DE60122816T2

DE60122816T2 - Genort, beteiligt an der Regulation der Haarpigmentierung, Vestibularfunktion und Fruchtbarkeit

Info

Publication number: DE60122816T2
Application number: DE60122816T
Authority: DE
Inventors: Kathryn S.E. Cheah
Original assignee: University of Hong Kong HKU
Current assignee: University of Hong Kong HKU
Priority date: 2000-03-20
Filing date: 2001-03-20
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2021-03-21
Also published as: EP1148128B1; EP1148128A1; DE60122816D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Es wurde eine Mauslinie geschaffen, die eine rezessive Mutation trägt, welche durch Insertion eines Transgens verursacht wird. Diese Mäuse sind durch eine veränderte Pigmentierung von Haaren gekennzeichnet, was eine gelbe Fellfarbe, Rotationsverhalten und eine Unfähigkeit zu schwimmen ergibt. Es hat sich gezeigt, dass sich das Transgen in zwei Stellen auf dem Mäusechromosom 3 insertiert hat. Eine Recherche in der Mausgemon-Datenbank bestätigte, dass die Mutation neu ist. Der mutante Locus wurde yellow submarine (ysb) genannt. DNA, die die Transgen-Insertion flankiert, wurde isoliert und verwendet, um nach den entsprechenden normalen (unmutierten) Sequenzen zu suchen. Genomische Klone, die 20 kb des unmutierten ysb-Locus (+^ysb) überspannen, wurden isoliert, und Kartierungsexperimente weisen darauf hin, dass die Transgen-Integration eine Deletion und chromosomale Inversion verursacht hat, was zu zwei Transgen-Integrationsstellen führt. Rotationsverhalten kann eine Abnormität im Innenohr widerspiegeln oder auf eine Abnormität in der Rautenhirnentwicklung zurückzuführen sein. Studien zeigen eine abnorme Struktur der Innenohren von ysb-Mäusen und einen verkümmerten Hörnerv. Daher sind ysb-Mäuse eine neue Mutante, die sowohl eine abnorme Regulation der Pigmentierung als auch eine Innenohr-Funktionsstörung zeigt. Molekulargenetik, Bioinformatik, Entwicklungsbiologie, transgene und physiologische Ansätze werden verwendet, um: 1) das bzw. die Gene am Wildtyp-ysb(+^ysb)-Locus zu identifizieren und zu charakterisieren; 2) die Natur der ysb-Mutation zu bestimmen; 3) die molekularen und entwicklungsmäßigen Grundlagen, die dem oder den Defekten bei ysb-Mäusen zugrundliegen, zu studieren; und 4) die neurophysiologischen Veränderungen im Gleichgewichtssinn und Gehör bei ysb-Mäusen zu charakterisieren. Ungefähr 1/1000 Säuglingen sind bei der Geburt von Hörfehlern betrof fen, von denen zwei Drittel eine genetische Basis haben. Ysb-Mäuse sind ein wertvolles Modell, um Moleküle zu identifizieren, die an der Kontrolle des Gleichgewichtssinns beteiligt sind. Diese Studien liefern fundamentale Informationen über die Entwicklung des Innenohrs und die Mechanismen, durch die es zu Hör- und Gleichgewichtsdefekten kommen kann. Die Identifizierung und Charakterisierung des bzw. der ysb-Gene und des molekularen Defekts bei ysb-Mäusen liefern auch neue Einsichten in die komplexen Regulationswege, die eine Agouti-Fellfarbe bei Mäusen steuern.
Diese Erfindung stellt eine isolierte Nucleinsäure bereit, die einen mutanten yellow-submarine-Locus definiert, wobei der mutante yellow-submarine-Locus mit einem Wildtyp-yellow-submarine-Locus identisch ist, abgesehen von einer Integration eines pAA2-Transgens in wenigstens einen Bereich auf einem Chromosom.
Diese isolierten Nucleinsäuremoleküle umfassen das Mäusechromosom 3 und pAA2-DNA-Sequenzen, die die 5'-Integrationsstelle, welche eine Nucleinsäure-Verbindungssequenz gemäß SEQ ID Nr. 4 umfasst, flankieren bzw. die 3'-Integrationsstelle, welche eine Nucleinsäure-Verbindungssequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 umfasst, flankieren.
Diese Erfindung stellt einen replizierbaren Vektor bereit, der die obige Nucleinsäure umfasst. Diese Erfindung stellt eine Wirtszelle bereit, die den Vektor umfasst.
Diese Erfindung gibt die Verwendung einer Nucleinsäure aus wenigstens 14 Nucleotiden an, die mit den Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung spezifisch hybridisieren kann.
Diese Erfindung gibt ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Innenohr-Funktionsstörung bei einem Patienten an, das Folgendes umfasst: a) In-Kontakt-Bringen einer von dem Patienten erhaltenen Nucleinsäureprobe mit der obigen Nucleinsäure, die spezifisch an den mutierten Teil des ysb-Locus bindet; und b) Nachweisen der markierten Nucleinsäure, dadurch Nachweisen von mutantem ysb und dadurch Diagnostizieren einer Innenohr-Funktionsstörung bei dem Patienten.
Diese Erfindung gibt ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Pigmentierungs-Funktionsstörung bei einem Patienten an, das Folgendes umfasst: a) In-Kontakt-Bringen einer von dem Patienten erhaltenen Nucleinsäureprobe mit der obigen Nucleinsäure, die spezifisch an den mutierten Teil des ysb-Locus bindet; und b) Nachweisen der markierten Nucleinsäure, dadurch Nachweisen von mutantem ysb und dadurch Diagnostizieren einer Pigmentierungs-Funktionsstörung bei dem Patienten.
Diese Erfindung gibt ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Zellwachstums-Funktionsstörung, Zellproliferations-Funktionsstörung oder Zelltod-Funktionsstörung bei einem Patienten an, das Folgendes umfasst: a) In-Kontakt-Bringen einer von dem Patienten erhaltenen Nucleinsäureprobe mit der obigen Nucleinsäure, die spezifisch an den mutierten Teil des ysb-Locus bindet; und b) Nachweisen der markierten Nucleinsäure, dadurch Nachweisen von mutantem ysb und dadurch Diagnostizieren einer Zellwachstums-Funktionsstörung oder Proliferations-Funktionsstörung bei dem Patienten.
Diese Erfindung gibt ein Verfahren zum Diagnostizieren eines Vestibularisausfalls bei einem Patienten an, das Folgendes umfasst: a) In-Kontakt-Bringen einer von dem Patienten erhaltenen Nucleinsäureprobe mit der obigen Nucleinsäure, die spezifisch an den mutierten Teil des ysb-Locus bindet; und b) Nachweisen der markierten Nucleinsäure, dadurch Nachweisen des Gens, das für die gelbe Fellfarbe verantwortlich ist und dadurch Anzeigen des Vorhandenseins eines Vestibularisausfalls bei dem Patienten.
Kurzbeschreibung der Figuren
1
(A) Homozygote ysb-Maus, die eine gelbe Fellfarbe zeigt, im Vergleich mit (B) einem heterozygoten Wurfgeschwister mit Agouti-Fell und (C) einem schwarzen C57BL.
2
Totalpräparat-X-gal-Färbung (blau) verschiedener pAA2-Mausembryonen, die das typische LacZ-Expressionsmuster zeigen, in verschiedenen Embryonalstadien.
(A) Embryo 9,0 Tage nach der Paarung (dpc; dies post coitum); (B) Embryo 12,5 dpc; (C) Embryo 13,5 dpc; (D) Embryo 13,5 dpc. Zu den Expressionsstellen gehören der Kiemenbogen (ba), die Chorda dorsalis (no), die Urwirbel (pv), die Schnauze (sn) und die Zehen (dg).
3
LacZ-Expression gemäß der X-gal-Färbung (blau) von KM12-transgenen Embryonen in verschiedenen Embryonalstadien. LacZ wird an für pAA2 typischen Stellen (2) sowie an zusätzlichen Stellen einschließlich der Rhombomere (r) 2, 3 und 5 im Rautenhirn (hb), des Neuralrohrs (nt), des Rückenmarks (sc) und der Haarfollikel (hf), die nicht die normalen Expressionsstellen des Col2a1-Transgens sind, exprimiert. (A) Ein im Totalpräparat mit X-gal angefärbter 9,5-dpc-KM12-Embryo zeigt LacZ-Expression im Kiemenbogen (ba), Herz (he), der Chorda dorsalis (no), den Rhombomeren (r) 2, 3 und 5, dem Ohrbläschen (ov) und dem Neuralrohr (nt). (B) zeigt einen Sagittalschnitt eines KM12-transgenen 10,5-dpc-Embryos. (C) Zum Zeitpunkt 10,5 dpc zeigt der KM12-transgene Embryo zusätzliche Expressionsstellen an den Urwirbeln (pv), dem Vorderhirn (fb) und den Spinalganglien (drg) (in dieser Ansicht nicht gezeigt), aber unter Verschwinden der r5-Expression. (D) Expressionsmuster eines 12,5-dpc-Fetus; in diesem Stadium findet man eine Färbung auch im Mittelhirn (mb), Rautenhirn (hb) und dem Rückenmark (sc). In (E) beobachtet man die LacZ-Expression bei 13,5-dpc-Embryonen auch in der Schnauze (sn), den Zehen (dg) und Rippen (rb). (F) Zum Zeitpunkt 16,5 dpc ist im sagittal halbierten Fetus weiterhin eine Expression im Hirn und in den Wirbeln zu beobachten. Eine Expression in Haarfollikeln wird in totalpräparierten (G) und geschnittenen (H) 16,5-dpc-Embryonen beobachtet und ist in der Haut 3,5 Tage postnatal, die im Totalpräparat mit X-Gal angefärbt und aufgehellt wurde (1), immer noch vorhanden.
4
Schwimmtest: A) Eine Wildtypmaus schwimmt in Wasser, auch aktiv; B), C), D) und E): Eine homozygote yellow-submarine(ysb)-Maus rotiert in Wasser und geht unter.
5
Strecktest. Die Maus links, eine ysb-homozygote Maus mit Vestibularisausfall, zeigt eine Tendenz, sich zum Bauch hin einzukrümmen, wenn sie am Schwanz gehalten wird. Die Maus rechts zeigt eine normale Streckreaktion mit ausgestrecktem Körper.
6
Southern-Blot-Hybridisierung von genomischer DNA von Mäusen, die heterozygot (he) bzw. homozygot (ho) in Bezug auf das pAA2-Transgen in der Km12-Linie sind, und nichttransgenen (nt) Kontroll-Wurfgeschwistern unter Verwendung von (A) kreisler- (B) agouti- und (C) α-MSHR-cDNA-Sonden. Die Strukturgene kreisler, agouti und α-MSHR wurden durch das COL2A1-lacZ-Transgen in ysb-Mäusen nicht zerstört.
7
Der ysb-Locus und die chromosomale Lokalisierung des pAA2-Transgens. (A) Lokalisierung von pAA2 (Cheah et al., 1995) bei KM12/ysb-transgenen Mäusen auf Chromosom 3 durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) unter Verwendung von pAA2 als Sonde. Das Transgen ist bei der Kartierung von ysb-Chromosomen in der Metaphase im A2- und B-C-Bereich zu finden. (B) Chromosomenkarte der transgenen Integration. (C) Genomische Klone, die durch PCR-Sonden für die Integrationsstellen 1 und 2 isoliert wurden. (D) Chromosomale Lokalisierung von genomischen Klonen für die Integrationsstellen 1 und 2 durch FISH auf Wildtypchromosomen in der Metaphase. Beide befinden sich bei A3 auf Chromosom 3. Literatur: K.S.E. Cheah, A Levy, P.A. Trainor, A.W.K. Wai, T. Kuffner, C.L. So, K.K.H. Leung, R.H. Lovell-Badge und P.P.L. Tam. (1995) Human COL2A1-directed SV40 T-antigen expression in transgenic and chimeric mice results in abnormal skeletal development. J. Cell Biol. 128, 223-237.
8
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) von ysb-Chromosomen unter Verwendung eines Transgens (pAA2) als Sonde. (A) Das Transgen hat sich in zwei Insertionsstellen im Chromosom integriert. Der Pfeil zeigt die Position von Fluoreszenzsignalen. (B) Das DAPI-Bandenmuster zeigt, dass die pAA2-Insertionsstellen Chromosom 3 entsprechen. (C) Entsprechende Banden, die ein Fluoreszenzsignal zeigen, sind durch Punkte gezeigt.
9
Totalpräparat-in-situ-Hybridisierung von 9,5-dpc-Embryonen unter Verwendung von Krox-20-Ribosonde, doppelt angefärbt auf β-Galactosidase-Aktivität (rötlich). Homozygote ysb-Embryonen (E, F) und heterozygote ysb-Embryonen (C, D) haben zum Zeitpunkt 9,5 dpc ein normales Krox-20-Expressionsmuster in den Rhombomeren (r) 3 und 5. Sagittale Ansicht (A) und dorsale Ansicht (B) eines nichttransgenen Wurfgeschwisters, das ein normales Muster zeigt.
10
Totalpräparat-Neurofilament-Immunfärbung von nichttransgenen Kontroll- (A, B), heterozygoten ysb- (C, D) und homozygoten ysb-10,5-dpc-Embryonen (E, F) unter Verwendung von monoklonalem Antikörper (2h3), doppelt angefärbt auf β-Galactosidase-Aktivierung. In homozygoten ysb wird bei 10,5 dpc eine Reduktion des achten Nervs (VIIIn) beobachtet.
11
Dreidimensionale rekonstruierte Bilder von Innenohren von a) nichttransgenen, b) heterozygoten ysb- und c) homozygoten ysb-16,5-dpc-Feten, die strukturelle Fehlbildungen bei der Entwicklung von homozygoten ysb-Innenohren zeigen. Man beachte, dass der obere Bogengang bei homozygotem ysb unterbrochen ist (*).
12
Dreidimensionale rekonstruierte Bilder von Innenohren von a) nichttransgenen Wildtyp-, b) heterozygoten ysb- (+/-) und c) homozygoten ysb-16,5-dpc-Feten (-/-). Man beachte, dass Neuroepithelstrukturen bei der Entwicklung des Innenohrs von homozygoten ysb-Feten fehlen. Bei homozygotem 16,5-dpc-ysb (-/-) ist der obere Bogengang partiell unterbrochen (*) und endet in einem blinden Sack (c); die Macula utriculi sowie Crista superior und lateralis fehlen.
13
Dreidimensionale rekonstruierte Bilder von Innenohren zum Zeitpunkt 13,75 dpc, die strukturelle Fehlbildungen bei der Entwicklung von homozygoten ysb-Innenohren zeigen. Der obere Bogengang ist bei homozygotem ysb unterbrochen (*).
14

