JPH0788309B2 - 抗血友病因子濃縮物 - Google Patents
抗血友病因子濃縮物Info
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- JPH0788309B2 JPH0788309B2 JP58094213A JP9421383A JPH0788309B2 JP H0788309 B2 JPH0788309 B2 JP H0788309B2 JP 58094213 A JP58094213 A JP 58094213A JP 9421383 A JP9421383 A JP 9421383A JP H0788309 B2 JPH0788309 B2 JP H0788309B2
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- ahf
- solution
- viii
- ultrafiltration
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は新規な抗血友病因子濃縮物およびその製造方法
に関し、かつそれらを提供することを目的とする。本発
明のほかの目的は、以下の説明から明らかとなるであろ
う。特記しないかぎり、部および百分率は重量による。
に関し、かつそれらを提供することを目的とする。本発
明のほかの目的は、以下の説明から明らかとなるであろ
う。特記しないかぎり、部および百分率は重量による。
現在、抗血友病因子（AHF）、あるいは因子VIIIとして
知られている、はヒトの血漿から調製される。低温沈殿
物（Cryoprecipitate）を新らしく凍結したヒト血漿の
融解プールから遠心分離により回収し、ダイサーにかけ
（diced）、洗浄して可溶性タンパク質を除去する。次
いで、低温沈殿物を水で抽出または可溶化する。この水
溶液のpHをわずかに酸性にし、この溶液を冷却して異質
の非AHFタンパク質を分離する。次に、水溶液を水酸化
アルミニウムで処理して、望ましくないタンパク質、と
くにプロトロンビン複合タンパク質を除去する。このア
ルミニウム水酸化物を用いる精製技術は、Hershgold et
al,J.Lab.＆ Clin.Med.,1966、Vol.67、23−32ページ
〔Mozen著、the Twenty−Fourth Annual Wayne State U
niversity Symposinm on Blood,Detroit,Michigan（Jan
uary1976）およびXV Congress of the International S
ociety of Hematology,Jerusalem,Israel（1974）〕お
よび米国特許第4,170,639号（Liu et al,1979年10月）
に記載された。塩および緩衝剤を水溶液に加え、次いで
この水溶液のpHをわずかに酸性に調整した後、これを凍
結乾燥する。
知られている、はヒトの血漿から調製される。低温沈殿
物（Cryoprecipitate）を新らしく凍結したヒト血漿の
融解プールから遠心分離により回収し、ダイサーにかけ
（diced）、洗浄して可溶性タンパク質を除去する。次
いで、低温沈殿物を水で抽出または可溶化する。この水
溶液のpHをわずかに酸性にし、この溶液を冷却して異質
の非AHFタンパク質を分離する。次に、水溶液を水酸化
アルミニウムで処理して、望ましくないタンパク質、と
くにプロトロンビン複合タンパク質を除去する。このア
ルミニウム水酸化物を用いる精製技術は、Hershgold et
al,J.Lab.＆ Clin.Med.,1966、Vol.67、23−32ページ
〔Mozen著、the Twenty−Fourth Annual Wayne State U
niversity Symposinm on Blood,Detroit,Michigan（Jan
uary1976）およびXV Congress of the International S
ociety of Hematology,Jerusalem,Israel（1974）〕お
よび米国特許第4,170,639号（Liu et al,1979年10月）
に記載された。塩および緩衝剤を水溶液に加え、次いで
この水溶液のpHをわずかに酸性に調整した後、これを凍
結乾燥する。
大規模の処理において、水性AHF濃縮物から水を除去し
た後、それを凍結乾燥することが望ましい。この目的
に、AHF濃縮物を再沈殿させた後、凍結乾燥する。水溶
液を冷エタノール、ポリエチレングリコール、またはグ
リシンで処理し、これによりAHFタンパク質を沈殿させ
る。沈殿を遠心分離により集め、水、緩衝剤、生理的食
塩水、および酸と混合し、そして凍結乾燥する。
た後、それを凍結乾燥することが望ましい。この目的
に、AHF濃縮物を再沈殿させた後、凍結乾燥する。水溶
液を冷エタノール、ポリエチレングリコール、またはグ
リシンで処理し、これによりAHFタンパク質を沈殿させ
る。沈殿を遠心分離により集め、水、緩衝剤、生理的食
塩水、および酸と混合し、そして凍結乾燥する。
