SK286235B6 - Spôsob zisťovania transformačnej schopnosti látky, spôsob zisťovania predispozície buniek stať sa nádorovými bunkami, použitie nukleovej kyseliny a diagnostická súprava - Google Patents

Abstract

Predložený vynález sa týka spôsobu zisťovania transformačnej schopnosti možnej transformačnej látky, ktorý zahŕňa poskytnutie netransformovanej diploidnej bunky s indukovateľnou apoptínovou apoptickou aktivitou, vystavenie tejto bunky možnej transformačnej látke a určenie lokalizácie apoptickej aktivity vnútri tejto bunky alebo zistenie indukcie apoptózy v tejto bunke, pričom apoptínová apoptickáaktivita je poskytnutá plazmidom kódujúcim apoptín alebo vírusovým vektorom exprimujúcim apoptín. Tiež je opísaný spôsob zisťovania predispozície diploidnej bunky stať sa nádorovou bunkou, použitie nukleovej kyseliny kódujúcej apoptín alebo jeho funkčný derivát, alebo jeho fragment na prípravu liečiva na profylaktické ošetrenie buniek podskupín buniek v osobe, ktorého podskupina buniek je náchylná na rakovinu, a diagnostická súprava na vykonávanie spôsobu podľa vynálezu.

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka oblasti diagnostiky rakoviny, ako aj oblasti zisťovania transformačných schopností podozrivých, nádory vyvolávajúcich alebo nádory podporujúcich látok (pri používaní tu budú obidva termíny zamieňané).

Doterajší stav techniky

V predkladanom vynáleze je spoločným menovateľom pre všetky skôr uvedené oblasti to, že v nich môže byť uplatnený podľa tohto vynálezu apoptín, jeho deriváty alebo jeho fragmenty (tu sú všetky označované ako apoptín alebo apoptínu podobná aktivita). Apoptín je proteín pôvodne nájdený vo víruse slepačej anémie (Notebom a kol.), 1991) a pôvodne bol pomenovaný VP3. Apoptická aktivita tohto proteínu bola objavená skupinou autorov terajšieho vynálezu (Notebom a kol., 1994).

Ako bolo uvedené, predkladaný vynález využíva indukovanie apoptózy účinkom apoptínu.

Apoptóza je aktívny a programovaný fyziologický proces odstraňovania prebytočných, rozsiahlo poškodených alebo malígnych buniek (Eamshaw, 1995, Duke a kol., 1996).

Apoptóza je charakterizovaná vysýchaním buniek, rozpadom jadra a fragmentáciou cytoplazmy, kondenzáciou a štiepením DNA na fragmenty s veľkosťou domén, vo väčšine prípadov nasledovaných rozpadom v oblastiach medzi nukleozómami. Apoptické bunky sa rozpadajú na apoptické telieska, obalené membránou. Nakoniec susedné bunky alebo makrofágy rýchlo tieto umierajúce bunky fagocytujú (Wyllie a kol., 1980, White, 1996). V bunkách rastúcich v podmienkach tkanivovej kultúry a v bunkách z tkanív môžu byť analyzované príznaky apoptózy pomocou činidiel farbiacich chromozomálnu DNA, ako sú napríklad DAPI alebo propidium jodid, ktorý farbí normálnu DNA (chromatickú) silno a pravidelne, ale apoptotický chromatín slabo alebo nepravidelne (Noterbom a kol., 1994, Teford a kol., 1992).

Apoptotický proces môže byť začatý mnohými regulačným podnetmi (Willie, 1995, White 1996, Levine, 1997). Zmeny v bunkovej schopnosti prežiť hrajú dôležitú úlohu v ľudskej patogéneze, napríklad vo vývoji rakoviny, ktorý je spôsobený zvýšeným bujnením alebo znížením umierania buniek (Kerr a kol., 1994, Paulovich, 1997). Bolo ukázané, že rôzne chemoterapeutické činidlá a ožiarenia indukujú apoptózu nádorových buniek, ktorá je v mnohých prípadoch sprostredkovaná supresorovým nádorovým proteínom p53 (Thompson, 1995, Bellamy a kol., 1995, Steller, 1995, McDonell a kol., 1995).

Mnoho nádorov však počas svojho vývoja vyžaduje mutáciu v p53, čo je často v súhlase so slabou odpoveďou na rakovinovú terapiu. Transformačné proteíny DNA nádorových vírusov inaktivujú p53 nepriamo alebo priamo väzbou na neho (Teodoro, 1997). Príkladom takejto látky je veľký T-antigén DNA národového vírusu SC40. V určitých nádoroch systému krvnej tvorby je vysoká expresná úroveň onkogénu Bcl-2 spojená so silnou odolnosťou k rôznym chemoterapeutickým látkam, indukujúcim apoptózu (Hockenbery 1994, Sachs a Lotem, 1997). Pre takéto rakoviny, ktoré sú odolné k rôznym cytotoxickým látkam, sa vyvíjali alternatívne protinádorové liečebné postupy, ktoré sú založené na indukcii apoptózy (Thompson, 1995 a Paulovich a kol., 1997).

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka spôsobu zisťovania transformačnej schopnosti možnej transformačnej látky, ktorý zahŕňa

- poskytnutie netransformovanej diploidnej bunky s indukovateľnou apoptínovou apoptickou aktivitou,

- vystavenie tejto bunky možnej transformačnej látke a

- určenie lokalizácie apoptickej aktivity vnútri tejto bunky alebo zistenie indukcie apoptózy v tejto bunke, pričom apoptínová apoptická aktivita je poskytnutá plazmidom kódujúcim apoptín alebo vírusovým vektorom exprimujúcim apoptín.

Apoptín je malý proteín odvodený z vírusu slepačej anémie (CAV; Notebom a De Boer, 1995, Notebom a kol., 1991, Notebom a kol., 1994), ktorý môže indukovať apoptózu v ľudských nádorových a transformovaných bunkových líniách, ale nie v netransformovaných diploidných ľudských bunkách. In vitro nie je apoptín schopný indukovať programovanú smrť bunky v normálnych lymfoidných, kožných fibroblastických, epidermálnych a endoteliálych bunkách ani v bunkách hladkých svalov. Ale keď sú normálne bunky transformované, napríklad transformačnými génmi zo SV40, stávajú sa citlivé na apoptózu navodenú pomocou apoptínu.

(Danen-van Ooschot, 1997 a Notebom, 1996). Dlhodobá expresia apoptínu v normálnych ľudských fibroblastoch ukázala, že apoptín nemá toxický účinok ani transformačnú aktivitu na tieto bunky. V normálnych bunkách bolo zistené, že apoptín je umiestnený prevažne v cytoplazme, zatiaľ čo v transformovaných alebo nenádorových bunkách bol umiestnený v jadre, čo naznačuje, že umiestnenie apoptínu má vzťah k jeho aktivite, ktorá indikuje bunkovú smrť (Danen-van Ooschot, 1997).

Ďalej bolo zistené, že apoptín môže indukovať apoptôzu aj v neprítomnosti funkčného p53 (Zhuang a kol., 1995a) a nemôže byť inhibovaný proteínom Bcl-2, Bcr-abl (Zhuang a kol., 1995), proteínom BAG-1, spojeným s Bcl-2, ani inhibítorom caspázy, proteínom CrmA vírusu vakcínie (Danen-van Ooschot, 1997 a Notebom, 1996). Zdá sa, že bunky, ktoré sú iba imortalizované a z toho dôvodu minimálne transformované, môžu byť taktiež apoptínom usmrtené.

Preto je apoptín výnimočne účinná protinádorová látka taktiež proti nádorom, ktoré nie sú vôbec alebo sú menej citlivé na (chemo)terapeutické látky, pretože stratili funkčný p53, pre (nad)produkciu Bcl-2 alebo iného génu, ktorý inhibuje apoptôzu. Skutočnosť, že apoptín neindukuje apoptôzu v normálnych ľudských bunkách naznačuje, že toxický účinok pôsobenia apoptínu in vivo bude veľmi nízky. Navyše sa zdá, že dokonca prednádorové, minimálne transformované bunky môžu byť citlivé na smrť indukujúci účinok apoptínu. Na základe znalostí, že apoptín je celkom bezpečný pre normálne bunky, ale že akonáhle sa bunka stane transformovanou alebo imortalizovanou (tieto termíny sa tu môžu pri používaní zamieňať), autori tohto vynálezu opísali niektoré využitia, založené na tomto zistení.

