JPH0819352A - トランスジェニック動物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 非ヒトトランスジェニック動物であって、a)
内胞状皮膚及び毛包において誘導し得る調節領域と、b)
標識遺伝子とからなる組換え遺伝子組立て体又は導入遺
伝子を含有するトランスジェニック動物。前記遺伝子組
立て体又は導入遺伝子は、前記動物それ自体又は胎生段
階における該動物の先代に導入されている。前記標識遺
伝子は、Ｋ６ケラチンの遺伝子の調節領域の制御下で容
易に検出できることにを特徴とする。Ｋ６ケラチンは内
因性（異常増殖を生じる腫瘍、傷の治癒、病気例えば乾
癬）及び外因性（レチノイン酸、TPA などによる局所処
理）の異常増殖刺激に応答して表皮の上部基底層で誘導
される能力に特徴がある。 【効果】このトランスジェニック動物は、表皮の異常増
殖を誘発及び保護する薬剤、例えば放射線、化学物質、
化粧料等を同定するためのモデル系として使用でき、ま
た毛の成長のサイクルに影響を及ぼす薬剤の検出に有用
である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、非ヒト(nonhuman)トラ
ンスジェニック動物（遺伝子導入動物ともいう）であっ
て、表皮の異常増殖(hyperproliferation)を誘発及び保
護する薬剤、例えば放射線、化学物質、化粧料化合物、
種々の病理(pathologies) 等を同定するためのモデル系
として使用できるトランスジェニック動物に関する。ま
た、本発明は、毛のサイクルに影響を及ぼす薬剤の検出
にも有用である。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】トラン
スジェニック動物は、そのゲノム中に外生遺伝子〔導入
遺伝子又はトランスジーン(transgene) と呼ばれる〕を
有する動物であり、外生遺伝子はトランスジェニック動
物それ自体又はその先代(antecessor)のいずれかに導入
されている。また、外生遺伝子はトランスジェニックの
動物の生殖細胞中にも存在するので、導入遺伝子は親か
ら子に、最初の始祖動物(founder animal)からトランス
ジェニック動物の血統(lines) を確立できるように伝達
される。受精した卵母細胞中に導入遺伝子が導入される
と、始祖動物の全ての細胞すなわち体細胞と生殖細胞の
両方に、導入遺伝子が存在する可能性が最大になる。後
者すなわち生殖細胞は、その後代(descendants) の約半
数に導入遺伝子を伝達し、後代はその細胞全てに導入遺
伝子を有するであろう。導入遺伝子が後の胎生段階にお
いて導入される場合には、始祖動物は、その体細胞及び
生殖細胞の全てが必ずしも導入遺伝子を有するとは限ら
ないので、モザイクであろう。これにより後代のごく一
部が導入遺伝子を有することになる。しかしながら、導
入遺伝子を受け継ぐ後代は、生殖細胞を含めその細胞全
てに導入遺伝子を有するであろう。

【０００３】トランスジェニック動物が生み出される際
の１つの問題は、トランスジェニック動物の始祖動物、
従って該始祖動物から生み出される対応する血統の全部
が、それらが有する導入遺伝子を必ずしも発現するとは
限らないということである。位置効果として知られてい
るこの効果は、導入遺伝子がトランスジェニック動物の
ゲノムの任意の場所に組み込まれ得るということによる
ものである。この組み込みが異質染色質領域において生
じる場合には、導入遺伝子の活性(activity)は全体的に
又は部分的に抑制され得る。また、導入遺伝子がある種
の遺伝子の調節領域の近くに組み込まれる場合には、導
入遺伝子の活性は変えられ得るか又は上記ある種の遺伝
子が有する調節領域によって制御される代わりに、この
“外来(foreign) ”の調節領域によって制御されるよう
になる場合さえある。この理由により、トランスジェニ
ック動物が特定されると、それらのうちのどれが導入遺
伝子を適切に発現するかを調べる必要がある。

【０００４】種々の種のトランスジェニック動物を生み
出すことが可能であるが、この分野における研究の大部
分はマウスについて行われてきている。一般的にトラン
スジェニック動物、特にマウスは、遺伝子活性(genetic
activity)の制御を調節する機構を研究するためのモデ
ル系として大きな用途を有し、また動物生理学における
特異的因子及びそれらの変型(alterations) の役割を決
定するためのモデル系として大きな用途を有する。

【０００５】種々の可能性が存在するが、導入遺伝子を
移入する最も普通の方法は、単細胞状態の胚の前核の中
にDNA を微量注入する方法である〔Gordonらの論文：Pr
oc.Natl. Acad. Sci. USA, 77,7380(1980) ; Brinster
らの論文、Cell, 27,223(1981)；Wagnerらの論文：Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 78,6376(1981);GordonとRud
dleの論文：Methods Enzymol,101C,411(1981)〕。現在
までに、かなりの数の遺伝子が、トランスジェニック動
物、基本的にはマウスに導入され、研究されて来ている
〔概説として、PalmiterとGordonの論文：Ann. Rev. Ge
net., 20,405(1986)参照〕。また、種々の起源に由来す
るタンパク質の調節領域と解読領域とを有する組換え遺
伝子組立て体が、トランスジェニック動物に導入されて
いる。これら“化合物”導入遺伝子（“compounds ”tr
ansgene)は、動物の細胞全てに存在するが、遺伝子組立
て体に使用される特定の調節要素を通常的に活性化する
組織において発現するのみである。このようにして、適
当な調節要素を用いて、種々の興味（臨床的、薬学的、
生物学的又は生物工学的な興味）ある遺伝子の活性をト
ランスジェニック動物の予め選択された組織へ向けるこ
とができる。特に興味ある調節配列の１群は誘導性の調
節配列であり、該調節配列は、それが結合されている構
造遺伝子の発現を調節することを可能にするという理由
から、前記調節領域を活性化するために必要とされる誘
導物質(inductor)の有無を制御(control) する。

