KR101480153B1 - 멜리틴 항생펩타이드를 함유한 누에고치를 생산하는 형질전환 누에 - Google Patents
멜리틴 항생펩타이드를 함유한 누에고치를 생산하는 형질전환 누에 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 봉독 유래 멜리틴(melittin) 항생펩타이드가 함유된 누에고치를 생산하는 형질전환 누에 및 이를 이용하여 멜리틴 항생펩타이드가 함유된 누에고치를 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 표지 유전자 조절 프로모터, 표지 유전자, 누에 유래의 피브로인(Fibroin) 프로모터 및 봉독 유래의 멜리틴 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현벡터를 제작하여 상기 재조합 발현벡터로 누에를 형질전환시킴으로써 실크내 멜리틴 항생펩타이드가 함유된 누에고치를 생산하는 형질전환 누에를 제조할 수 있으며, 상기 형질전환 누에는 멜리틴 항생펩타이드를 다량 함유하고 있는 누에고치를 생산함으로써, 천연항생제로서 개발이 가능하여, 가축사료 첨가제뿐만 아니라 화장품, 치약 등 생활용품의 소재 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 봉독 유래 멜리틴(melittin) 항생펩타이드가 함유된 누에고치를 생산하는 형질전환 누에, 및 상기 형질전환 누에를 이용하여 멜리틴 항생펩타이드가 함유된 누에고치를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
누에는 분류학상 곤충각(Insectada), 인시목(lepidoptera), 가잠아과 (Bombyxidae), 가잠아속(Bombyx), 가잠종(mori)에 속한다. 누에는 완전변태 곤충으로 알에서 부화한 유충이 발육하여 번데기가 되고, 성충(나방)이 되어 알을 낳고 일생을 마친다. 누에의 일생은 평균 60일 정도로 비교적 짧아 실험동물로서 이점을 가지고 있다. 산란된 알에는 방치하면 착색하여 다음해 봄까지 부화하지 않는 것과 착색하지 않고 부화하는 것이 있다. 1년에 몇 회 부화하는가는 각각의 유전자 작용에 의하여 식도 하 신경절 내에서 생산되는 휴면 호르몬의 분비량에 의해 결정된다. 누에알에서 수정 핵은 여러 번 분열하여 분열 핵을 형성하고 핵 주위에 원형질이 둘러싸게 되고 이들은 알의 가장자리를 향하여 이동하게 된다. 예를 들면 개미누에는 산란 후 12시간이 지나면 세포융합(Syncytial blastoderm)이 형성되고 20시간 후면 인공부화법의 하나인 침산 처리가 가능해진다. 산란 후 30시간이면, 완전한 난황세포가 되고 약 10일 후 개미누에로 부화된다.
누에는 연구용뿐만 아니라 그 산업적 가치로 인해 형질전환된 누에를 생산하기 위한 다양한 연구가 진행되어 왔다. 누에 형질전환 기술 개발은 일본의 Tamura 등에 의해 나비목곤충인 Trichopusia ni에서 유래한 piggyBac 유전자를 이용하여 형질전환용 전이벡터를 구축하고 이를 다화성 누에 품종의 알에 미세주입(microinjection)하여 최초로 형질전환 누에 제작에 성공하였다. 최근에는 다양한 바이오의약품을 생산하는 형질전환누에가 보고되고 있다. 한편, 누에알에 전이벡터를 주입하는 것은 2000년 Tamura 등이 사용한 미세주입법으로서 미세주입의 위치는 배아의 주공과 후부 사이의 가운데 배면 부분에 주사함으로써 형질전환 효율을 향상시킬 수 있음이 보고된바 있다. 또한, 형질전환에 사용된 누에 품종인 금옥잠은 잠125와 잠140의 교잡종으로서 일반 원종에 비해 누에알이 크고, 인공사료에 의한 연중 사육이 가능하며, 월년 종의 특징인 염산처리에 의해 부화된다. 그러므로 선발된 누에형질전환체를 장기간 보관할 수 있는 장점을 가지고 있다.
