DE69827805T2

DE69827805T2 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung des transformationspotentials von verbindungen.

Info

Publication number: DE69827805T2
Application number: DE69827805T
Authority: DE
Inventors: Hubertus Mathieu NOTEBORN
Original assignee: Leadd BV
Current assignee: Leadd BV
Priority date: 1997-08-12
Filing date: 1998-08-11
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2018-08-12
Also published as: NO20000736L; PL338683A1; WO1999008108A1; AU756587B2; CA2301401C; KR20010022812A; SK286235B6; AU8752998A; JP2001512829A; SK1902000A3; RU2214598C2; EP1004021A1; ATE283478T1; NZ502800A; DE69827805D1; NO20000736D0; PL196605B1; CZ2000479A3; BR9811163A; JP4287588B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnose und Behandlung von Krebs sowie das Gebiet der Ermittlung des Transformier- oder Umwandlungsvermögens vermuteter tumorerzeugender oder tumorbegünstigender Mittel (diese beiden Begriffe werden in dieser Anmeldung austauschbar verwendet).
Der gemeinsame Nenner der vorliegenden Erfindung ist, dass all die obigen Gebiete Gebiete sind, in denen Apoptin oder Derivate und/oder Fragmente desselben erfindungsgemäß angewendet werden können. Apoptin ist ein Protein, welches ursprünglich im Chicken Anemia Virus (Noteborn et al., 1991) gefunden wurde und ursprünglich die Bezeichnung VP3 trug. Die apoptotische Aktivität dieses Proteins wurde von der Gruppe der vorliegenden Erfinder (Noteborn et al., 1994) entdeckt.
Wie vorstehend erwähnt nutzt die vorliegende Erfindung die Apoptose induzierende Wirkung von Apoptin.
Apoptose ist ein aktiver und programmierter physiologischer Prozess für das Eliminieren überflüssiger, stark geschädigter oder bösartiger Zellen (Earnshaw, 1995, Duke et al., 1996). Apoptose ist durch ein Schrumpfen der Zellen, eine Segmentation des Nukleus und eine Fragmentation des Zytoplasmas, Kondensation und Spaltung der DNA in Fragmente von Domänengröße, in den meisten Fällen gefolgt von internukleosomaler Degradation, gekennzeichnet. Die apoptotischen Zellen werden zu membranumschlossenen apoptotischen Körpern fragmentiert. Schließlich phagotycieren benachbarte Zellen und/oder Macrophagen schnell diese sterbenden Zellen (Wyllie et al., 1980, White, 1996). Unter Gewebekulturbedingungen gezüchtete Zellen sowie Zellen aus Geweben können mit Mitteln, welche chromosomale DNA färben, z. B. DAPI oder Propidiumiodid, welches normale DNA (chromatisch) stark und regelmäßig färbt, apoptotisches Chromin aber schwach und/oder unregelmäßig (Noteborn et al., 1994, Telford et al., 1992) auf Anzeichen von Apoptose hin analysiert werden.
Der apoptotische Prozess kann durch eine Vielzahl von regelnden Stimuli (Wyllie, 1995, White 1996, Levine, 1997) ausgelöst werden. Änderungen der Zellüberlebensrate spielen bei der menschlichen Pathogenese eine wichtige Rolle, z. B. bei der Entwicklung von Krebs, welcher durch verstärkte Wucherung und/oder verminderten Zelltod verursacht wird (Kerr et al., 1994, Paulovich, 1997). Eine Vielzahl von chemotherapeutischen Mittel sowie Bestrahlung induzieren nachgewiesenermaßen in Tumorzellen Apoptose, wobei in vielen Fällen das Tumorsupressorprotein p53 vermittelt (Thompson, 1995, Bellamy et al., 1995, Steller, 1995, McDonell et al., 1995). Viele Tumore erwerben aber während ihrer Entwicklung eine Mutation des p53, was häufig mit einem schlechten Ansprechen auf eine Krebstherapie in Wechselwirkung steht. Transformierende Proteine von DNA-Tumorviren inaktivieren p53 indirekt oder direkt durch Anbindung (Teodoro, 1997). Ein Beispiel für ein solches Mittel ist das große T-Antigen des DNA-Tumorvirus SV40. Bei bestimmten hämatopoetischen Tumoren ist ein hoher Expressionswert des Bcl-2-Onkogens mit einer starken Resistenz gegenüber verschiedenen apoptose-induzierenden chemotherapeutischen Mitteln verbunden (Hockenberry 1994, Sachs und Lotem, 1997). Bei diesen Krebsarten, die gegenüber vielen zytotoxischen Mitteln resistent sind, werden derzeit alternative Antitumortherapien auf der Grundlage einer Induktion von Apoptose entwickelt (Thompson, 1995 und Paulovich et al., 1997).
Apoptin ist ein kleines Protein, das aus dem Chicken Anemia Virus (CAV; Noteborn und De Boer, 1995, Noteborn et al., 1991, Noteborn et al., 1994) gewonnen wird und in menschlichen bösartigen und transformierten Zelllinien, aber nicht in untransformierten diploiden menschlichen Zellen Apoptose induzieren kann. In vitro vermag Apoptin keinen programmierten Zelltod bei normalen lymphoiden, dermalen, fibroplastischen, epidermalen, endothelialen und Glattmuskel-Zellen induzieren. Wenn aber normale Zellen transformiert werden, z. B. durch die transformierenden Gene von SV40, werden sie durch Apoptin für Apoptose anfällig. (Danen-van Oorschot, 1997 und Noteborn, 1996). Die langfristige Expression von Apoptin in normalen menschlichen Fibroblasten enthüllte, dass Apoptin in diesen Zellen keine toxische oder transformierende Aktivität aufweist. Bei normalen Zellen fand man Apoptin vorrangig im Zytoplasma angesiedelt, während es sich in transformierten oder bösartigen Zellen im Nukleus befand, was nahe legt, dass die Ansiedelung von Apoptin mit seiner todbringenden Aktivität in Verbindung steht (Danen-van Oorschot et al. 1997).
Weiterhin haben wir bewiesen, dass Apoptin bei Fehlen von funktionellem ph53 Apoptose induzieren kann (Zhuang et al., 1995a) und nicht durch Bcl-2, Bcr-abl (Zhuang et al., 1995), das Bcl-2-assoziierende Protein BAG-1 und den Caspase-Hemmer Kuhpockenprotein CrmA (Danen-Van Oorschot, 1997, Noteborn, 1996) gehemmt werden kann. Schließlich scheint es, dass Zellen, die nur immortalisiert und somit minimal transformiert werden, ebenfalls durch Apoptin getötet werden können.
Daher ist Apoptin ein äußerst wirksames Antitumormittel, auch bei Tumoren, die aufgrund des Fehlens von funktionellem p53, (Über)expression von Bcl-2 oder anderen apoptose-hemmenden Genen nicht oder weniger gut auf (chemo)therapeutische Mittel ansprechen. Die Tatsache, dass Apoptin in normalen menschlichen Zellen keine Apoptose induziert, legt nahe, dass eine toxische Wirkung der Apoptinbehandlung in vivo sehr gering sein wird. Ferner scheint es, dass selbst prämaligne, minimal transformierte Zellen auf die todbringende Wirkung von Apoptin ansprechen. In dem Wissen, dass Apoptin bei normalen Zellen recht unbedenklich ist, aber dass dies nach Transformieren oder Umwandeln und/oder Immortalisieren einer Zelle (die Begriffe sind in dieser Anmeldung austauschbar verwendbar) nicht mehr so sein muss, haben die vorliegenden Erfinder aufgrund dieser Erkenntnis einige Einsatzmöglichkeiten entwickelt. Die Erfindung gibt somit ein Verfahren für das Ermitteln der Umwandlungsfähigkeit eines möglichen Umwandlungsmittels, welches das Versehen einer nicht umgewandelten diploiden Zelle mit induzierbarer apoptin-apoptotischer Aktivität, das Aussetzen der Zelle dem Umwandlungsmittel und das Ermitteln der Lokalisierung der apoptotischen Aktivität in der Zelle oder das Ermitteln des Einleitens der Apoptose in der Zelle umfasst, an die Hand, wobei die apoptin-apoptotische Aktivität durch ein apoptin-kodierendes Plasmid oder einen Virusvektor, welcher Apoptin exprimiert, vorgesehen wird.
