DE19811327A1 - Verfahren zur Bestimmung von chemischen Verbindungen - Google Patents

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von chemischen Verbindung(en), die an den Ah-Rezeptor von Zielzellen binden, wobei Zielzellen mit den chemischen Verbindungen behandelt werden und wobei die Bindung des Stoffs an den Ah-Rezeptor der Zielzellen durch Messung der hierdurch induzierten Expression eines für toxische Wirkungen der chemischen Verbindung(en) relevanten Detektor-Gens bestimmt wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von chemischen Verbindungen, die an den Ah-Rezeptor von Zielzellen binden.

Der Ah-Rezeptor ist ein Mitglied der Proteinfamilie bHLH-PAS. Die Mitglieder dieser Proteinfamilie wirken als bedingt regulierte Transcriptionfaktoren, welche durch bestimmte niedermolekulare Stoffe, beispielsweise durch Dioxine, aromatische Kohlenwasserstoffe, (heterozyklische) Nahrungsmittel mutagene und dergleichen aktiviert werden. Solche niedermolekulare, den Ah-Rezeptor aktivierende Stoffe werden folgend auch als Ah-Liganden bezeichnet. Die Bezeichnung Dioxine ist die zusammenfassende Bezeichnung für halogenierte polycyklische aromatische Kohlenwasserstoffe. Hierzu gehören insbesondere die polychlorierten Dibenzodioxine, polychlorierten Dibenzofurane und polychlorierten Biphenyle. An die Stelle von Chlor können auch andere Halogene treten. Als Beispiel ist 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-1,4-dioxin (TCDD) zu nennen. Der Ausdruck niedermolekular meint Molekulargewichte unterhalb von 2000. Grundsätzlich bezieht der Begriff jedoch unabhängig vom Molekulargewicht alle Verbindungen ein, die an den Rezeptor binden.

Ah-Liganden transformieren den Ah-Rezeptor in einen aktiven Zustand, in welchem der Ah-Rezeptor z. B. mit dem Kernfaktor ARNT dimerisiert und infolge die Expression von Zielgenen induziert. Bislang bekannt ist, daß Zielgene, welche mit dem Metabolismus von Fremdsubstanzen korreliert sind, exprimiert werden. Hierzu gehören die Cytochrom P450I Subfamilie und Enzyme des Phase II Metabolismus (Schmidt, J.V., Bradfield C.A. Ann Rev Cell Dev Biol 12, 55 (1996).; Hankinson, O., Annu Rev Pharmacol Toxicol 35, 307 (1995). Weiterhin ist bekannt, daß Dioxine die Proliferation und Differenzierung von Zeilen beeinflussen, wofür als phänomenologische Wirkungen beispielhaft Krebserkrankungen (z. B. der Leber) oder Sterilität zu nennen sind. Der Ah-Rezeptor spielt in diesen Prozessen eine Rolle, wie die Korrelation zwischen Ah-Rezeptoraktivierung und der Toxizität von Dioxin-ver­ wandten Liganden sowie genetische Untersuchungen an Mäusen, welche verschiedene Allele des Ah-Rezeptorgens oder gezielte Null-Mutationen tragen, zeigen (Schmidt, J.V., Bradfield, C.A., Ann Rev Cell Dev Biol 12,55 (1966); Hankinson, O., Annu Rev Pharmacol Toxicol 35, 307 (1995); Fernandez-Salguero, P. et al., Science 268, 722 (1995); Sewall, C.H., Lucier G.W., Mutat Res 333, 111 (1995), bekannt. Es ist unwahrscheinlich, daß eine Dioxin-induzierte Metabolisierung von Fremdstoffen für die Toxizität verantwortlich ist. Insofern sind die Mechnismen und Gene, durch welche der Ah-Rezeptor die vorstehenden ausgeprägten Wirkungen zeigt, bislang unbekannt. Zwar sind als Zielgene für den Ah-Rezeptor IL-1β und der Tissue Plasminogen Activator Inhibitor 2 identifiziert worden (Sutter, T.R., Guzmann, K., Dold, K.M., Greenlee, W.F., Science 254, 415 (1991), diese scheinen jedoch, wie andere Zytokine, nicht direkt vom Ah-Rezeptor reguliert zu werden.

