あるいは該遺伝子と相同な遺伝子をtargeted disruptionにより欠失させた、〔1〕に記載の非ヒト動物、
〔3〕非ヒト動物が齧歯類動物である〔1〕または〔2〕に記載の動物、
〔4〕齧歯類動物がマウスである〔3〕に記載の動物、
〔5〕以下の(a)又は(b)のDNAを含んでなる遺伝子を欠失した〔1〕ないし〔4〕に記載の動物、
(a) 配列番号1に記載の塩基配列またはそのコード配列からなるDNA、
(b) 配列番号1に記載の塩基配列またはそのコード配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、プロテアーゼをコードするDNA、
〔6〕〔1〕ないし〔5〕に記載の動物の、しわを測定する工程を含んで成る、該動物をしわのモデル動物として使用する方法、に関する。
以下に本発明の実施の形態について詳細に説明する。
最初にサスペース遺伝子のtargeted disruptionについて、サスペース遺伝子のクローニング、targeted disruptionに用いるターゲッティングベクターの構築、相同組換えを起こしたES細胞の取得の順に説明する。
1.サスペース遺伝子の一部を含むDNAのクローニング
サスペースをコードするDNAは、配列番号1に記載の塩基配列を基にプライマーを設定し、非ヒト動物のGenomic DNAあるいはcDNAよりPCRにより、あるいは非ヒト動物のRNAよりRT-PCRにより得ることができる。また別法としては、前述の引用文献(Bernard D. et al.)に記載の塩基配列を基にプローブを合成して、非ヒト動物のGenomic DNA library あるいはcDNA libraryより、プローブとハイブリダイズするクローンを選び出し、塩基配列を決定して、サスペース遺伝子あるいはその一部、好ましくは500 bp以上、更に好ましくは1 kbp以上の塩基配列を含むクローンを選択しても良い。
クローニングされたDNAに含まれる制限酵素切断部位を確認して制限酵素地図を作製する。相同組換えするのに十分な長さのDNA、好ましくは7 kbp以上、更に好ましくは10 kbp以上のクローンが得られなかった場合は、複数のクローンより適切な制限酵素部位でDNAを切り出して繋ぎ合わせることも許される。
本発明は、サスペースをコードするDNAあるいはその一部、好ましくはサスペースをコードするDNAの500 bp以上、更に好ましくは1 kbp以上、更に好ましくは2 kbp以上、3 kbp以上の塩基配列を含むDNAの、サスペースKO動物、しわを有する動物、またはしわモデル動物の製造における使用にも関する。
得られた相同組換えに十分な長さのDNA中のエクソン領域の制限酵素部位に、薬剤耐性遺伝子などのポジティブ選択マーカー、好ましくはネオマイシン耐性遺伝子を導入する。またエクソンの一部を取り除いて、代わりに薬剤耐性遺伝子に置き換えることも許される。適当な制限酵素siteが無い場合にはPCR・制限酵素siteを含むオリゴヌクレオチドのligation等により、適当な制限酵素siteを導入してもよい。
好ましくは、導入されたDNAとサスペース遺伝子の間に相同組換えが起こらず、導入されたDNAがサスペース遺伝子以外の部位に挿入されてしまった胚性幹細胞(ES細胞)を除去するために、ベクター内にはネガティブ選択マーカー、例えばチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素遺伝子などを含むのが望ましい。
これらのDNAの塩基配列を操作する組換えDNA技術は、例えばSambruck, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY に記載された方法によって行うことができるが、適当な組換えDNAを得ることができれば、これらの方法に限られるものではない。
作製したターゲティングベクターを、制限酵素で切断して直鎖状DNAとし、例えばフェノール・クロロフォルム抽出、アガロース電気泳動、超遠心等により精製して、ES細胞、例えばTT2(Yagi T. et al., Anal. Biochem. 214: 70-76, 1993)へトランスフェクションする。トランスフェクションの方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクチンなどが挙げられるが、本発明はこれに限られるものではない。ES細胞として、ラット(Iannaccone PM et al., Dev. Biol. 163:288-292, 1994)、サル(Thomson JA, et al: Proc Natl Acad Sci USA (1995) 92: 7844-7848)、ウサギ(Schoonjans L et al., Mol. Reprod. Dev. 1996; 45:439-443)、ミンク(Sukoyan, M.A. et al. (1993) Mol. Reprod. Dev. 36, 148-158)、ハムスター(Doetschman T et al., Dev Biol 1988;127:224-227)、ブタ(Wheeler, M. B. (1994) Reprod. Fertil. Dev. 6, 563-568; Shim, H. et al. (1997) Biol. Reprod. 57, 1089-1095)、マーモセット(Thomson, J. A. et al. (1996) Biol. Reprod. 55, 254-259; Thomson JA et al., Curr Top Dev Biol (1998) 38: 133-165)などの動物由来のES細胞も使用することができる。