누에는 헤비사슬 피브로인(heavy-chain fibroin), 라이트사슬 피브로인(light-chain fibroin), 및 P25 단백질로 이루어진 견 단백질을 생산한다. 견 단백질 발현은, 특히 피브로인은 5령기 유충의 후부견사선에서 아주 강력한 발현을 하여 전체 체중의 약 20% 이상이나 되는 피프로인 단백질을 생산한다. 이러한 피브로인의 강력하고 조직 특이적인 발현 조절 기작을 해명하는 것은 유전자 발현조절 연구에 중요한 실마리를 제공할 수 있을 것으로 기대되며, 이 조절 기작은 진핵생물에서 유용물질의 대량생산에 이용될 수 있다.
피브로인 유전자의 연구는 분자량이 큰 아미노산 배열의 특수성을 이용하여 5령 말기의 후부 견사선으로부터 Suzuki와 Brown에 의하여 처음으로 1972년에 mRNA가 분리되었으며, 이어서 1976년에는 누에의 게놈(genomic) DNA로부터 피브로인 유전자를 클로닝하였다. 그리고 이후의 연구로 가잠에서 H 사슬과 L 사슬이, 야잠에서 H 사슬이 클로닝되어 그 구조와 조절의 연구가 활발하게 진행 중에 있다.
가잠의 H사슬은 16 내지 17 kb의 길이로 2개의 엑손(exon)으로 이루어져 있으며, L 사슬의 경우 13472 bp 길이로 7개의 엑손(exon)으로 이루어져 있다. 피브로인의 H 사슬 유전자의 전사는 배 발생의 25 stage에서 활성화된 후 유충 발생시기에 후부견사선에서 스위치 온과 오프가 반복적으로 일어난다. Nuclear run-on assay를 통한 전사 조절 연구에 의하여 5령기 유충의 후부견사선의 전반부에서 국한되어 전사가 일어남을 밝혀졌다. 그리고 이때 L 사슬이 H 사슬과 같이 전사됨이 밝혀졌다. 피브로인 유전자는 세포 분화 과정에 유전자의 증폭이나 메틸레이션(methylation)과 같은 구조적 변화가 일어나지 않는 것이 확인되었는데, 이것은 피브로인 유전자의 발현이 대부분 전사에 의해 조절된다는 것을 의미한다.
형질전환 동물이란 외래의 유전자가 숙주의 게놈상에 삽입되어 그 형질의 일부가 변한 동물을 말하며 그때의 외래유전자를 트랜스젠(transgene)이라 한다. 1970년 중반부터 체세포나 생식세포에 유전자재조합 바이러스를 사용하여 외래유전자를 도입하기 시작하였고, 1980년도에는 미세주사방법(microinjection)으로 고든에 의해 슈퍼마우스를 생산하게 되었다.
외래유전자를 도입하는 기술로는 인산칼슘법, 전기천공법, DEAE-덱스트란법, 리포좀법, 미세주사법, bombardment법 등이 있다. 상기 방법들 중 DEAE-덱스트란법과 전기 천공법은 세포를 DNA가 열린 구멍을 통해 직접 세포질로 들어가게 하는 방법인데, 이 두 방법에서는 DNA가 손상을 입을 수도 있다. 리포좀을 이용하는 방법은 DNA를 인공지질 소포체인 리포좀을 넣어 세포막과 융합시켜 직접 세포 내로 운반시키는 방법으로 광범위하게 사용되고 있다. 미세주사법은 1세포기 수정란에 미세조작기를 사용하여 난에 손상을 주지 않을 정도의 미세주사침으로 DNA를 직접 주입하는 방법이다. 실용화 단계에 있는 외래유전자 도입기술은 도입되는 외래 유전자들이 성장률 조절, 극한 환경에서의 내성, 유전자 치료에 관련된 것이라면 인류에게 무한한 혜택을 줄 수 있을 것이다.
멜리틴(Melittin)은 26개의 아미노산으로 구성된 단백질로서, 봉독의 주요한 성분으로 봉독 성분에서 50% 이상을 차지하고 있다. 멜리틴은 항균, 항생, 용혈, 혈압강화, 통증완화, 세포재생, 면역증강 및 혈관확장 활성을 가지고 있는 것으로 보고된 바 있으며, NF-κB의 활성화를 저해하고 DNA 결합능을 조절하는 활성을 가지므로 NF-κB 활성 억제제 또는 NF-κB가 관여하는 DNA의 전사를 조절하는 전사 억제제로 사용될 수 있음이 보고된 바 있다.
