KR100260631B1

KR100260631B1 - 활성형 인간 감마 인터페론의 제조방법 및 그에 의해 제조된 단백질

Info

Publication number: KR100260631B1
Application number: KR1019920013926A
Authority: KR
Inventors: 이영미; 이상종; 이복만
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1992-08-03
Filing date: 1992-08-03
Publication date: 2000-07-01
Also published as: KR940004059A

Abstract

본 발명은 유전자 재조합된 미생물로부터 인간 감마 인터페론 활성을 갖는 재조합 인간 감마 인터페론을 제조하는데에 있어서, 상기 미생물로부터 추출된 재조합 인간 감마 인터페론의 불용성 과립구를 요소와 포도당이 함유된 단백질 변성용액에 용해시켜 변성시킨 후, 포도당이 함유된 재구성 완충용액에 희석시키고, 양이온 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 활성형 인간 감마 인터페론의 제조방법과 그러한 방법에 의해 얻어지는 pH 7에서의 용해도가 20㎎/㎖이고 비활성도가 6 × 10⁷IU/㎎ 이상인 인간 감마 인터페론을 제공하는 것이다.

Description

활성형 인간 감마 인터페론의 제조 방법 및 그에 의해 제조된 단백질

제1도는 단백질 재구성 과정에서 생성된 단백질 집합체(aggregated form)의 함량을 pH에 따라 나타낸 것이고,

제2도는 단백질 재구성 과정에 있어서 가용성의 불완전 재구성된 단백질(soluble mis-folded form) 형성에 대한 pH의 영향을 나타낸 것이고,

제3도는 pH 5.5에서 단백질 농도에 따라 완전 재구성된 단백질(correct folded protein)의 양을 단백질 재구성을 위한 희석의 방치시간 경과에 따라 나타낸 것이고,

제4도는 pH 5.5에서 단백질 재구성 효율에 미치는 포도당의 영향을 나타낸 것이고,

제5도는 포도당 함유 또는 비함유 용액의 단백질 재구성에 있어서 염의 효과를 나타낸 것이다.

본 발명은 활성형 인간 감마 인터페론의 제조 방법 및 그에 의해 제조된 단백질에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 재조합 인간 감마 인터페론이 미생물 세포내에서 비활성 불용성 단백질로 생산되는 경우, 이 불용성 단백질을 용해시킨 후 이를 안정하고 천연형의 감마 인터페론과 동일한 구조(native conformation)를 갖는 활성형 단백질로 재구성하는 방법 및 이렇게 재구성하여 제조된 활성형 단백질에 관한 것이다.

일반적으로 인터페론은 세포의 기능을 조절해 주는 작용을 갖고 있는 단백질의 한 부류로서 그 기능은 매우 다양하다.

예를 들면, 바이러스로 부터의 세포 보호, 골수에서의 세포 분열 억제, T 세포작용의 조절, 자연면역세포(NK 세포)의 기능항진 유도에 의한 식균작용상승 또는 특수 암세포에 대한 분열억제 등의 기능이 있는 것으로 알려져 있다. 현재 알려진 인터페론으로는 백혈구(leukocyte)에서 바이러스 감염에 의해 유도되는 α-인터페론, 섬유아세포(fibroblast)에서 바이러스나 이중나선의 RNA에 의해 유도 생산되는 β-인터페론과 임파구(lymphocyte)에서 항원이나 세포 분열촉진물질(mitogen)에 의해 유도 생산되는 γ-인터페론등 3종류가 있다. 이들 인터페론들은 현재 제한된 질병의 치료제로서 임상에서 응용되고 있다. 특히, 감마 인터페론의 항바이러스 작용, 항암작용, 항증식(anti-proliferative) 기능 및 면역조절작용등은 치료재로서의 이용가치가 탁월하여, 최근에는 항바이러스제, 항암제 및 항염·항류마티스제로서 임상에서 응용되고 있다.