A) Sequenz des PCR-Produkts an der Integrationsstelle 1
B) Sequenz des PCR-Produkts an der Integrationsstelle 2

15
Southern-Analysen von genomischer ysb-DNA unter Verwendung von flankierenden Sonden an den Integrationsstellen 1 und 2. In den mutanten Allelen werden Banden unterschiedlicher Größe beobachtet, wenn sie mit flankierenden Sonden von beiden Integrationsstellen sondiert werden (gezeigt durch entsprechende Pfeile). Bei den untersuchten ysb-Mäusen (6. Generation) wird keine Segregation der beiden Integrationsstellen beobachtet. Wt, Wildtyp; he, heterozygotes ysb; ho, homozygotes ysb.
16
Deletion in ysb an der Integrationsstelle 2.

(A) 20-kb-Deletion in ysb. (B)-(E) Autoradiogramme von Southern-Blots von genomischer DNA, die mit EcoRI (B, D), SacI (C) und XbaI (E) verdaut wurde, von ysb-heterozygoten, -homozygoten und nichttransgenen Mäusen. Die Sonden waren: B) pSD14 (1,4 kb EcoRI); C) pSD11 (1,9 kb SacI); D) pSD9 (3,2 kb BamHI); E) pSD8 (2,0 kb SacI).
(B) Man beachte, dass eine Umlagerungsbande beobachtet wird, wenn pSD14 (1,4 kb EcoRI) verwendet wird, um homozygote genomische ysb-DNA zu sondieren.

* bedeutet homozygotes ysb

Man beachte die deletierten Sequenzen, die von den Sonden pSD11 (C), pSD9 (D) und pSD8 (E) aufgedeckt wurden.
17

Sequenzinformation für die 8,1-kb-Deletion innerhalb des ysb-Locus.
Locus: Chromosom 3
Definition: pPLS
Stichworte: genomische DNA
Herkunft: Hausmaus
Organismus: Mus musculus
Vektor: pBluescript
Insert: 8114 bp
Insertionsstellen: HindIII

Information:

A. Sequenz von pPLS, das ein 8114-bp-DNA-Fragment (HindIII-Produkt) von 20 kb deletierten Sequenzen in der Integrationsstelle 2 enthält.
B. Sequenzausrichtung, die zeigt, dass pPLS (1743 bp-1906 bp) Sequenzen mit 90% Identität mit IMAGE 1196866 enthält.
C. Sequenzausrichtung, die zeigt, dass pPLS (106 bp-395 bp) Sequenzen mit 100% Identität mit IMAGE 636095 enthält.

