JPH11502718A

JPH11502718A - 単一微生物による発酵性炭素源の１，３−プロパンジオールへの生物転化

Info

Publication number: JPH11502718A
Application number: JP8534295A
Authority: JP
Inventors: ラッフェンド，リサ，アン; ナガラジャン，ヴァサンサ; ナカムラ，チャールズ，エドウィン
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Priority date: 1995-05-12
Filing date: 1996-05-10
Publication date: 1999-03-09
Anticipated expiration: 2016-05-10
Also published as: JP3403412B2; EP0826057A1; KR100525325B1; IN189532B; AU725012B2; KR19990014710A; AR001934A1; DE69637824D1; CN1500877A; KR100567274B1; CN100506991C; CN102304551A; IL118169A0; CN1189854A; EP0826057B1; AU5678996A; CA2220880A1; US6025184A; ZA963737B; US5686276A

Abstract

(57)【要約】活性グリセロールデヒドラターゼ酵素または活性ジオールデヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子を含有する微生物を用い、これらの生物を適当な発酵条件下で炭素基質と接触させることによる、単一の生物による炭素基質の、１，３−プロパンジオールへの生物転化のための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】単一微生物による発酵性炭素源の１，３−プロパンジオールへの生物転化発明の技術分野本発明は、単一微生物による発酵性炭素源の１，３−プロパンジオールへの生物変換(bioconversion)に関する。発明の技術背景１，３−プロパンジオールは、ポリエステル繊維の製造およびポリウレタンおよび環状化合物の製造における潜在的用途を有するモノマーである。１，３−プロパンジオールへの種々の化学的経路が知られている。例えば、エチレンオキサイドは、ホスフィン酸、水、一酸化炭素、水素および酸の存在下で触媒によって、アクロレインの触媒溶液相水和に続いて行われる還元によって、あるいは、グリセロール等の炭化水素から、一酸化炭素および水素の存在下で、周期表のVIII族の原子を有する触媒によって反応させることによって１，３−プロパンジオールへ変換することができる。１，３−プロパンジオールはこれらの方法によって得ることが可能であるものの、それらは費用がかかり、かつ、環境汚染物質を含有する廃物流を生ずる。一世紀も前から、１，３−プロパンジオールがグリセロールの発酵から得られることが知られている。１，３−プロパンジオールを産生可能な細菌株が、例えば、シトロバクター(Citrobacter)属、クトストリジウム(Clostridium)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、イリオバクター(Ilyobacter)属、クレプシエラ (Kleobsiella)属、ラクトバシルス(Lactobacillus)属およびペロバクター(Pelob acter)属において見出されている。研究されている各ケースでは、グリセロールは２工程の酵素触媒反応手順で１，３−プロパンジオールに変換される。第１の工程では、デヒドラターゼ(dehydratase)が、グリセロールの、３−ヒドロキシルプロピオンアルデヒド（３−ＨＰ）および水への変換（式１）を触媒する。第２の工程では、３−ＨＰが、ＮＡＤ⁺連結オキシドレダクターゼ(NAD⁺-lin ked oxidoreductase)によって１，３−プロパンジオールへと還元される（式２）。グリセロール → ３−ＨＰ＋Ｈ₂Ｏ（式１）３−ＨＰ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺→ １，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ⁺ （式２）この１，３−プロパンジオールは、それ以上は代謝されず、その結果、高濃度で培地に蓄積する。反応全体としては、補助因子(cofactor)の形態で還元当量の還元されたβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）が消費され、これは、酸化されてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ⁺）になる。グリセロールからの１，３−プロパンジオールの製造は、一般に、嫌気性条件下で、グリセロールを唯一の炭素源として用いて、他の外来の還元当量受容体の不在下で行われる。これらの条件下では、例えば、シトロバクター、クロストリジウムおよびクレプシエラの菌株において、グリセロールについての平行経路が働くが、この経路には、まず最初に、ＮＡＤ⁺（またはＮＡＤＰ⁺）結合グリセロールデヒドロゲナーゼにより、グリセロールをジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）へ酸化すること（式３）が包含される。このＤＨＡは、続いてＤＨＡキナーゼによるジヒドロキシアセトンホスフェート（ＤＨＡＰ）へのリン酸化（式４）を行うことによって、生合成に、そして、例えば、解糖を経由するＡＴＰ生成の支援に利用できる。この１，３−プロパンジオール経路とは対照的に、本発明の経路は、炭素およびエネルギーを細胞に付与し、かつＮＡＤＨを消費するのではなく、ＮＡＤＨを生成する。グリセロール＋ＮＡＤ⁺ → ＤＨＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺ （式３）ＤＨＡ＋ＡＴＰ → ＤＨＡＰ＋ＡＤＰ（式４）クレプシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)およびシトロバクター・フロインディイ(Citrobacter freundii)では、グリセロールデヒドラターゼ、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼおよびジヒドロキシアセトンキナーゼの機能的に結合した活性(functionally linked activities)をコードする遺伝子（それぞれ、順に、ｄｈａＢ、ｄｈａＴ、ｄｈａＤ、ｄｈａＫ）は、ｄｈａレギュロンによって包含される。シトロバクターおよびクレプシエラ由来のｄｈａレギュロンは大腸菌(Escherichia coli)内で表現されており、かつ、グリセロールを１，３−プロパンジオールへと変換することが示されている。グリセロール製造のための生物学的方法は公知である。圧倒的大多数のグリセロール産生者は酵母であるが、幾つかの細菌、他の真菌および藻類も知られている。細菌および酵母はともに、グルコースまたは他の炭水化物を、解糖におけるフルクトース−１，６−ビスホスフェート経路によって、あるいはエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路によって、グリセロールを産生するが、一方、特定の藻類は、葉緑体内で、溶解した二酸化炭素または重炭酸塩をカルビン回路の３− 炭素中間体(3-carbon intermediates)へと変換する。一連の工程において、この３−炭素中間体であるホスホグリセリン酸は、グリセルアルデヒド３−ホスフェートに変換され、これは、そのケト異性体であるジヒドロキシアセトンへ、そして最終的にはグリセロールへと容易に相互変換することが可能である。グリセロールおよび１，３−プロパンジオールを製造する生物学的方法はそれぞれ公知であるが、全体のプロセスが単一の生物によって達成可能であることは未だに証明されていない。１，３−プロパンジオール製造のための上記の化学的方法および生物学的方法のどちらも、工業的規模での製造にはそれ程好適ではない。その理由は、化学的方法はエネルギーを多く消費するものであり、生物学的方法は高価な出発原料であるグリセロールを必要とするからである。低エネルギーの投入および安価な出発原料しか必要としない方法が必要とされている。さらに望ましい方法は、炭水化物または糖などの基本的な炭素源を所望の１，３−プロパンジオール最終生成物へと変換する能力を有する微生物を取りいれたものであろう。グリセロールまたはジヒドロキシアセトン以外の発酵性炭素源を１，３−プロパンジオールへ単一生物を用いて転化することが望ましいが、そのような試みには著しい困難を克服しなければならないことが実証されている。例えば、Gottsc halkら（欧州特許第373230号）は、１，３−プロパンジオール製造に有用な大部分の菌株、例えば、シトロバクター・フロインディイ(Citrobacter freundii)、クロストリジウム・オートブチリカム(Clostridium autobutylicum)、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butylcum)およびクレプシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)の増殖が、フルクトースやグルコース等の水素供与体の存在によって阻害されることを教示している。ラクトバシルス・ブレビス(L actobacillus brevis)およびラクトバシルス・ブフナー(Lactobacillus buchner )の菌株は、グリセロールとフルクトースまたはグルコースとの共発酵(co-ferme ntations)において１，３−プロパンジオールを生産するが、グリセロールが唯一の炭素源として供給された場合には増殖せず、かつ、休止細胞はグルコースまたはフルクトースを代謝できることがわかっているけれども、それらは１，３− プロパンジオールを産生しない(Viega DA Cunhaら、J．Bacteriol．174，1013， (1992))。同様に、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytropus)の菌株は、グリセロールおよびアセテートが供給された場合には１，３−プロパンジオールを産生するが、グリセロール以外の炭素基質（フルクトースおよびグルコースを含む）からは１，３−プロパンジオールを産生しない（Steib ら、Arch． Microbiol．140，139(1984)）最後に、Tongら（Appl．Biochem．Biotech．34，1 49(1992)）は、グリセロールデヒドラターゼをコードするｄｈａレギュロンで形質転換された組換え大腸菌が、外来性グリセロール不在下ではグルコースからもキシロースからも１，３−プロパンジオールを産生しないことを教示している。グリセロールからの１，３−プロパンジオールの収率を改善するための試みが報告されており、そこにおいて、還元当量を提供することが可能な補助基質(co- substrates)、典型的には発酵性糖類、がその方法に含まれる。収率の改善は、グリセロールとグルコースとを共発酵する(co-fermenting)シトロバクター・フロインディイおよびクレプシエラ・ニューモニエDSM4270 の休止細胞について権利請求されている（Gottschalkら、前出；およびTran-Dinh ら、独国特許第37 34764 号）。しかし、権利請求されているのはグリセロールとグルコースとを共発酵するクレプシエラ・ニューモニエATCC25955 の増殖細胞についてではなく、それらは、１，３−プロパンジオールを全く産生しない(I-T．Tong，Ph.D．Thes is，University of Wisconsin-Madison(1992))。高い収率は、組換え大腸菌によるグリセロールとグルコースまたはフラクトースとの共発酵について報告されている。しかし、１，３−プロパンジオールは、グリセロールの不在下では全く産生されない（Tongら、前出）。これらの系において、単一の生物は、ＮＡＤＨ生成源として炭水化物を用いるが、細胞の維持または増殖のためのエネルギーおよび炭素を供給しながらである。これらの開示は、糖類が、１，３−プロパンジオールを生成する炭素の流れに入らないことを示唆する。いずれの場合もグリセロールの外来性供給源の不在下においては、決して１，３−プロパンジオールは産生されない。したがって、文献の重要性から、明らかに、単一の生物による１，３−プロパンジオールの炭水化物源からの産生が不可能であることが示唆される。本発明により解決すべき問題は、単一の生物によるグルコースまたは他の糖類のような安価な炭素基質からの１，３−プロパンジオールの生物学的産生である。この１，３−プロパンジオールの生物学的産生は、グリセロールを、２工程の連続反応のための基質として必要とし、その反応において、デヒドラターゼ酵素（典型的には補助酵素Ｂ₁₂依存性デヒドラターゼ）が、グリセロールを中間体である３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへと変換し、さらにＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）依存性オキシドレダクターゼによって１，３−プロパンジオールへと還元される。補助因子の要件が複雑なので、１，３−プロパンジオール製造のための本発明の反応手順を用いる工業的方法では全細胞触媒(whole cell cataly st)を用いることが必要となる。さらに、この方法を経済的に採算が合うようにするために、グリセロールやヒドロキシアセトンよりも安価な原料が必要となる。グルコースおよび他の炭水化物は好適な基質であるが、上述のように、１，３ −プロパンジオールの産生を阻害することがわかっている。その結果、単一の生物では、グルコースを１，３−プロパンジオールへと変換しないことが示されていた。本出願人は、上述の問題を解決し、本発明は、単一の生物を用いて、発酵性炭素源を１，３−プロパンジオールへ直接的に生物変換することを提供する。