【０００６】トランスジェニック動物の産生は十分に確
立されており、当該専門家には公知である〔GordonとRu
ddleの論文：Methods in Enzymol.,101C,1244(1983); H
oganとConstatiniとLacyの著作：「Manipulating a Mou
se Embryo. A LaboratoryManual」（1986年発行）、Col
d Spring Harbor Laboratory 、Cold SpringHarbor〕。

【０００７】皮膚は、体の表面を覆う組織であり、２つ
の主要な層、すなわち表面上皮すなわち表皮と、その下
にある結合組織層すなわち真皮とから構成される〔Fawc
ettの著作：「Bloom and Fawcett : A Textbook of His
tlogy」,11th Edition,W.B. Saunders Company 発行（1
986年) 、第543- 575頁〕。

【０００８】皮膚の特異的機能は、大部分は表皮の諸性
質に依存する。この上皮は、体の表面全体にわたって連
続した細胞被覆を形成するが、分化してある種の皮膚付
属器すなわち毛、爪及び皮膚腺をも形成する。

【０００９】表皮は重層偏平上皮であり、該上皮は２つ
の細胞層：すなわち分裂能を有する立方体状の細胞の単
一層からなる基底層と、基底層に由来する細胞であって
分裂能を失っている細胞からなる上部基底層(suprabasa
l layer)とに区分される。上部基底層は、有棘層と、顆
粒層と、角質層とに区分される。上部基底層細胞(supra
basal cell) は、最終分化のプログラムに乗り、そのプ
ログラムの間に上皮の表面に向かって移動すると同時に
劇的な形態学的変化を受けて最終的に角質層の角質細胞
を生じる。これらの偏平で強く角質化した死細胞は、最
終的に皮膚から剥離することにより脱離してしまう。

【００１０】毛は、真皮の奥深くまで伸びる表皮の管状
陥入すなわち毛包(hair follicule)から生じるケラチン
の薄いフィラメントである。毛は活性な毛包(follicle)
の球根状末端膨脹(the bulbous terminal eapansio) の
陥入から発育する。厳密な意味での毛とそれを取り囲む
毛包の両者は、幾つかの異なる同心状の細胞層によって
構成された複合構造物である(Fawcettの1987年の前記著
作）。

【００１１】毛は絶え間なく成長する組織ではなく、毛
の成長の段階に従って毛包の構造を大きく変えながら成
長段階と休止期とを交互に行う組織である。従って、成
長段階においては、毛包はその最大長さに達するまで伸
長し、一方、真皮(dermal)の毛乳頭を取り囲む上皮細胞
はその種々の特徴型に分化する。毛母基(matrix)の細胞
は、真皮毛乳頭を取り囲む陥入において活発に増殖し始
める。また、毛母基に由来する細胞は、真皮の毛乳頭の
ドーム(dome)の直ぐ上の毛球の角質形成帯域において角
質化しながら高い分裂指数を維持して、３つの主要構成
要素：すなわち髄質、皮質及びクチクラを伴った毛幹を
生じる。

【００１２】脊椎動物の細胞の大部分（必ずしも全部で
はない）は、いわゆる中間フィラメントによって構成さ
れる細胞骨格を有する。この細胞骨格は、各々の細胞型
について特異的な方法で発現される少なくとも６種類の
異なるタンパク質によって構成され得る。ケラチンは、
上皮細胞及びその付属器官（爪及び毛）の中間フィラメ
ントからなる細胞骨格を形成する〔Mol らの論文：Cel
l, 31,11(1982);Heidらの論文：Differentiation,32,10
1(1986)〕。これらタンパク質は、ポリペプチド２〜８
個の群における発現が上皮細胞の各々の型に特異的であ
るという理由からも特徴付けられている構成員(member)
約30からなる一群を構成する。このような次第で、表皮
においては、基底細胞はＫ４ケラチンとＫ14ケラチンを
合成し、一方、基底細胞が上部基底層細胞に分化する
と、上部基底層細胞はＫ４ケラチンとＫ14ケラチンをＫ
１ケラチンとＫ10ケラチンの対に置き換える〔Eichner
らの論文：J. Cell Biol.,98,1388(1984); Stollerらの
論文: J.Cell Biol., 107 ,427(1988)〕。これに対し
て、種々の内部重層化上皮、例えば舌、口蓋、膣又は毛
包の外毛根層(external root layer) に存在するＫ６ケ
ラチンは内胞状上皮(interfollicular epidermis) にお
いては発現されない〔Quinlan らの論文：AnnalsNew Yo
rk Acad. Sci.,455 ,282(1985)〕。しかしながら、この
Ｋ６ケラチンは、表皮組織の異常増殖障害の全てにおい
て、表皮の上部基底層細胞中で誘導される〔Weiss らの
論文：J. Cell Biol.,98,1397(1984); Stollerらの前記
論文〕。また、このＫ６ケラチンは、TPA 、レチノイン
酸及び過形成誘導剤(hyperplasia-inducing agent) を
用いて皮膚を局所処理することにより誘導される〔例え
ば、Schweizer らの論文：J. Invest. Dermatol.,125(1
987)；Eichner らの論文：J. Invest. Dermatol.,154(1
992)〕。