2011년 7월 부로 가축사료 내 성장촉진용 항생제 사용 전면금지로 인한 무항생제 사육시 발생할 수 있는 생산성 감소, 질병발생율 증가 등의 문제를 해결하기 위해 효율적인 항생제 대체제 개발이 시급히 요구되고 있는 실정이다.
관련 선행기술로는 대한민국등록특허 제10-0267742호(등록일: 2000년 07월 07일, 명칭: 녹색 형광단백질 유전자가 삽입된 재조합 베큘로바이러스를 이용한 형광누에 및 제조방법)과 대한민국등록특허 제10-0323550호(등록일: 2002년 01월 24일, 명칭: 누에의 형질전환방법과 형질전환된 누에)가 있다
본 발명의 목적은 가축사료 내 첨가할 천연항생제를 저가로 대량생산하기 위하여 표지 유전자 조절 프로모터, 표지 유전자, 누에 유래의 피브로인(Fibroin) 프로모터 및 봉독 유래의 멜리틴(melittin) 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현벡터, 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 실크내 멜리틴이 발현되는 형질전환 누에를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 형질전환 누에를 이용하여 멜리틴 항생펩타이드가 함유된 누에고치를 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표지 유전자 조절 프로모터, 표지 유전자, 누에 유래의 피브로인(Fibroin) 프로모터 및 봉독 유래의 멜리틴(melittin) 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
상기 멜리틴 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되며, 또한, 상기 멜리틴 유전자는 1번 또는 2번 이상 반복하여 도입되는 것을 특징으로 한다.
상기 표지 유전자 조절 프로모터는 3xP3 프로모터인 것을 특징으로 한다.
상기 표지 유전자는 EGFP(green fluorescent protein) 유전자인 것을 특징으로 한다.
상기 유전자 컨스트럭트는 도 1의 구조로 구성되는 것을 특징으로 한다.
상기 발현벡터는 piggyBac 벡터인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 재조합 발현벡터를 누에(Bombyx mori) 또는 누에알에 형질전환시켜 제조한, 실크내 멜리틴이 발현되는 형질전환 누에를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 본 발명에 따른 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 재조합 발현벡터를 누에알에 형질전환시켜 형질전환된 누에알을 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 형질전환된 누에알을 부화시켜 형질전환 누에를 제조하는 단계를 포함하는 실크내 멜리틴이 발현되는 형질전환 누에를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 단계 2)의 형질전환은 미세주입법(microinjection)을 이용하는 것을 특징으로 하는 실크내 멜리틴이 발현되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 단계 3)에 있어서 i) 발현벡터에 표지 유전자를 도입한 후, 형질전환 누에에서 상기 표지 유전자의 발현을 확인하는 방법; 또는 ii) 형질전환 누에에서 멜리틴 유전자의 발현을 확인하는 방법 중 하나의 방법으로 형질전환 누에를 선발하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
아울러, 본 발명은
1) 상기 본 발명에 따른 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 재조합 발현벡터를 누에 또는 누에알에 형질전환시켜 형질전환 누에를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 형질전환된 누에를 사육하여 누에고치를 획득하는 단계를 포함하는 멜리틴 항생펩타이드가 함유된 누에고치를 대량으로 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 형질전환 누에는 꿀벌 봉독의 주성분인 멜리틴 항생펩타이드를 함유하고 있는 누에고치를 생산함으로써, 천연항생제로서 개발이 가능하여, 가축사료 첨가제 뿐만 아니라 화장품, 치약 등 생활용품의 소재 등으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 양잠농가는 본 발명을 통해 일반누에와는 차별화된 고부가가치의 천연항생제를 생산하는 형질전환누에를 사육함으로써 소득향상에 크게 기여할 수 있다.
도 1은 전이벡터(p3xP3-EGFP-pFigH-Melitinx5)의 구조를 나타내는 그림이다.
도 2는 G2 형질전환 누에의 EGFP의 형광을 나타내는 그림이다.
A는 알의 경우, 2세대 5령 배아의 눈 및 복부 신경계에서 형광이 나타나는 것을 보여준다. 이때, 화살표는 눈 및 신경계를 표시한다.
B는 유충의 경우, 2세대 5령충의 눈에서 형광이 나타나는 것을 보여준다. 이때, 화살표는 눈을 표시한다.
C는 번데기의 경우, 눈에서 형광이 나타나는 것을 보여준다. 이때, 화살표는 눈을 표시한다.
D는 성충의 경우, 눈에서 형광이 나타나는 것을 보여준다. 이때, 화살표는 눈을 표시한다.
