DE19811327A1 - Verfahren zur Bestimmung von chemischen Verbindungen - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung von chemischen VerbindungenInfo
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Abstract
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von chemischen Verbindung(en), die an den Ah-Rezeptor von Zielzellen binden, wobei Zielzellen mit den chemischen Verbindungen behandelt werden und wobei die Bindung des Stoffs an den Ah-Rezeptor der Zielzellen durch Messung der hierdurch induzierten Expression eines für toxische Wirkungen der chemischen Verbindung(en) relevanten Detektor-Gens bestimmt wird.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung
von chemischen Verbindungen, die an den Ah-Rezeptor von Zielzellen binden.
Der Ah-Rezeptor ist ein Mitglied der Proteinfamilie bHLH-PAS. Die Mitglieder
dieser Proteinfamilie wirken als bedingt regulierte Transcriptionfaktoren, welche
durch bestimmte niedermolekulare Stoffe, beispielsweise durch Dioxine, aromatische
Kohlenwasserstoffe, (heterozyklische) Nahrungsmittel mutagene und dergleichen
aktiviert werden. Solche niedermolekulare, den Ah-Rezeptor aktivierende Stoffe
werden folgend auch als Ah-Liganden bezeichnet. Die Bezeichnung Dioxine ist die
zusammenfassende Bezeichnung für halogenierte polycyklische aromatische
Kohlenwasserstoffe. Hierzu gehören insbesondere die polychlorierten
Dibenzodioxine, polychlorierten Dibenzofurane und polychlorierten Biphenyle. An
die Stelle von Chlor können auch andere Halogene treten. Als Beispiel ist
2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-1,4-dioxin (TCDD) zu nennen. Der Ausdruck niedermolekular
meint Molekulargewichte unterhalb von 2000. Grundsätzlich bezieht der Begriff
jedoch unabhängig vom Molekulargewicht alle Verbindungen ein, die an den
Rezeptor binden.
Ah-Liganden transformieren den Ah-Rezeptor in einen aktiven Zustand, in welchem
der Ah-Rezeptor z. B. mit dem Kernfaktor ARNT dimerisiert und infolge die
Expression von Zielgenen induziert. Bislang bekannt ist, daß Zielgene, welche mit
dem Metabolismus von Fremdsubstanzen korreliert sind, exprimiert werden. Hierzu
gehören die Cytochrom P450I Subfamilie und Enzyme des Phase II Metabolismus
(Schmidt, J.V., Bradfield C.A. Ann Rev Cell Dev Biol 12, 55 (1996).; Hankinson, O.,
Annu Rev Pharmacol Toxicol 35, 307 (1995). Weiterhin ist bekannt, daß Dioxine die
Proliferation und Differenzierung von Zeilen beeinflussen, wofür als
phänomenologische Wirkungen beispielhaft Krebserkrankungen (z. B. der Leber) oder
Sterilität zu nennen sind. Der Ah-Rezeptor spielt in diesen Prozessen eine Rolle, wie
die Korrelation zwischen Ah-Rezeptoraktivierung und der Toxizität von Dioxin-ver
wandten Liganden sowie genetische Untersuchungen an Mäusen, welche
verschiedene Allele des Ah-Rezeptorgens oder gezielte Null-Mutationen tragen,
zeigen (Schmidt, J.V., Bradfield, C.A., Ann Rev Cell Dev Biol 12,55 (1966);
Hankinson, O., Annu Rev Pharmacol Toxicol 35, 307 (1995); Fernandez-Salguero, P.
et al., Science 268, 722 (1995); Sewall, C.H., Lucier G.W., Mutat Res 333, 111 (1995),
bekannt. Es ist unwahrscheinlich, daß eine Dioxin-induzierte Metabolisierung von
Fremdstoffen für die Toxizität verantwortlich ist. Insofern sind die Mechnismen und
Gene, durch welche der Ah-Rezeptor die vorstehenden ausgeprägten Wirkungen
zeigt, bislang unbekannt. Zwar sind als Zielgene für den Ah-Rezeptor IL-1β und der
Tissue Plasminogen Activator Inhibitor 2 identifiziert worden (Sutter, T.R.,
Guzmann, K., Dold, K.M., Greenlee, W.F., Science 254, 415 (1991), diese scheinen
jedoch, wie andere Zytokine, nicht direkt vom Ah-Rezeptor reguliert zu werden.
