JP2002514426A

JP2002514426A - ビタミンｂ１２輸送のための遺伝子を含む組替え生物による１，３−プロパンジオールの製造方法

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Publication number: JP2002514426A
Application number: JP2000548477A
Authority: JP
Inventors: ホワイテド，グレゴリー・エム; ブルトフイス，ベン; トリムバー，ドナルド・イー; ガテンビイ，アンソニー・エイ
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Priority date: 1998-05-12
Filing date: 1999-05-12
Publication date: 2002-05-21
Also published as: CN1300321A; CA2326722A1; KR20010043531A; CN1297662C; AU3899799A; US6432686B1; IL139466A; ID28024A; BR9910519A; WO1999058686A3; KR100590635B1; DE69939697D1; EP1076708A2; HK1038039A1; EP1076708B1; WO1999058686A2; IL139466A0

Abstract

(57)【要約】グリセロール脱水酵素をコードする遺伝子、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素、ビタミンＢ₁₂受容体前駆体（ＢｔｕＢ）をコードする遺伝子、ビタミンＢ₁₂輸送系透過酵素タンパク質（ＢｔｕＣ）をコードする遺伝子およびビタミンＢ₁₂輸送ＡＴＰ−結合タンパク質（ＢｔｕＤ）をコードする遺伝子を含んでいる組替え生物体を提供する。この組替え生物体を炭素基質と接触させ、１，３−プロパンジオールを増殖培地から単離する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は分子生物学の分野および１，３−プロパンジオールの製造のための組
替え生物体の使用に関する。より具体的には、本発明は、炭素基質を１，３−プ
ロパンジオールに効率的に転換する遺伝子と関連してビタミンＢ₁₂の細胞内輸送
に影響を及ぼすクローン化遺伝子の発現を記載する。

【０００２】背景１，３−プロパンジオールは、ポリエステル繊維の製造およびポリウレタンお
よび環状化合物の製造に使用されているモノマーである。

【０００３】１，３−プロパンジオールへの種々の化学的経路は公知である。例えば、１，
３−プロパンジオールは、１）ホスフィン、水、一酸化炭素、水素および酸の存
在下、触媒上でのエチレンオキシドから、２）アクロレインの接触液相水和およ
び引き続いての還元により、または３）周期表のＶＩＩＩ族からの原子を有する
触媒上、一酸化炭素および水素の存在下で反応させる炭化水素、例えばグリセロ
ール（グリセリン）から製造される。１，３−プロパンジオールはこれらの方法
で生成できるけれども、これらはコストがかかり、環境汚染物を含む廃棄物を発
生する。

【０００４】一世紀も前から、１，３−プロパンジオールはグリセロールの発酵から製造で
きることが公知である。１，３−プロパンジオールを産生できる細菌株は、例え
ばシトロバクター(Citrobacter)、クロストリジウム(Clostridium)、エンテロバ
クター(Enterobacter)、イリオバクター(Ilyobacter)、クレブシエラ(Klebsiell
a)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、およびペロバクター(Pelobacter)の群の
中で発見されている。研究されたそれぞれの場合に、グリセロールは１，３−プ
ロパンジオールに２段階の酵素触媒反応連鎖で転換される。第一段階では、脱水
酵素がグリセロールの３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰ）および
水への転換に触媒作用をする（式１）。第二段階で３−ＨＰは、１，３−プロパ
ンジオールにＮＡＤ⁺−リンク−酸化還元酵素により還元される（式２）。

【０００５】グリセロール→３−ＨＰ＋Ｈ₂Ｏ（式１）３−ＨＰ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺→１，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ⁺ （式２）１，３−プロパンジオールは、これ以上は代謝されず、その結果、培地内に高
い濃度で蓄積する。反応全体で、補因子である還元型β−ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレチオド（ＮＡＤＨ）の形で１還元当量を消費し、これはニコチンアミ
ドアデニンジヌクレチオド（ＮＡＤ⁺）に酸化される。

【０００６】グリセロールから１，３−プロパンジオールの産生は、一般にグリセロールを
唯一の炭素源として使用する嫌気性条件下およびその他の外因性の還元性当量受
容体(reducing equivalent acceptors）の非存在で行われる。これらの条件下、
シトロバクター(Citrobacter)、クロストリジウム(Clostridium)、およびクレブ
シエラ(Klebsiella)の株内で、例えばグリセロールの平行経路が機能し、これは
最初にＮＡＤ⁺−（またはＮＡＤＰ⁺−）リンクしたグリセロール脱水素酵素によ
るグリセロールのジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）への酸化を含む（式３）。Ｄ
ＨＡは、ＤＨＡキナーゼによるリン酸ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡＰ）へのリ
ン酸化（式４）に続いて、例えば生合成のためおよび解糖を介するＡＴＰ生成の
支援のために利用できるようになる。

【０００７】グリセロール＋ＮＡＤ⁺→ＤＨＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺ （式３）ＤＨＡ＋ＡＴＰ→ＤＨＡＰ＋ＡＤＰ（式４）１，３−プロパンジオールへの経路とは対照的に、この経路は、炭素およびエ
ネルギーを細胞に供給し、ＮＡＤＨを消費ではなく生成する。

【０００８】クレブシエラニューモニエ(Klebsiella pneumoniae) およびシトロバクター
フレウンディイ(Citrobacter freundii)内で、グリセロール脱水酵素（ｄｈａ
Ｂ）、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ｄｈａＴ）、グリセロール脱水
素酵素（ｄｈａＤ）、およびジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）の機
能的にリンクした活性をコードする遺伝子は、ｄｈａレギュロンに含まれる。シ
トロバクター(Citrobacter) およびクレブシエラ(Klebsiella)からのｄｈａレギ
ュロンは、大腸菌(Escherchia coli) 内に発現されており、グリセロールを１，
３−プロパンジオールに転換することが証明されている。

【０００９】１，３−プロパンジオールの生物学的製造は、２段階連続反応のための基質と
してグリセロールを必要とし、この反応内で、脱水酵素（代表的には補酵素Ｂ₁₂ 依存性脱水酵素）がグリセロールを中間体である３−ヒドロキシプロピオンアル
デヒドに転換し、これは次いで１，３−プロパンジオールにＮＡＤＨ−（または
ＮＡＤＰＨ）依存性酸化還元酵素により還元される。これらの補因子の要求は複
雑であり、１，３−プロパンジオールの製造のためのこの反応系列を組み込んだ
工業的方法のためには、全細胞触媒(whole cell catalyst) の使用が要求される
。補酵素Ｂ₁₂依存性ジオール脱水酵素を含む生物体を用いるグリセロールからの
１，３−プロパンジオールの製造方法は、米国特許（ＵＳ）第５，６３３，３６
２号（ナガラジャンら(Nagarajan et al.)）に記載されている。しかしこの方法
は、原料としてグリセロール使用に限定はしていない。グルコースおよび他の炭
水化物が適する基質であり、また最近、これらの基質は１，３−プロパンジオー
ル産生のための基質として証明されている。炭水化物は、１，３−プロパンジオ
ールに混合微生物培養物を用いて転換され、この場合、炭水化物は最初に一種の
微生物種により発酵されてグリセロールとなり、次いで１，３−プロパンジオー
ルに第二の微生物種により転換される〔米国特許（ＵＳ）第５，５９９，６８９
号（ヘイニーら(Haynie et al.)）〕。簡単化および経済的な理由から、炭水化
物を１，３−プロパンジオールに転換できる単一の生物体が好ましい。このよう
な生物体は、米国特許（ＵＳ）第５，６８６，２７９号（ラッフェンドら(Laffe
nd et al.)）により記載されている。

【００１０】一部の細菌、例えばサルモネラ(Salmonella)およびクレブシエラ(Klebsiella)
は、補酵素Ｂ₁₂を合成することができて、ジオールまたはグリセロール脱水酵素
を操作できるが、しかし、他の種はＢ₁₂を細胞の外部から輸送しなければならな
い。用語「Ｂ₁₂」は、補酵素Ｂ₁₂、上方軸５’−デオキシアデノシル配位子が他
の配位子（例えばアクオ−、シアノ−またはメチル基）で置換されている補酵素
Ｂ₁₂の誘導体、およびラジカル種のコブ（cob）（ＩＩ）アラミンを集合的に表
すために用いる。

【００１１】細菌内へのＢ₁₂輸送は、２つの主要な問題を提起する。第一は、Ｂ₁₂分子が、
外膜ポーリンを通過するためには大きすぎて、そのために特殊な外膜輸送系を必
要とすること。第二には、環境中のＢ₁₂の希少性のために、外膜輸送系はＢ₁₂に
対して高い親和性を有していなければならず、また内膜を通過する他の系による
引き続いての輸送のためにこれをペリプラズム内に移動させなければならないこ
と。Ｂ₁₂のコリン環を合成できない大腸菌(E. coli) に対しては、一定の条件下
での増殖のために、Ｂ₁₂の外部からの供給が必要である。これらの要求は適度で
あり、機能的ＭｅｔＨが存在する場合には約２５個のＢ₁₂分子（メチルコバラミ
ン）が必要であり、またエタノールアミンアンモニア−リアーゼ依存性増殖に
対しては、約５００個の補酵素Ｂ₁₂分子が必要である。

【００１２】輸送プロセスに対しては、数種のタンパク質が必要である。６６ｋＤａ外膜タ
ンパク質ＢｔｕＢは、アデノシル−、アクオ−、シアノ−およびメチルコバラ
ミンおよび相当するコビンアミドに対して高い親和性(Affinity)（Ｋｄ＝０．３
ｎＭ）の受容体として働く。Ｂ₁₂の非存在または低レベル（＜１ｎＭ）での増殖
の場合には、約２００コピーのＢｔｕＢが細胞あたりに存在する。しかし、高レ
ベルのＢ₁₂（＞０．１μＭ）を含む培地中の細胞の増殖は、ＢｔｕＢの合成を抑
制し、５ｎＭのレベルであっても、取り込み活性(uptake activity）は８０〜９
０％が抑制される。サルモネラ(Salmonella)とは異なり、大腸菌(E. coli) Ｂｔ
ｕＢは、好気性生分解により抑制されない。ペリプラズム内への輸送は、カルシ
ウムの同時輸送も必要とするエネルギー依存性プロセスによるＢｔｕＢと２６ｋ
Ｄａ内膜タンパク質ＴｏｎＢとの間の相互作用を必要とする。実際、Ｂ₁₂のＢｔ
ｕＢへの高親和性結合はカルシウム依存性であり、またＢ₁₂の飽和レベルでｐＨ
６．６におけるカルシウムに対する約３０ｎＭのＫｄを有する相互Ｂ₁₂依存性カ
ルシウム結合部位の証拠がある。カルシウムに対するこの親和性は、ｐＨ低下と
共に減少する。ＴｏｎＢは、輸送のために必要な構造交替を動かすためにプロト
ン駆動力を使用する。ＴｏｎＢが存在しないと、Ｂ₁₂は外膜に非常に低い効率で
浸透する。またＴｏｎＢは、ＦｅｐＡおよびＦｈｕＡ系を含め、鉄に対する外膜
輸送系にエネルギーを与える。このように、ＢｔｕＢは、ＴｏｎＢ活性に対する
これらの系と競合する。タンパク質合成が存在しないと、Ｂ₁₂輸送の速度は、約
２０分の半減期で低下し、これはＴｏｎＢ活性の損失に帰することができる。Ｂ
ｔｕＢからペリプラズム結合タンパク質へのＢ₁₂輸送は、ほとんど特性が明らか
ではなく、ｂｔｕＦでコードされるタンパク質を、少なくともサルモネラ(Salmo
nella)内では含んでいるであろう。

【００１３】内膜を通過する輸送は、ｂｔｕＣＥＤオペロンによりコードされるＢｔｕＣお
よびＢｔｕＤタンパク質により仲介される。ＢｔｕＣおよびＢｔｕＤは、ペリプ
ラズム結合タンパク質を必要とする輸送タンパク質に似ており、またＢｔｕＤは
ＡＴＰ結合部位を有している。これら２種の遺伝子の突然変異表現型は、外部Ｂ ₁₂ の適度な増加により修正され、またＢｔｕＢ／ＴｏｎＢ系は、Ｂ₁₂をペリプラ
ズム内に集中し、このようにして細胞質内へのＢ₁₂の幸運な輸送が促進されると
考えられる。ＢｔｕＥは輸送には関与せず、またその機能は分かっていない。ｂ
ｔｕＣＥＤオペロンは、構成性に発現されるとみなされ、また増殖培地中のＢ₁₂ の存在によっては調節されない。

【００１４】輸送経路は、外膜タンパク質ＢｔｕＢへのＢ₁₂の最初の結合、次いで内膜タン
パク質ＴｏｎＢとの相互作用およびエネルギー依存性トランスロケーションおよ
びペリプラズムＢｔｕＦとの結合、そして最後に内膜タンパク質ＢｔｕＣＤへの
運搬および細胞質へのトランスロケーションとして要約できる。