인간 감마 인터페론의 유전자 염기서열은 1982년 그레이 등(P.W. Gray et al., Nature 295, 503-508(1982))에 의해 cDNA(complementary DNA)로부터 판독, 규명되었으며 이어서 인간 감마 인터페론의 생체내에서의 구조는 1984년 린더네크 등(E. Rinderknecht et al., J. Biol. Chem. 259, 6790-6767(1984))에 의해 규명되어졌다. 이들 연구결과에 의하면, c-DNA로부터 유추된 인간 감마 인터페론은 146개의 아미노산으로 구성될 것으로 추정하였으나, 실제 생체로부터 직접 분리, 정제한 생리활성을 갖는 인간 감마 인터페론은 N-말단의 아미노산 서열에 있어서 c-DNA로부터 유추된 것과는 달리 Cys-Tyt-Cys가 없으며, 글루타민(Gln)으로 시작되는 것으로 밝혀졌다. 즉, 생체내 활성 인간 감마 인터페론은 N-말단이 Cys-Tyr-Cys로 시작되는 것이 아니라, Cys-Tyr-Cys은 절단 제거되고 Cys-Tyr-Cys의 다음 잔기인 글루타민(Gln)으로부터 시작되는 것을 의미한다. C-말단에 있어서는 절단이 여러 장소에서 일어나 아미노산 길이에 있어서 여러 가지로 존재하는 것으로 밝혀졌다. 또한 최근에는 C-말단에서 절단된 아미노산의 수에 따라 생리 활성이 다름도 밝혀졌으며, 특히 절단된 아미노산의 개수가 증가함에 따라 생리활성이 증가하며, 절단된 아미노산이 9개 혹은 10개인 경우 생리활성의 최고치를 나타내며, 더 이상의 절단에 있어서는 생리활성이 급격히 낮아진다는 사실도 알려졌다. C-말단에서 아미노산이 9개 절단된 것은 1984년 린더네크(E Rinderknecht et al., J. Biol. Chem. 259, 6790-6797(1984))에 의해 생체내에서 최종적으로 정재해낸 것중 가장 긴것에 해당된다.

유전자 재조합 감마 인터페론의 생산에 있어서는 인간세포 또는 동물세포를 숙주세포로 사용하여 이들 세포를 세포분열 촉진 물질로 자극하여서 인간 감마 인터페론의 생산을 유도시켜줌으로써 N-말단이 글루타민(Gln)으로 시작되는 인간 감마 인터페론을 대량으로 생산하는 방법은 미생물을 숙주세포로 이용하여 생산하는 경우보다 생산성이 많이 떨어진다.

한편, 미생물로부터 유전자 재조합 방법을 이용하여 인간 감마 인터페론 생산하는데 있어서, 초기에는 N-말단이 Cys-Tyr-Cys로 시작하는 것이었으나, 생체내활성 단백질이 Cys-Tyr-Cys가 절단되어 제거된 것으로 판명된 후에는 글루타민(Gln)으로 시작되는 단백질을 생산, 정제해오고 있다. 미생물에서 생산되는 인간 감마 인터페론은 가용성의 활성 단백질로 생산되기 보다는 과립구라고 불리우는 불용성 단백질로 생산되며, 특히 미생물내에서 생산된 인간 감마 인터페론의 양이 많을수록 불용성 단백질로 생산된다. 불용성의 불활성 단백질로 생산될 경우에는 이 불활성 단백질을 임상에 적용 가능하도록 천연형의 단백질과 같이 높은 용해도와 활성을 갖도록 천연형 구조를 갖는 단백질로 변환시켜야만 한다. 물론 미생물을 이용한 인간 감마 인터페론의 생산에 있어서도 인간세포 혹은 동물 세포 배양법과 같이 가용성의 활성 단백질로 생산, 정제할 수 있으나, 이 경우도 인간 또는 동물세포 배양법에서와 같이 생산성에 있어서 많은 문제점을 가졌다. 따라서, 인간 감마 인터페론의 생산에 있어서는 미생물을 이용하여 불용성 단백질로 과립구로 생산한 다음, 불활성 단백질을 활성 단백질로 재구성시키는 것이 가장 유리하다는데 의견이 모아지고 있다.

