TW201331368A - 單步驟純化重組胃幽門螺旋桿菌嗜中性白血球激活蛋白（ｈｐ－ｎａｐ）的方法 - Google Patents

單步驟純化重組胃幽門螺旋桿菌嗜中性白血球激活蛋白（ｈｐ－ｎａｐ）的方法 Download PDF

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Abstract

本發明揭露一種單步驟純化重組胃幽門螺旋桿菌嗜中性白血球激活蛋白(HP-NAP)的方法，其步驟包括：提供一含有HP-NAP之待純化樣本，其中該待純化樣本係取自一可表現重組HP-NAP之蛋白質表現系統；將該含有重組HP-NAP之待純化樣本以一二乙氨乙基(DEAE)離子交換樹脂，在一預定pH值區間進行純化；以及收集經由該上述步驟後之一流出液(flowthrough fraction)及清洗液(wash fraction)，其中該流出液及清洗液包含一預定純度之重組HP-NAP。本發明利用高親和性的DEAE Sephadex離子交換樹脂以單一步驟將水溶性蛋白的重組HP-NAP純化出來，藉此從枯草桿菌表現系統中純化出低內毒素殘留的重組HP-NAP，且純化出來的重組HP-NAP具有典型的α-helix二級結構且可活化嗜中性白血球以產生活性氧。

Description

單步驟純化重組胃幽門螺旋桿菌嗜中性白血球激活蛋白(HP-NAP)的方法
本發明係關於一種自業已導入基因之轉形株經由樹脂回收及純化重組蛋白質之方法，特別是關於一種單步驟純化重組胃幽門螺旋桿菌嗜中性白血球激活蛋白(HP-NAP)的方法。
胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)是引發胃炎、消化性潰瘍，以及胃癌的主要致病菌。而胃幽門螺旋桿菌嗜中性白血球激活蛋白(Helicobacter pylori neutrophil activating protein,HP-NAP)是胃幽門螺旋桿菌的重要致病因子。根據流行病學的探討，在台灣地區居住的健康人口群中的「胃幽門螺旋桿菌」感染人口數，亦高達一千多萬人左右，而這些受感染的人口群也是罹患「胃腺癌」的高危險群。由此可知，「胃幽門螺旋桿菌」的感染已成為台灣地區重要的公共衛生課題。一般而言，胃幽門螺旋桿菌的藥物治療大致可分為幾種，包括：抗酸劑，如氫離子阻斷劑(Proton Pump Inhibitor，PPI)以及抗生素，常見的抗酸劑中氫離子阻斷劑有Esomeprazole、Lansoprazole、Pantoprazole及Rabeprazole等，抗生素則包括Amoxicillin及Clarithromycin等。
由於前述提及胃幽門螺旋桿菌是一種與慢性胃炎(Chronic Gastritis)、消化性潰瘍(peptic ulcer disease)、胃腺癌(gastric adenocarcinoma)及淋巴癌(lymphoma)高度相關的細菌，而胃幽門螺旋桿菌嗜中性白血球激活蛋白(HP-NAP)是其中一種毒性因子(virulence factor)，在胃幽門螺旋桿菌感染所造成的致病過程中扮演了一種重要角色，胃幽門螺旋桿菌嗜中性白血球激活蛋白(HP-NAP)目前已被認為可作為對抗胃幽門螺旋桿菌感染的疫苗；因此，有效地取得HP-NAP蛋白質成了亟待發展的目標。
承上所述，胃幽門螺旋桿菌與多種胃部疾病及癌症高度相關，而胃幽門螺旋桿菌嗜中性白血球激活蛋白(HP-NAP)是其中一種毒性因子(virulence factor)，在胃幽門螺旋桿菌感染所造成的治病過程中扮演了一種重要角色。HP-NAP目前已被認為可作為對抗胃幽門螺旋桿菌感染的疫苗，因此，有效地取得HP-NAP蛋白質成了亟待發展的目標。
本發明技術內容係關於一種建立枯草桿菌表現系統表現重組胃幽門螺旋桿菌嗜中性白血球激活蛋白(HP-NAP)，且經由單步驟的有效純化過程，可避免脂多醣(lipopolysaccharide,LPS)污染進而減少內毒素污染的問題。本發明利用高親和性的DEAE Sephadex離子交換樹脂以單一步驟將水溶性蛋白的重組HP-NAP純化出來，藉此從枯草桿菌表現系統中純化出低內毒素殘留的重組HP-NAP，且純化出來的重組HP-NAP具有典型的α-helix二級結構且可活化嗜中性白血球以產生活性氧(reactive oxygen species,ROS)。這些結果顯示枯草桿菌表現系統所表現的重組胃幽門螺旋桿菌嗜中性白血球激活蛋白不但在結構上折疊正確且在功能上具有活性，也證實了此種單一步驟的純化方法應可有效地純化枯草桿菌表現系統所表現的重組HP-NAP，以用於基礎研究、疫苗發展或藥物設計上。