도 3은 G2 형질전환 누에에서 RT-PCR을 이용하여 멜리틴 유전자를 분석한 결과를 나타내는 그림이다. 이때, 레인 M은 1 kb 단계 DNA 마커를 나타내고, 레인 1은 cFibH-Melitinx5의 PCR 산물을 나타낸다.
도 2는 G2 형질전환 누에의 EGFP의 형광을 나타내는 그림이다.
A는 알의 경우, 2세대 5령 배아의 눈 및 복부 신경계에서 형광이 나타나는 것을 보여준다. 이때, 화살표는 눈 및 신경계를 표시한다.
B는 유충의 경우, 2세대 5령충의 눈에서 형광이 나타나는 것을 보여준다. 이때, 화살표는 눈을 표시한다.
C는 번데기의 경우, 눈에서 형광이 나타나는 것을 보여준다. 이때, 화살표는 눈을 표시한다.
D는 성충의 경우, 눈에서 형광이 나타나는 것을 보여준다. 이때, 화살표는 눈을 표시한다.
도 3은 G2 형질전환 누에에서 RT-PCR을 이용하여 멜리틴 유전자를 분석한 결과를 나타내는 그림이다. 이때, 레인 M은 1 kb 단계 DNA 마커를 나타내고, 레인 1은 cFibH-Melitinx5의 PCR 산물을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 표지 유전자 조절 프로모터, 표지 유전자, 누에 유래의 피브로인(Fibroin) 프로모터 및 봉독 유래의 멜리틴(melittin) 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
상기 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 멜리틴 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 상기 염기서열에서 하나 또는 둘 이상의 염기가 삽입, 결실 또는 치환된 서열로 구성된 것도 포함할 수 있다.
상기 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 멜리틴 유전자는 1번 또는 2번 이상 반복하여 도입되는 것이 바람직하고, 5번 ~ 7번 반복하여 도입되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한가지 실시예에서는 도입되는 멜리틴 유전자로서 꿀벌 봉독 유래 멜리틴(melittin) 항생펩타이드의 활성부위 cDNA만을 선정하였다. 그런 다음, 누에 실크내에서 멜리틴을 과량발현시키기 위하여 멜리틴 유전자를 5 반복으로 중복합성하였다. 이때, 5 반복의 멜리틴이 재조합된 누에실크에서 1 반복 멜리틴의 분리정제를 용이하게 하기 위하여, 멜리틴 유전자 사이에 시아노겐 브로마이드(Cyanogen bromide, CNBr)의 인식 아미노산인 메티오닌(methionine, M)을 삽입하여 최종적으로 M-Melittin-M-Melittin-M-Melittin-M-Melittin-M-Melittin-M을 합성하여 사용하였다.
상기 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 피브로인 프로모터는 누에 유래 피브로인 H 프로모터(pFibH)를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 한가지 실시예에서는 상기에서 합성된 5 반복의 멜리틴 유전자의 발현조절을 위해서, 실크의 주성분인 피브로인(Fibroin) 단백질의 프로모터(pFibH)를 사용하였다.
상기 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 표지 유전자 조절 프로모터는 3xP3 프로모터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 표지 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터는 모두 사용가능하다.
상기 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 표지 유전자는 형광단백질을 발현하는 유전자는 모두 사용가능하며, EGFP(green fluorescent protein) 유전자를 사용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한가지 실시예에서는 형질전환체 선발을 위해서, 형광단백질(EGFP)을 표지유전자로 사용하였고, 표지유전자의 발현조절은 눈과 신경시스템에서 특이적으로 발현하는 3xP3 프로모터를 사용하였다.
상기 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 유전자 컨스트럭트는 도 1의 구조로 구성된 컨스트럭트를 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 유전자 컨스트럭트가 도입되는 발현벡터는 piggyBac 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 재조합 발현벡터를 누에(Bombyx mori) 또는 누에알에 형질전환시켜 제조한, 실크내 멜리틴이 발현되는 형질전환 누에를 제공한다.