グルコースは、モデル基質として用いられ、この生物変換は、あらゆる既存の微生物に適用可能である。デヒドラターゼに対する遺伝子を有する微生物は、グルコースおよび他の糖類を、グリセロール分解経路を経て、１，３−プロパンジオールへ、良好な収率および選択性で変換することができる。さらに、本発明は、１）グリセロール、２）ジヒドロキシアセトン、または３）グリセロールの酸化状態にあるＣ₃化合物（例えば、グリセロール３−ホスフェート）または４）ジヒドロキシアセトンの酸化状態にあるＣ₃化合物（例えば、ジヒドロキシアセトンホスフェートまたはグリセロアルデヒド３−ホスフェート）に容易に変換されるあらゆる炭素基質に広く適用することができる。発明の要旨本発明は、デヒドラターゼ酵素を表現可能な遺伝子を少なくとも１種有する単一な微生物による、炭素基質の１，３−プロパンジオールへの生物変換方法であって、前記微生物を前記基質と接触させる工程による生物変換方法を包含する。この微生物は、野生型であってもよく、あるいは遺伝的に改変されていてもよく、例えば、組換え微生物または微生物の突然変異体が挙げられる。好ましくは、上記デヒドラターゼ酵素は、グリセロールデヒドラターゼ酵素またはジオールデヒドラターゼ酵素である。本発明は、さらに、上記方法の生産物を包含する。本発明は、さらに、クレプシエラ・ニューモニエから単離された約３５ｋｂのＤＮＡ断片を含有するコスミドであって、前記断片が、図１の第１および第２カラムの制限消化を有する活性グリセロールデヒドラターゼ酵素をコードしていることを特徴とするコスミドを包含する。このコスミドは、微生物に伝達されると、炭素基質、特に、グルコース、の１，３−プロパンジオールへの代謝を可能にする。本発明は、さらに、宿主微生物と、上記コスミドまたはグリセロールデヒドラターゼ酵素以外の活性機能性タンパク質をコードする上記コスミドのＤＮＡ断片とを含有する形質転換された微生物を包含する。本発明は、さらに、好適な条件下で、グリセロールを、デヒドラターゼ酵素を発現可能な遺伝子を少なくとも１種有する単一の微生物と接触させる工程を具える、１，３−プロパンジオールを製造するための生物変換方法であって、上記微生物が、アスペルギルス(Aspergillus)属、サッカロミセス(Saccharomyces)属、ジゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)属、ピヒア(Pichia)属、クリベロミセス(Kluyveromyces)属、カンジダ(Candida)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、デバリオミセス(Debaryomyces)属、ムーコル(Mucor)属、トルロプシス(Torulopsis) 属、メチロバクター(Methylobacter)属、サルモネラ(Salmonella)属、バシルス( Bacillus)属、ストレプトミセス(Streptomyces)属、およびシュードモナス(Pseu domonas)属からなる群から選ばれることを特徴とする方法を包含する。本発明は、さらに、好適な条件下で、炭素基質を、デヒドラターゼ酵素を表現可能な遺伝子を少なくとも１種有する単一の微生物と接触させる工程を具える、１，３−プロパンジオール製造のための生物変換方法であって、上記遺伝子がグリセロールデヒドラターゼをコードし、かつクレプシエラ属、ラクトバシルス属、エンテロバクター属、シトロバクター属、ペロバクター属、イリオバクター属、およびクロストリジウム属からなる群から単離されることを特徴とする方法を包含する。本発明は、さらに、適当な条件下で、炭素基質を、デヒドラターゼ酵素を表現可能な遺伝子を少なくとも１種有する単一の微生物と接触させる工程を具える、１，３−プロパンジオール製造のための生物変換方法であって、上記遺伝子が、グリセロールデヒドラターゼをコードし、かつクレプシエラ属およびサルモネラ属からなる群から単離されることを特徴とする方法を包含する。好ましい宿主微生物は、シトロバクター属、エンテロバクター属、クロストリジウム属、クレプシエラ属、エロバクター(Aerobacter)属、ラクトバシルス属、アスペルギルス属、サッカロミセス属、ジゴサッカロミセス属、ピヒア属、クリベロミセス属、カンジダ属、ハンゼヌラ属、デバリオミセス属、ムーコル属、トルロプシス属、メチロバクター属、エシェリキア(Escherichia)属、サルモネラ属、バシルス属、ストレプトミセス属およびシュードモナス属からなる群から選ばれる。本発明を具体化する組換え微生物は、「生物学的寄託の簡単な説明」で述べる。図面の簡単な説明図１は、それぞれカラム１、２および４として標識したコスミドｐｋＰ１、ｐＫＰ２およびｐＫＰ４の制限消化（ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩ）および０．８％アガロースゲル電気泳動での分離を示す。分子サイズマーカーは、最後のレーンに装荷した。１および２として標識したカラムは、グリセロールデヒドラターゼ酵素を含有するコスミドを表わす。図２は、ｐＫＰ１の部分的な物理的地図およびＤＮＡ配列に基づく遺伝子の位置を示す。遺伝子は、ウイスコンシン大学の塩基配列分析ソフトウエアにより提供されるTfastaプログラム［Genetics Computer Group，Version 7，April，199 1，575，Science Device、Madison，WI53711］を用いて、推定したオープン・リーディング・フレームを、ジーンバンク(Genbank)のデータベースと比較することによって同定した。生物学的寄託および配列表の簡単な説明グリセロールデヒドラターゼ酵素をコードするクレプシエラゲノムの一部を含有するコスミドｐＫＰ１を含有する形質転換した大腸菌ＤＨ５αは、ブダペスト条約に基づき１９９５年４月１８日付でＡＴＣＣに寄託し、ATCC69789 に指定された。ジオールデヒドラターゼ酵素をコードするクレプシエラのゲノムの一部を含有するコスミドｐＫＰ４を含有する形質転換した大腸菌ＤＨ５αは、ブダペスト条約に基づき１９９５年４月１８日付でATCCに寄託し、ATCC69790 に指定された。緑膿菌［シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)］株PAO2 845:pDT9（ｄｈａＢオペロンを含有するプラスミドで形質転換されている）は、ブダペスト条約に基づき１９９６年４月１１日付でＡＴＣＣに寄託し、ATCC5576 0 に指定された。ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)株MSP42.81（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３およびｄｈａＴ遺伝子のための表現カセットを含有する非複製性プラスミドで形質転換されている）は、ブダペスト条約に基づき１９９６年４月１１日付でATCCに寄託し、ATCC74363 に指定された。サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株pMCK1/10/17(HM)#A（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３およびｄｈａＴオペロンを含有するプラスミドで形質転換されている）は、本国際出願の提出前に、１９９６年５月９日付でブダペスト条約に基づきＡＴＣＣに寄託し、ATCC74370 に指定された。ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)株SL/14.2(ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３およびｄｈａＴオペロンを含有するプラスミドで形質転換されている) は、本国際出願の提出前に、１９９６年５月９日付でブダペスト条約に基づきＡＴＣＣに寄託し、ATCC98052 に指定された。バシルス・リヘニフォルミス(Bacil lus licheniformis)株BG188/pM26（クローン＃８）（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、およびｄｈａＢ３オペロンを含有するプラスミドで形質転換されている）は、本国際出願の提出前に、１９９６年５月９日付でブダペスト条約に基づきＡＴＣＣに寄託し、ATCC98051 に指定された。枯草菌［バシルス・サチリス(Bacillus su btilis)］株BG2864/pM27(クローン＃１)（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３およびｄｈａＴオペロンを含有するプラスミドで形質転換されている）は、本国際出願の提出前に、１９９６年５月９日付でブダペスト条約に基づきＡＴＣＣに寄託し、ATCC98050 に指定された。アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger )株TGR40-13（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３およびｄｈａＴオペロンを含有するプラスミドで形質転換されている）は、本国際出願の提出前に、１９９６年５月９日付でブダペスト条約に基づきＡＴＣＣに寄託し、ATCC74369 に指定された。「ＡＴＣＣ」とは、国際寄託機関である「アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (American Type Culture Collection)」(所在地：12301 Parklawn Drive，Rockv ile，MD 20852 U.S.A.)をいう。「指定(desingations)」とは、寄託物質の受託番号をいう。本出願人は、「特許出願におけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列の標準表記のための規則(Ruls for the Standard Representation of Nucleotide and Amin o Acid Sequences in Patent Applications)」（「ＥＰＯ長官の決定(Decision of the President of the EPO)」の別冊ＩおよびII）、および37C.F.R.1.821-1. 825 と追補ＡおよびＢ（「ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含有する出願開示の要件(Requirements、for Application Disclosures Containing Nucl eotides and/or Amino Acid Sequences)」）に従って４６種の配列を提供している。発明の詳細な説明本発明は、単一微生物における、１，３−プロパンジオールの、発酵性炭素源からの生物学的製造方法を提供する。この方法は、炭素源と接触させるデヒドラターゼ酵素含有微生物を組み入れ、１，３−プロパンジオールは、増殖培地から単離される。この単一の微生物は、野生型であってもよく、あるいは、デヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子を含有する遺伝的に改変された生物であってもよい。本発明は、ポリエステルおよび他のポリマーの製造に有用な１，３−プロパンジオールモノマーの、迅速で、安価で、かつ環境問題に責任を果たせる供給源を提供する。ここで用いられているように、請求の範囲および明細書を説明するために、以下の用語を用いてもよい。ここで用いられているように、「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖であってもよく、糖と、リン酸と、プリンまたはピリミジンとを含有するモノマー（ヌクレオチド）からなる大きな分子をいう。「核酸断片」という用語は、特定の核酸分子の断片である。高等植物では、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が遺伝物質であり、一方、リボ核酸（ＲＮＡ）がＤＮＡ中の情報のタンパク質への伝達に関与している。「ゲノム」は、生物の各細胞に含有される遺伝物質の全体である。「ヌクレオチド配列」という用語は、一本鎖または二本鎖であってもよく、ＤＮＡまたはＲＮＡへの組み込みが可能な合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を場合によっては含有するＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーをいう。ここで用いられるように、「本質的に類似する」とは、コードされたアミノ酸における変化をもたらさない塩基の変化を含んでいてもよいＤＮＡ配列、あるいは、１個以上のアミノ酸を改変してもよいが、そのＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の機能的特性に影響を及ぼさない塩基の変化を含むＤＮＡ配列をいう。したがって、本発明は、具体的に例示した配列以上のものを包含すると理解される。表面に現れない変化（得られるタンパク質分子の機能的特性に実質的に影響を及ぼさない変化）を生ずる配列の修飾（例えば、配列における欠失、挿入、または置換）も考慮される。例えば、遺伝子コードの縮退を反映する、あるいは最終的には特定の部位で化学的に同等のアミノ酸を産生する遺伝子配列における改変が考慮される。したがって、アミノ酸のアラニン（疎水性アミノ酸）に対するコドンは、別のより疎水性の弱い残基（例えば、グリシン）またはより疎水性が強い残基（例えば、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）をコードするコドンで置換してもよい。同様に、１個の負に帯電した残基の他の残基への置換（例えば、アスパラギン酸からグルタミン酸への置換）、または１個の正に帯電した残基の他の残基への置換（例えば、リジンのアルギニンへの置換）をもたらす変化により、生物学的に同等の生成物が産生されることが予想できるであろう。タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部分の改変をもたらすヌクレオチドを変化させても、タンパク質の活性が変わらないことも予想できるであろう。幾つかの場合では、事実、タンパク質の生物学的活性に対する改変の効果を研究するために、配列の突然変異体をつくることが望ましいかもしれない。提案された修飾の各々は、十分に当業者の慣例手順の範囲内であり、例えば、コードされた生成物において生物学的活性が保持されているか否かを測定することなどが挙げられる。さらに、当業者であれば、本発明に包含される「本質的に同様の」配列は、緊縮（ストリンジェント）条件下（０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５ ℃）で、ここにおいて例示した配列とハイブリッド形成する能力によっても定義されることがわかる。「遺伝子」とは、コード領域の前方（５′をコードしない）および後方（３′ をコードしない）の調節配列を含む、特定のタンパク質を表現する核酸断片をいう。「生の(native)」あるいは「野生型の」遺伝子とは、それ自身の調節配列を有する、天然に見出される遺伝子をいう。「遺伝的に改変された」または「遺伝的に改変された微生物」という用語は、本発明における使用に適したあらゆる微生物であり、これは、該微生物の天然の遺伝的機構の改変を受けているものである。微生物は、異種の核酸断片を含有するベクターによる形質転換、突然変異誘発剤（例えば、ＵＶ光、エタンスルホン酸）による突然変異誘発、または細胞ゲノムの安定な改変をもたらす他の方法によって、遺伝的に改変されてもよい。「構築」という用語は、あらゆる供給源に由来するプラスミド、ウイルス、自律複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、直鎖状または環状の、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであって、幾つかのヌクレオチド配列が、選択した遺伝子生産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適当な３′非翻訳配列と一緒に細胞に導入できる独特の構造に結合または組換えられている。「形質転換」または「トランスフェクション」という用語は、核酸の取込み後の細胞における新たな遺伝子の獲得をいう。獲得した遺伝子は、染色体ＤＮＡに組み込まれるか、あるいは、染色体外複製配列として導入されてもよい。「形質転換体」とは、形質転換の生成物をいう。「遺伝的に改変される」とは、形質転換または突然変異によって遺伝的物質を変化させる工程をいう。「表現」という用語は、遺伝子生成物の配列をコードする遺伝子から該遺伝子生成物への転写および翻訳をいう。ここで用いられるような「プラスミド」または「ベクター」または「コスミド」とは、細胞の中心的代謝の一部ではなく、かつ通常は環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態である、遺伝子をしばしば担持する染色体外のエレメントをいう。「デヒドラターゼ酵素」という用語は、グリセロール分子を生成物である３− ヒドロキシプロピオンアルデヒドへと異性化または転化することが可能なあらゆる酵素をいう。本発明の目的では、このデヒドラターゼ酵素としては、それぞれグリセロールおよび１，２−プロパンジオールを好ましい基質とするグリセロールデヒドラターゼおよびジオールデヒドラターゼが挙げられる。「炭素基質」または「炭素源」という用語は、微生物によって代謝され得るあらゆる炭素供給源であって、少なくとも１個の炭素原子を含有し、グリセロールまたはジヒドロキシアセトン以外のものを意味する。組換え生物の構築炭素基質を１，３−プロパンジオールに転化するための酵素的経路をコードする必要な遺伝子を含有する組換え生物は、当業界で周知の技術を用いて構築することができる。本発明では、デヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子は、クレプシエラ等の天然のままの宿主から単離し、これを用いて、大腸菌宿主株ＤＨ５α 、ECL707およびAA200 を形質転換した。所望の遺伝子を細菌ゲノムから得る方法は、分子生物学の業界では周知慣用である。例えば、遺伝子の配列が既知の場合、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適当なゲノムライブラリーを作成してもよく、所望の遺伝子配列に相補的なプローブを用いてスクリーニングしてもよい。いったん配列を単離したら、ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）（米国特許第4,683,202 号）のような標準プライマー誘導増幅方法を用いてＤＮＡを増幅して、適当なベクターを用いた形質転換に適した量のＤＮＡを得てもよい。あるいはまた、ゲノムＤＮＡの大きなセグメント（３４〜４５ｋｂ）がベクターにパッケージされていてもよいコスミドライブラリーを作成して、適当な宿主を形質転換してもよい。コスミドベクターは、大量のＤＮＡを収容可能である点において独特である。一般に、コスミドベクターはｃｏｓＤＮＡ配列の少なくとも１個のコピーを有し、これは、外来ＤＮＡのパッケージングおよび続いて行われる環化に必要である。このcos 配列に加えて、これらのベクターは、複製起点（例えば、ＣｏｌＥ１）および薬剤耐性マーカー（例えば、アンピシリンまたはネオマイシン耐性遺伝子）も含有する。好適な細菌宿主の形質転換のためのコスミドベクターを用いる方法は、Sambrook，J らのMolecular Cloning:A Laboratory Manual ．Second Edition(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory P ressに十分に記載されており、引用することにより本明細書の一部を構成するものとする。クローンコスミドに典型的に行われているように、外来ＤＮＡを単離し、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いてコスミドベクターのｃｏｓ領域に隣接して連結する。直鎖状にした外来ＤＮＡを含有するコスミドベクターは、次に、バクテリオファージλ等のＤＮＡパッケージングビヒクルと反応させる。このパッケージング工程を行う際に、ｃｏｓ部位を切り出し、外来ＤＮＡを細菌ウイルス粒子の頭部にパッケージする。次いで、これらの粒子を用いて、大腸菌等の適当な宿主細胞をトランスフェクトする。この外来ＤＮＡは、いったん細胞に注入されると、ｃｏｓ付着末端の影響で環化する。このようにして、外来ＤＮＡの大きなセグメントを組換え宿主細胞に導入し発現することができる。コスミドベクターおよびコスミド・形質転換方法は、本発明の文脈の範囲内で用いて、グリセロールを１，３−プロパンジオールへと加工することができる遺伝子を有することが知られている細菌の属由来のゲノムＤＮＡの大きなセグメントをクローニングした。具体的には、Ｋ．ニューモニエ由来のゲノムＤＮＡを当業界で周知の方法により単離して、コスミドベクターSupercosl(商標)へ挿入するための制限酵素Sau3A で消化して、GigapackIIパッケージング抽出物を用いてパッケージングした。ベクターを構築した後、大腸菌XL1-BlueMR細胞をコスミドＤＮＡで形質転換した。グリセロールを１，３−プロパンジオールに転化する能力について、形質転換体を、グリセロールの存在下で細胞を増殖し、そして１，３−プロパンジオールが形成されているか否か培地を分析することによってスクリーニングした。１，３−プロパンジオール陽性形質転換体のうち２つを分析し、これらのコスミドをｐＫＰ１およびｐＫＰ２と命名した。ＤＮＡ配列決定により、Ｃ．フロインディイ由来のグリセロールデヒドラターゼ遺伝子に対する広範囲の相同性が判明し、これらの形質転換体がグリセロールデヒドラターゼ遺伝子をコードするＤＮＡ含有することが証明された。他の１，３−プロパンジオール陽性形質転換体を分析し、これらのコスミドをｐＫＰ４およびｐＫＰ５と命名した。ＤＮＡ配列決定により、これらのコスミドがジオールデヒドラターゼ遺伝子をコードするＤＮＡ担持することが判明した。本発明はクレプシエラのコスミド内から単離した遺伝子を用いたが、別のデヒドラターゼ遺伝子の供給源としては、シトロバクター、クロストリジウムおよびサルモネラが挙げられる。しかし、これらに限定されるものではない。１，３−プロパンジオールの生産に正の影響を与える他の遺伝子を適当な宿主内で表現させてもよい。例えば、特定の酵素を、グリセロール分解経路および／または他の経路において、野生型細胞において現在わかっているレベルよりもはるかに高いレベルで過剰表現させることは非常に望ましい。これは、それらの酵素をコードする遺伝子を多コピープラスミドに選択的クローニングすることにより、あるいはそれらの遺伝子を強力に誘導性または構成性プロモーター下に配置することにより達成することができる。所望のタンパク質の過剰発現の方法は分子生物学の業界では周知慣用であり、例としては前出のSambrookに見出すことができる。さらに、当業者に公知の方法により或る遺伝子の特異的欠失は、１，３ −プロパンジオールの産生に正の影響を与える。かかる方法の例は、Enzymology ，Volume 217，R．Wu editor，Academic Press: San Diego(1993)の方法に見出すことができる。突然変異体例示の細胞に加えて、本発明の方法は、特に１，３−プロパンジオールの産生を強化するように設計された単一または複数の突然変異を有する細胞を用いることができると考えられる。通常は炭素原料を非生産性経路に流用する細胞、または著しい異化代謝産物抑制を示す細胞は、突然変異させて、これらの表現型の欠陥を回避してもよいであろう。例えば、多くの野生型細胞は、培地中のグルコースおよび副生物からの異化代謝産物抑制に供され、グルコース抑制に耐性である１，３−プロパンジオール産生能力をもつこれらの野生型生物の突然変異株が、本発明においては特に有用であると考えられる。突然変異株を作製する方法は当業界では周知慣用である。例えば、野生型細胞を放射線または化学的突然変異誘発剤等の種々の作用因子に曝し、所望の表現型をスクリーニングしてもよい。放射線によって突然変異を起こす場合、紫外線（ＵＶ）またはイオン化放射線が用いられる。遺伝子突然変異に適した短いUV波長は、２００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲であり、２５４ｎｍが好ましい。この波長でのＵＶ照射は主に、核酸配列内での、グアニジンおよびシトシンからアデニンおよびチミジンへの変化をもたらす。細胞は、全てたいていのＵＶ誘発突然変異を修復するＤＮＡ修復機構を有するので、カフェインおよび他の阻害剤などの薬剤を添加して、この修復プロセスを阻止し、有効な突然変異の数を最大にしてもよい。３００ｎｍ〜４００ｎｍの範囲の光を用いた長波長ＵＶによる突然変異も可能であるが、ＤＮＡと相互作用するプソラレン(psoralen)染料等の種々の活性化剤と共に用いない場合には、一般に短波長のＵＶ光の場合程には効果的ではない。化学薬剤による突然変異誘発も、突然変異株を得るのに有効であり、一般に用いられる物質としては、フレームシフト変異をもたらすことで著名な複製していないＤＮＡに影響を及ぼす薬剤（例えば、ＨＮＯ₂およびＮＨ₂ＯＨ）、および複製しているＤＮＡに影響を及ぼす薬剤（例えば、アクリジン染料）が挙げられる。放射線照射または化学薬剤を用いて突然変異を起こす具体的な方法は、当業界では十分な資料により実証されている。例えば、Thomas D．Brock のBiotechnol ogy: A Textbook of Industrial Microbiology，Second Edition(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.，またはDeshpande，Mukund V.，Appl．Bio chem．Biotechnol.，36，227，(1992)を参照されたい。これらは引用することにより、本明細書の一部を構成するものとする。突然変異誘発が起きた後、所望の表現型を有する突然変異体は、種々の方法によって選択することができる。ランダム・スクリーニングは最も一般的であり、そこでは、突然変異誘発された細胞は、所望の生成物または中間体を産生する能力について選択される。あるいはまた、突然変異体の選択的単離は、突然変異誘発した母集団を耐性コロニーのみが発育することができる選択培地上で増殖することによって行うことができる。突然変異体の選択方法は、高度に発達しており、微生物工業界では周知である。前出のBrock、DeMancilhaら、Food Chem.， 14，313,（1984）を参照されたい。１，３−プロパンジオール生成経路における突然変異および形質転換制限酵素経路：１，３−プロパンジオールのグルコースからの生産は、以下の一連の工程によって達成できる。この一連の工程は、当業者にとって公知である幾つかの経路の代表的なものである。グルコースは、一連の工程において、解糖経路の酵素によって、デヒドロアセトンホスフェート（ＤＨＡＰ）および３−ホスホログリセロアルデヒド（３−ＰＧ）へと転化される。次いで、グリセロールが形成されるが、これはＤＨＡＰを加水分解してジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）とし、続いて還元するか、あるいは、ＤＨＡＰを還元してグリセロール３−ホスフェート（Ｇ３Ｐ）として、続いて加水分解することにより行われる。この加水分解工程は、基質に関しては非特異性であることが知られている幾つかの細胞性ホスファターゼによって触媒されてもよく、あるいは、この活性を組換えによって宿主に導入してもよい。上記還元工程は、ＮＡＤ⁺（またはＮＡＤＰ⁺）結合宿主酵素によって触媒されてもよく、あるいは、この活性を組換えによって宿主に導入してもよい。ｄｈａレギュロンが、式３の可逆反応を触媒するグリセロールデヒドロゲナーゼ(E.C.1.1.1.6)を含有することには注目に値する。