Ein Verfahren der eingangs genannten Art ist bekannt aus Safe S. (1993)
Development of bioassays and approaches for the risk assessment of
2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin and related compounds. Environ. Health Perspect. 101:
317-325. Bei dem insofern bekannten Verfahren werden Substanzen mit Affinität an
den Ah-Rezeptor and die Aktivierung des Ah-Rezeptors durch diese Substanzen in
Zellen durch die Aktivierung von Genen für die Metabolisierung von Fremdstoffen
nachgewiesen. Hierbei wird in einzelnen die Induktion des Cytochroms P450IA1
durch den aktivierten Ah-Rezeptor gemessen. Eine solche Messung erlaubt zwar den
Nachweis der Aktivierung des Ah-Rezeptors; die Induktion des Cytochroms P450IA1
hat aber keine direkte Bedeutung für die Toxizität von dioxinartigen Verbindungen.
Demgegenüber wäre es wünschenswert, einen für die Toxizität relevanten Parameter
zu bestimmen.
Gegenüber dem Stand der Technik liegt der Erfindung das technische Problem
zugrunde, ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von
chemischen Verbindungen, die den Ah-Rezeptor binden, zur Verfügung zu stellen.
Dieses Verfahren soll sich insbesondere zur Bestimmung der Toxizität von
dioxinartigen Verbindungen eignen.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein Verfahren, das
dadurch gekennzeichnet ist, daß Zielzellen mit der chemischen Verbindung behandelt
werden und die Bindung des Stoffs an den Ah-Rezeptor der Zielzellen durch
Messung der hierdurch induzierten Expression eines für toxische Wirkungen der
chemischen Verbindungen relevanten Detektor-Gens bestimmt wird.
Vorzugsweise steht das Detektorgen unter der Kontrolle der regulatorischen Elemente
des Kip1-Gens. Als Detektor-Gen ist z. B. ein Gen bezeichnet, welches das
natürlicherweise von dem Kip1-Promoter kontrollierte Kip1-Gen-Produkt ist. In
diesem Falle kann ein Nachweis der Kip1-Expression beispielsweise durch Northern-
Blot oder Western-Immunoblotverfahren erfolgen. Der Ausdruck Detektor-Gen
bezieht sich dabei darauf, daß ein dadurch exprimierbares Protein mit fachüblichen
Mittel zumindest halb-quantitativ unschwer nachweisbar ist.
Alternativ kommen auch synthetische Gene in Betracht, die die wesentlichen
regulatorischen Elemente des Kip1-Gens enthalten. In diesem Falle ist es z. B.
vorteilhaft, das Luziferase-Gen unter die Kontrolle des Kip1-Promoters zu
verwenden, da dieses besonders leicht meßbar ist. Luziferase ist ein in Leuchtorganen
vorkommendes Enzym, das in Gegenwart von Sauerstoff Luziferin in einen optisch
angeregten Zustand überführt. Luziferase läßt sich daher leicht mit optischen
Nachweissystemen messen, wodurch hohe Probendurchsätze möglich sind und ein
effektives Screening von niedermolekularen Stoffen im Rahmen des
erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt werden kann. Denkbar sind für das
erfindungsgemäße Verfahren aber auch andere Detektorsysteme, wie alkalische
Phosphatase, Chloramphinikolacetyltransferase, β-Galactosidase.
Die Erfindung beruht demgemäß auf der neuen Erkenntnis, daß der Ah-Rezeptor
direkt die Expression des Kip1-Gens induziert, und zwar dessen Transskription und
daß ein unter der Kontrolle des Kip1-Gens stehendes Detektorgen einsetzbar ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Testkit, welcher mit dem Kip1-Promoter und
einem von diesem kontrollierten Detektorgen arbeitet, um die verschiedenen
physiologischen Wirkungen der chemischen Verbindungen zu untersuchen. Dieser
zeichnet sich dadurch aus, daß er Zellen enthält, in denen die zuvor beschriebenen
Detektorgene und der Ah-Rezeptor vorhanden sind. Durch ein solches Testkit werden
mehrere Vorteile erreicht. Ein erster Vorteil besteht darin, daß ein für die Toxizität
der chemischen Verbindungen relevanter Parameter zuverlässig bestimmt werden
kann.