Es versteht sich, dass im Vorstehenden eine apoptotische Aktivität auch die Einheit mit dieser Aktivität bezeichnet. Es ist bevorzugt, die Zelle mit apoptotischen Aktivität durch Transduzieren der Zelle mit einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül, welches die Aktivität kodiert, vorzusehen. Eine apoptinartige Aktivität wird hier als jede (vorzugsweise eiweißartige) Substanz mit ähnlicher Eigenschaft wie VP3 oder Apoptin des Chicken Anemia Virus definiert. In dieser Definition sind im Einzelnen allelische Varianten, Derivate und/oder Fragmente von Apoptin enthalten, wobei Derivate laut Definition Aminosäureersatz aufweisen, welcher nicht zum Verlust der gesamten apoptotischen Aktivität führt. Es versteht sich, dass eine ähnliche Aktivität bedeutet, dass die Art der Aktivität gleich ist, aber die Menge unterschiedlich sein kann. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind vor allem bei Anwendungen geeignet, wodurch das mögliche Umwandlungsmittel eine eiweißartige Substanz ist. Dadurch kann die eiweißartige Substanz in der nicht umgewandelten Zelle mit der apoptotischen Aktivität gemeinsam exprimiert wird. Die beispielhafte eiweißartige Substanz ist das große T-Antigen von SV40 oder eine funktionelle Entsprechung desselben.
Die Erfindung gibt auch Abwandlungen am Apoptin-Gen an die Hand, welche zu Änderungen des Apoptin-Proteins führen, welche Apoptin in den Nukleus in nicht umgewandelten und umgewandelten/tumorerzeugenden Zellen eindringen lassen, was zur Induktion von Apoptose führt. Das Apoptin-Protein wird mit einem Nukleuslokalisierungssignal von SV40 vergrößert. Die Definition von Apoptin umfasst im Einzelnen allelische Varianten, Derivate und/oder Fragmente von Apoptin, wobei Derivate laut Definition Aminosäureersatz aufweisen, welcher nicht zum Verlust der gesamten apoptotischen Aktivität führt. Dadurch kann das Apoptin-Protein in nicht umgewandelten Zellen mit der apoptotischen Aktivität exprimiert werden. Apoptinfragmente mit dieser apoptotischen Aktivität, die aber nicht durch ihre eigenen Sequenzen in den Nukleus von nicht umgewandelten oder umgewandelten Zellen eindringen können, können mittels der Modifikationen in den Nukleus eindringen und Apoptose induzieren.
Die Erfindung gibt weiterhin ein Verfahren für das Ermitteln der Veranlagung einer diploiden Zelle zur Wandlung in eine Tumorzelle durch Versorgen der Zelle mit einer induzierbaren apoptin-apoptotischen Aktivität und Unterziehen der Zelle einer verhältnismäßig milden tumorerzeugenden Aktivität sowie Ermitteln von Apoptose in der Zelle und/oder Ermitteln der Lokalisierung der apoptotischen Aktivität in der Zelle an die Hand, wobei die apoptin-apoptotische Aktivität durch ein Plasmid, welches Apoptin kodiert, oder einen Virusvektor, welcher Apoptin exprimiert, vorgesehen wird. In diesem Fall liegt das vorstehend erwähnte vermutete Umwandlungsmittel bereits als Mutation, welche zu einer tumorerzeugenden oder onkogenen Aktivität führt, in der Zelle vor. In diesem Fall führt die Tatsache, dass Apoptin nur in Zellen, die bereits umgewandelt wurden, Apoptose induziert, zu der Möglichkeit zu prüfen, ob Zellen eine Mutation aufweisen, welche zu einer Immortalisierung oder Umwandlung führt, wenn sie einer schwachen Umwandlungsaktivität wie UV-Bestrahlung oder Röntgenbestrahlung ausgesetzt werden. Auf diese Weise kann die Wahrscheinlichkeit ermittelt werden, ob eine Gruppe von Zellen zu Krebs führt. Dies führt natürlich zu Anwendungen in dem Gebiet der Diagnose der Wahrscheinlichkeit, ob Menschen mit einem erblichen Risiko Krebs bekommen, und der präventiven Behandlung, welches eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist. Diese Art von Diagnose kann auch bei der Beratung von Menschen bezüglich der Wahrscheinlichkeit einer Krebsveranlagung ihrer Kinder eingesetzt werden.
Somit gibt die Erfindung auch ein Verfahren für das Ermitteln der Prädisposition einer Person bezüglich erblicher Arten von Krebs an die Hand, welches das Unterziehen einer Probe einer relevanten Untermenge von Zellen dieser Person einem hierin offenbarten Verfahren umfasst. Ferner gibt die Erfindung ein Verfahren für das Ermitteln einer Genmutation mit onkogener und/oder transformierender Aktivität in einer Zelle an die Hand, welches das Unterziehen der Zelle einem erfindungsgemäßen Verfahren umfasst. Wie vorstehend erwähnt, besteht eine weitere Aufgabe der Erfindung darin, Mittel für die prophylaktische Behandlung einer Untermenge von Zellen in einer Person an die Hand zu geben, wobei die Untermenge von Zellen krebsanfällig ist. Diese Mittel umfassen eine Nukleinsäure, welche Apoptinaktivität kodiert, vorzugsweise in Form eines Gentransportvehikels.
Gentransportvehikel können viralen oder sonstigen Ursprungs sein. Auf dem Gebiet wurden viele Vehikel offenbart und sind dem Fachmann bekannt. Sie umfassen einschließlich aber nicht ausschließlich adenovirale Vektoren, vorzugsweise in Form von adenoviralen Partikeln; retrovirale Vektoren, vorzugsweise als rekombinante Viren; die gleiche Art von Vektoren, aber aus anderen Viren abgeleitet; Liposome oder andere Trägermoleküle, etc.
Die Erfindung gibt ferner ein Diagnosetestpaket für das Ausführen eines erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Ermittlung des Tumorerzeugungsvermögens eines Mittels an die Hand, welches eine nicht umgewandelte Zelle, welche mit einer Apoptin kodierenden Nukleinsäure oder einem funktionellen Derivat oder Fragment desselben transduziert wurde, sowie optional alle anderen Materialien umfasst, welche für das Ausführen des Tests und das Feststellen des Ergebnisses notwendig sind.
Ferner gibt die Erfindung ein Diagnosetestpaket für das Ausführen eines erfindungsgemäßen Verfahrens für das Ermitteln der Krebsanfälligkeit von Zellen an die Hand, welches eine Apoptin kodierende Nukleinsäure oder ein funktionelles Derivat oder Fragment desselben, das eine eukaryotische Zelle transduzieren und in dieser Zelle exprimiert werden kann, sowie optional alle anderen Materialien umfasst, die für das Ausführen des Tests und das Feststellen des Ergebnisses notwendig sind. Vorzugsweise wird auch ein Mittel, um eine Zelle einer milden tumorerzeugenden Aktivität, wie UV-Bestrahlung und Röntgenbehandlung, zu unterziehen, an die Hand gegeben.
Weiterhin gibt die Erfindung ein Verfahren für das Untersuchen der Induktion von apoptin-induzierter Apoptose durch Umwandlungsmittel wie Chemikalien, Viren, UV- und Röntgenbestrahlung in einem transgenen Mausmodell an die Hand, welches zur Hemmung von Tumorbildung führt. Die apoptin-transgenen Mäuse können für das Analysieren der Antitumorwirkung von Apoptin bei transgenen Chimären, welche erbliche Krebsarten tragen und Apoptin exprimieren können, verwendet werden. Weiterhin kann die Wirkung der Expression von Apoptin mittels der beschriebenen apoptin-transgenen Mäuse in einem in-vivo Modell untersucht werden.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Wir haben bereits gezeigt, dass das Viralprotein Apoptin in gezüchteten umgewandelten Zellen sowohl menschlichen Ursprungs als auch Nagetierursprungs, aber nicht in normalen menschlichen Zellen Apoptose induziert. Wir haben nun festgestellt, dass Apoptin bei gezüchteten embryonalen Fibroblasten von Mäusen (oder Ratten) keine Apoptose induziert. (Die Kulturen wurden aus 16–18 Tage alten Embryos von Mäusen (oder Ratten) gewonnen). Dies zeigt, dass Apoptin auch in dem intakten Embryo exprimiert werden kann, ohne Toxizität hervorzurufen, zumindest bei Embryos einer nicht zu frühen embryonalen Entwicklungsstufe.
