CN115716878B - 一种利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法，包括以下步骤：(1)表达纯化得到突变型泛素或类泛素蛋白；所述突变型泛素的C末端为半胱氨酸，所述突变型类泛素蛋白的C末端甘氨酸对应的核苷酸序列突变为半胱氨酸对应的核苷酸序列；(2)表达纯化得到突变型的组蛋白八聚体；所述突变型的组蛋白八聚体在进行泛素化/类泛素化修饰位点上的赖氨酸突变为半胱氨酸；(3)利用化学交联剂，将突变型泛素或类泛素蛋白与突变型组蛋白八聚体在非变性条件下进行交联反应；(4)将化学交联反应产物进行标准色谱纯化。该方法利用化学交联方法直接在组蛋白八聚体水平上进行体外构建泛素化/类泛素化组蛋白八聚体。
Description
技术领域
本发明涉及体外构建泛素化或类泛素化组蛋白八聚体，具体涉及一种利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法。
背景技术
染色体是真核生物中携带遗传信息的主要载体，其基本结构单元是核小体。核小体由四种组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)构成的八聚体和缠绕上面的147bp的DNA组成，核小体之间由linker DNA连接形成串珠状结构，经过多步压缩折叠形成染色体。表观遗传调控是一种不改变DNA序列的情况下，发生的基因表达可遗传的变化，主要包括DNA甲基化、X染色体失活、染色质重塑、组蛋白修饰等。
组蛋白修饰是非常重要的表观遗传调控之一，主要包括甲基化、磷酸化、乙酰化、乙酸化、sumo化和泛素化等。其中泛素化修饰占组蛋白修饰的16％左右，是组蛋白修饰中非常重要的一种翻译后修饰，其通过改变染色质结构或招募组蛋白修饰因子来影响基因表达。组蛋白的泛素化和去泛素化是基于组蛋白修饰的基因表观遗传调控的基质之一，它和组蛋白的其他修饰共同形成了“组蛋白密码”，目前已经成为基因转录调控的研究热点。越来越多的研究表明组蛋白的泛素化修饰不仅与基础生命活动息息相关，而且影响多种疾病的发生发展，因此研究与疾病相关的组蛋白泛素化修饰可以作为一种潜在的治疗疾病的靶点。基于泛素化组蛋白的合成、核小体复合物方法的开展以及冷冻电镜技术的出现，近些年研究者对一系列重要的泛素化核小体与效应蛋白复合物展开了研究，揭示分析了泛素化核小体对部分效应蛋白的特异性识别与活化机制。然而，目前获得泛素化核小体的底物(泛素化组蛋白八聚体)具有一定的难度和挑战，因此亟需一种简单高效的方法来解决上述问题。
目前获得泛素化核小体的方法主要有两种，一种是分离纯化内源性核小体(Hela细胞或小牛胸腺)，但是该方法具有以下比较明显的缺点：1、由于生物体的复杂性导致分离的核小体修饰类型不均一；2、纯化过程中被裂解液中的去泛素化酶影响，可能导致核小体去泛素化。另一种比较经典的是体外重组核小体的方法，首先在变性条件下(尿素和盐酸胍)分别纯化出四种组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)，然后通过透析复性方法折叠成组蛋白八聚体，再与DNA混合后通过透析降低盐浓度的方法获得体外重组的核小体，这种方法最大的限制是步骤多、耗时长。而对于泛素化核小体复合物的研究中，需要获得泛素化的组蛋白八聚体，为了解决这个问题，相关科研工作者开展了全化学合成、半化学合成以及化学交联方法。其中，全合成需要利用固相合成的方法合成若干个比较短的多肽链，再用化学键将这些多肽链连接成一条完整的目标蛋白；半化学合成是一种将多种表达重组蛋白通过化学键连接起来形成目标蛋白的方法，上述两种方法都存在操作繁琐、难度大、产率低的问题。应运而生的化学交联方法巧妙的解决了上述问题，不仅操作简单、产率较高，而且获得的泛素化组蛋白对去泛素酶不敏感，化学性质稳定，适合泛素化核小体复合物的结构观察和相关研究。
现有的获得泛素化组蛋白的化学交联方法包括以下步骤：(1)通过分子克隆技术在泛素的N端加上His标签，将泛素的C末端甘氨酸突变为半胱氨酸，表达纯化出突变的泛素；(2)将组蛋白的特定位点的赖氨酸突变为半胱氨酸，表达纯化出突变的组蛋白；(3)将上述两种蛋白溶解于10mM HCl中，在交联剂二氯丙酮的作用下，以及在50mM硼酸缓冲液，pH8.1条件下进行交联反应，完成组蛋白的泛素化修饰；(4)将交联反应产物重悬到含尿素的缓冲液中通过镍柱或钴柱纯化得到泛素化组蛋白、泛素的二聚体和未反应的泛素，同时未参与反应的组蛋白从流穿液中除去；(5)然后用TEV酶切过夜(切除His标签)，再次通过镍柱或钴柱纯化收集泛素化组蛋白、泛素二聚体和未反应的泛素，透析后冻干；(6)接下来将冻干的蛋白重悬到含尿素的缓冲液中，通过半制备反相高效液相色谱柱得到泛素化的组蛋白，透析后冻干；(7)然后通过标准流程获得泛素化组蛋白八聚体，具体步骤如下：将四种冻干的组蛋白按比例重悬到含盐酸胍的unfolding buffer中，然后透析到含有2M NaCl或KCl的refolding buffer复性成组蛋白八聚体；(8)最后通过凝胶过滤层析纯化分离得到泛素化组蛋白八聚体。