本發明係提供一種單步驟純化重組胃幽門螺旋桿菌嗜中性白血球激活蛋白(HP-NAP)的方法，其步驟包括：提供一含有HP-NAP之待純化樣本，其中該待純化樣本係取自一可表現重組HP-NAP之蛋白質表現系統；將該含有重組HP-NAP之待純化樣本以一二乙氨乙基(DEAE)離子交換樹脂，在一預定pH值區間進行純化；以及收集經由該上述步驟後之一流出液(flowthrough fraction)及清洗液(wash fraction)，其中該流出液及清洗液包含一預定純度之重組HP-NAP。
較佳地，在前述之方法中，其中該預定pH值區間係介於pH 7.5~9.0之間，進一步較佳地可介於7.5~8.0之間。
較佳地，如前所述之方法，其中該純化後之重組HP-NAP係為原態(native)之HP-NAP。
較佳地，如前所述之方法，其中該純化後之重組HP-NAP係為由α-helix單體所形成之多聚體蛋白質。
較佳地，如前所述之方法，其中該蛋白質表現系統係為枯草桿菌(B. subtilis)表現系統或是大腸桿菌(E. coli)表現系統。
較佳地，如前所述之方法，其中該DEAE離子交換樹脂係為DEAE Sephadex樹脂。
較佳地，如前所述之方法，其中該DEAE離子交換樹脂係為DEAE Sepharose樹脂。
較佳地，如前所述之方法，其中該重組HP-NAP之純度至少大於90%。
較佳地，如前所述之方法，更包括在收集該流出液及清洗液後進行一濃縮過濾步驟以除去該重組HP-NAP所含有之內毒素並提高該重組HP-NAP之純度。
較佳地，如前所述之方法，其中經過該濃縮過濾步驟後，其中該內毒素的含量為每毫克HP-NAP低於3.29 EU。
經由本發明所採用之技術手段，利用高親和性的DEAE Sephadex離子交換樹脂以收集流出液及清洗液的方式，僅需單一步驟即可將水溶性的重組HP-NAP純化出來，藉此純化出低內毒素殘留的重組HP-NAP，且純化出來的重組HP-NAP係為(native form)原態之HP-NAP，具有典型的α-helix二級結構且具有免疫活性。
本發明係提供一種單步驟純化重組胃幽門螺旋桿菌嗜中性白血球激活蛋白(HP-NAP)的方法，其步驟包括：提供一含有HP-NAP之待純化樣本，其中該待純化樣本係取自一可表現重組HP-NAP之蛋白質表現系統；將該含有重組HP-NAP之待純化樣本以一二乙氨乙基(DEAE)離子交換樹脂，在一預定pH值區間進行純化；以及收集經由該上述步驟後之一流出液(flowthrough fraction)及清洗液(wash fraction)，其中該流出液及清洗液包含一預定純度之重組HP-NAP。在上述的方法中，其中該預定pH值區間係介於pH 7.5~9.0之間，該純化後之重組HP-NAP係為原態(native)之HP-NAP，該純化後之重組HP-NAP係為由α-helix單體所形成之多聚體蛋白質，該蛋白質表現系統係為枯草桿菌(B. subtilis)表現系統，該DEAE離子交換樹脂係為DEAE Sephadex樹脂或DEAE Sepharose樹脂，該重組HP-NAP之純度至少大於90%。另外，更包括在收集該流出液及清洗液後進行一濃縮過濾步驟以除去該重組HP-NAP所含有之內毒素並提高該重組HP-NAP之純度，其中經過該濃縮過濾步驟後，其中該內毒素的含量為每毫克HP-NAP低於3.29 EU。
材料及方法 將 napA 基因選殖進入枯草桿菌 (B . subtilis) 表現系統
胃幽門螺旋桿菌(H. pylori strain 26695)之基因體DNA係萃取自胃幽門螺旋桿菌培養液，且使用Puregene DNA純化套組(Gentra Systems,Minneapolis,MN)參照其使用說明純化。嗜中性白血球激活蛋白基因(napA gene)係經由胃幽門螺旋桿菌(H. pylori strain 26695)之基因體DNA進行PCR擴增所得，其使用的正向及反向引子對分別包含Nde I及Hind III切點。正向引子對(forward)序列為SEQ ID NO. 1: 5’-TTTTTTAACATATGAAGACCTTTGAGATCCTA-3’，而反向引子對(reversed primer)序列為SEQ ID NO. 2: 5’-GCAACTCTTCATCAATCCTTA-3’。PCR反應係使用基因體DNA作為模板，以及使用套組中的酵素反應混合物(Expand High Fidelity enzyme mix,Roche,Mannheim,Germany)，於PCR反應器(Mastercycler Gradient 5331,Eppendorf,Germany)中進行反應。起始變性反應(denaturing phase)為94℃5分鐘；接著進行94℃1分鐘、60℃ 1分鐘、72℃ 2分鐘的35個循環，最終延長反應(elongation phase)為72℃7分鐘。接著將napA的擴增片段，以選殖套組(TOPO TA cloning kit,Invitrogen,Carlsbad,CA)選殖入pCR4-TOPO載體。