피브로인 H-chain의 긴 반복서열은 소수성 상호작용에 의해 결정구조를 형성하는데, 이러한 구조를 형성하기 위해서는 2가지 요소가 꼭 필요하다. 첫 번째는 H-chain의 N 말단과 C 말단에 실크 속으로 피브로인 분자를 분비시키기 위한 시그날 서열이 있어야 하고, 두 번째는 H-chain C 말단의 20번째 시스테인 잔기와 L-chain N 말단의 172번 시스테인 잔기가 이황화결합을 형성하고 있어야 한다. 따라서 본 발명에서는 이러한 시스템을 기반으로 피브로인 H-chain에서 재조합 단백질인 멜리틴을 발현시키는 누에 형질전환체를 제작하였다.
또한, 본 발명은
1) 본 발명에 따른 상기 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 재조합 발현벡터를 누에알에 형질전환시켜 형질전환된 누에알을 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 형질전환된 누에알을 부화시켜 형질전환 누에를 제조하는 단계를 포함하는 실크내 멜리틴이 발현되는 형질전환 누에를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 2)의 형질전환은 미세주입법(microinjection)을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 공지된 형질전환법은 모두 사용가능하다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 3)에 있어서, 하기 중 하나의 방법으로 형질전환 누에를 선발하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
i) 발현벡터에 표지 유전자를 도입한 후, 형질전환 누에에서 상기 표지 유전자의 발현을 확인하는 방법; 또는,
ii) 형질전환 누에에서 멜리틴 유전자의 발현을 확인하는 방법.
본 발명의 한가지 실시예에서는 공지된 미세주입법을 이용하여 상기 재조합 발현벡터로 누에알을 형질전환시킨 후, 그 중 일부를 유충으로 부화시켰으며, 그 중 일부 성충이 된 나방들을 서로 교배시켜 F1세대의 누에알을 획득하였다. 그런 다음, 이들 F1세대의 누에알의 산란 후 초기배, 유충, 번데기 또는 성충에서 각각 눈 또는 신경조직에서의 표지 유전자의 발현을 관찰함으로써 형질전환체를 선발하였다. 그런 다음, 최종적으로 이들만을 교배시켜 F2세대의 형질전환체를 획득하였다.
아울러, 본 발명은
1) 본 발명에 따른 상기 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 재조합 발현벡터를 누에 또는 누에알에 형질전환시켜 형질전환 누에를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 형질전환된 누에를 사육하여 누에고치를 획득하는 단계를 포함하는 멜리틴 항생펩타이드가 함유된 누에고치를 대량으로 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 형질전환 누에는 항생펩타이드인 멜리틴을 다량 함유하고 있는 누에고치를 생산할 수 있으므로, 천연항생제, 가축사료 첨가제, 화장품, 치약 등 생활용품의 소재 등으로 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 형질전환용 전이벡터의 제작
누에 실크의 피브로인(Fibroin)에서 멜리틴(Melittin) 단백질이 발현되는 형질전환 누에를 제작하기 위해, 피브로인 프로모터와 melittin 유전자를 piggyBac 벡터에 도입하여 제작하였다.
먼저 피브로인 프로모터를 얻기 위해서, 1,124 bp 프로모터 서열과 1,430 bp N-말단에 피브로인 H 유전자(AF226688의 nt 61,312 - 63,870)의 인트론(972 bp)이 포함된 단편은 누에에서 분리된 게놈(genomic) DNA와 프라이머들(pFibHN-F: 5'-GGCGCGCCGTGCGTGATCAGGAAAAAT-3'(서열번호: 2)(27 mer)) 및 (pFibHN-R: 5'-TGCACCGACTGCAGCACTAGTGCTGAA-3'(서열번호: 3)(27 mer))을 사용하여 PCR로 증폭하였고, pGEM-T Easy Vector System(Promega, Madison WI)에 클로닝하였다. 완성된 플라스미드는 'pGEMT-pFibH-NTD'로 명명하였다.
H-chain gene ORF의 180 bp 3' 말단과 피브로인 H 유전자(AF226688의 nt 79,021 - 80,009)의 300 bp 3' 영역이 포함된 단편은 누에에서 분리한 게놈 DNA와 프라이머들(pFibHC-F: 5'-AGCGTCAGTTACGGAGCTGGCAGGGGA-3'(서열번호: 4)(27 mer) 및 pFibHC-F: 5'-TATAGTATTCTTAGTTGAGAAGGCATA-3'(서열번호: 5)(27 mer))을 사용하여 PCR로 증폭하였고, pGEM-T Easy Vector System(Promega, USA)에 클로닝하였다. 완성된 플라스미드는 'pGEMT-CTD'로 명명하였다.