トランスフェクションした細胞は適当な選択培地中、例えばネオマイシン耐性遺伝子とチミジンキナーゼ遺伝子を組み込んだターゲティングベクターを構築した場合には、培地中にネオマイシンとガンシクロビルを含む選択培地中で培養する。
両薬剤に対し薬剤耐性を呈して増殖してきたES細胞に、導入遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれたことは、PCR等で容易に同定することができる。更にターゲティングベクターの外側の5’上流もしくは3’下流のDNA一部をプローブとしてサザンブロット解析する事により、相同組み換えを起こしたかどうかを確認する事もできる。また、ターゲティングベクターがランダムに挿入されていないことを確かめるために、ターゲティングベクター内のDNAをプローブとしてサザンブロット解析する事により確認できる。これらの方法を組み合わせることにより、相同組み換えを起こしたES細胞を取得することができる。
ノックアウトマウスは、受精後8細胞期胚あるいは胚盤胞の採取、相同組み換えを起こしたES細胞のマイクロインジェクション、偽妊娠マウスへの操作卵の移植、偽妊娠マウスの出産と産仔の育成、PCR法およびサザンブロット法による遺伝子導入マウスの選抜、導入遺伝子をもつマウスの系統樹立、のステップを経て作製する(Yagi, T. et. al., Analytical Biochem. 214, 70, 1993)。
1.8細胞期胚あるいは胚盤胞の採取
受精卵は、雌マウスに過剰排卵を誘発させるため、妊馬血清性生殖腺刺激ホルモン5国際単位とヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン2.5国際単位をそれぞれ腹腔内投与して、受精後2.5日目の雌マウスより卵管−子宮還流法により8細胞期胚を得る。なお胚盤胞を用いる場合は受精後3.5日目、雌マウスの子宮を取り出し、子宮還流により胚を得る。
得られた8細胞期胚または胚盤胞に、相同組換えを起こしたES細胞をマイクロインジェクションする。マイクロインジェクションは、例えばHogan, B.L.M., A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1986、Yagi T. et. al., Analytical Biochem. 214, 70, 1993 の記載に基づき、倒立顕微鏡下で、マイクロマニピュレータ、マイクロインジェクター、インジェクションピペットおよびホールディングピペットを用いて行うことができる。また、インジェクション用ディッシュには、例えばFalcon 3002(Becton Dickinson Labware)に培地5μlの液滴およびES細胞を浮遊させた液滴を作り、流動パラフィンを重層したものを用いる。以下相同組換えを起こしたES細胞のマイクロインジェクションした8細胞期胚あるいは胚盤胞を操作卵と称す。
精管結紮雄マウスと正常雌マウスを交配させて偽妊娠マウスを作成し、操作卵を移植する。操作卵の移植は、例えばHogan, B.L.M., A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1986、Yagi T. et. al., Analytical Biochem. 214, 70, 1993 の記載に基づいて行うことができる。以下に具体的操作の例を記すが、本発明はこれに限られるものではない。
偽妊娠マウスを、例えば50mg/kg体重のペントバルビタールナトリウムにて全身麻酔を行い、両けん部を約1cm切開して卵巣および卵管を露出し、実体顕微鏡下で卵巣嚢をピンセットで切開し卵管采を露出させる。次に卵管あたり7〜8個の操作卵を卵管采に送り込む。この時、操作卵とともに入れた微小気泡によって、卵管内に移植されたことを確認する。このあと卵管および卵巣を腹腔に戻し両切開部を縫合し、マウスを麻酔から覚醒させる。場合によっては、操作卵を翌日まで培養し、胚盤胞に発生させてから子宮に移植しても良い。
多くの場合、移植後17日目には仔マウスが得られる。仔マウスは通常、相同組換え起こしたES細胞と、受精卵を採取したマウス細胞のキメラとなる。例えばES細胞としてTT2を用い、ICRより採取した8細胞期胚に注入した場合、キメラ率の高い仔マウスは体毛色がアグウチ優位となり、キメラ率の低いマウスは体毛色が白色優位となる。
5.PCR法およびサザンブロット法による遺伝子導入マウスの選抜