【００１３】

【課題を解決するための手段、作用及び効果】前記して
あることから、Ｋ６ケラチンの遺伝子の発現を調節する
DNA 配列を特定し得、且つ該DNA 配列を機能的に連結し
て、標識遺伝子の発現がＫ６ケラチン遺伝子の調節領域
の制御下にそのままあるような方法で、遺伝子組立て体
における標識遺伝子を形成させるならば、かかる組立て
体を有するトランスジェニック動物は、表皮の異常増殖
を招く物質、因子又はプロセスを同定するための優れた
モデル系であろう。これらの表皮の異常増殖刺激の存在
下では、Ｋ６ケラチン遺伝子の調節領域は、表皮の上部
基底層において活性化され、標識遺伝子によってコード
化された生成物の合成を惹起し、以下に詳しく説明する
方法により容易に検出されるであろう。本発明はまさ
に、表皮の異常増殖を誘発する物理的、化学的、生物学
的薬剤及びその他の薬剤を同定するのに使用するため
の、適当な標識遺伝子に連結されたＫ６ケラチンの遺伝
子の調節領域から構成される導入遺伝子を有するトラン
スジェニック動物にある。また、これらのトランスジェ
ニック動物は、表皮を異常増殖刺激の作用から保護する
物質及び因子あるいは表皮の異常増殖を抑制する物質及
び因子を同定することを可能にするであろう。かかる表
皮の異常増殖の保護物質で処理された動物は、異常増殖
刺激に対して未処理動物よりも小さい強さで応答するか
又は全く応答しないであろう。従って、Ｋ６ケラチン遺
伝子の調節領域は小さい強さで誘導されるか又は全く誘
導されないであろうし、該調節領域に連結された対応す
る標識遺伝子の誘導が小さいか又は全くないものとして
肉眼で観察し得るであろう。

【００１４】表皮の異常増殖状態の視覚化（肉眼視）に
関しては、Ｋ６ケラチン遺伝子の調節領域に連結すべき
標識遺伝子を適切に選別することが極めて重要であり、
該標識は容易に確認できる物質をコード化しなければな
らない。本発明においては、Ｋ６ケラチンの調節領域の
制御下に置かれ、しかもトランスジェニック動物のゲノ
ム中に導入される標識として、β−ガラクトシダーゼ
（β-gal）の遺伝子を選択している。得られるトランス
ジェニック動物の皮膚がＸ-gal（すなわちβ-galの基
質）の存在下で異常増殖刺激を受けると、表皮の上部基
底層細胞例えば尾の上部基底層細胞は青色を発現する。
その色の強さは導入遺伝子の誘導の強さに左右される、
すなわち表皮が暴露されている異常増殖刺激の強さに左
右される。同様の方法で、細胞及び組織であってその中
で遺伝子組立て体に使用されたＫ６ケラチン遺伝子の調
節領域が活性化される細胞及び組織全てが、構成様式(a
constituent manner)で又は誘導剤刺激に応じて青く染
色されるであろう。

【００１５】極めて重要な別の標識遺伝子は、ルシフェ
ラーゼの標識遺伝子である〔Owらの論文：Science,234
,856(1986)〕。この標識遺伝子を使用すると、異常増
殖刺激を受ける表皮の細胞はルシフェラーゼを産生する
であろう。ルシフェラーゼは、ルシフェリンの存在下で
且つ適当な条件下で発光をもたらす。別の可能な標識遺
伝子は、本発明の特徴からみて恐らくはあまり重要では
ないが、生化学的に検出可能な化学物質、例えばクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ〔Gormanら
の論文：Mol. Cell Biol.,2 ,1044(1982) 〕、キサンチ
ン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ〔Null
iganとBergの論文：Science,209,1422(1980)〕、ウイル
スSV40のＴ抗原又は成長ホルモンを生じるであろう。生
物学的に活性な物質、例えば癌遺伝子又はサイトカイン
を生じることに特徴がある別の可能な標識遺伝子は、使
用可能ではあるが、本発明にはおいてはあまり有効では
ない。

【００１６】本発明の別の利点及び特徴は、下記の記載
から明らかになるであろう。

【００１７】添付の図１は、プラスミドpKIV*Z(8.8) の
挿入断片を示すものである。該挿入断片は、β−ガラク
トシダーゼの標識遺伝子の解読領域が結合されているウ
シのケラチンIV* 遺伝子の前にある5'領域の8.8 キロ塩
基対(kbp) からなる。ウシのケラチンIV* （いわゆる歴
史的理由でこのように呼ばれている）は、ヒトのＫ６ケ
ラチンと等価である（Jarcano ら、Differentiation …
…）。従って、本発明全体を通してウシ又はヒト起源い
ずれかのＫ６ケラチンについて述べる。

【００１８】

【実施例】導入遺伝子KIV*Z(8.8)の組立て 異常増殖刺激に応答して表皮中で誘導性遺伝子を生成さ
せる目的で、Maniatisらの著作「Molecular Cloning: A
Laboratory Manual」(Cold Spring HarborLaborator
y、Cold Spring Harbor)(1982年発行）に記載の組換えD
NA 法に従って、ウシのＫ６ケラチンの遺伝子の前にあ
る5'領域の8.8kbpのDNA 断片をβ−ガラクトシダーゼの
遺伝子の解読領域に連結した。