그런 다음, 'pGEMT-pFibH-NTD'는 Asc I 및 BamH I으로, 'pGEMT-CTD'는 Sal I 및 Fse I으로 각각 제한효소 처리함으로써 단편들을 준비하였다. 이들 단편들은 Apa I 및 Not I으로 제한효소 처리된 pBluescriptII SK(-) vector(Stratagene, CA)에 함께 클로닝하였고, 'pFibHNC-null'로 명명하였다.
종결코돈 없는 Melitin x 5 유전자(ATGggaattggagcagttctgaaggtattaaccacaggattgcccgccctcataagttggattaaacgtaagaggcaacagATGggaattggagcagttctgaaggtattaaccacaggattgcccgccctcataagttggattaaacgtaagaggcaacagATGggaattggagcagttctgaaggtattaaccacaggattgcccgccctcataagttggattaaacgtaagaggcaacagATGggaattggagcagttctgaaggtattaaccacaggattgcccgccctcataagttggattaaacgtaagaggcaacagATGggaattggagcagttctgaaggtattaaccacaggattgcccgccctcataagttggattaaacgtaagaggcaacagATG;
MGIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQMGIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQMGIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQMGIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQMGIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQM)는 유전자 합성과정(Bioneer, korea)을 이용하여 제작하였고, pGEM-T easy벡터(Promega Co.)에 클로닝하였다.
이때, 누에 실크 내에서 멜리틴을 과량발현시키기 위하여 멜리틴 유전자를 5반복으로 중복합성하였다
이는, 1회 단독발현에 비하여 반복수를 증가시키면 멜리틴의 생산량이 증가하기 때문이다. 이 외에도 표지유전자(EGFP 등)의 반복수를 증가시킴으로써 발현량이 증가할 수 있으나, 반복 수를 증가시키는데는 상당한 시간과 비용이 소요되는 문제가 있기 때문에 본 발명에서는 5반복으로 중복합성을 하였다.
이때, 상기 5 반복의 멜리틴이 재조합된 누에 실크에서 1반복 멜리틴의 분리정제를 용이하게 하기 위하여, 멜리틴 유전자 사이에 시어노겐 브로마이드(Cyanogen bromide, CNBr)의 인식 아미노산인 메티오닌(methionine, M)을 삽입하여 최종적으로 M-Melittin-M-Melittin-M-Melittin-M-Melittin-M-Melittin-M을 합성하였다. 상기 플라스미드는 Not I 및 Bbvc I으로 제한효소 처리하였고, 분리된 단편은 Not I 및 Bbvc I으로 제한효소 처리된 'pFibHNC-nul'에 클로닝하였다. 완성된 플라스미드는 'pFibHNC-Melitin x 5'로 명명하였다.
마지막으로, 'pFibHNC-Melitin x 5'를 Asc I 및 Fse I으로 제한효소 처리하여 분리된 단편을 Asc I 및 Fse I으로 제한효소 처리된 'pG-3xP3-EGFP'에 클로닝하였다. 이때, 형질전환체를 선발하기 위한 마커 유전자로 EGFP 유전자를 사용하였고, 상기 EGFP 유전자의 조절 프로모터로는 3xP3 프로모터를 사용하였다. 완성된 플라스미드는 'pG-3xP3-EGFP-pFibH-Melitin x 5'(도 1)로 명명하였다.
<
실시예
2> 누에 형질전환체의 제작 및 선발
<2-1> 누에의 준비 및 사육
형질전환에 사용된 누에(Bombyx mori, 농촌진흥청 국립농업과학원 잠사양봉소재과에서 보유하고 있는 누에를 사용함)는 금옥잠(125 x 140)을 사용하였고, 표준 사육 기준(온도, 24℃- 27℃; 상대습도, 70% - 90%)에 준하여 사육하였다. 형질전환에 사용된 누에알은 산란 후 4시간 이내의 것만 사용하였다.