米国特許第4,170,639号（Liu）は、水性AHF抽出液を、
水酸化アルミニウムで精製し、緩衝液および生理的食塩
水で再構成し、そして酸性pHに調整した後、限外過し
て濃縮し、次いで凍結乾燥できることを開示している。
限外過は、酸性pHに調整し、再構成したAHF抽出液に
ついてのみ、分子量カツトオフ（cut−off）が100万ダ
ルトンである膜を用いて実施される。
水酸化アルミニウムで精製し、緩衝液および生理的食塩
水で再構成し、そして酸性pHに調整した後、限外過し
て濃縮し、次いで凍結乾燥できることを開示している。
限外過は、酸性pHに調整し、再構成したAHF抽出液に
ついてのみ、分子量カツトオフ（cut−off）が100万ダ
ルトンである膜を用いて実施される。
本発明者らは、AHFタンパク質の水溶液を精製して望ま
しくないタンパク質を除去した後であるが、それを緩衝
剤および生理的食塩水と混合しかつそれを酸性のpHに調
整する前に、前記AHF水溶液を限外過することにより
それから水を効果的に除去できることを見出した。
しくないタンパク質を除去した後であるが、それを緩衝
剤および生理的食塩水と混合しかつそれを酸性のpHに調
整する前に、前記AHF水溶液を限外過することにより
それから水を効果的に除去できることを見出した。
本発明者らの研究によると、水の除去は本発明の方法に
おいてAHFタンパク質の活性を有意に変化させないで達
成させることが示された。先行技術の方法において用い
られる限外過技術は、AHF活性の収率を減少させ、こ
の減少は本発明の方法により予期されないほどに回避さ
れる。
おいてAHFタンパク質の活性を有意に変化させないで達
成させることが示された。先行技術の方法において用い
られる限外過技術は、AHF活性の収率を減少させ、こ
の減少は本発明の方法により予期されないほどに回避さ
れる。
本発明の主な利点は、AHF活性を本質的に完全に回収す
るということである。従来の再沈殿および限外過法
は、因子VIIIを不完全に回収し、これは多分AHFタンパ
ク質の変性によるものと思われる。緩衝剤および生理的
食塩水との混合およびpH調整の少なくとも５時間前にお
いて、水性抽出物に限外過を適用する本発明の方法に
おいて、AHF活性の有意の減少は観測されない。先行技
術の限外過法は、抗血有病因子の約15％以上の損失を
生ずる。
るということである。従来の再沈殿および限外過法
は、因子VIIIを不完全に回収し、これは多分AHFタンパ
ク質の変性によるものと思われる。緩衝剤および生理的
食塩水との混合およびpH調整の少なくとも５時間前にお
いて、水性抽出物に限外過を適用する本発明の方法に
おいて、AHF活性の有意の減少は観測されない。先行技
術の限外過法は、抗血有病因子の約15％以上の損失を
生ずる。
本発明のさらに他の利点は、本発明の方法の生成物中の
ホン・ウイレブラント（Von Willebrandt）因子（VIII
R:WF）の含量が有意に高いということである。実質的に
同じ比率でVIII R:WFおよびプロコアギユラント（proco
agulant）因子（VIII:C）を含有する生成物を得ること
が可能である。このような生成物は、自然のVIII:Cの状
態にいつそう近接して近づき、ホン・ウイレブラント患
者、すなわち、ホン・ウイレブラントの病気に悩まされ
る患者に適するであろう。さらい、この生成物の生体内
の半減期は増加する。一般に、本発明の生成物中のVII
I:C/VIII R:WF比（それぞれの活性単位を基準とした
比、以下同じ）約1/0.5〜１の範囲内、通常約1/1であ
り、これに対してアルコール沈殿法において上の比は約
1/0.1〜0.4、通常1/0.2である。本発明の生成物中のVII
I R:WFの濃度は、15単位/mlより大きく、一般に約15〜3
0単位/mlであり、時には100単位/ml程度に高い。たとえ
ば、濃縮のアルコール沈殿工程を用いて得られたVIII
R:WFの濃度は、一般に15単位/mlより小、すなわち約５
〜10単位/mlである。
ホン・ウイレブラント（Von Willebrandt）因子（VIII
R:WF）の含量が有意に高いということである。実質的に
同じ比率でVIII R:WFおよびプロコアギユラント（proco
agulant）因子（VIII:C）を含有する生成物を得ること
が可能である。このような生成物は、自然のVIII:Cの状
態にいつそう近接して近づき、ホン・ウイレブラント患
者、すなわち、ホン・ウイレブラントの病気に悩まされ
る患者に適するであろう。さらい、この生成物の生体内
の半減期は増加する。一般に、本発明の生成物中のVII
I:C/VIII R:WF比（それぞれの活性単位を基準とした
比、以下同じ）約1/0.5〜１の範囲内、通常約1/1であ
り、これに対してアルコール沈殿法において上の比は約
1/0.1〜0.4、通常1/0.2である。本発明の生成物中のVII
I R:WFの濃度は、15単位/mlより大きく、一般に約15〜3
0単位/mlであり、時には100単位/ml程度に高い。たとえ
ば、濃縮のアルコール沈殿工程を用いて得られたVIII