Vynález poskytuje metódu na určenie transformačných schopností potenciálneho transformačného činidla, ktorá pozostáva z dodania indukovateľnej, apoptínu podobnej, apoptotickej aktivity netransformovaným bunkám, vystavenie týchto buniek uvedenému transformačnému činidlu a zistenie lokalizácie uvedenej apoptotickej aktivity vnútri buniek, alebo zistenie indukcie apoptózy v uvedených bunkách. Predpokladá sa, že uvedená apoptotická aktivita označuje tiež entitu, ktorá má uvedenú aktivitu.

Je výhodné dodať uvedeným bunkám zmienenú apoptotickú aktivitu pomocou transdukcie buniek molekulou rekombinantnej nukleovej kyseliny, ktorá uvedenú aktivitu kóduje. Apoptínu podobná aktivita je tu definovaná ako akákoľvek látka (výhodne proteínovej podstaty), ktorá má podobnú aktivitu ako VP3 alebo apoptín, alebo vírus slepačej anémie. Obzvlášť sú do uvedenej definície zahrnuté alelické varianty, deriváty alebo fragmenty apoptínu, pričom deriváty sú definované tak, že obsahujú aminokyselinové zámeny, ktoré nemajú za následok stratu celej apoptotickej aktivity. Predpokladá sa, že výraz podobná aktivita znamená, že druh aktivity je taký istý, hoci jej množstvo môže byť odlišné. Postupy podľa predloženého vynálezu sú obzvlášť vhodné v aplikáciách, kde uvedené možné transformačné činidlo ja látka proteínovej povahy. To umožňuje látke proteínovej povahy byť spoločne exprimovaná v uvedených netransformovaných bunkách s uvedenou apoptotickou aktivitou. Príkladom látky proteínovej povahy je veľký T-antigén vírusu SV40 alebo jeho funkčné ekvivalenty.

Vynález taktiež opisuje modifikácie apoptínového génu, ktoré majú za následok také zmeny proteínu apoptínu, ktoré umožnia apoptínu vstúpiť do jadra netransformovaných a transformovaných/nádorotvomých buniek, čo má za následok indukciu apoptózy. Apoptínový protein je zväčšený o signál na umiestnenie v jadre, ktoré pochádza od SV40. Obzvlášť sú do spomenutej definície apoptínu zahrnuté alelické varianty, deriváty alebo fragmenty apoptínu, pričom deriváty sú definované tak, že obsahujú aminokyselinové zámeny, ktoré nemajú za následok stratu celej apoptickej aktivity. To umožňuje proteínu apoptínu byť spoločne exprimovaný v netransformovaných bunkách s uvedenou apoptotickou aktivitou. Fragmenty apoptínu s uvedenou apoptickou aktivitou, ale neschopné vstúpiť do jadra netransformovaných buniek pomocou svojich vlastných sekvencii, sú schopné do jadra vstúpiť vďaka modifikáciám a indukovať apoptôzu.

Vynález ďalej poskytuje spôsob na určenie, aká je predispozícia bunky na to, aby sa stala bunkou nádorovou tým, že je do uvedenej bunky vnesená indukovateľná, apoptínu podobná apoptotická aktivita, uvedená bunka je vystavená relatívne slabej nádorotvomej aktivite a v uvedenej bunke je zisťovaná apoptóza alebo je zisťovaná lokalizácia uvedenej apoptotickej aktivity v uvedenej bunke. V tomto prípade podozrivé transformačné činidlo, ako tu bolo skôr diskutované, je už prítomné v uvedenej bunke ako mutácia, vedúce k nádorovej alebo nádorotvomej aktivite. V tom prípade skutočnosť, že apoptín indukuje apoptôzu iba v bunkách, ktoré boli už transformované, vedie k možnosti kontrolovať, či bunky obsahujú mutáciu, ktorá vedie k imortalizácii alebo transformácii pri vystavení slabej transformačnej aktivite, ako je ožiarenie UV a pôsobenie žiarenia lúčmi X.

Týmto spôsobom môže byť určená pravdepodobnosť, že ďalší vývoj daných buniek povedie smerom k rakovine. To však vedie k uplatneniu na poli diagnózy zmien u tých osôb, ktoré majú riziko dedičného získania rakoviny a poskytnutie im preventívnej liečby, čo je iným predmetom predloženého vynálezu. Tento druh diagnózy môže byť taktiež uplatnený, keď sú ľudom podávané konzultácie o pravdepodobnosti, s akou budú ich deti predisponované k rakovine.

Predkladaný vynález takto taktiež poskytuje metódu na zisťovanie predispozície subjektu k dedičným typom rakoviny, ktorá pozostáva zo spracovania vzorky príslušného súboru buniek tohto subjektu pomocou postupu, tu opísaného. Vynález ďalej poskytuje metódu na zisťovanie génovej mutácie, ktorá má nádorovú alebo transformačnú aktivitu pre bunky, ktorá pozostáva zo spracovania uvedených buniek pomocou postupu podľa predloženého vynálezu.

Ako tu už bolo skôr uvedené, ďalším predmetom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsoby preventívneho liečenia určitých súborov u osoby, u ktorej sú tieto súbory buniek náchylné na rakovinu. Tieto spôsoby obsahujú nukleovú kyselinu kódujúcu apoptínu podobnú aktivitu, výhodne podanou vo forme nosiča, prenášajúceho gény. Nosiče prenášajúce gény môžu byť vírusového alebo iného pôvodu. V odbore bolo opísaných mnoho nosičov a sú známe osobám so skúsenosťou v tomto odbore. Zahrnujú okrem iného adenovírusové vektory, výhodne vo forme adenovírusových častíc; retrovírusové vektory, výhodne vo forme rekombinatných retrovírusov a tie isté druhy vektorov, ale odvodené od iných vírusov; lipozómy alebo iné nosičové molekuly atď.

Vynález ďalej poskytuje diagnostickú testovaciu súpravu na uskutočňovanie metódy, opísanej v predkladanom vynáleze, na určenie schopnosti činidla vyvolávať nádor, skladajúci sa z netransformovaných buniek, transdukovaných nukleovou kyselinou, kódujúcu apoptín alebo jeho funkčný derivát alebo fragment a prípadne všetky ďalšie potreby nevyhnutné na uskutočnenie testu a detekciu výsledku.

Vynález ďalej poskytuje diagnostickú testovaciu súpravu pre metódy opísané v predloženom vynáleze, na určenie sklonu buniek k rakovine, obsahujúce nukleovú kyselinu, kódujúcu apoptín alebo jeho funkčný derivát alebo fragment, schopnú transdukovať eukaryotickú bunku a schopnú byť v takejto bunke exprimovanou a prípadne všetky ďalšie potreby nevyhnutné na urobenie testu a detekciu výsledku.

Je výhodné, keď sú taktiež poskytnuté prostriedky na vystavenie buniek slabej nádorovej aktivite, ako je žiarenie UV alebo lúčmi X.

Vynález taktiež poskytuje metódu na štúdium indukcie apoptínom indukovanej apoptózy transformujúcimi činidlami, ako sú chemikálie, vírusy, UV žiarenie a X ožiarenie na modeli transgénnych myší, ktorých výsledkom je inhibícia tvorby nádorov. Myši s transgénnym apoptínom môžu byť použité na analýzu protinádorového účinku apoptínu v transgénnych chimérach nesúcich dedičné typy rakoviny a schopné exprimovať apoptín. Ďalej môže byť pomocou opísaných myší s transgénnym apoptínom študovaný účinok expresie apoptínu v in vivo modeloch.

Podrobný opis vynálezu

Už skôr bolo ukázané, že vírusový apoptín indukuje apoptózu v kultivovaných transformovaných bunkách tak ľudského, ako aj hlodavčieho pôvodu, nikdy však v normálnych ľudských bunkách. Teraz bolo pozorované, že apoptín nie je schopný indukovať apoptózu v kultivovaných myších (alebo krysích) embryonálnych fibroblastoch (kultúry boli odvodené zo 16 až 18 dní starých myších (krysích) embryí). To ukazuje, že apoptín môže byť taktiež exprimovaný v nepoškodenom embryu bez toho, aby pôsobil toxicky, prinajmenšom v embryách, ktoré už nie sú vo veľmi skorom štádiu embryonálneho vývoja.