完成後的質體命名為pCR4-TOPO-NAP，並定序確認napA已正確插入。將包含napA之片段以Nde I及Hind III自pCR4-TOPO-NAP切下後選殖入pET28a表現載體(Novagen,Madison,WI)。完成後的質體命名為pET28a-His-NAP。將napA片段以Nde I及Hind III自pET28a-His-NAP切下後選殖入pRPA表現載體(如第1圖所示)，其為pEX5A之衍生載體(Yeh et al.,2007)。完成後的質體命名為pRPA-NAP，如第1圖所示，並將其以電轉化技術(electro-transform)送入枯草桿菌(B. subtilis DB104)菌株中(Kawamura and Doi et al.,1984)。
HP-NAP 表現於枯草桿菌( B . subtilis )中的最佳化
將B. subtilis DB104-pRPA-NAP培養於含有四環黴素的LB培養盤並置於37℃下培養一晚。挑出B. subtilis DB104-pRPA-NAP的單一菌落，接種於含有四環黴素的LB培養液。預培養時以150 rpm、37℃之下搖瓶培養一晚。將上述預培養液以1: 100比例接種至含有四環黴素的LB培養液。以180 rpm、37℃之下搖瓶培養分別收集3至24小時的菌液。B. subtilis DB104-pRPA-NAP的生長，係藉由U-2800 UV-VIS光譜儀(Hitachi,Tokyo,Japan)讀取各收集液於600 nm的吸光值。接著，將上述所收集之1 ml的B. subtilis培養液，以13,000 x g於4℃之下離心1分鐘。除去上清液後，將菌體沉澱(pellets)以液態氮冷凍儲存於-70℃直到使用。B. subtilis DB104係作為負控制組，且B. subtilis DB104的培養條件與B. subtilis DB104-pRPA-NAP相同。
將取自1 ml的B. subtilis DB104-pRPA-NAP及B. subtilis DB104菌體沉澱重新懸浮於1 ml含有20 mM Tris-HCl及50 mM NaCl其pH為8.0的緩衝溶液中，且添加有1 μl之蛋白酶抑制劑混合物(Pl mix)，其內含0.13 mM之PMSF、10.67 μg/ml之TLCK以及10.67 μg/ml之TPCK。將菌體懸浮液置於冰上以超音波SONICS VCX-750(Sonics & Materials,Newtown,CT)探頭將細胞震盪破碎。所得細胞溶解物以15%之SDS PAGE進行分析，接著以PhastGelTM Blue R染色以檢測HP-NAP之表現，並以Multi Gauge V3.0軟體進行定量。
枯草桿菌( B. subtilis )中的HP-NAP之大量表現
將B. subtilis DB104-pRPA-NAP於37℃培養，以150 rpm之轉速搖瓶直至其OD600nm達到2.0至2.1。將上述菌液，以1:100之比例接種於含有四環黴素之LB培養液中。將培養液以180 rpm於37℃之下搖瓶培養，直至其OD600nm達到1.4~1.6。之後，將該些菌液以6,000 x g於4℃下離心15分鐘以移除其上清液並保存於-70℃直至純化。
以批量法生產表現於枯草桿菌( B. subtilis )中的重組 HP-NAP 之純化最佳化
將B. subtilis菌體沉澱物重新懸浮於含有蛋白酶抑制劑混合物及50 mM NaCl其pH為8.0且體積為原培養液之十分之一的Tris緩衝溶液中，用高壓均質機(Avestin Inc.,Ottawa,Canada)在4℃下進行破菌。將細胞溶解物以30,000 x g於4℃離心1小時以得到其上清液。以此上清液所含的可溶性蛋白質進行pH或蛋白質與樹脂之比例最佳化。取適量處於pH為8.0的Tris緩衝溶液之上清液分別調整成pH 7.0至9.0。將上述pH值的上清液與樹脂以3:1的體積比例各別與DEAE Sepharose(GE Healthcare Life Sciences,Uppsala,Sweden)及DEAE Sephadex(Sigma-Aldrich,St. Louis,MO)樹脂混合，並在4℃下以小型試管旋轉混和器上搖動30分鐘後將混合物以10,000 x g於4℃下離心30秒，除去上清液並收集為流出液(flowthrough fraction)。在兩種樹脂中分別加入一個管柱體積(CV)上述pH值的Tris緩衝溶液。放置該混合液於小型試管旋轉混和器上搖動10分鐘並以上述方式離心所得上清液為清洗液(wash fraction)並重複該些步驟五次。在兩種樹脂中分別加入一個管柱體積(CV)上述pH值內含1M NaCl的Tris緩衝溶液。放置該混合液於小型試管旋轉混和器上搖動10分鐘並以上述方式離心所得上清液為沖提液(elution fraction)並重複該些步驟兩次。包含流出液、清洗液及沖提液，以15% SDS-PAGE及10% native-PAGE進行分析。為了決定在實驗中欲注入樹脂之蛋白質量以得到純的HP-NAP，取處於pH為8.0的Tris緩衝溶液之上清液與DEAE Sepharose及DEAE Sephadex樹脂依上清液中的可溶性蛋白量0.5至1.3 mg/ml樹脂之比例混合。其餘操作方式皆與上述進行pH與樹脂之比例最佳化相同。上述實驗所得之流出液(flowthrough fraction)、清洗液(wash fraction)及沖提液(elution fraction)以15% SDS-PAGE進行分析。