18
Zusammenfassungskarte von pPLS, die den Ort von EST-IMAGE-Sequenzen zeigt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung stellt eine isolierte Nucleinsäure bereit, die einen mutanten yellow-submarine-Locus definiert, wobei der mutante yellow-submarine-Locus mit einem Wildtyp-yellow-submarine-Locus identisch ist, abgesehen von einer Integration eines pAA2-Transgens in wenigstens einen Bereich auf einem Chromosom.
Diese isolierten Nucleinsäuremoleküle umfassen das Mäusechromosom 3 und pAA2-DNA-Sequenzen, die die 5'-Integrationsstelle, welche eine Nucleinsäure-Verbindungssequenz gemäß SEQ ID Nr. 4 umfasst, flankieren bzw. die 3'-Integrationsstelle, welche eine Nucleinsäure-Verbindungssequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 umfasst, flankieren.
Die isolierte Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung umfasst genomische DNA, RNA und cDNA. Die Nucleinsäure kann mit einem nachweisbaren Marker markiert sein. Der nachweisbare Marker umfasst unter anderem einen radioaktiven, kolorimetrischen, lumineszenten oder fluoreszenten Marker.
Diese Erfindung stellt einen replizierbaren Vektor bereit, der die obige Nucleinsäure umfasst. Diese Erfindung stellt eine Wirtszelle bereit, die den Vektor umfasst. In einer Ausführungsform ist die Zelle eine eukaryontische Zelle. In einer Ausführungsform ist die Zelle eine Bakterienzelle. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung umfassen unter anderem ein Plasmid, Cosmid, einen λ-Phagen, YAC, BAC oder PAC.
Diese Erfindung gibt ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Innenohr-Funktionsstörung bei einem Patienten an, das Folgendes umfasst: a) In-Kontakt-Bringen einer von dem Patienten erhaltenen Nucleinsäureprobe mit der obigen Nucleinsäure, die spezifisch an den mutierten Teil des ysb-Locus bindet; und b) Nachweisen der markierten Nucleinsäure, dadurch Nachweisen von mutantem ysb und dadurch Diagnostizieren einer Innenohr-Funktionsstörung bei dem Patienten.
Diese Erfindung gibt ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Pigmentierungs-Funktionsstörung bei einem Patienten an, das Folgendes umfasst: a) In-Kontakt-Bringen einer von dem Patienten erhaltenen Nucleinsäureprobe mit der obigen Nucleinsäure, die spezifisch an den mutierten Teil des ysb-Locus bindet; und b) Nachweisen der markierten Nucleinsäure, dadurch Nachweisen von mutantem ysb und dadurch Diagnostizieren einer Pigmentierungs-Funktionsstörung bei dem Patienten.
Diese Erfindung gibt ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Zellwachstums-Funktionsstörung, Zellproliferations-Funktionsstörung oder Zelltod-Funktionsstörung bei einem Patienten an, das Folgendes umfasst: a) In-Kontakt-Bringen einer von dem Patienten erhaltenen Nucleinsäureprobe mit der obigen Nucleinsäure, die spezifisch an den mutierten Teil des ysb-Locus bindet; und b) Nachweisen der markierten Nucleinsäure, dadurch Nachweisen von mutantem ysb und dadurch Diagnostizieren einer Zellwachstums-Funktionsstörung oder Proliferations-Funktionsstörung bei dem Patienten.
In einer Ausführungsform des obigen Verfahrens ist der Patient ein Säuger. In einer anderen Ausführungsform ist der Patient ein Nichtsäuger. Der Patient kann ein Mensch, ein Primat, ein Pferd, ein Schaf, ein Vogel, ein Rind, ein Schwein, ein Hund, eine Katze oder eine Maus sein. Der Patient kann ein Wirbeltier sein.
Diese Erfindung gibt ein Verfahren zum Diagnostizieren eines Vestibularisausfalls bei einem Patienten an, das Folgendes umfasst: a) In-Kontakt-Bringen einer von dem Patienten erhaltenen Nucleinsäureprobe mit der obigen Nucleinsäure, die spezifisch an den mutierten Teil des ysb-Locus bindet; und b) Nachweisen der markierten Nucleinsäure, dadurch Nachweisen des Gens, das für die gelbe Fellfarbe verantwortlich ist und dadurch Anzeigen des Vorhandenseins eines Vestibularisausfalls bei dem Patienten.
Experimentelle Details
Es wurde eine Mauslinie (KM12) geschaffen, die eine rezessive Mutation trägt, welche durch Insertion eines Transgens verursacht wird. Diese Mäuse sind durch eine Veränderung der Fellfarbe nach Gelb und Rotationsverhalten gekennzeichnet (1).
Das gelbe Fell von KM12-Mäusen lässt eine abnorme Regulation der Pigmentsynthese vermuten. Die Haarpigmentierung bei Mäusen wird durch viele Entwicklungs- und Signalgebungsvorgänge vermittelt, bei denen Enzyme, Transcriptionsfaktoren, ein Wachstumsfaktor und sein Rezeptor, ein Membrantransportprotein, ein Hormonrezeptor und ein Antagonist der Hormonbindung beteiligt sind. Bei Mäusen hat wildtypfarbiges Haar Agouti-Färbung und enthält zwei Pigmente, wobei die Ansätze und Spitzen das schwarze Pigment Eumelanin enthalten und eine Zwischenbande Phäomelanin enthält. Zwei Gene in Mäusen, agouti (A) auf Chromosom 2 und extension (E) auf Chromosom 8, sind an der Regulation der relativen Mengen an Eumelanin und Phäomelanin in der Maus beteiligt. Mutationen in diesen beiden Loci führen bei Mäusen zu einer gelben Fellfarbe. Dominante Mutationen im A-Gen, wie lethal yellow und viable yellow, führen zu einer adipösen Maus, die vollständig oder fast ganz gelb ist, weil nur Phäomelanin produziert wird. Dagegen sind Mutationen in E, die zu einer gelben Fellfarbe führen (e), rezessiv. Sowohl der agouti- als auch der extension-Locus wurden kloniert. Das A-Gen codiert ein Polypeptid aus 131 Aminosäuren mit einer Struktur, die mit seiner vorgeschlagenen parakrinen Funktion im Einklang steht. E codiert den MSH-Rezeptor (MSH-R). Es wurde festgestellt, dass in KM12-Mäusen weder A noch E mutiert sind. Außerdem wurde das Transgen auf zwei Integrationsstellen auf dem Mäusechromosom 3 lokalisiert (7), was mit einer Mutation außerhalb des A- und des E-Locus im Einklang steht.
Das Rotationsverhalten von KM12-Mäusen lässt eine Innenohr-Fehlfunktion vermuten, die das Gleichgewicht beeinflusst. Das reife Innenohr besteht aus der Gehörschnecke, die für die Wahrnehmung von Schall verantwortlich ist (Corti-Organ), und dem Vestibularapparat, der für den Gleichgewichtssinn verantwortlich ist. Es wurden viele Gene gefunden, die die Entwicklung und Funktionen des Innenohrs regulieren, und Mutationen, die Hör- und Gleichgewichtsdefekte verursachen, wurden sowohl beim Menschen als auch bei der Maus gefunden. Diese Gene codieren verschiedene Klassen von Proteinen, wie Transcriptionsfaktoren, sezernierte Wachstumsfaktoren, Signalmoleküle, Rezeptoren, Komponenten des Cytoskeletts, intrazelluläre Transporter und Ionenkanalproteine. Obwohl mit Taubheit assoziierte Pigmentierungsdefekte (wie microphthalmia, dilute) gefunden wurden, wurden bisher bei Mäusen keine Mutationen identifiziert, die sowohl ein gelbes Fell als auch Innenohrdefekte verursachen.
Die Datenbanken wurden nach in Frage kommenden Genen und bekannten mutanten Loci auf Chromosom 3, die für das gelbe Fell und den Vestibularisausfall verantwortlich sein können, durchsucht, und es wurden keine gefunden. Die Mutation ist daher neu. Auf der Grundlage der phänotypischen Merkmale von KM12-homozygoten Mäusen wurde der mutante Locus yellow submarine (ysb) genannt.
Eine notwendige Vorbedingung, um den bzw. die molekularen Defekte in ysb-Mäusen zu definieren, besteht darin, das bzw. die mutierten Gene zu identifizieren und die phänotypischen Abnormitäten zu charakterisieren. Im derzeitigen RGC-Projekt wurde eine Analyse der vestibulären Abnormitäten in ysb-Mäusen begonnen. Abnormitäten im Hörnerv und Innenohr wurden in ysb-Embryonen gefunden. Inverses PCR wurde verwendet, um flankierende DNA aus den beiden Transgen-Insertionsstellen zu isolieren. Diese flankierenden DNAs wurden verwendet, um genomische Klone zu isolieren, die insgesamt 49 kb DNA überspannen. Southern-Analysen unter Verwendung dieser Klone zeigen, dass an der Integrationsstelle 2 ungefähr 20 kb DNA deletiert wurde. Klone für beide Integrationsstellen wurden an derselben Stelle auf Chromosom 3 lokalisiert. Die Daten lassen vermuten, dass die Transgen-Integration eine Deletion und chromosomale Inversion verursacht hat. Es wurde auch bestimmt, dass es eine rezessive Mutante auf Chromosom 3 (genannt lcc: light coat and circling; helles Fell und Rotationsverhalten) mit ähnlichen Merkmalen wie ysb gibt, die als Ergebnis einer Röntgenbestrahlung auftrat und zu ysb allel sein kann (Dr. C. Tease; MRC Mammalian Genetics Unit, Harwell), und ein Vergleich der beiden Mutanten wird gerade durchgeführt. Kreuzungen zwischen ysb- und lcc-Mäusen zeigen, dass die ysb-Mutanten die lcc-Mutation nicht komplementieren können, was stark vermuten lässt, dass die Mutationen allel sind.
Molekulargenetik, Bioinformatik, Entwicklungsbiologie, transgene und physiologische Ansätze werden verwendet, um: die Gene am +^ysb-Locus zu identifizieren und die molekularen und entwicklungsmäßigen Grundlagen, die dem oder den Defekten bei ysb-Mäusen zugrundliegen, zu studieren. Die folgenden Verfahren werden verwendet: 1) Isolierung und Charakterisierung des bzw. der +^ysb-Gene; 2) Bestimmung der natur der ysb-Mutation; 3) Durchführung von genetischen Komplementierungstests zwischen ysb- und lcc-Mäusen; 4) Durchführung von Experimenten zur transgenen Rettung; 5) Charakterisierung der Entwicklungsdefekte in den Innenohren von ysb-Mäusen unter Verwendung von dreidimensionalen Rekonstruktionsanalysen, Molekularmarkern und Chimärenstudien; 6) Charakterisierung der neurophysiologischen Veränderungen im Gleichgewichtssinn und Gehör bei ysb-Mäusen. Obwohl eine gewisse Betonung auf die Innenohrdefekte von ysb gelegt wurde, werden durch Klonieren und Charakterisieren des bzw. der ysb-Gene Einsichten in den bzw. die biochemischen und möglichen intrazellulären Signalübertragungsdefekte, die der Veränderung der Fellfarbe zugrundeliegen, gewonnen. Ungefähr 1/1000 Säuglingen sind bei der Geburt von Hörfehlern betroffen, von denen zwei Drittel eine genetische Basis haben. Etwa die Hälfte der Kinder mit Hörschäden haben auch einen Vestibularisausfall. Mäuse sind wegen der Ähnlichkeit in Struktur und Entwicklung zwischen Maus- und Humaninnenohren gute Modelle, um Hörschäden zu untersuchen. Diese Studien liefern fundamentale Informationen über die Mechanismen der Innenohrentwicklung und die molekulare Basis, durch die es bei Gleichgewichtsstörungen von Mäusen und Menschen zu Innenohrdefekten kommen kann.