<2-2> 누에 형질전환체의 제작
누에 형질전환체의 제작은 2000년 Tamura 등이 사용한 미세주입(microinjection)법을 참고로 실험을 진행하였다.(Tamura T, Thibert C, Royer C, Kanda T, Abraham E, Kamba M, Komoto N, Thomas JL, Mauchamp B, Chavancy G,Shirk P, Fraser M, Prudhomme JC, Couble P (2000) Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol 18, 81-84)
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 제작한 전이벡터'pG-3xP3-EGFP-pFibH-Melitin x 5'와 헬퍼(Helper) 플라스미드인 pHA3PIG의 농도비는 1 : 1(각각 200 ng/ul)의 비율로 사용하였고, 미세주입용 완충용액(5 mM KCl, 0.5 mM Phosphate buffer, pH 7.0)에 0.2 ㎍/㎕의 농도로 희석하였다. 누에 초기 배로의 미세주입(microinjection)은 배아의 주공과 후부 사이의 가운데 배면 부분에 주입하였는데, 그 과정은 다음과 같이 실시하였다. 먼저 텅스텐 침으로 누에알의 난간에 작은 구멍을 뚫고, 이 구멍에 DNA 용액이 들어있는 미세관(microcapillary)의 끝을 삽입 후, 미세주입기(microinjector)의 공기압을 이용하여 DNA 용액을 알 속으로 주입하였다. 이때, 각 배아에 주입된 DNA 용액의 양은 10-15 nl가 사용되었고, 난간에 생긴 구멍은 시아노크릴레이트(Cyanocrylate) 접착제를 사용하여 막았다. 총1800개의 누에알을 미세주입하였다. 미세주입 후 누에알은 보습한 패트리디쉬에 넣어서 25℃에서 부화할 때까지 보호하였다.
<2-3> 누에 형질전환체의 선발
누에 형질전환체의 선발은 형광현미경을 이용하였다. 구체적으로, LEICA MZ16FA 현미경(Leica사, USA) 및 Microscope MZ FLIII Flourescence Filter EGFP 형광필터(Leica사, USA)를 사용하여, 누에의 세대별 및 시기별로 관찰하여 선발하였다. 기존에 보고된 문헌에 의하면 3xP3 프로모터는 누에 초기 배 단계의 눈과 신경조직, 유충과 번데기 및 성충의 눈에서 작용한다고 알려져 있으므로, 이러한 특징을 근거로 형질전환체를 선발하였다.
그 결과, 446 마리의 유충이 부화되었고, 그 중 성충이 된 124마리의 나방들을 서로 교배시켜 F1세대의 누에알을 얻었다. 또한, 산란 후 3일째부터 누에 초기 배의 눈과 신경조직에서 녹색형광이 관찰되었으며, 총 12 아구(Broods)의 형질전환체를 선발할 수 있었다(표 1). 또한 이렇게 선발된 아구에서 녹색 형광의 눈을 가진 유충과 번데기 및 성충을 선발하였고(도 2), 최종적으로 이들만을 교배하여 F2세대의 형질전환체를 선발하였다.
| 주입된 배아 | 부화된 배아 | G0 아구(brood) | EGFP 양성을 갖는 G1 아구 |
| 1800 마리 | 446 마리 | 62 마리 | 12마리 |
금옥잠 종이 숙주 종으로 사용되었다.
벡터 플라스미드 p3xP3-EGFP-pFibH-Melitinx5(200 ng/ul) 및 헬퍼 플라스미드(200 ng/ul)를 주입을 위해 사용되었다.
<
실시예
3> 누에 형질전환체에서
멜리틴
유전자의 발현 분석
누에 형질전환체 내에서 멜리틴 유전자의 발현을 알아보기 위해, RT-PCR을 이용하여 분석하였다.
구체적으로, 2세대(F2) 5령 기잠(5th instar larvae) 누에 형질전환체에서 TRI REAGENT(Molecular Research Center)를 사용하여 총(total) RNA 2 ug를 분리하였고, High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit(Applied Biosystems)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. PCR에는 유전자 특이적 프라이머(gene specific primer)는 pFibHNC-null 벡터의 FibH cDNA를 증폭할 수 있는 FibH-ATG-F 프라이머(5'-ATGAGAGTCAAAACCTTTGTGATCTT-3'(서열번호: 6)) 및 FibH-TAA-R 프라이머(5'-TTAGCAATTCACACAAGGCAGTG-3'(서열번호: 7))를 사용하여 수행하였다. PCR은 다음의 과정으로 진행하였다. 먼저, 95℃에서 5분간 1회 수행 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 50초로 30회 반복으로 수행하였고, 72℃에서 5분 간 1회 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 2% 아가로즈 젤(agarose gel)에 전기영동하여 확인하였다.