グリセロール → ３−ＨＰ＋Ｈ₂Ｏ（式１）３−ＨＰ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺ → １，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ⁺ （式２）グリセロール＋ＮＡＤ⁺ → ＤＨＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺ （式３）上記で詳細に証明したように、グリセロールは、中間体である３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰ）を経て１，３−プロパンジオールへと転化される。中間体３−ＨＰは、宿主によってコードされうる、あるいは組換えによって宿主に導入されうるデヒドラターゼ酵素によってグリセロールから製造される（式１）。このデヒドラターゼは、グリセロールデヒドラターゼ（E.C.4.2.1.30）、ジオールデヒドラターゼ(E.C.4.2.1.28)、あるいはこの形質転換を触媒することができるいずれの酵素であってもよい。グリセロールデヒドラターゼ（ジオールデヒドラターゼではない）は、ｄｈａレギュロンによってコードされる。１，３−プロパンジオールは、ＮＡＤ⁺(またはＮＡＤＨ⁺)結合宿主酵素によって、３ −HPから製造される（式２）か、あるいはこの活性は組換えによって宿主に導入することができる。１，３−プロパンジオールの製造におけるこの最後の反応は、１，３−プロパンジオールデヒドラターゼ(E.C.1.1.1.202)または他のアルコールデヒドロゲナーゼによって触媒することができる。炭素チャネリングに影響を及ぼす突然変異および形質転換：１，３−プロパンジオール生成経路に変異(variations)を含む種々の突然変異生物が本発明では有用である。例えば、トリオースリン酸イソメラーゼ突然変異(tpi-)を本発明の微生物に導入することは、突然変異を用いて炭素チャンネリングにより性能(per formance)を改善する一つの例である。この突然変異は、構造遺伝子に向けられて酵素活性を弱めまたは向上するようにしてもよく、あるいは、調節遺伝子に向けられて酵素活性の表現レベルを調整するようにしてもよい。あるいはまた、形質転換および突然変異を組み合わせて、１，３−プロパンジオール産生を促進するために特定の酵素活性を調節してもよい。したがって、１，３−プロパンジオール産生の増大をもたらす全細胞触媒の改変を予期することは、本発明の範疇内である。培地および炭素基質：本発明における発酵培地は、適当な炭素基質を含有しなければならない。適当な基質としては、グルコースおよびフルクトース等のモノサッカライド、ラクトースまたはスクロース等のオリゴサッカライド、デンプンまたはセルロース等のポリサッカライド、またはそれらの混合物、およびチーズ・ホエー・パーミエート、コーンスティープリカー、サトウダイコン糖蜜および大麦モルト等の再生可能な原料からの非精製混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、炭素基質は、二酸化炭素等の１炭素基質、または主要な生化学的中間体への代謝による転化が実証されているメタノールであってもよい。単一の炭素源（例えば、メタノール、ホルムアルデヒドまたはギ酸エステル）からのグリセロール生産は、メチロトローフ酵母において（K.Yamadaら、Agric．Biol.，Chem .，53(2) 541-543（1989））および細菌において(Hunterら、Biochemistry，24 ，4148-4155，(1985))報告されている。これらの生物は、１炭素化合物を、メタンからギ酸エステル(formate)にわたる酸化状態において、同化し、グリセロールを産生することができる。炭素同化の経路は、リブロース一リン酸を経由して、セリンを経由して、あるいはキシルロース一リン酸を経由してもよい(Gottsch alk，Bacterial Metabolism，Second Edition，Springer-Verlag: New York(198 6))。リブロース一リン酸経路は、ギ酸エステルとリブロース−５−リン酸とを縮合して６炭糖を形成することを包含し、この６炭糖はフルクトースになり、最終的には３炭素生成物であるグリセロアルデヒド−３−リン酸になる。同様に、セリン経路は、１炭素化合物を、メチレンテトラヒドロホレートを経て解糖経路へと同化する。１および２炭素基質に加えて、メチロトローフ生物は、代謝活性のためにメチルアミン、グルコサミンなどの幾つかの他の炭素含有化合物をおよび種々のアミノ酸を利用することも知られている。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンからの炭素を用いてトレハロースまたはグリセロールを形成することが知られて（Bellionら、Microb．Growth Cl Compd.，[Int．Symp.]，7th(1993)，415- 32．Editor(s): Murrell，J．Collin; Kelly，Don P．Publisher: Intercept，A ndover，UK）。同様に、Candida のいろいろな種はアラニンまたはオレイン酸を代謝する(Sulterら、Arch．Microbiol．(1990)，153(5)，485-9)。したがって、本発明で用いられる炭素の供給源は、広範囲にわたる炭素含有基質を包含し、生物がどれを選択するかによって限定されるにすぎない、と考えられる。上記の炭素基質およびそれらの混合物の全部が本発明に適していると考えられるが、好ましい炭素基質は、グルコース、フルクトース、スクロースまたはメタノールである。適当な炭素源に加えて、発酵培地は、当業者にとって公知であり、培養の増殖および１，３−プロパンジオール生産に必要な酵素経路の促進に適している、適当な無機質、塩、補助因子(cofactors)、緩衝液および他の成分を含有しなければならない。Co(II)塩および／またはビタミンＢ₁₂またはそれらの前駆体に特に注意すべきである。培養条件：典型的には、細胞は３０℃で適当な培地中で増殖させる。本発明において好ましい増殖培地は、通常の商業的に調製された培地であり、例えば、ルリア・ベルタニ（Luria Bertni：ＬＢ）ブイヨン、サブロー・デキストロース（Sabouraud Dextrose：ＳＤ）ブイヨンまたは酵母培地（ＹＭ）ブイヨンなどが挙げられる。他の定義された、あるいは合成の増殖培地も使用可能であり、特定の微生物の増殖に適した培地は微生物学または発酵科学の当業者には公知であろう。異化代謝産物抑制を直接的または間接的に調節することが知られている薬剤（例えば、環状アデノシン２′：３′モノホスフェート）を反応培地に組み込んでもよい。同様に、１，３−プロパンジオール生産の促進をもたらす、酵素活性を調節することが知られている薬剤（例えば、メチルビオローゲン）を遺伝子操作と共働して、あるいは遺伝子操作の代替として用いてもよい。発酵に対する好適なｐＨ範囲は、ｐＨ５．０〜ｐＨ９．０の範囲であり、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が初期条件としては好ましい。反応は、好気性または嫌気性の条件下で行ってもよく、嫌気的または微好気性の条件が好ましい。バッチ発酵および連続発酵：本発明の方法は、発酵のバッチ法を用いる。伝統的なバッチ発酵は密閉系であり、そこでは、培地の組成が発酵の開始時に設定され、発酵を行っている間に人為的な改変はしない。つまり、発酵の開始時に、培地を所望の一種または二種以上の生物と共に接種して、系に何も添加しなくても発酵が起こるようにする。しかし、典型的には、「バッチ発酵(batch fermentation)」とは、炭素源の添加に関してはバッチ式であり、ｐＨおよび酸素濃度などの要因の調節がしばしば試みられている。バッチ系では、系の代謝産物およびバイオマスの組成は、発酵が停止するまで、絶えず変化している。バッチ式培養では、細胞は増減して、静止遅滞期(static lag phase)を経て高増殖対数期(high growth log phase)へ最終的には増殖速度が低下または停止する定常期に至る。未処理の場合には、定常期にある細胞は、最終的には死滅する。対数期にある細胞が通常最終生成物または中間体の産生の大部分(bulk)を担っている。標準的なバッチ系の１つの変形例は流加系(Fed-Batch system)である。さらに流加発酵法も本発明では適しており、発酵が進行するに従って基質が増量して添加される以外は典型的なバッチ系を含む。流加系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害しやすい場合、および培地中の基質量を制限することが望ましい場合に有用である。流加系における実際の基質濃度の測定は困難であり、したがって、測定可能な因子（例えば、ｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ₂等の廃ガスの分圧）の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加発酵は、当業界において周知慣用であり、その例が前出のBrock に見られる。本発明はバッチモードで行われるが、本方法は連続発酵法に適合可能であると考えられる。連続発酵は開放系であり、そこでは、決められた発酵培地が連続的にバイオリアクターに添加され、処理のために等量のならし培地が同時に除去される。連続発酵は、通常、培養物を細胞が主に対数期増殖をする一定の高密度に保持する。連続発酵は、細胞の増殖または最終生成物の濃度に影響を及ぼす１つの因子または任意数の因子の調節を可能にする。例えば、１つの方法では、炭素源または窒素レベルのような制限栄養素(limiting nutrient)を固定した速度に保持し、かつ他の全てのパラメーターを増減させる。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保持したままで、増殖に影響を及ぼす幾つかの因子を連続的に変化させることができる。連続系では、定常状態の増殖条件を保持しようと努力し、したがって、発酵中に、培地が排出されることによる細胞の損失は、細胞増殖速度とバランスを取らなくてはならない。連続発酵プロセスのための栄養素および増殖因子の調節方法は、生成物形成速度を最大するための技法と並んで、工業微生物学の業界で周知であり、種々の方法が前出のBrock によって詳述されている。本発明は、バッチ法、流加法または連続法のいずれを用いて実施してもよく、どのような発酵方法も適していると考えられる。さらに、細胞は、全細胞触媒(w hole cell catalysts)として基質に固定化して１，３−プロパンジオール産生の発酵条件に供してもよい、と考えられる。１，３−プロパンジオールの同定および精製発酵培地からの１，３−プロパンジオールの精製方法は、当業界において公知である。例えば、プロパンジオールは、細胞培地から、反応混合物を有機溶剤による抽出、蒸留およびカラムクロマトグラフィーに供することによって得ることが可能である（米国特許第5,356,812 号）。この方法において特に良い有機溶剤は、シクロヘキサンである（米国特許第5,008,473 号）。１，３−プロパンジオールは、培地を高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）にかけることによって直接的に同定することができる。本発明において好ましいのは、発酵培地が、イソクラチック(isocratic)なやり方で０．０１Ｎ硫酸の移動相を用いた分析用イオン交換カラムで分析される方法である。細胞本発明に適している細胞は、デヒドラターゼ酵素を有するものを含む。適している細胞は、原核または真核のいずれであってもよく、その活性デヒドラターゼ酵素表現能力によってのみ限定される、と考えられる。本発明において特に有用なものは、大規模な発酵方法に容易に適合し得る細胞である。かかる生物は、工業的バイオプロセッシングの業界で周知であり、その例は、「Re combinant Microbes for Industrial and Agricultural Applications」[Murook a et al.，eds.，Marcel Dekker，Inc.，New York，New York(1994)]に見られ、発酵性細菌、さらには酵母および糸状菌が包含される。典型的には、該酵素は、それぞれグリセロールまたは１，２−プロパンジオールに基質特異性を有するグリセロールデヒドラターゼまたはジオールデヒドラターゼのいずれかである。デヒドラターゼ酵素は、グリセロールをヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）に転化することができ、この３−ＨＰＡは次いで１，３−プロパンジオールへと転化される。この経路を含有する細胞は、シトロバクター、エンテロバクター、クロストリジウム、クレプシエラ、サルモネラおよびラクトバシルス属に属する突然変異または組換え生物を含む。発酵によってグリセロールを生産する当業者にとって公知の微生物、例えば、アスペルギルス、サッカロミセス、ジゴサッカロミセス、ピヒア、クリベロミセス、カンジダ、ハンゼヌラ、ジュナリエラ(Dunaliella)、デバリオミセス(DeBaryomyces)、ムーコル、トリロプシス(Tor ylopsis)、およびメチロバクテリア(Mathylobacteria)は、組換えデヒドラターゼ酵素の宿主であり得る。本発明における宿主として好適な他の細胞としては、バシルス、エシェリキア、シュードモナス、およびストレプトミセスが挙げられる。理論に縛られるつもりはないが、上述の群に属する本発明に適している生物は、天然に存在すると考えられる。本出願人の実験研究に基づけば、非常に広範囲にわたる細胞が本発明で使用可能であると考えられる。本出願人は、例えば、広範囲にわたって多様な遺伝子型および表現型の組成を有する細胞が、適当な炭素基質を１，３−プロパンジオールへと生物転化し得ることを証明した。細胞の例としては、ｄｈａ遺伝子構成性Ｋ．