【００１５】Ｂ₁₂輸送のための重要な制御機構は、外膜タンパク質ＢｔｕＢのレベルに対す
る補酵素Ｂ₁₂の影響である。細胞性補酵素Ｂ₁₂の形成は、ｂｔｕＲ遺伝子により
コードされるＡＴＰ：コリノイドアデノシル転換酵素の活性からの結果である。
上記のように、培地内のＢ₁₂の存在は、ＢｔｕＢ機能の低下となるが、しかしこ
の直接抑制は、補酵素Ｂ₁₂に関する場合のみ観察され、ｂｔｕＲ−欠損株への種
々のＢ₁₂分子の付加の場合に見られるような補酵素Ｂ₁₂前駆体に関しては観察さ
れないことを強調することは重要である。培地内で供給される補酵素Ｂ₁₂前駆体
は、補酵素Ｂ₁₂へのその転換からの結果として抑制を起こすのであろう。制御は
、メッセージ合成の開始ではなく継続の変更と考えられ、すなわちｂｔｕＢ発現
に対する外来プロモーターの使用は、補酵素Ｂ₁₂による調節からの保護を必ずし
も与えない。ｂｔｕＢ調節の異常な特徴は、単独コピーの場合のように、ｂｔｕ
Ｂ遺伝子が多コピープラスミド上に持ち込まれた場合に抑制が有効と考えられる
ことにある。標的配列の過剰コピーによる滴定（力価）の見かけの不足は、細胞
内の抑制因子（補酵素Ｂ₁₂）の大過剰を示唆する。

【００１６】遺伝子融合研究において、転写および翻訳制御の両者共、ｂｔｕＢ発現に適合
するように認められ、一緒に考えると、これらの種々の特徴は、直接相互作用が
補酵素Ｂ₁₂とｍＲＮＡリーダーの間に起きる機構を示唆する。この相互作用は、
ｍＲＮＡ折り畳みを誘発してヘアピンを安定化させ、これによりリボソームの翻
訳起点への接近を遮断する。自体の発現および調節の制御においてｂｔｕＢ転写
のかなりの割合が必要なことは、リーダーおよびｂｔｕＢコード領域を含む転写
後イベントが、転写読み取りおよび翻訳開始の両者に影響することを示唆する。
調節における転写した領域の関与は、アミノ酸生合成経路における転写減衰制御
に対して論文が書かれているが、しかしｂｔｕＢ調節の異常な特徴は、重要な調
節部位がｂｔｕＢコード配列内に位置し、またこの調節が転写と翻訳の両者に影
響することである。

【００１７】本発明により解決すべき課題は、Ｂ₁₂輸送に責任がある活性をコードする外来
遺伝子の存在により酵素への補酵素Ｂ₁₂の利用可能性を上昇させて、補酵素Ｂ₁₂ 依存性脱水酵素を含む単一の組替え生物体を用いて、１，３−プロパンジオール
を生物学的に製造する方法である。

【００１８】発明の要約出願人は、酵素への補酵素Ｂ₁₂の利用可能性をＢ₁₂輸送遺伝子の存在により上
昇させることにより、直接１，３−プロパンジオールへの発酵可能な炭素源の脱
水酵素−媒介生物変換が可能な単一の組替え生物体を提供することにより、上記
の問題を解決した。好ましい基質は、発酵可能な炭水化物、単一炭素基質(singl
e carbon substrate) およびこれらの混合物を含む、より大きい基質の集合から
のグルコースおよびグリセロールである。

【００１９】本発明は、（ｉ）形質転換された宿主細胞を少なくとも１種の発酵可能な炭素
源およびビタミンＢ₁₂の有効量と接触させ、これにより１，３−プロパンジオー
ルが産生され、形質転換された宿主細胞は、（ａ）脱水酵素活性を有するタンパ
ク質をコードする遺伝子の少なくとも１種のコピー、（ｂ）酸化還元酵素活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１種のコピー、（ｃ）ビタミ
ンＢ₁₂受容体前駆体タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１種のコピー、
（ｄ）ビタミンＢ₁₂輸送系透過酵素タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも
１種のコピー、および（ｅ）ビタミンＢ₁₂輸送ＡＴＰ−またはＧＴＰ−結合タン
パク質をコードする遺伝子の少なくとも１種のコピー、を含んでおり、ここで、
（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の遺伝子の少なくとも１種のコピーが宿主細胞中に
導入され、そして、（ｉｉ）段階（ｉ）から産生された１，３−プロパンジオー
ルを回収することを含んでいる、１，３−プロパンジオールの生物体製造のため
の方法を提供する。Ｂ₁₂の有効量は、存在する脱水酵素の量に対して０．１から
１０．０倍のモル比である。

【００２０】本発明はさらに、（ａ）脱水酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
の少なくとも１種のコピー、（ｂ）酸化還元酵素活性を有する遺伝子の少なくと
も１種のコピー、（ｃ）ビタミンＢ₁₂受容体前駆体（ＢｔｕＢ）をコードする遺
伝子の少なくとも１種のコピー、（ｄ）ビタミンＢ₁₂輸送系透過酵素タンパク質
（ＢｔｕＣ）をコードする遺伝子の少なくとも１種のコピー、および（ｅ）ビタ
ミンＢ₁₂輸送ＡＴＰ−またはＧＴＰ−結合タンパク質（ＢｔｕＤ）をコードする
遺伝子の少なくとも１種のコピー、を含んでおり、ここで、（ｃ）、（ｄ）およ
び（ｅ）の遺伝子の少なくとも１種のコピーが宿主細胞中に導入される形質転換
され、脱水酵素を発現する宿主細胞を提供する。

【００２１】配列表の簡単な説明出願人は、特許出願におけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列の標準表示に関
する規則(Anexes I and II to the Decision of the President of the EPO, pu
blished in Supplement No.2 to OJ EPO, 12/1992)、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２
１〜１．８２５および補遺ＡおよびＢ（ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配
列を含む出願公開のための要件）、および世界知的所有権機構(WIPO)標準ＳＴ．
２５(1998)およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表示の要件(Rules 5.2 and 49.5(a-
bis), and Section 208 and Annex C of Administrative Instructions) に準拠
して、配列２５個を提出する。配列の記載は、Nucleic Acid Research 13:3021-
3030(1985)およびBiochemical Journal 219(No.2):345-373(1984) に記載され、
ここに引用して組み込むＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ基準に準拠して定義されるヌクレ
オチオド配列単位に対して１文字記号、およびアミノ酸に対する３文字記号を含
んでいる。

【００２２】配列番号１は、ビタミンＢ₁₂受容体前駆体タンパク質をコードする大腸菌(E.
coli)ｂｔｕＢのヌクレオチオド配列である。

【００２３】配列番号２は、ビタミンＢ₁₂受容体前駆体タンパク質をコードするサルモネラ
(Salmonella)ｂｔｕＢのヌクレオチオド配列である。

【００２４】配列番号３は、ビタミンＢ₁₂輸送系透過酵素タンパク質をコードする大腸菌(E
. coli)ｂｔｕＣのヌクレオチオド配列である。

【００２５】配列番号４は、ビタミンＢ₁₂輸送ＡＴＰ−結合タンパク質をコードする大腸菌
(E. coli)ｂｔｕＤのヌクレオチオド配列である。

【００２６】配列番号５は、ビタミンＢ₁₂輸送ペリプラズムタンパク質をコードする大腸菌
(E. coli)ｂｔｕＥのヌクレオチオド配列である。

【００２７】配列番号６は、グリセロール脱水酵素のα−サブユニットをコードするｄｈａ
Ｂ１のヌクレオチオド配列である。

【００２８】配列番号７は、グリセロール脱水酵素のβ−サブユニットをコードするｄｈａ
Ｂ２のヌクレオチオド配列である。

【００２９】配列番号８は、グリセロール脱水酵素のγ−サブユニットをコードするｄｈａ
Ｂ３のヌクレオチオド配列である。

【００３０】配列番号９は、クレブシエラ(Klebsiella)酸化還元酵素をコードするｄｈａＴ
のヌクレオチオド配列である。

【００３１】配列番号１０は、ＰＨＫ２８−２６、すなわちｄｈａオペロンを含む１２．１
ｋｂＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片のヌクレオチオド配列である。

【００３２】配列番号１１は、発現ベクターｐＴａｃＩＱの構築に使用される多クローニン
グ部位およびターミネーター配列のヌクレオチオド配列である。

【００３３】配列番号１２〜２３は、本発明の発現ベクターの構築に使用されるプライマー
である。

【００３４】配列番号２４は、ｄｈａＴおよびｄｈａＢ（１，２，３）の発現カセットの構
築に使用されるｐＣＬ１９２０内のインサートのヌクレオチオド配列である。

【００３５】配列番号２５は、ストレプトミセス(Streptomyces)からのグルコース異性化酵
素プロモーター配列のヌクレオチオド配列である。

【００３６】発明の詳細な説明本発明は、単一の組替え生物体内で発酵可能な炭素源から１，３−プロパンジ
オールを生物学的に製造する方法を提供する。この方法は、グリセロール脱水酵
素をコードする遺伝子、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素、ビタミンＢ₁₂ 受容体前駆体（ＢｔｕＢ）をコードする遺伝子、ビタミンＢ₁₂輸送系透過酵素タ
ンパク質（ＢｔｕＣ）をコードする遺伝子、およびビタミンＢ₁₂輸送ＡＴＰ−結
合タンパク質遺伝子（ＢｔｕＤ）をコードする遺伝子を含む微生物を包含する。
組替え微生物を炭素基質と接触させ、１，３−プロパンジオールを増殖培地から
単離する。

【００３７】本方法は、ポリエステルおよびその他のポリマーの製造に使用できる１，３−
プロパンジオールモノマーの迅速、安価で環境的に責任が持てる供給源を提供す
る。

【００３８】下記の定義は、特許請求の範囲および明細書を解釈するために使用されるもの
である。

【００３９】用語「ビタミンＢ₁₂受容体前駆体」、「ＢｔｕＢ」または「外膜ビタミンＢ₁₂ 受容体タンパク質」は、細菌の外膜上に位置し、補酵素Ｂ₁₂、シアノコバラミン
、アクアコバラミン、メチコバラミンおよびコビンアミドを、カルチャー培地か
らペリプラズム領域へ輸送する責任があるポリペプチドを指す。本発明の範囲内
で、ＢｔｕＢは、例えば大腸菌(Escherichia coli)のｂｔｕＢ遺伝子（ジーンバ
ンク(GenBank) Ｍ１０１１２）（配列番号１）およびサルモネラチフィムリウ
ム(Salmonella typhimurium)のｂｔｕＢ遺伝子（ジーンバンク(GenBank) Ｍ８９
４８１）（配列番号２）によりコードされるタンパク質を含む。

【００４０】用語「ＢｔｕＣ」または「ビタミンＢ₁₂輸送系透過酵素タンパク質」は、細菌
の内膜上に位置し、ＢｔｕＤと一緒にビタミンＢ₁₂および補酵素Ｂ₁₂をペリプラ
ズム領域から細胞質に輸送するポリペプチドを指す。ＢｔｕＣは、例えば大腸菌
(E. coli) のｂｔｕＣ遺伝子（ジーンバンク(GenBank) Ｍ１４０３１）（配列番
号３）によりコードされるポリペプチドを含む。

【００４１】用語「ＢｔｕＤ」または「ビタミンＢ₁₂輸送ＡＴＰ−結合タンパク質」は、細
菌の内膜上に位置し、ＢｔｕＣと一緒にＢ₁₂または補酵素Ｂ₁₂をペリプラズム領
域から細胞質に輸送するポリペプチドを指す。ＢｔｕＤは、例えば大腸菌(E. co
li) のｂｔｕＤ遺伝子（ジーンバンク(GenBank) Ｍ１４０３１）（配列番号４）
によりコードされるポリペプチドを含む。

【００４２】用語「ＢｔｕＥ」は、大腸菌(E. coli) のｂｔｕＥ遺伝子（ジーンバンク(Gen
Bank) Ｍ１４０３１）（配列番号５）によりコードされるポリペプチドを指し、
また輸送系の補助成分である。

【００４３】用語「グリセロール脱水酵素」または「脱水酵素」は、グリセロールを産生物
である３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに異性化または転換することができ
る補酵素Ｂ₁₂依存性酵素活性に責任があるポリペプチドを指す。本発明の範囲内
で、脱水酵素は、グリセロール脱水酵素（ジーンバンク(GenBank) Ｕ０９７７１
、Ｕ３０９０３）およびジオール脱水酵素（ジーンバンク(GenBank) Ｄ４５０７
１）を含み、それぞれグリセロールおよび１，２−プロパンジオールの好ましい
基質を有する。クレブシエラニューモニエ(K. pneumoniae) ＡＴＣＣ２５９５
５のグリセロール脱水酵素は、それぞれ配列番号６、７および８で定義される遺
伝子ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２およびｄｈａＢ３によりコードされる。ｄｈａＢ１
、ｄｈａＢ２およびｄｈａＢ３遺伝子は、それぞれグリセロール脱水酵素のα、
β、およびγサブユニットをコードする。グリセロール脱水酵素およびジオール
脱水酵素は、補酵素Ｂ₁₂を１：１の化学量論比で結合する錯体（α２β２γ２サ
ブユニット組成をもって）である。

【００４４】補酵素Ｂ₁₂前駆体（またはビタミンＢ₁₂）の「有効量」は、補酵素Ｂ₁₂前駆体
（またはビタミンＢ₁₂）が、系内に、脱水酵素に対して０．１〜１０のモル比で
存在することを意味する。