【００１９】図１に得られた導入遺伝子を記載する。図
１には、種々の制限酵素の切断部位並びにＫ６ケラチン
の遺伝子の調節領域に由来する部分（Ｋ６；連続線）、
β−ガラクトシダーゼの遺伝子に由来する部分（lacZ；
長方形の領域）及びベクターに由来する部分(pPolyIII.
1;波線）部分が示されている。

【００２０】この組み立ては下記の種々の工程で行っ
た。工程１ ：プラスミド pPolyIII.1 中のLacZのクローニン
グ プラスミドpRSV- LacZ-pUC8 から出発した。このプラス
ミドは、pUC8ベクター中にクローン化されているRSV ウ
イルスのLTR に結合されたLacZ遺伝子を含有する。この
プラスミドは、プラスミドpZ-1〔NortonとCoffinの論
文、Mol. Cell.Biol.,5,281(1985)〕に由来するもので
あり、該プラスミドにおいてはベクターpBR322がpUC8に
代えられている。このプラスミドを制限酵素 KpnＩとBa
mHＩとを用いて２重消化することにより、LacZ遺伝子を
該プラスミドから単離し、この断片を、上記と同じ制限
酵素 KpnＩとBamHＩとを用いて順々に消化したプラスミ
ドpPolyIII.1〔Lathe らの論文:Gene,57,193(1987)〕中
にクローン化した。この組立て体をpZIII.1.と命名し
た。

【００２１】工程２: プラスミド pZIII.1. 中へのＫ６
ケラチン遺伝子の調節領域のクローニング このクローンニングは下記の種々の工程で順々に行っ
た。工程2.1: ゲノムクローンλ６〔Blessingらの論文:EMBO
Journal,6 ,567(1987)〕から出発した。このゲノムクロ
ーンはウシのＫ６ケラチンの遺伝子の前にある約11kbp
の領域と、該遺伝子の４kbp の解読領域とを含んでい
る。このクローンλ６を単離したウシgenotheca と、下
記に述べるλＡクローンとを、ベクターλEMBL3 中に組
み立てた。酵素EcoRＩ及びBamHＩ（これらは−8.8kbpの
位置それぞれにおいてＫ６ケラチン遺伝子の前にある領
域を切断する）を用いてλ６を処理した。この得られた
断片を、同じ酵素、すなわちEcoRＩ及びBamHＩで消化し
たプラスミドpBluescript(Stratagene)中に挿入してプ
ラスミド pIV*5'E/Bを生じさせた。

【００２２】工程2.2:ゲノムクローンλＡ（Blessingら
の1987年の前記論文）から出発した。該ゲノムクローン
は、ウシのＫ６ケラチン遺伝子の前にある5'領域の約3.
6kbpと、3'領域におけるDNA の約３kbp 以上の遺伝子の
完全解読領域とを含んでいる。酵素BamHＩ及び KpnＩ
（これらはＫ６遺伝子の-3.6 kbpと+3 kbpそれぞれの位
置で切断する）を用いてλＡを消化した。この得られた
断片を、同じ酵素BamHＩ及びKpnＩで消化したプラスミ
ドpUC18 中にクローン化してプラスミドpIV*B/K を生じ
させた。

【００２３】工程2.3:酵素SalIとBamHＩとを用いて２重
消化することにより、前記ベクターから挿入断片 pIV*
5'E/Bを分離した。得られたこの断片を、酵素SalIとBam
HI で消化したプラスミドpIV*B/K 中にクローン化して
プラスミドpIV*S/K を得た。該プラスミドは、ウシＫ６
ケラチン遺伝子の前にある8.8kbpと、該遺伝子の３kbp
の解読領域とを含んでいた。

【００２４】工程2.4:プラスミドpIV*S/K を酵素SalIと
NaeI（これはＫ６ケラチンの遺伝子の位置＋115 bpで切
断する）で消化して、Ｋ６ケラチンの遺伝子の位置−8.
8kbpから位置＋115bp にまで伸びる断片を遊離させた。
この断片を、酵素SalIとAsp718とを用いて予め消化して
あるプラスミドpZIII.1 に結合した。後者すなわちAsp7
18制限部位はクレノウポリメラーゼで処理することによ
り変化させた。この連結生成物はプラスミドpKIV*Z(8.
8) であり、これはトランスジェニック動物のゲノム内
部に導入されるであろう導入遺伝子を含んでいる。

【００２５】組換え組立て体pKIV*Z(8.8) を有するトラ
ンスジェニックマウスの産生 前記プラスミドpKIV*Z(8.8) を、NotI(DNAμg 当たり酵
素４単位、37℃、１時間)(ベクター pポリIII.1 の多重
クローニング部位の両側に置かれた酵素）で消化して、
該ベクターから挿入断片すなわち導入遺伝子KIV*Z(8.8)
を分離した。得られた消化生成物を低融点の１％アガロ
ースのゲル中で電気泳動にかけ、上記導入遺伝子を含ん
でいる約12kbp のバンドをゲルから切り取った。導入遺
伝子を精製するために、上記アガロースを65℃で溶融
し、37℃に冷却し、次いで１容量のフェノールで抽出し
た。フェノール抽出の水性層を１容量のフェノール／ク
ロロホルム（容量比１：１）で抽出した。この抽出の水
性層を再び１容量のクロロホルムで抽出し、この最後の
抽出の水性層からDNA を−70℃で２倍容のエタノールを
用いて沈殿させ、15,000x/g で15分間遠心分離すること
により沈降させた。さらに、得られたDNA を0.2M NaCl
、20mMトリス-HCl(pH7.5) 、１mM/EDTA からなる溶液
500μリットルに溶解し、Elutip-d(Sleicher and Schue
ll 製) のカラム中で10mMトリス-HCl(pH7.5) 、0.1mM/E
DTAで濾過することにより精製した。得られたDNA をエ
タノールを用いて沈殿させ、次いで溶解して２μg/mlに
した。精製した導入遺伝子のコピー 250〜400 個を、Wa
gnerらの1981年の論文（前記論文）及びHogan らの1986
年の著作（前記著作）に記載の方法に従って、単一細胞
状態の受精卵の前核に微量注入した。 この卵は雑種マ
ウスC57B1/6J×balb/cから得た。このマウスはJackson
Laboratories(USA所在) から入手した。