Ein Verfahren der eingangs genannten Art ist bekannt aus Safe S. (1993) Development of bioassays and approaches for the risk assessment of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin and related compounds. Environ. Health Perspect. 101: 317-325. Bei dem insofern bekannten Verfahren werden Substanzen mit Affinität an den Ah-Rezeptor and die Aktivierung des Ah-Rezeptors durch diese Substanzen in Zellen durch die Aktivierung von Genen für die Metabolisierung von Fremdstoffen nachgewiesen. Hierbei wird in einzelnen die Induktion des Cytochroms P450IA1 durch den aktivierten Ah-Rezeptor gemessen. Eine solche Messung erlaubt zwar den Nachweis der Aktivierung des Ah-Rezeptors; die Induktion des Cytochroms P450IA1 hat aber keine direkte Bedeutung für die Toxizität von dioxinartigen Verbindungen. Demgegenüber wäre es wünschenswert, einen für die Toxizität relevanten Parameter zu bestimmen.

Gegenüber dem Stand der Technik liegt der Erfindung das technische Problem zugrunde, ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von chemischen Verbindungen, die den Ah-Rezeptor binden, zur Verfügung zu stellen. Dieses Verfahren soll sich insbesondere zur Bestimmung der Toxizität von dioxinartigen Verbindungen eignen.

Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Zielzellen mit der chemischen Verbindung behandelt werden und die Bindung des Stoffs an den Ah-Rezeptor der Zielzellen durch Messung der hierdurch induzierten Expression eines für toxische Wirkungen der chemischen Verbindungen relevanten Detektor-Gens bestimmt wird.

Vorzugsweise steht das Detektorgen unter der Kontrolle der regulatorischen Elemente des Kip1-Gens. Als Detektor-Gen ist z. B. ein Gen bezeichnet, welches das natürlicherweise von dem Kip1-Promoter kontrollierte Kip1-Gen-Produkt ist. In diesem Falle kann ein Nachweis der Kip1-Expression beispielsweise durch Northern- Blot oder Western-Immunoblotverfahren erfolgen. Der Ausdruck Detektor-Gen bezieht sich dabei darauf, daß ein dadurch exprimierbares Protein mit fachüblichen Mittel zumindest halb-quantitativ unschwer nachweisbar ist.

Alternativ kommen auch synthetische Gene in Betracht, die die wesentlichen regulatorischen Elemente des Kip1-Gens enthalten. In diesem Falle ist es z. B. vorteilhaft, das Luziferase-Gen unter die Kontrolle des Kip1-Promoters zu verwenden, da dieses besonders leicht meßbar ist. Luziferase ist ein in Leuchtorganen vorkommendes Enzym, das in Gegenwart von Sauerstoff Luziferin in einen optisch angeregten Zustand überführt. Luziferase läßt sich daher leicht mit optischen Nachweissystemen messen, wodurch hohe Probendurchsätze möglich sind und ein effektives Screening von niedermolekularen Stoffen im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt werden kann. Denkbar sind für das erfindungsgemäße Verfahren aber auch andere Detektorsysteme, wie alkalische Phosphatase, Chloramphinikolacetyltransferase, β-Galactosidase.