【００４５】用語「酸化脱水酵素」または「１，３−プロパンジオール酸化脱水酵素」は、
３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの１，３−プロパンジオールへの還元を触
媒できる酵素活性に責任があるポリペプチドを指す。１，３−プロパンジオール
酸化脱水酵素は、例えばｄｈａＴ遺伝子（ジーンバンク(GenBank) Ｕ０９７７１
、Ｕ３０９０３）でコードされるポリペプチドを含み、配列番号９で定義される
。

【００４６】用語「補酵素Ｂ₁₂」および「アデノシルコバラミン」は、５’−デオキシアデ
ノシルコバラミンを意味して、互換可能に使用される。ヒドロキソコバラミンは
、上方軸５’−デオキシアデノシル配位子がヒドロキシで置換されている補酵素
Ｂ₁₂の誘導体である。アクアコバラミンは、ヒドロキソコバラミンのプロトン化
した形である。メチルコバラミンは、上方軸５’−デオキシアデノシル配位子が
メチルで置換されている補酵素Ｂ₁₂の誘導体である。用語「シアノコバラミン」
は、上方軸５’−デオキシ’５’−アデノシル配位子がシアノで置換されている
補酵素Ｂ₁₂を指して使用される。用語「ビタミンＢ₁₂」および「Ｂ₁₂」は、補酵
素Ｂ₁₂、上方軸５’−デオキシアデノシル配位子が他の配位子、例えばアクオ−
、シアノ−またはメチル基で置換されている補酵素Ｂ₁₂の誘導体、およびラジカ
ル種のコブ（ＩＩ）アラミンを集合的に指し、互換可能に使用される。用語「補
酵素Ｂ₁₂前駆体」は、上方軸５’−デオキシアデノシル配位子が置換されている
補酵素Ｂ₁₂の誘導を指す。補酵素Ｂ₁₂前駆体の「有効量」は、補酵素Ｂ₁₂前駆体
が、存在する脱水酵素の量に対して約０．１〜１０．０倍のモル比で系内に存在
することを意味する。

【００４７】用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換可能に使用される。

【００４８】用語「発酵可能な炭素基質」および「発酵可能な炭素源」は、本発明の宿主生
物体により代謝されることができる炭素源を指し、また特には、単糖類、オリゴ
糖類、多糖類、グリセロール、ジヒドロキシアセトンおよび単炭素基質またはこ
れらの混合物から成る群から選択される炭素源である。

【００４９】用語「宿主細胞」または「宿主生物体」は、外来または異種遺伝子または外因
性遺伝子の多重コピーを受容し、また活性遺伝子生成物を生成するためにこれら
の遺伝子を発現できる微生物を指す。

【００５０】「遺伝子」は、コーディング配列に先立つ（５’−非コーディング配列）およ
び後に続く（３’−非コーディング配列）調節配列を含む特定のタンパク質を発
現する核酸断片を指す。「本来の遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に
見いだされるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見いだ
されない調節およびコーディング配列を含んでいる、本来の遺伝子でないあらゆ
る遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源から由来する調節配列お
よびコーディング配列、または同じ起源から由来するが、しかし天然に見いださ
れるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコーディング配列を含んで
いてもよい。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内のその本来の位置にある天
然の遺伝子を指す。「外来」または「異種」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見
いだされない遺伝子を指すが、しかしこれは遺伝子移送により宿主生物体内に導
入される。外来遺伝子は、非本来の生物体内に挿入された本体の遺伝子、または
キメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換操作によりゲノ
ム中に導入された遺伝子である。

【００５１】用語「コードする」および「コード化」は、転写または翻訳の機構を通じて、
遺伝子がアミノ酸配列を生成するプロセスを指す。特定のアミノ酸配列をコード
するプロセスは、コードされたアミノ酸内に変化を起こさない塩基変化を含んで
もよいＤＮＡ配列、または一個またはそれ以上のアミノ酸を交替させてもよいが
、しかしＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の機能的性質に影響を及ぼさ
ないＤＮＡ配列を含む。従って、本発明は、特定の例示した配列より多くのもの
を含むと考える。生成した単分子の機能的性質に実施的な影響を及ぼさないサイ
レント変化を起こす配列の変更、例えば配列内の欠失、挿入、または置換も考慮
に入れている。例えば、遺伝暗号の縮退を反映するか、または与えられた部位に
おいて化学的に同等のアミノ酸の生成となる遺伝子配列の交替を考慮に入れてい
る。このように、疎水性アミノ酸のアミノ酸アラニンに対するコドンは、他のよ
り疎水性が低い残基（例えばグリシン）、または疎水性がさらに高い残基（例え
ばバリン、ロイシン、またはイソロイシン）をコードするコドンで置換されても
よい。同様に、負に荷電した残基を他の残基へ置換（例えばアスパラギン酸をグ
ルタミン酸に代える）、または正に荷電した残基を他の残基への置換（例えばリ
シンをアルギニンに代える）となる変化も、生物学的に等価の生成物を生成する
と想定できる。タンパク質分子のＮ−末端またはＣ−末端部分の交替となるヌク
レオチド変化も、タンパク質の活性を交替させるとは想定されない。ある場合に
は、タンパク質の生物学的活性に対する交替の影響を研究するために、配列の突
然変異体を作製することは実際望ましいことがある。提案されたそれぞれの変更
は当該技術分野での日常的な技術の範囲内であり、これはコードされた生成物内
の生物学的活性の保持の決定であるからである。さらに、熟練者は、本発明に包
含される配列は、また厳しい条件下（０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５
℃）において本明細書中に例示した配列を用いてハイブリッド化するその能力に
よっても定義されることを認識している。

【００５２】用語「発現」は、遺伝子生成物の配列をコードする遺伝子からの遺伝子生成物
への転写および翻訳を指す。

【００５３】用語「プラスミド」、「ベクター」、おおび「カセット」は、細胞の中心代謝
の一部ではない遺伝子を持つことが多い余分の染色体要素を指し、通常は環状二
重鎖ＤＮＡ分子である。このような要素は、いかなる起源から誘導された、線状
または環状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列
、ファージまたはヌクレオチド配列で自動的に複製してもよく、これらの中には
多数のヌクレオチド配列が結合または再結合して、適当な３’非翻訳配列を同時
に有する選択された遺伝子生成物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を
細胞内に導入できる独特の構造となる。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を
含み、外来遺伝子の他に特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特
定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子の他
にその宿主内のその遺伝子の発現を促進させる要素を有する特定のベクターを指
す。

【００５４】用語「形質転換」および「移入」は、核酸の組み込みの後における細胞内の新
しい遺伝子の取得を呼ぶ。取得された遺伝子は、染色体ＤＮＡ内に合体されるか
、または染色体外複製配列として導入される。用語「形質転換体」は、形質転換
の生成物を呼ぶ。

【００５５】用語「遺伝子的な交替」は、形質転換または突然変異により遺伝的物質を変化
させるプロセスを指す。

【００５６】本発明は、ビタミンＢ₁₂の細胞内輸送のために必要な酵素をコードする遺伝子
と関連して、発酵可能な炭素基質を１，３−プロパンジオールに転換するために
必要な遺伝的機械を組み込んだ生産生物体の構築を含む。１，３−プロパンジオ
ール産生に関係する遺伝子は、脱水酵素遺伝子（代表的にはグリセロールまたは
ジオール脱水酵素）および酸化還元酵素ならびに脱水酵素の組み立てまたは安定
性維持に支援となることが期待されるその他のタンパク質を含む。これらの遺伝
子は、導入遺伝子であり宿主細胞内に導入されるか、または内因性であってもよ
い。ビタミンＢ₁₂の細胞内輸送に責任がある遺伝子は、ビタミンＢ₁₂受容体前駆
体タンパク質（ＢｔｕＢ）をコードする少なくとも１個の遺伝子、ビタミンＢ₁₂ 輸送系透過酵素タンパク質（ＢｔｕＣ）をコードする少なくとも１個の遺伝子お
よびビタミンＢ₁₂輸送ＡＴＰ−結合タンパク質（ＢｔｕＤ）をコードする少なく
とも１個の遺伝子を含む。これらの遺伝子の少なくとも１個は、導入遺伝子であ
り、産生細胞内に導入される。次いで、形質転換した産生細胞を、１，３−プロ
パンジオールの産生に適当な条件下で増殖する。

【００５７】炭素基質を１，３−プロパンジオールに転換する酵素経路をコードする必要な
遺伝子を含む組替え生物体は、この技術分野で良く知られている技術を用いて構
築してもよい。本発明において、グリセロール脱水酵素をコードする遺伝子（ｄ
ｈａＢ）および１，３−プロパンジオール脱水酵素をコードする遺伝子（ｄｈａ
Ｔ）は、本来の宿主、例えばクレブシエラ(Klebsiella)から単離され、本来の宿
主、例えば大腸菌(E. coli) およびＳ．チフィムリウム(S. typhimurium)から単
離されたＢｔｕＢをコードする遺伝子（ｂｔｕＢ）、ＢｔｕＣをコードする遺伝
子（ｂｔｕＣ）、ＢｔｕＤをコードする遺伝子（ｂｔｕＤ）、およびＢｔｕＥを
コードする遺伝子（ｂｔｕＥ）と一緒にして宿主株、例えば大腸菌(E. coli) 株
ＤＨ５αまたはＦＭ５；Ｋ．ニューモニアエ(K. pneumoniae) 株ＡＴＣＣ２５９
５５；Ｋ．オキシトカ(K. oxytoca)株ＡＴＣＣ８７２４またはＭ５ａｌ；Ｓ．セ
レヴィシアエ(S. cerevisiae) 株ＹＰＨ４９９、Ｐ．パストリス(P. pastoris)
株ＧＴＳ１１５、またはＡ．ニジエル(A. niger)株ＦＳ１を形質転換するために
使用される。

【００５８】ｄｈａＢ、ｄｈａＴの原理的説明グルコースからのの１，３−プロパンジオールの産生は、下記の一連の段階に
より完成できる。この連鎖は、この分野の専門家には既知の多数の経路の代表で
ある。グルコースは、解糖経路の酵素による一連の段階により、リン酸ジヒドロ
キシアセトン（ＤＨＡＰ）および３−ホスホグリセルアルデヒド（３−ＰＧ）に
転換される。次いで、グリセロールは、ＤＨＡＰの加水分解によりジヒドロキシ
アセトン（ＤＨＡ）、引き続く還元によるか、あるいはＤＨＡＰのグリセロール
−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への還元、引き続く加水分解によるかのいずれかで形成
される。加水分解段階は、これらの基質に対して非特異性であることが既知のい
かなる数の細胞ホスファターゼにより触媒作用を受けるか、または組替えにより
宿主内に活性を導入することができる。還元段階は、ＮＡＤ⁺（またはＮＡＤＰ⁺ ）リンク宿主酵素により触媒作用を受けるることができるか、または組替えによ
り宿主内に活性を導入することができる。ｄｈａレギュロンが、式３の可逆反応
に触媒作用があるグリセロール脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）を含むこ
とは注目に値する。

【００５９】グリセロール→３−ＨＰ＋Ｈ₂Ｏ（式１）３−ＨＰ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺→１，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ⁺ （式２）グリセロール＋ＮＡＤ⁺→ＤＨＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺ （式３）グリセロールは、以上に詳細に記載したように、中間体の３−ヒドロキシプロ
ピオンアルデヒド（３−ＨＰ）を経由して１，３−プロパンジオールに転換され
る。中間体の３−ＨＰは、宿主によりコードできるかまたは組替えにより宿主内
に導入できる脱水酵素によりグリセロールから産生される（式１）。この脱水酵
素は、グリセロール脱水酵素（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）、ジオール脱水酵素
（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）またはこの形質転換に触媒作用ができるその他の
いかなる酵素であってもよい。グリセロール脱水酵素はｄｈａレギュロンでコー
ド化されるが、ジオール脱水酵素はされない。１，３−プロパンジオールは、Ｎ
ＡＤ⁺−（またはＮＡＤＰ⁺）リンク宿主酵素により３−ＨＰから産生される（式
２）か、または活性は組替えにより宿主内に導入できる。１，３−プロパンジオ
ール産生におけるこの最終の反応は、１，３−プロパンジオール脱水素酵素（Ｅ
．Ｃ．１．１．１．２０２）またはその他のアルコール脱水素酵素により触媒作
用を受けることができる。

