KR20130140221A

KR20130140221A - 감마 카르복실화를 필요로 하는 단백질 생산용 벡터를 포함하는 숙주 세포

Info

Publication number: KR20130140221A
Application number: KR1020137031720A
Authority: KR
Inventors: 앤 뢰브그렌
Original assignee: 아스트라제네카 아베
Priority date: 2005-04-13
Filing date: 2006-04-10
Publication date: 2013-12-23
Also published as: CA2602793A1; TWI384070B; AR053053A1; BRPI0609120A2; US8304224B2; AU2006234788B2; US20080312127A1; KR20080002949A; AU2006234788A1; WO2006110083A1; US20120077229A1; EP1874928A1; IL186036A0; US20130065295A1; RU2007140550A; TW200716753A; CN101198696A; MX2007012704A; US7989193B2; JP2008535517A

Abstract

본 발명은 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열과, 비타민 K 에폭사이도리덕타제(epoxidoreductase)를 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열과, γ-글루타밀 카르복실라제를 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 더 나아가 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질을 높은 수율로 생성하는 방법에 관한 것이다.

Description

감마 카르복실화를 필요로 하는 단백질 생산용 벡터를 포함하는 숙주 세포{A host cell comprising a vector for production of proteins requiring gamma-carboxylation}

본 발명은 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열과, 비타민 K 에폭사이도리덕타제(epoxidoreductase)를 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열과, γ-글루타밀 카르복실라제 및 관련된 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 더 나아가 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질을 높은 수율로 생성하는 방법에 관한 것이다.

출혈은 흔한 임상 문제이다. 출혈은 질병, 외상, 수술 및 약물 치료(medicinal treatment)의 결과로 나타난다. 출혈을 기계적으로 멈추게 하는 것이 필요하다. 이것은 출혈의 위치 때문에 혹은 많은 작은 혈관으로부터의 확산 때문에 어렵게될 수 있거나 불가능할 수도 있다. 따라서, 출혈 환자는 지혈을 지원해주는 약물로 치료하는 것이 필요하다. 이러한 약물에는 혈액으로부터 추출된 제품(haemotherapy), 내인성 지혈제를 방출하게 하는 약물, 재조합된 응고 인자(F) 또는 피덩이 용해를 지연하는 약물이 될 수 있다.

혈액에서 얻어진 제품 중 지역 병원에서 자주 입수된 1차 치료제(first line treatment)에는 볼륨 대체(volume substitution) 및 지혈을 지원하기 위한 전혈(whole blood), 산소 공급 능력을 개선하기 위한 농축 적혈구, 혈소판의 숫자가 낮거나 결핍된 경우 혈소판의 숫자를 증가시키기 위한 농축 혈소판, 지혈(혈액 응고와 혈소판 응집)을 돕기 위한 신선한 냉동 혈장이 있다. 지혈을 돕는 제2차 라인 혈장 유도 제품에는 혈장 냉동침전물, 프로트롬빈 복합체 농축물, 활성 프로트롬빈 복합체 농축물 및 정제된 응고 인자가 있다. 몇가지 응고 인자는 오늘날 비활성 (응고 인자 VIII 및 IX) 및 활성(응고 인자 VIIa) 인간 재조합 단백질로서 입수 가능하다.

혈우병은 비정상적이거나 결핍된 응고 인자 또는 응고 인자에 대해 지향되어 혈액응고촉진 기능을 억제하는 항체로 인한 선천성 혹은 후천적인 출혈 질병이다. 가장 흔한 혈액병은 응고 인자 VIII이 결핍된 혈우병 A와 인자 IX가 결핍된 혈우병 B이다. 정제되거나 재조합된 단일 응고 인자들이 혈우병 환자의 주된 처치제이다. 억제성 항체를 갖고 있는 환자는 이들 항체가 환자에게 투여된 응고 인자를 중화시킬 수 있기 때문에 치료 문제를 안고 있다.

활성형 단백질 C(APC)는 활성 응고 인자 Va와 VIIIa를 분해함으로써 혈장 응고를 억제하는 억제제이다. 재조합 APC는 패혈증 환자의 비정상적인 혈장 응고를 효과적으로 치료하는 것으로 보여져 왔다.

정제 과정이 간단하지 않고, 오염된 바이러스 제거를 목적으로 하는 몇가지 단계들을 포함하는 많은 단계들을 필요로 하기는 하지만, 치료용 응고 인자는 인간 혈장으로부터 얻을 수 있다. 그러나, 광범위한 안전 조치나 혈액에서 유도된 제품의 테스트에도 불구하고, 감염성 바이러스나 프리온에 의한 오염은 제거될 수 없다. 이러한 위험성 때문에, 인간 치료 단백질을 동물 유도 성분이 없는 배지에서 배양된 재조합 세포로부터 생성하는 것이 크게 바람직하다. 이것은 항상 간단하지는 않는데, 그 이유는 많은 단백질이 충분히 기능적 형태로 생성되어지는 즉, 정확히 번역후 변형되어지는 포유류 숙주를 필요로 하기 때문이다. 재조합 세포에서 상업적으로 생산되는 응고 인자에는 FVII(NovoSeven), FVIII(Kogenate, Recombinate, Refacto), FIX(BeneFix) (Roddie 및 Ludlam. Blood Rev. 11:169-177, 1997), 그리고 활성 단백질 C(Xigris)가 있다. 충분히 기능적인 재조합 인간 응고 인자를 다량 얻는데 있어서 주된 장애 중 하나는 FII, FVII, FIX, FX, 단백질 S, 및 단백질 C에 존재하는 Gla 도메인에 있다. 이 도메인은 카르복실기를 추가하여 번역후 변형되는 글루타민산 잔기를 포함한다. 이들 인자의 생산은 이들의 과도한 발현이 저카르복실화되고 이에 따라 비활성인 단백질로 된다는 사실에 의해서 방해받는다. Gla 변형은 γ-글루타밀 카르복실라제(GGCX)로 불리는 비타민 K-의존 효소 작용의 결과이다. 이 효소는 많은 과학자들에 의해 광범위하게 연구되어 왔는데, 특히, 응고 인자 연구에 관여한 과학자들에 의해 연구되어 왔다(WO-A-8803926; Wu 등. Science 254(5038):1634-1636, 1991; Rehemtulla 등, Proc Natl Acad Sci USA 90:4611-4615, 1993; Stanley J. Biol. Chem. 274(24):16940-16944, 1999; Vo 등, FEBS letters 445:256-260, 1999; Begley 등., The Journal of Biological Chemistry 275(46):36245-36249, 2000; Walker 등, The Journal of Biological Chemistry 276(11):7769-7774, 2001; Bandyopadhyay 등. Proc Natl Acad Sci USA 99(3):1264-1269, 2002; Czerwiec 등, Eur J Biochem 269:6162-6172, 2002; Hallgren 등, Biochemistry 41(50):15045-15055, 2002; Harvey 등, The Journal of Biological Chemistry 278(10):8363-8369, 2003). GGCX와 응고 인자 FIX를 공동 발현시키려는 시도가 적어도 두개의 과학 그룹에서 있었으나 성공적이지 못했다(Rehemtulla 등. 1993, 동서(ibid); Hallgren 등. 2002, 동서). GGCX 효소에 대한 많은 관심을 고려하면, 더 많은 시도가 실패했고 이에 따라 보고가 되지 않았다고 가정할 수 있다. GGCX는 보조인자로서 환원형 비타민 K를 필요로 한다. 환원형 비타민 K는 GGCX에 의해 비타민 K 에폭사이드로 변환되고, 이 비타민 K 에폭사이드는 비타민 K 에폭사이도리덕타제(VKOR)에 의해 환원형 비타민 K로 리사이클된다. 따라서, 단백질의 효과적인 비타민 K 의존 카르복실화를 위해서는 두 개의 효소, GGCX와 VKOR이 필요하다. VKOR의 클로닝과 식별은 2004년도에 보고되었다(Li et al., Nature 427:541-543, 2004, Rost et al., Nature 427:537-541, 2004). VKOR 단백질은 적어도 하나의 예측된 막횡단 부분을 갖는 163 아미노산 폴리펩타이드이다. 재조합 세포로부터 VKOR 활동은 마이크로솜 세포하 분획으로 국소화된다.

