JPH01175995A - 生理活性物質の農縮・脱塩方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生理活性たんぱく質を含有する溶液の濃縮・
脱塩方法に関し、さらに詳しくは、精製された生理活性
たんぱく賃金有水溶液を効率良く濃縮・脱塩する方法に
関するものである。

［従来技術および問題点］ たんぱく質、ペプチド、糖たんぱく質またはホルモン等
のいわゆる生理活性物質は、微量でヒトおよび動物の生
理に大きく影響を及ぼす物質であり、種々の生理機能の
研究および臨床治療への応用等、様々な分野での重要性
がしばしば指摘されている。これらの生理活性物質は、
生体組織からの抽出、精製によって得られるが、組織中
の含有量が極めて微量にすぎない上、物理的な作用に比
較的不安定であるために濃縮および脱塩等の処理工程中
に失活したり、あるいは吸着等により損失し、実質的な
収率は極めて低い。従って臨床治療面においてはいうま
でもなく、研究面での需要にも充分応え得ないという問
題点がある。近年の細胞培養技術あるいは遺伝子組換え
技術の進歩により、有用な生理活性物質が従来より大量
に生産されるようになったが、このような方法によって
得られる生理活性物質も、微妙な条件の変化で失活され
易いという点では従来と変わりはなく、精製および濃縮
等の工程に伴って実質的な収率の大幅な低下を避けがた
いのが実状である。さらに、精製工程中に溶液中の生理
活性物質が使用に不適当な程度にまで希釈されたり、溶
液中に不必要な物質、特に塩類が混入されて実用に適さ
なくなる場合も多い。このような理由から、脱塩・濃縮
して最終的に得られる製品は、最新の技術を駆使しても
非常に高価なものとなり、臨床上および研究上の要求を
充分溝たすまでには至っていない。

通常、生理活性物質の濃縮および脱塩は凍結乾燥法、沈
殿法、イオン交換法、減圧透析法および限外濾過法等を
用いて行なわれている。しかしながら、凍結乾燥法は脱
塩に有効でなく、生理活性物質のみならず塩類および低
分子物質も同様に濃縮されるので、溶液中の塩蟲度が上
昇し、生理活性物質の失活、変性を招く恐れが高い。沈
殿法は、大量の処理には適するが、収率が低い上、沈殿
剤の除去が問題である。イオン交換法は、大量の処理に
適し、また比較的容易に完全な脱塩を期待し得るが、吸
着による生理活性物質損失の恐れがある上、非イオン性
の低分子物質が除去されず、さらに他の緩衝液への転用
が困難であるという問題がある。減圧透析法は、少量の
試料の処理には適するが、大量の処理には不適当である
。また、限外濾過法は、大量処理に適し、装置も比較的
安価に得られるが、溶液中に微量しか存在しない生理活
性物質が吸着や剪断応力によって損失または失活される
結果、収率が低下するという問題を有すこのように、現
行の濃縮・脱塩方法はいずれも生理活性物質を含有する
溶液の処理には不都合な点を有しており、従って、生理
活性物質含有水溶液、特に精製後の生理活性物質含有水
溶液を、活性物質の失活や損失を伴なわずに適当な濃度
に濃縮および／または脱塩する方法の開発が強く望まれ
ていた。

［間屈点を解決するための手段］ 本発明者らは、精製処理後の生理活性物質含有水溶液を
、該生理活性物質の失活および／または損失を伴うこと
なく高収率で、容易に濃縮・脱塩する方法を得ることを
目的として鋭意研究を重ねた結果、精製された生理活性
物質含有水溶液に該生理活性物質と同等若しくはそれ以
上の分子量を有する別のたんぱく質を加え、このたんぱ
く質の共存下に透析または限外濾過すると、生理活性物
質の失活や損失を伴うことなく、効率良く濃縮・脱塩す
ることができることを見い出だし、本発明を完成するに
至った。