然而，上述方法仍存在以下缺点：步骤多、耗时长、操作繁琐，最后通过凝胶过滤层析得到的泛素化组蛋白八聚体纯度不高，如图1所示(图1引自Dyer,P.N.,Reconstitutionof nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.MethodsEnzymol 2004,375,23-44)，H3-H4四聚体与组蛋白八聚体无法完全分离。
而且，对于上述方法而言，分别表达的组蛋白属于包涵体形式(非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性)的蛋白，因此必须在变性条件下进行交联、纯化，具体为在交联反应中加入HCl以及在纯化过程中添加尿素和盐酸胍以增加组蛋白的溶解性；而且，由于组蛋白需要进一步复性重折叠成正确的三级结构才能具有生物活性；所以，该方法会有导致组蛋白损伤、从而影响其生物活性的风险。
此外，组蛋白纯化过程中需要多步透析置换缓冲液条件，这一方面增加了纯化时间，另一方面蛋白长期在变性条件中会增加损伤蛋白质的风险。
因此亟需一种快速、高效获得泛素化/类泛素化核小体底物(泛素化/类泛素化组蛋白八聚体)的方法，进而揭示更多与疾病发生相关的分子机制，推动表观遗传领域的研究进展。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷与不足，本发明的目的在于提供一种利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法，该方法利用化学交联方法直接在组蛋白八聚体水平上进行体外构建泛素化/类泛素化组蛋白八聚体。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法，包括以下步骤：
(1)通过大肠杆菌感受态细胞表达纯化得到突变型泛素或类泛素蛋白；所述突变型泛素的C末端为半胱氨酸，所述突变型类泛素蛋白的C末端甘氨酸对应的核苷酸序列突变为半胱氨酸对应的核苷酸序列，以用于与组蛋白八聚体进行交联反应；
(2)通过大肠杆菌感受态细胞表达纯化得到突变型的组蛋白八聚体；所述突变型的组蛋白八聚体在进行泛素化/类泛素化修饰位点上的赖氨酸突变为半胱氨酸；
(3)利用化学交联剂，将突变型泛素或类泛素蛋白与突变型组蛋白八聚体在非变性条件下进行交联反应；
(4)将化学交联反应产物进行标准色谱纯化，即可得到高纯度的泛素化或类泛素化组蛋白八聚体。
本发明根据生物体内泛素化修饰的过程，将泛素或类泛素蛋白C末端的甘氨酸突变为半胱氨酸，组蛋白八聚体在需要进行泛素化/类泛素化修饰位点上的赖氨酸突变为半胱氨酸，在化学交联剂的作用下，通过半胱氨酸的巯基(-SH)与化学交联剂的取代反应，将泛素或类泛素蛋白与组蛋白八聚体通过化学键连接起来，形成稳定的泛素化或类泛素化组蛋白八聚体。
本发明所述的非变性条件是指，相对变性条件而言，在交联反应时不添加HCl以及纯化过程中不添加尿素、盐酸胍等变性剂。由于本发明方法直接采用的组蛋白八聚体是三级结构折叠正确、具有生物活性的蛋白质，因此，本发明在整个过程中无需使用HCl、尿素、盐酸胍等变性条件，而且在非变性条件下进行交联、纯化，并避免了进行复性重折叠，从而有效的保证了产物——泛素化/类泛素化组蛋白八聚体的生物活性。
在本发明的一个实施例中，所述化学交联剂是二氯丙酮或二溴丙酮，优选为二溴丙酮。
所述化学交联剂在使用时溶于有机溶剂中，浓度为100mM～5M。
所述步骤(3)中交联反应的具体步骤如下：将突变型泛素或类泛素蛋白和组蛋白八聚体在冰浴条件下混合均匀，再加入化学交联剂，以PBS作为缓冲液，在冰浴(0℃)条件下进行交联反应，反应结束后加入还原剂终止反应，即得交联反应产物。
所述交联反应在1.5～2.5M氯盐的环境下进行，所述氯盐的阳离子选自钠离子或钾离子。
在本发明的一个具体实施例中，所述交联反应中，组蛋白八聚体、突变型泛素或类泛素蛋白和化学交联剂的摩尔比为1：2～16：2～32。
所述交联反应中，反应条件可为静置或转动。
所述交联反应的时间为1～48小时，优选为3小时。
所述交联反应的pH值为7.0～8.0。
所述交联反应中，还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇(β-ME)中的一种。
在本发明的另一个具体实施例中，在泛素或类泛素蛋白和组蛋白八聚体在冰浴条件下混合均匀后，先加入三(2-羧乙基)膦(TCEP)，进行孵育，再加入化学交联剂，以PBS作为缓冲液在冰浴条件下进行交联反应。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(4)中所述的标准色谱纯化包括凝胶过滤层析和His亲和柱纯化；且本发明对突变型泛素或类泛素化蛋白进行表达纯化前，在其N端加上His标签，以便在步骤(4)中利用His亲和柱对反应产物进行纯化。
所述His亲和柱为镍离子柱或钴离子柱。