Die Erfindung beruht demgemäß auf der neuen Erkenntnis, daß der Ah-Rezeptor direkt die Expression des Kip1-Gens induziert, und zwar dessen Transskription und daß ein unter der Kontrolle des Kip1-Gens stehendes Detektorgen einsetzbar ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Testkit, welcher mit dem Kip1-Promoter und einem von diesem kontrollierten Detektorgen arbeitet, um die verschiedenen physiologischen Wirkungen der chemischen Verbindungen zu untersuchen. Dieser zeichnet sich dadurch aus, daß er Zellen enthält, in denen die zuvor beschriebenen Detektorgene und der Ah-Rezeptor vorhanden sind. Durch ein solches Testkit werden mehrere Vorteile erreicht. Ein erster Vorteil besteht darin, daß ein für die Toxizität der chemischen Verbindungen relevanter Parameter zuverlässig bestimmt werden kann.

Die Erfindung betrifft schließlich auch transgene Zielzellen zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren und Testkits, die unter Kontrolle des Kip1-Promotors stehende fremde Detektorgen-DNS enthalten. Hierbei gelten alle vorstehenden Erläuterungen bezüglich Promoter und Detektorgen-DNS entsprechend. Solche Zielzellen sind unschwer mit den Mitteln der Gentechnologie herstellbar. So kann beispielsweise die c-DNA-Sequenz der Detektorgen-DNS in einen Expressionsvektor, beispielsweise ein Plasmid, kloniert werden, welcher den Promotorbereich des Kip1-Gens enthält.

Die DNA-Sequenz beispielsweise für die Luziferase ist bekannt (de Wet et al. a.a.O.). Die DNA-Sequenz für den Kip1-Promoter ist ebenfalls bekannt, wozu auf Minami, S. et al. FEBS Letter 411, 1 (1997) verwiesen wird. Die relative Anordnung von Kip1- Promoter und Detektorgen zueinander erfolgt nach üblichen Verfahren.

Zur Kontrolle der Genübertragung können zusätzlich Selektionsgene in die Zielzelle eingebracht werden. Dies sind Gene, die eine leichte Selektion der generierten transgenen Zielzellen erlauben.

Die Auswahl geeigneter Zielzellen liegt im üblichen Können des Fachmanns. Als Zielzellen kommen Mikroorganismen, tierische und menschliche Zellen in Frage. Beispiele für geeignete Mikroorganismen sind Hefezellen. Als tierische Zellen kommen z. B. CHO-Zellen (Göttlicher, M., Wiebel, F.J. Toxicol Appl Pharmacol 111, 496 (1991) oder Hepatomzellen in Betracht.

Sofern die transgenen Zielzellen nichtmenschliche Zellen sind, kann es vorteilhaft sein, wenn deren Genom für die Expression des human-Ah-Rezeptors codierende DNS enthält. Diese DNS ist bekannt, wozu auf die Literaturstelle Dolwick et al. (1993) Cloning and expression of a human Ah receptor cDNA. Mol. Pharmacol. 44: 911-917 verwiesen wird. Hierzu werden die Zielzellen zusätzlich dahingehend gentechnisch modifiziert, daß sie eine für den human-Ah-Rezeptor kodierende c-DNS exprimieren. Beispielsweise werden als Zielzellen Zellen von Tieren aus der Gruppe der Rodenten, beispielsweise 5L Rattenhepatomzellen, verwendet.

Die Erfindung und die der Erfindung zugrundeliegenden Erkenntnisse werden folgend näher erläutert.