이에 따라, 불활성 단백질을 활성 단백질로 재구성시키는 방법이 프라이어(Prior, C.)등에 의해서 연구되었다(국제 특허 출원 공개 제 85/05637 호, 출원일 85. 6. 4, BIOGEN N.V.). 이것은 1㎎/㎖ 농도의 단백질을 구아니딘염 또는 요소로 변성시킨 후, 슈크로스가 든 완충용액에 희석하고 친화성 크로마토그래피하여 재구성시키는 방법으로 이 방법에 의하여 불활성 단백질의 약 60% 정도가 활성 단백질로 전환될 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이 방법은 단백질 농도가 극히 제한되어 있고 활성 단백질의 회수율이 낮으므로 대량 정제하기에는 아직도 많은 문제점이 존재하고 있다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 예의 연구한 결과, 유전자 재조합 방법으로 생성된 불용성 인간 감마 인터페론을 정제하는 동안 또는 정제전이나 후에 이 인간 감마 인터페론을 요소등의 단백질변성제와 포도당이 함유된 단백질 변성용액에 완전히 용해시켜 변성(denature)시킨 후, 포도당이 함유된 재구성 완충용액으로 희석시켜 재구성(refolding)시킨 다음, 크로마토그래피를 실시하여 완벽하게 재구성시킴으로써 6 × 10⁷IU/㎎ 이상의 활성과 pH 7의 중성용액에서 20㎎/㎖ 이상의 용해도를 갖는 천연형의 활성 단백질과 동일한 구조의 활성형 단백질을 높은 회수율로 대량 제조할 수 있음을 알게되어 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명의 목적은 유전자 재조합 방법에 의해 미생물에서 불용성의 불활성 단백질로 생산된 재조합 인간 감마 인터페론을 임상에 적용가능하도록 천연형의 구조를 가지며 안정하고 용해도가 활성이 높은 단백질로 재구성시키는 활성형 인간 감마-인터페론의 제조방법을 제공하는 것이며, 또한 이 방법에 의해 재구성된 활성형 단백질을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따르면, 유전자 재조합 방법으로 생산된 정제되거나 정제되지 않은 혹은 부분정제된 인간 감마 인터페론을 먼저 요소등의 단백질 변성제와 포도당이 함유된 단백질 변성용액에 용해시켜 완전히 변성시킨다.

그런 다음, 단백질을 재구성시키기 위하여 포도당이 함유된 재구성 완충용액에 10배 희석시킨다. 이때, 재구성 완충용액에서의 포도당 농도는 2 내지 10(w/w)%가 되게하고, pH는 5 내지 8 정도가 되게하는 것이 적당하다. 또한 본 발명에서는 재구성시키고자 하는 인간 감마 인터페론의 적정 농도가 재구성 완충용액에서 0.5 내지 10㎎/㎖로서 매우 많은 양의 단백질을 재구성시킬 수가 있다. 일반적으로 알려진 인간 감마 인터페론의 재구성 방법은 재구성시키고자 하는 단백질 시료의 농도가 1㎎/㎖ 이하인 경우에서만 가능하다는 것을 고려할 때, 본 발명에서와 같이 단백질 시료의 농도가 10㎎/㎖ 정도로 매우 높아도 재구성 효율이 떨어지지 않는다는 점은 매우 큰 잇점일 것이다.

상기에서와 같은 재구성 완충용액에서의 재구성과정을 마친후에 인간 감마 인터페론은 가용성의 완전 재구성 단백질(correct folded protein)뿐만 아니라 가용성 불완전 재구성 단백질(mis-folded protein) 및 불용성의 불완전 재구성 단백질도 혼합되어 있는 상태로 얻어지므로, 이들 불완전 재구성 단백질을 완전 재구성된 단백질로 전환시키거나 혹은 제거시키기 위하여 S-세파로스 또는 CM-세파로즈등을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피를 실시한다. 이러한 양이온 교환 크로마토그래피과정동안 불용성의 불완전 재구성 단백질은 제거되며 가용성의 불완전 재구성 단백질은 가용성의 완전 재구성 단백질로 전환된다.

혹은, 양이온 교환 크로마토그래피 대신에, 재구성 완충용액에 용매투석 후 다시 고농도의 염이 함유된 완충용액에 재차 용매투석하여 가용성의 불완전 재구성 단백질을 불용성의 불완전 재구성 단백질로 전환시킴으로써 완전 재구성 단백질의 분리를 용이하게 할 수 있다.