【００６０】ｄｈａレギュロンは、ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードするｄｈａＫ、
グリセロール脱水素酵素をコードするｄｈａＤ、調節タンパク質をコードするｄ
ｈａＲ、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素をコードするｄｈａＴならびに
酵素のα、βおよびγサブユニットをそれぞれコードするｄｈａＢ１、ｄｈａＢ
２、およびｄｈａＢ３をそれぞれ含む数種の機能要素を含んでいる。さらに、タ
ンパク質Ｘ、タンパク質１、タンパク質２、およびタンパク質３と呼ばれる遺伝
子産生物（それぞれｄｈａＢＸ、ｏｒｆＹ、ｏｒｆＸ、およびｏｒｆＷに相当す
る）は、ｄｈａレギュロン内でコードされる。これらの遺伝子産生物の正確な機
能は、完全には特性化されていないけれども、遺伝子は、グリセロール脱水酵素
（ｄｈａＢ）または１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ｄｈａＴ）にリン
クされ、１，３−プロパンジオールの製造に使えることが知られている。グリセ
ロール脱水酵素に結合している補酵素Ｂ₁₂は、場合により不可逆的な開裂を受け
、脱水酵素に緊密に結合される不活性な変性補酵素を形成する。酵素の再活性化
は、結合した変性補酵素と、遊離して変化していない補酵素Ｂ₁₂との交換により
起きる。タンパク質Ｘおよび少なくとも１種のタンパク質１、タンパク質２、お
よびタンパク質３は、この交換プロセスに関与する（ＵＳＳＮ０８／９６９，６
８三参照）。別の脱水酵素系内で、それぞれタンパク質Ｘおよびタンパク質２を
コードする遺伝子に相当するｄｄｒＡおよびｄｄｒＢと呼ばれる遺伝子は、交換
プロセスに関与すると記載されている（モリら(Mori et al., J. Biol. Chem. 2
72, 32034-32041 (1997)）。

【００６１】グリセロール−３−リン酸脱水素酵素およびグリセロール−３−ホスファター
ゼは、１，３−プロパンジオールの産生に必須なグルコースからグリセロールへ
の転換に特に有効なことが想定される。用語「グリセロール−３−リン酸脱水素
酵素」は、リン酸ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡＰ）のグリセロール−３−リン
酸（Ｇ３Ｐ）への転換に触媒となる酵素活性に責任があるポリペプチドを指す。
生物体内で、Ｇ３ＰＤＨは、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、またはＦＡＤ依存性であろ
う。ＮＡＤＨ依存性酵素（ＥＣ１．１．１．８）は、例えばＧＰＤ１（ジーンバ
ンク(GenBank) Ｚ７４０７１ｘ２）、またはＧＰＤ２（ジーンバンク(GenBank)
Ｚ３５１６９ｘ１）、またはＧＰＤ３（ジーンバンク(GenBank) Ｇ９８４１８２
）、またはＤＡＲ１（ジーンバンク(GenBank) Ｚ７４０７１ｘ２）を含む数種の
遺伝子によりコードされている。ＮＡＤＨＰ依存性酵素（ＥＣ１．１．１．９４
）は、ｇｐｓＡ（ジーンバンク(GenBank) Ｕ３２１６４３（ｃｄｓ１９７９１１
−１９６８９２）Ｇ４６６７４６およびＬ４５２４６）によりコードされている
。ＦＡＤ依存性酵素（ＥＣ１．１．９９．５）は、ＧＵＴ２（ジーンバンク(Gen
Bank) Ｚ４７０４７ｘ２３）、またはｇｌｐＤ（ジーンバンク(GenBank) Ｇ１４
７８３８）、またはｇｌｐＡＢＣ（ジーンバンク(GenBank) Ｍ２０９３８）によ
りコードされている。用語「グリセロール−３−ホスファターゼ」は、グリセロ
ール−３−リン酸および水のグリセロールおよび無機リン酸塩への転換を触媒す
る酵素活性に責任があるポリペプチドを指す。グリセロール−３−ホスファター
ゼは、例えばＧＰＰ１（ジーンバンク(GenBank) Ｚ４７０４７ｘ１２５）、また
はＧＰＰ２（ジーンバンク(GenBank) Ｕ１８８１３ｘ１１) によりコードされて
いる。

【００６２】遺伝子の単離細菌のゲノムから希望する遺伝子を得る方法は共通しており、分子生物学の分
野で良く知られている。例えば、遺伝子の配列が既知であれば、適するゲノムラ
イブラリーは、制限エンドヌクレアーゼ消化により創成してもよく、また希望す
る遺伝子配列に相補性のプローブを用いてスクリーニングしてもよい。配列が単
離されると、適当なベクターを用いる形質転換に適する量のＤＮＡを得るために
、ＤＮＡを標準的なプライマー先導増幅法(primer directed amplification met
hod)、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許（ＵＳ）第４，６８３
，２０２号）を用いて増幅してもよい。

【００６３】あるいは、大量のゲノムＤＮＡ（３５〜４５ｋｂ）の大きい断片をベクター内
にパッケージングし、適当な宿主を形質転換するために使用してコスミドライブ
ラリーを創成してもよい。コスミドベクターは、大量のＤＮＡを受容できる唯一
のものである。一般に、コスミドベクターは、引き続いての外来ＤＮＡのパッケ
ージングおよび引き続いての環化に必要なｃｏｓＤＮＡ配列の少なくとも１個の
コピーを有する。ｃｏｓ配列に加えて、これらのベクターは、また複製起点、例
えばＣｏｌＥ１を有し、また薬剤耐性マーカー、例えばアンピシリンまたはネオ
マイシンに対して耐性の遺伝子を含む。適切な細菌宿主の形質転換のためにコス
ミドベクターを用いる方法は、サンブルックら「分子クローニング：実験室用マ
ニュアル」(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二
版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (19
89))に詳しく記載されている。

【００６４】コスミドをクローニングするために代表的には、適当な制限エンドヌクレアー
ゼを用いて外来ＤＮＡを単離し、コスミドベクターのｃｏｓ領域に隣接して結合
させる。次いで、直線化した外来ＤＮＡを含むコスミドベクターをＤＮＡパッケ
ージングベヒクル、例えばベクテリオファージλと反応させる。パッケージング
プロセスの間に、ｃｏｓ部位は開裂し、外来ＤＮＡは細菌ウイルス粒子の頭部内
にパッケージングされる。次いで、これらの粒子は、適当な宿主細胞、例えば大
腸菌(E. coli) に移入するために使用される。細胞内に注入されると、外来ＤＮ
Ａはｃｏｓの付着末端の影響によって環化する。このようにして外来ＤＮＡの大
きな断片を組替え宿主細胞内に導入し、また発現できる。

【００６５】グリセロール脱水酵素（ｄｈａＢ）および１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子の単離およびクローニングｄｈａＢおよびｄｈａＴの同定および単離のための方法は、本質的に米国特許
（ＵＳ）第５，６８６，２７６号に記載のようにして行い、ここに引用して編入
する。コスミドベクターおよびコスミド形質転換法を、本発明の範囲内で、グリ
セロールを１，３−プロパンジオールに変換できる遺伝子を有することが既知の
細菌属からのゲノムＤＮＡの大きい断片をクローニングするために使用した。２
種類の１，３−プロパンジオール陽性形質転換体を分析して、ＤＮＡ配列はＣ．
フレウンディ(C. Freundii) からのグリセロール脱水酵素遺伝子（ｄｈａＢ）へ
の広範な相同性を表し、これらの形質転換体がグリセロール脱水酵素遺伝子をコ
ードするＤＮＡを含んでいることが証明された。ｄｈａＢおよびｄｈａＴを単離
し、Ｂ₁₂輸送機能をコードする遺伝子を有する組替え宿主内での同時発現のため
の適切な発現カセット内にクローニングした。

【００６６】本発明は、クレブシエラ(Klebsiella)コスミド内からの単離遺伝子を使用して
いるが、しかし脱水酵素の別の供給源には、シトロバクター(Citrobacter)、ク
ロトストリディア(Clostridia)、およびサルモネラ(Salmonella)も含まれ、また
これらには限定されない。

【００６７】Ｂ₁₂輸送遺伝子Ｂ₁₂輸送遺伝子の原理的説明アデノシル−コバラミン（補酵素Ｂ₁₂）は、グリセロール脱水酵素活性のため
の重要な補因子である。この補酵素は、既知の最も複雑な非ポリマー性天然生成
物であり、その生体内合成は約３０個の遺伝子の産物を用いて導かれる。補酵素
Ｂ₁₂の合成は、原核生物内で見いだされ、その一部は化合物を最初から(de novo
) 合成でき、一方他の物は一部の反応を行うことができる。例えば大腸菌(E. co
li) は、コリン環構造を作ることはできないが、コビンアミドのコリノイドへの
転換に触媒作用をすることができ、また５’−デオキシアデノシル基を導入でき
る。

【００６８】大腸菌(E. coli) 内へのＢ₁₂輸送は、機能性ＤｈａＢ酵素の産生のための限定
要因であり、この場合に補酵素Ｂ₁₂の高い細胞内利用可能性がグリセロール脱水
酵素活性（および最終的には１，３−プロパンジオール産生）を最適化するため
に必要であろう。これは、Ｂ₁₂の細胞内への輸送速度を上昇させて達成できるで
あろう。補酵素Ｂ₁₂の役割がｂｔｕＢ発現、および発酵に必要な補酵素Ｂ₁₂のレ
ベルの抑制因子であるとすると、Ｂ₁₂輸送は、細胞分裂からのＢｔｕＢの代謝回
転または希釈により、時間と共に低下する傾向となる。細胞内の遊離補酵素Ｂ₁₂ の利用できるプールは、取り込み速度、補酵素Ｂ₁₂に対するＢｔｕＢ、ｍＲＮＡ
およびＤｈａＢの比親和性、およびｍＲＮＡおよびＤｈａＢの濃度により影響を
受ける。Ｂ₁₂濃縮培地を用いた場合には取り込みが低下するので、取り込み機構
が回復するか否かを決定する重要な因子は、ｂｔｕＢ発現に対する調節の役割と
ＤｈａＢ酵素の間の補酵素Ｂ₁₂の分配であろう。これは、希望する補因子（補酵
素Ｂ₁₂）がそれ自体の限界に対して責任があるという異常な問題を提起する。補
酵素Ｂ₁₂の代わりに補酵素Ｂ₁₂前駆体を含む培地を使用すると、この問題を避け
ることはできるが、しかしこれは、輸送された前駆体がｂｔｕＲをコードするア
デノシルトランスフェラーゼにより補酵素Ｂ₁₂に転換されるから、一時的な利益
に過ぎないであろう。遺伝子調節の問題を避ける一つの方法は、ＢｔｕＢ合成を
補酵素Ｂ₁₂調節から脱結合することである。多コピープラスミド上へのクローニ
ングによるｂｔｕＢ発現の増幅は、膜へのＢ₁₂結合の増加および取り込み速度の
上昇に導き、またｂｔｕＢ天然プロモーターが置換された場合には、これもＢｔ
ｕＢ合成を補酵素Ｂ₁₂調節から脱結合するであろう。

【００６９】細菌内へのＢ₁₂輸送は、特異的な輸送系を必要とする。この輸送プロセスのた
めには、数種のタンパク質を必要とする。６６ｋＤａ外膜タンパク質ＢｔｕＢは
、アデノシル−、アクオ−、シアノ−およびメチル−コバラミンおよび相当する
コビンアミドに対する受容体として働く。ペリプラズム内への輸送は、ＢｔｕＢ
と２６ｋＤａ内膜タンパク質ＴｏｎＢとのエネルギー依存性プロセスによる相互
作用を必要とする。内膜を通過する輸送は、ｂｔｕＣＥＤオペロンによりコード
されるＢｔｕＣおよびＢｔｕＤタンパク質により媒介される。ＢｔｕＣおよびＢ
ｔｕＤは、ペリプラズム結合タンパク質を必要とする輸送タンパク質に似ており
、またＢｔｕＤはＡＴＰ結合部位を有する。輸送経路は、最初にＢ₁₂の外膜タン
パク質ＢｔｕＢへの結合、次いで内膜タンパク質ＴｏｎＢとの相互作用およびエ
ネルギー依存性トランスロケーションおよびペリプラズムＢｔｕＦ（Ｓ．チフィ
ムリウム(S. typhimurium)内）への結合、および最後に内膜タンパク質ＢｔｕＣ
Ｄへの運搬および細胞質へのトランスロケーションとして要約できる。多コピー
プラスミド上のクローニングによるｂｔｕＢＣＥＤ発現の増幅は、Ｂ₁₂の膜への
結合の増加および細胞内への取り込み速度上昇に導く。

【００７０】Ｂ₁₂輸送遺伝子の単離および発現大腸菌(E. coli) 内の複製要素として存在できる発現プラスミドを、４種のＢ ₁₂ 輸送遺伝子、ｂｔｕＢ、ｂｔｕＣ、ｂｔｕＤおよびｂｔｕＥに対して構築した
。４種の遺伝子は、遺伝子特異性プライマーおよび大腸菌(E. coli) 染色体ＤＮ
Ａを用いるＰＣＲにより単離した。この４種の遺伝子は、発現プラスミド上に一
緒に集めた。すべての発現プラスミドは、転写のためにｔｒｃプロモーター、翻
訳のために天然ｂｔｕリボソーム結合部位を使用する。それぞれのプラスミドは
、また１）アンピシリンを含む培地上の大腸菌(E. coli) 内の選択のためのβ−
ラクタマーゼのための遺伝子または２）クロラムフェニコールを含む培地上の選
択のためのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺
伝子のいずれかも含んでいた。複製のプラスミド起点は、ＣｏｌＥ１またはｐ１
５Ａのいずれかである。