Jetzt konnten wir apoptin-transgene Mäuse erzeugen, welche vital sind. Wir treten den Beweis an, dass eine konstitutive Expression von Apoptin in einer transgenen Maus nicht zu tödlichen oder anderen lebensbedrohlichen/lebensverkürzenden Wirkungen führt. Wir haben auch festgestellt, dass die Cotransfektion gezüchteter normaler menschlicher Fibroblasten mit dem Apoptin-Gen und den umwandelnden SV-40-Genen den Apoptin-Prozess aktiviert, welcher von einer Translokation des Apoptin-Proteins von dem Zytoplasma, wo es sich zunächst sammelt, zu dem Nukleus begleitet wird.
Die beschriebene Erfindung liefert die Basis für Aminosäureadditionen zu dem Apoptin-Protein oder dessen Fragmenten, wobei es diesen möglich wird, in den Zellnukleus einzudringen und/oder sich dort zu sammeln, was zur Induktion von Apoptose führt.
Die Erfindung liefert die Grundlage für einen Diagnosetest für das Feststellen von potenziell umwandelnden Genen. Normale diploide Säugetierzellen, wie menschliche Zellen und/oder Nagetierzellen, werden für einen solchen Test verwendet. Hierfür werden die normalen diploiden Zellen mit einem die Plasmid, welches das Gen bzw. die Gene enthält, die untersucht werden sollen, sowie mit dem apoptin-kodierenden Plasmid cotransfiziert oder mit dem Gen bzw. den Genen transfiziert, die untersucht werden sollen, und mit einem Virusvektor, welcher Apoptin exprimiert, infiziert. Die Induktion von apoptin-induzierter Apoptose und/oder das Vorhandensein von Apoptin im Nukleus zeigt, dass das untersuchte Gen ein umwandelndes/tumorerzeugendes Potenzial beherbergt.
Weiterhin haben wir entdeckt, dass diploide menschliche Zellen, welche von Personen isoliert werden, die eine Keimbahnmutation in einem Tumorsuppressor-Gen tragen und dadurch anfällig für die Entwicklung eines gewissen Tumorspektrums sind (nachstehend auch als krebsanfällig bezeichnet), gegenüber der apoptose-induzierenden Wirkung von Apoptin resistent sind, genauso wie diploide Zellen von gesunden Personen, aber empfindlich werden, wenn die Zellkulturen mit UV-Licht bestrahlt werden.
Dies ermöglichte uns die Entwicklung eines Diagnose-Assay für die Prognose einer Krebsanfälligkeit. In Familien mit einer erblichen Veranlagung zu Krebs aufgrund einer Keimbahnmutation in einem Tumorsuppressor-Gen ist häufig ohne eine umfassende Analyse der chromosomalen DNA keine Prognose möglich, ob ein Familienmitglied betroffen ist und das Krankheitsgen trägt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass dies durch Nutzen des Apoptin-Gens einfach möglich ist. Zu diesem Zweck werden diploide Hautfibroblasten oder Lymphozyten von der zu testenden Person isoliert und die gezüchteten Zellen werden mit dem Apoptin-Gen transfiziert, gefolgt von Bestrahlung mit UV-Licht (266 nm). Wenn die transfizierten Zellen nach der UV-Bestrahlung apoptotisch werden, aber ohne UV-Bestrahlung keine Apoptose durchlaufen, dann ist dies ein (starker) Hinweis, dass die Person krebsanfällig ist. Nicht alle Arten von Krebsveranlagung, die auf eine Mutation eines Tumorsuppressor-Gens zurückzuführen sind, wurden bereits mit dem Apoptin/UV-Assay getestet. Es gibt jedoch keinen Grund zur Annahme, dass das gleiche Phänomen nicht bei anderen krebsanfälligen Zellen beobachtet wird. Ein ähnlicher Diagnosetest für die Prognose einer Krebsanfälligkeit kann auch durch Verwendung von Röntgenbehandlung an Stelle von UV-Bestrahlung ausgeführt werden.
Die Erfindung ermöglicht uns auch den Erhalt von mehr Informationen über die molekulare Basis von Krebsanfälligkeit und deren Beziehung zu gewissen Stressreaktionen, wie z. B. Enhanced Reactivation (ER, verstärkte Reaktivierung) (Abrahams et al., 1996). Die verstärkte Reaktivierung ist eine der Reaktionen normaler (menschlicher) Zellen auf bestimmte DNA-schädigende Mittel und scheint die Anfälligkeit der Zellen gegenüber onkogener Umwandlung wiederzuspiegeln.
Nun wird die Erfindung in dem folgenden experimentellen Teil eingehender beschrieben. Dies dient nur der Veranschaulichung und sollte nicht als Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung ausgelegt werden.
Experimenteller Teil
Zellen und Zellkulturbedingungen
Aus 14 Tage alten Rattenembryos wurden Rattenembryofibroblasten (REF) erzeugt. Die Zellen wurden aus flüssigem Stickstoff aufgetaut, in DMEM supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum kultiviert und bei Zellpassage 2 mit Plasmid-DNA transfiziert.
Mäuseembroyfibroblasten (MEF) wurden aus p53+/+ Mäusen oder aus p53–/– Knockout-Mäusen (Tyler Jacks, 1994 und 1996; Tyler Jacks et al., 1994) hergestellt. Die Zellen wurden auf Corning-Schalen in F15-Medium, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, gezüchtet. P19-Zellen werden aus einem Mäuseembryokarzinom/teratokarzinom (Burney et al., 1982) gewonnen. Die Zellen wurden auf gelierten Petrischalen in DMEM, supplementiert mit einem 8% fötalem Kälberserum, gezüchtet.
BRK/xho-Zellen werden von den Nierenzellen von Rattenbabys durch Transformieren mit dem Adenovirus Typ 5 Region E1 (Schrier et al., 1983) erzeugt. Die Zellen wurden in DMEM, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, kultiviert.
Die menschlichen diploiden Vorhautfibroblasten VH10 und VH25 (Klein et al., 1990) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, gezüchtet.
Primäre Kulturen von menschlichen epidermalen Keratinozyten (FSK-1) wurden wie beschrieben in komplettem Medium (Rheinwald und Green, 1975) mit geringfügigen Abwandlungen nach M. Ponec et al., 1981, angelegt und anschließend in serumfreien Keratinozytenmedium (KSFM) kultiviert. Für die hier beschriebenen Experimente wurde Passage Nummer 3 verwendet.
P9605-Zellen sind diploide Fibroblasten, welche p16–/– sind, aus Patienten mit dysplastischem Nävussyndrom (DNS) gewonnen werden, was als Präkursor eines familiären atypischen multiplen Nävus-Melanomsyndroms (FAMM) postuliert wird (Gruis et al., 1995). Die Zellen wurden in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum gezüchtet. GM1492-Zellen sind menschliche diploide Fibroblasten, die p53 nicht exprimieren und aus Patienten mit Bloom's Syndrom gewonnen werden, einer autosomalen rezessiven Störung mit einer höheren Krebshäufigkeit (Van Laar et al., 1994). Die Zellen wurden in DMEM, welches 10% fötales Kälberserum enthält, gezüchtet.
LF2675T sind diploide Hautfibroblasten aus Patienten mit Li-Fraumeni-Syndrom (FLS). Diese Erkrankung ist durch eine Keimbahnmutation in einer Allele des p53-Gens und ein vorzeitiges Eintreten verschiedener Krebsarten charakterisiert (Srivastava et al., 1990; Abrahams et al., 1996). Die Zellen wurden in DMEM, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, gezüchtet.
401-Zellen sind diploide Hautfibroblasten einer Person aus einer Familie mit Lynch-Syndrom Typ 2 mit hoher Häufigkeit verschiedener Krebsarten. Die Zellen wurden aus einer Person, die an Brustkrebs verstarb, gewonnen (Abrahams et al., 1996). Die Zellen wurden in DMEM, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, gezüchtet. Alle Kulturmedien wurden aus GIBCO/BRL erhalten und enthielten die Antibiotika Penicillin und Streptomycin.