이와 같은 본 발명은 미생물로부터 불용성인 불활성 인간 감마 인터페론을 정제하기 전이나 정제동안 또는 정제후 언제든 적용할 수 있다. 단백질을 분리한 후 재구성시키는 경우, 예컨대 균체(wet cell)를 완충용액에 현탁, 분쇄시킨 후 원심분리 하여 침전물을 회수하고, 이 침전물을 요소가 함유된 완충용액에 용해시킨 후 원심분리하여 침전물을 제거하고, 그 상등액을 요소가 함유된 완충용액상에서 양이온교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피하여 95% 이상의 순도로 정제시킨 다음, 본 발명에 따라 재구성시킬 수 있다.

또는, 정제과정동안 재구성시키는 방법으로서, 예컨대 상기에서 설명한 정제과정중에 양이온 교환 크로마토그래피를 실시한 후, 본 발명에 따라 단백질 재구성을 실시하고, 이어서 겔 여과 크로마토그래피 혹은 친화성 블루(Affinity Blue) 크로마토그래피하여 95% 이상의 순도로 정제시킬 수도 있다.

또는, 먼저 단백질 재구성을 실시한 후 정제하는 방법으로서, 예컨대 균체를 완충용액에 현탁, 분쇄시킨 후 원심분리하여 침전물을 회수하고, 이 침전물을 요소 및 포도당이 함유된 완충용액에 용해시키고, 헥산의 제거를 위하여 폴리에틸렌아민(PEI)을 첨가한 후 원심분리하여 침전물을 제거한 다음, 그 상등액을 본 발명에 따라 포도당이 함유된 재구성 완충용액에 희석시킨 후 양이온 교환크로마토그래피와 겔여과 크로마토그래피하여 정제한다. 이때 정제된 인간 감마 인터페론을 소디움도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)하여 C-말단에서 절단이 일어나 크기가 작아진 인간 감마 인터페론등 일부 불순물 단백질이 존재할 경우 친화성 블루 크로마토그래피를 이용하여 불순 단백질을 제거하여서 순도 95% 이상으로 정제시킬 수 있다.

이상과 같은 본 발명에 따라 재구성된 인간 감마 인터페론은 pH7의 중성 수용액에 20㎎/㎖ 이상의 용해도와 6 × 10⁷IU/㎎ 이상의 비활성도(specific activity)를 갖으며, 20mM 소디움포스페이트, pH7 완충용액에서 단백질 농도가 1㎎/㎖ 인 경우 단백질의 변성온도(Tm)가 56~58℃ 정도로 안정성을 갖는 단백질임을 확인하였다.

상기와 같은 본 발명은 재조합 미생물로부터 새로 생산된 단백질에 뿐만 아니라 이미 정제된 단백질이 변성되어 생리활성이 떨어지거나 용해도가 떨어진 단백질에 적용하여도 다시 천연형의 구조를 가지며 안정하고 용해도가 높고 활성이 높은 가용성의 활성형 단백질로 재구성할 수 있다.

이하 본 발명을 하기의 실험 및 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 하기 참조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐이고 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

[참조예 1]

[pH에 따른 단백질 집합체의 형성]

불용성 또는 불황성의 인간 감마 인터페론을 가용성의 활성 단백질로 재구성하는 과정을 최적화하기 위하여 먼저 단백질 변성제에 의한 변성 후 단백질의 재구성 과정에서 pH에 따른 단배질 집합체의 형성에 미치는 영향을 다음과 같이 조사하였다.

정제된 재조합 인간 감마 인터페론을 1㎎/㎖의 농도가 되도록 8M 요소, 20mM NH₄OAc(ammonium aceate)의 pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8의 5개 용액에 녹이고, 각 용액을 동일 pH의 20mM NH₄OAc 용액으로 10배 희석한 후 280nm에서 UV 흡수치를 측정하였다. UV 측정후 희석한 용액을 다시 동일 pH의 20mM NaOAc 용액에 용매 투석한 다음, 0.2㎛의 필터를 통과시킨 뒤 UV를 측정하였다.