Die Mauslinie KM12
Bei der Herstellung von transgenen Mäusen zerstört die Integration der exogenen DNA zuweilen die Funktion von einem oder mehreren Genen. Bei der Untersuchung der Regulation des COL2A1-Gens unter Verwendung eines rekombinanten Plasmids (pAA2), das regulatorische DNA-Sequenzen aus COL2A1 enthielt, die mit dem lacZ-Reportergen verknüpft waren (Cheah et al., 1995), wurde eine rezessive Mutation geschaffen, die durch die Insertion des Transgens verursacht wurde. Diese Mäuse sind durch eine Änderung der Fellfarbe nach Gelb und durch Rotationsverhalten gekennzeichnet, das man nur bei Nachkommen beobachtet, die homozygot in Bezug auf das Transgen sind (1, Anhang). Bei der Entwicklung von KM12-Embryonen wird das Transgen nicht nur in den Stellen exprimiert, die man für COL2A1 erwartet, sondern auch in zusätzlichen Expressionsdomänen, wie spezifischen Rhombomeren des Rautenhirns (r2,3,5), im Rückenmark, den Spinalganglien und in den Haarfollikeln der Haut. Diese neuralen und Hautexpressionsstellen sind nicht typisch für das endogene Col2a1-Gen, stehen aber mit der Fellfarbe und dem Verhaltensphänotyp von KM12-Mäusen im Einklang (2, 3).
Agouti- und gelbe Fellfarbe
Das gelbe Fell von KM12-Mäusen lässt eine anormale Regulation der Pigmentsynthese vermuten. Bei Mäusen hat wildtypfarbiges Haar Agouti-Färbung und enthält zwei Pigmente, wobei die Ansätze und Spitzen das schwarze Pigment Eumelanin enthalten und eine Zwischenbande Phäomelanin enthält. Die Regulation der Haarpigmentierung bei Mäusen wird durch viele Entwicklungs- und Signalgebungsvorgänge vermittelt, bei denen mehrere Enzyme, Transcriptionsfaktoren, ein Wachstumsfaktor und sein Rezeptor, ein Membrantransportprotein, ein an ein G-Protein gekoppelter Hormonrezeptor und ein Antagonist der Hormonbindung beteiligt sind. Diese Pigmente werden in Melanocyten von Tyrosinase synthetisiert (Übersichtsartikel in). Zwei Gene in Mäusen, agouti (A) auf Chromosom 2 und extension (E) auf Chromosom 8, sind an der Regulation der relativen Mengen an Eumelanin und Phäomelanin in der Maus beteiligt. Mutationen in diesen beiden Loci führen bei Mäusen zu einer gelben Fellfarbe. Dominante Mutationen im A-Gen, wie lethal yellow und viable yellow, führen zu einer adipösen Maus, die vollständig oder fast ganz gelb ist, weil nur Phäomelanin produziert wird. Dagegen sind Mutationen in E, die zu einer gelben Fellfarbe führen (e), rezessiv. Sowohl der A- als auch der E-Locus wurden kloniert. Das A-Gen codiert ein Polypeptid aus 131 Aminosäuren mit einer Struktur, die mit seiner vorgeschlagenen parakrinen Funktion im Einklang steht. E codiert den MSH-Rezeptor (MSH-R), ein 35-kD-Polypeptid mit sieben Transmembrandomänen, und wird in Melanocyten exprimiert. Die Aktivierung von MSH-R fördert die Eumelaninsynthese, während das agouti-Protein die Phäomelaninsynthese verstärkt.
Gene und Innenohrdefekte
Viele taube Mausmutanten sind durch das klassische Shaker/Waltzer-Verhalten von Rotation, Zurückwerfen des Kopfes und Hyperaktivität gekennzeichnet. Das Rotationsverhalten von KM12-Mäusen lässt eine Innenohr-Fehlfunktion vermuten, die den Gleichgewichtssinn und das Gehör beeinflusst. KM12-Mäuse zeigen auch andere Merkmale von Innenohrdefekten, wie Zurückwerfen des Kopfes und eine Unfähigkeit zu schwimmen (4). Außerdem zeigen KM12-Mäuse eine anormale Streckreaktion. Wenn sie am Schwanz hochgenommen werden, strecken KM12-Mäuse ihre Gliedmaßen nicht aus wie normale Mäuse, sondern krümmen sich zum Bauch hin ein (5, Anhang). KM12-Mäuse zeigen zwar eine gewisse Reaktion auf scharfe Geräusche (Preyer-Reflex), doch scheint diese nicht so stark zu sein wie bei Wildtypmäusen. Daher ist es möglich, dass KM12-Mäuse partiell hörgeschädigt sind. Physiologische Tests, die das endocochleäre Potential (EP) und das Summenaktionspotential (CAP) messen, zeigen, dass ysb-Mäuse taub sind und dass ysb/lcc-Compound-Heterozygote stocktaub sind. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Stria vascularis nicht richtig funktioniert, und dass die Aktivität des Nervus cochleae als Reaktion auf ein Geräusch ebenfalls anormal ist.
Das Innenohr ist ein komplexes Sinnesorgan, das sich aus einem aus einer einzelnen Zellschicht bestehenden Epithel (Ohrplakode) entwickelt, das sich durch eine Reihe von Zell- und Gewebebewegungen einstülpt und unter Bildung des Ohrvesikels schließt. Weitere morphogenetische Bewegungen und mehrstufige Induktionsereignisse, die die Differenzierung und Proliferation regulieren, führen zur Bildung des Organs für das Gehör und den Gleichgewichtssinn. Das reife Innenohr besteht aus der Gehörschnecke, die für die Wahrnehmung von Schall verantwortlich ist (Corti-Organ), und dem Vestibularapparat, der für den Gleichgewichtssinn verantwortlich ist. Von vielen Genen wurde gezeigt, dass sie im sich entwickelnden Innenohr exprimiert werden. Dazu gehören Gene, die Transcriptionsfaktoren (z.B. Nkx5.1/hmx3, Nkx5.2/hmx2, otx-1, msx1, pax2, kreisler usw.), sezernierte Faktoren (z.B. Bmp4, fgf3, fgf2, bdnf), Rezeptoren (z.B. EphA4, trkA, trkB, trkC, Ednrb, PTHrpR), Cytoskelettproteine, wie unkonventionelle Myosine (z.B. Myo7a, myo15 usw.), codieren.
Innenohrdefekte wurden auf einen oder mehrere von drei Typen von Abnormitäten zurückgeführt: morphogenetisch, cochleosakkulär und neuroepithelial. Morphogenetische Defekte werden durch Entwicklungsabnormitäten in der Struktur des Innenohrs (Labyrinth) verursacht. Cochleosakkuläre Abnormitäten entstehen aus Defekten im sekretorischen Epithel des Ductus cochlearis. Neuroepitheliale Defekte ergeben sich daraus, dass das Sinnesepithel die normale Reifung nicht vollendet. Außerdem kann eine abnorme Rautenhirnentwicklung zu einem Vestibularisausfall führen. Zum Beispiel sind kreisler-Mäuse durch Taubheit und Rotationsverhalten bei adulten Tieren und durch Abnormitäten in der Positionierung der Ohrbläschen und der Segmentierung des Rautenhirns gekennzeichnet.
Mäuse sind wegen der Ähnlichkeit in Struktur und Entwicklung zwischen Maus- und Humaninnenohren gute Modelle, um Hörschäden zu untersuchen. Von Mutationen in mehreren Genen, die im Innenohr exprimiert wurden, wurde gezeigt, dass sie bei Menschen und Mäusen Hör- und/oder Gleichgewichtsstörungen verursachen. Dazu gehören Myo7a, Myo15, kreisler, hmx3 (nkx5.1), fgfr3 und andere.
Die folgenden Verfahren werden durchgeführt: a) Charakterisierung von Abnormitäten im Rautenhirn und der Ohrentwicklung bei KM12-Mäusen und b) Isolieren der DNA-Sequenzen an der bzw. den Integrationsstellen des Transgens bei KM12-Mäusen.
Yellow submarine: ein neuer mutanter Locus
Die rezessive Natur des mutanten Phänotyps lässt vermuten, dass das Transgen nicht in das A-Gen integriert wurde.
Die Insertion des Transgens in die codierenden Sequenzen der MSH-R-, ACTH-R-, agouti- und kreisler-Gene wurde getestet, da gezeigt wurde, dass diese für die agouti-Fellfarbe oder die Innenohrentwicklung wichtig sind. Southern-Blot-Analysen der DNA von KM12-Mäusen unter Verwendung von Sonden für die kreisler-, agouti-, E- und ACTHR(Mc2r)-Gene [Spenden von Dr. G. Barsh (UCSF), Dr. R. Woychik (Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge) und Dr. R. Cone (Oregon Health Sciences University, Portland)] zeigen, dass die codierenden Sequenzen dieser Gene nicht von dem Transgen unterbrochen wurden (6). Diese Ergebnisse schließen daher die Chromosomen 2 (agouti, kreisler), 8 (E) und 18 (Mc2r) aus.
Unter Verwendung des gesamten Transgens und seiner Endfragmente als Sonden in Southern-Blot-Analysen haben wir bestimmt, dass 3 Kopien des Transgens in 2 Stellen im Genom integriert wurden. Es gibt zwei Kopien des Transgens in Kopf-Schwanz-Anordnung an einer Integrationsstelle (Int. 1) und eine Kopie an der anderen (Int. 2) (zusammengefasst in 7, Anhang). Da der Fellfarben- und der Verhaltensphänotyp jedoch über ungefähr 176 Meiosen (6 Generationen) nicht segregiert sind, hat das Transgen vielleicht eine Umordnung und/oder Deletion eines Teils des Chromosom verursacht. Daher könnten der Fellfarben- und der Verhaltensphänotyp von KM12-Mäusen durch die Mutation von einem oder mehreren Genen verursacht sein.
Die chromosomale Zuordnung des KM12-Transgens ist ein wesentlicher und informativer erster Schritt bei der Definition der Natur der Mutation. Das Transgen wurde durch FISH auf zwei Integrationsstellen auf dem Mäusechromosom 3 lokalisiert, was mit den Southern-Analysen im Einklang steht (7, 8). Die Daten stehen auch mit den Ergebnissen im Einklang, die die Loci A, E und kreisler ausschließen.
Bisher wurden bei Mäusen keine Mutationen identifiziert, die sowohl ein gelbes Fell als auch Innenohrdefekte verursachen. Die Datenbanken wurden nach in Frage kommenden Genen und bekannten mutanten Loci auf Chromosom 3, die für das gelbe Fell und den Vestibularisausfall verantwortlich sein können, durchsucht, und es wurden keine gefunden. Die Mutation ist daher neu. Auf der Grundlage der phänotypischen Merkmale von KM12-homozygoten Mäusen wurde der mutante Locus yellow submarine (ysb) genannt (homozygote Mutanten werden im Folgenden als ysb und der Wildtyp als +^ysb bezeichnet; Leung, K.K., S. Dong, A. Tang, H. Heng, L.C. Tsui, P.P.L. Tam & K.S.E. Cheah, Yellow submarine (ysb), a newly discovered locus regulating hair colour and inner ear function; Manuskript in Vorbereitung).