導入遺伝子が生殖細胞に入っているかどうかは、体毛色が白色のマウス、たとえばICRと交配し、得られた仔マウスの体毛色により容易に確認することができる。あるいはキメラ率の高いマウスは生殖細胞も導入遺伝子を含んでいることが期待されることから、できるだけキメラ率の高いマウスを交配し、得られた仔マウスの尾よりDNAを抽出してPCRをすることにより、導入遺伝子の有無を確認できる。また、PCRの代わりにサザンブロット解析により、より確実な遺伝子型を同定できる。
ヘテロマウス(以下、Heマウス)同士を交配することによって、得られた仔マウスの中に導入遺伝子がホモに存在するサスペースKOマウスを得ることができる。サスペースKOマウスは、Heマウス同士、HeマウスとサスペースKOマウス、サスペースKOマウス同士のいずれの交配でも得ることができる。
サスペースKOマウスのmRNAの発現の有無はノーザンブロット解析、RT-PCR、RNaseプロテクションアッセイ、in situ等により確認できる。またサスペースのタンパク質の発現を免疫組織染色により確認することができる。さらに、表皮顆粒層部位にサスペースが存在しないことを免疫染色等により確認することも可能である。
サスペースKO動物は、サスペースの機能を解析する目的で用いることができる。サスペースKO動物を野生型動物と比較し、サスペースKO動物の表現形質から、サスペースが野生型動物で果たしていた機能を解析することが可能である。
サスペースKO動物を用いれば、その表現形質から、サスペースが個体発生に於いて果たした機能も解析することができる。
その端的に現れた例として、本発明者らは、サスペースが皮膚の形態形成に重要な役割を果たすことを見出した。その発端は、サスペースKOマウスが体側に多数のしわを引き起こすことを見出したことである。このしわはオスよりもメスでより顕著に認められる事から皮膚の性差がしわの形成に影響を及ぼす事が示唆された。
従って、サスペースKOマウス、及び野生型マウスの表現形質を比較観察することにより、サスペースが果たす特有の機能を解析できることを示している。例えば本発明は、皺および/または弛みを検出する方法であって、サスペースをコードする遺伝子または該遺伝子と相同な遺伝子を欠失させた動物の皺および/または弛みを検出する工程を含む方法に関する。また本発明は、皺および/または弛みの検出用の、サスペースをコードする遺伝子または該遺伝子と相同な遺伝子を欠失させた動物に関する。また本発明は、皺および/または弛みの検出における、サスペースをコードする遺伝子または該遺伝子と相同な遺伝子を欠失させた動物の使用に関する。
本発明で明らかにした、サスペースKO動物の、サスペースのしわ形成に果たす機能の解析のための使用、及びサスペースKO動物のしわモデル動物としての使用は、本発明の例示であり、本発明はこの例に限られるものではない。
本発明は、サスペースが機能的に発現していないサスペースKO動物の作製法、及びその特徴を開示するものである。本発明により、サスペースに特有の機能を解析することが可能となっただけでなく、サスペースKO動物を、サスペースの欠失により起こるしわのモデル動物として使用することが可能となった。例えば、サスペースKO動物におけるしわおよび/またはたるみを指標として、これを軽減する薬剤や治療方法のアッセイやスクリーニングを行うことができる。また、サスペースKO動物に対して病態を作製する事により、サスペースがその病態形成にどのぐらい関わっているかを調べる事ができ、サスペース阻害剤の有効性を確認する事ができる。さらに、リコンビナントサスペースを化粧品や治療薬として使用する際、サスペースKO動物のしわを指標として活性の確認に用いる事もできる。
配列番号1に記載のマウスサスペース遺伝子の塩基配列を基に、公的なゲノミックデータベースをサーチして、マウスサスペース遺伝子の5’側2.2Kb、3’側7.7Kbのゲノム領域を増幅するプライマーを設計した。そのプライマーを用いて129SVJ由来のマウスゲノムから、ジェノミックPCRによりサスペース遺伝子の5’側、3’側ゲノム領域を単離した。
プロモーターを含むネオマイシン耐性遺伝子の両側に、サスペース遺伝子のエクソンに対して5’側、および3’側相同領域を持つターゲティングベクターを作成した。
5’側相同領域を含むゲノミックDNAクローンはbluntingを行った。3’側相同領域を含むゲノミックDNAクローンはPCR プライマー中の配列であるSal IとApa Iで切断した。pBluescriptTM SK(-)にネオマイシン耐性遺伝子が挿入されたものに対して、これらの5’側の相同領域、3’側の相同領域をそれぞれネオマイシン耐性遺伝子の両側に対してblunting部位、Sal I, Apa I切断部位を順に作製し導入することで最終的にターゲティングベクターを作製した。(図1)。
ターゲティングベクターをNot Iで切断して直鎖上のDNA(1 mg/ml)とした。ES細胞へのエレクトロポーレーションはKURABO社にて行った。生じたES細胞コロニーの一部からDNAを抽出し、相同組み換えのみが起きているクローンをサザンブロット解析によって同定した。ターゲッテイングベクターにふくまれない部分の5’側のゲノムDNAをプローブとして、サザンブロット解析を行ったが、野生型の6.8 Kbに対して相同組換えでは2.7 KbのDNA断片を検出することができた。