Nachdem durch einleitende Experimente gefunden wurde, der Effekt von Dioxin auf den Zellzyklus anhaltende und induzierte Genexpression erfordert, wurden Experimente zur Untersuchung der Ah-Rezeptor-abhängigen, den Zellzyklus regulierenden Gene durchgeführt durch Charakterisierung biochemischer Veränderungen im Zellzyklusablauf (Lees, E., Curr Opin Cell Biol 7, 773 (1995); Morgan, D.O., Nature 374, 131 (1995). Die Pegel der Cycline D und E, welche in dem G1-S Übergang des Zellzyklus involviert sind, als auch deren assoziierte Cyclin-ab­ hängigen Kinasen (cdks 2 und 4) wurden durch Dioxin Behandlung nicht reduziert (siehe Fig. 2A). Die Pegel der Cycline D2 und D3 waren sogar erhöht, vermutlich weil die Zellen in einem Zustand eingefroren sind, welcher per se mit einem hohen Pegel dieser Cycline assoziiert ist. Dennoch, die Cyclin E assoziierte Histon H1 Kinase Aktivität war substanziell reduziert in Verfolg einer Behandlung mit TCDD (siehe Fig. 2B). p27Kip1 (Polyak, K. et al., Cell 78, 59 (1994); Toyoshima H., Hunter, T., Cell 78, 67 (1994), welche unter anderen Bedingungen durch TGFβ induziert wird, wurde nach 4 bis 72-stündiger Dioxin Exposition mit durchgehend erhöhtem Pegel gemessen mittels Western Blot (siehe Fig. 2C, Bahnen 1 und 2). Diese Induktion ist spezifisch, weil die p18-Ink und p21-Cip1 Pegel nicht nennenswert verändert waren und andere Inhibitoren (p57-Kip2, p15-Ink, p16-Ink, p19-Ink) nicht nachgewiesen werden konnten. Erhöhte Mengen an p27Kip1 waren assoziiert mit Cyclin E nach TCDD Behandlung, wie aus einer Immuncopräzipiationsanalyse (Fig. 2D) ersichtlich. In den gleichen Präzipitaten wurde die erwartete Akkumulation von einer langsamer wandernden Form von cdk2 gefunden (Fig. 2D), welche vermutlich bei Thr-160 nicht phosphoryliert ist (Polyak, a.a.O.). AhR (R = Rezeptor) beeinflußt die p27Kip1 Induktion, da eine Dioxin-ab­ hängige p27Kip1-Hochregulierung in einem an AhR armen Subclon von 5L Zellen nicht festgestellt werden konnte (BP8-AhR-, Fig. C, Bahnen 3 und 4). Die Induktion wurde weiterhin durch ektopische Expression (Weiss, C. et al., Exp Cell Res 226, 154 (1996) des AhR in diesem Subclon wiederhergestellt (BP8-AhR+, Fig. C, Bahnen 5 und 6). Der Anstieg des p27Kip1 Proteinpegels ging einher mit einer vierfachen Induktion von Kip1 mRNA (Fig. 2E, Bahnen 1 und 2). Dies ist nicht durch RNA Stabilisierung hervorgerufen, da TCDD den Zerfall von Kip1 mRNA nach Unterbrechung der Transkription durch Actinomycin D nicht beeinflußt hat. Eine Kip1 mRNA Induktion erfordert nicht eine Dioxin-induzierte Expression von intermediären Proteinen, da der Translationsinhibitor Cycloheximid keinen Effekt zeigte (Fig. 2E, Bahnen 3 und 4). Diese Daten belegen die AhR-abhängige Aktivierung der Kip1 Transskription als einen neuen Mechanismus der Kip1 Induktion, welcher anders ist gegenüber der Kip1-Protein Akkumulation aufgrund von posttransskritionaler Regulation wie in anderen Fällen (Loda, M. et al., Nat med 3, 231 (1997), Pagano, M. et al., Science 269, 682 (1995); Tam, S.W., et al., Leukemia 3, 363 (1997).