【００２６】微量注入した後に、上記の卵をＭ16培地
〔Hogan らの1986年の著作（前記の著作）〕中で37℃、
５％CO₂ で１夜インキュベートした。その翌日に、上記
処理に耐えた卵を、十分に確立されている方法〔Gordon
とRuddleの1983年の論文（前記の論文); Hoganらの1986
年の論文（前記の論文）〕に従って疑似妊娠させた母マ
ウス（精管切除した雄と予めつがいにしておいたもの）
に移した。移入した胚（胎児）は養母マウスの出産予定
日まで発育させた。新生マウスは20〜21日目の終りに生
まれた。

【００２７】上記マウス全てを22℃、50％湿度の家畜小
屋で、照明12時間／暗闇12時間の周期で飼育した。出産
後３週間目に新生マウスを分析して、それらのうちのど
れがトランスジェニック性であるか、すなわち導入遺伝
子の保有マウスであるかについて調べた。このために、
マウスに麻酔をかけて尾の先端から約１cmを切り取っ
た。この組織から、基本的にはHogan らの1986年の著作
（前記著作）の方法に従って、0.5 ％SDS の存在下でプ
ロテイナーゼＫを用いて１夜インキュベートし、次いで
フェノール：クロロホルム（容量比１：１）で２回抽出
し、さらにクロロホルムで抽出することにより、DNA を
抽出した。得られた核酸をエタノールを用いて室温で沈
殿させ、10mMトリス-HCl(pH7.5) 、1mM/EDTAからなる溶
液250 μリットルに再溶解した。DNA 約10μg をEcoRＩ
で消化し、１％アガロースのゲル中で電気泳動にかけ、
次いで基本的にはSouthernの論文、J. Mol. Biol.,98,5
03(1975)に記載の方法に従ってニトロセルロース膜に移
した。該ニトロセルロースフィルターと放射性プローブ
とを、50％ホルムアミド、５×SSC 、５×デンハート溶
液、１％SDS 、10mMトリス-HCl(pH7.5) 及び10％硫酸デ
キストランを含有する緩衝液中で42℃で１夜ハイブリダ
イズさせた。その後に、ニトロセルロースフィルターを
２×SSC 、0.1 ％ SDS中で室温で15分間、２回洗浄し、
次いで0.1 ×SSC 、0.1 ％SDSで65℃で30分間、２回洗
浄した。これらは全て、Maniatisらの1982年の著作（前
記著作）に記載の方法に従った。

【００２８】放射性プローブとしては、Feinberg とVo
gelsteinの論文、Anal. Biochem.,132 ,6(1983)の方法
により、高い特異活性をもつ放射性標識されたlacZ遺伝
子を有するプラスミドpRSV-lacZ-pUC8のHindIII/EcoRI
制限断片を使用した。ハイブリダイゼーションにより、
マウス４匹がこの方法によって検出可能な再構成(reorg
anization)の型なしに(without) 導入遺伝子（５〜50コ
ピー）を有していることが示された。これらの始祖マウ
ス４匹（雄１匹と雌３匹）を適当な性の雑種マウスC57b
1/6J×balb/cと交雑させた。その全ては導入遺伝子をそ
れらの後代に伝達した。対応するトランスジェニック系
統を確立することが可能である。

【００２９】本明細書においては通常のマウスについて
説明したが、本発明は所定の動物の種に限定されるもの
ではなく、ヒトの表皮の重要なモデルを提供するヒト以
外の種に適用できる。例えば数例を挙げると、毛がない
ことに特徴があるある種の突然変異(mutant)マウス、ウ
サギ及びブタは、人間にとって重要な形質転換（トラン
スジェニック）皮膚を生み出し得る動物である。さらに
また、下記において更に決定されるように、導入遺伝子
KIV*Z(8.8)をもつ動物は、毛の成長を刺激することがで
きる物質及び因子を調べるための良好なモデル系であり
得る。そのためには、雌のヒツジもまた非常に重要なト
ランスジェニックモデルであり得るであろう。

【００３０】また、本明細書において説明した微量注入
法と異なる別の方法、例えばDNA 電気穿孔法、胚芽細胞
へのDNA 移入法、精子へのDNA 移入法などがトランスジ
ェニック動物の産生に使用できる。