인간 감마 인터페론의 생리활성형은 이량체(dimer)이나, 구조에 이상이 생길 경우 단백질 분자간 퇴합(association)이 일어나 집합체를 형성하며, 이것이 더욱 커지면서 침전으로 진행된다. 따라서 희석 후 UV 값과 희석, 용매투석, 0.2㎛ 필터 통과후의 UV 값의 차이는, 단백질이 집합체를 형성하여 0.2㎛ 필터를 통과하지 못하는데서 오는 것으로 생각할 수 있다. 제1도는 단백질 재조합 과정에서 생성된 단백질 집합체의 함량을 pH에 따라 나타낸 결과이다. 여기서 알 수 있듯이 단백질 재구성과정에서 pH가 높을수록 단백질 집합체가 더 잘 생성됨을 알 수 있다.

[참조예 2]

[pH에 따른 가용성 불완전 재구성 단백질의 형성]

본 실험에서는 pH에 따른 가용성의 불완전 재구성 단백질의 생성을 조사하였다.

정제된 재조합 인간 감마 인터페론을 1㎎/㎖의 농도가 되도록 8M 요소, 20mM NH₄OAc의 pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8의 5개 용액에 각각 녹이고, 각 용액을 동일 pH의 20mM NH₄OAc 용액에 10배 희석한 후, 280nm에서 UV 흡수치를 측정하였다. UV 측정후 희석한 용액을 20mM 소디움 포스페이트, pH 7 수용액에 OM, 0.15M 및 0.5M NaCl이 각각 첨가된 3개의 용액에 48시간 용매 투석한 후, 0.2㎛의 필터에 통과시킨 뒤, 280nm에서 UV 측정하였다.

포스페이트 완충용액과 고이온 강도하에서 가용성의 불완전 재구성된 단백질은 단백질 집합체가 되며 나아가서는 침전으로의 형성을 촉진하나 완전 재구성된 단백질에는 영향을 미치지 않으므로, 0.2㎛의 필터를 통과할 수 있는 이량체의 가용성의 불완전 재구성된 단백질은 고이온 강도의 완충용액에 대한 용매투석에 있어서 이온 강도의 증가에 따른 단백질 집합체의 형성증가로 0.2㎛의 필터를 통해 제거할 수 있다. 제2도는 이들 가용성의 불완전 재구성된 단백질 형성에 대한 단백질 재구성 과정에 있어서의 pH의 영향을 조사한 결과이다. 여기서는 pH 5 이하에서 가용성의 불완전 재구성된 단백질이 많이 생성됨을 알 수 있다.

[참조예 3]

[단백질 농도에 따른 단백질 재구성 효율]

상기 실험 1 및 2의 결과로부터 결정된 단백질 집합체 및 가용성의 불완전 재구성 단백질이 적게 생성되는 pH 영역에서 단백질 농도에 따른 단백질 재구성 효율을 알아 보았다.

정제된 인간 감마 인터페론을 1, 4, 10㎎/㎖의 농도가 되도록 8M 요소, 20mM NaOAc(sodium acetate), pH 5.5 용액에 각각 녹이고, 각 용액을 20mM NaOAc, pH 5.5 용액에 10배 희석한 다음, 일정기간 경과후 모노-S 양이온 교환 크로마토그래피(Pharmacia사 제품) 컬럼을 이용하여 재구성이 제대로 일어난 단백질을 회수, 정제하였다.

제3도는 pH5.5 에서의 단백질 농도에 따라 완전 재구성된 단백질의 양을 단백질 재구성을 위한 희석의 방치시간 경과에 따라 나타낸 것이다. 인간 감마 인터페론의 재구성은 단백질 농도가 낮을수록 잘 일어나는 것으로 알려졌으나, pH5.5에서는 1㎎/㎖의 단백질 농도에서 보다 4㎎/㎖의 단백질 농도에서 완전 재구성된 단백질로의 단백질 회수율이 더 높음을 보여주고 있다. 즉, 최적 pH에서는 단백질 농도가 낮을수록 단백질 재구성이 잘 일어나는 것이 아니라, 단백질 재구성에 있어서 최적 단백질 농도가 존재하는 것을 의미한다. 인간 감마 인터페론의 생리활성형이 이량체임을 고려하면, 타당성이 있는 결과로 생각된다. 이 단백질 최적농도는 지금가지 보고된 재구성의 최적화의 농도가 1㎎/㎖ 이하의 농도라는 사실과 비교할 때, 재구성에 있어서 pH 최적화의 중요성을 알 수 있다.