Teraz boli nami vytvorené myši nesúce transgénny apoptín, ktoré boli životaschopné. Takto je podaný dôkaz, že konštutitívna expresia apoptínu v transgénnej myši nemá žiadne smrteľné alebo iné život ohrozujúce alebo život obmedzujúce účinky. Taktiež bolo pozorované, že súčasná transfekcia kultivovaných normálnych ľudských fibroplastov apoptínovým génom a transformujúcimi génmi s SV40 aktivuje apoptický proces, ktorý je spojený s translokáciou apoptínového proteínu z cytoplazmy, kde sa pôvodne akumuluje, do jadra.

Opísaný vynález poskytuje základ na pridávanie aminokyselín k apoptínovému proteínu alebo fragmentom, ktoré im umožnia vstúpiť do bunkového jadra alebo sa v ňom akumulovať, čo má za následok indukciu apoptózy.

Vynález poskytuje základ diagnostického testu na zaistenie potenciálne transformujúcich génov. Na takýto test sú použité normálne diploidné cicavčie bunky, ako sú ľudské alebo hlodavčie bunky. Na tento účel sú normálne diploidné bunky kotransfekované plazmidom obsahujúcim gén (gény), ktoré sa študujú a súčasne plazmidom obsahujúcim apoptín alebo transfekované génom (génmi), ktoré sa študujú a súčasne vírusovým vektorom, ktorý exprimuje apoptín. Vyvolanie apoptínom indukovanej apoptózy alebo prítomnosť v jadre ukazuje, že testovaný gén má transformačnú prípadne nádorovotvomú schopnosť.

Ďalej bolo zistené, že diploidné ľudské bunky, izolované z jedincov nesúcich v zárodočnej línii mutáciu v géne, ktorý potláča vývoj nádorov, následkom čoho sú predisponované na vývoj určitého spektra nádorov (sú tu taktiež označované, že majú sklon k nádorom), sú odolné na účinok apoptínu indukovať apoptózu, rovnako ako diploidné bunky zo zdravých jedincov, ale sa stanú citlivé, keď sú v bunkových kultúrach ožiarené ultrafialovým svetlom.

To umožnilo vyvinúť diagnostický test na predpoveď náchylnosti na rakovinu. V rodinách s dedičnou predispozíciou na vývoj rakoviny, spôsobenou tým, že v zárodkovej línii sa nachádza mutácia v géne, ktorý potláča vývoj nádorov, často nie je možné bez rozsiahlej analýzy chromozonálnej DNA predpovedať, či člen rodiny je postihnutý a nesie v sebe gén spôsobujúci chorobu. Naše výsledky ukazujú, že toto je jednoduchšie uskutočniteľné tým, že sa použije apoptínový gén. Na tento cieľ sú z testovaného jedinca izolované diploidné kožné fibroblasty alebo lymfocyty a kultivované bunky sú transfekované apoptínovým génom s nasledujúcim ožiarením UV svetlom (266 nm). Pokiaľ sa transfekované bunky stanú po UV ožiarení apoptickými, ale súčasne sa nestávajú apoptotickými bez expozície UV ožiarenia, potom ide o (závažný) ukazovateľ toho, že je dinec má sklon k vyvinutiu rakoviny. Nie všetky typy nádorovej predispozície, spôsobené mutáciou génu, ktorý potláča vývoj nádorov, boli doteraz testované týmto apoptín/UV testom. Ale nie je dôvod predpokladať, že ten istý jav doteraz nebude pozorovaný v iných bunkách so sklonom k vývoju nádorov. Podobný diagnostický test na predpovedanie náchylnosti na rakovinu môže byť taktiež urobený s použitím X lúčov namiesto UV ožiarenia.

Vynález taktiež umožňuje získať viacej informácií o molekulárnom základe sklonu k rakovine a jeho vzťahu k určitým odpovediam na stres, ako je zvýšená reaktivácia (ER) (Abrahams a kol., 1996). Zvýšená reaktivácia je jedna z reakcií normálnych (ľudských) buniek na určité látky, poškodzujúca DNA a zdá sa, že odráža citlivosť buniek k nádorovej transformácii.

Experimentálna časť - opis použitých materiálov a metód

Bunky a podmienky na pestovanie bunkových kultúr.

Krysie embryonálne fibroblasty (REF) boli pripravené zo 14 dní starých krysích embryí. Bunky sa nechali rozmraziť po vybratí z tekutého dusíka, kultivované v médiu DMEM doplneným 10 % fetálneho teľacieho séra a transfekované v druhej bunkovej pasáži plazmidovou DNA.

Myšie embryonálne fibroblasty (MEF) boli pripravené z myší p53+/+ alebo z myší s vyradeným p53-/(Tyler Jacks, 1994 a 1996; Tyler Jacks a kol., 1994). Bunky boli pestované na miskách Coming v médiu F15, doplnenom 10 % fetálneho teľacieho séra. Bunky P19 boli odvodené z myšieho embryonálneho karcinómu/tetrakarcinómu (Bumey a kol., 1982). Bunky boli pestované na Petriho miskách, potiahnutých želatínou, v médiu DMEM, doplnenom 8 % fetálneho teľacieho séra.

Bunky BRK/xho boli pripravené z ľadvinových buniek mladých krýs pomocou transformácie oblasti E1 adenovírusu typu 5(Schrier a kol., 1983). Bunky boli pestované v DMEM, doplnenom 10 % fetálneho teľacieho séra.

Ľudské diploidné fibroblasty z predkožky, VH10 a VH25(Klien a koľ, 1990) boli pestované v Eaglovom médiu, modifikovanom podľa Dullbecca (DMEN), doplnenom 10 % fetálneho teľacieho séra.

Začiatok pestovania primárnych kultúr ľudských epidermálnych keratinocytov (FSK-1) bol urobený v kompletnom médiu opísanom v Rheinwald a Green, 1975, s malou zmenou podľa M. Ponec a kol., 1981 a potom pestované v médiu pre keratinocyty (KSFM) bez prítomnosti séra. Na tu opísané pokusy bola použitá tretia bunková pasáž.

Bunky F9605 sú diploidné fibroblasty, ktoré sú p 16-/-, odvodené z pacientov so syndrómom dysplastického materského znamienka (DNS), o ktorom je stanovené, že je predstupňom syndrómu familiárneho atypického mnohotvomého melanómového materského znamienka (FAMMM) (Gruis a kol., 1995). Bunky boli pestované v DMEM, s 10 % fetálneho teľacieho séra.

Bunky GM1492 sú ľudské diploidné fibroblasty, ktoré neexprimujú p53 a sú odvodené z pacientov s Bloomovým syndrómom, autozomálnou recesívnou poruchou s vysokým výskytom rakoviny (Van Laar a kol., 1994). Bunky boli pestované v DMEM, obsahujúcom 10 % fetálneho teľacieho séra.

Bunky LF2675T sú diploidné kožné fibroblasty, ktoré sú odvodené z pacientov s Li-Fraumei syndrómom (LFS). Táto choroba je charakterizovaná tým, že v zárodkovej línii sa vyskytuje mutácia v jednej alele génu pre p53 a taktiež skorým objavovaním sa rôznych typov rakoviny /Srivastava a kol., 1990; Abrahams akol., 1996). Bunky boli pestované v DMEM, doplnenom 10 % fetálneho teľacieho séra.

Všetky kultivačné médiá boli získané od Gibco/BRL a obsahovali antibiotiká penicilín a streptomycín.

Ožarovanie bunkových kultúr.

Upravené médium bolo z kultúr odstránené a bunky boli dvakrát opláchnuté PBS. Po odstránení PBS boli kultúry ožiarené UV, ako bolo opísané (Abrahams a kol., 1984) alebo na ne bolo pôsobené lúčmi X (5 grejov) pomocou prístroja Andrex 225 SMART (Andrex St, Copenhagen) pri 200 kV, 4 mA s filtrom 1 - mm Al. Dávka a intenzita dávky boli kontrolované dozimetrom PTW. Po UV ožiarení bolo navrátené upravené médium a kultúry boli inkubované pri teplote 37 °C.