表現於枯草桿菌( B. subtilis )中的重組HP-NAP之純化
利用批量法破菌及離心後所得的上清液進行大量HP-NAP的純化。將可溶性蛋白質與樹脂之比例依0.77 mg/ml注入接在KTAprime system(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)上且已與pH 8.0的Tris緩衝溶液平衡的DEAE Sephadex管柱中。使用pH 8.0的Tris緩衝溶液在流速1 ml/min下以每管3 ml收集流出液。接著將流速調整至5 ml/min並將管柱以pH 8.0的Tris緩衝溶液清洗兩個管柱體積並以每管5 ml收集。最終，將該些蛋白管質以含有1 M NaCl的pH 8.0之Tris緩衝溶液，以5 ml/min之流速進行沖提。沖提液以每管10 ml進行收集。將SDS-PAGE分析檢測到重組HP-NAP之收集液以含有30 ka超過濾濃縮膜(ultrafiltration regenerated cellulose YM membrane)的濃縮裝置進行濃縮並置換pH 8.0之Tris緩衝溶液成pH 7.2之D-PBS。將細胞溶解物之蛋白質、可溶性蛋白質、含HP-NAP之收集液及濃縮後之HP-NAP以15% SDS-PAGE進行分析。再以PhastGelTM Blue R染色分析SDS-PAGE之膠體確認濃縮後HP-NAP的純度。濃縮之HP-NAP經帶有正電荷、親水性濾膜(Acrodisc chromatography unit with Mustang E membrane)之針筒式過濾器過濾去除內毒素後，其內毒素含量為每毫克HP-NAP低於3.29 EU。
人類嗜中性白血球的分離
周邊靜脈血液樣本係取自健康捐贈者。將血液樣本混合以等量的3% dextran至0.9%食鹽水溶液中，並置於室溫下20分鐘以沉澱其紅血球。在dextran沉澱後，將含有白血球的血漿以250 x g於5℃下離心10分鐘，白血球係分層於Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare Bio-Sciences AS(Uppsala,Sweden))，接著以400 x g於20℃之下連續離心40分鐘。將含有大量多型核白细胞之細胞沉澱物以低滲裂解(hypotonic lysis)除去紅血球。再將細胞沉澱物重新懸浮於D-PBS，並保存於冰上於5小時內使用。最後的細胞懸浮液，以Cytocentrifuged preparations將細胞固定於玻片上進行劉氏染色(Liu's stain)，再以光學顯微鏡400X檢測至少700個細胞以計算細胞純度，其中含有90%以上的嗜中性白血球，並以錐藍質排除測試(trypan blue exclusion test)分析其存活率超過95%。
氧化壓力測定法(oxidative burst assay)
將分離出的人類嗜中性白血球以含有0.5 mM D-glucose之D-PBS(Invitrogen)(簡稱為D-PBS-G)重新懸浮至2 x 106 cells/ml。50 μl的細胞懸浮液分注至96孔盤中，並將細胞維持於37℃。接著，將150 μl各別含有0.9 mM CaCl2,0.5 mM MgCl2,0.27 μM H2DCFH-DA(Dichlorodihydrofluorescein diacetate)混入溶於未去除或已去除內毒素之D-PBS的刺激物混合液，將之加入96孔盤中的細胞懸浮液使其最終體積為200 μl。在總體積為200 μl之細胞與刺激物混合液，HP-NAP、PMA及H2DCFH-DA之最終濃度分別為1、0.08 μM及10 μM。利用Fluoroskan Ascent fluorometer(Labsystems,Helsinki,Finland)，以三重複、每30分鐘偵測一次，共進行4小時的方式，監測其538 nm的螢光發射光譜。
超離心分析( Ultracentrifugation analysis )