Bestrahlung der Zellkulturen
Das konditionierte Medium wurde aus den Kulturen entfernt und die Zellen wurden zweimal mit PBS gespült. Nach Entfernen des PBS wurden die Kulturen wie zuvor beschrieben UV-bestrahlt (Abrahams et al., 1984) oder unter Verwendung eines Andrex 225 SMART (Andrex St, Kopenhagen) bei 200 KV, 4 mA mit einem 1-mm-A1-Filter einer Röntgenbehandlung unterzogen. Die Dosis und die Dosisrate wurden mit einem PTW-Dosimeter überwacht. Nach der UV-Behandlung wurde das konditionierte Medium zurückgegeben und die Kulturen wurden bei 37°C inkubiert.
Plasmide
Das Expressionsplasmid pCMV-VP3 enthält die CAV-DNA-Sequenz, welche ausschließlich das Apoptin-Protein kodiert (nt 427–868; Noteborn et al., 1991, Noteborn und De Boer, 1996), und das Plasmid pCMV-des kodiert Desmin, ein strukturelles Protein von Muskelzellen (Menke et al., 1997). Das Plasmid pCMV-neo dient als „leere" Negativkontrolle für Plasmide, welche Genprodukte mit einer potenziellen Wirkung auf die apoptin-induziert Apoptose kodieren. Alle exprimierten Gene stehen unter der Regulation des (frühen) verstärkten Cytomegalovirus-Promoters.
Das Plasmid SC40 enthält den Klon einer frühen Region defekten SV40-Ursprungs (Replikationsursprung) mit Bereichen, die sowohl das große T-Antigen als auch das kleine T-Antigen von SV40 kodieren und durch ihren eigenen Promotor reguliert werden (Dinsart et al., 1984). Das Plasmid pR-s884 exprimiert ein komplettes großes T-Antigen von SV40 und ein abgeschnittenes kleines T-Antigen unter der Transkriptionskontrolle der langen terminalen Wiederholung des Rous-Sarkomvirus (RSV; De Ronde et al., 1989; Smits et al., 1992). Das Plasmid PR-SVt enthält cDNA-Sequenzen, welche für das kleine T-Gen von SV40 kodieren, das mit dem RSV-LTR verschmolzen wurde (Philips und Bundell, 1988).
Das Expressionsplasmid 21 EcoA, welches aus den H-2Kb-Histokompatibilitätsantigen-Gen/Promoterbereichen von Mäusen (Mellor et al., 1982) und pBr327-Sequenzen besteht, ist ein Geschenk von Prof. Dr. Frank Grosveld, Erasmus Universität, Rotterdam, Niederlande. Das Plasmid 21 EcoA enthält ein NotI in dem ersten Exon des H-2Kb-Gens, welches die Regulierung der Integration eines fremden Gens durch den H-2Kb-Promoter ermöglicht. Das BamH1-Fragment, welches die Apoptin kodierenden Sequenzen enthält, wurde von pCMV-VP3 isoliert und an der NotI-Stelle des 21 EcoA-Plasmids mit Hilfe von NotI-BamHI-Linkern geklont. Das endgültige Plasmid, welches das Apoptin-Gen unter der Regulierung des H-2Kb-Promoters enthielt, wurde p21EcoA-VP3 genannt. Anschließend wurde die EcoR1-Stelle neben dem Apoptin-Gen durch Linearisierung des Plasmids p21EcoA-VP3 an dieser spezifischen EcoRI-Stelle gelöscht und mit Klenow-Polymerase-Behandlung behandelt. Das Plasmid heißt p21EcoA-Vp3-Eco.
Das DNA-Fragment, welches die H-2kB-Expressionseinheit mit dem Apoptin-Gen enthielt, wurde von den prokaryotischen DNA-Sequenzen mittels EcoRI-Verdauung und Agarose-Gel-Elektrophorese getrennt.
Die Plasmid-DNA wurde durch Zentrifugieren in einem CsCl-Gradienten- und Säulenchromatograph in Sephacryl S500 (Pharmacia, Schweden) gereinigt.
Transiente Transfektion
Die Zellen wurden in Monolayer-Kulturen mit dem Transfektionsmittel DOTAP (Boehringer, Mannheim, BRD) im Wesentlichen wie von Fischer et al., 1996 beschrieben transfiziert oder wurden mit Plasmid-DNA durch Calciumphosphatausfällung, wie von Graham und Van der Eb (1973) beschrieben, transfiziert.
Indirekte Immunfluoreszenz
Alle Zellen wurden auf Glasmikroskopscheiben gezüchtet. Die Scheiben waren entweder unbeschichtet (VH20, VH25) oder mit 3-Amino-propyltriethoxysilan (TESPA; FSK-2) beschichtet. Die Zellen wurden mit 80% Aceton 10 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert und wie beschrieben (Van den Heuvel, 1990) für indirekte Immunfluoreszenz verwendet. Um das Vorhandensein und/oder die zelluläre Lokalisierung von Apoptin in transfizierten Zellen nachzuweisen, wurde monoklonaler Antikörper (MAB) CVI-CAV-85.1 von Mäusen (85.1; Noteborn et al., 1991); für menschliches Desmin der Mäuse-Mab 33 (Monosan, Uden, Niederlande); für SV40- T-Antigene Pab 419, freundlicherweise von Dr. A.-G. Jochemsen, Universität Leiden, Niederlande, zur Verfügung gestellt, verwendet. Als sekundärer Antikörper wurde mit Fluoreszin-Isothiocyanat markierter Ziegen-Antimaus-Antikörper (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA) verwendet. Nukleare DNA wurde mit 2,4-Diamino-2-phenylindol (DAPI) gefärbt.
Die Erzeugung von apoptin-transgenen Mäusen
Für die Erzeugung von apoptin-transgenen Mäusen wurden befruchtete Oozyten des FVB-Mausstamms und Mäuse des murinen Stamms als Surrogat verwendet. Die Mikroinjektionen wurden in den männlichen Pronuklei nach Brinster et al. (1981) durchgeführt. Pro Mikroinjektion wurden 500 Kopien des EcoR1-DNA-Fragments, gewonnen aus Plasmid p21EcoA-Vp3-Eco, welches die erforderliche H-2Kb-Transkriptionseinheit und das komplette Apoptin-Gen enthielt, injiziert.
Ergebnisse und Diskussion
Apoptin induziert Apoptose in transformierten Zellen von Nagetieren, aber nicht in normalen Embryozellen
Zur Prüfung, ob Apoptin in normalen Embryozellen von Nagetieren keine Apoptose induziert, wurden Mausembryozellkulturen und Rattenembryozellkulturen mit einem apoptin-kodierenden Plasmid transient transfiziert. Als Negativkontrolle wurden Zellen mit einem Plasmid transfiziert, welches Desmin kodierend, welches keine apoptotische Aktivität aufweist. Die Apoptin exprimierenden Zellen wurden mittels indirekter Immunfluoreszenz mit Mab 85.1 untersucht und die Desmin exprimierenden Zellen mit Maus-Mab 33. Die Induktion von Apoptose in apoptin- oder desmin-positiven Zellen wurde mit Hilfe von DAP analysiert, das eine regelmäßige Verfärbung bei intakten Nuklei erzeugt, aber eine unregelmäßige und/oder schwache Verfärbung bei apoptotischen Nuklei.
Fünf Tage nach der Transfektion waren 10–20% der desmin-positiven Zellen apoptotisch, was der höchstwahrscheinlich durch den Transfektionsvorgang bedingte Basalwert ist (Daten nicht gezeigt, Menke et al., 1997, Danen-van Oorschot, 1997a). Zwei, drei, vier oder fünf Tage nach der Transfektion überstieg der Prozentsatz apoptotischer apoptin-positiver Zellen den Prozentsatz der in den desmin-positiven Kulturen beobachteten apoptotischen Zellen nicht signifikant, was anzeigt, dass Apoptin in normalen Embryozellkulturen keine Apoptose induziert. Die transiente Transfektion von transformierten Embryozellen von Mäusen/Ratten oder Nierenzellen von Rattenbabys mit dem Plasmid, welches Apoptin kodiert, bewies, dass Apoptin in diesen Zellen Apoptose induzieren kann. Die Ergebnisse der Apoptinexpression in „normalen" embryonalen Nagetierzellen gegenüber transformierten Nagetierzellen werden in 1 gezeigt.
Diese Daten zeigen, dass Apoptin in normalen erwachsenen und embryonalen Nagetierzellen keine Apoptose induziert, aber in den viral transformierten Derivaten zumindest unter Zellkulturbedingungen Apoptose induziert.