Plazmidy

Expresný plazmid pCMV-VP3 obsahuje DNA sekvenciu z CAV, ktorá kóduje výlučne apoptínový proteín (nukleotidy 427 až 867; Noterbom a kol., 1991, Noterbom a De Boer 1996) a plazmid pCMV-des, ktorý kóduje desmín, štrukturálny proteín svalových buniek (Menke a kol., 1997). Plazmid pCMV-neo je použitý ako „prázdna“ negatívna kontrola pre plazmidy kódujúce génové produkty s potenciálnym účinkom na apoptózu indukovanú apoptínom. Všetky exprimované gény sú regulované (včasným) rozšíreným promótorom cytomegalovírusu.

Plazmid SV40 obsahuje skorú oblasť SV40 bez originu (ori-) s kódujúcimi oblasťami tak pre veľký T antigén SV40, ako aj pre malý T antigén SV40, regulované ich vlastným promótorom (Dinsart a kol., 1984). Plazmid pR-s884 exprimuje kompletný veľký T antigén SV40 a skrátený malý T antigén pod transkripčnou kontrolou dlhého koncového opakovania (LTR) z vírusu Rousovho sarkómu (RSV; De Ronde a kol., 1989;

Smits a kol., 1992). Plazmid PR-SVt obsahuje cDNA sekvencie kódujúce malý T antigén SV40, fúzovaný s RSV LTR (Philips a Bundell, 1988),

Expresný plazmid 21EcoA, ktorý sa skladá zo sekvencii oblasti myšieho génu pre histokompatibilný antigén/promótor (Mellor a kol., 1982) a pBR327, je darom od Prof. Dr. Franka Grosvelda, Erasmová univerzita, Rotterdam, Holandsko. Plazmid 21EcoA obsahuje cieľové miesto pre Notl vnútri prvého exónu H-2Kb génu, ktoré umožňuje zabudovanie cudzorodého génu, ktorý sa tak stane regulovaný promótorom H-2Kb. Fragment BamHl, obsahujúci sekvenciu kódujúcu apoptín bol izolovaný z pCMV-VP3 a klonovaný pomocou linkéru Notl-BamHl do Notl miesta plazmidu 21EcoA. Výsledný plazmid, obsahujúci apoptínový gén pod regulačnou kontrolou II-2Kb promótora, bol pomenovaný p21EcoA-VP3. Potom bolo EcoRI miesto, nachádzajúce sa v blízkosti apoptínového génu odstránené tak, že plazmid p21 EcoA-VP3 na tomto špecifickom EcoRI mieste bol linearizovaný a bolo na naň pôsobené Klenowovým fragmentom DNA polymerázy. Plazmid je pomenovaný p21EcoA-VP3-Eco.

Fragment DNA obsahujúci expresnú jednotku H-2kB s apoptínovým génom bol oddelený od sekvencii prokarytickej DNA pomocou štiepenia EcoRI a elektroforézou v agarózovom géli.

Plazmidová DNA bola čistená centrifugáciou v gradiente CsCl a chromatografiou na stĺpci Sephacrylu S5000 (Pharmacia, Švédsko).

Prechodná transfekcia

Bunky boli transfekované vo forme jednovrstvovej tkanivovej kultúry za prítomnosti transfekčného činidla DOTAB (Boehringer Mannheim, Spolková republika Nemecko) v podstate tak, ako bolo opísané vo Fischer a kol., 1996 alebo boli transfekované plazmidovou DNA pomocou precipitácie fosfátom vápenatým, ako bolo opísané v Graham a Van der Eb (1873).

Nepriama imunofluorescencia

Všetky bunky boli pestované na mikroskopických sklíčkach. Sklíčka buď neboli potiahnuté (VH10, VH25), alebo boli potiahnuté 3-amino-propyltrietoxysilanom (TESPA; FSK-1). Bunky boli fixované 80 % acetónom počas 10 minút pri teplote miestnosti a použité na nepriamu imunofluorescenciu, ako bolo opísané (Van den Heulvel, 1990). Na demonštráciu prítomnosti alebo bunkovej lokalizácie apoptínu v transformovaných bunkách boli použité myšie monoklonálne protilátky (Mab) CVI-CAV-85.1 (85.1; Noterbom a kol., 1991); pre ľudský desmín myší Mab 33 (Monosa, Uden, Nizozemsko); pre T antigény SV40 Pab 419, láskavo poskytnuté Dr. A. -G Jochemsen, Universita v Leidene, Holandsko). Ako druhá protilátka bola použitá kozia protimyšia protilátka označená fluoresceín izotiokyanátom (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West grove PA, USA). Jadrová DNA bola farbená 2,4-diamino-2-fenylindolom (DAPI).

Príprava transgénnych myší nesúcich gén pre apoptín

Na prípravu transgénnych myší, nesúcich gén pre apoptín, boli použité oplodnené oocyty z myšieho kmeňa FVB a myši z myšieho kmeňa boli použité ako pestúni. Mikroinjekcie do samčieho pronuklea boli urobené podľa Brinster a kol., (1981). V jednej mikroinjekcii bolo podaných 500 kópií EcoRI DNA fragmentu, odvodeného z plazmidu p21EcoA-Vp3-Eco, ktorý obsahuje požadovanú transkripčnú jednotku a kompletný apoptínový gén.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 ukazuje apoptínom indukovanú apoptózovú aktivitu v „normálnych“ embryonálnych fibroblastoch hlodavcov v porovnaní s transformovanými bunkovými líniami hlodavcov. Bunky boli prechodne transfekované pCMV-VP3. Potom boli bunky v niekoľkých časových intervaloch po transfekcii fixované a analyzované nepriamou imunofluorescenciou pomocou Mab 85.1, špecifických na apoptín. Ako relatívna miera indukcie apoptózy je uvedené percento buniek pozitívnych na apoptín, ktoré sa abnormálne farbia DAPI.

Obrázok 2 ukazuje účinok veľkého T antigénu SV40 alebo malého T antigénu SV40 na apoptínom indukovanú apoptózu vo fibroblastoch a keratinocytoch z normálnych jedincov. Bunky VH10 a FSK-1 boli prechodne transfekované plazmidom pCMV-VP3 a pCMV-neo alebo pSV40 exprimujúcim veľký T antigén a malý T antigén SV40, pR-s884 exprimujúcim veľký T antigén SV40 a pR-SVt exprimujúcim T antigén SV40. Potom boli bunky v niekoľkých časových intervaloch po transfekcii fixované a analyzované nepriamou imonufluorescenciou pomocou Mab 85.1, špecifických na apoptín. Ako relatívna miera indukcie apoptózy je uvedené percento buniek pozitívnych na apoptín, ktoré sa abnormálne farbia DAPI.

Obrázok 3 ukazuje lokalizáciu apoptínu v normálnych ľudských disponibilných bunkách, exprimujúcich buď samotný apoptín, alebo apoptín spoločne s veľkým T antigénom SV40 alebo malým T antigénom SV40. V tých istých bunkách, ktoré boli analyzované na obrázku 2, pokiaľ sa týka indukcie apoptózy, bolo taktiež zisťované, či je apoptín lokalizovaný v jadre alebo v cytoplazme. Ako relatívna miera lokalizácie apoptínu v jadre je uvedené percento buniek pozitívnych na apoptín a obsahujúcich apoptín v jadre.

Obrázok 4 ukazuje účinok veľkého T antigénu SV40 alebo malého antigénu SV40 na apoptínom indukovanú apoptózu v myších fibroblastoch, ktoré sú odvodené z normálnych myší p53+/+ alebo z transgénnych myší p53-/-. Bunky boli prechodne transfekované plazmidom pCMV-VP3 exprimujúcim apoptín a kontrolným plazmidom pCMV-VP3 exprimujúcim veľký T antigén SV40, pR-s884 exprimujúcim veľký T antigén a pR-S Vt kódujúcim malý T antigén. Potom boli bunky v niekoľkých časových intervaloch po transfekcii fixované a analyzované nepriamou imunofluorescenciou pomocou Mab 85.1, špecifických na apoptín. Ako relatívna miera indukcie apoptózy je uvedené percento buniek pozitívnych na apoptín, ktoré sa abnormálne farbia DAPI.