Charakterisierung des ysb-Phänotyps
Ysb-Mäuse sind ein wertvolles Modell, um Moleküle zu identifizieren, die an der Kontrolle der Pigmentierung und des Gleichgewichtssinns beteiligt sind. Die strukturellen Abnormitäten bei ysb-Mäusen wurden analysiert. Der Phänotyp und das Expressionsmuster des Transgens in ysb-Mäusen weisen darauf hin, dass eine Integration des Transgens eine rezessive Mutation verursacht hat, die die Regulation der Pigmentierung beeinflusst und auch eine abnorme Innenohrentwicklung verursacht. Die Studien konzentrierten sich am Anfang auf die Innenohrabnormitäten bei ysb-Mäusen.
Struktur von Rautenhirn und Kranialnerv
Bei der Embryogenese der Wirbeltiere ist der Vorgang der Segmentierung, bei dem sich wiederholende Blöcke von Gewebe entlang der von vorn nach hinten verlaufenden Körperachse entstehen, für die Musterbildung und Differenzierung fundamental. Bei der Entwicklung des Rautenhirns erfolgt eine Segmentierung mit Bildung von Rhombomeren im neuralen Epithel. Eine ausführliche Studie von kreisler-Embryonen unter Verwendung von Markern für die Rautenhirnsegmentierung, wie Knox-20- und Hox-Genen, hat gezeigt, dass die kreisler-Mutation wahrscheinlich auf die Folgen einer abnormen Segmentierung des Rautenhirns zurückzuführen ist, die zu einem Verlust der Rhombomere (r) 5 und 6 führt. Knox-20 ist ein geeigneter Marker für die Rautenhirnsegmentierung, der normalerweise an den Tagen 9,0-9,5 in r3 und r5 exprimiert wird, und in r3 von ysb-Embryonen wurde eine lacZ-Expression beobachtet. Um zu bewerten, ob der Phänotyp von ysb-Mäusen mit einem Problem der Rautenhirnentwicklung assoziiert ist, wurde anfangs das Expressionsmuster von Knox-20 bei heterozygoten und homozygoten, 9,0-9,5 Tagen alten Embryonen durch in-situ-Hybridisierung im Totalpräparat und an Schnitten untersucht und mit dem des Wildtyps verglichen. Die in-situ-Hybridisierung am Totalpräparat zeigte keine Veränderungen in der Rhombomerenentwicklung von Krox-20-mRNA in homozygoten und heterozygoten zum Zeitpunkt 9,5 dpc (9). Dies ist anders als bei der kreisler-Mutante, was vermuten lässt, dass die Mutation insgesamt keine schweren Veränderungen in den Rhombomeren 3 und 5 verursacht hat.
Immunfärbungsstudien am Totalpräparat von 10,5 Tage alten ysb-Embryonen unter Verwendung eines Antikörpers (2H3) gegen Neurofilament zeigten bei homozygoten Mutanten eine Reduktion des VIII. Nervs (der den Vestibularnerv ergibt), während die anderen Kranialnerven normal schienen (10, Anhang). Heterozygote erschienen normal, obwohl der VIII. Nerv im Vergleich zum Wildtyp dünner erschien. Dieses Ergebnis steht mit dem Vestibularisausfall bei den ysb-Mäusen im Einklang. Die Mutation könnte daher a) die Fähigkeit des VIII. Nervs, zur Ohrkapsel hin zu wachsen, beeinflusst haben; b) bewirkt haben, dass am Anfang nicht die volle Zahl der Vorläufer von der Otocyste weggewandert ist; oder c) einen abnormen Zelltod (Apoptose) verursacht haben.
Innenohrmorphologie
Um zu bestimmen, ob es bei homozygoten ysb-Mäusen irgendwelche Innenohrfehlbildungen gibt, wurden dreidimensionale Rekonstruktionen des Innenohrs der Mäuse unter Verwendung von histologischen seriellen Schnitten erzeugt. Dreidimensionale Rekonstruktionen von Bildern von Schnitten der Ohren von Wildtyp-, heterozygoten und homozygoten ysb-Feten zum Zeitpunkt 16,5 dpc (dies post coitum; Tage nach der Paarung) wurden durchgeführt. Daraufhin wurde das Lumen eingezeichnet, um einen Eindruck von der gesamten Struktur des Labyrinths zu erhalten. Die Daten zeigen Defekte am oberen und seitlichen Bogengang und an der Ampulle bei zwei ysb-Feten, wobei einer schwerer betroffen ist als der andere (Anhang, 11).
Die Rekonstruktionen des Lumens bei zwei homozygoten 16,5-dpc-ysb-Feten zeigen, dass der obere und der seitliche Bogengang verkürzt waren und ihre Ampullen fehlten. Nach 16,5 dpc sind die sensorischen Bereiche von nichtsensorischen Bereichen zu unterscheiden, da die Zellen zu einem mehrreihigen Epithel differenziert sind. Dieses Epithel erscheint wegen der zwei oder mehr Schichten von Zellkernen dicker als das umgebende Epithel. Da dieser Unterschied leicht mit dem Lichtmikroskop beobachtet werden konnte, wurden diese verdickten Bereiche nachgezogen und auf das Lumen von Ohren gezeichnet, die zuvor rekonstruiert worden waren (12, Anhang). Die verschiedenen Arten von sensorischen Bereichen einschließlich des Corti-Organs (Schalldetektor), der Maculae (Detektoren der linearen Bewegung) und der Cristae (Detektoren der Drehbewegung) sind in verschiedenen Farben dargestellt, um leichter aufzuzeigen, welche sensorischen Bereiche betroffen sind.
Die Hinzufügung der sensorischen Information zu diesen Rekonstruktionen zeigte, dass mehrere verschiedene Typen von sensorischen Bereichen bei dem homozygoten Fetus abnorm waren. Die obere und die seitliche Crista, die sich in den Ampullen befinden, fehlten (4, Anhang). Diese Beobachtung steht mit der früheren Beobachtung in Einklang, dass die Ampullen fehlten. Die ausführliche Analyse von Sinnesepithelien zeigte auch, dass es keine ektopische Bildung dieser Cristae gab. Beide Maculae schienen ebenfalls von der Mutation beeinflusst zu sein: die utrikuläre Macula zeigte fast keine Verdickung im erwarteten Bereich, und die sakkuläre Macula zeigte zwar eine gewisse Verdickung, erschien jedoch abnorm. Der einzige vestibuläre Fleck, der normal erschien, war die hintere Crista. Das Hörorgan, das Corti-Organ, erschien zu diesem Zeitpunkt der Entwicklung ebenfalls normal. Beim heterozygoten Fetus wurden unter Verwendung dieses Analyseverfahrens keine Abnormitäten beobachtet, und das Wildtyp-Wurfgeschwister (+/+) wurde als Kontrolle verwendet. Die Rekonstruktion von Schnitten aus 13,75-dpc-Feten zeigte einen ähnlichen Defekt in den Bogengängen (13).
Isolierung und Charakterisierung von Transgen-Integrationsstellen
7 fasst den Fortschritt bei der Isolierung des Wildtyplocus an der Transgen-Integrationsstelle zusammen. Durch Primerassoziation innerhalb des Transgens wurde inverse PCR verwendet, um DNA-Sequenzen zu isolieren, die die Integrationsstellen flankieren (7). Zwei PCR-Produkte von 350 bp (Spel-1) und 600 bp (Spel-2) wurden für die Integrationsstellen 1 bzw. 2 erhalten. Eine Sequenzanalyse (14) zeigte die Anwesenheit eines möglichen PolyA-Befestigungssignal in Spel-1, aber eine BLAST-Recherche in genomischen und EST-Datenbanken zeigte keine signifikanten Übereinstimmungen. Für die Integrationsstelle 1 wurde eine längere 5'-flankierende Sequenz (1,8 kb) und für die Stelle 2 eine 3'-flankierende Sequenz (500 bp) erhalten.
Eine Southern-Blot-Hybridisierung unter Verwendung der flankierenden Sequenzen für beide Integrationsstellen zeigte, dass eine Deletion an der Integrationsstelle 2, aber nicht an Stelle 1 stattgefunden hatte (15). Dann wurden diese PCR-Fragmente verwendet, um eine normale genomische 129-Maus-λ-Phagen-Bibliothek zu durchmustern. Für die Integrationsstelle 1 wurden vier überlappende genomische Klone erhalten. Für die Integrationsstelle 2 wurden zwei genomische Klone erhalten. Bei der weiteren Durchmusterung wurden zwei weitere Klone isoliert. Insgesamt wurden genomische Sequenzen, die 19 kb bzw. 30 kb überspannten, an den Integrationsstellen 1 bzw. 2 isoliert. Southern-Analysen unter Verwendung dieser genomischen Klone als Sonden zeigten, dass an der Integrationsstelle 2 ungefähr 20 kb DNA deletiert wurden (16). Ein Klon für die Integrationsstelle 2 hybridisierte in Northern-Analysen mit mRNA von einem 15,5-dpc-Mausfetus. Die genomischen Klone für die Integrationsstellen 1 und 2 sind in demselben Bereich von Chromosom 3 colokalisiert, was vermuten lässt, dass möglicherweise auch eine Chromosomeninversion stattgefunden hat (7). Diese Ergebnisse würden erklären, warum die beiden Transgen-Insertionen über so viele Meiosen hinweg nicht segregiert sind. Die Sequenz von 8114 bp (in ein Plasmid pPLS kloniert) innerhalb des 20-kb-Bereichs, der an der Integrationsstelle 2 in ysb deletiert ist, wurde bestimmt (17). Dieser Bereich enthält Sequenzen mit 90% bzw. 100% Homologie zu den IMAGE-Klonen 1196866 und 636096 in der EST-Datenbank (17). Die Positionen dieser IMAGE-Klonsequenzen innerhalb von pPLS sind in 18 zusammengefasst.
Das bzw. die ysb-Gene werden identifiziert und charakterisiert, und die molekularen und entwicklungsmäßigen Grundlagen, die dem oder den Defekten bei ysb-Mäusen zugrundliegen, werden studiert. Dazu wird auf den derzeitigen Ergebnissen aufgebaut, und Molekulargenetik, Bioinformatik, Entwicklungsbiologie, transgene und physiologische Ansätze werden verwendet, um: a) das bzw. die +^ysb-Gene und die codierten Transcripte zu identifizieren und zu charakterisieren; b) die Natur der ysb-Mutation zu bestimmen; c) genetische Komplementierungstests und transgene Rettungsexperimente durchzuführen; d) die Entwicklungsdefekte bei den Innenohren von ysb-Mäusen unter Verwendung von dreidimensionalen Rekonstruktionsanalysen, Molekularmarkern und Chimärenstudien näher zu charakterisieren; e) neurophysiologische Veränderungen im Gleichgewichtssinn und Gehör zu charakterisieren.
Diese Studien liefern fundamentale Informationen über die Mechanismen, durch die es zu Innenohrdefekten kommen kann.
Verfahren
Molekulare Klonierung und Charakterisierung der Sequenz des Wildtyp- und des mutanten ysb-Locus
1 Genentdeckung und -charakterisierung am ysb-Locus:
Mehrere Ansätze werden verwendet, um Gene am ysb-Locus zu identifizieren.