【００３１】トランスジェニックマウスにおける導入遺
伝子KIV*Z(8.8)の発現 トランスジェニックマウスの種々の組織における導入遺
伝子の活性を、これらの組織の細胞により産生されるβ
−ガラクトシダーゼの量をその場で肉眼で観察すること
により測定した。このために、Kothary らの論文、Deve
lopment,105 ,707(1989) の方法に従って、合成された
酵素の量に応じて細胞が幾分かの(greater or lesser)
強さの青色を発現するような方法で、７〜10μｍの凍結
切片をＸ- gal と共にインキュベートした。このために
は、７〜10μｍの凍結切片をPBSで洗浄し、0.2 ％ゲン
ターアルデヒド(genteraldehyde)又はグルタールアルデ
ヒドのPBS 溶液中で４℃で５〜20分間固定した。PBS 中
で２回洗浄した後に、前記の切片を、0.04％ 5- クロロ
-4- ブロモ-3- インドリル- β-D- ガラクトシド(X-ga
l、SIGMA 社製）、1mM MgCl₂ 、10mMフェロシアン化カ
リウム及び10mMフェロシアン化ナトリウムからなる青色
発現混合物中でインキュベートした。発現した色の強さ
に応じてインキュベーションを２〜18時間続けた。

【００３２】表１（この表にはβ−ガラクトシダーゼ活
性が存在した供試組織又は存在しなかった供試組織を示
した）から明らかなように、導入遺伝子の本質的な発現
パターンは、Ｋ６ケラチンの発現パターンに極めて類似
している〔表ＩとQuinlan らの1985年の論文（前記論
文）とを比較して〕。発現が適当な重層上皮組織中で検
出されたばかりではなく、それに加えて、該重層上皮組
織内で、もしこれらの発現がＫ６ケラチンの発現に匹敵
するべきである場合に予期されるように、青く染色され
た上部基底層細胞が存在していた。

【００３３】体、例えば尾の種々の領域の内胞状皮膚(i
nterfollicular skin)は、予期されたように、全てにお
いて陰性(negative)の系統であった。この場合に、導入
遺伝子が異常増殖刺激を受けた表皮の領域に導入される
か否かを調べるために、レチノイン酸及びTPA を種々の
系統のトランスジェニック動物の尾に局所投与した。こ
のために、Schweizer らの方法（前記論文）を用いて上
記動物の尾を14日間、アセトン100 μリットルに溶解し
た全trans-レチノイン酸（レチノイン酸）30μg で毎
日、局所処理するか、又はアセトン100 μリットル中の
TPA 20 nmol で２日ごとに局所処理した。別法として、
導入遺伝子の発現を、耳に対して本出願人によって作ら
れた瘢痕化(cicatrization) 方法における傷について、
又は動物自身によってその横腹(sides) に自然に作られ
た傷について調べた。また、DMBAを用いて開始し、TPA
を用いて促進させることによって化学的に作り出された
背中の皮膚腫瘍〔Yuspa とPoirier の論文：Adv. Cance
r Res., 50,25 (1988)〕における導入遺伝子の発現も調
べた。これら全ての場合においては、関連する皮膚の上
部基底層細胞において青色の強い誘導が認められた、す
なわち過形成(hyperplasia) を発現した。この色は未処
理の周囲領域には認められず、従って周囲領域は組織学
的には正常のままであった。レチノイン酸で処理した動
物の尾については、二方向ゲル(bi-dimentional gels）
〔O'Farellらの論文： Cell,12,1133(1977)〕によっ
て、導入遺伝子による青色の誘導が内生Ｋ６ケラチンの
出現に対応することを調べた。

【００３４】レチノイン酸による処理のどの時点で導入
遺伝子が誘導されたかを調べるために、同じ系統のマウ
ス７匹の尾をそれぞれ０、３、５、７、９、11及び14日
間、上記の方法で処理した。上記処理期間の終りに、マ
ウスに麻酔をかけて、処理部位を尾から取り出した。こ
の尾の一部分を用いてミクロトーム上で切片化し、得ら
れた切片をＸ-galの存在下でインキュベートして、青色
が発現したかどうかを観察した。同じ方法で処理した非
トランスジェニック動物の尾の皮膚を用いて、Chomezyn
ski とSacchiの論文、Anal. Bioderm.,162,156(1992)に
記載のフェノール／酸・法によりRNA を抽出した。この
様にして抽出したRNA 全部を下記のようにしてノーザン
型ハイブリダイゼーションによって分析した。すなわ
ち、各々の尾のRNA 20μg を、１％アガロース、１％ホ
ルムアミドのゲル中で電気泳動にかけ、次いでLerachら
の論文、Biochemistry, 16,4743(1979) の方法に従って
ニトロセルロースフィルターに移した。その後に、トラ
ンスジェニックマウスの特定に関して先に述べたサザン
型ハイブリダイゼーションについて説明した方法と同様
の方法で、このフィルターを、放射線標識したマウスＫ
６ケラチンの特異的プローブ〔Fincheらの論文：J. Inv
est. Dermatol.,(1992) 〕とハイブリダイズさせた。Ｘ
-galを用いた染色において肉眼で見えるようにされた導
入遺伝子の発現と、処理３日後に開始した内生Ｋ６ケラ
チンの発現とは両方共に、処理９日目に最大に達するま
で並行して漸進的に増大することが認められた。すなわ
ち、本発明のトランスジェニックマウスの皮膚切片のＸ
-galによる染色は青色を発現し、この色はレチノイン酸
による処理の初期の時点で、しかも処理動物の皮膚に明
確な過形成反応が現れる以前にすでに検出可能であっ
た。このことから、皮膚の異常増殖を生じる薬剤の同定
用モデル系として提案されたトランスジェニック動物
が、本発明において提案された検出方法と一緒に、短い
処理時間で陽性の結果を与える非常に感度のよい系を構
成することが明らかにされる。