Coexpression von großem T-Antigen von SV40 und Apoptin führt zu apoptin-induzierter Apoptose bei normalen menschlichen diploiden Zellen
Wir haben die Wirkung der Expression von transformierenden Genen auf apoptin-induzierte Apoptose bei normalen menschlichen Zellen, die aus gesunden Personen gewonnen wurden, untersucht. Zu diesem Zweck wurden menschliche diploide VH10-Fibroblasten und diploide FSK-1-Keratinozyten transient mit dem Apoptinkodierenden Plasmmid pCMV-VP3 und mit entweder dem sowohl das große T- als auch das kleine T-Antigen von SV40 kodierenden Plasmid pSV40, dem das große T-Antigen kodierenden pR-s884, dem das kleine T-Antigen kodierenden pR-SVt oder dem Plasmid pCMV-neo als Negativkontrolle cotransfiziert. Durch indirekte Immunfluoreszenz wurden die Zellen auf apoptin-induzierte Apoptose analysiert. Beide, die normalen VH10- und die FSK-1-Zellen, erfuhren keine Apoptose, wenn Apoptin mit dem Kontrollplasmid transfiziert wurde.
Die Ergebnisse zeigten wie erwartet, dass die Expression von Apoptin allein in normalen menschlichen diploiden Zellen keine Apoptose induzieren kann, was die von Danen-Van Oorschot beschriebenen Daten (1997) bestätigt. Normale diploide menschliche Fibroblasten und Keratinozyten, welche beides – Apoptin und das große T-Antigen von SV40 – allein oder zusammen mit dem kleinen T-Antigen exprimierten, erfuhren eine apoptin-induzierte Apoptose (2). Die Geschwindigkeit der Apoptose-Induktion war bei Vorhandensein der viralen umwandelnden Gene beträchtlich höher. Coexpression des kleinen T-Antigens von SV40 mit Apoptin führte zu keiner Induktion von Apoptose durch Apoptin. Der Übergang der normalen Zellen von Apoptinresistenz zu Apoptinanfälligkeit lässt sich wahrscheinlich durch die Tatsache erklären, dass das Apoptin-Protein von einem zytoplasmischen Ort zu einem nuklearen Ort wechselt. Dieser Übergang wird bereits etwa 2 Tage nach Transfektion der SV40-Plasmide (3) erkennbar. Man kann schließen, dass ein Ereignis eintritt, in diesem Beispiel aufgrund der Expression eines transformierenden Produkts aus einem DNA-Tumorvirus, welches zur Translokation von Apoptin vom Zytoplasma zum Nukleus führt, welches von Induktion der Apoptose gefolgt ist.
Coexpression von großem T-Antigen von SV40 und Apoptin führt zu apoptininduzierter Apoptose bei normalen diploiden Nagetierzellen
Als Nächstes haben wir die Wirkung der Coexpression von umwandelnden Genen und Apoptin auf die Apoptoseinduktion in normalen Fibroblasten von Mäuseembryos (MEF), gewonnen von p53+/+ Mäusen oder von transgenen p53–/– Mäusen, untersucht. Beide Arten von transient transfizierten MEFs, welche das transformierende große T-Gen von SV40 mit oder ohne kleinem T-Antigen in Kombination mit Apoptin coexprimierten, erfuhren eine sehr schnelle Apoptose, wohingegen MEF, welches Apoptin zusammen mit einem Kontrollplasmid oder einem Plasmid, das das nicht transformierende kleine T-Antigen kodierte, exprimierte, nicht zu apoptin-induzierter Apoptose führte. Die Ergebnisse werden in 4 gezeigt.
Die Immunfluoreszenzanalyse zeigte auch auf, dass die Coexpression von Apoptin und einem großen T-Antigen von SV40 zu der zellulären Translokation von Apoptin führte. In den untersuchten MEFs findet sich Apoptin in dem Zytoplasma. Bei Expression von großem T-Antigen von SV40 dringt Apoptin in den Nukleus ein, gefolgt von Induktion der Apoptose. Zum Vergleich wird auch der Prozentsatz der apoptin-positiven transformierten Mäusezellen in 5 gegeben.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Apoptin sowohl in p53+/+ als auch in p53–/– Mäusefibroblasten keine Apoptose induziert, sehr wohl aber bei Expression eines transformierenden Proteins. Diese Information ist wichtig, da bekannt ist, dass „normale" p53–/– Zellen sehr anfällig für spontane Transformation sind und sich leicht zu höher transformierten Phänotypen verwandeln. Der Verlust von p53 allein reicht aber nicht aus, um einen transformierten Charakter zu erzeugen. Weiterhin zeigt dieser Befund, dass Apoptin Apoptose bei Expression eines transformierenden Proteins in anderen Säugetierzellen als menschlichen Zellen induzieren kann.
Coexpression von großem T-Antigen von SV40 und Apoptin führt zu apoptininduzierter Apoptose bei normalen diploiden Zellen, welche aus krebsanfälligen Menschen gewonnen wurden
Mittels transienter Transfektion und Immunfluoreszenz haben wir auch die Wirkung von Apoptin in den normalen Fibroblasten F9605 und GM1492 geprüft, die aus Personen gewonnen wurden, die aufgrund eines genetischen Defekts eine vermehrte Krebshäufigkeit aufweisen. Apoptin kann in normalen diploiden Zellen von diesen krebsanfälligen Personen keine Apoptose induzieren. Bei Expression von großem T-Antigen von SV40 induziert Apoptin aber Apoptose (6) nach Eindringen in den Nukleus (Daten nicht gezeigt).
Diese Daten bestätigen, dass diploide Zellen aus erblichen krebsanfälligen Syndromen nicht apoptinanfällig sind, wohingegen sie dies werden, wenn sie ein transformierendes Gen exprimieren. Somit sind in diesem Assay diploide Zellen aus diesen erblichen Syndromen identisch zu „normalen" diploiden menschlichen Zellen.
Die Wirkung kovalenten Verbindens eines großen SV40-T-Antigen-Nukleuslokalisierungssignals mit dem Apoptin-Protein auf die Induktion von Apoptose
Als Nächstes haben wir geprüft, ob die Expression eines chimären Proteins bestehend aus Apoptin und das Nukleuslokalisierungssignal des großen SV40-T-Antigens (Aminosäuren N-Proline-Proline-Lysine-Lysine-Lysine-Argenine-Lysine-Valine-C des großen SV40-T-Antigens, kovalent mit dem N-Terminus von Apoptin verbunden) zur Induktion von Apoptose in transformierten und nicht transformierten menschlichen Zellen führt. Das chimäre Protein trägt die Bezeichnung NLS-Apoptin. Zu diesem Zweck wurden nicht transformierte menschliche VH10-Fibroblasten und transformierte aus Osteosarkom gewonnene menschliche Saos-2-Zellen (Danen-van Oorschot et al., 1997) mit einem Plasmid transfiziert, welches das chimäre Protein NLS-Apoptin kodierte. Bei beiden Zelltypen führte die Expression von NLS-Apotopin zur nuklearen Lokalisierung von Apoptin und zur Induktion von Apoptose.
Diese Daten beweisen, dass ein modifiziertes Apoptin, welche seine Nukleuslokalisierung in zelltransformiert-unabhängiger Weise zulässt, in den Nukleus übersiedeln kann, gefolgt von Induktion von Apoptose.
Ein Fusionsprodukt der ersten N-terminalen 69 Aminosäuren von Apoptin und des nichtapoptotischen GFP-Proteins führt nicht zur Induktion von Apoptose, was mit der Tatsache übereinstimmt, dass dieses chimäre Protein nicht in den Nukleus eindringt (Noteborn und Pietersen, 1998). Nun haben wird die 8 Aminosäuren des NLS mit dem N-Terminus des Apoptinfragments bestehend aus den Aminosäuren 1–69 (NLS-Apoptin/1–69) kovalent verbunden. Die Transfektion sowohl der nicht transformierten VH10-Zellen und der tumorerzeugenden menschlichen Zellen (wie z. B. aus Osteosarkom gewonnene Saos-2-Zellen) mit einem Plasmid, welches das NLS-Apoptin/1–69 kodierte, führte zur Nukleuslokalisierung des NLS-Apoptin/1–69 gefolgt von Induktion der Apoptose.
Diese Daten zeigen, dass neben dem C-tenninalen Teil des Apoptin auch der N-terminale Teil (1–69 a. a.) bei Translokalisieren in den Nukleus das gleiche tut. In diesen Experimenten wurde wie erwartet NLS-GPP in den Nukleus translokalisiert, führte aber nicht zur Induktion von Apoptose.