【００７１】宿主細胞脱水酵素をコードする遺伝子と細胞内Ｂ₁₂輸送に責任がある遺伝子との同時発
現による組替え産生１，３−プロパンジオールのために適する宿主細胞は、原核
生物性または真核生物性のいずれでもよく、また活性酵素を発現するそれらの能
力によってのみ限定される。好ましい宿主は、１，３−プロパンジオールまたは
グリセロールの産生のために標準的に使用されるもの、例えばシトロバクター(C
itrobacter)、エンテロバクター(Enterobacter)、クロトストリジウム(Clostrid
ium)、クレブシエラ(Klebsiella)、アエロバクター(Aerobacter)、ラクトバチル
ス(Lactobacillus)、アスペルギルス(Aspergillus)、サッカロミセス(Saccharom
yces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ジゴサッカロミセス(Zygos
accharomyces)、ピヒア(Pichia)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、カンジダ
(Candida)、ハンセヌラ(Hansenula)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ムコール
(Mucor)、トルロプシス(Torulopsis)、メチロバクター(Methylobacter) 、エシ
ェルキア(Escherchia)、サルモネラ(Salmonella)、バチルス(Bacillus)、ストレ
プトミセス(Streptomyces)およびシュードモナス(Pseudomonas) である。本発明
で最も好ましくは、大腸菌(E. coli)、クレブシエラ(Klebsiella)種、およびサ
ッカロミセス(Saccharomyces)種である。

【００７２】大腸菌(E. coli) 、サッカロミセス(Saccharomyces)種、およびクレブシエラ(
Klebsiella)種が、特に好ましい宿主である。クレブシエラプネウモニアエ(Kl
ebsiella pneumoniae)の株は、単独の炭素としてのグリセロール上で増殖する場
合に、１，３−プロパンジオールを産生するとして知られている。クレブシエラ
(Klebsiella)が、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、または単炭素基質から１，３−
プロパンジオールを産生するために遺伝子的に変換できることも想定されている
。

【００７３】ベクターおよび発現カセット本発明は、適切な脱水酵素をコードする遺伝子および適当な宿主細胞内へのＢ ₁₂ の細胞内輸送に影響を及ぼす遺伝子のクローニング、形質転換および発現のた
めに適する各種のベクターおよび形質転換および発現カセットを提供する。適切
なベクターは、使用する細胞と相容性のものである。適切なベクターは、例えば
細菌、ウイルス（例えばバクテリオファージＴ７またはＭ−１３誘導ファージ）
、コスミド、酵母、または植物から誘導できる。このようなベクターの取得およ
び使用のプロトコールは、当業者には公知である（サンブルックら「分子クロー
ニング：実験室用マニュアル」(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labor
atory Manual, 第１、２、３巻, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sprin
g Harbor, NY (1989))）。

【００７４】代表的には、ベクターまたはカセットは、関連する遺伝子の転写および翻訳を
指令する配列、選択可能なマーカー、および自律的複製または染色体組込を可能
とする配列を含む。適切なベクターは、転写開始制御を収容している遺伝子の５
’領域および転写停止を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含んでいる。両方の制
御領域が形質転換された宿主細胞に相同な遺伝子から誘導されていると最も好ま
しく、これは、このような制御領域が産生宿主として選択された特定の種に本来
的な遺伝子から誘導されている必要は必ずしもないと理解されているにもかかわ
らず成立する。

【００７５】希望する宿主細胞内で本発明の関連遺伝子の発現を推進するために使用される
開始制御領域、またはプロモーターは多数あり、当業者にはよく知られている。
実際に、これらの遺伝子を駆動することができるいかなるプロモーターも本発明
に適し、これらはＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧ
Ｋ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ
、ＴＰＩ（サッカロミセス(Saccharomyces) 内での発現に使用できる）、ＡＯＸ
１（ピキア(Pichia)内での発現に使用できる）、およびｌａｃ、ｔｒｐ，λＰ_L
、λＰ_R Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌(E. coli) 内の発現に使用できる
）を含んでいるが、これらには限定されない。

【００７６】停止制御領域も、好ましい宿主に本来的な種々の遺伝子から誘導されてもよい
。場合により停止部位が不要ではあろうが、しかし、含まれていると最も好まし
い。

【００７７】本酵素の効率的な発現のために、酵素をコードするＤＮＡは、発現が適切なメ
ッセンジャーＲＮＡの形成となるように選択された発現制御領域への開始コドン
を通して操作的にリンクされている。

【００７８】適切な宿主の形質転換および１，３−プロパンジオールの産生のための遺伝子の発現適切なカセットが構築されると、これらは適切な宿主細胞の形質転換に使用さ
れる。細胞内Ｂ₁₂輸送に責任がある遺伝子を含むカセットならびにグリセロール
脱水酵素（ｄｈａＢ）、および１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ｄｈａ
Ｔ）の宿主細胞内への別々または一緒での導入は、公知の方法、例えば形質転換
（例えばカルシウム浸透化細胞(calciumu-permeabilized cell) 、電気泳動）ま
たは組替えファージウイルスを用いる移入によりなし遂げられる（サムブルック
ら、上記参照）。

【００７９】本発明においてグリセロール脱水酵素をコードする遺伝子（ｄｈａＢ）、１，
３−プロパンジオール酸化還元酵素をコードする遺伝子（ｄｈａＴ）、ＢｔｕＢ
をコードする遺伝子（ｂｔｕＢ）、ＢｔｕＣをコードする遺伝子（ｂｔｕＣ）、
ＢｔｕＤをコードする遺伝子（ｂｔｕＤ）、およびＢｔｕＥをコードする遺伝子
（ｂｔｕＥ）を含む大腸菌(E. coli) ＦＭ５は、ビタミンＢ₁₂または補酵素Ｂ₁₂ を培地から細胞質内への輸送に使用され、グリセロール脱水酵素を機能させるこ
とができる。

【００８０】培地および炭素源本発明における発酵培地は、適当な炭素基質を含まなければならない。適当な
基質は、グリセロール、ジヒドロキシアセトン、単糖類、例えばグルコースおよ
びフルクトース、オリゴ糖類、例えばラクトースまたはスクロース、多糖類、例
えばデンプンまたはセルロース、またはこれらの混合物、および再生可能な原料
からの未精製混合物、例えばチーズ乳漿浸透液(cheese whey permeate)、コーン
ステープリカー(cornsteep liquor)、テンサイモラス、およびオオムギモルトを
含んでいるが、これらに限定はされない。さらに、炭素基質は、主要生化学中間
体への代謝転換が証明されている単炭素基質（例えば二酸化炭素またはメタノー
ル）であってもよい。

【００８１】単炭素源（例えばメタノール、ホルムアルデヒド、またはフォーメート）から
のグリセロール産生は、メチロトローフ酵母内（ヤマダら(Yamada et al., Agri
c. Biol. Chem. 53(2) 541-543.(1989)）および細菌内（ハンターら(Hunter et
al., Biochemistry, 24, 4148-4155,(1985)）について報告されている。これら
の生物体は、メタンからフォーメートまでの酸化状態にある単炭素化合物を同化
でき、グリセロールを産生する。炭素同化の経路は、一リン酸リブロース経由、
セリン経由、または一リン酸キシルロース経由（ゴッチャルク「細菌代謝」(Got
tschalk, Bacterial Metabolism,第２版, Springer-Verlag, New York (1986)）
が可能である。一リン酸リブロース経路は、フォーメートとリブロース−５−リ
ン酸との縮合で六炭素糖を形成し、これがフルクトースとなり、また場合により
三炭素産生物であるグリセルアルデヒド−３−リン酸となることを含む。同様に
、セリン経路も、単炭素化合物を解糖経路内に入れ、メチレンテトラヒドロ葉酸
を経由して同化する。

【００８２】炭素１個および２個の基質の利用に加えて、メチロトローフ性生物体は、多数
の他の炭素含有化合物、例えばメチルアミン、グルコサミンおよび種々のアミノ
酸を代謝活性のために使用されることも知られている。例えば、メチロトローフ
酵母は、メチルアミンからの炭素をトレハロースまたはグリセロールの形成のた
めに使用することが知られている（ベリヨンら(Bellion et al., Microb. Growt
h C1 Compd., [Int. Symp], 7th(1993)、415-32. Editor(s): Murrell, J. Coll
in; Kelly, Don P. Publisher: Intercept. Andover, UK)）。同様に、カンジダ
(Candida)の種々の種類は、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（スルターら(
Sulter et al., Arch. Microbiol. 153(5), 485-9, 1990)）。従って、本発明で
利用される炭素の供給源は、多種類の炭素含有基質を包含し、宿主生物体の要求
によってのみ制限される。

【００８３】上記の炭素基質およびこれらの混合物のすべては、本発明に適することが想定
されるが、好ましい炭素基質は、グリセロール、ジヒドロキシアセトン、単糖類
、オリゴ糖類、多糖類、および単一炭素基質である。さらに好ましくは、糖類、
例えばグルコース、フルクトース、スクロースおよび単一炭素基質、例えばメタ
ノールおよび二酸化炭素である。最も好ましいのはグルコースである。

【００８４】適当な炭素源に加えて、発酵培地は、本技術の熟練者には既知であり、グリセ
ロール産生に必要な酵素経路の培養物の増殖および促進に適する、適切な無機物
、塩、補因子、緩衝液およびその他の成分を含まなければならない。特別の注目
は、Ｃｏ（ＩＩ）塩および補酵素Ｂ₁₂前駆体に集まる。例えば大腸菌(E. coli)
および真核生物は、補酵素Ｂ₁₂を最初からは合成はできず、補酵素Ｂ₁₂前駆体を
利用できるだけである。好ましい補酵素Ｂ₁₂前駆体は、シアノコバラミンおよび
ヒドロキソコバラミンである。宿主細胞内の補酵素Ｂ₁₂の量は、脱水酵素の量に
対して、ほぼ同じモル濃度であることが望ましい。

【００８５】カルチャー条件代表的には、細胞は適当な培地内、３０℃で増殖させる。本発明における適当
な増殖培地は、通常の商業的に調製された培地、例えばルリアベルタニ(Luria
Bertani)（ＬＢ）ブロス(broth)、サブローデキストロース(Sabouraud Dextr
ose)（ＳＤ）ブロスまたは酵母・麦芽抽出液（ＹＭ）ブロスである。その他の定
義されるかまたは合成された増殖培地も使用してよく、また特定の微生物の増殖
のために適当な培地は、微生物学または発酵科学の分野の専門家には既知である
。カタボライト抑制を直接的または間接的に調節することが既知の薬剤、例えば
環状アデノシン３’：５’−モノホスフェートの使用を反応培地内に組み込んで
もよい。同様に、グリセロール産生の促進に導く酵素活性を調節することが既知
の薬剤（例えばサルファイト、バイサルファイトおよびアルカリ類）の使用は、
遺伝子操作と関連してまたはその代替として使用してもよい。

【００８６】発酵のために適当なｐＨ範囲は、ｐＨ５．０〜ｐＨ９．０であり、ここでｐＨ
６．０〜ｐＨ８．０が初期条件の範囲として好ましい。

【００８７】反応は好気性でも嫌気性でも行ってよいが、こで、嫌気性または微好気性(mic
roaerobic)条件が好ましい。

【００８８】発酵本発明は、バッチ法、流加培養法(Fed-Batch)、または連続法を用いて実施し
てもよく、また発酵のいかなる方法も適する。さらに、細胞は全細胞触媒として
基質上に不動体化し、１，３−プロパンジオール産生のための発酵条件下に置く
ことも想定に入っている。

【００８９】本方法は、ここでは発酵のバッチ法として例示する。古典的なバッチ発酵は、
培地の組成を発酵の開始時に設定し、発酵の間に人手による変更を加えない閉鎖
系である。このように、発酵の初期において、培地は希望する生物体または複数
の生物体により接種され、発酵は系になにも加えないで起きることが可能となる
。しかし、代表的には、バッチ発酵とは、炭素源の添加に関して「バッチ」であ
り、制御因子、例えばｐＨおよび酸素濃度に対しては、しばしば変更が試みられ
る。バッチ系の代謝生成物およびバイオマス組成は、発酵が停止するまで常に変
化する。バッチカルチャー内で、細胞は、静的な誘導期(lag phase) を経過して
高い増殖の対数増殖期に変化し、最後には増殖速度が低下または停止する定常期
に達するまで変化する。非処理の場合には、定常期にある細胞は場合により死ん
でしまう。対数期の細胞は、一般に最終生成物または中間体の産生の全体に対し
て責任がある。

【００９０】標準バッチ系の変形法は、流加培養発酵系であり、これも本発明に適している
。代表的なバッチ系のこの変形において、基質は発酵の進行に伴って追加分とし
て加えられる。流加培養法は、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害しやすい場
合および培地内に限定された量の基質を含むことが望ましい場合に使用される。
流加培養系内の実際の基質濃度の測定は困難であり、従って、測定可能な因子、
例えばｐＨ、溶存酸素、および排出気体、例えばＣＯ₂分圧の変化に基づいて推
定する。バッチおよび流加培養発酵は一般的であり、当該技術分野では良く知ら
れており、その例は、ブロック(Brock、下記）に見いだすことができる。

【００９１】この方法は、また連続発酵法にも適用できる。連続発酵は、一定の発酵培地を
連続的に生反応槽に加え、同量の条件調整した培地を同時に処理のために取り出
す開放系である。連続発酵は、一般に細胞が主として対数増殖期にある一定の高
密度にカルチャーを維持する。