由于本发明的交联反应中化学键的非特异性，因此反应产物中至少有四种交联蛋白，包括：1个泛素/类泛素+组蛋白八聚体、2个泛素/类泛素+组蛋白八聚体、泛素/类泛素+泛素/类泛素、组蛋白八聚体+组蛋白八聚体；所以，根据①组蛋白八聚体和泛素/类泛素化之间较大的分子量差异，以及②泛素的N端带有的His标签，本发明能够利用凝胶过滤层析(Superdex 200)和His亲和柱(镍离子柱或钴离子柱)对泛素化八聚体产物达到纯化目的，得到高纯度的泛素化或类泛素化组蛋白八聚体。
本发明步骤(4)纯化的具体步骤为：将交联反应产物在高速离心后通过凝胶过滤层析(Superdex 200)，根据分子量大小可将未反应的组蛋白八聚体和泛素化/类泛素化组蛋白八聚体与突变型泛素/类泛素化蛋白分开，接下来将两种组蛋白八聚体的混合液高速离心或过滤后，通过His亲和柱除去未反应的组蛋白八聚体，并利用梯度洗脱方法获得高纯度的泛素化/类泛素化组蛋白八聚体。上述步骤中，因为泛素N端带有His标签可挂在柱子上，未反应的组蛋白八聚体从流穿夜中除去，从而实现泛素化与未泛素化组蛋白八聚体的分离；以及利用His亲和柱和泛素N端的His标签，本发明采用的梯度洗脱方法将修饰一个泛素/类泛素蛋白的组蛋白八聚体和修饰两个泛素/类泛素蛋白的组蛋白八聚体分开，从而获得高纯度的泛素化/类泛素化组蛋白八聚体。
本发明对比现有技术，具有以下的优点和有益效果：
(1)本发明中最大的一个创新点在于直接在组蛋白八聚体水平进行交联反应来实现泛素化修饰(现有方法在单一的组蛋白上进行交联反应)，如图2所示，我们直接可以在非变性环境(即在无需加入尿素和盐酸胍的条件下)中得到高纯度的泛素化组蛋白八聚体，从而避免了现有方法中变复性(即四种组蛋白通过透析方法体外重组成组蛋白八聚体)的操作。
(2)本发明通过交联反应即得到泛素化组蛋白八聚体/类泛素化组蛋白八聚体，从而避免了现有化学交联方法纯化后产物纯度仍不高的问题；而且，通过本发明的交联反应后，采用简单的凝胶过滤层析和亲和柱就可以达到良好的分离效果，并且亲和柱通过梯度洗脱能够将修饰一个泛素/类泛素蛋白的组蛋白八聚体和修饰两个泛素/类泛素蛋白的组蛋白八聚体分离，最终得到高纯度的修饰两个泛素/类泛素蛋白的组蛋白八聚体。
(3)相对于现有的化学交联方法，本发明方法得到的泛素化/类泛素化组蛋白八聚体的产率高，特异性强。
其中，①发明人发现二溴丙酮作为交联剂进行反应，避免了存在于交联剂和氯化钠中相同的氯元素影响化学反应速率的问题；②发明人进行了一系列条件优化，通过改变泛素/类泛素蛋白、组蛋白八聚体和交联剂之间的比例，有效的提高了交联反应的产率，经过两步纯化产率依旧可达到56％(纯化过程中会有不可避免的样品损失)。
(4)本发明方法操作简单、效果好、产率高，与现有的化学交联方法，以及全合成和半合成方法相比省去了繁琐的多步化学反应。
由图2中现有技术的化学交联与本发明获得泛素化组蛋白八聚体的流程对比可知，本发明方法明显步骤简单、耗时短，以往的方法需要分别表达纯化四种组蛋白，泛素化修饰后纯化步骤较多，繁琐庞大的工作量又需要消耗更多的人力资源，本发明极大的简化了步骤并缩短了时间；即使以同时纯化四种组蛋白为例，现有技术获取泛素化组蛋白八聚体仍需要10天以上，而本发明只需4～5天即可得到高纯度的泛素化或类泛素化组蛋白八聚体。
(5)本发明方法具有巨大的潜在应用价值，具有一定的普适性，不仅可以适用于多个位点的核小体泛素化修饰，而且适用于类泛素化修饰组蛋白八聚体，对核小体相关复合物的蛋白结构研究具有重大意义。
附图说明
以下通过附图对本发明作进一步的说明。
图1为现有化学交联方法纯化后的产物分析图；
图2为现有化学交联方法和本发明方法制备纯化泛素化组蛋白八聚体的流程对比图；
图3为实施例1中G76C突变型泛素的表达及纯化过程；
图4为实施例2中H2AK119C突变型组蛋白八聚体的表达和纯化过程；
图5为G76C突变型泛素和H2AK119C组蛋白八聚体在静置和转动条件下交联反应的SDS-PAGE分析图；
图6为G76C突变型泛素和H2AK119C组蛋白八聚体在不同条件和不同时间的交联反应；
图7为G76C突变型泛素和H2AK119C组蛋白八聚体在不同交联剂和不同pH条件下的交联反应和Western Bolt鉴定结果；
图8为G76C突变型泛素与H2AK119C突变型组蛋白八聚体的交联产物的两步纯化过程；
图9为实施例4中Western bolt鉴定交联反应和纯化后的产物情况；
图10为实施例5中H2BK120C突变型组蛋白八聚体的表达和纯化过程；
图11为G76C突变型泛素和H2BK120C组蛋白八聚体在不同比例条件下的交联反应产物SDS-PAGE分析图；
图12为G76C突变型泛素与H2BK120C突变型组蛋白八聚体的交联产物的两步纯化过程；
图13为突变型类泛素蛋白G92C SUMO3的表达及纯化结果；
图14为突变型类泛素蛋白G83C UFM1的表达及纯化结果；
图15为突变型类泛素蛋白G76C NEDD8的表达及纯化结果；
图16为不同突变型组蛋白八聚体H2AK125C、H2BK7C、H2BK34C、H3K18C、H3K56C、H4K12C、H4K31C的纯化结果；