R:WFの濃度は、一般に15単位/mlより小、すなわち約５
〜10単位/mlである。
本発明の他の利点は、AHFタンパク質対フイブリノーゲ
ンのミリグラム数の比が改良されるということである。
従来の再沈殿を用いて得られるものよりも増大したAHF
濃縮物の収率は、単位投与量当りのフイブリノーゲンの
量を有意に低減する。こうして、大きい体積のAHF濃縮
物を受け取る患者におけるフイブリノーゲンの過剰投与
は、本発明の生成物を用いることにより回避することが
できる。本発明の生成物のAHFタンパク質対フイブリノ
ーゲンの重量比（VIII:C/mgψ）は、約2.6〜4.0/1の範
囲内、通常約3.0/1に低下する。先行技術により用いら
れる濃縮のアルコール再沈殿法において、最終生成物の
VIII:C/mgψ比は約1.0〜2.5/1、一般に約1.5/1である。
改良されたVIII:C/VIII R:WFおよびVIII:C/mgψを有す
る本発明の生成物は、従来入手できなかつた。
ンのミリグラム数の比が改良されるということである。
従来の再沈殿を用いて得られるものよりも増大したAHF
濃縮物の収率は、単位投与量当りのフイブリノーゲンの
量を有意に低減する。こうして、大きい体積のAHF濃縮
物を受け取る患者におけるフイブリノーゲンの過剰投与
は、本発明の生成物を用いることにより回避することが
できる。本発明の生成物のAHFタンパク質対フイブリノ
ーゲンの重量比（VIII:C/mgψ）は、約2.6〜4.0/1の範
囲内、通常約3.0/1に低下する。先行技術により用いら
れる濃縮のアルコール再沈殿法において、最終生成物の
VIII:C/mgψ比は約1.0〜2.5/1、一般に約1.5/1である。
改良されたVIII:C/VIII R:WFおよびVIII:C/mgψを有す
る本発明の生成物は、従来入手できなかつた。
前述のように、AHF濃縮物はヒトの血漿から得られる。
一般に、AHF濃縮物の調製は、Hershgold et al,J.Lab.C
lin.Med.,Supra.に最初に記載されている方法の修正お
よび改善により実施される。ヒトの新らしい凍結血漿の
５℃より低い温度において融解したプールから、低温沈
殿を除去する。低温沈殿をダイサーにかけ、緩衝液で洗
浄し、次いで水中に可溶化する。水性AHF溶液のpHを、
生物学的に許容されうる酸、この特定の型の酸はこの分
野でよく知られている、の添加により6.40〜6.95の範囲
内に調整することが好ましい。10℃より低く冷却した
後、形成する沈殿があるときは、それをデカンテーシヨ
ンまたは遠心分離により除去する。活性AFH成分を含有
する水溶液を、アルミニウム水酸化物と混合して、望ま
しくないタンパク質を選択的に除去する。pHが全体を通
じて事実上一定にとどまるということは、この処理の特
徴である。アルミニウム水酸化物処理の結果、望ましく
ないタンパク質はAHF効力を実質的に損失しないで水性A
HF溶液から選択的に除去される。本発明の方法を適用す
るのは、この精製された水溶液である。
一般に、AHF濃縮物の調製は、Hershgold et al,J.Lab.C
lin.Med.,Supra.に最初に記載されている方法の修正お
よび改善により実施される。ヒトの新らしい凍結血漿の
５℃より低い温度において融解したプールから、低温沈
殿を除去する。低温沈殿をダイサーにかけ、緩衝液で洗
浄し、次いで水中に可溶化する。水性AHF溶液のpHを、
生物学的に許容されうる酸、この特定の型の酸はこの分
野でよく知られている、の添加により6.40〜6.95の範囲
内に調整することが好ましい。10℃より低く冷却した
後、形成する沈殿があるときは、それをデカンテーシヨ
ンまたは遠心分離により除去する。活性AFH成分を含有
する水溶液を、アルミニウム水酸化物と混合して、望ま
しくないタンパク質を選択的に除去する。pHが全体を通
じて事実上一定にとどまるということは、この処理の特
徴である。アルミニウム水酸化物処理の結果、望ましく
ないタンパク質はAHF効力を実質的に損失しないで水性A
HF溶液から選択的に除去される。本発明の方法を適用す
るのは、この精製された水溶液である。
本発明によれば、上のように処理した水性AHF溶液を限
外過する。この溶液を特定の半透膜と接触させ、これ
により所望量の水を除去する。すなわち、除去したと
き、最終溶液の凍結乾燥を大きく促進する量の水を除去
する。本発明の方法に適する膜は、100万ダルトンより
小さい、好ましくは10,000〜300,000ダルトンの範囲内
の呼称分子量カツトオフ（cut−off）をもつべきであ
る。100万ダルトンの分子量カツトオフをもつ膜はAHFタ
ンパク質を物理的に捕捉し、こうして、AHF濃縮物の収
量は減少する。本発明において使用できる（対応する呼
称分子量カツトオフをもつ）典型的な限外過膜は、ア
ミコン（Amicon）XM50（50,000ダルトン、アミコン・コ
ーポレーシヨン、マサチユセツツ州レクシントン、
製）、アミコンPM10（10,000ダルトン）、アミコンXM10
0A（100,000ダルトン）、アミコンXM300（300,000ダル