Die Erfindung betrifft schließlich auch transgene Zielzellen zur Verwendung in
einem erfindungsgemäßen Verfahren und Testkits, die unter Kontrolle des
Kip1-Promotors stehende fremde Detektorgen-DNS enthalten. Hierbei gelten alle
vorstehenden Erläuterungen bezüglich Promoter und Detektorgen-DNS entsprechend.
Solche Zielzellen sind unschwer mit den Mitteln der Gentechnologie herstellbar. So
kann beispielsweise die c-DNA-Sequenz der Detektorgen-DNS in einen
Expressionsvektor, beispielsweise ein Plasmid, kloniert werden, welcher den
Promotorbereich des Kip1-Gens enthält.
Die DNA-Sequenz beispielsweise für die Luziferase ist bekannt (de Wet et al. a.a.O.).
Die DNA-Sequenz für den Kip1-Promoter ist ebenfalls bekannt, wozu auf Minami, S.
et al. FEBS Letter 411, 1 (1997) verwiesen wird. Die relative Anordnung von Kip1-
Promoter und Detektorgen zueinander erfolgt nach üblichen Verfahren.
Zur Kontrolle der Genübertragung können zusätzlich Selektionsgene in die Zielzelle
eingebracht werden. Dies sind Gene, die eine leichte Selektion der generierten
transgenen Zielzellen erlauben.
Die Auswahl geeigneter Zielzellen liegt im üblichen Können des Fachmanns. Als
Zielzellen kommen Mikroorganismen, tierische und menschliche Zellen in Frage.
Beispiele für geeignete Mikroorganismen sind Hefezellen. Als tierische Zellen
kommen z. B. CHO-Zellen (Göttlicher, M., Wiebel, F.J. Toxicol Appl Pharmacol
111, 496 (1991) oder Hepatomzellen in Betracht.
Sofern die transgenen Zielzellen nichtmenschliche Zellen sind, kann es vorteilhaft
sein, wenn deren Genom für die Expression des human-Ah-Rezeptors codierende
DNS enthält. Diese DNS ist bekannt, wozu auf die Literaturstelle Dolwick et al.
(1993) Cloning and expression of a human Ah receptor cDNA. Mol. Pharmacol. 44:
911-917 verwiesen wird. Hierzu werden die Zielzellen zusätzlich dahingehend
gentechnisch modifiziert, daß sie eine für den human-Ah-Rezeptor kodierende c-DNS
exprimieren. Beispielsweise werden als Zielzellen Zellen von Tieren aus der Gruppe
der Rodenten, beispielsweise 5L Rattenhepatomzellen, verwendet.
Die Erfindung und die der Erfindung zugrundeliegenden Erkenntnisse werden
folgend näher erläutert.
Nachdem durch einleitende Experimente gefunden wurde, der Effekt von Dioxin auf
den Zellzyklus anhaltende und induzierte Genexpression erfordert, wurden
Experimente zur Untersuchung der Ah-Rezeptor-abhängigen, den Zellzyklus
regulierenden Gene durchgeführt durch Charakterisierung biochemischer
Veränderungen im Zellzyklusablauf (Lees, E., Curr Opin Cell Biol 7, 773 (1995);
Morgan, D.O., Nature 374, 131 (1995). Die Pegel der Cycline D und E, welche in dem
G1-S Übergang des Zellzyklus involviert sind, als auch deren assoziierte Cyclin-ab
hängigen Kinasen (cdks 2 und 4) wurden durch Dioxin Behandlung nicht reduziert
(siehe Fig. 2A). Die Pegel der Cycline D2 und D3 waren sogar erhöht, vermutlich
weil die Zellen in einem Zustand eingefroren sind, welcher per se mit einem hohen
Pegel dieser Cycline assoziiert ist. Dennoch, die Cyclin E assoziierte Histon H1
Kinase Aktivität war substanziell reduziert in Verfolg einer Behandlung mit TCDD
(siehe Fig. 2B). p27Kip1 (Polyak, K. et al., Cell 78, 59 (1994); Toyoshima H.,
Hunter, T., Cell 78, 67 (1994), welche unter anderen Bedingungen durch TGFβ
induziert wird, wurde nach 4 bis 72-stündiger Dioxin Exposition mit durchgehend
erhöhtem Pegel gemessen mittels Western Blot (siehe Fig. 2C, Bahnen 1 und 2).