【００３５】導入遺伝子の発現が検出された極めて興味
ある別の領域は、毛包の２つの部分すなわち外毛根鞘と
毛球の角質形成帯域であった。さらにまた、この毛球の
角質形成帯域では、青色は成長の初期段階、すなわち組
織再生(anagen)における毛において認められるのみであ
った。サイクルの関数(function)としての毛球の角質形
成帯域における導入遺伝子のこの発現は、調査した体の
部位の全て、すなわち尾、鼻及び胴体の毛において認め
られた。従って、この導入遺伝子のさらなる特質は、毛
の成長を刺激する物質の検出におけるその使用にあるで
あろう。これらの物質で処理したトランスジェニックマ
ウスは、より大きな密度の毛を有し、青色を生じ得る毛
球の角質生成帯域を有するであろう。さらにまた、同様
の推論により、前記のトランスジェニック動物は毛の成
長を抑制する物質の同定に使用しできる。同じ型の推論
が、毛(wool)の成長に関してトランスジェニック雌ヒツ
ジ又は工業的に重要なウシの別の動物に適用できる。

【００３６】本発明のトランスジェニック動物の用途 本発明のトランスジェニック動物は、表皮において異常
増殖を生じる薬剤又はその出現から保護する薬剤、ある
いは異常増殖が現われるとそれを後退させる薬剤を同定
するのに使用できる。また、これらの動物は、毛又は別
種の動物の均等物例えば雌ヒツジの毛の成長サイクルを
積極的に(positively)及び消極的(negatively)に変える
薬剤を同定するのにも使用できる。

【００３７】本発明のトランスジェニック動物は、導入
遺伝子を検出するのに提案された方法と共に、敏感で、
迅速なモデル系を構成する。上記方法は、容易に検出し
得る分子標識を肉眼で見ることができることに基づいて
いることに加え、一方では、より客観的であり、他方で
は、該方法を実施するオペレーターにとっては、異常増
殖を調べるのに通常使用される別の方法、例えば表皮中
の細胞層を数える方法又は基底層細胞の組織学的特徴(a
spect)及び該細胞の細胞質／核小体の比を判定する方法
（これらの方法は高度の経験と組織学的知識を必要とす
る）よりも簡単である。実験室で使用される異常増殖を
同定する方法、例えば活発に分裂する細胞による放射性
チミジンの取り込みは、長い時間と該方法を実施する人
に必要とされる高度の技術的及び実際的専門知識の故
に、病院又は工業的環境においてはさほど実用的でな
い。また、尾の皮膚について試験を実施できるために、
供試動物は比較的小さい傷を負うことですみ、しかも該
動物を犠牲にする必要がない。さらにまた、尾の極く一
部を必要とするのみであるので、１つの動物を１種以上
の試験に使用できる。試験を体の別の部分の皮膚につい
て実施する場合には、処理部位の比較的小さい生検(bio
psy)を必要とするのみであり、供試動物に加えられる損
傷もごく僅かである。また、皮膚が容易に再生するの
で、同じ動物を再び長期間使用できる。

【００３８】処理及び検出 調査すべき薬剤は、動物の皮膚に局所投与するのが好ま
しいが、該薬剤は摂取させてもよいし、注射してもよい
し、あるいは別のより簡便な方法で投与してもよい。所
定の物質の異常増殖産生能を調べることを意図したこれ
らの実験では、該物質は、供試動物の尾又は背中のいず
れか、好ましく毛を剃った尾又は背中のいずれかに局所
投与される。処理した皮膚の組織学的切片とＸ-galとの
インキュベーションによる青色の誘発を、調査する物質
を溶解するビヒクルのみで処理した対照動物の同様の切
片と比較した。別法として、Schweizer らの1987年の論
文（前記論文）で使用された方法に基づいて、前述の方
法に従い動物をレチノイン酸又はTPA で処理して、陽性
対照に使用できる。

【００３９】物質の可能な異常増殖抑制効果又は抗増殖
(antiproliferative) 効果を調べようとする場合には、
この物質でトランスジェニック動物を、異常増殖産生能
について知られている別の物質、例えばTPA 、レチノイ
ン酸、紫外線などで処理する前に処理するか又はこれら
と同時に処理する。このようにして処理した動物を、異
常増殖産生剤のみで処理した動物と比較する。また、局
所的過形成は、トランスジェニック動物において公知の
方法により又は調査の具体的目的により誘導されるであ
ろう。その後、供試動物の一部を、調査することを所望
する所定の型の過形成性の異常増殖について、可能な一
般的又は具体的な抗増殖能をもつ物質で処理する。残り
の動物は、この物質で処理しないばかりではなく、抗増
殖性物質で処理した動物と比較される対照として残され
る。

【００４０】毛の成長に影響を及ぼし得る物質を調べる
ためには、これらの物質を背中の皮膚に施用するのが好
ましい。Ｘ-galと共にインキュベートした組織学的切片
においては、ビヒクルだけで処理した動物と比較した毛
球の角質形成帯域中の染色を示す密度は、調査される物
質の毛の成長促進能又は抑制能の尺度(measure) を与え
るであろう。

【００４１】表皮の異常増殖及び毛の成長の両方の場合
においては、モデル動物、特に突然変異マウスが存在す
る〔LyonとSearleの著作、1989年発行、「Genetic Vari
antsand Strains of the Laboratory Mouse」、Oxford
University Press-GustavFischer Verlag, publisher
s〕。これらの場合には、導入遺伝子KIV*Z(8.8)を有す
るトランスジェニック血統をこれらの動物から生み出し
得る。また、導入遺伝子は、導入遺伝子を有する非突然
変異系統(strain)との適当な交雑によって突然変異系統
に伝達され得る。