本発明に於ける生理活性物質には、生理活性を有するポ
リペプチド、たんぱく質、糖たんぱく質などが含まれる
が、本明細書では便宜上、これらを総括して「生理活性
たんぱく質」と呼ぶ。一方、生理活性たんぱく質の水溶
液に添加するたんぱく質は、以下「第２のたんぱく質」
と呼ぶ。

即ち、本発明は、精製された生理活性たんぱく質を含有
する水溶液に、該生理活性たんぱく質と同等もしくはそ
れ以上の分子量を有する実質的に生理活性を持たない第
２のたんぱく質を加え、得られた混合物を限外濾過また
は透析することを特徴とする生理活性たんぱく質水溶液
の濃縮・脱塩方法を提供するものである。

本発明方法に用いられる第２のたんぱく質は、生理活性
たんぱく賃金有水溶液中の塩類および低分子物質のみが
、透析膜または限外濾過膜を介して効率良く排除される
ように作用し、もって該物質の損失を防ぐ。しかしなが
ら、この第２のたんぱく質は、生理活性たんぱく質と共
に溶液中に残存する。従って、第２のたんぱく質はヒト
または動物にとって無毒であると共に、自身に生理活性
が殆んどまたは全く無い物質、もしくは生理活性物質と
の分離が容易である物質である必要がある。

いずれにしても、第２のたんぱく質は、処理すべき溶液
中の生理活性たんぱく質の種類に応じて適宜選択される
べきである。

上記の条件に適合する限り、本発明方法に用い得る第２
のたんぱく質は特定のたんぱく質に限定されず様々な種
類のものから選択し得る。そのようなたんぱく質の内、
例えば、コラーゲン、ゼラチンまたはアルブミンが好ま
しい。あるいはそれらの混合物であってもよい。特に好
ましくは、コラーゲンである。コラーゲンは、ｐＨ調整
、や塩濃度調整で容易に生理活性物質との分離が可能で
ある。これらのたんぱく質の種類や起源は特に限定され
ないが、アルブミンの場合、濃縮・脱塩しようとする生
理活性たんぱく質で処置すべき対象動物由来のものであ
ることが好ましい。他方、コラーゲンおよびその分解産
物であるゼラチンの場合は、それらが元来抗原性の低い
物質である上、現在人手可能な注射用コラーゲンは、ウ
シ真皮から抽出したコラーゲンをペプシン処理して抗原
決定基となるテロペプチドを除去したものであることか
ら、本発明方法に用いさらにはヒトに投与することにお
いてなんら問題の無い物質といえる。従って、コラーゲ
ンおよびその分解産物であるゼラチンは、いかなる種に
由来するものであってもよい。

なお、コラーゲンは、分子中のりジン残基のε−アミノ
酸をカルボキシル基に変換したり、カルボキシル基をサ
クシンイミドエステルに変換して活性化した誘導体、あ
るいは、遺伝子組換え技術で生産されたものであっても
よい。

生理活性たんぱく質に対する第２のたんぱく質の割合は
、厳密なものではないが、通常、生理活性たんぱく質１
モルに対し、約１Ｏ−４モル以上の割合で加えるとよい
。具体的な添加量は、処理すべき溶液の生理活性たんぱ
く質の種類および濃度、並びに選択された第２のたんぱ
く質の分子量等に左右される。一般にコラーゲンの場合
、めやすとしては、生理活性たん白質に対し、モル比で
５×１０−４〜２Ｘ１０’程度である。また添加濃度は
約０．０００１〜２％（ｗ／ｖ）であることが好ましく
、さらに、０．００１−１％（ｗ／ｖ）であることがよ
り好ましい。また、アルブミン、ゼラチンの場合、めや
すとしては生理活性たん白質に対し、モル比で５Ｘ１０
−３〜２×１０５程度である。また、添加濃度は約０．
’　００１〜２０（ｗ／ｖ）％であることが好ましく、
さらに、０．０１〜５％（ｗ／■）であることがより好
ましい。