Normale diploide Zellen von krebsanfälligen Personen erfahren nach UV-Bestrahlung eine apoptin-induzierte Apoptose
Wir haben auch die Wirkung von UV-Bestrahlung auf die Apoptose-Induktion durch Apoptin bei diploiden Zellen geprüft. Aus gesunden Personen (VH25) oder von Personen mit Krebsanfälligkeitssyndrom (LF2675T-Zellen von einem Patienten mit Li-Fraumeni-Syndrom und 401-Zellen von einem Patienten mit Lynch-Syndrom Typ 2) gewonnene diploide Fibroblasten wurden mit einem apoptin-kodierenden Plasmid transient transfiziert. Vor der Transfektion wurde ein Teil der Zellen UV-bestrahlt. Als Negativkontrolle wurden die Zellen mit einem das Protein Desmid kodierenden Plasmid transfiziert.
Alle 3 Zelltypen, VH25, LF2675T und 401, zeigten ohne UV-Bestrahlung keine apoptin-induzierte Apoptose. In Kombination mit UV-Bestrahlung erfuhren jedoch die LF2675T- und 401-Zellen, aber nicht die VH25-Zellen, sehr schnell eine Apoptininduzierte Apoptose. Zwar haben wir keine Erklärung für dieses Phänomen, doch schien es, dass es mit einer anderen Zelleigenschaft in Korrelation steht. Diploide Zellen von Patienten, die aufgrund einer Keimbahnmutation in einem Tumorsuppressor-Gen krebsanfällig sind, zeigen eine unerwartete Reaktion auf UV-Bestrahlung. Bei Behandlung normaler diploider Fibroblasten mit UV oder einem anderen DNA-schädigenden Mittel reagieren sie mit einer Vielzahl transienter Reaktionen, darunter Aktivierung der Signaltransduktionswege, Induktion der Expression einer Vielzahl von Genen, Hemmung zellulärer DNA-Replikation und Aktivierung von SOS-artigen Phänomenen wie Enhanced Reactivation (ER) und Enhanced Mutagenesis (EM). Abrahams et al. (1996) haben festgestellt, dass normale diploide Fibroblasten von Patienten mit einer erblichen Krebsveranlagung aufgrund einer Keimbahnmutation in einem Tumorsuppressor-Gen die gleichen Reaktion auf UV-Strahlung wie Zellen von normalen Personen zeigen, mit Ausnahme einer Reaktion: Enhanced Reactivation (verstärkte Reaktivierung). Die ER-Reaktion in Zellen dieser Patienten ist viel höher als in Zellen normaler Personen, daher werden diese Patientenzellen als ERsuper (+) bezeichnet. Die molekularbiologische Basis des ER-Phänomens ist noch unklar. Der Nachweis von ER ist ein zeitaufwändiges Vorgehen, da es auf der Messung der (verstärkten) Überlebensrate eines UV-bestrahlten Virus in UV-geschädigten (oder röntgengeschädigen) Zellen verglichen mit der Überlebensrate in nicht geschädigten Zellen beruht. Eine auf apoptin-induzierter Apoptose bei UV-Bestrahlung beruhende Untersuchung ist beträchtlich einfacher und schneller (siehe unten). Die Tatsache, dass Apoptin bei UV-Bestrahlung in krebsanfälligen Zellen aktiv wird, ermöglicht auch die Untersuchung des ER-Prozesses. Es gibt Hinweise, dass ER bei dem Prozess der Krebsinduktion durch DNA-schädigende Mittel eine wichtige Rolle spielt.
Normale diploide Zellen von krebsanfälligen Personen erfahren nach Röntgenbehandlung eine apoptin-induzierte Apoptose
Als Nächstes haben wir auch die Wirkung einer Röntgenbehandlung auf die Apoptose-Induktion durch Apoptin bei menschlichen diploiden Zellen untersucht. Diploide Fibroblasten, welche von gesunden Personen (VH10) oder von Personen mit einem Krebsanfälligkeitssyndrom wie LF2675- und 401-Zellen gewonnen wurden, wurden mit einem apoptin-kodierenden Plasmid transfiziert. Vor der Transfektion wurde ein Teil der Zellen mit Röntgenstrahlung (Dosis: 5 Gray) behandelt. Als Negativkontrolle wurden die Zellen mit einem das Protein Desmid kodierenden Plasmid transfiziert.
Wie erwartet zeigten alle analysierten nicht bestrahlten Zellen der Zelllinien VH10, LF2675 und 401 keine apoptin-induzierte Apoptose. In Kombination mit der Röntgenbehandlung erfuhren aber die aus krebsanfälligen Personen gewonnenen Zelllinien Apoptose, die aus gesunden Personen gewonnenen Zellen dagegen nicht. Fünf Tage nach der Transfektion war die Mehrzahl dieser röntgenbehandelten apoptin-positiven krebsanfälligen Zellen apoptotisch geworden. Die mit Röntgenstrahlung behandelten Zellen, welche die nichtapoptotische Substanz Desmin exprimierten, erfuhren keine apoptin-induzierte Apoptose.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Behandlung mit Röntgenstrahlen, welche wie die oben beschriebene UV-C-Behandlung DNA-Schäden hervorruft, zur Induktion von Apoptose durch Apoptin bei normalen, nicht transformierten menschlichen Zellen führt.
Diagnose-Assay für krebsinduzierende Gene beruhend auf apoptin-induzierter Apoptose
Danen-Van Oorschot et al. (1997a) haben berichtet, dass die zelluläre Lokalisierung von Apoptin bei tumorerzeugenden/transformierten menschlichen Zellen verglichen mit der Lokalisierung in normalen, nicht transformierten Zellen anders ist. Ferner korreliert auch das Ansammeln von Apoptin in dem Nukleus mit Apoptose-Induktion, wohingegen die zytoplasmische Lokalisierung mit Zellvitalität und normaler proliferativer Kapazität korreliert.
Beruhend auf dem vorliegenden Bericht können wir ein Diagnose-Assay zur Identifizierung von krebsinduzierenden und/oder transformierenden Mitteln oder Genen entwickeln. Eine erste Art von Assay besteht aus dem Transfizieren von „normalen" Zellen, z. B. menschlichen Ursprungs oder von Nagetieren, mit einem Plasmid, welches Apoptin kodiert. oder Infizieren der Zellen mit Virusvektoren, die Apoptin exprimieren, zusammen mit einem Plasmid, welches ein vermeintliches transformierendes/krebsinduzierendes Gen kodiert. Anschließend werden die Zellen (1) auf die Fähigkeit, Apoptose durch das Apoptin-Gen zu erfahren, und (2) auf eine Verschiebung der Lokalisierung des Apoptins von dem Zytoplasma zu dem Nukleus untersucht.
Die intrazelluläre Lokalisierung von Apoptin kann mit Hilfe eines Immunfluoreszenz-Assay mit apoptin-spezifischen monoklonalen Antikörpern, wie CVI-CAV-85.1 ermittelt werden. Wenn der Apoptose-Prozentsatz in normalen Zellen, welche Apoptin und das vermeintliche transformierende/krebsinduzierende Gen coexprimieren, signifikant höher als in den apoptin-positiven Kontrollzellen ist, welche ein Kontrollplasmid exprimieren, kann gefolgert werden, dass das analysierte Gen tatsächlich eine transformierende/krebsinduzierende Aktivität aufweist.
Ein zweites Beispiel eines Diagnosetests beruht auf der Behandlung gezüchteter normaler diploider Zellen mit einem vermeintlichen karzinogenen Mittel. Das Mittel kann zum Beispiel unterschiedlich lange dem Kulturmedium zugegeben werden.
Anschließend werden die Zellen mit einem Plasmid, welches Apoptin kodiert, transfiziert oder mit einem Virusvektor, welcher Apoptin exprimiert, infiziert. Dieses Vorgehen kann auch durch zuerst Transfizieren/Infizieren der normalen Zellen und dann Behandeln der Zellen mit dem zu testenden Mittel ausgeführt werden. Die anschließenden Schritte des Assay sind die gleichen, wie sie für die erste Art von Diagnose-Assay beschrieben wurden.