인간 FII(프로트롬빈)에 대해, 완전히 기능적인 프로트롬빈을 얻기 위해서는 적어도 10개의 Glu 잔기 중 8개는 정확하게 변형되어야 한다(Malhotra, et al., J. Biol. Chem. 260:279-287, 1985; Seegers and WaIz Prothrombin and other vitamin K proteins', CRC Press, 1986). 이와 유사하게, 인간 응고 인자 IX의 응고 활동은 Gla-도메인에서 12개의 글루타민 잔기 중 적어도 10개의 γ-카르복실화를 필요로 한다(White et al, Thromb. Haemost. 78:261-265, 1997). 높은 생산 수준의 rhFII를 얻기 위한 광범위한 노력이 몇 개의 다른 시스템, 예를 들어, CHO 세포, BHK 세포, 293 세포, 및 백시니아 바이러스 발현 시스템을 이용하여 행해져 왔으나, 모두 실패했거나 카르복실화가 부족한 프로덕트가 되어 기능적으로 비활성 프로트롬빈이 되고 말았다(Jørgensen et al., J. Biol. Chem. 262:6729-6734, 1987; Russo et al., Biotechnol Appl Biochem 14(2):222-233, 1991; Fischer et al., J Biotechnol 38(2):129-136, 1995; Herlitschka et al. Protein Expr. Purif. 8(3):358-364, 1996; Russo et al., Protein Expr. Purif. 10:214-225, 1997; Vo et al. 1999, ibid; Wu and Suttie Thromb Res 96(2):91-98, 1999). 초기에 보고된 카르복실화된 재조합 인간 프로트롬빈의 생산성은 낮았는데, 돌연변이 프로트롬빈에 대해서는 20 mg/L (Cote et al., J. Biol. Chem 269:11374-11380, 1994), CHO 세포에서 발현된 인간 프로트롬빈에 대해서는 0.55 mg/L(충분히 카르복실화됨, Jørgensen et al. 1987, 동서), CHO 세포에서는 25 mg/L (카르복실화 정도는 나타나지 않음, Russo et al. 1997, 동서)로 보고되었다.

알려진 바와 같이, γ-카르복실화를 필요로 하는 단백질과 VKOR의 공동 발현(co-expressing)은 초기에 보고되지 않았다.

국제특허공보 WO 92/19636은 인간과 소의 비타민 K 의존 카르복실라제의 클로닝과 서열 식별을 개시하고 있다. 상기 출원은 비타민 K 의존 단백질을 준비하기 위하여, 적절한 숙주 세포에서 비타민 K 의존 카르복실라제(GGCX)와 비타민 K 의존 단백질의 공동 발현을 제안하고 있다. 카르복실라제와 비타민 K 의존 단백질의 공동 발현은 예시되어 있지 않다.

국제특허공보 WO 2005/038019는 γ-카르복실화된 단백질과 GGCX의 제어된 공동 발현에 의해 전반적인 γ-카르복실화된 단백질의 생산성을 증가시키는 방법을 청구하고 있다. 상기 발명은 응고인자 II 및 FIX의 개선된 생산성과 함께 예시되어 있다.

국제특허공보 WO 2005/030039는 γ-카르복실화를 개선하기 위하여 비타민 K 의존 단백질을 비타민 K 에폭사이드 환원효소(VKOR)를 가지고 공동발현하는 것을 제안하고 있다. 그러나, 그러한 발현은 예시되어 있지 않다.

썬(Sun) 등에 의해 응고 인자 X(FX)와 VKOR의 공동 발현이 γ-카르복실화된 단백질의 부분(share)을 개선한다는 점이 증명되었다(Blood 106: 3811-3815, 2005). 와지(Wajih) 등은 VKOR과의 공동 발현에 의해 개선된 γ-카르복실화된 응고 인자 IX(FIX)의 부분(share)을 입증하였다(JBC 280:31603-31607, 2005) 이들 두 논문은 VKOR이 γ-카르복실화된 단백질의 부분을 증가시키나 VKOR 공동 발현은 응고 인자의 전체 생산성은 개선시키지 못한다고 보고하고 있다.

높은 수율로 활성화된 혈액 응고 인자들을 생산하는 개선된 방법에 대한 요구가 있다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키기 위한 방법에 관한 것이다.

도 1은 F10NopA (인자 X + GGCX) 공동 발현 벡터의 플라스미드 맵과 VKORzeo (VKOR) 발현 벡터의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 2는 FII, GGCX 및 VKOR의 공동 발현을 위해 사용된 벡터의 플라스미드 맵을 도시한다.

본 발명의 제1측면에 따르면, 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터와, 비타민 K에폭사이도리덕타제(epoxidoreductase)을 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것인데, 이 숙주 세포는 γ-글루타밀 카르복실라제를 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열을 더 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 (i)감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질과, (ii) 비타민 K 에폭사이도리덕타제를 발현하기 위해 조작된(engineered) 세포를 제공하는 것으로서, 상기 단백질 (i) 및 (ii)가 10:1과 500:1 사이의 비율로 발현된다.

본 발명의 또 다른 측면은 유전적으로 변형된 진핵 숙주 세포를 제공하는 것으로서, 이 숙주 세포는 (i) 비타민 K 에폭사이도리덕타제 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드--상기 비타민 K 에폭사이도리덕타제 단백질 인코딩 서열은 상기 세포에 의해 비타민 K 에폭사이도리덕타제 단백질의 발현을 허용하는 발현 제어 서열에 동작가능하게 링크되어 있음--;와 (ii)γ-글루타밀 카르복실라제 단백질에 의해 카르복실화를 필요로 하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 세포에 의해 상기 카르복실화를 필요로 하는 단백질의 발현을 허용하는 발현 제어 서열에 동작가능하게 링크되어 있는 폴리뉴클레오티드; 및 (iii) 감마-글루타밀 카르복실라제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열과, 비타민 K 에폭사이도리덕타제를 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 (i) 감마-카르복실화를 필요로 하는 재조합 단백질, 비타민 K 에폭사이도리덕타제, 및 γ-글루타밀 카르복실라제를 발현하는 세포를 배양하는 단계와, (ii) 감마-카르복실화된 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 감마-카르복실화된 단백질을 생성하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 방법은 전술한 방법에 따라 생성된 활성 카르복실화된 단백질을 정제하는 단계와, 상기 정제된 카르복실화된 단백질을 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 혼합하는 단계를 포함하는, 혈액 응고를 유도하거나 또는 증가되거나 감소되는 응고를 촉진시키기 위해 적절한 약학 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 방법에 따라 얻어진 분리된 감마-카르복실화된 단백질을 약리학적으로 유효한 양을 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자에게 증가된 또는 감소된 응고를 촉진시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 방법에 따라 생성된 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질은 지혈 치료 또는 항혈전 치료에 사용될 수 있다.

[실시예]

본 발명의 제1측면은 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터와, 비타민 K 에폭사이도리덕타제(epoxidoreductase)를 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하고, γ-글루타밀 카르복실라제을 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열을 더 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다.

일 실시예에서, 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질을 인코딩하는 상기 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열은 제1 프로모터를 포함하고, 비타민 K 에폭사이도리덕타제를 인코딩하는 상기 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열은 제2 프로모터를 포함한다. 다른 실시예에서, 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질과 비타민 K 에폭사이도리덕타제가 적어도 10:1의 비율로 발현되도록 상기 제1 프로모터가 상기 제2 프로모터보다 충분히 더 강력하다. 다른 실시예에서, 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질과 비타민 K 에폭사이도리덕타제가 적어도 5:1의 비율로 발현되도록 상기 제1 프로모터가 상기 제2 프로모터보다 충분히 더 강력하다.

또 다른 실시예에서, 세포는 γ-글루타밀 카르복실라제를 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열을 더 포함한다. 일실시예에서, γ-글루타밀 카르복실라제 및 관련된 발현 제어 서열을 인코딩하는 핵산 분자는 제3 프로모터를 더 포함하는데, 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제가 적어도 5:1의 비율로 발현되도록 상기 제1 프로모터가 상기 제3 프로모터보다 충분히 더 강력하다. 또 다른 실시예에서, 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질과 비타민 K 에폭사이도리덕타제가 적어도 5:1의 비율로 발현되도록 상기 제1 프로모터가 상기 제2 프로모터보다 충분히 더 강력하다.

제1 프로모터는 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 최조기 프로모터(immediate-early promoter)가 될 수 있고, 제2 및 제3 프로모터는 SV40 조기 프로모터(early promoter)가 될 수 있다.

감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열과, 비타민 K 에폭사이도리덕타제 및 선택적으로 γ-글루타밀 카르복실라제를 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열 모두가 동일한 발현 벡터내에 위치한다. 또 다른 실시예에서, 이들 둘 또는 선택적으로 세 개의 핵산 분자들은 두개 이상의 별도의 발현 벡터에 위치한다.

본 발명의 또 다른 측면은 (i)감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질과, (ii) 비타민 K 에폭사이도리덕타제를 발현하기 위해 조작된(engineered) 세포를 제공하는 것으로서, 상기 단백질 (i) 및 (ii)가 10:1과 500:1 사이의 비율로 발현된다. 또 다른 실시예에서는, 상기 단백질 (i) 및 (ii)가 5:1과 500:1 사이의 비율로 발현된다.

감마-카르복실화를 필요로 하는 상기 단백질은 응고 인자 VII, 응고 FVII, 응고 인자 IX, 응고 FIX, 프로트롬빈, 응고 인자 II, 응고 FII, 응고 인자 X, 응고 FX 및 이들의 활성형 FVIIa, FIXa, FXa, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 뼈 Gla 단백질, 기질 Gla 단백질 및 성장 정지-특이 단백질 6, 인자 X-유사 뱀독 프로테아제와 같은 응고 인자에 유사한 뱀독 프로테아제, 및 아칸쏘피나에(acanthophiinae) FXa-유사 단백질로 이루어진 군에서 선택된다.