Diese Induktion ist spezifisch, weil die p18-Ink und p21-Cip1 Pegel nicht
nennenswert verändert waren und andere Inhibitoren (p57-Kip2, p15-Ink, p16-Ink,
p19-Ink) nicht nachgewiesen werden konnten. Erhöhte Mengen an p27Kip1 waren
assoziiert mit Cyclin E nach TCDD Behandlung, wie aus einer
Immuncopräzipiationsanalyse (Fig. 2D) ersichtlich. In den gleichen Präzipitaten
wurde die erwartete Akkumulation von einer langsamer wandernden Form von cdk2
gefunden (Fig. 2D), welche vermutlich bei Thr-160 nicht phosphoryliert ist (Polyak,
a.a.O.). AhR (R = Rezeptor) beeinflußt die p27Kip1 Induktion, da eine Dioxin-ab
hängige p27Kip1-Hochregulierung in einem an AhR armen Subclon von 5L Zellen
nicht festgestellt werden konnte (BP8-AhR-, Fig. C, Bahnen 3 und 4). Die Induktion
wurde weiterhin durch ektopische Expression (Weiss, C. et al., Exp Cell Res 226, 154
(1996) des AhR in diesem Subclon wiederhergestellt (BP8-AhR+, Fig. C, Bahnen 5
und 6). Der Anstieg des p27Kip1 Proteinpegels ging einher mit einer vierfachen
Induktion von Kip1 mRNA (Fig. 2E, Bahnen 1 und 2). Dies ist nicht durch RNA
Stabilisierung hervorgerufen, da TCDD den Zerfall von Kip1 mRNA nach
Unterbrechung der Transkription durch Actinomycin D nicht beeinflußt hat. Eine
Kip1 mRNA Induktion erfordert nicht eine Dioxin-induzierte Expression von
intermediären Proteinen, da der Translationsinhibitor Cycloheximid keinen Effekt
zeigte (Fig. 2E, Bahnen 3 und 4). Diese Daten belegen die AhR-abhängige
Aktivierung der Kip1 Transskription als einen neuen Mechanismus der Kip1
Induktion, welcher anders ist gegenüber der Kip1-Protein Akkumulation aufgrund
von posttransskritionaler Regulation wie in anderen Fällen (Loda, M. et al., Nat med
3, 231 (1997), Pagano, M. et al., Science 269, 682 (1995); Tam, S.W., et al., Leukemia
3, 363 (1997).
Genetische Hinweise für eine kausale Rolle der Kip1 Induktion in dioxin-induzierter
Zellzyklus-Verzögerung wurden durch die transiente Expression einer Kip1
Antisensus RNA zur Inaktivierung von Kip1 erhalten. Coexpression des Green
Flourescent Protein (GFP, Heim, A.B. et al., Nature 373, 663 (1997) ermöglichte den
Nachweis von effizient transfizierten Zellen mittels Flow Cytometrie (Fig. 3A).
Wenn GFP zusammen mit einem leeren Expressionsvektor exprimiert wurde,
reduzierte TCDD Behandlung die relative Anzahl von Zellen in S/G2 in beiden, der
effizient transfizierten Subpopulation (Fig. 3B, oberes Panels) und der Mehrzahl von
nicht-transfizierten Zellen aus der gleichen Kulturschale (Fig 3B, zweite Reihe).
Wenn Kip1 Antisensus RNA zusammen mit GFP exprimiert wurde, wurde der
TCDD Effekt auf die Zellzyklus-Verteilung in der effizient transfizierten
Subpopulation an Zellen unterbrochen (Fig. 3B, dritte Reihe). In der nicht-trans
fizierten Subpopulation der gleichen Zellkultur verzögerte TCDD den Fortgang
des Zellzyklus in der erwarteten Weise (Fig. 3B, letzte Reihe). Es ist dabei
anzumerken, daß durch die Elektroporation die Dioxinempfindlichkeit reduziert
wurde, so daß die beobachteten Effekte auf den Zellzyklus weniger ausgeprägt waren
als in nicht-transfizierten Zellen, beispielsweise 1,5-2fach gegenüber 3-4fach in
nicht elektroporierten Zellen (Weiss, a.a.O.). Diese Daten zeigen deutlich, daß Kip1
erforderlich ist für eine AnR-abhängige Dysregulation der Proliferation in 5L Zellen.