Diagnose-Assay für Krebsanfälligkeit
Die in diesem Bericht vorgelegten Daten ermöglichen uns die Entwicklung eines Assay zur Ermittlung, ob eine Person mit einem unbekannten zellulären/genetischen Hintergrund verglichen mit normalen Gesunden krebsanfällig ist. Normale diploide Zellen einer krebsanfälligen Person sind gegenüber apoptin-induzierter Apoptose unempfindlich, werden dies aber nach Behandlung mit UV- oder Röntgenstrahlen oder einem anderen DNA-schädigenden Mittel. Nachstehend wird ein Beispiel eines solchen Diagnose-Assay beruhend auf der Wirkung der UV-Strahlung beschrieben. Dieser Assay kann auch mit anderen mutagenen/karzinogenen Mitteln durchgeführt werden.
Primäre normale diploide Zellen werden aus einer Hautbiopsie der zu testenden Person isoliert und in einem geeigneten Medium kultiviert. Als Nächstes werden die Zellen mit UV bestrahlt und anschließend mit einem apoptin-kodierenden Plasmid transfiziert oder mit einem Virusvektor, welcher Apoptin exprimiert, infiziert oder die Zellen werden zuerst transfiziert/infiziert und dann bestrahlt. Parallel werden diploide Zellen von einem normalen Gesunden als Kontrolle verwendet.
Durch Verwenden eines indirekten Immunfluoreszenz-Assay auf der Basis von apoptin-spezifischen Mabs werden die Zellen auf das Vorhandensein von Apoptin im Nukleus und/oder das Erfahren einer Apoptose analysiert. Wenn der Prozentsatz an Zellen, die Apoptose erfahren, unter den apoptin-positiven, UV-behandelten Zellen signifikant höher als der Apoptose-Prozentsatz bei UV-behandelten Zellen einer normalen Person ist, ist dies ein starker Hinweis, dass die Person, von der die Zellen isoliert wurden, krebsanfällig ist.
Verwendung von Apoptin-Proteinen in pharmazeutischen Rezepturen für die Antikrebstherapie
Auf der Grundlage der oben erwähnten Ergebnisse kann man auch Verfahren zur Anwendung von Apoptin in der Antikrebstherapie, nicht als Gen (DNA), sondern als Protein, entwickeln. Apoptin ist ein vergleichsweise kleines Protein, welches es möglich macht, es als Protein in Zellen einzubringen. (Wenn Fragmente des Apoptin-Proteins immer noch die gewünschte apoptotische Wirkung auf Krebszellen haben, werden wir Proteinfragmente an Stelle des intakten Proteins verwenden). Unser Ziel ist die Entwicklung wirksamer pharmazeutischer Rezepturen, welche die Stabilität des aktiven Bestandteils sicherstellen (= Apoptin oder ein Fragment desselben), und falls möglich Spezifizität für die anzuvisierende Tumorzelle.
Die Neoplasien, die wir mit geeigneten sowohl heilenden als auch präventiven apoptin-haltigen Rezepturen zu behandeln hoffen, umfassen: erbliche Formen von Kolorektalkrebs (familiäre adenomatöse Polypose (FAP)) und hereditäres nicht-polypöses kolorektales Karzinom (HNPCC), Leberkrebs (oder andere Organe, die mit Perfusionsverfahren behandelt werden können), Leukämien und Lymphome (über den Blutkreislauf zu behandeln), Hauttumore und möglicherweise Lungentumore (über die Atemwege).
Die Konstruktion und die Analysen eines Expressionsplasmids für die Erzeugung apoptin-transgener Mäuse
Die Tatsache, dass wir jetzt beobachtet haben, dass Apoptin in gezüchteten embryonalen Mäusefibroblasten keine Apoptose induziert, ließ uns schlussfolgern, dass Apoptin auch in dem intakten Embryo und in erwachsenen Mäusen exprimiert werden kann, ohne Toxizität zu verursachen, zumindest in Embryos eines nicht zu frühen Stadiums der embryonalen Entwicklung. Wir haben ein Expressionssystem beruhend auf der murinen H-2Kb-Transkriptionseinheit gewählt, welches eine konstitutive Expression fremder Gene während der Embryogenese und in Erwachsenenstadien verschiedener Organe erlaubt (Drezen et al., 1992; Morello et al., 1986).
Daher haben wir das Expressionsplasmid p21EcoA-Vp3-Eco konstruiert, welches Apoptin unter Regulierung des murinen H-2Kb-Promoters exprimiert. Weiterhin enthält der Expressionsvektor die anderen H-2Kb-Elemente, welche die Expression des Apoptin-Gens erlauben. 8 zeigt eine schematische Darstellung des Expressionsvektors p21EcoA-Vp3-Eco transgenen Apoptins.
Mittels transienter Transfektionen transformierter Saos-2-zellen mit dem Plasmid p21EcoA-Vp3-Eco konnten wir beweisen, dass Apoptin tatsächlich im Kontext der H-2Kb-Sequenzen exprimiert werden konnte. Weiterhin führte das exprimierte Apoptin zur Induktion von Apoptose, und zwar in ähnlichem Umfang wie Apoptin, welches mittels des Plasmids pCMV-VP3 exprimiert wurde (siehe 9).
Diese Ergebnisse implizieren, dass der verwendete Expressionsvektor p21EcoA-Vp3-Eco Apoptin so exprimiert, dass transformierte Zellen zur Apoptose gebracht werden.
Die Erzeugung apoptin-transgener Mäuse
Insgesamt wurden 300 befruchteten Oozyten ein DNA-Fragment mikroinjiziert, welches aus der H-2Kb-Transkriptionseinheit und dem Apoptin-Gen bestand, und diese wurden auf 11 Surrogatmäuse übertragen. Insgesamt hatten wir einen Nachwuchs von 51 neugeborenen Mäusen.
Mittels der Southern-Blot-Analyse (Southern, 1975) der BamHI- oder XbaI-verdauten Mäuseschwanz-DNA unter Verwendung eines 32P-markierten DNA-Fragments bestehend aus dem kompletten VP3-Gen wurde gezeigt, dass die Apoptin/H-2Kb-Einheit in der genomen DNA von insgesamt 7 Founder-Mäusen (F0) integriert war. Alle apoptin-transgenen Mäuse sahen gesund aus. Aus unbekannten Gründen starb jedoch eine apoptin-transgene Maus im Alter von 5–6 Wochen. Die apoptintransgenen Mäuse wurden mit FVB-Männchen oder -Weibchen gepaart. Die Schwanz-DNA des Nachwuchses wurde mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktionsanalyse (PCR) unter Verwendung der Primer P1 (5'-CTCTCCAACAACATACT-CCACCCGG-3') und P2 (CTTATACGCCTTTTTGCGGTTCGGG-3') auf Vorhandensein des Apoptin-Gens analysiert. Aus allen F0-Mäusen erhielten wir eine oder mehrere apoptin-transgene F1-Mäuse (10). Alle Mäuse der F1-Generation der apoptin-transgenen Tiere erwiesen sich als vital und zeigen bisher keinen pathologischen Defekt, welcher mit der Expression von Apoptin in Korrelation stehen könnte.
Mittels der Northern-Blot-Analyse (Noteborn et al., 1992) konnte die Expression des Apoptin-Gens wie erwartet in verschiedenen Organen ermittelt werden.
Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Apoptin-induzierte Apoptose-Aktivität bei „normalen" embryonalen Nagetier-Fibroblasten verglichen mit Zellen von transformierten Nagetier-Zelllinien. Die Zellen wurden transient mit pCMV-VP3 transfiziert. Anschließend wurden die Zellen bei mehreren Zeitintervallen nach der Transfektion fixiert und durch indirekte Immunfluoreszenz mit Hilfe des apoptin-spezifischen Mab 85.1 analysiert. Der Prozentsatz apoptin-positiver Zellen, die mit DAPI anomal verfärbten, wird als relatives Maß für die Induktion von Apoptose gegeben.
2 zeigt die Wirkung des großen T-Antigens und/oder des kleinen T-Antigens von SV40 auf die apoptin-induzierte Apoptose in Fibroblasten und Keratinozyten von normalen Personen. VH10- und FSK-1-Zellen wurden transient mit Plasmid pCMV-VP3 und pCMV-neo oder pSV40, welches das große T- und das kleine T-Antigen von SV40 exprimierte, pR-s884, welches das große T-Antigen von SV40 exprimierte, und pR-SVt, welches das kleine T-Antigen von SV40 exprimierte, transfiziert. Anschließend wurden die Zellen bei mehreren Zeitintervallen nach Transfektion fixiert und durch indirekte Immunfluoreszenz mit Hilfe des apoptin-spezifischen Mab 85.1 analysiert. Der Prozentsatz apoptin-positiver Zellen, die mit DAPI anomal verfärbten, wird als relatives Maß für Apoptose gegeben.