일실시예에서, 감마-카르복실화를 필요로 하는 상기 단백질은 비타민 K 의존 응고 인자이다. 또 다른 실시예에서, 감마-카르복실화를 필요로 하는 상기 단백질은 인자 IX이다. 제3 실시예에서, 감마-카르복실화를 필요로 하는 상기 단백질은 프로트롬빈이다. 제4 실시예에서, 감마-카르복실화를 필요로 하는 상기 단백질은 인자 X이다. 제5 실시예에서, 감마-카르복실화를 필요로 하는 상기 단백질은 인자 VII이다.

감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질은 바람직하게는 인간 단백질이지만, 모든 진핵 단백질이 본 발명의 범위에 포함된다. 비타민 K 에폭사이도리덕타제는 바람직하게는 인간 단백질이지만, 모든 진핵생물의 비타민 K 에폭사이도리덕타제가 본 발명에 사용될 수 있다. γ-글루타밀 카르복실라제는 바람직하게는 인간 단백질이지만, 모든 진핵생물의 γ-글루타밀 카르복실라제가 본 발명에 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 유전적으로 변형(modification)된 진핵 숙주 세포를 제공하는 것으로서,

(i) 비타민 K 에폭사이도리덕타제 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 비타민 K 에폭사이도리덕타제 단백질 인코딩 서열은 상기 세포에 의해 비타민 K 에폭사이도리덕타제 단백질의 발현을 허용하는 발현 제어 서열에 동작가능하게 링크되어 있는 폴리뉴클레오티드;

(ii) γ-글루타밀 카르복실라제 단백질에 의해 카르복실화를 필요로 하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 세포에 의해 상기 카르복실화를 필요로 하는 단백질의 발현을 허용하는 발현 제어 서열에 동작가능하게 링크되어 있는 폴리뉴클레오티드; 및

(iii) 감마-글루타밀 카르복실라제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 감마-글루타밀 카르복실라제 단백질 인코딩 서열은 상기 세포에 의해 감마-클루타밀 카르복실라제 단백질의 발현을 허용하는 발현 제어 서열에 동작가능하게 링크되어 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일실시예에서, 상기 세포는 비타민 K 에폭사이도리덕타제 단백질과 카르복실화를 필요로 하는 단백질을 적어도 1:10의 비율로 발현할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 비율은 적어도 1:5이다.

숙주 세포는 바람직하게는 진핵 세포이다. 전형적인 숙주 세포는 곤충 세포, 이스트 세포 및 포유 동물의 세포를 포함하나, 이에 국한되지는 않는다. 포유류 동물의 세포가 특히 바람직하다. 적당한 포유 동물 세포 라인은 CHO, HEK, NS0, 293, Per C.6, BHK, 및 COS 세포와 이들의 유도체를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 일실시예에서, 숙주 세포는 포유동물 세포 라인 CHO-S이다.

본 발명의 또 다른 측면은 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열과, 비타민 K 에폭사이도리덕타제를 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 제공하는 것이다. 일실시예에서, 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열은 제1 프로모터를 포함하며, 비타민 K 에폭사이도리덕타제를 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열은 제2 프로모터를 포함한다. 상기 제1 프로모터가 상기 제2 프로모터보다 충분히 더 강력하여, 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질과 비타민 K 에폭사이도리덕타제가 적어도 10:1의 비율로 발현된다. 또 다른 실시예에서 이 비율은 5:1이다. 상기 벡터는 또한 γ-글루타밀 카르복실라제를 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 γ-글루타밀 카르복실라제를 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열은 제3 프로모터를 포함할 수 있는데, 상기 제1 프로모터가 상기 제3 프로모터보다 충분히 더 강력하여서, 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제가 적어도 10:1의 비율로 발현된다. 또 다른 실시예에서 이 비율은 5:1이다. 상기 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질은 응고 인자 VII, 응고 FVII, 응고 인자 IX, 응고 FIX, 프로트롬빈, 응고 인자 II, 응고 FII, 응고 인자 X, 응고 FX 및 이들의 활성형 FVIIa, FIXa, FXa, 인자 X-유사(factor X-like) 뱀독 프로테아제 및 아칸쏘피나에(Acanthopiinae) FXa-유사 단백질과 같은 응고 인자에 유사한 뱀독 프로테아제, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 뼈 Gla 단백질, 기질 Gla 단백질 및 성장 정지-특이 단백질 6로 이루어진 군에서 선택된다.

상기 세포는 γ-카르복실화를 필요로 하는 단백질과 비타민 K 에폭사이도리덕타제를 이들 두 단백질의 발현에 적당한 조건하에서 적어도 10:1의 비율로 발현한다.

본 발명에 따른 VKOR 한가지만 혹은 GGCX와 조합된 공동 발현에 의해 생산된 비타민 K 의존 응고 인자들(FII, FVII, FIX, FX 및 이들의 활성형 FIIa 또는 트롬빈, FVIIa, FIXa, FXa)은 외상, 수술, 또는 간, 신장의 질병 후, 또는 혈소판이나 혈액 응고 인자들의 질병(haemophilia)후에 따르는 출혈을 방지하고 치료하는데 유용할 것으로 예상할 수 있다. 마찬가지로, 응고 인자 단백질 C와 이의 활성형 APC는 감소된 수준의 단백질 C와 함께 혹은 감소된 수준의 단백질 C없이 증가된 응고 질병을 방지하고 치료하는데 유용할 것이라고 예상할 수 있다. 본 발명은 해독후 카르복실화를 필요로 하는 다른 단백질에도 적용될 수 있다.

본 발명은 γ-카르복실화에 의존하는 임의의 단백질의 생산성을 향상시키는데 적용될 것인데, 상기 단백질은 프로트롬빈, 응고 인자 II(FII), 응고 인자 VII(FVII), 응고 인자 IX(FIX), 응고 인자 X(FX), 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 뼈 Gla 단백질(BGP 또는 오스테오칼신으로도 알려짐), 기질 Gla 단백질(MGP), 프롤린 풍부 Gla 폴리펩티드 1(PRRG1), 프롤린 풍부 Gla 폴리펩티드 2(PRRG2), 성장 정지-특이 단백질 6(Gas 6)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 다른 적당한 단백질로는 일레피드(elapid) 뱀(아칸쏘피나에 아과에 속함) 독과 콘 달팽이 독(Conus textile)에 있는 FXa-유사 단백질이 있다.

이들 단백질은 그 핵산 및 아미노산 서열을 포함하여 잘 알려져 있다. 표 1은 본 발명에서 사용될 수 있는 다양한 단백질의 야생형 및 돌연변이형의 대표적인 서열을 보여준다.

기재	cDNA EMBL acc#	스플라이스 변이 (단백질)	돌연변이	유전자 EMBL acc#
글루타메이트 감마 카르복실라제	BC013979	2; BC013979; AF253530	1 SNP (EMBL# U65896); 2 SNPs (OMIM# 137167)	U65896
프로트롬빈	V00595	1; V00595	대략 100 SNP's (EMBL# AF478696)	AF478696
인자 VII	AF466933	4; AF466933; AF272774; AR030786; AAN60063	21 SNPs (OMIM# 277500)	J02933
인자 IX	A01819	3; A01819; A34669; M19063	5 SNPs (EMBL# AF536327); 108 SNPs (OMIM# 306900)	AF536327
인자 X	BC046125	4; BC040125; M57285; AR095306; AB005892	118 SNPs (EMBL# AF503510); 14 SNPs (OMIM# 227600)	AF503510
단백질 C	BC034377	7; AB083690; AB083693; I09623; S50739; S72338	57 SNPs (EMBL# AF378903); 25 SNPs (OMIM# 176860)	AF378903
오스테오칼신(Osteocalcin)	AF141310	5; AF141310; AF141310; BC033656; X04143; X51699		X04143
기질 GLA 단백질	BC005272	1; BC005272
성장 정지-특이 6; AXL 자극 인자	BC038984	1; BC038984
단백질 Z	M55670	2; AB033749; AB033749
프롤린-풍부 Gla (G-카르복시글루타믹 산) 폴리펩티드 1	AF009242	2; AF009242;BC030786
프롤린-풍부 Gla (G-카르복시글루타믹산) 폴리펩티드 2	AF009243	2; AF009243; BC026032
비타민 K-의존 단백질 S 전구물질	BC015801	1; BC015801	대략 100 SNPs (EMBL# AY308744); 8 SNPs (OMIM# 176880)	AY308744
뱀독FX-유사 프로테아제	AY769963 AAT42490 AAT42491 AAX37260 AAX37261 AAX37262 AAX37263 AAX37264 AAV34695	더 추가

본 발명은 특별한 단백질이나 공동 발현될 단백질들 중 어느 하나의 단백질 인코딩 서열에 한정되지 않는다는 점을 이해할 것이다. 더욱이, 특히 혈액 응고 인자에 관하여, 다양한 돌연변이형의 단백질들이 본 발명이 속한 기술분야에서 개시되어져 왔다. 본 발명은 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이(allelic variants)를 포함한 상기 돌연변이형에도, 야생형 서열에 적용되는 것과 동등하게 적용될 수 있다. 일실시예에서, 본 발명은 임의의 야생형 단백질 또는 이 야생형 단백질에 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%의 서열 일치를 가지는 단백질로 달성될 수 있다.