图17为G76C突变型泛素和多种组蛋白八聚体在不同比例条件下的交联反应；
图18为类泛素蛋白(SUMO3、UFM1和NEDD8)和多种组蛋白八聚体在不同比例条件下的交联反应；
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明作进一步的说明。
本发明所述利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法中，步骤(1)和步骤(2)采用表达纯化的方法分别为：
1.步骤(1)中突变型泛素或类泛素蛋白表达纯化的步骤是：将突变后测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，使用氨苄抗性的培养基，IPTG低温诱导过夜后离心收集菌体，用含有还原剂和蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液重悬后高压破碎，低温高速离心后收集上清，上清通过GST亲和层析柱，上述缓冲液洗杂以后用HRV 3C蛋白酶在低温条件下切除GST标签，通过洗脱即可初步获得大量的泛素蛋白；然后将获得的泛素蛋白通过凝胶过滤层析柱(Superdex 75)进行纯化，最终可获得大量高纯度的泛素蛋白。
所述泛素表达纯化的步骤中，培养基可以为LB、TB、2YT中的一种，优选为TB。
所述泛素表达纯化的步骤中，IPTG所选浓度为0.2～1mM，优选为0.4mM。
所述泛素表达纯化的步骤中，低温条件可以为16～28℃，优选为20℃。
所述泛素表达纯化的步骤中，过夜诱导时间可以为8～20小时，优选为14小时。
所述泛素表达纯化的步骤中，还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇中的一种。
所述的泛素表达纯化的步骤中，蛋白酶抑制剂选自PMSF、苯甲醚、Proteininhibitor。
2.步骤(2)中突变型组蛋白八聚体的纯化步骤为：将突变后测序正确的质粒转入大肠杆菌感受态细胞，在37℃条件下0.4mM IPTG诱导过夜，离心收集目的菌液；用含还原剂的Tris、NaCl缓冲液重悬菌体，高压破碎后高速离心大于1个小时，离心后将上清通过肝素亲和层析柱(Heparin)，最后通过凝胶过滤层析柱(Superdex 200)纯化，即可得到高纯度的组蛋白八聚体。
所述的组蛋白八聚体纯化的步骤中，组蛋白八聚体要保存在不低于2M NaCl缓冲液中，因为组蛋白本身带较强电荷，高盐条件下组蛋白八聚体才能稳定保存。
所述的组蛋白八聚体纯化的步骤中，还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇中的一种。
以下实施例中采用的二氯丙酮为1,3-二氯丙酮，二溴丙酮为1,3-二氯丙酮。
实施例1：G76C突变型泛素的表达纯化
设计引物通过聚合酶链式反应(PCR)在泛素的N端加上重组HRV 3C蛋白酶切位点(便于将泛素从GST融合蛋白上切下来)和His标签(便于后期泛素化核小体的纯化)并在C末端的甘氨酸(Gly)突变成半胱氨酸(Cys)便于后期与组蛋白八聚体进行交联反应。
首先是使用大肠杆菌体系表达突变后的泛素蛋白：将质粒转入大肠杆菌感受态细胞中，涂板(氨苄抗性LB固体培养基)后过夜培养，获得表达菌株。挑取表达菌株在LB液体培养基(ampicillin)中37℃、220rpm摇菌过夜，转接入TB培养基中继续摇菌至OD600为0.6～2.0，加入IPTG后继续摇菌诱导约14小时，4000rpm、4℃条件下离心30分钟收菌。
用SDS-PAGE鉴定蛋白成功表达后进入蛋白纯化阶段：用五倍体积的裂解液重悬菌体，高压破碎后，4℃条件下高速离心分离上清，将离心上清通过GST亲和柱(流速1ml/min)，再用五倍柱体积的磷酸盐缓冲液除去杂蛋白(流速2ml/min)，然后加入HRV3C蛋白酶在低温条件下酶切3～48小时，用SDS-PAGE鉴定酶切效果。鉴定成功酶切后洗脱蛋白，浓缩(3KDa超滤管)后将样品通过凝胶过滤层析(superdex 75)即可得到高纯度的突变型泛素(G76CUbq)，用SDS-PAGE鉴定分析每管中的样品后合并样品后浓缩，液氮速冻后-80℃保存。
图3为G76C突变型泛素的表达及纯化过程。图3中的(a)为本实施例中G76C突变型泛素的表达及酶切情况，SDS-PAGE证实蛋白成功表达、酶切48小时后成功将泛素从GST融合蛋白中切开。图3中的(b)和(c)为本实施例中G76C突变型泛素通过凝胶过滤层析和SDS-PAGE鉴定不同EP管中的蛋白情况，证实通过凝胶过滤层析根据蛋白分子量大小成功将目的蛋白分离出来。图3中的(d)为本实施例中最终得到的目的蛋白的SDS-PAGE鉴定情况，根据分子量大小证明最终成功纯化高纯度的G76C突变型的泛素。
实施例2：突变型组蛋白八聚体(H2AK119C)的表达纯化
首先利用聚合酶链式反应(PCR)，通过定点突变技术在野生型组蛋白八聚体质粒(H2A、H2B、H3和H4在一个载体的四个独立阅读框内)的H2A 119位点的Lys突变成Cys，然后通过测序技术确定突变成功。