Interessanterweise führt ein Verlust von Kip1 durch gezielte Mutagenese in Mäusen
zu einem entgegengesetzten Phänotypus in Verfolg einer Dioxinvergiftung, nämlich
Zunahme des Körpergewichts und multiple Organhyperplasie einschließlich eines
hyperplastischen Thymus (Fero, M.L. et al., Cell 85, 733 (1996); Nakayama, K., ibid.
S. 707; Kiyokawa, ibid S. 721).
Ein wesentlicher Angriffspunkt der Dioxintoxizität ist der Thymus, welcher eine
AhR-abhängige Atrophie erleidet (Poland, A. et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol
22, 517 (1982); Fernandez-Salguero, P. et al., Science 268, 722 (1995)). Fetal Thymus
Organ Culture (FTOC) bietet ein brauchbares Modell zum Studium von Dioxin
Aktivitäten (Lai, Z.W. et al., Mol Pharmacol 52, 30 (1997), sowie die darin genannten
Literaturstellen). Nach nur 2 Tagen FTOC wurde eine 3fache Induktion von Kip1-Pro
tein in Thymocyten, welche von TCDD behandelten Kulturen präpariert wurden,
gefunden, gegenüber Kulturen, die nur dem Lösungsmittel exponiert wurden (Fig.
4A). Dies ging einher mit einer Abnahme der Thymocyten-Proliferation, wie gezeigt
durch einen reduzierten 3H-Thymidine Einbau in die Thymocyten DNA (75 ± 7%) und
einen Abfall von 32 ± 3% auf 24 ± 1% der Anzahl Zellen in den S und G2 Phasen des
Zellzyklus (ein repräsentatives Beispiel von 3 ähnlichen Experimenten ist in der Fig.
4B gezeigt). Die Proliferationsrate in allen frühen Thymocytensubpopulationen war
unabhängig von Status der CD4 oder CD8 Expression (Tabelle 1) reduziert, aber der
Effekt war stärker ausgeprägt in der prädominant unreifen, doppelt negativen und
einer kleinen CD4low/+/CD8-Subpopulation.
Im Ergebnis zeigen die dargestellten Erkenntnisse, daß der Zellzyklus Inhibitor
p27Kip1 unter der Kontrolle von AhR steht. Dadurch wird es erfindungsgemäß
überraschenderweise möglich Daten zur Dioxintoxizität in Rodenten und Menschen
(Sewall, C.H., Lucier G.W., Mutat Res 333, 111 (1995) oder Toxizität bei niedrigen
Dioxinkonzentrationen, wie sie ubiquitär in der Umwelt zu finden sind, zu
vergleichen.
Die Ergebnisse der von den Erfindern durchgeführten Versuche werden anhand der
folgenden Figuren noch näher erläutert:
Die Fig. 1 zeigt die transskriptionsabhängige Verzögerung des Zellzyklus-Fortschritts
durch TCDD. 5L Zellen wurden wachstumsmäßig eingefroren durch Fasten in
serumfreiem Medium über 24h und synchron aus der Blockierung des Zellzyklus
durch Zugabe von Serum befreit. Der Zellzyklusfortschritt wurde durch Western Blot
Analyse überwacht, und zwar 8h nach Serumstimulation durch die Akkumulation von
phosphoryliertem Rb Protein (oberer Pfeil) im Verhältnis zu hypophosphoryliertem
Rb Protein (unterer Pfeil). 2h vor der Analyse wurden die Zellen mit 1 nM TCDD,
dem Transkriptionsinhibitor Actinomycin D (5 µg/ml) oder beidem behandelt. Die
Kultivierungsbedingungen sind zuvor beschrieben worden (Weiss, a.a.O.) und
Extrakte wurden durch Zell-Lysis in denaturiertem SDS Probenpuffer präpariert.