두 서열 사이의 서열 일치(sequence identity)는 BestFit, Gap 또는 FrameAlign과 같은 프로그램을 사용하여 페어-와이즈(pair-wise) 컴퓨터 배열 분석에 의해 판단될 수 있다. 바람직한 배열 툴은 BestFit이다. 실제, 서열 데이터베이스로부터 질의 조사(query search)와 유사/동일 서열을 찾을때, 일반적으로 Blast, Blast2, NCBI Blast2, WashU Blast2, FastA, Fasta3 및 PILEUP과 같은 적절한 소프트웨어와, Blosum 62와 같은 스코어링 매트릭스를 사용하여 유사 서열들의 초기 식별을 수행하는 것이 필요하다. 이러한 소프트웨어 패키지는 스미스-워터만(Smith-Waterman)의 "황금-기준(gold-standard)" 배열 알고리즘에 아주 근접하도록 시도한다. 따라서, 유사성, 즉 어떻게 두 개의 주된 폴리펩티드 서열이 라인업(line up) 하는지를 산정하는데 사용되는 바람직한 소프트웨어/조사 엔진 프로그램은 스미스-워터만이다. 일치(identity)는 직접적인 매칭을 의미하고, 유사성은 보존적인 대체를 허용한다.

본 명세서에서 사용되는 비타민 K 에폭사이도리덕타제 또는 "VKOR"이라는 용어는 비타민 K 에폭사이드와 비타민 K의 환원을 촉매하여 환원된 비타민 K를 형성하는 효소를 의미한다.

비타민 K 환원효소는 널리 배포되어 있고, 마우스 (Mus musculus), 랫(rat: Rattus norveigicus), 닭 (Gallus gallus) 및 소 (Bos taurus)와 같은 여러개의 다양한 종들로부터 클로닝되어 왔다. 동종 단백질들은 포유류, 조류, 양서류, 경골 어류, 날벌레(flies), 키네토플래스티드 및 박테리아와 같은 널리 퍼져있는 계통 발생 기원의 유기체의 서열로부터 예견될 수 있다. 표 2는 본 발명에 사용될 수 있는 인간 VKOR와 동종인 것으로 예견된 단백질(종 기원이후 분류됨)의 대표적인 서열의 비제한적(non-limiting) 리스트를 나타낸다.

종	데이터베이스 접근 #/ID
호모 사피엔스 (인류)	NP_775788 NP_996560 AAR28759 AAQ13668 AAQ88821 CAH10673
보스 타우러스(Bos taurus) (소)	NP_001003903
무스 무스컬러스(Mus musculus) (마우스)	NP_848715 BAB26325 NP_001001327
래터스 노르비지커스(Rattus norveigicus) (랫)	NP_976080 NP_976083 AAQ91028
갤러스 갤러스(Gallus gallus) (닭)	NP_001001328 NP_996530
제노퍼스 라에비스(Xenopus laevis) (발톱 개구리)	AAH43742 AAH77384
제노퍼스 트로피칼리스(Xenopus tropicalis) (양서류)	AAH76993
테트라돈 니그로비리디스(Tetraodon nigroviridis) (경골어)	CAF98534 CAG07588
타키푸고 루브리프스(Takifugo rubripes) (토라푸고:torafugo)	AAR82913 AAR82912
아노프엘리스 갬비아(Anopheles gambiae) (모기)	XP_310541 EAA06271
드로소필라 멜리노게스터(Drosophila melanogaster) (과일 날벌레)	DAA02561
트라이파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei) (원생동물문)	XP_340583
코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens) (높은 GC Gram+ 박테리아)	NP_737490
코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) (높은 GC Gram+ 박테리아)	NP_600038
미코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae) (높은 GC Gram+ 박테리아)	NP_302145

본 명세서에서 사용되는 "γ-글루타밀 카르복실라제" 또는 "GGCX"는 글루타민산 잔기의 카르복실화를 촉매하는 비타민 K 의존 효소를 지칭한다.

GGCX 효소는 널리 분포되어 있고, 베루가 고래[the beluga whale: 델피나프테러스 레우카스(Delphinapterus leucas)], 복어[옵사너스 타우(Opsanus tau)], 닭 (갤로스 갤로스:Gallus gallus), 먹장어(믹신 글루티노사:Myxine glutinosa), 편자게(리물루스 폴리피머스:Limulus polyphemus) 및 콘 달팽이[코너스 텍스타일( Conus textile)]와 같은 많은 다른 종들로부터 클로닝되어 왔다(Begley et al., 2000, 동서); Bandyopadhyay et al. 2002, 동서). 코너스 달팽이(conus snail)로부터 온 카르복실라제는 소의 카르복실라제와 유사하고, COS 세포에서 발현되어 왔다(Czerwiec et al. 2002, 동서). NCBI 접근 번호가 각각 gi 31217234, gi 21298685, gi 24216281, gi 24197548인 아노필레스 갬비에(Anopheles gambiae), 도소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogasand) 및 렙토스피라(Leptospira) (Bandyopadhyay et al., 2002, 동서)와 같은 원핵 생물과 곤충에서 GGCX에 유사한 단백질을 추가로 발견할 수 있다. 카르복실라제 효소는 괄목할 만한 진화적 보존성을 보인다. 인간의 것이 아닌 효소 몇 가지는 우리가 사용해오고 있는 인간 GGCX의 효소와 유사한 활성을 보여주었거나 그러한 활성을 가질 것이라고 예견되었고, 이에 따라 인간 효소에 대한 대체물로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 (종 기원이후 분류된) 인간 GGCX와 동종으로 예견된 단백질의 대표 서열을 나타냄.

종	데이터베이스 접근 #/ID
호모 사피엔스(Homo sapiens) (인류)	NM_000821.2 HUMGLUCARB HUMHGCA BC004422 HSU65896 AF253530.1
파피오 하마드라이아스(Papio hamadryas) (붉은 비비)	AC116665.1
델피나프테러스 루카스(Delphinapterus leucas) (흰고래)	AF278713
보스 타우러스(Bos taurus) (소)	NM_174066.2 BOVCARBOXG BOVBGCA
오비스 아리에스(Ovis aries) (국내산 양)	AF312035
라투스 노베지커스(Rattus norvegicus) (갈색 랫)	NM_031756.1 AF065387
머스 머스컬러스(Mus musculus) (마우스)	NM_019802.1 AF087938
옵사너스 타우(Opsanus tau) (경골어류)	AF278714.1
코너스 텍스타일(Conus textile) (연체동물)	AY0044904.1 AF382823.2
코너스 임페리얼리스(Conus imperialis) (연체동물)	AF448234.1
코너스 에피스코파터스(Conus episcopatus) (연체동물)	AF448233.1
코너스 오마리아(Conus omaria) (연체동물)	AF448235.1
도소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster) (과일 날벌레)	NM_079161.2
아노필레스 갬비아(Anopheles gambiae) (모기) (mosquito)XM_316389.1	XM_316389.1
세칼레 세레알레(Secale cereale) (모노콧:monocots)	SCE314767
트리티컴 아에스티범(Triticum aestivum) (참밀)	AF280606.1
트리티컴 우라르투(Triticum urartu) (모노콧)	AY245579.1
홀데움 불가레(Hordeum vulgare) (보리)	BLYHORDCA
렙토스피라 인터로간스(Leptospira interrogans) (스피로헤타)	AE011514.1
스트렙토미세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor) (높은GC Gram+ 박테리아)	SCO939109 SCO939124 AF425987.1
스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans) (높은GC Gram+ 박테리아)	SLU22894
스트렙토미세스 비지니에(Streptomyces viginiae) (높은 GC Gram+ 박테리아)	SVSNBDE
마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) (높은 GC Gram+ 박테리아)	MLSPCOPER
츨라미도모나스 리인하드티(Chlamydomonas reinhardtii) (녹조)	AF479588.1
딕트요스텔리움 디스코이데움(Dictyostelium discoideum) (점균류)	AC115612.2
코투닉스 코투닉스(Coturnix coturnix) (조류)	AF364329.1
브래디리조비움 자포니컴(Bradyrhizobium japonicum) (α-프로테오박테리아)	AP005937.1
로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides) (α-프로테오박테리아)	RSY14197
시노리조비움 멜리로티(Sinorhizobium meliloti) (α-프로테오박테리아)	RME603647 AF119834
메소리조비움 로티(Mesorhizobium loti) (α-프로테오박테리아)	AP003014.2
크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum) (β-프로테오박테리아)	AE016910.1 AE016918.1
슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) (γ-프로테오박테리아)	AE004613.1 AF165882
쟌토모나스 아조노포디스(Xanthomonas axonopodis) (γ-프로테오박테리아)	AE011706.1
인간 헤르페스바이러스 8	KSU52064 KSU75698 AF305694 AF360120 AF192756

상기 식별된 GGCX 단백질 각각은 본 발명에서 카르복실라제 효소로서 사용될 수 있다.