トン）などである。本発明の好ましい実施態様におい
て、水性AHF溶液の限外過は、限外過装置において
中空繊維を用いて、たてえば、アミコンDC30（30平方フ
イートの過面積）中空繊維装置においてアミコンH10P
10（10,000ダルトン）カートリツジのような限外過膜
などを用いて、実施する。
外過する。この溶液を特定の半透膜と接触させ、これ
により所望量の水を除去する。すなわち、除去したと
き、最終溶液の凍結乾燥を大きく促進する量の水を除去
する。本発明の方法に適する膜は、100万ダルトンより
小さい、好ましくは10,000〜300,000ダルトンの範囲内
の呼称分子量カツトオフ（cut−off）をもつべきであ
る。100万ダルトンの分子量カツトオフをもつ膜はAHFタ
ンパク質を物理的に捕捉し、こうして、AHF濃縮物の収
量は減少する。本発明において使用できる（対応する呼
称分子量カツトオフをもつ）典型的な限外過膜は、ア
ミコン（Amicon）XM50（50,000ダルトン、アミコン・コ
ーポレーシヨン、マサチユセツツ州レクシントン、
製）、アミコンPM10（10,000ダルトン）、アミコンXM10
0A（100,000ダルトン）、アミコンXM300（300,000ダル
トン）などである。本発明の好ましい実施態様におい
て、水性AHF溶液の限外過は、限外過装置において
中空繊維を用いて、たてえば、アミコンDC30（30平方フ
イートの過面積）中空繊維装置においてアミコンH10P
10（10,000ダルトン）カートリツジのような限外過膜
などを用いて、実施する。
本発明の方法を実施するとき、限外過膜壁における層
流および剪断の速度は低いことが好ましい。2000より小
さいレイノルズ数、好ましくは200〜300の範囲内のレイ
ノルズ数の壁における層流速度、および1000逆秒（sec
-1）より小さい、好ましくは200〜300sec-1の範囲内の
壁における剪断速度を用いて、きわめてすぐれた結果が
達成される。本発明に従う水溶液の限外過の間に膜壁
において、流速を高くし、その結果生ずる剪断を高くす
ると、濃縮されたAHF生成物はより短かい処理時間で生
ずることが、もちろん、認められる。しかしながら、AH
F濃縮物の活性は、これらの高い速度において、AHFタン
パク質の変性のため、減少する。これに関して、また、
AHFタンパク質の変性を最小とする目的で、空気の吸収
および剪断の場における他の界面効果、たとえば、発泡
などを最小とするために、特別の注意をしなくてはなら
ない。
流および剪断の速度は低いことが好ましい。2000より小
さいレイノルズ数、好ましくは200〜300の範囲内のレイ
ノルズ数の壁における層流速度、および1000逆秒（sec
-1）より小さい、好ましくは200〜300sec-1の範囲内の
壁における剪断速度を用いて、きわめてすぐれた結果が
達成される。本発明に従う水溶液の限外過の間に膜壁
において、流速を高くし、その結果生ずる剪断を高くす
ると、濃縮されたAHF生成物はより短かい処理時間で生
ずることが、もちろん、認められる。しかしながら、AH
F濃縮物の活性は、これらの高い速度において、AHFタン
パク質の変性のため、減少する。これに関して、また、
AHFタンパク質の変性を最小とする目的で、空気の吸収
および剪断の場における他の界面効果、たとえば、発泡
などを最小とするために、特別の注意をしなくてはなら
ない。
限外過の間に用いる型の再循環ポンプは、本発明の１
つの重要な面である。ダイヤフラムポンプはAHFタンパ
ク質の変性を最小にし、これに対し、遠心ポンプはその
使用の間にAHFタンパク質の活性が過度に損失するため
に望ましくない。限外過工程において使用するのに適
したポンプは、たとえば、Amicon LP−20（Amicon Corp
oration）空気圧作動ダイヤフラムポンプおよびワレン
−ラツプ・サンドパイパー（Warren−Rupp Sandpiper）
ポンプ（SA1−Ａ−DB−１−SS型）（Thomas and Associ
ates,Corte Madera,California）である。
つの重要な面である。ダイヤフラムポンプはAHFタンパ
ク質の変性を最小にし、これに対し、遠心ポンプはその
使用の間にAHFタンパク質の活性が過度に損失するため
に望ましくない。限外過工程において使用するのに適
したポンプは、たとえば、Amicon LP−20（Amicon Corp
oration）空気圧作動ダイヤフラムポンプおよびワレン
−ラツプ・サンドパイパー（Warren−Rupp Sandpiper）
ポンプ（SA1−Ａ−DB−１−SS型）（Thomas and Associ
ates,Corte Madera,California）である。
水性AHF溶液の限外過後、この溶液を、従来のよう
に、緩衝液および生理的食塩水と混合する。この目的
に、塩化ナトリウムを水性抽出液に生理学的に許容され
うる量で、通常0.05〜0.30モル、好ましくは0.15モルの
レベルで加える。さらに、適当な生理学的に許容されう
る緩衝剤、たとえば、クエン酸ナトリウムを、それに0.