Die Fig. 2 zeigt die Induktion des p27Kip1 Zellzyklusinhibitors während des Verzugs
der TCDD-abhängigen Zellzyklus Progression. Biochemische Eigenschaften von G1-Phase
Cyclin/cdk Komplexen wurden von 30-60% confluent asynchronen
Zellkulturen, welche - außer jenen in Teil E - einer 24-stündigen Behandlung mit
TCDD oder 0,1% des DMSO Lösungsmittels unterzogen worden waren, analysiert.
Mengen an G1-Phase Cyclinen D1, D2, D3 und E sowie cdks 2 und 4 (A) wurden
mittels Western Blot aus Extrakten, welche durch Lysis mit einem milden Detergenz
präpariert wurden (Matsushime, et al., Mol Cell Biol 14, 2066 (1994); bestimmt. Die
Cyclin E-abhängige Histon H1 Kinase Aktivität (B) wurde in einem Immunkomplex
Kinase Assay (Matsuchime, a.a.O.) gemessen nach Präzipitation mit einem Anti-
Cyclin E Antikörper (Bahnen 1 und 2) oder entsprechendem Anti-AP-2 Antikörper
als Negativkontrolle (Bahnen 3 und 4). Die p27Kip1 Proteinpegel (C) wurden aus
Ganzzellenextrakten aus TCDD behandelten Kulturen AhR exprimierender 5L Wild
Typ Zellen, ihren AnR-defizienten BP8AhR-Derivativen und BP8 Zellen, welche
AhR ektopisch exprimieren (BP8AhR+), mittels Western Blot bestimmt (Weiss,
a.a.O.). (D) Die Assoziation von erhöhten p27Kip1 Mengen mit Cyclin E wurde
mittels Immuncopräzipitationsanalyse mit einem anti-Cyclin E Antikörper getestet,
gefolgt von einer Western Blot Analyse von p27Kip1 oder cdk2 (Matsushime,
a.a.O.). Die Induktion von Kip1 mRNA (E) nach 4-stündiger Exposition mit TCDD
mit oder ohne 30-minütiger Vorbehandlung mit dem Translationsinhibitor
Cycloheximid (20 µg/ml) wurde mittels Northern Blot aus 10 µg total RNA getestet.
Die partielle Ratten Kip1 cDNA Probe wurde mittels RT-PCR aus 5L Zellen RNA
generiert unter Verwendung von Primern, welche mit nt 28-54 und nt 548-577 der
murinen cDNA korrespondieren (Polyak, a.a.O.). Die gleichförmige Beladung der
Bahnen in Protein Gelen mit Ganzzellenextrakten wurde mittels Coomassie Färbung
eines Teils des Gels kontrolliert und die RNA Beladung wurde durch
Rehybridisierung des Blots mit einer GAPDH Probe kontrolliert.
Die Fig. 3 zeigt, wie die Expression von Kip1 Antisensus RNA die TCDD induzierte
Verzögerung des Zellzyklusfortschritts beeinflußt. 5L Zellen wurden transient
contransfiziert mit Expressionsvektoren für eine Kip1 Antisensus RNA und GFP
(Teil B, unteres Panel) oder dem leeren Expressionsvektor und GFP (Teil B oberes
Panel) Zellen wurden 32h nach der Transfektion mit 1 nM TCDD oder 0,1% DMSO
Lösungsmittel als Kontrolle behandelt und geerntet für die 18h spätere Analyse mit
Flow Cytometrie unter Verwendung von Trypsin. (A) Die GFP exprimierende
Subpopulation transfizierter Zellen (dicke Linie) wurden mittels hoher Grün-
Fluoreszenz (GFP) identifiziert gegenüber nicht transfizierten Zellen (dünne Linie).
(B) Zellzyklus-Profile wurden mittels H33258 Färbung bestimmt und individuell auf
effizient transfizierte (ca. 5%), grün fluoreszierende Subpopulationen (Reihen 1 und
3) und nicht-transfizierte Subpopulationen (Reihen 2 und 4) analysiert in Gegenwart
von 1 nM TCDD (rechte Panels) oder 0,1% DMSO Lösungsmittel (linke Panels).