공동 발현된 단백질을 생성하는 한 가지 방법은 각자 발현 제어 서열의 부분으로서 다른 프로모터를 사용하는 것이다. 이 기술에는 이종 단백질을 다른 정도나 범위로 발현시킬 수 있는 다른 클로닝 벡터들, 프로모터들 및 기타 발현 제어 서열들의 예가 많이 있다. 재조합 발현 기술이 적절히 발전되어 있어서, 단백질 발현 분야에서의 당업자라면 프로모터와 다른 제어 서열들을 선택하여 카르복실화를 필요로하는 단백질, 비타민 K 에폭시도어덕타제, 및 선택적으로 γ-카르복실라제를 공동 발현시킬 수 있다. 어떤 특정한 프로모터나 다른 발현 제어 서열을 선택하여 사용할 것인가는 개별 선택의 문제이다.

일실시예에서, 감마 카르복실화를 필요로하는 단백질과 연관된 제어 서열은 강력한 프로모터이다. 일실시예에서, 이 프로모터는 인간 사이토메갈로바이러스 (hCMV) 최조기 프로모터(immediate-early promoter)이다. 여기서, 강력한 프로모터는 동일 조건에서 동일한 세포에 사용된 약한 프로모터보다 적어도 5배 이상 개수의 mRNA 전사를 발생시키는 프로모터로 정의된다.

다른 실시예에서, 비타민 K 에폭시도어덕타제와 연관된 제어 서열은 γ-글루타밀 카르복실라제가 존재할 때 약한 프로모터를 포함한다. 일실시예에서, 이 프로모터는 SV40 조기 프로모터(early promoter)이다. 다른 실시예에서, 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질, 비타민 K 에폭사이드 환원효소, 및 선택적으로 γ-글루타밀 카르복실라제는 비타민 K 에폭사이드 환원효소 및 선택적으로 γ-글루타밀 카르복실라제의 발현을 제어하는 프로모터를 갖는 다른 프로모터 요소의 제어하에 있는데, 이 프로모터는 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질의 발현을 제어하는 프로모터보다 약하다.

본 발명은 인자 X를 많이 발현(over-express)시키기 위해 강력한 CMV 프로모터(Boshart et al. Cell 41:521-530, 1985)를 사용하고, 비타민 K 에폭사이드 환원효소의 발현과 선택적으로 GGCX 발현을 제어하기 위해 약한 SV40 프로모터((Wenger et al. Anal Biochem 221:416-418, 1994)를 사용하여 예를 들고 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 강력한 프로모터는 pEF-lα [인간 연장 인자-lα서브유닛 유전자)(Mizushima andNagata, Nuc Acids Res 18:5322, 1990; Goldman et al., BioTechniques 21:1013-1015, 1996)], pRSV [로우스 사코마 바이러스 (Gorman et al., Proc Natl Acad Sci USA 79:6777-6781, 1982)], 및 pUbC [인간 유비큐틴 (Schorpp et al., Nuc Acids Res 24:1787-1788, 1996)]를 포함하는데, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생성된 정제된 감마 카르복실화된 단백질과 이를 혈액 응고 치료에 사용하는 용도까지 확장된다.

본 발명의 또 다른 측면은 전술한 방법에 의해 얻어진 추출된 감마-카르복실화된 단백질을 약리적으로 효과적인 양을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자의 증가 또는 감소된 응고를 촉진하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은, 감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제를 적어도 5:1의 비율로 발현하도록 된 숙주 세포로부터 발현된 활성 카르복실화된 단백질을 정제하는 단계와, 상기 정제된 카르복실화된 단백질을 하나 이상의 제약적으로 받아들여질 수 있는 운반체 또는 부형제와 혼합하는 단계를 포함하는 혈액 응고를 유도하는데 적당한 약학 조성물을 생성하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 기술 분야에서 잘 알려져 있는 기존의 제약 부형제를 사용하는 기존 프로세스에 의해 얻어질 수 있으나, 비경구적 또는 상처 부위에 직접 주사되기에 적절한 형태일 가능성이 높다.

적당한 희석제를 첨가하여 주사를 위한 수성 제제(aqueous preparation)을 준비하는데 적당한 분말은 일반적으로 적당한 운반체 및 부형제와 함께하는 활성 성분, 현탁 용제, 그리고 하나 이상의 스테빌라이져(stabiliser) 또는 보존제를 포함한다. 희석제는 보존제, 긴장성 조절제, 및 스테빌라이져와 같은 다른 적당한 부형제를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 수유 이멀젼(oil-in-water emulsion)의 형태로도 될 수 있다. 유상(oily phase)은 올리브 유나 아라치스 오일과 같은 식물 오일, 예를 들어 액체 파라핀과 같은 미네랄 오일, 또는 이들 오일들의 혼합 오일이 될 수 있다. 적절한 이멀젼제는 예를 들어, 검 아카시아 또는 검 트래거캔스와 같은 자연 발생하는 검, 콩, 레시틴(lecithin), 지방산 및 헥시톨 무수물(예를 들어 소르비탄 모노올레이트)부터 유도된 에스테르 또는 부분 에스테르와 같은 자연 발생 인지질, 그리고, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(monooleate)와 같은 에틸렌 옥사이드를 갖는 상기 부분 에스테르의 압축물(condensation product)이 될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은, 전술한 바와 같은 적절한 분산제, 습윤제, 현탁용제를 하나 이상 사용하는 알려진 프로세스에 따라 포뮬레이션될 수 있는 비독성 비경구적으로 받아들여질 수 있는 희석제 또는 용매에서 무균 용액 또는 현탁액(suspension)의 형태로 될 수 있다. 무균의 주사 가능한 제제는 예를 들어, 1,3-부탄디올 용액와 같은 비독성 비경구적으로 받아들여질 수 있는 희석제 또는 용매에서 무균의 주사가능한 용액 또는 현탁액도 될 수 있다.

제제(formulation)에 대한 추가적인 정보를 위해서 Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansen; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990의 Volume 5, Chapter 25.2; 또는 Drugs and the pharmaceutical sciences; Protein formulation and delivery (Eugen J. McNaIIy, executive editor), Marcel Dekker Inc 2000의 Volume이 참조된다.

단일 사용량 형태를 생성하기 위하여 하나 이상의 부형제와 결합되는 활성 성분의 양은 다뤄지는 숙주와 특정 투약 경로에 따라 반드시 변경될 것이다. 예를 들어, 인간에게 주사하도록 의도된 제제(formulation)는 일반적으로 전체 조성물의 약5 중량 퍼센트로부터 약98 중량 퍼센트로 변할 수 있는 적절하고 편리한 양의 부형제와 화합된 예를 들어, 0.2 mg 내지 6g 또는 0.5mg 내지 2g의 활성제를 포함할 것이다. 투여량 단위 형태는 일반적으로 약 0.2mg 내지 약 10g 또는 약 1mg 내지 약 500mg의 활성 성분을 포함할 것이다. 단백질 치료제는 통상 냉동 저장되거나, 동결 건조된다. 투약 경로 및 투여 요법에 대한 추가적인 정보를 위해, Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990.의 Volume 5, Chapter 25.3이 참조된다.

화합물의 치료 또는 예방 목적을 위한 투여량 크기는 약품의 잘 알려진 원리에 따라, 상태의 특성 및 심각성, 동물 또는 환자의 나이 및 성별, 그리고 투여 경로에 따라 자연히 달라질 것이다. 치료용 또는 예방용 화합물을 사용할 때, 만약 분할 투여량으로 투여가 필요하다면, 일반적으로 일용량이 예를 들어, 몸 kg당 20 ㎍ 내지 75 mg, 몸무게 kg당 0.5mg 내지 75mg의 범위내에서 받아들여지도록 투여될 것이다. 일반적으로 비경구 투여가 사용된다면, 적은 용량이 투여될 것이다. 따라서, 예를 들어, 정맥내 투여에 대하여, 예를 들어, 몸무게 kg 당 20㎍ 내지 30mg 또는 몸무게 kg 당 0.5mg 내지 30mg의 범위의 용량이 일반적으로 사용될 것이다. 이와 유사하게, 흡입 투여에 대하여, 예를 들어, 몸무게 kg 당 20㎍ 내지 30mg 또는 몸무게 kg 당 0.5mg 내지 25mg의 범위의 용량이 일반적으로 사용될 것이다. 대안으로서, 화합물은 몸무게 kg당, 및 몇시간 내지 며칠 동안의 기간 동안 시간마다 1㎍ - 10mg의 주입으로서 투여될 수 있다.

실험 섹션

본 발명은 다음과 같은 제한되지 않은 실시예를 통해서 더 설명될 것이다.

본 발명의 실시는 다르게 지시하지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술분야의 종래의 분자 생물학 방법과 재조합 DNA 기술을 사용할 것이다. 그러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY (2002); Glover & Hames, eds., DNA Cloning 3: A Practical Approach, VoIs. I, II, & III, IRL Press, Oxford (1995); Colowick & Kaplan, eds., Methods in Enzymology, Academic Press; Weir et al., eds., Handbook of Experimental Immunology, 5th ed., Blackwell Scientific Publications, Ltd., Edinburgh, (1997)을 참조할 수 있다.