ニューモニエ突然変異株、グリセロールデヒドラターゼまたはジオールデヒドラターゼのいずれかをコードする遺伝子を含有するクレプシエラ・ゲノムのエレメントを含む組換え大腸菌株、および、同じくクレプシエラ・ゲノムのエレメントでトランスフェクトされ、かつトリオースフォスフェート・イソメラーゼ酵素をコードする遺伝子に突然変異を有する組換え大腸菌(tpi-)株が挙げられる。クレプシエラ・ニューモニエ由来のｄｈａレギロンを含有する大腸菌形質転換体は、グルコースまたはキシロースの存在下であってもグリセロールを１，３− プロパンジオールへと転化することができたが(Tongら、Appl．Biochem．Biotec h.，34，149(1992))、グルコースのみの存在下では、これらの生物によって１，３−プロパンジオールは全く検出されなかった。この開示と直接に対照的なのは、本出願人は、クレプシエラ・ニューモニエ由来のｄｈａレギュロンを含有する２種の独立して単離されたコスミドのいずれかを含有する大腸菌の３種の菌株が、外来的に添加されたグリセロールの存在なしに、グルコースの供給材料(feed) から１，３−プロパンジオールを産生することを発見した。大腸菌株ECL707はＫ．ニューモニエのｄｈａレギュロンを含有するコスミドベクターｐＫＰ−１またはｐＫＰ−２を含有するが、この菌株は外来的に添加されたグリセロールの存在なしに、グルコースからの１，３−プロパンジオールの、検出可能ではあるが、小規模な産生を示した（実施例４）。代替宿主生物から構築した組換え大腸菌株ＤＨ５α（これも、コスミドベクターｐＫＰ−１またはｐＫＰ−２を含有する）は、適当な条件下ではグルコースからの１，３−プロパンジオールの産生において、ＥＣＬ７０７組換え体よりも有効であることがわかった（実施例３）。実施例４の条件下でグルコースから１，３−プロパンジオールを生産するのに最も有効なものは、コスミドベクターｐＫＰ−１またはｐＫＰ−２を含有する組換え大腸菌株ＡＡ２００（実施例２）である。大腸菌株ＡＡ２００は、検出可能なトリオースフォスフェート・イソメラーゼ酵素(tpi-)を含有する。ＡＡ２００−ｐＫＰ−１の菌株は、形質転換反応からの独立した単離物のプールからさらに研究するために選別されたものであるが、これは、２段階反応でグルコースを１，３−プロパンジオールへと転化した。第1 段階では、菌株ＡＡ２００−ｐＫＰ−１−５を、グルコースおよびグリセロールの不在下で高細胞密度まで増殖させた。第２段階では、グルコースは含有するが、グリセロールは全く含有しない培地に懸濁した増殖細胞は、高い転化率および選択性でグルコースを１，３−プロパンジオールへと転化した（実施例５）。免疫化学的、クロマトグラフィー的および遺伝学的には異なるが、補酵素(coenzyme)Ｂ₁₂依存性酵素であるグリセロールデヒドラターゼ(E.C.4.2.1.30)およびジオールデヒドラターゼ(E.C.4.2.1.28)は、グリセロールの、１，３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへの転化を触媒する。ジオールデヒドラターゼではなくグリセロールデヒドラターゼは、ｄｈａレギュロンに含まれる(encompassed)。Ｋ．ニューモニエA TCC8724は、ジオールデヒドラターゼは含むがグリセロールデヒドラターゼは含まないが、グリセロールを１，３−プロパンジオールへと転化する（Forageら、 J．Bacteriol.，149，413(1982)）。組換え大腸菌株ＥＣＬ７０７およびＡＡ２００は、ジオールデヒドラターゼの遺伝子をコードするコスミドベクターｐＫＰ４を含むが、グルコースを１，３−プロパンジオールへと転化する（実施例２および実施例４）。天然に発生する菌株から突然変異誘発によって調製したK.ニューモニエECL210 6(Ruchら、J．Bacteriol．124，348(1975))は、ｄｈａレギュロンのグリセロール）の構成性表現を示す(Ruchら、前出；Johnson ら、J．Bacteriol．164，479( 1985))。同じ表現型を示すK.ニューモニエATCC25955 由来の菌株が同様にして調製されている(Forageら、J．Bacteriol．149，413(1982))。クレプシエラｄｈａ構造遺伝子の表現は、部分的ではあるが、リプレッサー（dhaRの産物）によって制御される。（Sprengerら、J．Gen．Microbiol．135，1255(1989)）。本出願人は、ｄｈａ構造遺伝子を構成するＥＣＬ２１０６が、外来的に添加されたグリセロールの不在下で、グルコースの供給材料から１，３−プロパンジオールを産生することを示した（実施例６）。これは、同じ条件下で、検出可能なレベルの１，３−プロパンジオールを産生しなかった野生型K.ニューモニエATCC25955 とは異なる（実施例６）。ＥＣＬ２１０６におけるｄｈａ構造遺伝子の表現は、カタボライト異化代謝産物表現によってさらに制御される（Sprengerら、J．Gen．Microbiol．135，1255 (1989)）。異化代謝産物抑制を除くことは、C.freundiiから誘導される１，３− プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)およびK.oxytoca ATCC8724から誘導されるジオールデヒドラターゼについて証明されているように、必要な構造遺伝子を代替プロモーター(alternate promoters)の制御下に配置することによって達成可能である(Danielら、J．Bacteriolo．177，2151（1995）およびTobimatsu ら、J．Biol．Chem．270，7142(1995))。このようにしてＥＣＬ２１０６から異化代謝産物抑制を除くことによって、外来性のグリセロール供給源が存在しなくても１，３−プロパンジオールのグルコースからの生産の改善が達成される。例えば、tpi-突然変異によって説明されているような適当な炭素チャネリングによって、さらなる改善が得られる。シトロバクター種およびクレプシエラ種のｄｈａレギュロンは驚くほど類似しているので、当業者であれば、クレプシエラ種についての外来性のグリセロール供給源の不在下でのグルコースからの１，３−プロパンジオールの産生が関係する技術は、シトロバクター種にも適用される、と考えるであろう。さらに、Ｃ．ブチリカムによるグリセロールの代謝はＫ．ニューモニエに匹敵するので(Zeng ら、Biotechnol．And Bioeng.44，902(1994))、教示は、クロストリジア(Clostr idia)種にも及ぶ。実施例一般的方法リン酸化、連結反応および形質転換の操作は、当業界では公知である。以下の実施例で使用するのに適した技法は、Sambrook，J.らによるMolecular Cloning: A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Pres s（1989）にある。細菌培養物の維持および増殖に適した材料および方法は、当業界では公知である。以下の実施例で使用するのに適した技法は、Manual of Methods for Genera l Bacteriology (Phillipp Gerhardt，R.G.E．Murray，Ralph N．Costilow，Euge ne W．Nester，Willis A．Wood，Noel R．Krieg and G．Briggs Phillips，eds) ，American Society for Microbiology，Washington,DC．(1994)またはThomas D ．Brock のBiotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology，Second E dition(1989)Sinauer Associates．Inc.，Sunderland，MAにある。細菌細胞の増殖および維持に用いられる全ての試薬および材料は、特に指示しない限り、Aldr ich Chemicals（Milwaukee，WI）、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/B RL(Gaithersburg，MD)、または Sigma Chemical Company(St．Louis，MO)から得た。略記の意味は以下のとおりである。すなわち、「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「５０ａｍｐ」は５０ｇ／ｍＬのアンピシリンであり、「ＬＢ−５０ａｍｐ」は５０ｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するLuria-Bertani ブイヨンである。表中、以下の略語が用いられる。すなわち、「Ｃｏｎ．」は転化であり、「Ｓｅｌ．」は炭素に対する選択性であり、「ｎｄ」は検出できなかったことを意味する。酵素アッセイ無細胞抽出物におけるグリセロールデヒドラターゼ活性は、１，２−プロパンジオールを基質として用いて測定した。このアッセイは、アルデヒドとメチルベンゾ−２−チアゾロンヒドラゾンとの反応に基づくものであり、ForageおよびFo sterによって記載されている(Biochem．Biophys．Acta．569，249(1979))。１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（しばしば、１，３−プロパンジオールデヒドラターゼという）の活性は、記載されているように、溶液中またはスラブゲル中で、１，３−プロパンジオールおよびＮＡＤ⁺を基質として用いて測定した(Johnson およびLin，J．Bacteriol．169，2050(1987))。１，３−プロパンジオールの単離および同定グリセロールの１，３−プロパンジオールへの転化は、ＨＰＬＣによってモニターした。分析は、標準的な技法およびクロマトグラフィーの分野に習熟した者であれば入手可能な材料を用いて行った。１つの適した方法では、ＵＶ（２１０ｎｍ）およびRI検出を使用するWaters Maxima 820HPLC 装置を用いた。サンプルは、Shodex SH-1011P プレカラム（６ｍｍ×５０ｍｍ）を装備したShodex SH-10 11カラム（８ｍｍ×３００ｍｍ、Waters社(Milford，MA)から購入）に注入した（温度は５０℃に調節し、０．０１ＮのＨ₂ＳＯ₄を移動相として用いて、０．５ｍＬ／ｍｉｎの流量で行った）。定量分析が望まれる場合には、サンプルは、既知量のトリメチル酢酸を外部標準として用いて調製した。典型的には、グリセロールの保持時間（ＲＩ検出）、１，３−プロパンジオール（ＲＩ検出）、およびトリメチル酢酸（ＵＶおよびＲＩ検出）は、それぞれ２０．６７分、２６．０８分、および３５．０３分である。１，３−プロパンジオールの産生は、ＧＣ／ＭＳによって確認した。分析は、標準的な技法およびＧＣ／ＭＳの分野に習熟した者であれば入手可能な材料を用いて行った。１つの適した方法では、Hewlett Packard 5971シリーズ・マス選択的検出装置(mass selective detector)(ＥＩ)およびHP-INNOWaxカラム（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５ミクロン）に結合したHewlett Packard 5890シリーズIIガスクロマトグラフを用いた。生成した１，３−プロパンジオールの保持時間および質量スペクトルは、確実な１，３−プロパンジオール（ｍ／ｅ：５７．５８）と比較した。ＧＣ／ＭＳのもう１つの方法は、サンプルの誘導(derivatization)を含む。１．０ｍＬのサンプル（例えば、培養上清）に、３０ｕＬの濃縮（７０％ｖ／ｖ）過塩酸を添加した。混合後、そのサンプルを凍結乾燥した。ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド：ピリジンの１：１混合物（３００ｕＬ）を、凍結乾燥物に添加し、激しく混合し、６５℃で１時間にわたって放置した。このサンプルから遠心分離により不溶性物質を取り除いた。得られた液体を２つの層に分離して、その上部層を分析に用いた。このサンプルを、ＤＢ−５カラム（４８ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５ｕｍ；L&W Scientific社製）でクロマトグラフして、培養上清から得られた１，３−プロパンジオール誘導体の保持時間および質量スペクトルを、認証標準物質から得られたものと比較した。TMS 由来の１，３−プロパンジオールの質量スペクトルは、２０５、１７７、１３０、および１１５ＡＭＵの特有のイオンを含有している。Ｋ．ニューモニエコスミドライブラリーの構築Ｋ．ニューモニエ(ATCC25955)を、１００ｍＬのＬＢ培地で８時間にわたって３７℃で通気しながら増殖させた。細菌（試験管(tube)１本あたり２５ｍＬ）を３，０００ｒｐｍで１５分間にわたり、DuPont Sorbvall GLC 2.B 遠心分離機で、室温で遠心分離した。この細菌をペレット化し、上清をデカンテーションした。この細菌細胞ペレットを−２０℃で凍結した。染色体ＤＮＡを、以下に略述するようにして、ＤＮＡに剪断作用がかからないように特別の注意を払いながら（すなわち、ボルテックス処理はせずに）単離した。試験管１本の細菌を、２．５ｍＬの50mM Tris-10mM EDTA 再懸濁し、５００μｇのリゾチーム（1mg/ml）を添加した。このペレットを穏やかに再懸濁し、懸濁液を３７℃で１５分間にわたってインキュベートした。ドデシル硫酸ナトリウムを添加して最終濃度を０．５％にした。これにより、溶液は透明になった。プロテイナーゼＫ（５０ｕｇ／ｍＬ）を添加し、懸濁液を５５℃で２時間にわたってインキュベートした。この試験管を取り出し、氷浴に移し、塩化ナトリウムを添加して、最終濃度を０．４Ｍにした。２倍量のエタノールを該溶液に添加した。ガラス棒を界面に挿入して、ＤＮＡを穏やかに巻き付けた。ＤＮＡを７０％エタノールを含有する試験管に浸漬した。減圧乾燥した後、そのＤＮＡを５００ｕｌの水に再懸濁し、ＤＮＡの濃度を分光光度計により測定した。希釈したＤＮＡのアリコートを、０．５％アガロースゲルにかけて、ＤＮＡのそのままの性質(intact nature)を測定した。この染色体ＤＮＡを、Sambrookら（前出）に略述されているようにしてSau3A で部分的に消化した。