【００９２】連続発酵は、細胞増殖または最終産物濃度に影響する１個の因子またはいかな
る数の因子の調節でも可能とする。例えば、ある方法では、限界養分、例えば炭
素源または窒素レベルを一定の割合に維持し、他のパラメーターを加減して維持
する。他の系では、増殖に影響する多数の因子を連続的に変更し、一方では培地
の濁度で測定する細胞濃度は一定に保つことができる。連続系は、定常状態の増
殖条件の維持に努め、これにより培地取り出しによる細胞の損失を、発酵内の細
胞増殖速度に対してバランスさせなければならない。連続発酵法のための養分お
よび成長因子の調節の方法、ならびに産物形成の速度を最大化するための技術は
、工業的な微生物学の分野で良く知られている。種々の方法は、ブロック(Brock
、下記）に詳細に記載されている。

【００９３】１，３−プロパンジオールの同定および精製発酵培地からの１，３−プロパンジオールの精製方法は、当該分野では既知で
ある。例えば、プロパンジオールは、反応混合物を有機溶剤を用いる抽出、蒸留
およびカラムクロマトグラフィーで処理して細胞培地から得ることができる（米
国特許（ＵＳ）第５，３５６，８１２号）。この方法に対して特に良い有機溶剤
は、シクロヘキサンである（米国特許（ＵＳ）第５，００８，４７３号）。

【００９４】１，３−プロパンジオールは、培地を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）分析で試験すると直ちに同定できる。本発明で好ましくは、一定組成状態で移
動相として０．０１Ｎ硫酸を用いる分析用イオン交換カラムで、発酵培地を分析
する方法である。

【００９５】本発明は、さらに以下の実施例で定義する。これらの実施例は、本発明の好ま
しい態様を示してはいるが、説明のためのみであることは理解されなければなら
ない。上記の考察およびこれらの実施例から、当該分野の熟練者は、本発明の本
質的な特性を確認でき、またその思想および範囲から離れることなく、各種の使
用および条件に適合させるように本発明の各種の変更および改変を行うことがで
きる。

【００９６】実施例一般方法ホスホリル化、連結反応、および形質転換の方法は、当該分野では良く知られ
ている。下記の実施例に使用するために適合する技術は、サンブルック、Ｊ．ら
「分子クローニング：実験室用マニュアル」(Sambrook, J., et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess, Cold Spring Harbor, NY(1989) ）に見いだすことができる。

【００９７】細胞カルチャーの維持および増殖のために適合する材料および方法は、当該分
野では良く知られている。下記の実施例に使用するために適合する技術は、「一
般細菌学のための方法のマニュアル」(Manual of Methods for General Bacteri
ology (Phillipp Gerhardt, R.G.E. Murry, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nes
ter, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips, eds, American
Society for Microbiology, Washington, DC(1994))またはトーマスＤ．ブロ
ック「バイオ技術：工業微生物学教科書」(Thomas D. Brook: Biotechnology: A
Textbook of Industrial Microbiology, 第２版, Sinauer Associates, Inc.,
Sunderland, MA(1989)）に見いだすことができる。細菌細胞の増殖および維持の
ために使用するすべての試薬および材料は、特に別途断らない限り、アルドリッ
チ・ケミカルズ(Aldrich Chemicals, Milwalkee, WI)、ＤＩＦＣＯラボラトリー
ズ(DIFCO Laboratories, Detroit, MI)、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ(GIBCO/BRL, Gaith
ersburg, MD) 、またはシグマ・ケミカル社(Sigma Chemical Company, St. Loui
s, MO) から入手した。

【００９８】略語の意味は以下のようである：「ｈ」は時間（単数および複数）を意味し、
「ｍｉｎ」は分（単数および複数）を意味し、「ｓｅｃ」は秒（単数および複数
）を意味し、「ｄ」は日（単数および複数）を意味し、「ｍＬ」はミリリットル
を意味し、「Ｌ」はリットルを意味する。１，３−プロパンジオールの単離および同定グリセロールから１，３−プロパンジオールへの転換は、ＨＰＬＣで監視した
。分析は、クロマトグラフィーの技術の熟練者に利用できる標準的な方法および
材料を用いて行った。一つの適合する方法では、ＵＶ（２１０ｎｍ）およびＲＩ
検出を用いるウオーターズ・マキシマ(Waters Maxima) ８２０ＨＰＬＣ系を使用
した。試料は、ショデックス(Shodex)ＳＨ−１０１１Ｐプレカラム（６ｍｍｘ
５０ｍｍ）を備え、温度を５０℃に制御し、移動相として０．０１ＮＨ₂Ｓ
Ｏ₄を流量０．５ｍＬ／分で流すショデックスＳＨ−１０１１カラム（８ｍｍ
ｘ３００ｍｍ、ウオーターズ(Waters, Milford, MA) から購入）上に注入した
。定量分析を望む場合には、試料は、外標準として既知量のトリメチル酢酸を用
いて調製した。代表的には、グリセロール（ＲＩ検出）、１，３−プロパンジオ
ール（ＲＩ検出）、おおびトリメチル酢酸（ＵＶおよびＲＩ検出）の滞留時間は
、それぞれ２０．6 ７分、２６．０８分、および３５．０３分であった。

【００９９】１，３−プロパンジオールの産生は、ＧＣ／ＭＳで確認した。分析は、ＧＣ／
ＭＳの技術に熟練者が利用できる標準方法および材料を用いて行った。一つの適
合する方法では、ヒューレット・パッカード(Hewlett Packard) ５９７１シリー
ズ質量選択検出器（ＥＩ）およびＨＰ−ＩＮＮＯワックスカラム（長さ３０ｍ、
内径０．２５ｍｍ、膜厚さ０．２５μｍ）と結合したヒューレット・パッカード
５８９０シリーズＩＩガスクロマトグラフを用いた。得られた１，３−プロパン
ジオールの滞留時間および質量スペクトルは、真正の１，３−プロパンジオール
のものと比較した（ｍ／ｅ：５７．５８）。

【０１００】ＧＣ／ＭＳの別の方法では、試料の誘導化が含まれていた。試料（例えばカル
チャー上清）１．０ｍＬに濃（７０％ｖ／ｖ）過塩素酸３０μＬ（ｎＬ）を加え
た。混合の後、試料を冷凍して凍結乾燥した。ビス（トリメチルシリル）トリフ
ルオロアセトアミド：ピリジンの１：１混合物（３００μＬ）を凍結乾燥した物
質に加え、強く攪拌し、６５℃で１時間放置した。試料を遠心分離して不溶性物
質を除いた。得られた液体を２相に分液し、上の相を分析に使用した。試料をＤ
Ｂ−５カラム（４８ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚さ０．２５μｍ、Ｊ＆Ｗサイ
エンティフィック(Scientific)より入手）でクロマトグラフ処理し、カルチャー
上清から得られた１，３−プロパンジオール誘導体の滞留時間および質量スペク
トルを真正標準から得られたものと比較した。ＴＭＳ誘導体化１，３−プロパン
ジオールの質量スペクトルは、２０５、１７７、１３０および１１５ＡＭＵの特
性イオンを含んでいた。

【０１０１】ビタミンまたは補酵素Ｂ₁₂の同定細胞を含まない試料を補酵素Ｂ₁₂およびシアノコバラミン（シアノコバラミン
）定量のためにＨＰＬＣ分析した。コバラミン定量は、最初に２７８ｎｍおよび
３６１ｎｍにあるピーク面積比を標準と比較し、次いでコバラミンの標準曲線に
ピーク面積を適用して得られた。

【０１０２】ＨＰＬＣの方法カラム：スペルコシル(Supelcosil)ＬＣ−１８−ＤＢ、２５ｃｍｘ４．６ｃｍ（スペルコ社(Supelco Inc., Bellefonte, PA)) スペルコシルＬＣ−１８−ＤＢプレカラムキットカラム温度：周辺温度サンプル室：暗所、５℃ 検出２５４ｎｍ、および３６０ｎｍ注入体積：２５μｌ移動相Ａ：８．９５ｇ酢酸ナトリウム・３Ｈ₂Ｏ５．８８ｍＬ１．０Ｍ水酸化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＨ）４ＬＭＱＨ₂Ｏ氷酢酸を用いてｐＨ４．６とする。

【０１０３】移動相Ｂ（下記）２１０ｍＬを添加移動相Ｂ：４ＬＭｅＯＨ５．８８ｍｌＴＢＡＨ０．８９ｍＬ氷酢酸勾配：時間（分）流量ｍＬ／分Ａ％Ｂ％０１．０１０００３１．０７５２５９１．０６０４０１１１．００１００１３１．００１００１５１．０１０００１５．５０．１１０００グリセロール脱水酵素および１，３−プロパンジオール酸化還元酵素をコードする遺伝子（ｄｈａＢおよびｄｈａＴ）の単離およびクローニングｄｈａＢおよびｄｈａＴの同定および単離の方法は、本質的に米国特許（ＵＳ
）第５，６８６，２７６号（ここに参考文献として編入）に記載と同様にして行
った。コスミドベクターおよびコスミド形質転換法を本発明の範囲内で、グリセ
ロールを１，３−プロパンジオールに処理できる遺伝子を有することが既知の細
菌属からのゲノムＤＮＡの大型断片をクローニングするために使用した。具体的
には、Ｋ．プネウモニアエ(K. pneumoniae) ＡＴＣＣ２５９５５からのゲノムＤ
ＮＡを、当該分野では既知の方法により単離し、またコスミドベクターＳｕｐｅ
ｒｃｏｓ１内に挿入するために制限酵素Ｓａｕ３Ａを用いて消化し、Ｇｉｇａｐ
ａｃｋＩＩパッケージング抽出液を用いてパッケージングした。ベクターの構築
に次いで、大腸菌(E. coli) ＸＬ−１−ＢｌｕｅＭＲ細胞をコスミドＤＮＡを用
いて形質転換した。細胞をグリセロールの存在下で増殖し、１，３−プロパンジ
オール形成に関して培地を分析して、グリセロールから１，３−プロパンジオー
ルへの転換の能力に関して形質転換体をスクリーニングした。

【０１０４】１，３−プロパンジオール陽性形質転換体の２種類を分析し、コスミドをｐＫ
Ｐ１およびｐＫＰ２と名付けた。ＤＮＡの配列決定から、Ｃ．フレウンディ(C.
Freundii) からのグリセロール脱水酵素遺伝子（ｄｈａＢ）との広範な相同性が
明らかとなり、これらの形質転換体がグリセロール脱水酵素遺伝子をコードする
ＤＮＡを含んでいることが証明された。

【０１０５】ｐＩＢＩ３１（ＩＢＩバイオシステムズ(IBI Biosystems, New Haven, CN) ）
内にサブクローニングしたｐＫＰ１からの１２．１ｋｂＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ
断片を配列決定し、ｐＨＫ２８−２６と名付けた（配列番号１０）。配列決定か
ら、ｄｈａオペロンの関連するオープンリーディングフレームの座が、調節に必
要なグリセロール脱水酵素および遺伝子をコードしていることが明らかになった
。配列番号１０に関して、ｄｈａＫ（ジヒドロキシアセトンキナーゼをコード
する）のオープンリーディングフレーム断片が、塩基１〜３９９で見いだされ、
オープンリーディングフレームｄｈａＤ（グリセロール脱水素酵素をコードする
）は、塩基９８３〜２１０７に見いだされ、オープンリーディングフレームｄｈ
ａＲ（抑制因子をコードする）は、塩基２２０９〜４１３４に見いだされ、オー
プンリーディングフレームｄｈａＴ（１，３−プロパンジオール酸化還元酵素を
コードする）は、塩基５０１７〜６１８０に見いだされ、オープンリーディング
フレームｄｈａＢ１（αサブユニットグリセロール脱水酵素をコードする）は、
塩基７０４４〜８７１１に見いだされ、オープンリーディングフレームｄｈａＢ
２（βサブユニットグリセロール脱水酵素をコードする）は、塩基８７２４〜９
３０８に見いだされ、オープンリーディングフレームｄｈａＢ３（γサブユニッ
トグリセロール脱水酵素をコードする）は、塩基９３１１〜９７３６に見いださ
れ、またオープンリーディングフレームｄｈａＢＸ（未知機能のタンパク質をコ
ードする）は、塩基９７４９〜１１５７４に見いだされた。さらに、オープンリ
ーディングフレームｏｒｆＹ（未知機能のタンパク質をコードする）は、塩基６
２０２〜６６３０に見いだされ、オープンリーディングフレームｏｒｆＸ（未知
機能のタンパク質をコードする）は、塩基４６４３〜４９９６に見いだされ、ま
たオープンリーディングフレームｏｒｆＷ（未知機能のタンパク質をコードする
）は、塩基４１１２〜４６４２に見いだされた。

【０１０６】大腸菌の形質転換に使用するための汎用発現プラスミドの構築発現ベクターｐＴａｃＩＱの構築大腸菌(E. coli) 発現ベクターｐＴａｃＩＱは、ｌａｃＩｑ遺伝子（ファラボ
ー(Farabaugh, (1978), Nature 274 (5673) 765-769)）およびｔａｃプロモータ
ー（アマンら(Amann et al., (1983), Gene 25, 167-178)）をｐＢＲ３２２（サ
トクリフ(Sutcliffe, (1979), Cold Spring Harb. Symp. Quart. Biol. 43, 77-
90) ）の制限エンドヌクレアーゼ部位ＲｃｏＲＩ内に挿入して調製した。多重ク
ローニング部位およびターミネーター配列（配列番号１１）は、ｐＢＲ３２２配
列をＥｃｏＲＩからＳｐｈＩに置換する。