本発明方法は特定の生理活性たんぱく質を含有する溶液
の濃縮・脱塩処理に限定されないが、微量で生理活性を
有し、物理的な作用に比較的不安定なたんぱく質の濃縮
・脱塩において特に有用である。それらの活性たんぱく
質は、通常の濃縮・脱塩法では失活したり、吸着によっ
て損失され、充分な回収率を期待することができない。

この様なたんぱく質の代表的な例として、インターフェ
ロン、コロニー形成刺激因子、成長ホルモン、成長ホル
モン放出因子、インシュリン様成長因子、プラスミノー
ゲン活性化因子、エリスロボエチン、インターロイキン
２等のサイトカインを挙げることができる。

上記の生理活性たんぱく質は、直接生体組織から抽出し
たもの、細胞培養技術あるいは遺伝子組換え技術によっ
て製造されたものであってよい。

透析または限外濾過は、当該技術分野で既知の方法によ
って行なわれる。透析膜は、通常、このような生理活性
たんぱく質の透析に用いられる透析膜を使用して、常法
通り行うことができる。また、限外濾過法は、限外濾過
膜として膜状、平膜状、ホローファイバー状等の形状を
持った限外濾過装置が知られているが、いずれの型の装
置を用いても本発明方法を実施することができる。膜の
材質は、ポリアクリロニトリル系やポリスルホン系等、
種々ある膜のいずれであってもよい。

［発明の効果］ 本発明によれば、通常の方法によっては活性たんぱく質
の失活や損失を免れ得ないような生理活性たんぱく賃金
有水溶液を効率よく濃縮・脱塩することができ、貴重な
生理活性たんぱく質を高濃度に含有する溶液を得ること
ができる。従って、本発明は、様々な生理活性たんぱく
質の研究、および臨床への応用の両面での需要に応えて
それらの活性たんぱく質を提供するという点から、極め
て有益な方法を提供するものである。

以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１ α−インターフェロンを含む０．０１Ｍ−トリス、グリ
シンバッフｙ−（０，１５Ｍ、ＮａＣＱ含有、ｐＨ７）
２００ｍｇを塩酸酸性にｐ）ｌ調整゛した後、２％アテ
ロコラーゲンを０．０１％（Ｗ／Ｖ）になるように添加
し、撹拌溶解後、分画分子ｆｆ１ｌＯ，０００のポリス
ルホン系平膜を使って濃縮・脱塩操作を行なった。なお
、脱塩はＮａＣｌ２ｆ５度が最初のｌ／１０００になる
まで塩酸酸性蒸留水で２倍濃縮、２倍希釈を繰り返した
。

この操作でのα−インターフェロン（ＩＦＮ）の回収率
をコラーゲンの有無で比較した表１を次に示す。

コラーゲンの添加により明らかな回収率の向上が認めら
れた。

聚−上 実施例２ α−インターフェロンを含む０．（）ＩＭ−）リ　、ス
、グリシンバッフｙ−（０，１５Ｍ、ＮａＣＱ含有、ｐ
Ｈ７）２６９＋（２を塩酸酸性にｐＨ調整し、２％アテ
ロコラーゲンを０．０６％（Ｗ／Ｖ）になるように添加
し、撹拌溶解後、分画分子ｆｆ１ｌＯ，ｏｏｏの透析チ
ューブ（ビスキング社製）に入れ１０ぐの塩酸酸性蒸留
水に対して、３時間、３回透析した。

この操作でのα−インターフェロン（ＩＦＮ）の回収率
を表２に示す。

この結果、回収率は非常に高いものであった。

表２ 実施例３ α−インターフェロンを含む０．０１Ｍ−トリス、グリ
シンバッフｙ−（０，１５Ｍ、ＮａＣＱ含有、ｐＩ（７
）３００ｍＱにヒト血清アルブミン４５０ｉ９を撹拌溶
解後、塩酸酸性にｐＨｇ整し、２％アテロコラーゲン水
溶液３　、０　ｍ（ｌを加え撹拌溶解した。