【００４２】調査下にある薬剤の活性を検出する方法
は、常に導入遺伝子の活性に対するその作用を肉眼で見
ることができるようにすることである。肉眼で見ること
ができるようにするには、前記の方法〔本明細書の“導
入遺伝子KIV*Z(8.8)のトランスジェニックマウス中での
発現”の部を参照〕を使用して、処理した動物の皮膚の
組織学的切片をX-gal とインキュベートすることにより
行うことが好ましい。また、広い領域を肉眼で見ること
ができるようにすることが重要である場合には、数平方
ミリメートルの領域を外科的に抽出し、組織学的切片と
して同じ染色方法に供する。

【００４３】 表１：導入遺伝子pKIV*Z(8.8) の特異的組織発現 表皮 背中 − 尾 − 足底の皮膚 ＋（上部基底層） 毛包及び鼻毛 ＋（外毛根鞘及び角質形成帯域） 消化器上皮 口腔 ＋（上部基底層） 舌 ＋（上部基底層） 口蓋 ＋（上部基底層） 咽頭 ＋（上部基底層） 食道 ＋（上部基底層） 胃 ＋（腺領域と非腺領域の境界） 鼻の上皮 ＋ その他 脳、肝臓、腎臓、結腸 十二指腸、膵臓、肺 陰性 筋肉、胸腺、膀胱、 結合組織

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドpKIV*Z(8.8) の挿入断片であって、
β−ガラクトシダーゼの標識遺伝子の解読領域が結合さ
れているウシケラチンIV* 遺伝子の前にある5'領域の8.
8 kbp からなるプラスミドpKIV*Z(8.8) の挿入断片を示
すものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ミグエル・アンゲル・ヴイダル・カバレロ スペイン国．28010・マドリード．ニカシ オ・ガレゴ．９ (72)発明者 アナ・マリア・ブラボ・モラル スペイン国．24001・レオン．ヨセ・アン トニオ・プリモ・デ・リベラ．33 (72)発明者 ヨセ・ルイス・ヨルカノ・ノバル スペイン国．28230・ラス・ロサス・（マ ドリード）．エシヤ．43

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 非ヒトトランスジェニック動物であっ
   て、a)内胞状皮膚及び毛包において誘導し得る調節領域
   と、b)標識遺伝子とからなる組換え遺伝子組立て体又は
   導入遺伝子を有するトランスジェニック動物。
2. 【請求項２】 前記導入遺伝子が調節領域を有するもの
   であり、該調節領域が表皮の異常増殖を生じさせる物理
   的、化学的、生化学的、生物学的刺激又は別種の刺激に
   応答して内部胞表皮の細胞中で活性化されるものであ
   る、請求項１に記載のトランスジェニック動物。
3. 【請求項３】 前記導入遺伝子が調節領域を有するもの
   であり、該調節領域が毛の活性成長の組織再生段階にお
   ける毛球の角質形成帯域の細胞中で活性化されるもので
   ある、請求項１に記載のトランスジェニック動物。
4. 【請求項４】 前記調節領域が脊椎動物種のＫ６ケラチ
   ンの調節領域に由来するものである請求項１、２又は３
   に記載のトランスジェニック動物。
5. 【請求項５】 前記調節領域がウシのＫ６ケラチンの調
   節領域の断片である請求項１、２又は３に記載のトラン
   スジェニック動物。
6. 【請求項６】 前記調節領域がウシのＫ６ケラチンの遺
   伝子のEcoRＩ(-8.8kbp)/NaeＩ(+115bp)断片である請求
   項１、２又は３に記載のトランスジェニック動物。
7. 【請求項７】 前記調節領域が前記EcoRＩ(-8.8 kbp)/N
   aeＩ(+115bp)断片の一部分である請求項６に記載のトラ
   ンスジェニック動物。
8. 【請求項８】 前記標識遺伝子が、肉眼又はオートラジ
   オグラフにより検出し得るかあるいは別の種類の試験に
   より検出し得る生成物をコード化する遺伝子の少なくと
   も一部分を含有するものである、請求項４、５又は６に
   記載のトランスジェニック動物。
9. 【請求項９】 前記標識遺伝子がβ-gal遺伝子、CAT 遺
   伝子、ルシフェラーゼの遺伝子、ウイルス性、レトロウ
   イルス性又は細胞性の癌遺伝子、癌原遺伝子、サイカイ
   ニンの遺伝子あるいはリンホカインの遺伝子からなる群
   に属するものである、請求項８に記載のトランスジェニ
   ック動物。
10. 【請求項１０】 前記標識遺伝子がβ-gal遺伝子の少な
    くとも一部分である請求項８に記載のトランスジェニッ
    ク動物。
11. 【請求項１１】 前記動物が哺乳動物である請求項４、
    ５又は６に記載のトランスジェニック動物。
12. 【請求項１２】 前記動物が齧歯動物である請求項11に
    記載のトランスジェニック動物。
13. 【請求項１３】 前記齧歯動物がマウスである請求項12
    に記載のトランスジェニック動物。
14. 【請求項１４】 前記動物が雌のヒツジである請求項11
    に記載のトランスジェニック動物。
15. 【請求項１５】 前記動物がブタである請求項11に記載
    のトランスジェニック動物。