相同組み換えしたES細胞のメスマウスへのインジェクションはKURABO社により行われた。その結果得られた、キメラマウスをC57BL/6と交配することによってヘテロ (He) マウスを得て、Heマウス同士の交配によってノックアウト (KO) マウスを得た。
得られたマウスの遺伝子型を、PCRによって生じるDNA断片のサイズで確かめた。マウスの尾を2-3mm程度切り、ProteinaseK (0.25 mg/ml) によって消化 (55℃、一晩) した。以降、ゲノムDNAを常法に従って抽出し、蒸留水100-200μlにて溶解してPCRのテンプレートとした。ネオマイシン遺伝子に含まれる配列(P3; 配列番号3)と、サスペース遺伝子の2つの部位にプライマーを設計し(P1及びP2; 配列番号4及び配列番号5)、PCRを行うと、変異を起こした遺伝子は460bp(配列番号3と配列番号4からの産物)、野生型の遺伝子は670bp(配列番号4と配列番号5からの産物)のPCR産物を生じ、これにより各個体の遺伝子型を同定した。
また、サザンブロット解析によっても遺伝子型を確認した。マウスの尾より抽出したゲノムDNAをEcoRIにより切断し、KOマウスで2.7 kbのシグナルが検出されることを確認した。
サスペースKOマウスにおけるサスペースの発現をウエスターンブロットにより確認した。各遺伝子型のマウス3匹の皮膚から、3%ドデシル硫酸ナトリウム、1%メルカプトエタノールを含む溶液でタンパク質を抽出した。15%アクリルアミドゲルにて電気泳動を行い、抗サスペース抗体を用いてサスペースの欠損を確認した。また、マウス皮膚凍結切片を使った免疫組織検査でもサスペースは完全に欠損していた。
サスペースKOマウスは、生後5週頃から体側に対して平行に無数のしわが観察され、表皮に原因があるしわの解析モデルとしても有用であることが示唆された(図2)。
サスペースKOマウスのしわを更に解析するために組織化学的解析を行った所、すべての細胞層が正常に形成されていた(図3A)。また、他の重層扁平上皮である、毛、耳、食道、前胃部、膀胱等も正常であった。
次に角質細胞を耳から分離して解析した。マウスの耳を切除後、25 mM DTT, 2% SDSを含む純水に入れ、15分煮沸した。その後、遠心し、沈殿を10 mM Tris-Cl (pH 8.0)と1 mM EDTAの溶液に再建濁し、血球計算板に入れて観察した。サスペースKOマウスと正常マウスとの間に変化は認められなかった。(図3B)
マウス脇の皮膚を2% paraformaldehyde/PBS中で、室温、1時間、固定し、10% sucrose/PBS, 20% sucrose/PBS中において、それぞれ、3時間、o/N, 4℃で処理を行った。その後、Tissue-TEK O.C.T. Compound (Sakura Finetechnical) に包埋し、ドライアイスで凍結させた。その後、10μm厚で切片を作製し、シランコートしたスライドグラス上で乾燥させ、Block-Ace blocking solution (大日本製薬) 中で、室温1時間処理した後、1次抗体を加え、室温で1時間放置した。次にPBSで三回洗浄した後に、Alexa 488-goat anti-rabbit IgG (Molecular Probe) とSYTOX Green (Molecular Probe) の混合液中で、室温で30分間処理した。その後PBSで三回洗浄した後に、50% glycerol/PBSでマウントした。Confocal顕微鏡は、LSM510 confocal laser scanning microscope (cersion 23.3; Carl Zeiss Inc.) を用いた。図4Aに示すように、Keratin 14, keratin 1, involucrin, filaggrin, loricrin, desmoglein 1の表皮に対する免疫染色で、発現レベル及び局在にサスペースKOマウスと正常マウスで差はなかった。
Claims (5)
- サスペースをコードする遺伝子あるいは該遺伝子と相同な遺伝子をホモで欠失し、機能を持ったサスペースを欠失し、しわが増加した齧歯類動物からなる、しわ動物モデル。
- サスペースをコードする遺伝子あるいは該遺伝子と相同な遺伝子を標的化破壊(targeted disruption)により欠失させた、請求項1に記載のしわ動物モデル。
- 該齧歯類動物がマウスである請求項1または2に記載のしわ動物モデル。
- 以下の(a)又は(b)のDNAを含んでなる遺伝子を欠失した請求項1から3のいずれかに記載のしわ動物モデル。
(a)配列番号1に記載の塩基配列またはそのコード配列からなるDNA。
(b)配列番号1に記載の塩基配列またはそのコード配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、プロテアーゼをコードするDNA。 - 請求項1から4のいずれかに記載のしわ動物モデルの齧歯類動物の、しわを測定する工程を含んで成る、該動物をしわのモデル動物として使用する方法。
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