[참조예 4]

[단백질 재구성에 있어서 포도당의 영향]

단백질 재구성의 효율을 높이기 위하여 포도당 함유 용액에서의 단백질 재구성에 있어서 단백질 재구성의 효율, 즉 완전 재구성된 단백질로서 단백질 회수율을 다음과 같이 조사하였다.

정제된 인간 감마 인터페론을 1, 4, 10㎎/㎖의 농도가 되도록 10% 포도당 함유 20mM NaOAc, pH 5.5 용액에 10배 희석한다음, 일정시간의 경과에 따라 모노-S 컬럼을 이용하여 완전 재구성된 단백질을 회수, 정제하였다.

제4도는 pH 5.5에서 단백질 재구성 효율에 미치는 포도당의 영향을 나타낸 결과이다. 여기서는 단백질의 재구성에 있어서 포도당이 존재할 경우, 농도에 상관없이 단백질 재구성 효율이 크게 향상되었으며 1, 4, 10㎎/㎖의 농도 모두에서 100%에 가까운 단백질의 회수율을 보였으며 특히 초기 재구성에 있어서 10㎎/㎖의 단백질 농도의 경우가 10㎎/㎖의 경우보다 재구성이 빨리 일어남을 보여주고 있다.

[참조예 5]

[단백질 재구성에 있어서 염의 영향]

염이 인간 감마 인터페론의 단백질 재구성에 미치는 영향을 다음과 같이 조사하였다.

정제된 재조합 인간 감마 인터페론을 4㎎/㎖이 되도록 10% 포도당 함유, 포도당 비함유, 10% 포도당 및 0.3M NaCl 함유, 그리고 포도당 비함유 0.3M NaCl 함유의 8M 요소, 20mM NaOAc, pH 5.5의 4가지 용액에 각각 녹이고, 각 용액을 동일 농도의 포도당이 함유된 20mM NaOAc, pH 5.5 용액에 10배 희석한 후, 일정시간 후 모노-S 컬럼을 이용하여 완전 재구성된 단백질을 회수 정제하였다. 제5도는 포도당 함유 또는 비함유 용액의 단백질 재구성에 있어서 염의 효과를 나타낸 결과이다. 여기서는 염이 포도당 비함유 용액에서의 단백질 재구성에 있어서 단백질 회수율을 저하시키나, 10% 포도당 함유 용액에서는 단백질 회수율은 100%로 변화가 없고 오히려 초기의 단백질 재구성 속도가 증가되었음을 알 수 있다. 즉, 빠른 시간내에 단백질의 재구성이 일어나도록 기여한다. 본 실험의 의의는 일반적으로 단백질 재구성은 이온 강도가 낮은 용액에서 하여야 효율이 좋으나, 본 실험의 10% 포도당 함유 용액에서의 단백질 재구성은 높은 이온 강도의 염이 존재하여도 효율에 지장을 받지 않으므로, 단백질 정제과정중 어느 단계에서나 염의 제거없이 실시 가능하다는 것이다.

[실시예 1]

[정제후 재구성시키는 방법]