Genetische Hinweise für eine kausale Rolle der Kip1 Induktion in dioxin-induzierter Zellzyklus-Verzögerung wurden durch die transiente Expression einer Kip1 Antisensus RNA zur Inaktivierung von Kip1 erhalten. Coexpression des Green Flourescent Protein (GFP, Heim, A.B. et al., Nature 373, 663 (1997) ermöglichte den Nachweis von effizient transfizierten Zellen mittels Flow Cytometrie (Fig. 3A). Wenn GFP zusammen mit einem leeren Expressionsvektor exprimiert wurde, reduzierte TCDD Behandlung die relative Anzahl von Zellen in S/G2 in beiden, der effizient transfizierten Subpopulation (Fig. 3B, oberes Panels) und der Mehrzahl von nicht-transfizierten Zellen aus der gleichen Kulturschale (Fig 3B, zweite Reihe). Wenn Kip1 Antisensus RNA zusammen mit GFP exprimiert wurde, wurde der TCDD Effekt auf die Zellzyklus-Verteilung in der effizient transfizierten Subpopulation an Zellen unterbrochen (Fig. 3B, dritte Reihe). In der nicht-trans­ fizierten Subpopulation der gleichen Zellkultur verzögerte TCDD den Fortgang des Zellzyklus in der erwarteten Weise (Fig. 3B, letzte Reihe). Es ist dabei anzumerken, daß durch die Elektroporation die Dioxinempfindlichkeit reduziert wurde, so daß die beobachteten Effekte auf den Zellzyklus weniger ausgeprägt waren als in nicht-transfizierten Zellen, beispielsweise 1,5-2fach gegenüber 3-4fach in nicht elektroporierten Zellen (Weiss, a.a.O.). Diese Daten zeigen deutlich, daß Kip1 erforderlich ist für eine AnR-abhängige Dysregulation der Proliferation in 5L Zellen. Interessanterweise führt ein Verlust von Kip1 durch gezielte Mutagenese in Mäusen zu einem entgegengesetzten Phänotypus in Verfolg einer Dioxinvergiftung, nämlich Zunahme des Körpergewichts und multiple Organhyperplasie einschließlich eines hyperplastischen Thymus (Fero, M.L. et al., Cell 85, 733 (1996); Nakayama, K., ibid. S. 707; Kiyokawa, ibid S. 721).

Ein wesentlicher Angriffspunkt der Dioxintoxizität ist der Thymus, welcher eine AhR-abhängige Atrophie erleidet (Poland, A. et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol 22, 517 (1982); Fernandez-Salguero, P. et al., Science 268, 722 (1995)). Fetal Thymus Organ Culture (FTOC) bietet ein brauchbares Modell zum Studium von Dioxin Aktivitäten (Lai, Z.W. et al., Mol Pharmacol 52, 30 (1997), sowie die darin genannten Literaturstellen). Nach nur 2 Tagen FTOC wurde eine 3fache Induktion von Kip1-Pro­ tein in Thymocyten, welche von TCDD behandelten Kulturen präpariert wurden, gefunden, gegenüber Kulturen, die nur dem Lösungsmittel exponiert wurden (Fig. 4A). Dies ging einher mit einer Abnahme der Thymocyten-Proliferation, wie gezeigt durch einen reduzierten ³H-Thymidine Einbau in die Thymocyten DNA (75 ± 7%) und einen Abfall von 32 ± 3% auf 24 ± 1% der Anzahl Zellen in den S und G2 Phasen des Zellzyklus (ein repräsentatives Beispiel von 3 ähnlichen Experimenten ist in der Fig. 4B gezeigt). Die Proliferationsrate in allen frühen Thymocytensubpopulationen war unabhängig von Status der CD4 oder CD8 Expression (Tabelle 1) reduziert, aber der Effekt war stärker ausgeprägt in der prädominant unreifen, doppelt negativen und einer kleinen CD4low/+/CD8-Subpopulation.

Im Ergebnis zeigen die dargestellten Erkenntnisse, daß der Zellzyklus Inhibitor p27Kip1 unter der Kontrolle von AhR steht. Dadurch wird es erfindungsgemäß überraschenderweise möglich Daten zur Dioxintoxizität in Rodenten und Menschen (Sewall, C.H., Lucier G.W., Mutat Res 333, 111 (1995) oder Toxizität bei niedrigen Dioxinkonzentrationen, wie sie ubiquitär in der Umwelt zu finden sind, zu vergleichen.