Die Fig. 4 zeigt TCDD induziertes p27Kip1 Protein und Zellzyklus-Verzögerung in
tötaler Thymusorgankultur. Fötale Thymusdrüsen aus C57B16 Mäusen wurden nach
14,5 Tagen Schwangerschaft explantiert und für 2 Tage in der Gegenwart von 1 nM
TCDD oder 0,1% DMSO Lösungsmittel kultiviert vor der Präparation von
Thymocyten. p27Kip1 Protein (A) wurde mittels Western Blot aus 105 Thymocyten
bestimmt. Gleichmäßige Beladung des Gels wurde durch erneute Beprobung der
Blots mit einem Erk1 Antikörper sichergestellt (Eines von drei repräsentativen
Beispielen ist gezeigt). Die Zellzyklus Verteilung der gesamten
Lymphocytenpopulation (B) wurde mittels Flow Cytometrie nach DNA Färbung
mittels H33258 Bisbenzimid Farbstoff bestimmt.
Die folgende Tabelle zeigt die Unterdrückung der Proliferation in
Thymocytensubpopulationen durch TCDD. Thymocyten von fötalen Thymusdrüsen
wurden nach 2 Tagen der Kultivierung in der Gegenwart oder in Abwesenheit von
TCDD gesammelt und auf die Zellzyklusverteilung analysiert. Die Werte sind
Mittelwerte ± S.D. aus 3 unabhängigen Experimenten.
Claims (8)
1. Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von chemischen
Verbindungen, die an den Ah-Rezeptor von Zielzellen binden,
dadurch gekennzeichnet, daß Zielzellen mit den chemischen Verbindungen
behandelt werden und die Bindung des Stoffs an den Ah-Rezeptor der Zielzellen
durch Messung der hierdurch induzierten Expression eines für toxische
Wirkungen der chemischen Verbindung(en) relevanten Detektor-Gens bestimmt
wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß das Detektor-Gen das Kip1-Gen ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß das Detektor-Gen das Luziferase-Gen ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß Zielzellen verwendet werden, welche den human-
Ah-Rezeptor exprimieren.
5. Transgene Zielzellen zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 3
oder 4,
dadurch gekennzeichnet, daß deren Genom unter Kontrolle des Kip1-Promotors
stehende fremde Detektorgen-DNS enthält.
6. Transgene Zielzellen nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, daß deren Genom für die Expression des human-Ah-Re
zeptors codierende DNS enthält.
7. Testkit,
dadurch gekennzeichnet, daß er Zielzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 6
enthält.
8. Verwendung der Zielzellen oder des Testkits nach einem der Ansprüche 5 bis 7
zur Untersuchung des Grades der Toxizität verschiedener Stoffe aus der Gruppe
der Dioxine oder verwandter Verbindungen.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19811327A DE19811327A1 (de) | 1998-03-16 | 1998-03-16 | Verfahren zur Bestimmung von chemischen Verbindungen |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1731150B (zh) * | 2005-08-23 | 2010-04-28 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种利用生物芯片检测二恶英类化学物质的方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5496703A (en) * | 1991-11-15 | 1996-03-05 | Cornell Research Foundation, Inc. | Indirect immunoassay for dioxinlike compounds |
US5650283A (en) * | 1993-04-08 | 1997-07-22 | Northwestern University | Biological assay for detecting agonists to the Ah receptor |
-
1998
- 1998-03-16 DE DE19811327A patent/DE19811327A1/de not_active Ceased
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5496703A (en) * | 1991-11-15 | 1996-03-05 | Cornell Research Foundation, Inc. | Indirect immunoassay for dioxinlike compounds |
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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Datenbank "ISI Science litation Index" bei STN, AN 97:290640 Scisearch zu: Murine hepatic p53, RB, and CDK inhibitory protein expression follo- wing acute 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) exposure, Rininger J.A., Stoffregen D.A., Babish J.G., Chemosphere, (Mar-Apr 1997) Vol.34, No.5-7, pp.1557-1568. Publisher: Pergamon-ElsevierScience LTD, The Boulevard, Langford Lane, Kid- lington, Oxford, England OX5 1GB. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN1731150B (zh) * | 2005-08-23 | 2010-04-28 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种利用生物芯片检测二恶英类化学物质的方法 |
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