실시예 1

카르복실화된 단백질의 발현에서 VKOR의 중요성을 알아보기 위하여, CHO 세포에서 인간 응고 인자 X(FX)를 발현시켰다. 충분히 기능적인 FX는 조기에 발현되었는데, 카미어(Camire) 등은 백만개의 세포 및 시간당 대략 1㎍의 카르복실화된 FX를 얻었고(Camire et al. 2000 (Biochemistry 39:14322-14329)), 힘멜스페취 등은 DHFR 증폭에 놓여졌던 CHO 세포 라인을 사용하여 백만개 세포 및 시간 당 25% (19.5㎍)의 활성 FX를 얻었다고 주장하였다(Himmelspach et al 2000 (Thromb Res 97:51-67). 힘멜스페취 등은 불완전한 재조합 FX의 프로세싱을 보고하였고, 실제로 보여진 활성 FX의 최대 생산성은 5㎍/ml배지였다. 두 개의 문헌에서, 세포는 혈청포함 배지에서 유착 세포로서 자랐다. 세포는 원하는 융합까지 자라, 배지는 무혈청 배지로 교체되었고, 배양이 계속되어 제품의 축척이 가능하였다. 그 다음, 제품의 양을 이러한 혈청이 없는 배지로부터 추산하였다. 이러한 배양 절차는 세포가 단기간에 대해서만 제품을 생산하므로, 큰 스케일의 단백질 생산에는 적당하지 못하다. 또한, 제품은 소의 FX와 같은 혈청 단백질에 의해 오염될 것인데, 이 소 FX는 혈청 단백질이 제거하기에 어렵고 환자에게 주사된 제품에 있다면 항체 형성을 발생시킬 수 있기 때문에 상당히 바람직하지 않다. 따라서, 획득된 세포 라인은 제약 FX의 상업적 생산에 적절하지 않은 것으로 보여졌다.

재조합 인간 인자 X를 생산하는 안정적인 세포 라인의 확립

FX 코딩 서열은 인간 간 cDNA로부터 다음의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭되었다:

FlOFl: 5'-CACACCATGGGGCGCCCACT-3' (서열번호 2)

FlORl: 5'-GAGTGGGATCTCACTTTAATGGA-3' (서열번호 3)

PCR 제품의 클로닝은 먼저 pCDNA3.1-V5His(Invitrogen:인비트로젠)안으로 TA-TOPO 클로닝을 함으로써 행해진다. 정확한 FX 서열을 포함하는 클론들은 DNA 시퀀싱과 COS-7 세포에서의 일과성 발현에 의하여 식별된다. FX 인코딩 서열을 포함하는 둔단 절편(blunt-end fragment)는 그 다음에 EcoRV-분해되고 인산분해효소-처리된 발현 벡터 nopA로 클로닝된다. 획득된 F10nopA (서열번호 6) 클론은 삽입된 서열의 DNA 시퀀싱과 COS-7에서 일과성 발현에 의하여 검증된다.

VKOR 코딩 서열은 다음의 프라이머를 사용하여 인간 간 cDNA로부터 PCR 증폭된다:

VFl : 5'-CACCATGGGCAGCACCTGGGGGA-3 ' (서열번호 4)

VRl: 5'-GCTCAGTGCCTCTTAGCCTT-3' (서열번호 5)

PCR 제품의 클로닝은 먼저 pCDNA3.1-V5His(인비트로젠)안으로 TA-TOPO 클로닝을 함으로써 행해진다. 정확한 VKOR 인코딩 서열(서열번호 1)을 포함하는 클론들은 DNA 시퀀싱에 의해 식별된다. 그 다음, VKOR 서열을 포함하는 HindIII-NotI 절편은 동일한 효소로 분해된 발현 벡터 pZeoSV2+(인비트로젠)으로 옮겨진다. 얻어진 VKORzeo 클론(서열번호 7)은 DNA 시퀀싱을 통해서 검증된다.

CHO-S 세포(인비트로젠)은 인비트로젠에 의해 추천된대로 필수적으로 글루타맥스 I 및 9% 열처리된 FBS를 포함하는 DMEM F12 배지에서 자랐다. CHO-S의 트랜스펙션은 PvuI-분해된 (선형화된) F10nopA, Sspl-분해된 VKORzeo, 인비트로젠에 의해 추천된대로 필수적으로 리포펙타민 2000을 가지고 행해진다. DNA 트랜스펙션 믹스는 VKORzeo와 비교하여 1.6 배의 몰(molar) 과잉의 F10NopA를 포함한다. 트랜스펙션 다음날, 트랜스펙션된 세포는 선택 배지, 400 ㎍/ml G418를 더한 성장 배지상에서 96 웰 플레이트에 시딩(seeding)된다. 따라서, VKORzeo 컨스럭트(constrcut)는 선택되지 않지만, G418-저항 트랜스펙션에 무작위로 결합된다. 다음날 플레이트는 적당한 개수의 클론이 웰(5-10)마다 얻어졌는 지를 확인하기 위해 검사된다. 트랜스펙션하고 나서 6일 후, 선택 배지가 비타민 K(1㎍/ml)이 보충된 성장 배지에 의해 교체된다. 그 다음날, 플레이트는 샘플링되고, FX를 FXa로 활성화시키는 러셀 바이퍼 독(Russels' Viper Venom: RVV-X)를 바탕으로 한 어세이(assay)를 사용하여 FX 활성을 위해 어세이된다. 그 다음, FXa 활성은 유색 기질을 사용하여 측정된다(S2765, Chromogenix, Molndal, Sweden). RVV-X 어세이는 동일 목적으로 힘멜스페취 등에 의해 사용된 어세이와 동등하다. 높은 활성을 가진 웰들이 식별되고, 포함된 클론들은 확장되어 한계 희석 클로닝에 놓여지게 된다. 한계 희석 클로닝을 하고 최상의 클론들을 선택한 후, 선택된 클론들은 확장되어 단백질이 없는 배지(인비트로젠에 의해 추천한 대로 CD-CHO가 보충되고, 1㎍/ml의 비타민 K가 더해짐)에서 성장하도록 옮겨진다. 재조합 FX의 생산성은 T-플래스크 배양으로부터 추산되었다. VKOR의 발현은 실시간 PCR 분석을 통하여 어세이되었다. 충분히 활성 FX를 발현하는 모든 선택된 클론들은 또한 VKOR을 발현한다는 점을 발견하였다. 이점으로부터, VKOR의 공동 발현은 충분히 활성인 인간 응고 인자 X의 발현을 개선한다는 결론에 이르렀다. 획득된 세포 라인은 단백질과 동물 성분이 없는 배지에서 잘 자라고, 항생물질 선택 압력(antibiotic selection pressure)없이 FX를 생성한다. 따라서, 획득된 세포 라인은 큰 스케일의 단백질 생산에 적합하고, 높은 양의 활성 FX를 생성할 수 있는 것으로 여겨진다. 충분히 활성인 FX의 분량도 또한 이전에 보고된 것보다 상당히 높다.

실시예 2

FX, VKOR 및 GGCX의 공동 발현을 위한 생산성 분석 및 mRNA 비율

실시예 1에서 얻어진 클론들은 단백질이 없는 화학적으로 정의된 CHO 배지에 항생 물질(인비트로젠)없는 T-플래스크에서 자랐다. 샘플들이 cDNA 준비를 위해 4일 배양으로부터 수집되었고, 생산성 추산을 위한 샘플들은 루틴 스플릿(routine split)하고 난 5일 후 배양으로부터 수집되었다. 제어 샘플 또한 동일 배지에서 자란 부모의 트랜스펙션되지 않은 CHO-S 세포 라인으로부터 준비되었고, 제어 샘플의 분석은 예상된 결과를 가져다 주었다. 스피너 배양은 동물 성분이 없는 첨가물과 함께 또는 없이 CD-CHO에서 자랐다. 활성 rhFX의 양은 실시예 1에서와 같이 RVV-X를 바탕으로 한 어세이와, 연속적으로 희석된 정제된 플라즈마 유도 인간 인자 X의 표준에 의해서 추산되었다((Haematologic Technologies Inc.,Vermont, USA). RNA는 벤더인 인비트로젠(Invitrogen)사에 의해 공급된 프로토콜에 따라 Trizol^TM을 가지고 분리되었다. 분리된 RNA는 Ambion사로부터 입수된 DNA-free^TM 키트를 가지고 DNasel 처리되었다. cDNA 합성은 Superscript™의 RT-PCR을 위한 제1-스트랜드 합성 시스템(인비트로젠)으로부터의 헥사머 프라이머와 키트 내용물을 사용하여 실시되었다. 실시간 RT-PCR을 위한 프라이머와 Vic-라벨된 프로브들이 Applied Biosystems 사의 소프트웨어 Primer Express^TM을 사용하여 선택되었다.

인간 γ-카르복실라제 올리고뉴클레오티드

5 'ACACCTCTGGTTCAGACCTTTCTT 3' 포워드 프라이머 (서열번호 8)

5' AATCGCTCATGGAAAGGAGTATTT 3' 리버스 프라이머 (서열번호 9)

5' CAACAAAGGCTCCAGGAGATTGAACGC 3' 프로브 (서열번호 10)

인간 인자 X 올리고뉴클레오티드

프라이머는 Operon/Qiagen사에 의해 제조되었고, 프로브는 Applied Biosystems로부터 주문했다.