Obrázok 5 ukazuje lokalizáciu apoptínu v embryonálnych myších p53+/+ alebo p53-/- fibroblastoch, exprimujúcich buď samotný apoptín alebo apoptín spoločne s veľkých T antigénom SV40 alebo malým T antigénom SV40. V tých istých bunkách, ktoré boli analyzované v obrázku 4, pokiaľ sa týka indukcie apoptózy, bolo teraz taktiež zisťované, či v jadre je uvedené percento buniek pozitívnych na apoptín a obsahujúcich apoptín v jadre a ktoré sú stále v stave apoptózy.

Obrázok 6 ukazuje účinok veľkého T antigénu SV40 na apoptínom indukovanú apoptózovú aktivitu v „normálnych“ diploídných ľudských fibroblastoch 9605 alebo G4905, odvodených z jedincov so sklonom k vývinu rakoviny. Bunky boli prechodne transfekované pCMV-VP3 a pCMV-neo alebo pSV40 exprimujúcim tak veľký T antigén, ako aj malý T antigén SV40, pR-s884 exprimujúcim veľký T antigén SV40 a pRSVt exprimujúcim malý T antigén SV40. Potom boli bunky v niekoľkých časových intervaloch po transfekcii fixované a analyzované nepriamou imunofluorescenciou pomocou Mab 85.1, špecifických na apoptín. Ako relatívna miera indukcie apoptózy je uvedené percento buniek pozitívnych na apoptín, ktoré sa abnormálne farbia DAPI.

Obrázok 7 ukazuje účinok ožiarenia UV na apoptínom indukovanú apoptózu v „normálnych“ diploídných fibroblastoch, odvodených z normálnych zdravých jedincov v porovnaní s pacientmi so sklonom k vývinu rakoviny. Bunkám bolo simulované pôsobenie UV (kontrola) alebo boli skutočne ožiarené UV svetlom a potom boli prechodne transfekované pCMV-VP3 alebo pCMV-des. Nakoniec boli bunky v niekoľkých časových intervaloch po transfekcii fixované a analyzované nepriamou imunofluorescenciou pomocou Mab 85.1, špecifických na apoptín. Ako relatívna miera indukcie apoptózy je uvedené percento buniek pozitívnych na apoptín, ktoré sa abnormálne farbia DAPI.

Obrázok 8 ukazuje schematické znázornenie vektora exprimujúceho transgénny apoptín.

Obrázok 9 ukazuje apoptínom indukovanú apoptózovú aktivitu v bunkách Saos-2. Bunky boli prechodne transfekované p21EcoA-VP3-Eco, pCMV-VP3 (obidva experimujú apoptín) alebo pCMV-des exprimujúcim neapoptický proteín desmín. Potom boli bunky v niekoľkých časových intervaloch po transfekcii fixované a analyzované nepriamou imunofluorescenciou pomocou Mab 85.1, špecifických na apoptín. Ako relatívna miera indukcie apoptózy je uvedené percento buniek pozitívnych na apoptín, ktoré sa abnormálne farbia DAPI.

Obrázok 10 ukazuje schematické znázornenie rodokmeňa transgénnych myší obsahujúcich VP3 (apoptín). Biele sfarbené štvorčeky sú myši - zakladatelia rodokomeňa. Žlto a zeleno sfarbené štvorčeky predstavujú potomstvo (Fl) rôznych zakladateľov rodokmeňa transgénnych myší obsahujúcich apoptín.

Vynález bude podrobnejšie vysvetlený v nasledujúcej experimentálnej časti. Tá slúži iba na ilustračným ciele a nemala by byť interpretovaná ako obmedzovanie rozsahu vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Apoptín indukuje apoptózu v hlodavčích transformovaných bunkách, nie však v normálnych embryonálnych bunkách

Na zistenie, či apoptín nie je schopný indukovať apoptózu v normálnych embryonálnych hlodavčích bunkách, kultúry myších embryonálnych buniek a krysích embryonálnych buniek boli prechodne transfekované plazmidom, indukujúcim apoptín. Ako negatívna kontrola boli bunky transfekované plazmidom, kódujúcim desmín, ktorý nemá apoptickú aktivitu. Bunky exprimujúce apoptín boli vyhľadané pomocou nepriamej imunofluoroscencie s Mab 85.1 a bunky exprimujúce pomocou myších Mab. 33. Indukcia apoptózy v bunkách pozitívnych na apoptín a v bunkách pozitívnych na desmín bola zisťovaná pomocou DAPI, ktorý vytvára pravidelne sfarbenie v nepoškodených jadrách, zatiaľ čo apoptotické jadrá sú sfarbené nepravidelne alebo slabo.

Päť dní po transfekcii bolo apoptických 10 až 20 % buniek pozitívnych na desmín, čo je základná hladina, najpravdepodobnejšie spôsobená samotnou transfekciou (údaje nie sú uvedené, Menke a kol., 1997, Danenvan Oorschot, 1997a). Dva, tri, štyri alebo päť dní po transfekcii percento apoptických buniek v bunkách po zitívnych na apoptín neprevyšovalo významne percento apoptotických buniek, pozorovaných v kultúrach pozitívnych na desmín, čo naznačuje, že apoptín neindukuje apoptózu v normálnych embryonálnych bunkových kultúrach. Prechodná transfekcia transformovaných myších alebo krysích embryonálnych buniek, alebo ľadvinových buniek z mladých krýs plazmidom kódujúcim apoptín dokázala, že apoptín je schopný indukovať v týchto bunkách apoptózu. Výsledky expresie apoptínu v „normálnych“ embryonálnych hlodávčích bunkách v porovnaní s transformovanými hlodavčími bunkami sú ukázané na obrázku 1. Údaje ukazujú, že apoptín nie je schopný indukovať apoptózu v normálnych dospelých a embryonálnych hlodavčich bunkách, ale indukuje apoptózu v ich vírusovo transformovaných analógoch, prinajmenšom v podmienkach bunkovej tkanivovej kultúry.

Príklad 2

Spoločná expresia veľkého T antigénu SV40 a apoptínu má za následok vznik apoptínom indukovanej apoptózy v normálnych ľudských diploidných bunkách

Bol zisťovaný účinok expresie transformačných génov na apoptínom indukovanú apoptózu v normálnych ľudských bunkách, odvodených zo zdravých jedincov. Na tento cieľ boli ľudské diploidné fibroblasty VH10 a diploidné keratinocyty FSK-1 prechodne spoločne transfekované plazmidom pCMV-VP3 kódujúcim apoptín a buď plazmidom pSV40 kódujúcim veľký a malý T antigén SV40, pR-s884 kódujúcim veľký T antigén, pR-SVt kódujúcim malý T antigén alebo plazmidom pCMV-neo ako negatívna kontrola. V bunkách bola pomocou nepriamej imunoflorescencie zisťovaná apoptínom indukovaná apoptóza. Obidve normálne bunky VH10 a FSK-1 neuskutočnili apoptózu, keď im bol kontrolným plazmidom transfekovaný apoptín.

Výsledky ukázali, ako sa očakávalo, že expresia samotného apoptínu nie je schopná indukovať apoptózu v normálnych ľudských diploidných bunkách, čo potvrdzujú údaje opísané v Danen-van Oorschot (1997). Ale normálne diploidné ľudské fibroblasty a keratinocyty, exprimujúce súčasne apoptín a veľký T antigén SV40, buď samotný alebo spoločne s malým T antigénom, uskutočnia apoptínom indukovanú apoptózu (obrázok 2). Miera indukcie apoptózy bola zreteľne zvýšená v prítomnosti vírusových transformačných génov. Spoločná expresia malého T antigénu SV40 a apoptínu nemala za následok indukciu apoptózy apoptínom. Prechod normálnych buniek zo stavu necitlivostí proti apoptínu do stavu citlivosti, môže byť pravdepodobne vysvetlený skutočnosťou, že sa apoptínový proteín premiestni z pozície v cytoplazme do pozície v jadre. Tento prechod sa stáva zrejmý už približne dva dni po transfekcii plazmidov SV40 (obrázok 3). Je možné uzavrieť, že došlo k udalosti, v tomto prípade spôsobenej expresiou transformujúcich produktov DNA nádorových vírusov, ktorá má za následok premiestnenie apoptínu z cytoplazmy do jadra a toto premiestnenie je nasledované indukciou apoptózy.