Die Ergebnisse der von den Erfindern durchgeführten Versuche werden anhand der folgenden Figuren noch näher erläutert:

Die Fig. 1 zeigt die transskriptionsabhängige Verzögerung des Zellzyklus-Fortschritts durch TCDD. 5L Zellen wurden wachstumsmäßig eingefroren durch Fasten in serumfreiem Medium über 24h und synchron aus der Blockierung des Zellzyklus durch Zugabe von Serum befreit. Der Zellzyklusfortschritt wurde durch Western Blot Analyse überwacht, und zwar 8h nach Serumstimulation durch die Akkumulation von phosphoryliertem Rb Protein (oberer Pfeil) im Verhältnis zu hypophosphoryliertem Rb Protein (unterer Pfeil). 2h vor der Analyse wurden die Zellen mit 1 nM TCDD, dem Transkriptionsinhibitor Actinomycin D (5 µg/ml) oder beidem behandelt. Die Kultivierungsbedingungen sind zuvor beschrieben worden (Weiss, a.a.O.) und Extrakte wurden durch Zell-Lysis in denaturiertem SDS Probenpuffer präpariert.

Die Fig. 2 zeigt die Induktion des p27Kip1 Zellzyklusinhibitors während des Verzugs der TCDD-abhängigen Zellzyklus Progression. Biochemische Eigenschaften von G1-Phase Cyclin/cdk Komplexen wurden von 30-60% confluent asynchronen Zellkulturen, welche - außer jenen in Teil E - einer 24-stündigen Behandlung mit TCDD oder 0,1% des DMSO Lösungsmittels unterzogen worden waren, analysiert. Mengen an G1-Phase Cyclinen D1, D2, D3 und E sowie cdks 2 und 4 (A) wurden mittels Western Blot aus Extrakten, welche durch Lysis mit einem milden Detergenz präpariert wurden (Matsushime, et al., Mol Cell Biol 14, 2066 (1994); bestimmt. Die Cyclin E-abhängige Histon H1 Kinase Aktivität (B) wurde in einem Immunkomplex Kinase Assay (Matsuchime, a.a.O.) gemessen nach Präzipitation mit einem Anti- Cyclin E Antikörper (Bahnen 1 und 2) oder entsprechendem Anti-AP-2 Antikörper als Negativkontrolle (Bahnen 3 und 4). Die p27Kip1 Proteinpegel (C) wurden aus Ganzzellenextrakten aus TCDD behandelten Kulturen AhR exprimierender 5L Wild Typ Zellen, ihren AnR-defizienten BP8AhR-Derivativen und BP8 Zellen, welche AhR ektopisch exprimieren (BP8AhR+), mittels Western Blot bestimmt (Weiss, a.a.O.). (D) Die Assoziation von erhöhten p27Kip1 Mengen mit Cyclin E wurde mittels Immuncopräzipitationsanalyse mit einem anti-Cyclin E Antikörper getestet, gefolgt von einer Western Blot Analyse von p27Kip1 oder cdk2 (Matsushime, a.a.O.). Die Induktion von Kip1 mRNA (E) nach 4-stündiger Exposition mit TCDD mit oder ohne 30-minütiger Vorbehandlung mit dem Translationsinhibitor Cycloheximid (20 µg/ml) wurde mittels Northern Blot aus 10 µg total RNA getestet. Die partielle Ratten Kip1 cDNA Probe wurde mittels RT-PCR aus 5L Zellen RNA generiert unter Verwendung von Primern, welche mit nt 28-54 und nt 548-577 der murinen cDNA korrespondieren (Polyak, a.a.O.). Die gleichförmige Beladung der Bahnen in Protein Gelen mit Ganzzellenextrakten wurde mittels Coomassie Färbung eines Teils des Gels kontrolliert und die RNA Beladung wurde durch Rehybridisierung des Blots mit einer GAPDH Probe kontrolliert.