在pH 7.2之D-PBS中的HP-NAP，其沉降係數係以分析式超離心測得，其離心設備為Beckman Coulter ProteomeLabTM XL-I protein characterization system，離心條件為135,556 x g(41,000 rpm)於20℃之下進行186分鐘。HP-NAP之沉降係數及計算所得之分子量係以SEDFIT軟體進行分析求得。
液相層析質譜儀分析( Liquid chromatography mass spectrometry analysis )
重組HP-NAP之單體分子量係以液相層析質譜儀分析。將HP-NAP注入Agilent 1100 series(PaloAlto,CA)毛細管高效液相層析儀(HPLC)，其接有MST C4 0.075 x 10 mm管柱(Thermo,USA)。使用的溶劑為95% acetonitrile及0.1% formic acid，其流速為0.028 ml/min。其梯度係產生自5%至40%之溶劑、40分鐘，維持於40%之溶劑、50分鐘，以及產生自40%至70%之溶劑、60分鐘。HP-NAP被以40%至70%的溶劑梯度沖提出來，並以micromass Q-TOF(Waters Micromass,UK)進行分析。
圓二色譜分析( Circular dichroism spectroscopy analysis )
以AVIV 62A CD光譜儀(Aviv Associates,Lakewood,NJ)使用1 mm光徑長度之比色計(cuvette)於25℃下偵測處於pH 7.2的D-PBS且濃度為4 μg/ml之HP-NAP。其在遠紫外光的平均殘基橢圓率(mean residue ellipticity,MRE)，係以MRE=θ/(10 x L x C x P)之公式計算，其中θ為millidegree為單位之測得信號，L是比色計之光徑長度，C是蛋白質的分子濃度，P為胜肽鍵的數目。
統計分析
所有資料皆以平均值(means)±標準差(S.D.)呈現。統計分析軟體係使用Excel 2010(Microsoft)。統計學重要性係以Student’s t-test決定。p值小於0.05時被認為具有統計學重要性。
實施例1：在枯草桿菌( B. subtilis )中表現重組HP-NAP
為了在枯草桿菌(B. subtilis)中表現HP-NAP，在此係利用枯草桿菌DB104表現系統(Bacillus subtilis DB104 expression system)。將napA基因選殖入pRPA表現載體，並轉殖至Bacillus subtilis DB104以進行蛋白質表現。由於在Bacillus subtilis DB104中表現蛋白質無需誘發，如何決定理想的培養時間以得到最大表現量的重組HP-NAP就變得相當重要。利用SDS-PAGE分析各個培養時間點枯草桿菌表現的HP-NAP數量。第2圖顯示在具有pRPA-NAP的枯草桿菌中各個時間點所表現的重組HP-NAP(分子量約17 kDa)，而在培養15小時左右HP-NAP表現量達到最高點。而在B. subtilis DB104中未見到HP-NAP的表現。因此，選擇在其生長15小時，作為重組HP-NAP表現在枯草桿菌表現系統中的培養時間。如SDS-PAGE分析結果所示(第3A圖)，表現於枯草桿菌表現系統中的重組HP-NAP主要出現在可溶性上清液。Native PAGE分析結果更顯示出，其中分子量略大於232 kDa的蛋白質，即是表現於枯草桿菌表現系統中的重組HP-NAP，但在單獨的B. subtilis DB 104中則未出現(第3B圖)。該些結果顯示出表現於枯草桿菌中的重組HP-NAP是一種可溶性多聚體蛋白質。
實施例2：藉由單步驟DEAE離子交換層析純化表現於枯草桿菌中的HP-NAP
由於HP-NAP分子量較大，習知利用膠體管柱層析純化H. pylori的內生性HP-NAP(Evans et al.,1995)或是表現於E. coli中的重組蛋白(Kottakis et al.,2008,Thoreson et al.,2000,Wang et al.,2008)。然而，該些方式不但費時且需要一種以上的管柱層析方法，純化出高純度之HP-NAP。以Native PAGE分析表現HP-NAP的枯草桿菌之可溶性上清液的結果中，偵測到源自枯草桿菌中具有某些略大於140 kDa的蛋白質(第3B圖)。可能很難經由膠體管柱層析將該些蛋白質與重組HP-NAP分離。由於HP-NAP是一PI為6.75的蛋白質複合體(dodecameric protein)，因此利用DEAE離子交換管柱層析，以pH值高於6.5的緩衝液純化出表現於枯草桿菌系統中的HP-NAP。為了理想地純化出表現於枯草桿菌系統中的HP-NAP，利用五種不同pH值的緩衝液(pH 7.0、7.5、8.0、8.5及9.0)，配合DEAE-Sepharose或DEAE-Sephadex樹脂進行小產量純化，測試其純化效率。