この液を分画分子量１０，０００のポリスルホン系平膜
を使って１００ｍｇになるまで濃縮し、ＮａＣＱａ度が
最初の１／＋０００になるまで連続的に塩酸酸性蒸留水
を供給しながら脱塩した。

この操作でのα−インターフェロン（ＩＦＮ）の回収率
を表３に示す。

この結果からコラーゲンとヒト血清アルブミンを添加し
ても回収率を高めることがわかった。

表３ 実施例４ α−インターフェロンを含む０．ＯＩＭ−）リス、グリ
シンバッフｙ　　（０，１５Ｍ５ＮａＣＱ含有、ｐＨ７
）２０’ＯｚＣにヒト血清アルブミン３００肩９を加え
撹拌溶解後、塩酸酸性にｐＨ調整し、分画分子量ｔ　ｏ
、ｏ　ｏ　ｏのポリスルホン系平膜を使ってＮａＣ１２
ｅ度が阜初の１７１０００になるまで連続的に塩酸酸性
蒸留水を供給しながら脱塩した。

この操作でのα−インターフェロン（ＩＦＮ）の回収率
を表４に示す。

これは、実施例３からコラーゲンを除いた実施例で、ヒ
ト血清アルブミン単独でも同様に高い回収率を示した。

表４ 実施例５ α−インターフェロンを含む０．０１Ｍ−トリス、グリ
シンバッフｙ−（０，１５Ｍ、ＮａＣＱ含有、ｐＨ７）
６８ｉ１２にヒト血清アルブミン１０２ｏを加え撹拌溶
解後、分画分子ｉｔｏ、ｏｏｏのポリスルホン系平膜を
使ってＮａＣＱ濃度が最初の１／１０００になるまで連
続的に蒸留水を供給しながら脱塩した。

この操作でのα−インターフェロン（ＩＦＮ）の回収率
を表５に示す。

これは、実施例４を中性条件で実施したものである。実
施例４同様、高い回収率を示した。

表５ 以上実施例を挙げて説明してきたが、本発明は添加たん
白質として特に限定されるものではなく、生理活性物質
の使用目的や生理活性物質の存在する溶液に適したたん
白質を選択すればよい。特にコラーゲンはｐＨ値や、塩
濃度によって容易に生理活性物質と分離でき、又修飾コ
ラーゲンを用いることにより濃縮や脱塩時のｐ）（値を
生理活性物質にとって望ましい値に設定できる（例えば
中性付近であればサクシニル化コラーゲン）ので本発明
には特に好ましい。分離する必要がなければ血清アルブ
ミン（よ容易に入手可能でありほとんど全ての生理活性
物質の存在する溶液に可溶で、かつそれ自身活性を持た
ず本発明には好ましいたん白質である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、精製された生理活性たんぱく質を含有する水溶液に
   、該生理活性たんぱく質と同等もしくはそれ以上の分子
   量を有する実質的に生理活性を持たない第２のたんぱく
   質を加え、得られた混合物を限外濾過または透析するこ
   とを特徴とする生理活性たんぱく質水溶液の濃縮・脱塩
   方法。 ２、第２のたんぱく質がコラーゲン、ゼラチンまたはア
   ルブミン、あるいはそれらの混合物であることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、第２のたんぱく質を生理活性たんぱく質に対し、モ
   ル比で約１０＾−＾４以上の割合で加えることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。 ４、コラーゲンがアテロコラーゲンであることを特徴と
   する特許請求の範囲第１−３項のいずれかに記載の方法
   。 ５、生理活性たんぱく質がインターフェロン、コロニー
   形成刺激因子、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、
   インシュリン様成長因子、プラスミノーゲン活性化因子
   、エリスロボエチン、インターロイキン２等のサイトカ
   インであることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載
   の方法。