【０１０７】グリセロール脱水酵素遺伝子（ｄｈａＢ１，２，３，Ｘ）サブクローニングｄｈａＢ３遺伝子に対するオープンリーディングフレームを、ｐＨＫ２８−２
６から、プライマー（配列番号１２および配列番号１３）を用いるＰＣＲにより
、５’末端にＥｃｏＲＩ部位および３’末端にＸｂａＩ部位に組み込んで増幅し
た。生成物をｐＬｉｔｍｕｓ２９（ニューイングランドバイオラブ社(New Engla
nd Biolab, Inc., Beverly, MA) ）内にサブクローニングして、ｄｈａＢ３を含
むプラスミドｐＤＨＡＢ３を生成させた。

【０１０８】ｐＨＫ２８−２６からのｄｈａＢオペロンのｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａ
Ｂ３およびｄｈａＢＸに対する全コーディング領域を含む領域を、制限酵素Ｋｐ
ｎＩおよびＥｃｏＲＩを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋（ストラタジ
ーン(Stratagene, La Jolla, CA)）内にクローニングして、プラスミドｐＭ７を
創成した。

【０１０９】ｄｈａＢＸ遺伝子を、プラスミドｐＭ７とＡｐａＩおよびＸｂａＩとを一緒に
消化して取り去り、５．９ｋｂ断片を精製し、これをプラスミドｐＤＨＡＢ３か
らの３２５ｂｐＡｐａＩ−ＸｂａＩ断片と結合させて、ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ
２およびｄｈａＢ３を含むｐＭ１１を創成した。

【０１１０】ｄｈａＢ１遺伝子に対するオープンリーディングフレームを、ｐＨＫ２８−２
６から、プライマー（配列番号１４および配列番号１５）を用いるＰＣＲにより
、ＨｉｎｄＩＩＩ部位および５’末端に共通リボソーム結合部位および３’末端
にＸｂａＩ部位を組み込んで増幅した。生成物をｐＬｉｔｍｕｓ２８（ニューイ
ングランドバイオラブ社）内にサブクローニングしてｄｈａＢ１を含むプラスミ
ドｐＤＴ１を生成させた。

【０１１１】ｄｈａＢ１遺伝子、ｄｈａＢ２遺伝子およびｄｈａＢ３遺伝子の部分を含むｐ
Ｍ１１からのＮｏｔＩ−ＸｂａＩ断片をｐＤＴ１内に挿入して、ｄｈａＢ発現プ
ラスミドｐＤＴ２を創成した。ｐＤＴ２からのｄｈａＢ（１，２，３）遺伝子を
含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片をｐＴａｃＩＱ内に挿入してｐＤＴ３を創成
した。

【０１１２】１，３−プロパンジオール脱水素酵素遺伝子（ｄｈａＴ）サブクローニング１，３−プロパンジオール脱水素酵素遺伝子（ｄｈａＴ）を含むｐＨＫ２８−
２６のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋内にサブク
ローニングしてプラスミドｐＡＨ１を創成した。ｄｈａＴ遺伝子は、ＰＣＲによ
りテンプレートＤＮＡとしてのｐＡＨ１および合成プライマー（配列番号１６お
よび配列番号１７）から、５’末端にＸｂａＩおよび３’末端にＢａｍＨＩを組
み込んで増幅した。生成物をｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）内にＳｒ
ｆＩ部位にサブクローニングし、ｄｈａＴを含むプラスミドｐＡＨ４およびｐＡ
Ｈ５を生成させた。プラスミドｐＡＨ４は、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ内のｌａｃプ
ロモーターからの発現のための右配向のｄｈａＴ遺伝子を含み、またｐＡＨ５は
逆の配向のｄｈａＴ遺伝子を含む。ｄｈａＴ遺伝子を含むｐＡＨ４からのＸｂａ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片をｐＴａｃＩＱ内に挿入して、プラスミドｐＡＨ８を生成さ
せた。ＲＢＳおよびｄｈａＴ遺伝子を含むｐＡＨ８からのＨｉｎｄＩＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋内に挿入してプラスミドｐＡＨ１
１を創成した。

【０１１３】ｄｈａＴおよびｄｈａＢ（１，２，３）のための発現カセットの構築ｄｈａＴおよびｄｈａＢ（１，２，３）のための発現カセットは、標準分子生
物学法を用いて以上に記載したようにして個別のｄｈａＢ（１，２，３）および
ｄｈａＴサブクローンから構築した。ｐＤＴ３からのｄｈａＢ（１，２，３）遺
伝子を含むＳｐｅＩ−ＳａｃＩ断片をｐＡＨ１１内にＳｐｅＩ−ＳａｃＩ部位内
において挿入してｐＡＨ２４を創成した。ＳａｌＩ−ＸｂａＩリンカー（配列番
号２２および配列番老２３）を、制限酵素ＳａｌＩ−ＸｂａＩを用いて消化した
ｐＡＨ５内に挿入してｐＤＴ１６を創成した。リンカーはＸｂａＩ部位を破壊す
る。次いで、ｐＤＴ１６からの１ｋｂＳａｌＩ−ＭｌｕＩ断片をｐＡＨ２４内
に挿入して存在するＳａｌＩ−ＭｌｕＩ断片を置換してｐＤＴ１８を創成した。
ｐＤＴ２１は、ｐＤＴ１８からのＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片およびｐＭ７からのＮ
ｏｔＩ−ＸｂａＩ断片をｐＣＬ１９２０内に挿入（配列番号２４）して構築した
。ストレプトミセス(Streptomyces)からのグルコースイソメラーゼプロモーター
配列（配列番号２５）をＰＣＲによりクローニングし、ｐＬｉｔｍｕｓ２８のＥ
ｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位内に挿入してｐＤＴ５を構築した。ｐＣＬ１９２
５は、ｐＤＴ５のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ断片をｐＣＬ１９２０のＥｃｏＲＩ−
ＰｖｕＩ部位内に挿入して構築した。ｐＤＴ２４は、ｐＤＴ２１のＨｉｎＤＩＩ
Ｉ−ＭｌｕＩＩ断片およびｐＤＴ２１のＭｌｕＩ−ＸｂａＩ断片をｐＣＬ１９２
５のＨｉｎＤＩＩＩ−ＸｂａＩ部位内にクローニングして構築した。

【０１１４】実施例１Ｂ₁₂輸送遺伝子のための発現カセットの構築複製要素として存在できる発現プラスミドを、４種のＢ₁₂輸送遺伝子、ｂｔｕ
Ｂ、ｂｔｕＣ、ｂｔｕＤ、およびｂｔｕＥに対して構築した。すべての発現プラ
スミドは、転写のためのｔｒｃプロモーターを用いる。それぞれのプラスミドも
またアンピシリンを含む培地上の大腸菌(E. coli) 内の選択のためのβ−ラクタ
マーゼのための遺伝子、またはクロラムフェニコールを含む培地上の選択のため
のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のいず
れかを含んでいた。複製のプラスミド起点は、ＣｏｌＥ１またはｐ１５Ａのいず
れかである。

【０１１５】ｂｔｕＢ遺伝子は、５’末端にＮｃｏＩ部位および３’末端にＢａｍＨＩ部位
を付加するプライマー（配列番号１８、配列番号１９）を用いるＰＣＲにより大
腸菌(E. coli) 染色体ＤＮＡから増幅した。反応混合物は、１０ｍＭトリスｐＨ
８．３、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、０．０００１％ゼラチン
、２００μＭｄＡＴＰ、２００μＭｄＣＴＰ、２００μＭｄＧＴＰ、２０
０μＭｄＴＴＰ、１μＭの各プライマー、１〜１０ｎｇ標的ＤＮＡ、２５単位
／ｍＬのアンプリタク(Amplitaq)^TMＤＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマー
シータス(Parkin-Elmer Cetus, Norwalk CT)）を含んでいた。ＰＣＲパラメータ
ーは、９４℃で１分間、５２℃で１分間、７２℃で２分間、２５サイクルであっ
た。１９０５ｂｐＰＣＲ生成物を、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア
(Pharmacia, Piscataway, NJ) ）のＮｃｏＩとＢａｍＨＩ部位との間にクローニ
ングしてプラスミドｐＢｔｕＢ１を生成させた。プラスミドｐＢｔｕＢ１は、複
製のＣｏｌＥ１起点、アンピシリン耐性、ｌａｃＩｑ遺伝子を有し、またｂｔｕ
ＢはＰｔｒｃから発現される。

【０１１６】プラスミドｐＢｔｕＢ２を構築するために、ｌａｃＩｑ、Ｐｔｒｃ，およびｂ
ｔｕＢをコードするＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＢｔｕＢ１から取り去り、プ
ラスミドｐＡＣＹＣ１８４のＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩ部位内にクローニングした。
プラスミドｐＢｔｕＢ２は、複製のｐ１５Ａ起点、クロラムフェニコール耐性、
ｌａｃＩｑ遺伝子を有し、またｂｔｕＢはＰｔｒｃから発現される。

【０１１７】ｂｔｕＣＥＤ遺伝子は、５’末端にＢａｍＨＩ部位および３’末端にＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位を付加するプライマー（配列番号２０、配列番号２１）を用いるＰＣ
Ｒにより大腸菌(E. coli) 染色体ＤＮＡから増幅した。２５５７ｂｐＰＣＲ生成
物を、ｐＡＣＹＣ１８４のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位との間にクローニン
グしてプラスミドｐＣＥＤを生成させた。プラスミドｐＣＥＤは、複製のｐ１５
Ａ起点およびクロラムフェニコール耐性を有する。

【０１１８】プラスミドｐＢＣＥＤを構築するために、ｌａｃＩｑ、Ｐｔｒｃおよびｂｔｕ
ＢをコードするＳｐｈ／ＢａｍＨＩ断片をｐＢｔｕＢ１から取り去り、ｐＣＥＤ
のＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩ部位内にクローニングした。プラスミドｐＢＣＥＤは、
複製のｐ１５Ａ起点、クロラムフェニコール耐性、ｌａｃＩｑ遺伝子、およびｔ
ｒｃプロモーターから下流側の序列ｂｔｕＢＣＥＤ内にｂｔｕＢ遺伝子を有する
。

【０１１９】実施例２Ｂ₁₂輸送およびＤｈａＢ活性のための遺伝子を含む形質転換体大腸菌(E. coli) 株ＦＭ５を、ｄｈａプラスミドｐＤＴ２４（ｓｐｅｃＲ）、
ｂｔｕＢプラスミドｐＢｔｕＢ１（ａｍｐＲ）またはｐＢｔｕＢ２（ｃｈｌＲ）
、またはｂｔｕＢＣＥＤプラスミドｐＢＣＥＤ（ｃｈｌＲ）を用いて形質転換し
た。選択は、５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、５０ｍｇ／Ｌアンピシリンまた
は１００ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上である。適切な抗
生物質に対して耐性のコロニーを１，３−プロパンジオール産生およびビタミン
または補酵素Ｂ₁₂取り込みに使用した。

【０１２０】実施例３ｐＢＣＥＤを用いて形質転換したＦＭ５内での補酵素Ｂ₁₂の取り込み増加適切な株を一晩、３７℃で増殖させ、ブロス２５ｍＬを入れたバッフル付き２
５０ｍＬフラスコ内で２５０ｒｐｍで振とうした〔ブロスは、ＮＨ₄ＯＨを用い
てｐＨ６．８に滴定し、０．２ＭＫＨ₂ＰＯ₄、２．０ｇ／Ｌクエン酸、２．０
ｇ／ＬＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１．２ｍＬ９８％Ｈ₂ ＳＯ₄、０．３０ｇ／Ｌク
エン酸アンモニウム鉄（ＩＩＩ）、０．２０ｇ／ＬＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、５ｍ
Ｌの微量金属混合物、５ｇ／Ｌ酵母抽出液、１０ｇ／ＬＤ−グルコース、およ
び適切な抗生物質を含んでいた。微量金属混合物は、下記を含んでいた（ｇ／Ｌ
）：Ｎａ₂ＳＯ₄（４．０）、ＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ（０．８０）、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂ Ｏ（１．６）、ＣｏＳＯ₄（０．５２）、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ（０．１２）、お
よびＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（４．０）〕。一晩経過した培養物の希釈（１／１００
）は、２５ｍＬＭ９ブロスフラスコ内で行い、増殖はＯＤ₆₆₀が約１．０に達
するまで続けた。ＩＰＴＧを加える場合に、これはこの点で０．２ｍＭまで加え
、培養を１時間続けた。

【０１２１】シアノコバラミン（シアノコバラミン、ＣＮＣｂ１）または補酵素Ｂ₁₂をこの
濃度のＭ９培養物に加えた。補酵素Ｂ₁₂を含むすべての操作は、暗所（赤色光）
内で行った。コバラミンを加えると、直ちに試料１ｍＬを取り出し、細胞をペレ
ット化した。次いで培養物をさらに２５０ｒｐｍで振とうしながら培養し、下記
の表１おおび表２に記載のように終点試料採取まで続けた。