就兩種樹脂而言，重組HP-NAP主要表現於pH值7.5至9.0的上清液，以及在pH值7.0的沖提液(第4A~4B圖)。在pH為7.5至9.0的流出液之重組HP-NAP，比在pH值7.0的沖提液更高(第4A~4B圖)。此未預期的發現增加了一種可能性，也就是在pH值7.5至9.0間，重組HP-NAP在流出液比在沖提液更容易運用傳統的離子交換層析進行純化。另一方面，來自B. subtilis內生性(endogenous)的非HP-NAP蛋白，則在DEAE Sephadex樹脂純化下於流出液中相較於DEAE Sepharose樹脂純化有較大幅度的減少(第4A~4B圖左欄)。在pH 7.0至9.0之下，兩種樹脂在沖洗步驟中，部分殘留的HP-NAP及未結合於樹脂上的枯草桿菌內生性蛋白可被洗下(第4A~4B圖)。在沖提液中可見當緩衝液pH值在7.5及8.0時，以DEAE Sephadex樹脂進行純化，相較於DEAE Sepharose樹脂，HP-NAP僅有少量結合於樹脂之上(第4A~4B圖右欄)，亦即在pH 7.5及8.0的純化環境中，DEAE Sephadex樹脂對於HP-NAP有較佳的純化效果。然而，HP-NAP在pH 8.0的流出液之純度相較於pH 7.5的流出液有更高的純度(第4A圖左欄)，由此顯示出高純度的重組HP-NAP，可藉由收集pH值為8.0的流出液部分進行負向純化(negative purification)，而可自枯草桿菌表現系統中分離。
為了進一步發展利用負向純化以純化表現於枯草桿菌中的HP-NAP，在此利用小產量方法以測試欲與DEAE Sephadex樹脂混合之B. subtilis DB104-pRPA-NAP細胞溶解物之上清液在pH值8.0的理想蛋白量，以確保HP-NAP可由流出液中獲得最大量及最高純度，且大部分枯草桿菌內生性蛋白能有效結合於DEAE Sephadex樹脂上之有效條件。在加入蛋白量與樹脂體積比例為0.5~1.3 mg/ml DEAE Sephadex樹脂，HP-NAP出現於流出液中(第5圖左欄)；在蛋白質量介於0.9至1.3 mg/ml DEAE Sephadex樹脂時，部分殘留的HP-NAP及未結合於樹脂上的B. subtilis內生性蛋白在沖洗步驟被洗下的量亦有隨加入蛋白質量上升而增加的趨勢(第5圖左欄)；隨著加入蛋白質量上升，在沖提液中也可見枯草桿菌內生性蛋白結合於DEAE Sephadex樹脂的量亦增加(第5圖右欄)。該些結果顯示在pH 8.0時，蛋白質量與加入DEAE Sephadex樹脂之較佳比例應低於0.9 mg/ml樹脂。
已知加入蛋白質量與樹脂之比例關係後，在此應用負向純化以DEAE-Sephadex管柱並於pH 8.0之條件下以分離表現於B. subtilis之重組HP-NAP。將可溶性蛋白質與樹脂之比例依0.77 mg/ml注入DEAE-Sephadex管柱中。根據管柱層析之結果，重組HP-NAP主要分布於流出液中(第6圖)。B. subtilis之內生性蛋白則結合於DEAE-Sephadex樹脂且係出現在沖提液中(第6圖)。在濃縮含HP-NAP的流出液伴隨交換pH 8.0的Tris緩衝溶液成pH 7.2的D-PBS緩衝溶液過程後，純化之HP-NAP的純度為96%(第7A圖)。Native PAGE分析顯示純化之重組HP-NAP為多聚體形式且其分子量約為232 kDa(第7B圖)。表現於B. subtilis之重組HP-NAP的純化結果如表1所示。純化每克B. subtilis菌體沉澱可得1.8至3.3毫克的重組HP-NAP。該些結果顯示出利用單步驟之DEAE-Sephadex陰離子交換管柱層析之負向純化可有效純化出表現於B. subtilis之重組HP-NAP。
實施例3：自 B. subtilis 純化之HP-NAP為α-helix之多聚體蛋白質
為了確認純化之HP-NAP是否為多聚體蛋白質，故測量純化之HP-NAP的物理性質並對照與先前的研究結果是否相符，方可證明以此DEAE-Sephadex陰離子交換管柱層析所純化的HP-NAP呈現原態(native form)。發現純化之重組HP-NAP之沖提為單一波峰，經膠體管柱層析分析結果其分子量約為150 kDa(第8A圖)。沉降分析(sedimentation analysis)顯示純化之重組HP-NAP之沉降係數為9.53 S(第8B圖)，計算得到其分子量約為200 kDa。Native-PAGE、膠體管柱層析及沉降分析之結果顯示純化之HP-NAP形成一多聚體蛋白質。該些結果與先前文獻之結果一致(如表2)。