a. Bioinformatik: Die isolierten genomischen Klone werden sequenziert, und die Daten werden unter Verwendung von Bioinformatik-Tools auf die Anwesenheit von potentiellen Exons analysiert. Diese Vorhersagen sind sehr wichtig, um zu verfolgende Bereiche zu identifizieren.
b. Exprimierte Gensequenzen werden unter Verwendung einer Kombination von Ansätzen identifiziert. Zuerst werden DNA-Fragmente, die Exonsequenzen enthalten, mit Northern-Analysen durchmustert. Sobald solche Fragmente identifiziert sind, werden Exon-Trapping-Ansätze verwendet, um Bereiche mit transcribierten Sequenzen zu identifizieren. Potentielle exonhaltige Fragmente werden bei in-situ-Hybridisierungsstudien verwendet, und das Expressionsmuster wird mit dem des Transgens in ysb-Mäusen verglichen.

Um Einsichten in die Funktion des bzw. der Gene zu gewinnen, verwenden wir außerdem Bioinformatik-Tools, um in anderen Modellgenom-Datenbanken, z.B. Hefe, Fliege, Wurm, Fisch und Mensch, nach homologen Sequenzen zu suchen.
2. Klonierung des mutanten Locus Aufbau einer genomischen Bibliothek:
Um die Transgen-Integrationsstellen zu isolieren, wird eine genomische Cosmidbibliothek aus DNA aufgebaut, die aus homozygoten ysb-Mäusen isoliert wurde. Das Cosmid, pCos8 (Spende von Dr. A.-M. Frischauf, Imperial Cancer Research Fund, London), wird als Vektor beim Aufbau der Bibliothek verwendet. Dieser Vektor enthält keine IacZ-Sequenzen, und seine Verwendung hilft, die Isolierung von falsch positiven Klonen während der Durchmusterung der Bibliothek zu minimieren. Primärkulturen von Embryo-Fibroblasten aus KM12-homozygoten Mäusen werden angelegt und als Quelle für genomische DNA hohen Molekulargewichts verwendet. Die Cosmidbibliothek wird mit Standardverfahren aufgebaut. Um eine hohe Effizienz der Cosmidverpackung zu gewährleisten, werden getestete Verpackungsmischungen (z.B. Gigapack Gold von Stratagene) von kommerziellen Quellen erhalten. DNA-Sonden, die das 5'- und das 3'-Ende des Transgens abdecken, und lacZ-Sequenzen werden verwendet, um die Bibliothek durch Koloniehybridisierung zu durchmustern. Cosmidbibliotheken und isolierte Gene wurden in der Vergangenheit erfolgreich aufgebaut.
3. Charakterisierung von genomischen Klonen und des mutanten Locus:
Die Cosmide werden durch Restriktionsenzym-Kartierung und Southern-Blot-Analysen unter Verwendung der geeigneten Sonden in Bezug auf die Anwesenheit des Transgens charakterisiert. Sobald ein oder mehrere Cosmide, die das Transgen enthalten, identifiziert sind, werden Subklone hergestellt, und die Natur der Sequenzen, die sowohl das 5'- als auch das 3'-Ende der Insertionsstelle flankieren, werden durch DNA-Sequenzierung bestimmt. Dann werden die erhaltenen Sequenzen unter Verwendung von Bioinformatik-Tools analysiert, um potentielle offene Leseraster (ORFs) zu finden, und werden auch verwendet, um die Nucleotid- und Aminosäuresequenz-Datenbanken nach homologen Sequenzen abzusuchen. Die ysb-Klone werden verwendet, um genomische DNA von den Harwell-Mutanten zu analysieren. Um zu bestimmen, ob die ysb- und die Harwell-Mutante allel sind, wird ein Komplementierungstest durchgeführt, indem man die beiden Mutanten miteinander kreuzt. Wenn die zwei Mutanten sich nicht komplementieren, ist diese Information für die Identifizierung des verantwortlichen Gens nützlich, da zwei verschiedene Allele verfügbar wären. Weiterhin beinhalten beide Mutanten zwei mögliche Mutationsstellen, und die Nichtkomplementierung reduziert die Zahl der auf molekularem Niveau zu untersuchenden Stellen sofort, da es nur einen einzigen chromosomalen Überlappungsbereich zwischen den beiden Mutationen gibt.
4. Genetische Rettungsexperimente
Die Expression von BACs in transgenen Mäusen wurde erfolgreich verwendet, um Taubheit bei shaker-2-Mäusen zu korrigieren. Um festzustellen, ob die charakterisierten Sequenzen diejenigen sind, die in ysb mutiert sind, werden Klone mit bakteriellen künstlichen Chromosomen (BAC) durchmustert, wobei man die genomischen Klone für die Integrationsstelle 2 als Sonde verwendet. Wir testen die Fähigkeit von BAC-Klonen, die den ysb-Locus überspannen, den Phänotyp von ysb-Mäusen durch Transgenese zu retten. Es wäre auch wichtig, den ysb-Locus mit demjenigen der Harwell-Mutante zu vergleichen.
5. Isolierung von humanem ysb
Das Ziel besteht darin, testen zu können, ob irgendein humaner Vestibularisausfall durch Mutationen im humanen Homologen von ysb verursacht ist. Daher ist es wichtig, humane BAC-Klone zu isolieren, die den äquivalenten ysb-Locus abdecken. Die genomischen Mausklone werden verwendet, um eine humane BAC-Bibliothek zu durchsuchen. Sobald diese isoliert sind, werden sie wie bei den Mausklonen in Bezug auf Sequenz usw. charakterisiert. Ein Vergleich zwischen den humanen und den Mausklonen wird angestellt. Sobald in Frage kommende humane Klone isoliert sind, werden ihre chromosomalen Orte kartiert, und die Mutanten-Datenbanken (z.B. OMIM; Online Mendelian Inheritance in Man) werden nach möglichen assoziierten Störungen beim Menschen durchsucht. Die Verfügbarkeit von humanen Klonen ist eine Ressource für zukünftige Studien an humanen Patienten mit Hör- und Gleichgewichtsproblemen.
6. Morphologische und Entwicklung-sanalysen
Aus den Rekonstruktionen des Lumens von 13,75 und 16,5 Tagen alten Feten ging hervor, dass der obere und der seitliche Bogengang bei der homozygoten Mutante verkürzt waren und ihre Ampullen fehlten. Um den zeitlichen Eintritt der Entwicklungsabnormität nachzuvollziehen, werden die Köpfe von elf 12,5 Tage alten Feten und Neugeborenen von nichttransgenen Kontroll- und ysb-Mäusen fixiert und für die dreidimensionale Rekonstruktion verarbeitet. Die Struktur der Innenohren wird mit Hilfe von Software in drei Dimensionen rekonstruiert.
Um zu bestimmen, wann die abnorme Morphogenese der Bogengänge zuerst in Erscheinung tritt, wurde die Morphologie der Ohren von ysb-Embryonen nach 11, 13 (ein kritischer Zeitpunkt bei der Bogengangbildung) und 16,5 dpc sorgfältig herausseziert, gesäubert, und das Lumen wurde mit weißer Farbe gefüllt und dann auf Abnormität untersucht. Diese Technik sorgt für eine schnelle und genaue Visualisierung der dreidimensionalen Struktur des Ohrs, so dass die Variabilität im homozygoten Phänotyp bewertet und subtile Effekte bei Heterozygoten bewertet werden können. Die Statolithen in der extrazellulären Matrix, die auf den Haarzellen der Maculae liegen, lassen sich nach der Säuberung und vor dem Einspritzen von Farbe leicht beobachten. Es wird untersucht, ob sich diese Matrix in der Mutante normal bildet, da die Maculae nach 16,5 dpc abnorm erscheinen. Die Innenohren nach 18 dpc werden ebenfalls durch Rasterelektronenmikroskopie untersucht, um zu bestimmen, ob es irgendwelche Abnormitäten in der Verteilung und Struktur der Sinneszellen gibt.
Außerdem wird eine sorgfältige in-situ-Hybridisierungsanalyse durchgeführt, um bei ysb- und Wildtypembryonen die Expression von Genen zu vergleichen, die bekanntermaßen eine Rolle bei der Innenohrentwicklung spielen, wobei man Molekularmarker, wie Hox-Gene (Hoxa3, Hoxb1 und Hoxb2), Fgf3, nkx5.1, otx1, Bmp4, Trkb, Trkc, NT-3, BDNF, neurogeninI verwendet, und zwar aus den folgenden Gründen. Bei kreisler-Mäusen wurde gezeigt, dass der Defekt die Folge einer abnormen Segmentierung des Rautenhirns ist. Das hox-Gen und fgf3-Sonden werden verwendet, um die Rautenhirnentwicklung bei ysb-Mäusen zu untersuchen. In-vitro-Fate-Mapping zeigte, dass die seitliche Hälfte der Otocyste zu den Bogengängen und Cristae führt. Nkx5.1 wird im dorsolateralen Teil der Otocyste (und später in den Bogengängen) exprimiert, und eine Inaktivierung des Gens beeinflusst die Bogengänge. Otx-1 wird postereo-lateral in der Otocyste exprimiert, und der seitliche Bogengang fehlt, wenn das Gen in Mäusen ausgeschaltet wird. Da im ventro-lateralen Teil des Ohrenepithels bei 9,5 Tage alten ysb-Embryonen eine Xgal-Färbung gefunden wurde, wird die Expression dieser Gene untersucht, um zu bestimmen, ob das bzw. die ysb-Gene stromaufwärts oder stromabwärts dieser beiden Gene wirken. BMP4 wird als Marker verwendet, um die Cristae, Sinnesbereiche des Ohrs, zu untersuchen.