ＤＮＡ（2ug）を２単位のSau3A(Promega 社，Madison，WI )で室温で全容量２００μＬで消化した。０、５、１０および２０分の時点で、サンプル（５０μＬ）を抜き取り、５ｕｍｏｌのＥＤＴＡを含有する試験管に移した。これらの試験管を７０℃で１０分間にわたってインキュベートした。１アリコート（２μＬ）を抜き取り、０．５％アガロースゲル電気泳動で分析して、消化のレベルを測定し、サンプルの残り（４８μＬ）を−２０℃で保存した。上記ゲルをエチジウムブロマイドで染色して、ＵＶ下で可視化して、染色体ＤＮＡの部分消化を測定した。時間の増加に伴う染色体ＤＮＡのサイズの減少が観察され、このことは、染色体ＤＮＡのサイズの減少が、Sau3A の作用によるものであることを示している。ＤＮＡを、標準プロトコール法（Sambrookら、前出）によって残りのサンプルから抽出した。部分的に消化されたＫ．ニューモニエ由来ＤＮＡのコスミド・ライブラリーは、Supercosコスミドベクター・キットおよびGigapack II パッケージング抽出物を用い、Stratagene社(La Jolla，CA)から購入した試薬を用いて作製した。製造業者により提供された指示に従った。パッケージされたK.ニューモニエは、大腸菌XL1-Blue MR をトランスフェクトすることによって測定したところ４×１０⁴ 〜１．０×１０⁵ファージ力価）を含有していた。コスミドＤＮＡは、６個の大腸菌形質転換体から単離し、ＤＮＡの大きな挿入断片（２５〜３０ｋｂ）を含有することがわかった。実施例１１，３−プロパンジオールの発現のための大腸菌宿主細胞のコスミドＤＮＡによるクローニングおよび形質転換培地合成Ｓ１２培地を用いて、細菌の形質転換体の、１，３−プロパンジオール製造能についてスクリーニングした。Ｓ１２培地は、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．７ｍＭのＣａＣｌ₂、５０μＭのＭｎＣｌ₂、１μＭのＦｅＣｌ₃、１μＭのＺｎＣｌ、１．７μＭのＣｕＳＯ₄、２．５μＭのＣｏＣｌ₂、２．４μＭのＮａ₂ＭｏＯ₄、および２μＭの塩酸チアミンを含有する。増殖および発酵に用いられる培地A は、１０ｍＭの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのMOPS/KOH緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＭのリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．７ｍＭのＣａＣｌ₂、５０ｍＭのＭｎＣｌ₂、１μＭのＦｅＣｌ₃、１μＭのＺｎＣｌ、１．７２μＭのＣｕＳＯ₄、２．５３μ ＭのＣｏＣｌ₂、２．４２μＭのＮａ₂ＭｏＯ₄、２μＭの塩酸チアミン、０．０１％酵母エキス、０．０１％のカザミノ酸、０．８μｇ／ｍＬのビタミンＢ₁₂、および５０ａｍｐから構成されていた。培地Ａは、０．２％グリセロールまたは０．２％のグリセロール＋０．２％Ｄ−グルコースのいずれかを補足した。細胞クレプシエラ・ニューモニエECL2106(Ruchら、J．Bacteriol．124，348(1975) )（これは、文献では、Ｋ．エロゲネス(K.aerogenes)またはエロバクター・エロゲネス(Aerobacter aerogenes)としても知られている）は、E.C.C.Lin(Harvard Medical School，Cambridge，MA)から入手し、実験室の培養物として保持した。クレプシエラ・ニューモニエATCC 25955は、American Type Culture Collecti on(Rockville，MD)から購入した。大腸菌ＤＨ５αは、Gibco/BRL から購入し、グリセロールデヒドラターゼ酵素またはジオールデヒドラターゼ酵素のいずれかをコードする遺伝子を含有するクレプシエラ・ニューモニエATCC 25955から単離したコスミドＤＮＡで形質転換した。グリセロールデヒドラターゼを含有するコスミドは、ｐＫＰ１およびｐＫＰ２として同定され、ジオールデヒドラターゼ酵素を含有するコスミドは、ｐＫＰ４として同定された。形質転換したＤＨ５α細胞は、ＤＨ５α−ｐＫＰ１、ＤＨ５α−ｐＫＰ２およびＤＨ５α−ｐＫＰ４として同定された。大腸菌ECL707（Sprengerら、J．Gen．Microbiol.，135，1255(1989)）は、E.C .C.Lin（Harvard Medical School，Cambridge，MA）から入手し、同様にして、クレプシエラ・ニューモニエ由来のコスミドＤＮＡで形質転換した。これらの形質転換体は、ECL707−ｐＫＰ１およびECL707−ｐＫＰ２（グリセロールデヒドラターゼ遺伝子を含有）およびECL707−pKP4（ジオールデヒドラターゼ遺伝子を含有）として同定された。 tpi 遺伝子における突然変異を含有する大腸菌ＡＡ２００(Andersonら、J．Ge n Microbiol.，62，329(1970))は大腸菌 Genetic Stock Center，Yale Universi ty(New Haven，CT)から購入し、クレプシエラ・コスミドＤＮＡで形質転換して、組換え生物ＡＡ２００−ｐＫＰ１およびＡＡ２００−ｐＫＰ２（グリセロールデヒドラターゼ遺伝子を含有）およびＡＡ２００−ｐＫＰ４（ジオールデヒドラターゼ遺伝子を含有）を得た。ＤＨ５α ：Ｋ．ニューモニエＤＮＡでトランスフェクトされた大腸菌XL1-Blue MR のおよそ１，０００個のコロニーを含有する６枚の形質転換プレートを、５ｍＬのＬＢ培地で洗浄し、遠心分離した。細菌をペレット化し、５ｍＬのＬＢ培地＋グリセロールに再懸濁した。アリコート（５０μＬ）を、０．２％グリセロール＋４００ｎｇ／ｍＬのビタミンＢ₁₂０．００１％酵母エキス＋５０ａｍｐを有するＳ１２合成培地を含有する１５ｍL 容試験管に接種した。この試験管を、上部まで培地で満たし、パラフィルムで覆い、３０℃でインキュベートした。わずかな濁りが４８時間後に観察された。上記のようにして７８時間および１３２時間の時点で生成物の分布を分析したアリコートは、１，３−プロパンジオールについて陽性であり、それ以降の時点では１，３−プロパンジオールの含有量は増加していた。１，３−プロパンジオール産生に陽性であることがわかった細菌は、段階的に希釈し、ＬＢ−５０ａｍｐプレートに拡げて、単一コロニーを単離した。４８個の単一コロニーを単離し、１，３−プロパンジオール産生について再度チェックした。コスミドＤＮＡは、６個の独立したクローンから単離し、大腸菌株ＤＨ５ αに形質転換した。この形質転換体は、１，３−プロパンジオール産生について再度チェックした。２種の形質転換体をさらに特徴付けして、ＤＨ５α−ｐＫＰ１およびＤＨ５α−ｐＫＰ２と命名した。ｐＫＰ１から得た12.1kbのEcoRI-SalI断片は、pIBI31(IBI Biosystem，New Ha ven，CN)にサブクローニングし、配列決定し、ｐHK28-26(配列番号１)とした。配列決定により、グリセロールデヒドラターゼおよび調節に必要な遺伝子をコードするｄｈａオペロンの関連するオープン・リーディング・フレームの遺伝子座が明らかになった。配列番号１について言えば、ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードするｄｈａＫのオープン・リーディング・フレームの断片が１〜３９９番目の塩基に見出され、グリセロールジヒドロゲナーゼをコードするｄｈａＤのオープン・リーディング・フレームが９８３〜２１０７番目の塩基に見出され、リプレッサーをコードするｄｈａＲをコードするオープン・リーディング・フレームが２２０９〜４１３４番目の塩基に見出され、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードするｄｈａＴのオープン・リーディング・フレームが５０１７〜６１８０番目の塩基に見出され、アルファ・サブユニットのグリセロールデヒドラターゼをコードするｄｈａＢ１のオープン・リーディング・フレームが７０４４〜８７１１番目の塩基に見出され、ベータ・サブユニットのグリセロールデヒドラターゼをコードするｄｈａＢ２のオープン・リーディング・フレームが８７２４〜９３０８番目の塩基に見出され、ガンマ・サブユニットのグリセロールデヒドラターゼをコードするｄｈａＢ３のオープン・リーディング・フレームが９３１１〜９７３６番目の塩基に見出され、未知の機能のタンパク質をコードするｄｈａＢＸのオープン・リーディング・フレームが９７４９〜１１５７２番目の塩基に見出される。パッケージされたＫ．ニューモニエ由来のコスミドＤＮＡでトランスフェクトされた大腸菌XL1-Blue MR の単一コロニーを、２００ｕＬのＳ１５培地（１０ｍＭの硫酸アンモニウム、０．１ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５０ｍＭのMOPS/KOH緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．７ｍＭのＣａＣｌ₂、５０ｕＭのＭｎＣｌ₂、１ｕＭのＦｅＣｌ₃、１ｕＭのＺｎＣｌ、１．７２ｕＭのＣｕＳＯ₄、２．５３ｕＭのＣｏＣｌ₂、２．４２ｕＭのＮａ₂ＭｏＯ₄ 、および２ｕＭの塩酸チアミン）＋０．２％のグリセロール＋４００ｎｇ／ｍＬのビタミンＢ₁₂＋０．００１％の酵母エキス＋５０ｕｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するマイクロタイター・ウエルに接種した。マイクロタイター・ウエルに加えて、ＬＢ−５０ａｍｐを含有するマスターのプレートにも接種した。９６時間後、１００ｕＬを抜き取り、０．２ミクロンのナイロン製メンブランフィルターを含有するRaininマイクロフュージ・チューブ(microfuge tube)で遠心分離した。細菌を保持し、濾液をＨＰＬＣ分析用に処理した。約２４０個のコロニーをスクリーニングして１，３−プロパンジオール産生を示す陽性のクローンを同定した。３個の陽性のコロニーを同定し、その中の２個はＬＢ−５０ａｍｐ上で増殖したものであり、もう１個は増殖しなかったものである。単一のコロニーを、ＬＢ−５０ａｍｐ上で増殖した上記２個の陽性のコロニーの一方から単離し、かつ１，３−プロパンジオール産生を実証し、これをｐＫＰ４と命名した。コスミドＤＮＡ、ｐＫＰ４を含有する大腸菌株から単離し、大腸菌株ＤＨ５αを形質転換した。独立した形質転換体（ＤＨ５α−ｐＫＰ４と命名した）は１，３−プロパンジオールを産生することが実証された。ＥＣＬ７０７大腸菌株ECL707は、ｐＫＰ１、ｐＫＰ２、ｐＫＰ４およびSupercosベクター単独に対応するコスミドＫ．ニューモニエＤＮＡで形質転換して、それぞれをECL7 07-pKP1、ECL707-pKP2、ECL707-pKP4 およびECL707-sc と命名した。ECL707は、それぞれＡＴＰ依存性グリセロールキナーゼ、ＮＡＤ⁺結合グリセロールデヒドロゲナーゼ、およびホスホエノールピルベート依存性ホスホトランスフェラーゼ系のジヒドロキシアセトンに対する酵素IIをコードするglpK、gldおよびptsDが欠損している。各コスミドによる形質転換の２０個の単一コロニーおよびSupercosベクター単独（負のコントロール）の形質転換の５個のコロニーを、ＬＢ−５０ａｍｐプレートから単離し、マスターのＬＢ−５０ａｍｐプレートへ移した。これらの単離体についても、グリセロールを１，３−プロパンジオールへ転化する能力について試験して、それらがデヒドラターゼ活性を含んでいるかを調べた。形質転換体は、滅菌した楊枝(toothpick)で、０．２％グリセロールまたは０．２％グリセロール＋０．２％Ｄ−グルコースのいずれかを補足した２００μＬの培地Ａを含有するマイクロタイタープレートに移した。４８時間にわたって３０℃でインキュベートした後、該マイクロタイタープレートのウエルの内容物を、０．４５μ のナイロン製フィルターで濾過し、ＨＰＬＣでクロマトグラフィーした。これらの試験結果を表１に示す。ＡＡ２００大腸菌株AA200 は、pKP1、pKP2、pKP4およびSupercosベクター単独に対応するコスミドＫ．ニューモニエＤＮＡで形質転換して、それぞれをAA200-pKP1、AA20 0-pKP2、AA200-pKP4およびAA200-scと命名した。菌株AA200 は、トリオースフォスフェートイソメラーゼを欠損している(tpi-)。各コスミドによる形質転換の２０個の単一コロニーおよびエンプティ(empty) ベクターによる形質転換の５個のコロニーを、大腸菌株ECL707について記載したのと同様にして、単離し、グリセロールを１，３−プロパンジオールへ転化する能力について試験した。これらの試験結果を表２に示す。実施例２デヒドラターゼ活性を含むクレプシエラ・ニューモニエＤＮＡで形質転換した大腸菌株AA200 によるＤ−グルコースの１，３−プロパンジオールへの転化ガラス製血清ビンを、培地（１０１μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび０．２％のＤ−グルコースを補足し、さらに０．５〜１．０ｍＭの環状アデノシン２′：３′−モノホスフェート（cAMP）を補足した、あるいは補足していない、実施例１で定義した約１４ｍＬの培地Ａ）で容量いっぱいまで満たし、それに、Ｋ．ニューモニエｄｈａレギュロン・コスミドpKP1またはpKP2、Ｋ．ニューモニエpdu オペロンpKP4またはSupercosベクター単独を含有する大腸菌株AA200 から単離した選択した単一コロニーを植菌した。グリセロールと接触しないようにするために、植菌は、ＬＢ−５０ａｍｐの寒天培地または同じ培地の液体培養のいずれかから行った。反応物を、２５０ｒｐｍで攪拌しながら、約７２時間にわたって３０℃でインキュベートした。増殖は、６００ｎｍでの吸光度の変化によって測定し、そこにおいて、初期のＯＤ₆₀₀は０．０２０ＡＵであった。グルコースの消費(depletion)および生成物の分布の程度は、ＨＰＬＣによって測定した。単一コロニーの単離物は、番号付けした接尾語「−ｘ」によって同定した（例えば、 AA200-pKP1-x）。累積した結果を表３および表４に示す。実施例３デヒドラターゼ活性を含有するクレプシエラ・ニューモニエＤＮＡで形質転換された大腸菌株ＤＨ５αによるＤ−グルコースの１，３−プロパンジオールへの転化Ｋ．