005〜0.03モル、好ましくは0.01モルのレベルで加え
る。必要に応じて、水性抽出液のpHを6.4〜7.4の範囲内
〔食物および薬物の投与（Food and Drug Administrati
on）の規則により確立された〕に生理学的に許容されう
る酸の添加により調整する。水性AHF溶液を過して粒
子を除去し、次いで滅菌過する。
に、緩衝液および生理的食塩水と混合する。この目的
に、塩化ナトリウムを水性抽出液に生理学的に許容され
うる量で、通常0.05〜0.30モル、好ましくは0.15モルの
レベルで加える。さらに、適当な生理学的に許容されう
る緩衝剤、たとえば、クエン酸ナトリウムを、それに0.
005〜0.03モル、好ましくは0.01モルのレベルで加え
る。必要に応じて、水性抽出液のpHを6.4〜7.4の範囲内
〔食物および薬物の投与（Food and Drug Administrati
on）の規則により確立された〕に生理学的に許容されう
る酸の添加により調整する。水性AHF溶液を過して粒
子を除去し、次いで滅菌過する。
水性AHF溶液から水を除去するための限外過は、溶液
と緩衝液および生理的食塩水との混合前に、溶液へ適用
する必要があることに注意することが重要である。そう
でないと、上に列挙した利益および利点、とくにAHF生
成物の収率に関する、が実現されない。
と緩衝液および生理的食塩水との混合前に、溶液へ適用
する必要があることに注意することが重要である。そう
でないと、上に列挙した利益および利点、とくにAHF生
成物の収率に関する、が実現されない。
そのように処理された水性AHF溶液の滅菌過後、溶液
を凍結乾燥する。溶液は、この分野でよく知られている
ように、急速凍結すべき適当な大きさの容器へ無菌的に
充填し、凍結物質を凍結乾燥する。凍結乾燥した物質を
内部に含む容器を密閉し、生成物を使用するまで約２〜
８℃の温度で貯蔵する。
を凍結乾燥する。溶液は、この分野でよく知られている
ように、急速凍結すべき適当な大きさの容器へ無菌的に
充填し、凍結物質を凍結乾燥する。凍結乾燥した物質を
内部に含む容器を密閉し、生成物を使用するまで約２〜
８℃の温度で貯蔵する。
注入のため、各容器の内容物を無菌蒸留水中に再構成し
て、ほぼ25AHF活性単位/mlを含有する溶液を生成する。
て、ほぼ25AHF活性単位/mlを含有する溶液を生成する。
再構成した最終の凍結乾燥した生成物の色および透明度
を改良するために、前述の限外過後、グリシン沈殿工
程を実施することは、本発明の範囲内である。この目的
に、限外過した水溶液をグリシンと、約1.6〜2.2モ
ル、好ましくは1.9モルのグリシン濃度になるまで、約
５〜20℃において混合する。必要に応じて、この混合物
をクエン酸ナトリウムおよび生理的食塩水とそれぞれ0.
005〜0.03モルおよび0.05〜0.30モルの濃度に混合す
る。この混合物を約30分間以上、好ましくは30〜120分
間、最適には60分間保持する。上の教示に従つて調製し
た、凍結乾燥生成物を再構成すると、それは淡黄色およ
び80％より大きい透明度を有する。
を改良するために、前述の限外過後、グリシン沈殿工
程を実施することは、本発明の範囲内である。この目的
に、限外過した水溶液をグリシンと、約1.6〜2.2モ
ル、好ましくは1.9モルのグリシン濃度になるまで、約
５〜20℃において混合する。必要に応じて、この混合物
をクエン酸ナトリウムおよび生理的食塩水とそれぞれ0.