Mehrere neurotrophe Faktoren (z.B. BDNF und NT-3) und ihre Rezeptoren (Trkb, Trkc) sind für die frühe Entwicklung des Innenohrs wichtig. Sie regulieren das Überleben von vestibulären und cochleären Neuronen und der Neuronen, die das Innenohr innervieren. Da der VIII. Nerv bei ysb-Mäusen verkümmert ist, wird die Expression dieser Gene ebenfalls untersucht. Vor kurzem wurde gezeigt, dass das neurogeninI-Gen für die Bestimmung von neuronalen Vorläufern für die proximalen kranialen sensorischen Ganglien wesentlich ist und ein guter Marker zur Untersuchung der prospektiven Ganglienzellen bei ysb-Mäusen sein wird. Dieselben Marker werden verwendet, um die harwell- und die ysb-Mutante miteinander zu vergleichen, falls die Komplementierungstests beweisen sollten, dass sie allel sind (siehe oben).
7. Ursprung von Entwicklungsabnormitäten
Die Entwicklungsanalyse von markierten ES-Zellen in Mauschimären ist ein starker Ansatz, um das Zellschicksal und die zellklonspezifische Genfunktion zu untersuchen. Die Tatsache, dass der Locus der ysb-Mutante durch lacZ markiert ist, wird ausgenutzt, um die zellklonspezifische Genfunktion herauszuarbeiten sowie zu testen, ob der Gendefekt zellautonom oder nichtautonom ist.
Aus ysb-Blastocysten werden embryonale Stammzellen hergestellt und verwendet, um durch Blastocysteninjektion Chimären zu erzeugen. Analysierte chimärische Embryonen (5-10 pro Stadium) werden in den Entwicklungsstadien zwischen 9,5 dpc und der Geburt eingesammelt, und der relative Beitrag von ES-Zellen zur Entwicklung des Innenohrs gemäß der Beurteilung anhand der lacZ-Expression in den Chimären wird untersucht. Der präferentielle Verlust oder die Unterrepräsentierung des ysb-ES-Zell-Beitrags an bestimmten Stellen in dem sich entwickelnden Innenohr weist auf spezifische Veränderungen der Potenz des Zellklons hin. Die Zellklone werden durch in-situ-Hybridisierungen unter Verwendung der oben beschriebenen geeigneten Molekularmarker charakterisiert.
8. Neurophysiologie des Gleichgewichtssinns und Gehörs bei ysb-Mäusen
Die Neuronen, die das Innenohr innervieren, sind von der Ohrplakode abgeleitet. Diese Neuronen entstehen schon früh in der Entwicklung des Innenohrs aus der Plakode und bilden das akustische und das vestibuläre Ganglion. Die Neurofilament-Färbeexperimente hatten eine Reduktion des achten kranialen Nervs bei 10,5 Tage alten ysb-Embryos gezeigt, was vermuten lässt, dass die fehlende Innervierung des Innenohrs eine Ursache des Gleichgewichts- und/oder Hörproblems bei ysb-Mäusen sein könnte. Es ist wichtig, zu bewerten, ob die ysb-Mäuse (a) Kopfbewegungssignale und (b) Hörsignale effektiv zum Zentralnervensystem befördern können oder nicht. Die Expression von c-fos wird als Indikator für funktionell aktivierte neuronale Aktivität im Hirnstamm verwendet. Die Fos-Expression als Indikator für eine postsynaptische Stimulation ist ein etabliertes Verfahren zum Identifizieren von funktionellen Verbindungen zwischen peripheren sensorischen Rezeptoren und zentralen Neuronen. Daher wird eine Fos-Immunfärbung von Hirnschnitten verwendet, um die zentralen Neuronen zu kartieren, die am funktionellen Neuralweg beteiligt sind.
9. Vestibuläre Experimente
Natürliche vestibuläre Stimulierungen werden verwendet, d.h. wellenförmige Drehungen um die Gier- und Längsneigungsachse und Drehungen mit konstanter Geschwindigkeit um eine andere als die vertikale Achse. Erstere stimulieren die jeweiligen Paare von Bogengängen, während letztere selektiv die utrikulären Haarzellen nacheinander aktivieren. Mit diesen Stimulationsmodi sollten sekundäre Neuronen im Vestibulariskern, die eine funktionale Verbindung mit Haarzellen auf den jeweiligen Bogengangpaaren oder den utrikulären Maculae aufweisen, erregt werden und Fos exprimieren. Immunhistochemische Techniken, die c-fos beinhalten, werden verwendet, um das Muster der postsynaptischen Vestibularisstimulierung innerhalb der Vestibulariskerne und anderer Teile des Hirnstamms zu kartieren. Um das spinale Projektionsmuster von Fos-exprimierenden zentralen vestibulären Neuronen zu bestimmen, werden Hirnschnitte auf Neuronen untersucht, bei denen die Fos-Immunfärbung und retrograd transportierte Rhodamin-markierte Latexbeads (zuvor in das Rückenmark injiziert) colokalisiert sind.
Da Anästhetika bekanntermaßen die Niveaus der Fos-Expression beeinflussen, werden unbetäubte Tiere verwendet. Kontrollexperimente werden durchgeführt, um zu gewährleisten, dass die beobachteten Ergebnisse spezifisch auf die Aktivierung der Bogengang- und Otolithrezeptoren zurückzuführen sind: (a) intakte Mäuse befestigt, aber ohne Drehung; (b) akut labyrinthektomisierte Mäuse befestigt, aber ohne Drehung; und (c) akut labyrinthektomisierte Mäuse befestigt und dann in Drehung versetzt. Da die Expression von c-fos auch durch andere Sinnesreize als die in dieser Studie absichtlich erzeugten induziert werden kann, wird darauf geachtet, unkontrollierte Variablen und andere sensorische Einflüsse zu minimieren. Kontrollmäuse mit einer Scheinoperation am Rückenmark werden ebenfalls präpariert.
10. Hörexperimente
Diese Studien werden in Verbindung mit den Vestibularisexperimenten durchgeführt. Der Hörweg wird durch wiederholte Reizmodelle unter Verwendung von Tone-Burst-Signalen aktiviert. Die Schallreizung wird in einer abgedunkelten schalldichten Kammer durchgeführt. Jede sich frei bewegende Maus wird mit reinen Tone-Burst-Signalen konfrontiert, die von der Decke der Kammer aus abgegeben werden. Die funktionelle Verbindung zwischen zentralen Neuronen und den peripheren Hörrezeptoren wird durch Fos-Expression angezeigt. Diese Experimente liefern Informationen über das Aktivierungsmuster von Neuronen im zentralen Hörweg.
11. Zusätzliche Tests der Vestibularis/Hör-Funktion und Verhaltensstudien
Die folgenden Studien ergänzen die neurophysiologischen Studien und vergrößern den Umfang der Untersuchung erheblich, was die Definition des bzw. der zugrundeliegenden Defekte bei ysb-Mäusen erleichtert. Unter Verwendung der ysb-Maus wird eine Zuchtkolonie etabliert, um Mutanten für die Studie zu erhalten. Die Folgen der Vestibularisausfälle für das Verhalten werden unter Verwendung einer Standardbatterie von einfachen Gleichgewichtstests beschrieben, einschließlich Lagekorrekturreaktion bei Kontakt, Test mit erhöhter Plattform und Test im offenen Feld, Streckreaktion, Preyer-Reflex, und das Ausmaß und der Typ der Verhaltensabnormität werden quantifiziert. Die Funktion der Cochlea bei jungen adulten ysb und Wurfgeschwisterkontrollen wird bestimmt, indem man Schwellen für den Nachweis eines von der Cochlea ausgehenden Summenaktionspotentials als Reaktion auf Tone-Bursts bei verschiedenen Frequenzen und mit verschiedenen Intensitäten misst. Dieser Ansatz gibt einen Hinweis auf irgendwelche Hörschäden in der Mutante.
Die molekulare Klonierung und Charakterisierung der potentiellen ysb-Klone wird durchgeführt. Dreidimensionale Rekonstruktionen an 11 Tage alten ysb-, heterozygoten und Wildtyp-Feten und Neugeborenen werden durchgeführt. In-situ-Hybridisierungsexperimente werden durchgeführt. Die detaillierte Restriktionskarte der genomischen Klone, die für den ysb-Locus isoliert wurden, wird hergestellt, und dann werden die Klone durch Northern-Analysen auf die Anwesenheit von exprimierten Sequenzen getestet. Mit Hilfe von Bioinformatik werden die erhaltenen DNA-Sequenzen analysiert.
Literatur