ニューモニエのｄｈａレギュロン・コスミドpKP1またはpKP2を含有する大腸菌株ＤＨ５αを、実施例２に記載したようにして、Ｄ−グルコースを１，３− プロパンジオールに転化する能力について試験した。結果を表５に示す。実施例４デヒドラターゼ活性を含有するクレプシエラ・ニューモニエＤＮＡで形質転換された大腸菌株ECL707によるＤ−グルコースの１，３−プロパンジオールへの転換大腸菌株ECL707は、Ｋ．ニューモニエのｄｈａレギュロン・コスミドpKP1またはpKP2、Ｋ．ニューモニエ pduオペロンpKP4あるいはSupercosベクター単独を含有しており、これらを、Ｄ−グルコースを１，３−プロパンジオールへ転化する能力について実施例２に記載したのと同様にして試験した。それぞれの場合において、転化は定量的に行った。結果を表６に示す。実施例５大腸菌AA200-pKP1-5によるＤ−グルコースの１，３−プロパンジオールへの２段階転化５０ｍＬのLB-amp培地を含有するバッフル付フラスコ(buffled flasks)（２５０ｍＬ）に、AA200-pKP1-5の単一コロニーを植菌した。細胞を、二重反復で(in duplicate)、一夜にわたって３０または３７℃で攪拌しながら（２５０ｒｐｍ）増殖させた。増殖した培養物を回転させ（１０分間、１０，０００ｒｐｍ、４℃）、微量の金属類Ａ（０．０８μＭのCoCl₂、０．０６μＭのCuCl₂、７μＭのFeSO₄、２μ ＭのH₃BO₄、０．２μＭのMnCl₂、０．１μＭのNa₂MoO₄、０．０８μＭのNiCl₂、０．３μＭのZnSO₄、および０．０３ｍＭのチアミン）または微量の金属Ｂ（０．７ｍＭのCaCl₂、２．５３μＭのCoCl₂、１．７２μＭのCuSO₄、１．０μＭのFeCl₃、２ｍＭのMgCl₂、２．４２μＭのNa₂MoO₄、１．０μＭのZnC l₂、および０．０３ｍＭのチアミン）のいずれかを含有するグルコース非含有生成培地（１０ｍＭの（NH₄）₂SO₄、５ｍＭのリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％の酵母エキス、０．０１％のカザミノ酸、０．８μｇ／ｍＬのビタミンＢ₁₂、および５０μｇ／ｍＬのアンピシリン）に再懸濁した。、細胞を２秒間にわたって攪拌し、Ｄ−グルコースを含有する５０ｍＬの新たな生成培地に再懸濁し、６０ｍＬ容血清ビンに小分けし、そのビンをキャップし、ブチルゴム製隔膜(septa)で密閉した。このビンを攪拌し（２５０ｒｐｍ）、シリンジで該隔膜を通してサンプルを抜き取り、０．２μのフィルターで濾過した後で分析した。結果を表７および表８に示す。残留したグルコースは、酵素的分析(Biochemistry Analyzer，Yellow Springs Instr uments Co.，Inc.)によって測定し、１，３−プロパンジオールをＨＰＬＣにより分析した。実施例６クレプシエラ・ニューモニエ ATCC25955ではなくクレプシエラ・ニューモニエECL2106 によるＤ−グルコースの1,3-プロパンジオールへの転化容量いっぱい（約１４ｍＬ）まで培地で満たしたガラス製血清ビンを、Ｋ．ニューモニエECL2106 またはＫ．ニューモニエATCC25955 を含有するＬＢ寒天プレートからかるく植菌した。この培地は、５０ｍＭのグルコース、３ｍＭの（NH₄ ）₂SO₄、０．９ｍＭ CaCl₂、４μＭのCoCl₂、０．０６μＭのCuCl₂、７μＭのFe SO₄、２μＭのH₃BO₄、０．８ｍＭのMgSO₄、０．２μＭのMnCl₂、０．１μＭのNa₂ MoO₄、０．０８μＭのNiCl₂、０．３μＭのZnSO₄０．１ｍｇ／ｍＬのＤＬ−システイン、１０μＭのエチレンジアミン四酢酸、０．８μｇ／ｍＬのビタミンＢ₁₂ 、表９に示すリン酸カルシウム、および５０ｍＭのHEPES または５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）のいずれか一方を含有していた。反応物を２５０ｒｐｍで攪拌しながら、４７時間にわたって３０℃でインキュベートした。それ以外は反応物を実施例２に記載した通りに行った。結果を表９に示す。実施例７組換えピヒア・パストリスによる１，３−プロパンジオールの生産汎用目的の表現プラスミドの構築 pHIL-D4(Phillips Petroleum，Bartlesville，OK)中の０．９ｋｂのEcoRI/Xba l断片を、pAO815（Invistrogen，SanDiego，CA）の０．９ｋｂのEcoRI/Xbal断片と置き換えて、以下のエレメントを含有するプラスミドpHIL-D4B2 を得た。すなわち、このプラスミドは、5′AOX1（Ｐ．パストリスメタノール誘導性アルコールオキシダーゼＩ（AOX1）プロモーター）、AOX1 term(P.pastoris AOX1転写終結領域)HIS4(his4 宿主における選択用のＰ．パストリスヒスチジノールデヒドロゲナーゼ・コード遺伝子)、kan(アミノグリコシド３′−ホスホトランスフェラーゼをコードし、非常に多様な宿主にカナマイシン、ネオマイシンおよびG418耐性を付与し、かつカセットコピー数の指示物として有用な、トランスポソンTn903 由来の配列)、3′AOX1（部位指向性(site-direct ed)ベクター組込みのための5′AOX1との結合に用いられる、AOX1の下流にあるＰ．パストリス配列）、ori(大腸菌におけるプラスミド操作を可能にする、pBR322 のＤＮＡ複製の起点)、およびamp(アンピシリンに対する耐性を付与するpBR322 由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子)を含有していた。PHIL-D4B2 のもう１つの特徴は、Bgl2/Xbal 断片上のカセットをBamH1/Xbal部位にサブクローニングすることによって複数の表現カセット（5′AOXI-gene-AOXIterm）を１つのプラスミドに容易に配置できることである。dhaB1 およびdhaB2 の同時表現のためのプラスミドの構築 dhaB1 およびdhaB2 のオープン・リーディング・フレームは、コスミドpKP1から、PCR によって、５′末端にEcoRI 部位が組込まれているプライマー（それぞれ、dhaB1 およびdhaB2 として配列番号３を有する配列番号２および配列番号５を有する配列番号４）を用いて増幅した（１０ｍＭ Tris （ｐＨ８．２）、５０ｍＭ KCl、１．５ｍＭ MgCl₂、０．０００１％ゼラチン、２００μＭ dATP、２００μＭ dCTP、２００μＭ dGTP、２００μＭ dTTP、１μＭの各プライマー、１〜１０ｎｇ標的ＤＮＡ、２５単位／ｍＬ Amplitaq(登録商標)ＤＮＡポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus，Norwalk CT)。PCR ラメータは、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間を３５サイクルであった。その生成物を、pHIL-D 4B2 のEcoRI 部位にサブクローニングして、それぞれdhaB1 およびdhaB2 を含有する表現プラスミドpMP19 およびpMP20 を得た。 pMP19 から得たBgl2/Xbal 断片にあるdhaB1 表現カセットを、pMP20 のBamH1/ Xbal部位へサブクローニングして、pMP21 を得た。プラスミドpMP21 は、dhaB2 およびdhaB1 の両方の表現カセットおよびHIS4選択性マーカーを含有する。dhaB3 およびdhaTの同時表現のためのプラスミドの構築 dhaTおよびdhaB3 のオープン・リーディング・フレームは、PCR により、コスミドpKP1から、５′末端にEcoRI 部位を有するプライマー（それぞれdhaTおよび dhaB3 として配列番号７を有する配列番号６および配列番号９を有する配列番号８）を用いて増幅した。この生成物をpHIL-D4B2 のEcoRI 部位にサブクローニングして、それぞれdhaTおよびdhaB3 を含有する表現プラスミドpMP17 およびpMP1 8 を得た。このpMP1から得たBgl2/Xbal 上にあるdhaT表現カセットを、pMP18 のBamH1/Xb al部位にサブクローニングして、dhaTおよびdhaB3 の両方に対する表現カセットを含有するpMP22 を得た。 SUC2を含有する4.1kb のEcoR1 断片を、pRK20 （Phillip Petroleum，Bartles sville，OK）から欠失させて、pMP2を得た。SUC2は、ピヒアにおける第２の選択マーカーとして用いることができるインベルターゼをコードしている。LacZを含有する4.0kb のHind3 断片をpMP2から欠失させて、pMP3を得た。pHIL-D4 から得たAOX1 term を含有する0.4kb のHind3 断片を、pMP3のHind3 部位にサブクローニングして、pMP10 を得た。 pMP10 にある2.0kb のBgl12/Xbal断片を、pMP22 から得たdhaB3 およびdhaT表現カセットを含有する5.0kb のBgl2/Xbal 断片と置き換えて、pMP23 を得た。pR K20 から得たSUC2を含有する5.4kb のPst1/Bgl2 断片を、pSP73(Promega 社，Ma dison，WI)のPst1/Bgl2 部位にサブクローニングして、pMP11aを得た。プラスミドpMP11aをEcoR1 で切断し、T4DNA ポリメラーゼで満たして、再結合して、pMP1 1bを得た。pMP10 にある１．１ｋｂのPst1/Bgl2 断片を、pMP11bから得たSUC2を含有する5.4kb のBgl2/Pst1 断片で置き換えて、pMP12 を得た。 pMP23 にある1.0kb のScal/Bgl2 断片を、pMP12 から得たSUC2を含有する５．２ｋｂのScal/Bgl2 断片で置き換えて、pMP24 を得た。プラスミドpMP24 は、dh aTおよびdhaB3 の両方の表現カセットおよびSUC2選択性マーカーを含有する。dhaB1/dhaB2 表現プラスミドpMP21 によるＰ．パストリスの形質転換Ｐ．パストリス菌株GTS115(his4)（Phillips Petroleum，Bartlesville，OK）を、１〜２ugのBgl2一直鎖化プラスミドpMP21 で、Cregg ら(Mol．Cell. Biol．5，3376，(1985))により記載されているスフェロプラスト形質転換法を用いて形質転換した。細胞は、ヒスチジンを含有しないプレート上で３〜４日間にわたって３０℃で再生した。プラスミドＤＮＡを染色体に組込んだ後で、全ての形質転換体が生じた。形質転換体をYPD(１％Bacto 酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース)マスタープレートにパッチした(patched)。dhaB1 およびdhaB2 についてのＰ．パストリス形質転換体のスクリーニング染色体ＤＮＡは、上記のhis⁺形質転換体から調製し、dhaB1 およびdhaB2 に特異的であるプライマーを用いたPCR 分析に供した。高コピー数の菌株を、dhaB1 およびdhaB2 の両方を含有する形質転換体から、２０００μｇ／ｍＬ以下の高濃度のG418(sigma社，St．Louis，MO)を補充したYPD 培地での増殖によって選択した。高濃度のG418に対する耐性は、表現カセットの顕著な複製を示唆する。Ｐ．パストリスのdhaB3/dhaT表現プラスミドpMP24 による２次形質転換上記の高濃度のG418に対する耐性を有する形質転換体を、プラスミドpMP24 用いて、スフェロプラスト形質転換法を用いて再形質転換した。細胞は、まず最初に非選択性プレート上で２日間にわたって３０℃で再生し、その後で、再生した細胞を含有する上部の寒天を該プレートから削り取り、２０ｍＬの水の中で広く渦動処理した。４つ折りにしたチーズクロスを通過させた後、該細胞を遠心分離によりペレット化し、１０ｍＬの水に再懸濁した。２００μＬのアリコートをスクロース・プレートに拡げ、２日間にわたって３０℃でインキュベートした。全ての形質転換体は、プラスミドＤＮＡを染色体に組込んだ後で生じた。形質転換体は、小さなコロニーの背景の中に大きなコロニーとして出現し、単離が必要となる。Msu 培地（１Ｌ当たり、１３．４ｇの酵母窒素ベースw/o アミノ酸、１０ｇのスクロース、０．４ｇのビオチン）中で３０℃で攪拌しながら２４時間増殖させた後、形質転換体をMsu プレート（Msu 培地＋１５ｇ／Ｌの寒天）に縞状に塗布し、２日間にわたって３０℃で増殖させた。大きな単離コロニーをYPD マスタープレートにパッチした。dhaB1 、dhaB2、dhaB3 およびdhaTのＰ．パストリス二重形質転換体のスクリーニングおよびそれらの対応する酵素活性染色体ＤＮＡを上記のsuc⁺二重形質転換体から調製し、dhaB1、dhaB2。DhaB3 およびdhaTに特異的なプライマーを用いたPCR 分析に供した。このようにして、全４種のオープン・リーディング・フレームの存在が確認された。活性グリセロールデヒドラターゼ(dhaB)および１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)の存在は、in vitro酵素アッセイを用いて実証した。さらに、ウエスタン・ブロット解析により、全４種のオープン・リーディング・フレームからのタンパク質表現が確認された。これらのタンパク質の特徴決定のための無細胞抽出物を以下のようにして調製した。すなわち、dhaB1、dhaB2、dhaB 3 およびdhaTを含有する二重形質転換体を、MGY(１Ｌ当たり、１３．４ｇの酵母窒素ベース（アミノ酸なし）、０．４ｍｇのビオチン、１０ｍＬのグリセロール )中で２日間にわたって３０℃で攪拌しながら好気的に増殖させた。この細胞を遠心分離によってペレット化し、MM（１Ｌ当たり、１３．４ｇの酵母窒素ベース（アミノ酸なし）、０．４ｍｇのビオチン、５ｍＬのメタノール）中に再懸濁し、上記したようにしてインキュベートした。約２４時間後、その細胞を収集し、緩衝液（０．１Ｍのトリセン(tricene)/KOH 緩衝液（ｐＨ８．