Príklad 3

Spoločná expresia veľkého T antigénu SV40 a apoptínu má za následok vznik apoptínom indukovanej apoptózy v normálnych hlodavčich diploidných bunkách

Ďalej bol zisťovaný účinok spoločnej expresie transformujúcich génov a apoptínu na indukciu apoptózy v normálnych myších embryonálnych fibroblastoch (MEF) odvodených z myší p53+/+ alebo z transgénnych myší p53-/-. Obidva typy prechodne transfekovaných MEF spoločne exprimujúcich transformujúci veľký T gén SV40 buď s alebo bez malého T antigénu v kombinácii s apoptínom, urobili veľmi rýchlo apoptózu, zatiaľ čo MEF exprimujúci apoptín spoločne s kontrolným plazmidom, kódujúcim netransformujúci malý T antigén neurobili apoptózu indukovanú apoptínom. Výsledky sú ukázané na obrázku 4.

Imunofluorescenčná analýza taktiež odhalila, že spoločná expresia apoptínu a veľkého T antigénu SV40 mala za následok premiestnenie apoptínu v bunke. V testovaných MEF je apoptín umiestnený v cytoplazme. Po expresii veľkého T antigénu SV 40 vstúpi do jadra, po čom nasleduje indukcia apoptózy. Na porovnanie je taktiež na obrázku 5 ukázané percento transformovaných myších buniek pozitívnych na apoptín.

Výsledky naznačujú, že apoptín neindukuje apoptózu ani v p53+/+ ani v p53-/- myších fibroblastoch, ale urobí tak po expresii transformujúceho proteínu.

Táto informácia je dôležitá, pretože je známe, že „normálne“ bunky sú veľmi citlivé na spontánnu transformáciu a ľahko vyvinú silnejšie transformované fenotypy. Strata samotného p53 však nie je postačujúca na vytvorenie transformovaného charakteru. Tento vynález ďalej ukazuje, že apoptín môže indukovať apoptózu po expresii transformujúceho proteínu v iných cicavčích bunkách, ako sú bunky ľudské.

Príklad 4

Spoločná expresia veľkého T antigénu SV40 a apoptínu má za následok vznik apoptínom indukovanej apoptózy v normálnych diploidných bunkách, odvodených z ľudských jedincov so sklonom k vývinu rakoviny

Pomocou prechodnej transfekcie a imunofluorescencie bol taktiež zisťovaný účinok apoptínu na normálnych fibroblastoch F9605 a GM1492, ktoré sú odvodené z jedincov, ktorí vykazujú zvýšený výskyt rakoviny, spôsobený genetickým poškodením. Apoptín nie je schopný indukovať apoptózu v normálnych diploidných bunkách z týchto jedincov, náchylných na vývin rakoviny. Ale po expresii veľkého T antigénu SV40 apoptín indukuje po vstupe do jadra (údaje nie sú uvedené) apoptózu (obrázok 6).

Tieto údaje potvrdzujú, že diploidné bunky, pochádzajú z dedičných syndrómov sklonu k vývinu rakoviny, nie sú citlivé na apoptín, zatiaľ čo citlivými sa stanú, pokiaľ exprimujú transformačný gén. Teda diploidné bunky pochádzajúce z takýchto dedičných syndrómov, sú v tomto pokuse zhodné s „normálnymi“ diploidnými ľudskými bunkami.

Príklad 5

Účinok kovalentnej väzby signálu na jadrovú lokalizáciu z veľkého T antigénu SV40 na apoptínový proteín na indukciu apoptózy

Ďalej bolo zisťované, či expresia chimémeho proteínu obsahujúceho apoptín a signál pre jadrovú lokalizáciu z LT antigénu SV40 (aminokyseliny N-prolín-prolín-lyzín-lyzín-arginín-lyzín-valín-C z veľkého T antigénu, kovalentne viazaný na N-koniec apoptínu) má za následok indukciu apoptózy v netransformovaných a transformovaných ľudských bunkách. Chimémy proteín je nazývaný NLS-apoptín. S týmto cieľom boli netrasformované ľudské fíbroblasty VH10 a netrasformované bunky Saos-2, odvodené z ľudského osteosarkomu (Danen-vn Oorschot a kol., 1997) transfekované plazmidom kódujúcim chimemý proteín NSL-apoptín. V obidvoch typoch buniek má expresia NLS-apoptínu za následok umiestnenie apoptínu v jadre a indukciu apoptózy.

Exprimovaný neapoptický, zeleno fluoreskujúci proteín (Green Fluorescent Proteín - GFP; Pines, 1995) kovalentne viazaný na NLS, vstúpil do jadra, nemalo to však za následok indukciu apoptózy.

Údaje dokazujú, že pozmenený apoptín umožňujúci svoje umiestnenie do jadra v bunkách transformovaných nezávislým spôsobom, bude schopný sa premiestniť do jadra a po tomto premiestnení nasleduje indukcia apoptózy.

Fúzny produkt prvých 69 aminokyselín na N-konci apoptínu a neapoptického GFP proteínu nemalo za následok indukciu apoptózy, čo súhlasí so skutočnosťou, že tento chimémy proteín nevstupuje do jadra (Notebom a Pietersen, 1998). My sme teraz pripojili kovalentne 8 aminokyselín z NLS ku N-koncu apoptínového fragmentu, obsahujúceho aminokyseliny 1 až 69 (NLS-apoptín/1-69). Transfekcia tak netrasformovaných buniek VH10, ako aj nádorotvomých ľudských buniek (ako sú bunky Saos-2, odvodené z ľudského osteosarkómu) plazmidom kódujúcim NLS-apoptinl7/l-69 mala za následok umiestnenie NLS-apoptín/1-69 do jadra po tomto premiestnení nasledovala indukcia apoptózy.

Tieto údaje naznačujú, že vedľa C-koncovej časti apoptínu, taktiež jeho N-koncová časť (aminokyseliny 1 až 69) má rovnaký účinok, keď je premiestnená do jadra. V týchto pokusoch, ako sa očakávalo, bol NLS-GFP premiestnený do jadra, ale nemalo to za následok indukciu apoptózy.

Príklad 6

Normálne diploidné bunky, odvodené z jedincov so sklonom k vývinu rakoviny, uskutočnia apoptínom indukovanú apoptózu po ožiarení UV

Taktiež bol zisťovaný účinok žiarenia UV na indukciu apoptózy apoptínom v diploidných bunkách. Diploidné fíbroblasty, odvodené zo zdravých osôb (VH25) alebo z jedincov so syndrónom sklonu k vývinu rakoviny (bunky LF2675T z pacienta s Li Fraumeniho syndrónom a bunky 401 z pacienta s Lynchovým syndrónom typu 2) boli prechodne transfekované plazmidom kódujúcim apoptín. Pred transfekciou bola časť buniek ožiarená UV. Ako negatívna kontrola boli bunky transfekované plazmidom kódujúcim proteín desmín.

Všetky tri typy buniek, VH25, LF2675T a 401, neprejavovali apoptínom indukovanú apoptózu bez ožiarenia UV. V kombinácii sUV ožiarením však bunky LF2675T a 401, nie však bunky VH25 uskutočnili apoptínom indukovanú apoptózu veľmi rýchlo. Hoci nebolo pre tento jav vysvetlenie, zdalo sa, že je v súhlase s inými bunkovými vlastnosťami. Diploidné bunky z pacientov, ktorí majú sklon na vývin rakoviny, ktorý je spôsobený tým, že v zárodkovej línii je prítomná mutácia v géne, ktorý potláča vznik rakoviny, ukazujú neočakávané reakcie na ožiarenie UV. Keď sa na normálne diplodné fíbroblasty pôsobí UV alebo iným činidlom poškodzujúcim DNA reagujú veľkým počtom rozmanitých prechodných odpovedi vrátane aktivácie signálnej transdukčnej dráhy, indukcie expresie rozmanitých génov, inhibície replikácie bunkovej DNA a aktivácie javu podobného SOS, ako je zvýšená reaktivácia (ER) a zvýšená mutagenéza (EM). Abrahams a kol., (1996) zistili, že normálne diploidné fíbroblasty z pacientov, ktorí majú dedičnú predispozíciu na vývin rakoviny, ktorá je spôsobená tým, že v zárodkovej línii je prítomná mutácia v géne, ktorý potláča vznik rakoviny, ukazujú tie isté odpovede na ožiarenie UV ako bunky z normálnych jedincov okrem jedinej odpovede : zvýšená reaktivácia. Odpoveď ER v bunkách z týchto pacientov je omnoho vyššia ako v bunkách z normálnych jedincov, teda tieto pacientove bunky sú nazývané ERsuper(+). Molekulámo-biologický základ javu ER je stále nejasný. Detekcia ER je časovo náročným prístupom, pretože je založená na meraní (zvýšeného) prežívania vírusu ožiareného UV v bunkách poškodených U V (alebo lúčmi X), v porovnaní s prežívaním v nepoškodených bunkách. Test založený na apoptínom indukovanej apoptóze pod vplyvom ožiarenia