005〜0.03モルおよび0.05〜0.30モルの濃度に混合す
る。この混合物を約30分間以上、好ましくは30〜120分
間、最適には60分間保持する。上の教示に従つて調製し
た、凍結乾燥生成物を再構成すると、それは淡黄色およ
び80％より大きい透明度を有する。
前述のグリシン沈殿工程は限外過したAHF溶液に適用
しなくてはならないことは、注目するに値する。限外
過工程を省略すると、AHF活性のほぼ半分は最終生成物
において失なわれる。さらに、グリシンの処理が成功し
かつAHF活性の損失が回避されるためには、水性AHF溶液
は、グリシンの処理前に、少なくとも50mg/mlのタンパ
ク質を含有しなくてはならない。
しなくてはならないことは、注目するに値する。限外
過工程を省略すると、AHF活性のほぼ半分は最終生成物
において失なわれる。さらに、グリシンの処理が成功し
かつAHF活性の損失が回避されるためには、水性AHF溶液
は、グリシンの処理前に、少なくとも50mg/mlのタンパ
ク質を含有しなくてはならない。
グリシン処理の結果として形成する沈殿は、普通の手
段、たとえば、遠心分離、過などにより、AHF溶液か
ら分離され、そして沈殿は前述のように緩衝液および生
理的食塩水の中に溶解される。上のようにpHを調整した
後、水性AHF溶液を凍結乾燥して、乾燥したAHF濃縮物を
得る。
段、たとえば、遠心分離、過などにより、AHF溶液か
ら分離され、そして沈殿は前述のように緩衝液および生
理的食塩水の中に溶解される。上のようにpHを調整した
後、水性AHF溶液を凍結乾燥して、乾燥したAHF濃縮物を
得る。
明らかなように、水分が減少した、限外過したAHF溶
液は、完全には乾燥していないが、AHF濃縮物であると
考えられる。
液は、完全には乾燥していないが、AHF濃縮物であると
考えられる。
実施例 本発明を次の実施例により、さらに説明する。
実施例において、合計のタンパク質は280ナノメーター
における吸光度の測定により定量した。
における吸光度の測定により定量した。
プロコアギユラント活性（VIII:C）は、 Langdell et al,J.Lab.Clin.Med.,Vol.41、637−647（1
953）およびProctor et al,Am.J.Clin.Path.,Vol.36、2
12（1961）の方法を修正した１段階活性化部分的トロン
ボプラスチン時間〔one stage Activated Partial Thro
mboplastin Time（APTT）〕試験により検定した。
953）およびProctor et al,Am.J.Clin.Path.,Vol.36、2
12（1961）の方法を修正した１段階活性化部分的トロン
ボプラスチン時間〔one stage Activated Partial Thro
mboplastin Time（APTT）〕試験により検定した。
リストセチン（Ristocetin）−ウイレブラント因子活性
（VIII R:WF）は、Olson et al,Am.J.Clin.Path.,Vol.6
3、210−218（1975）に従うゲル過血小板を用いて検
定した。
（VIII R:WF）は、Olson et al,Am.J.Clin.Path.,Vol.6
3、210−218（1975）に従うゲル過血小板を用いて検
定した。
上記VIII:C（またはVIII−Ｃ）の活性およびVIII R:WF
の活性は、それぞれ正常血漿1mlの対応する活性を１単
位とした場合の単位（Ｕ）で表す（以下の表におけるU/
mlも同じ意味を有する）。
の活性は、それぞれ正常血漿1mlの対応する活性を１単
位とした場合の単位（Ｕ）で表す（以下の表におけるU/
mlも同じ意味を有する）。
定量的因子VIII抗原（VIII R:Ag）の定量は、Laurell,A
nal.Biochem.,Vol.15、45−52（1966）の手順に従い実
施した。
nal.Biochem.,Vol.15、45−52（1966）の手順に従い実
施した。
因子VIII関連タンパク質に対する抗血清は、ベーリング
・ダイアグノスチツクス（Behring Diagnostics）（Som
merville,New Jersey）から得た。
・ダイアグノスチツクス（Behring Diagnostics）（Som
merville,New Jersey）から得た。
タンパク質種の分布は、酢酸セルロースの電気泳動によ
り検定した。
り検定した。
実施例１ AHFタンパク質の水溶液の製造 Hershgold et al,supraの修正法に従つた。ヒトの新鮮
な凍結血漿を５℃以下で融解し、15℃以下に加温した。
そのように加温した血漿を２℃に冷却した。３時間後、
不溶性低温沈殿を10℃以下における遠心分離により集め
た。
な凍結血漿を５℃以下で融解し、15℃以下に加温した。
そのように加温した血漿を２℃に冷却した。３時間後、
不溶性低温沈殿を10℃以下における遠心分離により集め
た。
低温沈殿（1Kg）をダイサーにかけ、10の無菌水中に3
2℃において２時間比内に懸濁させた。次いで、混合物
を0.1N塩酸の添加によりpH6.8に調整し、５℃に冷却し