3 zeigt den Ort des Apoptins bei normalen menschlichen diploiden Zellen, welche nur Apoptin oder zusammen mit dem großen T-Antigen und/oder dem kleinen T-Antigen von SV40 exprimieren. Die gleichen in 2 bezüglich der Induktion von Apoptose analysierten Zellen wurden auf den Ort des Apoptin im Nukleus oder im Zytoplasma untersucht. Der Prozentsatz apoptin-positiver Zellen, welche Apoptin im Nukleus enthielten und noch keine Apoptose erfahren hatten, wurde als relatives Maß der Apoptin-Lokalisierung im Nukleus gegeben.
4 zeigt die Wirkung des großen T-Antigens und/oder des kleinen T-Antigens von SV40 auf die apoptin-induzierte Apoptose in Mäusefibroblasten, welche von einer normalen p53+/+ Maus oder einer transgenen p53–/– Knockout-Maus gewonnen werden. Die Zellen wurden transient mit Plasmid pCMV-VP3, welches Apoptin exprimiert, und dem Kontrollplasmid pCMV-neo oder mit pSV40, welches das große T-Antigen von SV40 exprimiert, pR-s884, welches das große T-Antigen exprimiert, und pR-SVt, welches das kleine T-Antigen kodiert, transfiziert. Anschließend wurden die Zellen bei mehreren Zeitabständen nach der Transfektion fixiert und durch indirekte Immunfluoreszenz mit Hilfe des apoptin-spezifischen Mab 85.1 analysiert. Der Prozentsatz apoptin-positiver Zellen, die mit DAPI anomal verfärbten, wird als relatives Maß für Apoptose gegeben.
5 zeigt den Ort des Apoptins bei embryonalen p53+/+ oder p53–/– Mäusefibroblasten, welche nur Apoptin oder zusammen mit dem großen T-Antigen und/oder dem kleinen T-Antigen von SV40 exprimieren. Die gleichen in 4 bezüglich der Induktion von Apoptose analysierten Zellen wurden auf den Ort des Apoptin im Nukleus oder im Zytoplasma untersucht. Der Prozentsatz apoptin-positver Zellen, welche Apoptin im Nukleus enthielten und noch apoptotisch waren, wurde als relatives Maß der Apoptin-Lokalisierung im Nukleus gegeben.
6 zeigt die Wirkung des großen T-Antigens von SV40 auf die apoptin-induzierte Apoptose in den „normalen" diploiden menschlichen Fibroblasten 9605 oder G4905, welche von krebsanfälligen Personen gewonnen werden. Die Zellen wurden transient mit pCMV-VP3 und pCMV-neo oder mit pSV40 oder pSV40, welches sowohl das große T-Antigen als auch das kleine T-Antigen von SV40 exprimiert, pR-s884, welches das große T-Antigen exprimiert, und pR-SVt, welches das kleine T-Antigen kodiert, transfiziert. Anschließend wurden die Zellen bei mehreren Zeitabständen nach der Transfektion fixiert und durch indirekte Immunfluoreszenz mit Hilfe des apoptin-spezifischen Mab 85.1 analysiert. Der Prozentsatz apoptin-positiver Zellen, die mit DAPI anomal verfärbten, wird als relatives Maß für Apoptose gegeben.
7 zeigt die Wirkung von UV-Strahlung auf apoptin-induzierte Apoptose bei „normalen" diploiden Fibroblasten, die aus normalen gesunden Personen gewonnen wurden, verglichen mit krebsanfälligen Patienten. Die Zellen wurden scheinbehandelt oder mit UV-Licht behandelt und anschließend transient mit pCMV-VP3 oder mit pCMV-des transfiziert. Anschließend wurden die Zellen bei mehreren Zeitabständen nach der Transfektion fixiert und durch indirekte Immunfluoreszenz mit Hilfe des apoptin-spezifischen Mab 85.1 analysiert. Der Prozentsatz apoptin-positiver Zellen, die mit DAPI anomal verfärbten, wird als relatives Maß für Apoptose gegeben
8 zeigt eine schematische Darstellung des Expressionsvektors transgenen Apoptins.
9 zeigt die apoptin-induzierte Apoptose-Aktivität in Saos-2-Zellen. Die Zellen wurden transient mit p21EcoA-Vp3-Eco, pCMV-VP3 (welche beide Apoptin exprimieren) oder mit pCMV-des, welches das nicht apoptotische Protein Desmin exprimiert, transfiziert. Anschließend wurden die Zellen bei mehreren Zeitabständen nach der Transfektion fixiert und durch indirekte Immunfluoreszenz mit Hilfe des apoptin-spezifischen Mab 85.1 analysiert. Der Prozentsatz apoptin-positiver Zellen, die mit DAPI anomal verfärbten, wird als relatives Maß für Apoptose gegeben.
10
Schematische Darstellung des Stammbaums der (apoptin)-transgenen VP3-Mäuse. Die weißen Kästchen sind Founder-Mäuse. Die gelben und grünen Kästchen stellen den Nachwuchs (F1) der verschiedenen apoptin-transgenen Founder dar.
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Claims

Verfahren für das Ermitteln der Umwandlungsfähigkeit eines möglichen Umwandlungsmittels, welches das Versehen einer nicht umgewandelten diploiden Zelle mit induzierbarer apoptin-apoptotischer Aktivität, das Aussetzen der Zelle dem Umwandlungsmittel und das Ermitteln der Lokalisierung der apoptotischen Aktivität in der Zelle oder das Ermitteln des Einleitens der Apoptose in der Zelle umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die apoptin-apoptotische Aktivität durch ein plasmid-kodierendes Apoptin oder ein Virusvektor exprimierendes Apoptin vorgesehen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die apoptotische Aktivität durch Transduktion der Zelle mit einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül, welche die Aktivität kodiert, vorgesehen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das mögliche Umwandlungsmittel eine eiweißartige Substanz ist.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die eiweißartige Substanz in der nicht umgewandelten Zelle mit der apoptotischen Aktivität gemeinsam exprimiert wird.
Verfahren für das Ermitteln der Prädisposition einer diploiden Zelle zur Wandlung in eine Tumorzelle durch Versorgen der Zelle mit einer induzierbaren apoptin-apoptotischen Aktivität und Unterziehen der Zelle einer verhältnismäßig milden tumorerzeugenden Aktivität sowie Ermitteln der Apoptose in der Zelle und/oder Ermitteln der Lokalisierung der apoptotischen Aktivität in der Zelle, wobei die apoptin-apoptotische Aktivität durch ein plasmid-kodierendes Apoptin oder ein Viralvektor exprimierendes Apoptin vorgesehen wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die milde tumorerzeugende Aktivität UV-Bestrahlung ist.
Verfahren für das Ermitteln der Prädisposition einer Testperson zu erblichen Krebsarten, welches das Unterziehen einer Probe einer relevanten Untermenge von Zellen dieser Testperson einem Verfahren nach Anspruch 5 oder 6 umfasst.
Verfahren für das Ermitteln einer Genmutation mit onkogener und/oder umwandelnder Aktivität in einer Zelle, welches das Unterziehen der Zelle einem Verfahren nach Anspruch 5 oder 6 umfasst.
Verwendung eines nukleinsäure-kodierenden Apoptin oder eines funktionellen Derivats oder Fragments desselben bei der Herstellung eines Medikaments für die prophylaktische Behandlung von Untermengen von Zellen in einer Person, wobei die Untermenge von Zellen eine Krebsveranlagung aufweist.
Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure in Form eines Gentransfervehikels vorgesehen wird.
Diagnostischer Testkit für das Ausführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 5–8, welcher ein nukleinsäure-kodierendes Apoptin oder ein funktionelles Derivat oder Fragment desselben umfasst, welches zur Transduktion einer eukaryoten Zelle fähig ist und in dieser Zelle exprimiert werden kann, und welcher weiterhin ein Mittel für das Unterziehen einer Zelle einer milden tumorerzeugenden Aktivität umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die eiweißartige Substanz das große T-Antigen von SV40 oder ein funktionelles Äquivalent desselben ist.