然后对突变的质粒进行蛋白八聚体表达：将质粒转入大肠杆菌感受态细胞中，涂氨苄板后过夜培养获得表达菌株。挑取单菌落后在LB液体培养基中37℃、220rpm摇菌过夜，然后转接入TB培养基中，37℃、220rpm继续摇菌4～6小时，加入终浓度为0.5mM IPTG后继续摇菌诱导过夜，4000rpm、4℃条件下离心30分钟弃上清收菌。
SDS-PAGE鉴定蛋白成功表达后进入蛋白纯化阶段：首先加入5倍体积的裂解液重悬菌体，4℃条件下高压破碎2～3次后4℃条件下高速离心收集上清，将离心上清以1mL/min的速度通过5mL肝素亲和柱(Heparin column)，然后用五倍体积的Tris缓冲液A洗去杂蛋白(流速2ml/min)，再用含2M NaCl的Tris缓冲液B进行梯度洗脱(流速2ml/min)，将收集的蛋白样品通过SDS-PAGE鉴定，根据SDS-PAGE的结果将组蛋白八聚体合并后浓缩，4℃条件下高速离心15～20分钟，将样品通过凝胶过滤层析(superdex 200)即可得到高纯度的H2AK119C组蛋白八聚体，用SDS-PAGE鉴定分析每管中的样品后合并样品后浓缩后液氮速冻，-80℃冰箱保存。
图4为H2AK119C突变型组蛋白八聚体的表达和纯化过程。图4中的(a)为本实施例中H2AK119C突变型组蛋白八聚体通过肝素亲和柱和SDS-PAGE鉴定肝素亲和柱的蛋白收集情况，证实通过梯度洗脱可以将组蛋白八聚体分离出来。图4中的(b)为本实施例中H2AK119C组蛋白八聚体通过凝胶过滤层析和SDS-PAGE鉴定不同EP管中的蛋白情况，证实通过凝胶过滤层析根据蛋白分子量大小成功将组蛋白八聚体分离出来，证明最终成功纯化出高纯度的H2AK119C组蛋白八聚体。
实施例3：泛素化组蛋白八聚体(H2AK119C)的交联反应及鉴定
将G76C突变型泛素、组蛋白八聚体两种蛋白样品和二氯丙酮(DMF助溶，二氯丙酮浓度为100mM～5M)按下表的比例混匀，在2M NaCl、PBS缓冲液和冰浴条件下反应(静置或转动)48h，反应结束后加入还原剂终止反应。反应期间在不同时间点取样后用SDS-PAGE鉴定化学交联反应情况。
| 组分 | 比例 |
| Octamer | 1.0 |
| Ubiquitin | 4 |
| DCA(DMF) | 8.8 |
图5为G76C突变型泛素与H2AK119C组蛋白八聚体在不同条件下的交联反应。图5为实施例3中泛素化组蛋白八聚体(H2AK119C)的交联反应的SDS-PAGE分析，根据实验结果可知，交联反应在静置和转动条件下、不同时间点均能观察到反应产物，说明我们成功构建了在组蛋白八聚体水平进行泛素化修饰的方法。
为了进一步优化交联条件，本实施例还在不同组分摩尔比例条件下进行了交联反应，具体比例见下表，实验结果见图6。图6的SDS-PAGE结果显示，泛素、交联剂和溶剂的比例均会影响交联效率(交联产率)，还证明了另外一种交联剂二溴丙酮也适用于此体系。
另外，为了确定最优反应条件下，考虑到二氯丙酮与氯化钠中相同的氯离子可能对化学反应速率有影响，以及卤代反应适宜于碱性条件，本实施例还在pH 7.5和8.0、不同比例、不同交联剂等条件下进行了一系列化学交联反应优化，结果见图7。图7(a)为突变型泛素G76C和H2AK119C组蛋白八聚体在不同交联剂和不同pH条件下的交联反应和WesternBolt鉴定结果。根据图7的实验结果，确定了最佳的交联条件：在pH7.5、交联剂为二溴丙酮时，冰浴条件下反应3小时。图7(b)是最佳交联条件下反应过程中Western bolt鉴定结果，其证实了交联反应后H2A与泛素成功交联。而且从图7(b)的实验现象明显看出本发明成功提高了交联反应的产率，经过交联和纯化后的高纯度泛素化组蛋白八聚体产率达到56％；这一方面由于采用二溴丙酮作为交联剂进行反应，避免了存在于交联剂和氯化钠中相同的氯元素影响化学反应速率的问题，另一方面通过改变泛素/类泛素蛋白、组蛋白八聚体和交联剂之间的比例，有效的提高了交联反应的产率，主要因为过量的泛素和交联剂可以增加组蛋白八聚体与泛素的碰撞机率，化学反应趋向增加目的产物的方向。
实施例4：泛素化组蛋白八聚体(H2AK119C)的纯化及鉴定
采用组蛋白八聚体：泛素：二溴丙酮摩尔比例1：8：10、pH7.5的反应条件扩大化学交联体系，利用G76C突变型泛素与H2AK119C突变型组蛋白八聚体进行反应，反应3小时后加入还原剂(5～10mMβ-ME)终止反应，然后将交联反应混合物通过凝胶过滤层析柱(superdex200)进行分离，可以按蛋白分子量大小分离出未反应的组蛋白八聚体和泛素化的组蛋白八聚体，将组蛋白八聚体合并后浓缩，浓缩的样品高速离心后通过钴柱，未反应的组蛋白八聚体会从流穿液中除去，因泛素的N端带His标签所以泛素化的组蛋白八聚体可以挂在钴柱上，接下来用含咪唑的缓冲液通过梯度洗脱方式将泛素化的组蛋白八聚体洗脱下来，然后通过SDS-PAGE和Western Bolt分析泛素化交联的比例和亲和柱洗脱下来的情况。