た。沈殿を５℃における遠心分離により除去した。
2℃において２時間比内に懸濁させた。次いで、混合物
を0.1N塩酸の添加によりpH6.8に調整し、５℃に冷却し
た。沈殿を５℃における遠心分離により除去した。
水溶液（上澄液）を水中のアルミニウム水酸化物の３％
の懸濁液と、0.1gのアルミニウム水酸化物対1gのタンパ
ク質の比で混合した。この混合物を５℃で30分間かきま
ぜ、アルミニウム水酸化物を過および遠心分離により
除去した。
の懸濁液と、0.1gのアルミニウム水酸化物対1gのタンパ
ク質の比で混合した。この混合物を５℃で30分間かきま
ぜ、アルミニウム水酸化物を過および遠心分離により
除去した。
実施例２ 細いみぞ（Thin Channel）中のAHF溶液の限外過 実施例１からの水溶液（300ml）を、特定した温度にお
いてアミコンTCF−10細いみぞ系における種々の細いみ
ぞの限外過膜を通して、限外過して、50mlの体積に
濃縮した。用いた膜はアミコンXM50、アミコンXM100A、
およびアミンコンXM300（すべてアミコン・コーポレー
シヨン）、ミリポア（Millipore）PSVP（106ダルトン、
ミリポア・コーポレーシヨン、マサチユセツツ州ベドフ
オード）であつた。限外過材料は、前述の方法により
分析した。
いてアミコンTCF−10細いみぞ系における種々の細いみ
ぞの限外過膜を通して、限外過して、50mlの体積に
濃縮した。用いた膜はアミコンXM50、アミコンXM100A、
およびアミンコンXM300（すべてアミコン・コーポレー
シヨン）、ミリポア（Millipore）PSVP（106ダルトン、
ミリポア・コーポレーシヨン、マサチユセツツ州ベドフ
オード）であつた。限外過材料は、前述の方法により
分析した。
結果を表１に要約する。
実施例３ 中空繊維中のAHF溶液の限外過 中規模実験 実施例１におけるように調製した水性AHF溶液（20）
を、有効過面積が10平方フイート（0.93m2）／カート
リツジでありそして呼称分子保持限界が10,000ダルトン
であるアミコンH10P10カートリツジを用いる、アミコン
DC30中繊維装置により限外過して、溶液を４の体積
に濃縮した。
を、有効過面積が10平方フイート（0.93m2）／カート
リツジでありそして呼称分子保持限界が10,000ダルトン
であるアミコンH10P10カートリツジを用いる、アミコン
DC30中繊維装置により限外過して、溶液を４の体積
に濃縮した。
限外濾過した材料の前述の方法に従う分析結果を、表２
に記載する。
に記載する。
限外過した材料をクエン酸ナトリウムおよび塩化ナト
リウムと、0.15モルの塩化ナトリウムおよび0.01モルの
クエン酸ナトリウムのレベルを得るために十分な量で混
合した。次に、構成した材料のpHを1N塩酸の添加により
6.9に調整した。次いで、10mlの各構成材料をバイアル
に入れ、400ミクロンより低い圧力および−40℃の出発
貯蔵温度から＋30℃の完成貯蔵温度において凍結乾燥し
た。
リウムと、0.15モルの塩化ナトリウムおよび0.01モルの
クエン酸ナトリウムのレベルを得るために十分な量で混
合した。次に、構成した材料のpHを1N塩酸の添加により
6.9に調整した。次いで、10mlの各構成材料をバイアル
に入れ、400ミクロンより低い圧力および−40℃の出発
貯蔵温度から＋30℃の完成貯蔵温度において凍結乾燥し
た。
実施例４ 中空繊維中のAHF溶液の限外過 生産規模の実験 実施例１におけるように調製した水性AHF溶液を、アミ
コンH10P10カートリツジを用いるアミコンDC中空繊維の
装置により限外過した。
コンH10P10カートリツジを用いるアミコンDC中空繊維の
装置により限外過した。
３回の実験の結果を、下表に記載する。
実施例５ 限外過した濃縮物中のタンパク質種の分布 それぞれ実施例３、実験１、２および３からの限外過
した濃縮物を、酢酸セルロースの電気泳動に付して、タ
ンパク質種の分布を決定した。
した濃縮物を、酢酸セルロースの電気泳動に付して、タ
ンパク質種の分布を決定した。
結果を下表４に要約する。
実施例６ グリシン沈殿後のAHF溶液の限外過 実施例４におけるように調製した限外過AHF溶液（8.6
）を12℃に冷却し、クエン酸ナトリウムと0.01モルの
濃度に混合し、塩化ナトリウムと0.15モルに混合し、そ
してグリシンと1.9モルの濃度に混合した。混合物の温
度を５℃に下げ、処理を通じて５℃に維持した。１時間
後、この混合物を５℃においてスタテイツク（Static）
モードで8500×ｇにおいて30分間遠心分離し、そしてペ
ーストを流出液から分離した。
）を12℃に冷却し、クエン酸ナトリウムと0.01モルの
濃度に混合し、塩化ナトリウムと0.15モルに混合し、そ
してグリシンと1.9モルの濃度に混合した。混合物の温
度を５℃に下げ、処理を通じて５℃に維持した。１時間
後、この混合物を５℃においてスタテイツク（Static）
モードで8500×ｇにおいて30分間遠心分離し、そしてペ
ーストを流出液から分離した。
グリシン処理からのペーストを最終の容器の緩衝系（0.