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Claims

Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das ein Segment der Region A2 des Mauschromosoms 3 umfasst, wobei das Segment eine Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 4 umfasst.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das ein Segment der Region B-C des Mauschromosoms 3 umfasst, wobei das Segment eine Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 umfasst.
Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Nucleinsäuremolekül markiert ist.
Replizierbarer Vektor, der das Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 oder 2 umfasst.
Vektor gemäß Anspruch 4, wobei der Vektor ein Plasmid, ein Cosmid, ein Lambdaphage, ein YAC, ein BAC oder ein PAC ist.
Wirtszelle, die den Vektor gemäß Anspruch 4 umfasst.
Wirtszelle gemäß Anspruch 6, wobei die Wirtszelle eine Bakterienzelle oder eine eukaryontische Zelle ist.
Verfahren zur Bestimmung einer Innenohr-Funktionsstörung bei einem Patienten, umfassend: a) In-Kontakt-Bringen einer Nucleinsäureprobe von dem Patienten mit dem Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3; und b) Bestimmen, ob das Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3 an die Nucleinsäureprobe von dem Patienten gebunden ist, wobei die Tatsache, dass das Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3 gebunden ist, eine Innenohr-Funktionsstörung bei dem Patienten anzeigt.
Verfahren zur Bestimmung einer Pigmentierungs-Funktionsstörung bei einem Patienten, umfassend: a) In-Kontakt-Bringen einer Nucleinsäureprobe von dem Patienten mit dem Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3; und b) Bestimmen, ob das Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3 an die Nucleinsäureprobe von dem Patienten gebunden ist, wobei die Tatsache, dass das Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3 gebunden ist, eine Pigmentierungs-Funktionsstörung bei dem Patienten anzeigt.
Verfahren zur Bestimmung eines Vestibularisausfalls bei einem Patienten, umfassend: a) In-Kontakt-Bringen einer Nucleinsäureprobe von dem Patienten mit dem Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3; und b) Bestimmen, ob das Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3 an die Nucleinsäureprobe von dem Patienten gebunden ist, wobei die Tatsache, dass das Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3 gebunden ist, einen Vestibularisausfall bei dem Patienten anzeigt.
Verfahren zur Bestimmung einer Zellwachstums-Funktionsstörung, Zellproliferations-Funktionsstörung oder Zelltod-Funktionsstörung bei einem Patienten, umfassend: a) In-Kontakt-Bringen einer Nucleinsäureprobe von dem Patienten mit dem Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3; und b) Bestimmen, ob das Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3 an die Nucleinsäureprobe von dem Patienten gebunden ist, wobei die Tatsache, dass das Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3 gebunden ist, eine Zellwachstums-Funktionsstörung, Zellproliferations-Funktionsstörung oder Zelltod-Funktionsstörung bei dem Patienten anzeigt.