图8和图9为G76C突变型泛素与H2AK119C突变型组蛋白八聚体的交联产物的纯化流程以及Western Bolt鉴定交联反应和纯化过程。图8中(a)和(b)为实施例4中交联反应产物通过凝胶过滤层析(superdex 200)的情况，说明通过蛋白质分子大小可以成功将组蛋白八聚体(含未反应和反应的)和泛素(含单体和二聚体)分离。图8中(c)和(d)为实施例4中通过凝胶过滤层析后分离出的组蛋白八聚体通过钴离子亲和柱的情况，说明经过钴离子亲和柱可以成功将泛素化的八聚体分离出来。图9为实施例4中用Western Bolt鉴定组蛋白八聚体通过钴离子亲和柱情况，结果证实蛋白八聚体可以通过钴离子亲和柱成功分离出高纯度的H2AK119C泛素化组蛋白八聚体，而且进一步从图9可知，本发明得到的产物是高纯度的修饰了两个泛素的H2AK119C组蛋白八聚体。
实施例5：突变型组蛋白八聚体(H2BK120C)的表达纯化
首先利用聚合酶链式反应(PCR)，通过定点突变技术在野生型组蛋白八聚体质粒(H2A、H2B、H3和H4在一个载体的四个独立阅读框内)的H2B 120位点的Lys突变成Cys。然后采用与实施例2相同的步骤对突变型组蛋白八聚体进行表达纯化。
图10为H2BK120C突变型组蛋白八聚体的表达和纯化过程。图10中的(a)为本实施例中H2BK120C突变型组蛋白八聚体过肝素亲和柱的情况和SDS-PAGE鉴定肝素亲和柱的蛋白收集情况，证实通过梯度洗脱可以将组蛋白八聚体分离出来。图10中的(b)为本实施例中H2BK120C组蛋白八聚体通过凝胶过滤层析和SDS-PAGE鉴定不同EP管中的蛋白情况，证实通过凝胶过滤层析根据蛋白分子量大小成功将组蛋白八聚体与核酸成功分开，证明最终成功纯化高纯度的H2BK120C组蛋白八聚体。
实施例6：泛素化组蛋白八聚体(H2BK120C)的交联反应
将G76C突变型泛素、组蛋白八聚体和二溴丙酮(DMF助溶，二溴丙酮浓度为100mM～5M)按不同比例混匀，置于2.5M KCl、PBS缓冲液和冰浴条件下反应3小时，反应结束后加入DTT终止反应，用SDS-PAGE鉴定化学交联反应情况。
图11为G76C突变型泛素与H2BK120C组蛋白八聚体在不同条件下的交联反应产物SDS-PAGE分析结果。根据图11的SDS-PAGE分析结果可知，本实施例在不同的反应条件下，在H2BK120C组蛋白八聚体上成功进行了泛素化修饰。这些实验结果也说明了本发明方法对于泛素化组蛋白八聚体的体系具有一定的普适性。
实施例7：泛素化组蛋白八聚体(H2BK120C)的纯化
根据组蛋白八聚体：泛素：二溴丙酮摩尔比例1：8：10、pH7.5的的反应条件扩大化学交联体系，利用G76C突变型泛素与H2BK120C组蛋白八聚体进行反应，反应3小时后加入还原剂(10mMβ-ME)终止反应，然后将交联反应混合物通过凝胶过滤层析柱(superdex 200)进行分离，可以按蛋白分子量大小分离出未反应的组蛋白八聚体和泛素化的组蛋白八聚体，将组蛋白八聚体合并后浓缩，浓缩的样品高速离心后通过钴柱，未反应的组蛋白八聚体会从流穿液中除去，因泛素的N端带His标签所以泛素化的组蛋白八聚体可以挂在钴柱上，接下来用含咪唑的缓冲液通过梯度洗脱方式将泛素化的组蛋白八聚体洗脱下来，然后通过SDS-PAGE和Western Bolt分析泛素化交联的比例和亲和柱洗脱下来的情况。
图12为G76C突变型泛素与H2BK120C突变型组蛋白八聚体的交联产物的纯化流程以及Western Bolt鉴定交联反应和纯化过程。图12中(a)和(c)为实施例7中交联反应产物通过凝胶过滤层析(superdex 200)的情况，说明通过蛋白质分子大小可以成功将组蛋白八聚体(含未反应和反应的)和泛素(含单体和二聚体)分离。图12中(b)和(d)为实施例7中通过凝胶过滤层析后分离出的组蛋白八聚体通过钴离子亲和柱的情况，可以成功将泛素化的八聚体分离出来。
实施例8：突变型类泛素G92C SUMO3、G83C UFM1、G76C NEDD8的表达纯化
①用于表达突变型类泛素G92C SUMO3的质粒是在实施例1中的基础上进行改造的，通过Gibson assembly连接方法将上述G76C泛素对应的基因序列替换成SUMO3对应的基因序列，使第92位氨基酸为半胱氨酸便于后期与组蛋白八聚体进行交联反应。
②用于表达突变型类泛素G83C UFM1的质粒是在实施例1中的基础上进行改造的，通过Gibson assembly连接方法将上述G76C泛素对应的基因序列替换成UFM1对应的基因序列，使第83位氨基酸为半胱氨酸。
③用于表达突变型类泛素G76C NEDD8的质粒是在实施例1中的基础上进行改造的，通过Gibson assembly连接方法将上述泛素对应的基因序列替换成NEDD8对应的基因序列，使第76位氨基酸为半胱氨酸。
分别对上述三种突变型类泛素进行表达纯化，具体步骤为：
使用大肠杆菌体系表达突变型类泛素蛋白：将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂板(氨苄抗性LB固体培养基)后过夜培养，获得表达菌株。挑取单菌落后在LB液体培养基(ampicillin)中37℃、220rpm摇菌过夜，转接入TB培养基中，37℃摇菌至OD600＝0.6～2.0，加入终浓度为0.4mM IPTG后、20℃诱导摇菌约14小时，4000rpm、4℃条件下离心30分钟弃上清收菌。