인간 감마 인터페론을 발현하는 숙주세포 사카로마이세스 세레비지애 pYLBC-γ IFN(Saccharomyces cerevisiae pYLBC-γ IFN, 대한민국 특허출원 제 86-3822 호 참조) 균체 100g을 300㎖의 완충액[20mM NaOAc, pH 5.5]에 현탁시켜서, 0.6㎛의 유리구슬로 비드 비터(bead beater)에서 분쇄시킨 후, 이를 12,000 × g에서 50분간 원심분리하여 침전물을 회수하고, 이 침전물을 1ℓ의 완충용액[9M 요소, 20mM NaOAc, pH 5.5]에 첨가하고 12시간 동안 교반시켜서 용해시킨 후 다시 12,000 × g에서 20분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 상기 상등액을 완충용액[8M 요소, 20mM NaOAc, pH 5.5]으로 미리 평형시킨 SP-세파덱스 50(Pharmacia 제품) 컬럼(5 × 5cm)에 2㎖/분의 속도로 통과시키면서 흡착시키고, 컬럼에 다시 완충용액[8M 요소, 20mM NaOAc, pH 5.5]을 통과시키면서 컬럼내에 유리된 상태로 남아있는 단백질을 모두 제거하였다. 그 다음 완충용액[8M 요소, 20mM NaOAc, 0.8M NaCl, pH 5.5]을 이용하여 선형구배시켜서 용출시키며, 이때의 용출 속도는 2㎖/분으로 하였다. 용출된 각 분획을 15% SDS-PAGE하여 인간 감마 인터페론이 많이 모여 있는 분획을 보았다. 이 분획을 5㎎/㎖ 정도의 단백질 농도가 되도록 분획 분자량 10,000의 한외여과막을 이용하여 농축하였으며 이를 완충용액[8M 요소, 20mM NaOAc, pH 5.5]으로 미리 평형시킨 세파크릴 S-200(Pharmacia사 제품)으로 겔 크로마토그래피를 실시하였다. 용출된 각 분획을 15% SDS-PAGE하여 감마 인터페론의 순도가 98% 이상되는 분획만을 모았다. 모아진 분획에 포도당을 최종농도가 10% 되도록 첨가한 후 10% 포도당이 함유된 완충용액[10% 포도당, 20mM NaOAc, pH 5.5]에 10배 희석하였다. 희석된 용액을 완충용액[20mM NaOAc, pH 5.5]으로 미리 평형시킨 S-세파로스에 5㎖/분의 속도로 통과시키면서 흡착시키고, 컬럼에 다시 완충용액[10% 포도당, 20mM NaOAc, pH 5.5]을 통과시며서 컬럼내에 유리된 상태로 남아있는 단백질과 잔존 요소를 제거하였다. 그런 다음 완충용액[20mM NaOAc, 1M NaCl, pH 5.5]을 이용하여 선형 구배시켜서 용출시켰다. 용출된 인간 감마 인터페론을 임상, 또는 실험목적에 적합한 완충용액에 충분히 용매 투석시켰다. 최종 정제된 인간 감마 인터페론은 6 × 10⁷IU/㎎ 이상의 활성과 98%의 순도와 pH 7의 중성 용액에서 20㎎/㎖ 이상의 용해도를 갖으며, 반복된 실험에 있어서 숙주세포 균체 100g당 100~400㎎의 단백질을 회수할 수 있었다.

[실시예 2]

[부분 정제 후 재구성시키는 방법]

본 실시예에서는 상기 실시예 1에 있어서 SP-세파덱스 C50에서 모아진 분획에 대해 단백질의 재구성을 실시한 후 분리 정제하였다.

상기 실시예 1의 SP-세파덱스 C50에서 모아진 분획에 포도당을 최종농도가 10% 되도록 첨가한 후 10% 포도당이 함유된 완충용액[10% 포도당, 20mM NaOAc, pH5.5]에 10배 희석한 후, 희석된 용액을 완충용액[20mM NaOAc, pH 5.5]으로 미리 평형시킨 S-세파로즈 컬럼에 흡착시키고, 컬럼에 다시 완충용액[10% 포도당, 20mM NaOAc, pH 5.5]을 통과 세척시킨 후, 그런 다음 완충용액[20mM NaOAc, 1M NaCl, pH5.5]을 이용하여 선형구배시켜서 용출시켰다. 용출된 각 분획을 15% SDS-PAGE하여 인체 감마 인터페론이 많이 모여 있는 분획을 모았다. 이 분획을 완충용액[20mM NaOAc, pH5.5]으로 미리 평형시킨 세파크릴 S-200으로 겔 여과 크로마토그래피를 실시하였다. 용출된 각 분획을 15% SDS-PAGE하여 인간 감마 인터페론의 순도가 99% 이상되는 분획만을 모았다.