01モルのクエン酸ナトリウムおよび0.15モルの生理的食
塩水）中に溶かし、そしてこの溶液の一部分を前述の手
順に従い分析した。
01モルのクエン酸ナトリウムおよび0.15モルの生理的食
塩水）中に溶かし、そしてこの溶液の一部分を前述の手
順に従い分析した。
上の溶液の残りの部分を−70℃で30日間凍結し、融解
し、上のように分析した。
し、上のように分析した。
結果を下表に要約する。
上からの凍結した溶液を融解し、予備過した。デキス
トローズを１％のレベルに加え、この溶液のpHを１モル
の塩酸の添加により6.9に調整した。この溶液を0.45μ/
0.22μポール（Pall）フイルターで過して無菌大量槽
に入れ、これら各10mlの溶液をバイアルに入れた。バイ
アルの内容物をストークス（Stokes）凍結乾燥器で前述
のように凍結乾燥した。
トローズを１％のレベルに加え、この溶液のpHを１モル
の塩酸の添加により6.9に調整した。この溶液を0.45μ/
0.22μポール（Pall）フイルターで過して無菌大量槽
に入れ、これら各10mlの溶液をバイアルに入れた。バイ
アルの内容物をストークス（Stokes）凍結乾燥器で前述
のように凍結乾燥した。
１個のバイアルからの凍結乾燥物を、最終容器の緩衝液
中で構成し、上のように分析した。
中で構成し、上のように分析した。
次の結果が得られた： 比活性（VIII:C基準）:0.89 溶解時間:3分38秒 VIII R:WF（μg/ml） （1:100希釈）:22.5 VIII R:Ag（μg/ml） （1:200希釈）:81 透明度：＞80％ 透明度は580ナノメーターにおける試料の透過率の測定
により決定した。対照すなわち標準は水であり、そして
透明度は司郎の透過率（580）／水の透過率（580）×10
0で表わした。
により決定した。対照すなわち標準は水であり、そして
透明度は司郎の透過率（580）／水の透過率（580）×10
0で表わした。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジヨン・エル・ランドブラド アメリカ合衆国カリフオルニア州94530エ ルセリト・クラブ・ビユ−コ−ト1390 (56)参考文献 特開 昭57−75928（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−67627（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- 【請求項１】プロコアギユラント因子（VIII:C）、ホン
・ウイレブラント因子（VII RI:WF）およびフイブリ
ノーゲンを含有する抗血友病因子（AHF）濃縮物であっ
て、VIII:C/フイブリノーゲンの重量比が2.6〜4.0/1で
あり、かつ該特性を得るのに十分な条件下で精製AHFタ
ンパク質の水溶液を分子量10,000〜300,000ダルトンの
カツトオフ限外濾過膜使用の限外濾過処理に付すること
によって得られた濃縮物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/427,372 US4455301A (en) | 1980-02-26 | 1982-09-29 | Antihemophilic factor concentrate |
| US427372 | 1982-09-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5959626A JPS5959626A (ja) | 1984-04-05 |
| JPH0788309B2 true JPH0788309B2 (ja) | 1995-09-27 |
Family
ID=23694590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58094213A Expired - Lifetime JPH0788309B2 (ja) | 1982-09-29 | 1983-05-30 | 抗血友病因子濃縮物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0788309B2 (ja) |
| AR (1) | AR230187A1 (ja) |
| AU (1) | AU555305B2 (ja) |
| MX (1) | MX165225B (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4495175A (en) * | 1982-08-05 | 1985-01-22 | University Of Rochester | Preparation of highly purified human antihemophilic factor |
| DE3432083A1 (de) * | 1984-08-31 | 1986-03-06 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Pasteurisierte, isoagglutininfreie faktor viii-praeparation und verfahren zu ihrer herstellung |
| DK525384D0 (da) * | 1984-11-05 | 1984-11-05 | Nordisk Insulinlab | Praeparat paa basis af faktor viii til behandling af haemofili a inhibitorpatienter samt fremgangsmaade til fremstilling af et saadan praeparat |
| ATE66374T1 (de) * | 1985-11-26 | 1991-09-15 | Novo Nordisk As | Zubereitungen und verfahren zur behandlung von blutungsstoerungen. |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT369263B (de) * | 1980-08-27 | 1982-12-27 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung eines faktor viii(ahf) -hochkonzentrates |
| JPS5867627A (ja) * | 1981-10-12 | 1983-04-22 | ア−マ−・フア−マシユ−テイカル・カンパニ− | 高純度抗血友病性因子の製造法 |
-
1983
- 1983-05-25 AU AU14952/83A patent/AU555305B2/en not_active Expired
- 1983-05-30 JP JP58094213A patent/JPH0788309B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1983-05-30 MX MX19747083A patent/MX165225B/es unknown
- 1983-05-31 AR AR29318983A patent/AR230187A1/es active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU1495283A (en) | 1984-05-03 |
| MX165225B (es) | 1992-10-30 |
| AR230187A1 (es) | 1984-03-01 |
| JPS5959626A (ja) | 1984-04-05 |
| AU555305B2 (en) | 1986-09-18 |
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