在此也針對HP-NAP單體確定其分子量與結構是否也符合先前的研究報告，由ESI-TOF LC-MS的結果顯示，純化之HP-NAP的單體分子量為16.934 kDa(第9A圖)，而遠紫外光圓二色譜(Far UV circular dichroism)的結果可得出純化之HP-NAP其單體之二級結構為α-helix(第9B圖)。綜合上述結果皆符合HP-NAP特有的物理性質(如表2)，由此可知表現於B. subtilis之重組HP-NAP，係藉由α-helix二級結構之單體而形成多聚體蛋白質。
實 施例4：表現於 B. subtilis 之重組HP-NAP促進人類嗜中性白血球之活性氧(ROS)產生
確認純化之HP-NAP的物理性質無誤後，透過刺激人類嗜中性白血球經由前述氧化壓力測定法測量其活性氧(ROS)被誘導產生的程度，即可知純化之HP-NAP是否具有活性。人類嗜中性白血球在純化的HP-NAP刺激之下確可產生活性氧，經過移除內毒素的步驟，去除如源自緩衝液等所有可能造成之額外內毒素污染的因子，HP-NAP仍能刺激人類嗜中性白血球產生活性氧(第10圖)。結果顯示純化之HP-NAP表現出正常的生物活性以刺激人類嗜中性白血球中活性氧的產生。
討論
目前已發展出數種純化HP-NAP的方法，其中不乏也有以離子交換層析法的方式來進行純化HP-NAP(Kottakis et al.,2008,Thoreson et al.,2000,Wang et al.,2006)，但在經過離子交換層析法純化後，尚須以膠體管柱層析方式做第二步純化，始可獲得高純度的HP-NAP。在發明人之先前研究中，運用兩次膠體管柱層析將E. coli表達的原態HP-NAP純化出來(Wang et al.,2008)，但這種兩步驟的純化卻是非常耗時的。在本發明中，單步驟的DEAE-Sephadex層析法的純化方式可縮短純化HP-NAP所需的時間。而在其他同樣是以單步驟純化HP-NAP的方法中，則大多是利用在HP-NAP上結合一段蛋白質標記(protein-tag)，再以親和性管柱(affinity column)的方式達到單步驟純化之目的(Ceci et al.,2007,Iankov et al.,2011,2009,Kang et al.,2005,Kottakis et al.,2008,Li et al.,2009,Long et al.,Tang et al.,2008)，但這些方法的缺點則在於HP-NAP並非呈現原態(native form)，在HP-NAP應用時將因應研究範圍的需要，而可能須另外進行切除融合肽(fusion peptide)的步驟。
本發明使用B. subtilis作為表達HP-NAP的系統，主要目的是為了降低脂多糖(LPS)污染，與Tonello et al.用B. subtilis作為表達HP-NAP的目的相同(Tonello et al.,1999)。Grandi(US007038012B1)所用的純化方法是利用80%硫酸銨(ammonium sulphate)以鹽析法(salting-out)的方式來去除大部分B. subtilis的內生性蛋白質，再結合金屬螯合層析(metal chelate chromatography)方式最後得到高純度的HP-NAP。而本發明則是先根據HP-NAP的pI值針對純化之pH及兩種DEAE樹脂進行純化測試，以期能使HP-NAP結合於DEAE樹脂上，並用NaCl將HP-NAP冲提出而藉此獲得高純度的HP-NAP，但令人意外的是，以不同的pH測試結果顯示於pH 8.0時HP-NAP會留在流出液中，鮮少HP-NAP會結合於DEAE樹脂之上，且以DEAE-sephadex有較佳的純化效果(第4圖)，由於此結果與原本的預測大相逕庭，有鑒於此，本發明設計了一套負向純化的流程，利用DEAE Sephadex離子交換層析可以單一步驟純化即獲得純度>96%的純化HP-NAP(第7圖)。由於此方式未使用高濃度的NaCl將HP-NAP從DEAE Sephadex沖提下來，故無須去鹽，但純化的HP-NAP由於存在於流出液中而使得濃度較低，因此我們額外利用30 kDa孔徑的濾膜進行濃縮以提高HP-NAP濃度，此步驟尚可使分子量低於30 KDa的蛋白質在濃縮的過程中被去除，因而可再提高HP-NAP的純度(第7圖)，若使用100 KDa孔徑的濾膜進行濃縮將可達到更高的純度。
在本發明另一實施例中，以相同的DEAE Sephadex離子交換層析純化方式應用到表現於大腸桿菌(E. coli)之重組HP-NAP，同樣在pH值高於7.5的純化環境中(介於7.5至9.0)，大部分的HP-NAP仍能留在流出液中而僅有少部分HP-NAP結合於DEAE Sephadex樹脂之上，且能夠提高HP-NAP的純度，見第11圖，此部分的結果近似於表現於B. Subtilis之重組HP-NAP在不同pH值之下所進行純化測試的結果，見第4圖，或許經由調整蛋白質量與DEAE Sephadex樹脂的比例能提高純化的效果。