UV je zreteľne jednoduchší a rýchlejší (pozri neskôr). Skutočnosť, že sa apoptín stáva v bunkách so sklonom k vývoju nádorov pod vplyvom ožiarenia UV aktívny, umožňuje taktiež študovať proces ER. Existujú dôkazy, ktoré ukazujú, že ER hrá dôležitú úlohu v procese indukcie rakoviny činidlami, ktoré poškodzujú DNA.

Príklad 7

Normálne diploidné bunky, odvodené z jedincov so sklonom k vývinu rakoviny, uskutočnia apoptínom indukovanú apoptózu po ožiarení X lúčmi

Ďalej bol taktiež zisťovaný účinok ožiarenia X lúčmi na indukciu apoptózy apoptínom v ľudských diploidných bunkách. Diploidné fibroblasty, odvodené zo zdravých jedincov (VH10) alebo z osôb so syndrómom sklonu na vývin rakoviny, ako sú bunky LF2675T a 401, boli transfekované plazmidom kódujúcim apoptín. Pred transfekciou bola časť buniek ožiarená X lúčmi (dávka 5 grejov). Ako negatívna kontrola boli bunky transfekované plazmidom kódujúcim proteín desmín.

Ako sa očakávalo, všetky analyzované neožiarené bunky línií: VH10, LF2675T a 401, neukázali apoptínom indukovanú apoptózu. V kombinácii s ožiarením X lúčmi však bunky odvodené z jedincov so sklonom k vývinu rakoviny uskutočnili apoptínom indukovanú apoptózu, zatiaľ čo tie bunky, ktoré boli odvodené zo zdravých jedincov, ju neuskutočnili. Päť dní po transfekcii sa väčšina z týchto buniek so sklonom k vývinu rakoviny, ožiarených X lúčmi a na apoptín pozitívnych, stala apoptickými. Bunky ožiarené X lúčmi a exprimujúce neapoptické činidlo desmin, neuskutočnili apoptínom indukovanú apoptózu.

Tieto výsledky naznačujú, že ožiarenie X lúčmi, spôsobujúce poškodenie DNA, ako opísané pôsobenie UV-C, má v normálnych netransformovaných ľudských bunkách za následok indukciu apoptózy apoptínom.

Príklad 8

Diagnostický test pre gény indukujúci rakovinu, založený na apoptínom indukovanej apoptóze

Danen- Van Ooschot a kol., (1997) publikoval, že bunková lokalizácia apoptínu je odlišná v nádorových/transformovaných ľudských bunkách v porovnaní s lokalizáciou v normálnych netransformovaných bunkách. Hromadenie apoptínu v jadre koreluje s indukciou apoptózy, zatiaľ čo lokalizácia v cytoplazme koreluje so životaschopnosťou buniek a normálnou schopnosťou množenia.

Na základe predkladanej skutočnosti, sme schopní vyvinúť diagnostický test na určovanie činidiel alebo génov, ktoré majú schopnosť indukovať rakovmu alebo schopnosť transformovať. Prvý typ testov pozostáva z transfekcie „normálnych“ buniek, napríklad buniek ľudského alebo hlodavčieho pôvodu, plazmidom kódujúcim apoptín alebo infekcie týchto buniek vírusovými vektormi, exprimujúcim apoptín, spoločne s plazmidom, kódujúcim predpokladaný transformujúci alebo rakovinu indukujúci gén. Potom budú bunky testované (1) na schopnosť uskutočniť apoptózu vplyvom apoptínového génu a (2) bude v nich sledovaná zmena v lokalizácii apoptínu z cytoplazmy do jadra.

Vnútrobunkovú lokalizáciu apoptínu je možné určiť pomocou imunofluorescenčného testu s monoklonálnymi protilátkami, špecifickými na apoptín, ako sú CVI-CAV-85.1. Ak percento apoptózy v normálnych bunkách spoločne exprimujúcich apoptín a predpokladaný transformujúci alebo rakovinu indukujúci gén je významne vyšší ako v kontrolných bunkách pozitívnych na apoptín a exprimujúcich kontrolný plazmid, je možné uzavrieť, že analyzovaný gén môže skutočne mať transformujúcu alebo rakovinu indukujúcu aktivitu.

Druhý príklad diagnostického testu je založený na pôsobení predpokladaného karcinogénneho činidla na kultivované normálne diploidné bunky. Činidlo môže byť pridané napríklad do kultivačného média počas rôzneho času. Potom sú bunky transfekované plazmidom kódujúcim apoptín alebo infikované vírusovými vektormi, exprimujúcimi apoptín. Tento postup môže byť taktiež uskutočnený tak, že sú najskôr normálne bunky transťekované/infikované a potom je na nich pôsobené testovaným činidlom. Nasledujúce kroky testu sú tie isté ako v prvom type diagnostického testu.

Príklad 9

Diagnostický test sklonu na vývoj rakoviny

Údaje uvedené v tejto správe nám dovoľujú vyvinúť diagnostický test na určovanie, či jedinec s neznámym bunkovým/genetickým základom, je v porovnaní s normálnymi zdravými osobami náchylnejší na vývoj rakoviny. Normálne diploidné bunky z jedinca so sklonom na vývoj rakoviny sú necitlivé na indukciu apoptózy apoptínom, ale stávajú sa citlivými na pôsobenie UV alebo X lúčov alebo iného činidla, poškodzujúceho DNA. Neskôr je opísaný príklad takéhoto diagnostického testu, ktorý je založený na účinku UV ožiarenia. Tento test sa môže taktiež robiť s inými mutagénnymi/kancerogénnymi činidlami.

Primáme normálne diploidné bunky sú izolované z kožnej biopsie testovaného jedinca a kultivované vo vhodnom médiu. Ďalej sú bunky ožiarené UV a potom sú transfekované plazmidom kódujúcim apoptín alebo infikované vírusovým vektorom, exprimujúcim apoptín alebo sú bunky najskôr transfekované/infikované a potom ožiarené. Paralelne sú ako kontrola použité diploidné bunky z normálneho zdravého jedinca.

Pomocou testu nepriamej imunofluorescencie, založeného na monoklonálnych protilátkach špecifických na apoptín, sú bunky analyzované na prítomnosť apoptínu v jadre alebo je zisťované, či je uskutočňovaná apoptóza. Ak percento buniek, v ktorých je uskutočňovaná apoptóza, je medzi UV ožiarenými bunkami pozitívnymi na apoptín významne vyššie ako percento apoptózy v UV ožiarených bunkách normálneho jedinca, je to silným dôkazom, že jedinec, z ktorého boli bunky izolované, má sklon na vývin rakoviny.

Príklad 10

Použitie apoptínových proteínov vo farmaceutických prípravkoch na liečbu rakoviny

Na základe uvedených výsledkov je možné tiež vyvinúť metódy na použitie apoptinu v protirakovinovej liečbe, nie však vo forme jeho génu (DNA), ale ako proteínu. Apoptín je pomerne malý proteín, čo uľahčuje jeho vnesenie ako proteínu do bunky. (Pokiaľ fragmenty apoptínového proteínu stále majú požadovaný apoptický účinok na rakovinové bunky, budú použité proteínového fragmenty namiesto intaktného proteínu). Naším cieľom je vyvinúť účinné farmaceutické prípravky, ktoré zaistia stabilitu aktívnych zložiek (t. j. apoptinu alebo jeho fragmentov) a pokiaľ možno špecifity pre nádorové bunky, ktoré budú cieľom pôsobenia prípravku.