用SDS-PAGE鉴定蛋白成功表达后进入蛋白纯化阶段：首先加入5倍体积的裂解液重悬菌体，高压破碎2～3次后4℃条件下高速离心收集上清，将离心上清通过GST亲和柱，再用5倍体积磷酸盐缓冲液洗去杂蛋白，然后加入HRV 3C蛋白酶在低温条件下酶切3～48小时，用SDS-PAGE鉴定酶切效果。鉴定成功酶切后用20毫升缓冲液洗脱，浓缩(3KDa超滤管)后高速离心15～20分钟，将样品通过凝胶过滤层析(superdex 75)即可得到高纯度的目标蛋白，用SDS-PAGE鉴定分析每管中的样品后合并样品后浓缩，液氮速冻后-80℃冰箱保存。
图13为突变型类泛素G92C SUMO3的表达及纯化过程。图13中的(a)为本实施例中G92C SUMO3通过凝胶过滤层析和SDS-PAGE鉴定不同EP管中的蛋白情况，证实通过凝胶过滤层析根据蛋白分子量大小成功将目的蛋白分离出来。图13中的(b)为本实施例中最终得到的目的蛋白的SDS-PAGE鉴定情况，根据分子量大小证明最终成功纯化高纯度的G92CSUMO3。
图14为突变型类泛素G83C UFM1的表达及纯化过程。图14中的(a)为本实施例中G83C UFM1通过凝胶过滤层析和SDS-PAGE鉴定不同管中的蛋白情况，证实通过凝胶过滤层析根据蛋白分子量大小成功将目的蛋白分离出来。图14中的(b)为本实施例中最终得到的目的蛋白的SDS-PAGE鉴定情况，根据分子量大小证明最终成功纯化高纯度的G83C UFM1。
图15为突变型类泛素G76C NEDD8的表达及纯化过程。图15中的(a)为本实施例中G76C NEDD8通过凝胶过滤层析和SDS-PAGE鉴定不同管中的蛋白情况，证实通过凝胶过滤层析根据蛋白分子量大小成功将目的蛋白分离出来。图15中的(b)为本实施例中最终得到的目的蛋白的SDS-PAGE鉴定情况，根据分子量大小证明最终成功纯化高纯度的G76C NEDD8。
实施例9：突变型组蛋白八聚体H2AK125C、H2BK7C、H2BK34C、H3K18C、H3K56C、H4K12C、H4K31C的表达纯化
①用于表达突变型组蛋白八聚体H2AK125C的质粒是在实施例2中的基础上进行改造的，通过定点突变技术将H2A 125位点赖氨酸对应的基因序列突变成半胱氨酸对应的基因序列，便于后期与泛素进行交联反应。
②用于表达突变型组蛋白八聚体H2BK7C的质粒是在实施例2中的基础上进行改造的，通过定点突变技术将H2B 7位点赖氨酸对应的基因序列突变成半胱氨酸对应的基因序列，便于后期与SUMO3进行交联反应。
③用于表达突变型组蛋白八聚体H2BK34C的质粒是在实施例2中的基础上进行改造的，通过定点突变技术将H2B 34位点赖氨酸对应的基因序列突变成半胱氨酸对应的基因序列，便于后期与泛素进行交联反应。
④用于表达突变型组蛋白八聚体H3K18C的质粒是在实施例2中的基础上进行改造的，通过定点突变技术将H3 18位点赖氨酸对应的基因序列突变成半胱氨酸对应的基因序列，便于后期与NEDD8进行交联反应。
⑤用于表达突变型组蛋白八聚体H3K56C的质粒是在实施例2中的基础上进行改造的，通过定点突变技术将H3 56位点赖氨酸对应的基因序列突变成半胱氨酸对应的基因序列，便于后期与泛素进行交联反应。
⑥用于表达突变型组蛋白八聚体H4K12C的质粒是在实施例2中的基础上进行改造的，通过定点突变技术将H4 12位点赖氨酸对应的基因序列突变成半胱氨酸对应的基因序列，便于后期与泛素进行交联反应。
⑦用于表达突变型组蛋白八聚体H4K31C的质粒是在实施例2中的基础上进行改造的，通过定点突变技术将H4 31位点赖氨酸对应的基因序列突变成半胱氨酸对应的基因序列，便于后期与UFM1进行交联反应。
本实施例采用实施例2相同的步骤对上述七种突变型组蛋白八聚体进行表达纯化，首先通过测序技术确定成功构建质粒载体后，进一步表达纯化，纯化结果见图16，根据SDS-PAGE结果显示，成功表达纯化出上述七种突变型组蛋白八聚体，可进一步与泛素或类泛素蛋白进行化学交联。
实施例10：泛素与组蛋白八聚体的交联反应
将实施例1得到的突变型泛素G76C分别和实施例9中四种不同的突变型组蛋白八聚体(H2AK125C、H2BK34C、H3K56C和H4K12C)在冰浴条件下按一定比例混匀，将溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的浓度为100mM～5M的二溴丙酮(DBA)立即加入上述蛋白混合液中，混合均匀后在1.5M NaCl、PBS缓冲液和冰浴条件下反应。
另外，本实施例为了判断还原剂TCEP对此反应的影响，在上述方法的基础上进行了以下实验：将两种蛋白混合后加入TCEP孵育1～2h，再加入二溴丙酮进行交联反应。
分别在上述反应0、3h后取样，然后用SDS-PAGE鉴定化学交联反应情况，结果见图17。反应结束后加入β-ME终止反应。