Die Fig. 3 zeigt, wie die Expression von Kip1 Antisensus RNA die TCDD induzierte Verzögerung des Zellzyklusfortschritts beeinflußt. 5L Zellen wurden transient contransfiziert mit Expressionsvektoren für eine Kip1 Antisensus RNA und GFP (Teil B, unteres Panel) oder dem leeren Expressionsvektor und GFP (Teil B oberes Panel) Zellen wurden 32h nach der Transfektion mit 1 nM TCDD oder 0,1% DMSO Lösungsmittel als Kontrolle behandelt und geerntet für die 18h spätere Analyse mit Flow Cytometrie unter Verwendung von Trypsin. (A) Die GFP exprimierende Subpopulation transfizierter Zellen (dicke Linie) wurden mittels hoher Grün- Fluoreszenz (GFP) identifiziert gegenüber nicht transfizierten Zellen (dünne Linie). (B) Zellzyklus-Profile wurden mittels H33258 Färbung bestimmt und individuell auf effizient transfizierte (ca. 5%), grün fluoreszierende Subpopulationen (Reihen 1 und 3) und nicht-transfizierte Subpopulationen (Reihen 2 und 4) analysiert in Gegenwart von 1 nM TCDD (rechte Panels) oder 0,1% DMSO Lösungsmittel (linke Panels).

Die Fig. 4 zeigt TCDD induziertes p27Kip1 Protein und Zellzyklus-Verzögerung in tötaler Thymusorgankultur. Fötale Thymusdrüsen aus C57B16 Mäusen wurden nach 14,5 Tagen Schwangerschaft explantiert und für 2 Tage in der Gegenwart von 1 nM TCDD oder 0,1% DMSO Lösungsmittel kultiviert vor der Präparation von Thymocyten. p27Kip1 Protein (A) wurde mittels Western Blot aus 10⁵ Thymocyten bestimmt. Gleichmäßige Beladung des Gels wurde durch erneute Beprobung der Blots mit einem Erk1 Antikörper sichergestellt (Eines von drei repräsentativen Beispielen ist gezeigt). Die Zellzyklus Verteilung der gesamten Lymphocytenpopulation (B) wurde mittels Flow Cytometrie nach DNA Färbung mittels H33258 Bisbenzimid Farbstoff bestimmt.

Die folgende Tabelle zeigt die Unterdrückung der Proliferation in Thymocytensubpopulationen durch TCDD. Thymocyten von fötalen Thymusdrüsen wurden nach 2 Tagen der Kultivierung in der Gegenwart oder in Abwesenheit von TCDD gesammelt und auf die Zellzyklusverteilung analysiert. Die Werte sind Mittelwerte ± S.D. aus 3 unabhängigen Experimenten.

Claims (8)

1. Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von chemischen Verbindungen, die an den Ah-Rezeptor von Zielzellen binden, dadurch gekennzeichnet, daß Zielzellen mit den chemischen Verbindungen behandelt werden und die Bindung des Stoffs an den Ah-Rezeptor der Zielzellen durch Messung der hierdurch induzierten Expression eines für toxische Wirkungen der chemischen Verbindung(en) relevanten Detektor-Gens bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektor-Gen das Kip1-Gen ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektor-Gen das Luziferase-Gen ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Zielzellen verwendet werden, welche den human- Ah-Rezeptor exprimieren.

5. Transgene Zielzellen zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß deren Genom unter Kontrolle des Kip1-Promotors stehende fremde Detektorgen-DNS enthält.

6. Transgene Zielzellen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß deren Genom für die Expression des human-Ah-Re­ zeptors codierende DNS enthält.

7. Testkit, dadurch gekennzeichnet, daß er Zielzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält.

8. Verwendung der Zielzellen oder des Testkits nach einem der Ansprüche 5 bis 7 zur Untersuchung des Grades der Toxizität verschiedener Stoffe aus der Gruppe der Dioxine oder verwandter Verbindungen.