5'CCGCAACAGCTGCAAGCT-3' 포워드 프라이머 (서열번호 11)

5'TGTCGTAGCCGGCACAGA-3' 리버스 프라이머 (서열번호 12)

5'CAGCAGCTTCATCATCACCCAGAACATG 프로브 (서열번호 13)

인간 VKOR 올리고뉴클레오티드

5'GCTGGGCCTCTGTCCTGAT-3' 포워드 프라이머 Seq(서열번호 14)

5'ATCCAGGCCAGGTAGACAGAAC-3' 리버스 프라이머 Se(서열번호 15)

5'CTGCTGAGCTCCCTGGTGTCTCTCG 프로브 S(서열번호 16)

로덴트(Rodent) GAPDH 제어 프라이머와 프로브 또한 사용되었다(Applied Biosystems; ABI # 4308318 TaqMan® 로덴트 GAPDH 제어 리에이젠트 프로토콜)-앰프리콘 길이 177bp. 실시간(Real-Time) RT-PCR 반응이 Applied Biosystems사의 7500 실시간 PCR 시스템에서 실행되었다. 증폭된 PCR 제품의 예상 길이는 아가로스 젤상에서 확인되었다.

FX 발현 클론의 실시간 PCR 분석 결과

클론 명칭	FX mRNA/세포	VKOR mRNA/세포	GGCX mRNA/세포	GAPDH mRNA/세포
FX1-5	137	0.62	1	1553
FX2-5	13	0.48	0.26	2985
FX3-9	3	0.03	0.17	1891
FX6	267	3	11	2289
FX17-2	319	2	37	2381

생산성 추정치 및 mRNA 비율. 비율은 표4의 데이터로부터 계산된다. 생산성은 희석 배지 샘플의 활성 어세이로부터 추정되었다.

클론 명칭	FX:VKOR 비율	FX:GGCX 비율	활성FX ㎍/ml T-flask	활성FX ㎍/ml 스피너
FX1-5	221:1	137:1	0.5	미실행
FX2-5	27:1	50:1	2.4	미실행
FX3-9	100:1	18:1	0.8	미실행
FX6	89:1	24:1	6.9	14
FX17-2	160:1	9:1	8.7	21

표 5에 기재된 생산성은 모두 이전에 비증폭 세포 라인으로부터 얻어진 생산성보다 크다. 비활성 FX를 포함한 총 FX 농도의 추정은 바이아코어 어세이(Biacore assay)를 사용하고, SDS-PAGE 및 웨스턴 블러팅에 의해 이루어졌다.

총 rhFX의 농도의 추정을 위한 바이아코어 어세이

BIAcore3000^TM 분석 시스템, 러닝 버퍼(10　mM HEPES, 0.15　M NaCl, 3.4　mM EDTA and 0.05% P20, pH 7.4), 0.15 M NaCl내의 토끼 항쥐 Fc(RAM　Fc, lot no. 610) 및 CM5 센서 칩을 Biacore AB(Uppsala, Sweden)사로부터 구입했다. 25℃에서 5㎕/분으로 절차를 진행되었다. 25℃에서 표준화된 아민 커플링 절차(35㎕ 활성 시간)를 사용하여 캡쳐링 항체 RAM Fc(35㎕, 10　mM 소듐 아세테이트에서 30 ㎍ /ml, pH　5.0)의 11000 RU를 CM5 칩의 채널 4로 공유결합(covalent coupling)시켰다. 이모빌리세이션(immobilisation)을 한 후, 표면이 5㎕ 10 mM 글리신 버퍼 pH　1.8로 재생되고, 러닝 버퍼로 더 평형상태가 되었다. 20㎕ 쥐 항FX의 흐름으로, 모노클론 IgG 항체 N77121M (Biodesign, Maine, USA) (러닝 버퍼에서 1/100로 희석됨) 660 RU가 캡쳐되었다. FX를 배지에 바인딩함으로써 매우 안정된 복합체가 되었고, 해리는 무시할 수 있다. 새로운 FX 샘플 각각에 대하여, RAM Fc 표면은 복수의 샌드위치 실험을 위해 재생되었다. 커플된 RAM Fc를 갖는 채널 4와 깨끗한 표면을 갖는 채널 3 사이의 RU 차이를 사용하여 5 ㎕ FX의 바인딩을 정량화하였다. Haematologic Technologies Inc.(Vermont, USA)사로부터 입수한 표준 pdFX (배지에서 2, 4, 6, 8, 10, 15 및 20 ㎍/ml)가 러닝되었고, RU 차이가 phFX의 농도에 대하여 플로팅되었으며, 하나의 바인딩 사이트에 대한 공식이 데이터에 맞춰졌다. 알려지지 않은 샘플의 RU 차이를 사용하여 표준 곡선으로부터 rhFX의 농도를 계산하였다.

생성된 충분히 활성된 rhFX의 부분(share). rhFX의 총량은 바이어코어 어세이를 사용하여 스피너 배양 샘플로부터 추정되었고, 활성 rhFX의 양이 RVV-X 어세이에 의해 추정되었다. 모든 샘플은 동물 성분이 없는 성장 배지에서 스피너 배양으로부터 얻어진 것이다.

클론/샘플	총FX ㎍/ml (바이아코어 어세이)	활성FX ㎍/ml (RVV-X)	% 활성FX
FX17-2/p050131	18.6	10.1	54
FX17-2/p050202	20.6	9.6	47
FX17-2/p050225	11.8	12.1	103
FX17-2/sp2050309	38.3	16.3	43
FX17-2/sp1050309	25.1	13.6	54
FX17-2/sp2050310	39.7	21.1	53
FX17-2/sp1050310	28.1	13	46

표 6의 결과는 VKOR의 공동 발현이 충분히 활성인 rhFX의 발현을 향상시킨다는 것을 나타낸다. 충분히 활성인 rhFX의 높은 부분(43-103%)은 SDS-PAGE, 웨스턴 블라팅, 및 단백질 정제에서 얻은 데이터와 부합된다.

실시예 3

인간 프로트롬빈 GGCX와 VKOR의 공동 발현

충분히 활성인 인간 프로트롬빈을 높은 수준으로 생성할 수 있는 세포 라인을 얻기 위하여, 초기에 비타민 K 의존 변형효소 γ-글루타밀 카르복실라제 (GGCX)와 hFII를 공동 발현하였다. 이러한 방법을 통해 P1E2 클론을 얻었다. P1E2는 rhFII를 발현하는 생산성이 높은 클론이지만, 정확히 변형된 rhFII의 발현이 다른 FII-생성 클론과 비교하여 대단히 개선된 것임에도 불구하고, 여전히 이 rhFII의 총량의 (배양 조건에 따라서) 20-60%만 충분히 γ-카르복실화된다. 충분히 γ-카르복실화된 rhFII의 수준을 더 향상시켜서 rhFII의 생산비를 낮추기 위한 노력으로서, 비타민 K 에폭사이드 환원효소(VKOR)을 사용하는 새로운 발현 방법이 시험되었다. VKOR을 두개의 다른 프로모터의 제어하에 두개의 다른 벡터에서 클로닝을 하였다: pHygro 벡터에서 pCMV와 pZeo 벡터에서 pSV40. CHO 세포에서, pCMV 프로모터는 pSV40 프로모터보다 6배보다 큰 프로모터 활성을 지닌 것으로 추정된다. 이들 두 개의 컨스트럭트(construct)는 rhFII 생성 세포 라인을 얻기 위해 두 개의 별도의 코트랜스펙션(co-transfection)에 사용된다.

세포 라인 개발 및 생산성 추산

세포 라인 개발은 CHO-S를 PP6 컨스트럭트(hFII 및 hGGCX를 인코딩함) (서열번호 20) 및 VKOR 컨스트럭트(도 1-2)중 하나를 가지고 코트랜스펙션(cotransfection)함으로써 개시된다. 트랜스펙션에 사용된 몰비는 2:3(PP6:VKOR)이다. 96-웰 플레이트에 트랜스펙턴트를 시딩(seeding)하고 선택한 후, 그다음 트랜스펙션 당 총5500-8500 클론들이 이커린(ecarin)을 바탕으로 한 크로모제닉-어세이(chromogenic-assay)를 사용하여 스크린되었다. 18개의 클론 풀이 초기 스크린 이후 선택되었다. 두번째 스크린 이후, 9 개의 클론 풀을 선택하여 확장하고, 세번째 스크리닝 어세이를 하였다. 각각의 트랜스펙션에 대하여, 최상의 생성 클론 풀이 제한 희석을 위하여 선택되었다. 여섯개의 96-웰 플레이트가 0.5 세포/웰로 시딩되었다. 24개 클론이 선택되어 스크린 이후 업스케일(upscale)되었다. VKOR을 인코딩하는 벡터가 선택되지 않았기 때문에, 타크만 분석(Taqman analyses)을 하여 VKOR 발현을 검증하였다. 모든 세개의 탑(top) 클론이 선택되었는데, A3F4 (PP6/pZeoVKOR), B11E8 및 B9A12 (PP6/pHygroVKOR), VKOR mRNA가 선택되었다. 네개 런(run)의 스피너 실험을 하여, P1E2 클론과 비교했을 때 PP6/VKOR에 대한 rhFII의 생산성을 평가하고 비교하였다.