그 결과, 피브로인 H 유전자의 N-말단과 C-말단 사이에 Melitinx5가 포함된 1077 bp 밴드를 확인할 수 있었고, 제한효소 Not I 및 Bbvc I을 사용하여 408 bp의 Melitinx5 유전자가 피브로인 H 유전자의 N-말단과 C-말단 사이에 존재하는 것을 확인할 수 있었다(도 3).
지금까지의 결과로 피브로인에서 멜리틴 유전자가 정상적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었고, 따라서 피브로인에서 멜리틴 제조합 단백질을 생산하는 누에형질전환체가 제작되었음을 확인할 수 있었다.
이와 같이, 상기 형질전환 누에는 꿀벌 봉독의 주성분인 멜리틴 항생펩타이드를 함유하고 있는 누에고치를 생산함으로써, 천연항생제로서 개발이 가능하여, 가축사료 첨가제 뿐만 아니라 화장품, 치약 등 생활용품의 소재 등으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 양잠농가는 본 발명을 통해 일반누에와는 차별화된 고부가가치의 천연항생제를 생산하는 형질전환누에를 사육함으로써 소득향상에 크게 기여할 수 있다.
상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 시험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> TRANSGENIC SILKWORMS PRODUCING COCOONS CONTAINING MELITTINS
ANTIBIOTIC PEPTIDES
<130> P2012-0170
<140> 10-2012-0123980
<141> 2012-11-05
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 408
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Melitinx5
<400> 1
atgggaattg gagcagttct gaaggtatta accacaggat tgcccgccct cataagttgg 60
attaaacgta agaggcaaca gatgggaatt ggagcagttc tgaaggtatt aaccacagga 120
ttgcccgccc tcataagttg gattaaacgt aagaggcaac agatgggaat tggagcagtt 180
ctgaaggtat taaccacagg attgcccgcc ctcataagtt ggattaaacg taagaggcaa 240
cagatgggaa ttggagcagt tctgaaggta ttaaccacag gattgcccgc cctcataagt 300
tggattaaac gtaagaggca acagatggga attggagcag ttctgaaggt attaaccaca 360
ggattgcccg ccctcataag ttggattaaa cgtaagaggc aacagatg 408
Claims (12)
- 표지 유전자 조절 프로모터, 표지 유전자, 누에 유래의 피브로인(Fibroin) 프로모터 및 봉독 유래의 멜리틴(melittin) 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하되,
상기 멜리틴 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 것을 특징으로 하는
재조합 발현벡터.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 멜리틴 유전자는 1번 또는 2번 이상 반복하여 도입되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 1항에 있어서, 상기 표지 유전자 조절 프로모터는 3xP3 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 1항에 있어서, 상기 표지 유전자는 EGFP(green fluorescent protein) 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 1항에 있어서, 상기 유전자 컨스트럭트는 도 1의 구조로 구성되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 1항에 있어서, 상기 발현벡터는 piggyBac 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 1항 또는, 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 재조합 발현벡터를 누에(Bombyx mori) 또는 누에알에 형질전환시켜 제조한, 실크내 멜리틴이 발현되는 형질전환 누에.
- 1) 제 1항 또는, 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 재조합 발현벡터를 누에알에 형질전환시켜 형질전환된 누에알을 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 형질전환된 누에알을 부화시켜 형질전환 누에를 제조하는 단계를 포함하는 실크내 멜리틴이 발현되는 형질전환 누에의 제조방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 단계 2)의 형질전환은 미세주입법(microinjection)을 이용하는 것을 특징으로 하는 실크내 멜리틴이 발현되는 형질전환 누에의 제조방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 단계 3)에 있어서 하기 중 하나의 방법으로 형질전환 누에를 선발하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 실크내 멜리틴이 발현되는 형질전환 누에의 제조방법:
i) 발현벡터에 표지 유전자를 도입한 후, 형질전환 누에에서 상기 표지 유전자의 발현을 확인하는 방법; 또는
ii) 형질전환 누에에서 멜리틴 유전자의 발현을 확인하는 방법.
- 1) 제 1항 또는, 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 재조합 발현벡터를 누에 또는 누에알에 형질전환시켜 형질전환 누에를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 형질전환된 누에를 사육하여 누에고치를 획득하는 단계를 포함하는 멜리틴 항생펩타이드가 함유된 누에고치의 대량 생산방법.
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