이때 순도 98% 미만의 인체 감마 인터페론의 분획이 많을 경우, 다시 인간 감마 인터페론이 많이 모여 있는 분획을 모아 Affi-Gel Blue(Bio-Rad사 제품)컬럼을 이용하여 친화성 크로마토그래피를 실시하였다. 완충용액[20mM NaOAc, 0.2M NaCl, pH 5.5]으로 미리 평형시킨 Affi-Gel Blue 컬럼에 상기 인간 감마 인터페론을 흡착시킨 다음, 완충용액[20mM NaOAc, 2M NaCl, pH 5.5]을 이용하여 0.2M부터 2M 까지 되도록 선형구배시켜서 용출시켰다. 용출된 각 분획을 15% SDS-PAGE하여 인간 감마 인터페론의 순도가 98% 이상이 되는 분획만을 모았다. 이렇게 하여 정제된 인간 감마 인터페론은 6 × 10⁷IU/㎎ 이상의 활성과 pH7의 중성수용액에서 20㎎/㎖ 이상의 용해도를 가지고 있었다.

[실시예 3]

[재구성시킨 후 정제하는 방법]

본 실시예에서는 먼저 단백질 재구성을 실시한 후 컬럼 크로마토그래피를 시행하여 인간 감마 인터페론을 정제하였다.

실시예 1에서 사용한 것과 동일한 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균체 100g을 300㎖의 완충액[20mM NaOAc, pH 5.5]에 현탁시키고, 0.6㎛의 유리구슬로 비드 비터(bead beater)에서 분쇄시킨 후, 이를 12,000 × g에서 50분간 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 이 침전물을 1ℓ의 완충용액[9M 요소, 10% 포도당, 20mM NaOAc, pH 5.5]에 첨가하여 12시간 동안 교반시켜서 용해시킨 후 이를 12,000 × g에서 20분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 상기 상등액에서 헥산을 제거하기 위하여 10%의 폴리에틸렌아민(PEI)을 최종 농도가 0.5% 되도록 첨가하여 1시간 동안 방치한 후, 12,000G에서 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 상기 상등액을 10% 포도당이 함유된 완충용액[10% 포도당, 20mM NaOAc, pH 5.5]에 10배 희석시킨 후, 희석된 용액을 실시예 2에서와 같이 S-세파로즈 크로마토그래피 S-200 겔 여과 크로마토그래피 및 필요에 따라서는 Affi-Gel Blue의 친화성 크로마토그래피를 실시하여 인간 감마 인터페론을 순도 98% 이상으로 정제하였다. 최종 정제된 인간 감마 인터페론은 6 × 10⁷IU/㎎ 이상의 활성과 pH 7의 중성 용액에서 20㎎/㎖ 이상의 용해도를 가지고 있었으며, 반복된 실험에 있어서 숙주세포 균체 100g 당 100~400㎎의 단백질을 회수할 수 있었다.

본 발명을 당해분야에서 통상의 지식을 가진자에게 자명한 변형과 변화를 가하여 실시하여도 본 발명의 본질을 변화시키지 않는한 본 발명의 범위에 속함은 물론이다.

Claims

유전자 재조합된 미생물로부터 인간 감마 인터페론 활성을 갖는 재조합 인간 감마 인터페론을 제조하는데에 있어서, 상기 미생물로부터 추출된 재조합 인간 감마 인터페론의 불용성 과립구를 요소와 포도당이 함유된 단백질 변성용액에 용해시켜 변성시킨 후, 포도당이 함유된 재구성 완충용액에 희석시키고, 양이온 교환 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 활성형 재조합 인간 감마 인터페론의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 재구성 완충용액중의 포도당 농도가 2 내지 10% W/V인 방법.
제1항에 있어서, 상기 재구성 완충용액의 pH가 5 내지 8인 방법.
제1항에 있어서, 상기 재구성 완충용액에서 재구성시키고자 하는 인간 감마 인터페론의 농도가 0.5㎎/㎖ 내지 10㎎/㎖인 방법.
제1항에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피로 S-세파로즈 또는 CM-세파로즈를 사용하는 방법.
제1항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피후 친화성 블루 크로마토그래피하는 단계를 추가로 포함하는 방법.