스피너 플래스크에서 rhFII의 생산

셀라인	샘플 ID	실험 런(run)	활성rhFII (㎍/mL)	SPR (pg/세포/일)	활성 rhFII의 부분(%로 나타낸 활성rhFII/총rhFII)
A3F4	050317	A	10.3	1.38	100
A3F4	050415	B	27.6	1	100
A3F4	050425	C	23	2.6	100
B9A12	050317	A	10.3	0.84	68
B9A12	050413	B	27.4	1	100
B9A12	050424	C	14.4	6.06	79
B11E8	050317	A	13	1.74	75
B11E8	050414	B	27.4	2.2	80
B11E8	050424	C	22.2	4	78
P1E2	050415	B	37.6	2.1	61
P1E2	050424	C	25.4	2.5	21

VKOR, GGCX 및 rhFII를 공동 발현하는 새로운 접근 방법이 P1E2 클론(20-60%, 표1 참조)와 비교하여, 훨씬 높은 부분(60-100%)의 충분히 활성인 rhFII를 생성하는 몇가지 rhFII-발현 클론을 만들어냈다. 두 개의 클론, B11E8 및 B9A12 (양쪽 PP6/pHygroVKOR 코트랜스펙션)에 대하여, P1E2 클론보다 높은 특유의 생산율(specific productivity rate)(세포당 일당 생성되는 활성 단백질의 양, SPR)이 어떤 배양 조건에서 얻어졌다. A3F4클론이 100% 충분히 카르복실화된 rhFII를 모든 배양 실험 런에서 생성하였다. 이 클론은 다른 두개의 클론과 비교하여, 두개의 변형 효소(GGCX 및 VKOR)의 FII에 대한 가장 높은 mRNA 비율을 가진다. 그러나, A3F4는 다른 클론들보다 더 충분히 활성인 rhFII을 생성하지 않는다.

실시예 4

VKOR로 슈퍼트랜스펙션함으로써 개선된 γ-카르복실화

VKOR을 사용하여 rhFII 생산을 개선하기 위한 두번째 시도로서, P1E2 클론(실시예 3)이 변형되어 VKOR을 공동발현하였다. 본 실시예에서는 pHygroVKOR 컨스트럭트(서열번호 22)를 사용하여 P1E2를 트랜스펙션하였고(부록과 도 1 참조), 클론들이 프로트롬비나제 활성 어세이에 의하여 개선된 생산성을 위해 스크리닝되었다. 총 7000-8000 클론이 96-웰 포맷에 적응된 말단(end-point) 프로트롬비나제 어세이를 사용하여 스크린되었다. 16개 클론 풀이 초기 스크린이후에 선택되었다. 선택된 클론 풀은 활성 rhFII의 부분을 추정하기 위하여, 확장되고 이카린(ecarin) 어세이와 프로트롬비나제 어세이 두개 어세이로 스크리닝되었다. 이 스크린 이후에 6개의 클론 풀이 선택되어 확장되었다. 세 개의 탑(top) 생성 클론 풀이 제한 희석 클로닝을 위해 선택되었다. 초기 프로트롬비나제 스크린 이후, 세 개 모든 풀로부터 유래된 28번째 클론을 선택하고 업스케일하였다. 두 번째 스크린 후, 8개의 클론을 선택하고 업스케일하였다. 각 클론된 풀로부터 온 하나의 클론에서 VKOR 발현을 증명하기 위하여 타크만 분석을 하였다. 모든 세 개의 탑(top) 클론이 선택되었는데, M3F6, P4A4 및 O3G3, VKOR mRNA가 검출되었다. 부모 P1E2 클론과 비교하여 P1E2/VKOR 클론들에 대한 rhFII의 생산성을 평가하기 위하여 세 개 런의 세이커 또는 스피녀 배양을 하였다.

각 클론된 풀로부터 온 하나의 클론에서 VKOR 발현을 증명하기 위하여 타크만 분석을 하였다. 모든 세 개의 탑(top) 클론이 선택되었는데, M3F6, P4A4 및 O3G3, VKOR mRNA가 검출되었다. 이들 클론들을 얻기 위하여 사용되는 선택 및 스크리닝 절차때문에, 이들 클론들은 최적 수준의 VKOR 발현을 나타내는 것으로 여겨진다. 이 최적의 발현 수준은 실시예 5에서 더 설명된다.

동물 성분이 없는 배지를 사용한 스피너/세이커 배양에서 최고치 생산성으로 rhFII 생산. VKOR 컨스트럭트를 포함하지 않는 P1E2 부모 세포 라인이 통제군과 동일한 조건에서 병행하여 자랐다.

샘플 (클론 및 날짜)	실험 시리즈	생존 세포 밀도(세포/ml)	생존력 (%)	총 rhFII mg/L	활성 rhFII mg/L	활성/총 rhFII (%)	SPR; 특이 생산율(specific productivity rate pg/세포/일
P1E2 050622	A	1700000	87	211.9	40	19	7.2
P1E2 050610	B	3866666	93	94.7	48.4	51	1.7
P1E2 051011	C	2500000	nd	47.9	38.4	80	nd

M3F6 050622	A	2550000	83	181.6	74.7	41	21.5
M3F6 050609	B	1950000	59	80.2	55	69	1.8

O3G3 050621	A	3525000	>95	194.6	63.7	33	3.1
O3G3 050609	B	3200000	85	128.7	68.6	53	4.2
O3G3 051010	C	6400000	nd	72.8	76.8	105	nd

P4A4 050621	A	2700000	>95	176.9	34.1	19	3.3
P4A4 050610	B	2233333	81	101.6	64.2	63	3.8

배양 실험 결과는 다른 배양 조건동안 활성 rhFII의 양과 부분이 변하였으나, 대부분의 런에 대하여 생성된 충분히 활성인 rhFII의 양은 원래 P1E2 세포 라인보다 새로운 P1E2/VKOR 클론에 대해 더 좋다는 것을 보여준다.

실시예 5

최적의 mRNA 발현 비율의 확립

실시예 4 및 5에서 세포 라인으로부터 준비된 메신저 RNA가 실시예 3에서와 유사하게 실시간 PCR로 분석되었다. GGCX 및 VKOR에 대하여, 실시예 3에서와 같은 올리고뉴클레오티드가 사용되었다.

프로트롬빈을 위한 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다:

5'TGGAGGACAAAACCGAAAGAGA 3'?포워드 프라이머 (서열번호 17)

5'CATCCGAGCCCTCCACAA 3'?리버스 프라이머 (서열번호 18)

5' CTCCTGGAATCCTACATCGACGGGC 3' 프로브 (서열번호 19)

인간 프로트롬빈(rhFII)의 최고치 발현에서 mRNA 비율 분석

세포 라인	mRNA 비율 FII/GGCX	mRNA 비율 FII/VKOR	mRNA 비율 VKOR/GGCX	얻어진 최상의 생산성* (활성 rhFII mg/L)
A3F4	5	13	0.4	27.6
B9A12	86	32	3	27.4
B11E8	29	33	0.9	27.4
M3F6	304	15	20	74.7
O3G3	218	17	13	76.8
P4A4	255	128	2	64.2
P1E2 (VKOR없는 통제군)	221	VKOR 검출되지 않음	VKOR 검출되지 않음	48.4

생산성 측정은 스피너 또는 세이크 플래스크에서 유사한 조건하에서 행해졌다.

표 9의 결과는 생성된 γ-카르복실화된 단백질과 관련하여 최적의 GGCX 및 VKOR 발현 수준이 있음을 나타낸다. 클론 M3F4, O3G3, 및 P4A4는 강력한 CMV 프로모터의 제어하에 VKOR을 포함하는 컨스트럭트를 갖는 (초기에는 rhFII+GGCX를 포함하는 컨스트럭트로 트랜스펙션하여 얻어진) P1E2를 트랜스펙션함으로써 얻어졌다. 충분히 활성인 rhFII의 향상된 생산성을 갖는 클론을 특히 검출하는 어세이를 통해 스크리닝을 실행하였다. 따라서, rhFII 및 GGCX와 관련되어 최적의 VKOR 발현 수준을 갖는 클론이 선택되었다.

실시예 4 및 5에서 세포 라인으로부터 준비된 메신저 RNA가 실시예 3에서와 유사하게 실시간 PCR을 통해 분석되었다. 모든 분석이 실시예 3에서와 같이 GAPDH 제어 반응을 포함한다.

[서열목록]

Claims

감마-카르복실화를 필요로 하는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터와,
비타민 K 에폭사이도리덕타제(epoxidoreductase)를 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하고,
γ-글루타밀 카르복실라제를 인코딩하는 핵산 분자 및 관련된 발현 제어 서열을 더 포함하는 호스트 세포.