【０１２２】個別の１ｍＬ試料からの細胞を含まない上清をコバラミン定量のためにＨＰＬ
Ｃ分析した。コバラミン定量は、最初に２７８ｎｍおよび３６１ｎｍにおけるピ
ーク面積比を標準と比較し、次いでコバラミンの標準曲線にピーク面積を適用し
て行った。

【０１２３】終点分析には、培地からの細胞分離、引き続いて細胞質からのペリプラズムの
分離を含んでいた。この方法は、本質的にカバックの方法(Kaback, Methods of
Enzymology, vol.22, p99, 1971)に従った。

【０１２４】回収した細胞ペッレットを秤量し、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０を用いて２回
洗浄した。ペレットを１ｇ／８０ｍＬの３０ｍＭトリス、ｐＨ８．０／２０％ス
クロースとして再懸濁した。マグネチックスターラー板上で攪拌している間に、
ＥＤＴＡを１０ｍＭまで、またリゾチームを０．５ｍｇ／ｍＬまで加えた。これ
らの懸濁液を室温で３０分間攪拌した。このリゾチーム／ＥＤＴＡインキュベー
ションに続いて、細胞を凝集させると、予想のように沈殿した。それぞれの沈殿
を１５，０００ｒｐｍで２０分間、４℃でペレット化した。今では希釈されたペ
リプラズムから成る上清を集め、体積を記録し、ＨＰＬＣのための試料を採取し
た。

【０１２５】回収したスフェロプラストペレットを組織ホモジナイザーを用いて３ｍＬの５
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０中でホモジナイズした。ホモジナイズ
の後、ＤｎａｓｅおよびＲｎａｓｅを５ｍｇ／ｍＬとなるように加え、懸濁液を
３７℃の水浴中でインキュベーションした。ＥＤＴＡを１０ｍＭとなるように加
え、インキュベーションをさらに１５分間続けた。ＭｇＳＯ₄を１５ｍＭとなる
ように加え、インキュベーションをさらに１５分間続けた。

【０１２６】得られた懸濁液を３９，０００ｒｐｍで１時間、４℃で超遠心分離した。今で
は希釈された細胞質から成る上清を集め、体積を記録し、ＨＰＬＣのための試料
を採取した。

【０１２７】コバラミンのペリプラズムおよび細胞質濃度は、下記を仮定して算出した：細
胞１μｇ（湿潤重量）は、細胞１，０００，０００個に相当し、細胞の体積は９
ｘ１０^-13ｍＬであり、またペリプラズムの体積は全細胞体積の３０％に等しい
。

【０１２８】表１ＦＭ５株内の５μＭシアノコバラミンの取り込みに対するｐＢｔｕＢ１Ａの影響株時間（時間）ペリプラズム細胞質ＦＭ５１６６μＭ６．５μＭＦＭ５／ｐＢｔｕＢ１１６１９６μＭ４５．０μＭ表２ＦＭ５株内の１０μＭ補酵素Ｂ₁₂の取り込みに対するｐＢＣＥＤの影響株時間（時間）ブロスペリプラズム細胞質ＦＭ５／ｐＢｔｕＢ２０９．７μＭ＋ＩＰＴＧ１６検出限界以下８４０μＭ８２μＭＦＭ５／ｐＢＣＥＤ０１０μＭ＋ＩＰＴＧ１６検出限界以下２８０μＭ１７０μＭ実施例４ｐＢＣＥＤを用いて形質転換したＦＭ５／ｐＤＴ２４からの１，３−プロパンジオールの産生増加大腸菌(E. coli) 株ＦＭ５／ｐＤＴ２４およびＦＭ５／ｐＤＴ２４／ｐＢＣＥ
Ｄを、培地２５ｍＬを含む２５０ｍＬフラスコ内、３０℃、遮光し２５０ｒｐｍ
で振とうして培養した。培地は、ＮＨ₄ ＯＨを用いてｐＨ６．８に滴定し、０．
２ＭＫＨ₂ＰＯ₄、２．０ｇ／Ｌクエン酸、２．０ｇ／ＬＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
、１．２ｍＬ９８％Ｈ₂ＳＯ₄、０．３０ｇ／Ｌクエン酸アンモニウム鉄（ＩＩＩ
）、０．２０ｇ／ＬＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、５ｍＬの微量金属混合物、５ｇ／Ｌ
酵母抽出液、１０ｇ／ＬＤ−グルコース、および３０ｇ／Ｌグリセロールを含
んでいた。微量金属混合物は、下記を含んでいた（ｇ／Ｌ）：Ｎａ₂ＳＯ₄（４．
０）、ＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ（０．８０）、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（１．６）、ＣｏＳ
Ｏ₄（０．５２）、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ（０．１２）、およびＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ（４．０）。さらに、ｐＤＴ２４およびｐＢＣＥＤは、５０μｇ／ｍＬスペク
チノマイシンおよび２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールをそれぞれ必要とした
。

【０１２９】ＦＭ５／ｐＤＴ２４およびＦＭ５／ｐＤＴ２４／ｐＢＣＥＤは、上記のように
して、シアノコバラミン、ヒドロキソコバラミン（ヒドロキシＢ₁₂）、または補
酵素Ｂ₁₂を最終濃度が０．４０μＭまたは４．０μＭのいずれかになるように加
えて増殖させた。フラスコに、最初の濃度ＯＤ₆₀₀が約０．０１ＡＵとなるよう
に接種し、ｐＨはｐＨ値６．２以上となるように０．５ＮＫＯＨを加えて維持
し、またグルコース濃度は５０％（ｗ／ｗ）溶液を加えて２ｇ／Ｌ以上に維持し
た。ｐＨは、カラーファストストリップ(ColorpHast strip, EM Science, Gib
bstown, NJ) を用いて監視した。グルコース濃度はトリンダー酵素アッセー(Tri
nder enzymatic assay, Sigma, St. Louis, MO) を用いて監視した。種々の時点
で、３Ｇ濃度（ｈｐｌｃ分析）および細胞密度（ＯＤ₆₀₀）を測定するために、
試料を取り出した。結果を下記の表３および４に示す。

【０１３０】

【表１】

【０１３１】

【表２】

【０１３２】

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ａ (72)発明者ホワイテド，グレゴリー・エムアメリカ合衆国カリフオルニア州94002ベルモント・サウスロード304 (72)発明者ブルトフイス，ベンオランダ・エヌエル−2300エイジーライデン・ポストブス251・アインシユタインベーク101 (72)発明者トリムバー，ドナルド・イーアメリカ合衆国カリフオルニア州94601レツドウツドシテイ・オーチヤードアベニユー349 (72)発明者ガテンビイ，アンソニー・エイアメリカ合衆国デラウエア州19802ウイルミントン・ベイナードブールバード2309 Ｆターム(参考） 4B024 BA07 BA08 BA63 BA80 DA06 DA11 DA12 GA11 GA19 HA03 4B064 AC05 CA02 CA05 CA06 CA19 CC03 CC24 CD12 DA16 4B065 AA01X AA01Y AA23X AA23Y AA26X AA29X AA29Y AA30X AA41X AA46X AA46Y AA50X AA60X AA66X AA72X AA74X AA76X AA77X AA79X AA82X AB01 AC14 BA02 BB06 BB07 BB12 BB13 BB15 BB17 BB18 CA05 CA27 CA28 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ｉ）形質転換された宿主細胞を、少なくとも１種の発酵可
能な炭素源およびビタミンＢ₁₂の有効量と接触させ、これにより１，３−プロパ
ンジオールが産生され、形質転換された宿主細胞が、（ａ）脱水酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１種の
コピー、（ｂ）酸化還元酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１
種のコピー、（ｃ）ビタミンＢ₁₂受容体前駆体タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１
種のコピー、（ｄ）ビタミンＢ₁₂輸送系透過酵素タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも
１種のコピー、および（ｅ）ビタミンＢ₁₂輸送ＡＴＰ−またはＧＴＰ−結合タンパク質をコードする遺
伝子の少なくとも１種のコピー、を含んでおり、ここで、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の遺伝子のいずれかの少なくとも１種のコ
ピーが宿主細胞中に導入され、そして（ｉｉ）段階（ｉ）から産生された１，３−プロパンジオールを回収することを含んでなる、１，３−プロパンジオールの生物による製造方法。
【請求項２】段階１（ａ）の脱水酵素活性を有するタンパク質をコードす
る遺伝子が、グリセロール脱水酵素およびジオール脱水酵素から成る群から選択
される酵素をコードする、請求項１の方法。
【請求項３】１（ａ）および１（ｂ）の遺伝子が、クレブシエラ種(Klebs
iella sp.)、シトロバクター種(Citrobacter sp.)、サルモネラ種(Salmonella s
p.)またはクロストリジウム種(Clostridium sp.)から独立して単離される、請求
項１の方法。
【請求項４】１（ｃ）、１（ｄ）および１（ｅ）の遺伝子が、エシェルキ
ア種(Escherchia sp.)、サルモネラ種(Salmonella sp.)、クレブシエラ種(Klebs
iella sp.)、シュードモナス種(Pseudomonas sp.)、またはシトロバクター種(Ci
trobacter sp.)から独立して単離される、請求項１の方法。
【請求項５】（ｉ）（ｉ）（ｃ）の遺伝子が，配列番号１および配列番
号２から成る群から選択されるｂｔｕＢ遺伝子であり、（ｉｉ）（ｉ）（ｄ）の遺伝子が、配列番号３のｂｔｕＣ遺伝子である、そし
て（ｉｉｉ）（ｉ）（ｅ）の遺伝子が、配列番号４のｂｔｕＤ遺伝子である請求項１の方法。
【請求項６】発酵可能な炭素源が、発酵可能な炭水化物、単一炭素基質、
およびこれらの混合物から成る群から選択される、請求項１の方法。
【請求項７】発酵可能な炭素源が、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、単一炭
素基質、グリセロール、ジヒドロキシアセトンおよび炭素含有アミンから成る群
から選択される、請求項１の方法。
【請求項８】形質転換された宿主細胞が、さらにグリセロール−３−リン
酸−脱水素酵素をコードする少なくとも１種のコピーおよびグリセロール−３−
ホスファターゼ酵素をコードする少なくとも１種のコピーを含んでいる、請求項
１の方法。
【請求項９】宿主細胞が、細菌、酵母、および糸状菌から成る群から選択
される、請求項１の方法。
【請求項１０】宿主細胞が、シトロバクター(Citrobacter)、エンテロバ
クター(Enterobacter)、クロストリジウム(Clostridium)、クレブシエラ(Klebsi
ella)、アエロバクター(Aerobacter)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、アスペ
ルギルス(Aspergillus)、サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス
(Schizosaccharomyces)、ジゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)、ピヒア(Pic
hia)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)、ハンセヌラ(Han
senula)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ムコール(Mucor)、トルロプシス(Tor
ulopsis)、メチロバクター(Methylobacter)、エシェルキア(Escherchia)、サル
モネラ(Salmonella)、バチルス(Bacillus)、ストレプトミセス(Streptomyces)お
よびプシュードモナス(Pseudomonas)から成る属の群から選択される、請求項９
の方法。
【請求項１１】ビタミンＢ₁₂の有効量が、存在する脱水酵素の量に対して
０．１から１０．０倍のモル比である、請求項１の方法。
【請求項１２】（ａ）脱水酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝
子の少なくとも１種のコピー、（ｂ）酸化還元酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１
種のコピー、（ｃ）ビタミンＢ₁₂受容体前駆体タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１
種のコピー、（ｄ）ビタミンＢ₁₂輸送系透過酵素タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも
１種のコピー、および（ｅ）ビタミンＢ₁₂輸送ＡＴＰ−またはＧＴＰ−結合タンパク質をコードする遺
伝子の少なくとも１種のコピー、を含んでおり、ここで、（ｉ）（ｃ）、（ｉ）（ｄ）および（ｉ）（ｅ）の遺伝子の少なくとも
１種のコピーが宿主細胞中に導入される、形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】（ｉ）形質転換された宿主細胞を、（ａ）単糖類、オリゴ
糖類、多糖類、単一炭素基質、グリセロール、ジヒドロキシアセトンおよび炭素
含有アミンから成る群から選択される、少なくとも１種の発酵可能な炭素源およ
び（ｂ）ビタミンＢ₁₂の有効量と接触させ、これにより１，３−プロパンジオー
ルが産生され、形質転換された宿主細胞が、（ａ）脱水酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１種の
コピー、（ｂ）酸化還元酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１
種のコピー、（ｃ）ビタミンＢ₁₂受容体前駆体タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１
種のコピー、（ｄ）ビタミンＢ₁₂輸送系透過酵素タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも
１種のコピー、および（ｅ）ビタミンＢ₁₂輸送ＡＴＰ−またはＧＴＰ−結合タンパク質をコードする遺
伝子の少なくとも１種のコピー、（ｆ）グリセロール−３−リン酸−脱水素酵素活性を有するタンパク質をコード
する遺伝子の少なくとも１種のコピー、および（ｇ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする
遺伝子の少なくとも１種のコピーを含んでおり、ここで、（ｉ）（ｃ）、（ｉ）（ｄ）および（ｉ）（ｅ）の遺伝子のいずれかの
少なくとも１種のコピーが宿主細胞中に導入され、そして（ｉｉ）段階（ｉ）から産生された１，３−プロパンジオールを回収することを含んでなる、１，３−プロパンジオールの生物による製造方法。