图17为G76C突变型泛素与不同突变型组蛋白八聚体在不同条件下的交联反应后的SDS-PAGE分析图，图17(a)为交联反应的示意图，说明了泛素与四种组蛋白八聚体在二溴丙酮作用下产生了四种交联产物；图17(b-e)分别为泛素与H2AK125C、H2BK34C、H3K56C和H4K12C四种组蛋白八聚体的交联反应前后的SDS-PAGE结果分析，说明了利用此方法可以在不同组蛋白位点上进行泛素化修饰，泛素、组蛋白八聚体和二溴丙酮的不同比例均能发生交联反应。
此外，将突变型泛素和组蛋白八聚体提前与TCEP孵育后能有效减少副产物的比例，猜测是TCEP将突变型泛素和组蛋白八聚体在纯化过程中氧化产生的二硫键还原，可进一步提高交联产率。
实施例11：三种类泛素蛋白与组蛋白八聚体的交联反应将实施例8得到的三种突变型类泛素蛋白(SUMO3、UFM1和NEDD8)分别和实施例9中不同的突变型组蛋白八聚体(H2BK7C、H4K31C和H3K18C)在冰浴条件下按一定比例混匀，将溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的浓度为100mM～5M的二溴丙酮(DBA)立即加入上述蛋白混合液中，混合均匀在2M NaCl、PBS缓冲液和冰浴条件下反应。
另外，本实施例为了判断还原剂TCEP对此反应的影响，在上述方法的基础上进行了以下实验：将两种蛋白混合后加入TCEP孵育1～2h，再加入二溴丙酮进行交联反应。
分别在上述反应0、3h后取样，然后用SDS-PAGE鉴定化学交联反应情况，结果见图18。反应结束后加入β-ME终止反应。
图18为三种类泛素蛋白(SUMO3、UFM1和NEDD8)与不同突变型组蛋白八聚体(H2BK7C、H4K31C和H3K18C)在不同条件下的交联反应后的SDS-PAGE分析图，图18(a)为交联反应的示意图，说明了三种类泛素蛋白分别与组蛋白八聚体在二溴丙酮作用下产生了四种交联产物；图18(b-d)分别为SUMO3与H2BK7C、UFM1与H4K31C、NEDD8与H3K18C的交联反应前后的SDS-PAGE结果分析，说明了利用此方法可以在不同组蛋白位点上进行类泛素化修饰，类泛素蛋白、组蛋白八聚体和二溴丙酮的不同比例均能发生交联反应。
将类泛素蛋白(SUMO3、UFM1和NEDD8)和组蛋白八聚体提前与TCEP孵育后能有效减少副产物的比例，猜测是TCEP将类泛素蛋白和组蛋白八聚体在纯化过程中氧化产生的二硫键还原，可进一步提高交联产率。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (4)
1.一种利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）在泛素或类泛素蛋白的N端加上His标签，然后通过大肠杆菌感受态细胞表达纯化得到突变型泛素或类泛素蛋白；所述突变型泛素的C末端为半胱氨酸，所述突变型类泛素蛋白的C末端甘氨酸对应的核苷酸序列突变为半胱氨酸对应的核苷酸序列；
（2）通过大肠杆菌感受态细胞表达纯化得到突变型的组蛋白八聚体；所述突变型的组蛋白八聚体在进行泛素化/类泛素化修饰位点上的赖氨酸突变为半胱氨酸；
（3）利用二氯丙酮或二溴丙酮作为化学交联剂，将突变型泛素或类泛素蛋白与突变型组蛋白八聚体在非变性条件下进行交联反应，具体步骤如下：将突变型泛素或类泛素蛋白和组蛋白八聚体在冰浴条件下混合均匀，再加入二氯丙酮或二溴丙酮，以PBS作为缓冲液，在冰浴和1.5~2.5M氯盐的条件下进行交联反应，反应结束后加入还原剂终止反应，即可得到交联反应产物；
其中，在交联反应中，组蛋白八聚体、突变型泛素或类泛素蛋白和化学交联剂的摩尔比为1：2~10：4~32，pH值为7.0~8.0；
所述氯盐的阳离子选自钠离子或钾离子；所述还原剂选自二硫苏糖醇、β-巯基乙醇中的一种；
（4）将化学交联反应产物依次进行凝胶过滤层析和His亲和柱纯化，即可得到高纯度的泛素化或类泛素化组蛋白八聚体。
2.根据权利要求1所述利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法，其特征是，所述交联反应的时间为1~48小时。
3.根据权利要求2所述利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法，其特征是，所述交联反应中，化学交联剂是二溴丙酮，交联反应的时间为3小时。
4.根据权利要求1至3任一项所述利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法，其特征是，步骤（4）的具体步骤为：将交联反应产物在高速离心后通过凝胶过滤层析，根据分子量大小将未反应的组蛋白八聚体和泛素化/类泛素化组蛋白八聚体与突变型泛素/类泛素化蛋白分开，接下来将两种组蛋白八聚体的混合液高速离心或过滤后，通过His亲和柱除去未反应的组蛋白八聚体，并利用梯度洗脱方法获得高纯度的泛素化/类泛素化组蛋白八聚体。
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