由以上實施例可知，本發明所提供之單步驟純化重組胃幽門螺旋桿菌嗜中性白血球激活蛋白的方法確具產業上之利用價值，惟以上之敘述僅為本發明之較佳實施例說明，凡精於此項技藝者當可依據上述之說明而作其它種種之改良，惟這些改變仍屬於本發明之精神及以下所界定之專利範圍中。
<110>　國立清華大學
<120>　單步驟純化重組胃幽門螺旋桿菌嗜中性白血球激活蛋白(HP-NAP)的方法
<160>　2
<170>　PatentIn version 3.5
<210>　1
<211>　32
<212>　DNA
<213>　人工序列
<221>　misc_feature
<223>　擴增napA之正向引子對(forward primer)
<400>　1
<210>　2
<211>　21
<212>　DNA
<213>　人工序列
<221>　misc_feature
<223>　擴增napA之反向引子對(reverse primer)
<400>　2
第1圖係顯示pRPA-NAP質體圖譜；
第2圖係顯示HP-NAP在B. subtilis中的表現情形；
第3A~3B圖係顯示HP-NAP在B. subtilis中的表現情形；
第4A~4B圖顯示以DEAE樹脂純化B. subtilis之HP-NAP及其pH值最佳化結果；
第5圖顯示以DEAE Sephadex純化B. subtilis之HP-NAP，其加入蛋白量與樹脂體積之最佳化比例；
第6圖顯示以DEAE Sephadex離子交換層析法純化B. subtilis之HP-NAP；
第7A~7B圖顯示B. subtilis之HP-NAP在純化後之膠體電泳結果；
第8A~8B圖顯示表現於B. subtilis之多聚體重組HP-NAP之物理特性分析；
第9A~9B圖顯示表現於B. subtilis之單體重組HP-NAP之物理學分析；
第10圖顯示表現於B. subtilis之重組HP-NAP，在純化後測量其活性氧產生之生物學分析；
第11圖係顯示以E. coli進行pH7.5~9.0純化結果。

Claims (12)

  1. 一種單步驟純化重組胃幽門螺旋桿菌嗜中性白血球激活蛋白(HP-NAP)的方法，其步驟包括：提供一含有HP-NAP之待純化樣本，其中該待純化樣本係取自一可表現重組HP-NAP之蛋白質表現系統；將該含有重組HP-NAP之待純化樣本以一二乙氨乙基(DEAE)離子交換樹脂，在一預定pH值區間進行純化；以及收集經由該上述步驟後之一流出液(flowthrough fraction)及清洗液(wash fraction)，其中該流出液及清洗液包含一預定純度之重組HP-NAP。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該預定pH值區間係介於pH 7.5~9.0之間。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該預定pH值區間係介於pH 7.5~8.0之間。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該純化後之重組HP-NAP係為原態(native)之HP-NAP。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該純化後之重組HP-NAP係為由α-helix單體所形成之多聚體蛋白質。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該蛋白質表現系統係為枯草桿菌(B. subtilis)表現系統。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該蛋白質表現系統係為大腸桿菌(E. coli)表現系統。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該DEAE離子交換樹脂係為DEAE Sephadex樹脂。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該DEAE離子交換樹脂係為DEAE Sepharose樹脂。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該重組HP-NAP之純度至少大於90%。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，更包括在收集該流出液及清洗液後進行一濃縮過濾步驟以除去該重組HP-NAP所含有之內毒素並提高該重組HP-NAP之純度。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中經過該濃縮過濾步驟後，其中該內毒素的含量為每毫克HP-NAP低於3.29 EU。
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