Novotvary, ktoré zamýšľame liečiť vhodnými prípravkami, obsahujúcimi apoptín, tak liečebne, ako aj preventívne, zahrnujú : dedičné formy rakoviny konečníka (familiálna adenomatózna polypóza (APC) a dedičná nepolypózna rakovina konečníka (HNPCC)), rakovina pečene (alebo iných orgánov, ktoré môžu byť liečené premývacími technikami), leukémie a lymfómy (budú liečené cestou krvného obehu), nádory kože a možné pľúcne nádory (cestou dýchacieho ústrojenstva).

Príklad 11

Konštrukcie a analýzy expresného plazmidu na prípravu transgénnych myší nesúcich gén pre apoptín

Skutočnosť, že bolo pozorované, že apoptín nie je schopný indukovať apoptózu v kultivovaných myších embryonálnych fibroblastoch, viedla k záveru, že apoptín môže byť taktiež exprimovaný v intaktnom embryu a dospelej myši bez toho, že by pôsobil toxicky, prinajmenšom v embryách, ktoré nie sú v príliš skorom štádiu embryonálneho vývoja. Bol vybraný expresný systém založený na myšej transkripčnej jednotke H-2Kb, ktorá umožňuje stálu expresiu cudzích génov počas embryogenézy a v štádiu dospelosti v rôznych orgánoch (Drezen a kol., 1992; Morello a kol., 1986).

Preto bol konštruovaný expresný plazmid p21EcoA-Vp3-Eco, ktorý exprimuje apoptín pod reguláciou myšieho promótora H-2Kb. Ďalej expresný vektor obsahuje iné časti H-2Kb, ktoré umožnia expresiu apoptinového génu. Obrázok 8 ukazuje schematicky expresný vektor p21EcoA-Vp3-Eco pre transgénnu expresiu apoptinu.

Metódou prechodnej transfekcie transformovaných buniek Saos-2 plazmidom p21EcoA-Vp3-Eco bolo dokázané, že apoptín môže byť skutočne exprimovaný v prostredí sekvencií H-2Kb. Ďalej exprimovaný apoptín taktiež indukoval apoptózu v podobnom rozsahu ako apoptín exprimovaný pomocou plazmidu pCMV-VP3 (pozri obrázok 9).

Tieto výsledky naznačujú, že použitý expresný vektor p21EcoA-Vp3-Eco exprimuje apoptín takým spôsobom, že transformované bunky uskutočnia apoptózu.

Príklad 12

Príprava transgénnych myší nesúcich gén pre apoptín

Celkom do 300 oplodnených vajíčok bol mikroinjekciou vložený DNA fragment, ktorý obsahuje transkripčnú jednotku H-2Kb a gén pre apoptín a tie boli prenesené do 11 pestúnskych myší. Celkom bolo získaných ako potomstvo 51 novonarodených myší.

Pomocou blokovacej analýzy podľa Southema (Southern, 1975) DNA z myších chvostíkov, štiepenej BamHl alebo Xbal a za použitia 32P označeného DNA fragmentu obsahujúceho kompletný gén VP3 bolo ukázané, že jednotka apoptín/H-2Kb bola včlenená do genómovej DNA celkom siedmich myší - zakladateľov línie (FO). Všetky transgénne myši, nesúce gén pre apoptín, vyzerali zdravo. Z neznámych dôvodov však jedna myš, nesúca gén pre apoptín, uhynula vo veku 5 až 6 týždňov.

Transgénne myši, nesúce gén pre apoptín, boli skrížené so samicou alebo samicami myšieho kmeňa FVB. V DNA z myších chvostíkov potomstva bola zisťovaná prítomnosť apoptínového génu analýzou pomocou polymerázovej reakcie (PCR) - s použitím primerov (5 '-CTCTCCAACAACATACT-CCACCCGG-3') a P2 (CTTATACGCCTTTTT-GCGGTTCGGG-3'). Od všetkých myší FO bola získaná jedna alebo viacej transgénnych myší Fl, nesúcich gén pre apoptín (obrázok 10).

Všetky myšie generácie Fl týchto transgénnych zvierat, nesúcich gén pre apoptín, preukázali životaschopnosť a neprejavili sa u nich žiadne defekty, ktoré by mohli byť dávané do súvislosti s expresiou apoptínu.

Metódou analýzy Northem-blot (Notebom a kol., 1992) môže byť expresia apoptínového génu, ako je možné očakávať, zistená v rôznych orgánoch.

Priemyselná využiteľnosť

Predpokladaný vynález je možné využiť pri liečení niektorých druhov rakoviny. Poskytuje diagnostické súpravy na zaistenie transformačnej aktivity predpokladaných transformujúcich látok, zistenie predispozície buniek na to, že sa vyvinú v nádorové bunky a podobné zistenie predispozície jedinca na vývin dedičných typov rakoviny. Ďalej vynález poskytuje liek na preventívne liečenie osôb, ktoré sú dedične náchylné na vývin niektorých druhov rakoviny.

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob zisťovania transformačnej schopnosti možnej transformačnej látky, ktorý zahŕňa

   - poskytnutie netransformovanej diploidnej bunky s indukovateľnou apoptínovou apoptickou aktivitou,

   - vystavenie tejto bunky možnej transformačnej látke a

   - určenie lokalizácie apoptickej aktivity vnútri tejto bunky alebo zistenie indukcie apoptózy v tejto bunke, vyznačujúci sa tým, že apoptínová apoptická aktivita je poskytnutá plazmidom kódujúcim apoptín alebo vírusovým vektorom exprimujúcim apoptín.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že uvedená apoptická aktivita je poskytnutá transdukciou uvedenej bunky molekulou rekombinantnej nukleovej kyseliny kódujúcej túto aktivitu.
3. 3. Spôsob podľa nárokov 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že uvedená možná transformujúca látka má bielkovinovú podstatu.
4. 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že látka bielkovinovej podstaty je v uvedenej netransformovanej bunke exprimovaná spoločne s apoptickou aktivitou.
5. 5. Spôsob zisťovania predispozície diploidnej bunky stať sa nádorovou bunkou,

   - poskytnutím uvedenej bunke indukovateľnej apoptínovej apoptickej aktivity a

   - podrobením uvedenej bunky relatívne miernej nádorotvomej aktivite a

   - zistením apoptózy v uvedenej bunke a/alebo určením lokalizácie apoptickej aktivity v uvedenej bunke, vyznačujúci sa tým, že apoptínová apoptická aktivita je poskytnutá plazmidom kódujúcim apoptín alebo vírusovým vektorom exprimujúcim apoptín.
6. 6. Spôsob podľa nároku 5,vyznačujúci sa tým, že miernou nádorotvomou aktivitou je UV žiarenie.
7. 7. Spôsob zisťovania predispozície jedinca na zdedené typy rakoviny, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podrobenie

   - vzorky príslušnej podskupine buniek tohto jedinca spôsobu podľa nároku 5 alebo 6.
8. 8. Spôsob zisťovania génovej mutácie majúcej onkogénnu a/alebo transformačnú aktivitu v bunkách, vyznačujúci sa t ý m, že zahŕňa

   - podrobenie uvedenej bunky spôsobu podľa nároku 5 alebo 6.
9. 9. Použitie nukleovej kyseliny kódujúcej apoptín alebo jeho funkčný derivát, alebo jeho fragment na prípravu liečiva na profylaktické ošetrenie buniek podskupín buniek v osobe, ktorého podskupina buniek je náchylná na rakovinu.
10. 10. Použitie podľa nároku 9, v ktorom nukleová kyselina je poskytnutá vo forme prostriedku génového nosiča.
11. 11. Diagnostická súprava na vykonávanie spôsobu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 8,vyznačujúca sa tým, že obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu apoptín alebo jeho funkčný derivát alebo jeho fragment schopný transdukcie eukaryotickej bunky a je schopný byť exprimovaný v takej bunke a ďalej obsahuje prostriedok na podrobenie bunky miernej nádorotvomej aktivite.
12. 12. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že bielkovinová látka je veľký T-antigén z SV40 alebo jeho funkčný ekvivalent.

    10 výkresov