２）、５０ｍＭの KCl ，および２％の１，２−プロパンジオール）に再懸濁し（ガラス製ロッドを用いてガラスビーズの存在下で渦動処理しながら）、機械的に粉砕し、遠心分離した。全４種(dhaB1、dhaB2、dhaB3 およびdhaT)のオープン・リーディング・フレームの存在について陽性を示し、かつそれらの対応する活性を示した１つの菌株を MSP42.81と命名し、これをさらなる研究用に選択した。組換えピヒア・パストリスを用いた１，３−プロパンジオールのin vivo 生産Ｐ．パストリスMSP42.81（ATCC74363）を、８．５ｇ／ＬのKH₂PO₄と、２．１ｇ／Ｌの(NH₄)₂SO₄と、１０ｇ／Ｌのグリセロールと、２．３ｇ／ＬのMgSO₄・7H₂ Oと、０．１８ｇ／ＬのCaSO₄・2H₂Oと、０．２９ｍＬ／ＬのPTMIとを含有する１．５Ｌの最少培地を含有するBuostat B 発酵槽(B．Braun Biotech， Inc.)で増殖させた。PTMIは、２４ｍＭのCuSO₄、４．８ｍＭのKI、１８ｍＭのMn SO₄、０．８ｍＭのNa₂MoO₄、０．３ｍＭのH₃BO₃、２．１ｍＭのCoCl₂、７０ｍＭのZnSO₄、２６ｍＭのH₂SO₄、２３４ｍＭのFeSO₄、および０．８ｍＭのビオチンを含有する保存無機溶液である。この発酵槽は、2MのNH₄OH を用いてｐＨ５．０に、および攪拌コントロールにより３０％の溶存酸素圧力に制御した。YMブイヨン中３０℃で増殖させたＰ．パストリス MSP42.81 の培養物を接種材料として用い、２０ｍＬの該培養物を用いて上記発酵槽に接種した。グリセロールが枯渇したことが示されたら（接種から２４時間後）、メタノール供給材料の添加によりAOX プロモーターの誘発を開始した。この供給材料は、１リットルのメタノールと、５ｍＬのPTMIと、０．２ｇ／Ｌ（水中）として調製された５ｍＬの保存ビオチン溶液とを含有していた。このメタノール溶液を手操作で添加して、０．５％（ＨＰＬＣ解析で決定）の平均濃度を維持した。誘発から５０時間後に５０ｍＬの細胞（ＯＤ₆₀₀＝２０ＡＵ）を上記反応槽から取り出した。この５０ｍＬの細胞懸濁液をペレット化し、１２．５ｍＬの窒素吹込みしたベース培地６．７ｇ／Ｌの酵母窒素ベース、３．０ｇ／Ｌの酵母エキス、１．０ｇ／ＬのK₂HPO₄、１．０ｇ／ＬのKH₂PO₄、３．０ｇ／Ｌの(NH₄)₂SO₄、ｐＨ７．２に滴定し、濾過滅菌したもの］に再懸濁した。補酵素Ｂ₁₂は、窒素吹込みした水に溶解した２ｍｇ／ｍＬの保存溶液として調製し、これを、上記細胞懸濁液に添加して、２０μｇ／ｍＬの最終濃度にした。３種の培地保存溶液を調製して１％のグルコース、０．５％のグルコースと０．５％(w/v)のグリセロール、および１．０％（w/v）のグリセロールを含有するベース培地とした。クロロキン(chlo roquine)の保存溶液（１．０６ｇ／５０ｍＬ、ｐＨ７．２）も調製した。表１０に記載した最終濃度になるように調製した２ｍＬの上記培地保存溶液およびクロロクインと水との混合物１ｍＬとを１０ｍＬ容の圧着密封した血清ビンに入れ、窒素吹込みしてから１ｍＬの細胞と補酵素Ｂ₁₂との混合物を添加した。この血清ビンを３０℃で振盪しながらインキュベートした。細胞を添加した直後および２４時間インキュベートした後に取り出したサンプルをＨＰＬＣで分析した。結果を表１０に示す。実施例８Ｄ−グルコースからの１，３−プロパンジオール生産のためのピヒア・パストリス二重形質転換体の使用Ｐ．パストリス MSP42.81 をBiostatB発酵槽（B．Braun Biotech，Inc.）内で１．５Ｌの最少培地（８．５ｇ／ＬのKH₂PO₄、２．１ｇ／Ｌの(NH₄)₂SO₄、１０ｇ／Ｌのグルコース、２．３ｇ／ＬのMgSO₄・7H₂O、０．１８ｇ／ＬのCaSO₄・2H₂O および０．２９ｍＬ／ＬのPTMIを含有）で増殖させた。それ以外は、発酵および誘発条件は、実施例７に記載のものと同一であった。誘発の１５時間後に反応槽から５０ｍＬの細胞を取り出した。改変したベース培地（６．７ｇ／Ｌの酵母窒素ベース、１．０ｇ／ＬのKH₂PO₄ 、１ｇ／ＬのK₂HPO₄、３ｇ／Ｌの(NH₄)₂SO₄、ｐＨ７．２に滴定し、濾過滅菌した）を用いた以外は実施例７に記載した通り細胞懸濁液を処理した。この改変ベース培地でも３種類の培地保存溶液を調製した。他の溶液は全て同一であった。反応混合物を記載のようにして調製し、３０℃で振盪しながらインキュベートした。細胞添加直後および７５時間インキュベートした後で取り出したサンプルをＨＰＬＣで分析した。炭素源としてのグルコースおよび５ｍＭクロロキンを含有する反応物(reaction)では、０．１７ｍＭの１，３−プロパンジオールが得られた。実施例９形質転換のためのプラスミド構築およびサッカロミセス・セレビシエにおけるdhaBおよびdhaTの表現汎用の表現プラスミドの構築２種類の表現プラスミドを作製した。すなわち、組換えによって染色体に組込み可能なものと、複製エピゾームエレメントとして存在可能なものである。各種類の普遍的表現(general expression)プラスミドでは、酵母プロモーターが存在し、酵母転写ターミネーターから、１種以上の制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位を含有するＤＮＡの断片によって分離した。各種の普遍的表現プラスミドは、アンピシリン含有培地における大腸菌の選択のためのβ−ラクタマーゼの遺伝子、大腸菌でのプラスミド保持のための複製起点、および２ミクロンのエピゾーム・エレメントの複製起点または染色体に導入されたＤＮＡの組換えおよび組込みのためのS.セレビシエ染色体で見られるものと相同な配列の一方も含有していた。酵母で用いられ、かつ表現プラスミド上に存在する選択性栄養素マーカーは、イミダゾールグリセロールホスフェートデヒドラターゼをコードするHIS3 遺伝子、オロチジン５′−ホスフェートデカルボキシラーゼをコードするURA3遺伝子、Ｎ−（５′−ホスホリボシル）−アントラニレートイソメラーゼをコードするTRP1遺伝子、およびβ−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼをコードするLEU2遺伝子のうちの１つである。用いられる酵母プロモーターはADH1 またはGAL1であり、転写ターミネーターはADH1、CYC1、またはAOX1であり、後者はピヒア・パストリス由来である。プラスミドpGADGH（Clontech社，Palo Alto，CA）をHindIII で消化し、その１本鎖末端を、HindIII-XmnIおよびEcoRI-XmnIアダプター（New England Biolab s 社，Berverly，MA）との結合反応によってEcoRI 末端に変換した。正しいEcoR I 末端を有するプラスミドの選択は、プラスミドpUC4K(Pharmacia Biotech 社， Uppsala)から得たEcoRI 断片上のカナマイシン耐性遺伝子との結合反応、大腸菌株ＤＨ５αへの形質転換および２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢプレート上での選択によって達成した。得られたプラスミド（pGAD/KAN2）を、Sna BI およびEcoRI で消化し、ADH1プロモーターを有する１．８ｋｂの断片を単離した。プラスミドpGBT9(Clonetech 社，Palo Alto，CA)をSnaBI およびEcoRI で消化し、１．５ｋｂのADH1/GAL4 断片を、pGAD/KAN2 からSnaBI およびEcoRI による消化によって単離した１．８ｋｂのADH1プロモーター断片で置き換えた。得られたベクター（pMCK11）は、ADH1プロモーターと、ターミネーターと、TRP1マーカーとを有する、酵母における複製プラスミドである。プラスミドpGADGHを、SnaBI およびHindIII で消化し、ADH1プロモーターを含有する１．８ｋｂの断片を単離した。この断片を、あらかじめSmaIおよびHindII I で消化したベクターpRS405（Staratagene 社，La Jolla，CA）に結合した。陽性のクローンは、プラスミド・コード化lacZアルファ・ペプチドの挿入不活性化 (insertional-inactivation)およびADH1プロモーター断片の存在により同定した。得られたプラスミド（pMCK4）は、ADH1プロモーターおよびLEU2マーカーを含有していた。 pDH1ターミネーターを含有するpGBT9 由来の約０．２ｋｂ（〜０．２ｋｂ）の NaeI-EcoRI断片は、EcoRI-HincII消化pRS403(Stratagene 社，La Jolla，CA)に結合して、約４．８ｋｂのプラスミドpRVN5 を得た。ADH1プロモーターを含有するpGAD/KAN2 由来の約２．０ｋｂのSnaBI-EcoRI 断片を、SmaI-EcoRI消化pRVN5 に結合して、ADH1プロモーターと、ターミネーターと、中間に独自のEcoRI クローニング部位とを有する約６．８ｋｂのプラスミドpRVN6 を得た。もう１つのXmnI部位を含有するpGADGH由来の０．４ｋｂのHindIII 断片を欠失させ、このベクターを再度結合して、７．０ｋｂのベクターpGAD-D3 を得た。ベクターpGAD-D3 を、XmnIで消化して、ADH1プロモーターと、ターミネーターと、介在するHindIII クローニング部位とを含有する約２．４ｋｂの断片を精製した。pRS404ベクター（Starategene 社，La Jolla，CA）をPvuII で消化し、TRP1を有する大きい方の３．８ｋｂの断片を精製し、pGAD-D3 から得たXmnIプロモーターおよびターミネーター断片に結合して、プラスミドpRVN11を得た。 dhaT、dhaB3 およびdhaB1 のためのオープン・リーディング・フレームは、pH K28-26（配列番号１）から、PCR により、プライマー（dhaT、dhaB3 およびdhaB 1 の各々について、それぞれ配列番号７と配列番号６、配列番号８と配列番号９、および配列番号２と配列番号３）を用いて、EcoRI 部位を５′末端に組込んで増幅した［１０ｍＭ Tris （ｐＨ８．３）、５０ｍＭ KCl、１．５ｍＭMgCl₂、０．０００１％ゼラチン、２００μＭ dATP、２００μＭ dCTP、２００μＭ dGT P、２００μＭ dTTP、１μＭの各プライマー、１〜１０ｎｇ標的ＤＮＡ、２５単位／ｍＬ Amplotaq(登録商標)ＤＮＡポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus 社，Nor walk CT)］。PCR パラメーターは、９４℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１分間で３５サイクルであった。生産物を、pHIL-D4(Philips Petroleum 社，Bartlesville，OK)のEcoRI 部位へサブクローニングして、dhaT、dhaB3 およびdhaB1 をそれぞれ含有するプラスミドpMP13、pMP14 およびpMP15 を得た。dhaT 表現用プラスミドの構築複製プラスミドpGAD/KAN2 をEcoRI で消化してカナマイシン耐性断片を取り除き、脱リン酸化し、pMP13 から得たdhaT EcoRI断片に結合した。得られたプラスミド(pMCK13)は、ADH1プロモーターからの転写に対して正しい方向に挿入されているdhaTを有しており、かつLEU2マーカーを含有していた。プラスミドpRNV6 をEcoRI で消化し、ｐMP13から得たdhaT EcoRI断片に結合した。得られたプラスミド（pRVN6T）は、ADH1プロモーターからの転写に対して正しい方向に挿入されているdhaTを有しており、かつHIS3マーカーを含有していた。dhaB1 表現用プラスミドの構築複製プラスミドpGADGHをHindIII で消化し、脱リン酸化し、pMP15 から得たdh aB1 HindIII 断片に結合した。得られたプラスミド(pMCK10)は、ADH1プロモーターからの転写に対して正しい方向に挿入されているdhaB1 を有しており、かつLE U2マーカーを含有していた。dhaB2 表現用プラスミドの構築複製プラスミドpMCK11をEcoRI で消化、脱リン酸化し、pMP20 から得たdhaB2 EcoRI 断片に結合した。得られたプラスミド(pMCK17)は、ADH1プロモーターからの転写に対して正しい方向に挿入されているdhaB2 を有しており、かつTRP1マーカーを含有していた。プラスミドpRS403をSmaIで消化し、pMCK17から得たSnaBI-NaeI dhaB2 断片に結合した。得られたプラスミド（pMCK21）は、ADH1プロモーターからの転写に対して正しい方向に挿入されているdhaB2 を有しており、かつHIS3マーカーを含有していた。dhaB3 表現用プラスミドの構築複製プラスミドpYES2(Invitrogen社，San Diego，CA)をEcoRI で消化、脱リン酸化し、pMP14 から得たdhaB3 EcoRI 断片に結合した。得られたプラスミド (pMCK1)は、GAL1プロモーターからの転写に対して正しい方向に挿入されているd haB3 を有しており、かつURA3マーカーを含有していた。複製プラスミドpGAD/KAN2 をEcoRI で消化し、脱リン酸化し、pMP14 から得た dhaB3 EcoRI 断片に結合した。得られたプラスミド（pMCK15）は、ADH1プロモーターからの転写に対して正しい方向に挿入されているdhaB3 を有しており、かつ LEU2マーカーを含有していた。プラスミドpRS404をPst およびHincIIで消化し、pMCK15から得たPstI/EcoRV d haB3 断片に結合した。得られたプラスミド（pMCK20）は、ADH1プロモーターからの転写に対して正しい方向に挿入されているdhaB3 を有しており、かつTRP1マーカーを含有していた。dha 表現プラスミドによるＳ．セレビシエの形質転換Ｓ．セレビシエ株YPH499(ura3-52 lys2-801 ade2-101 trip1-de163 his3-de12 00 leu2-de11)（Stragagene社，La Jolla，CA）を１〜２μg のプラスミドＤＮＡにより、Stratagene社から発行されているLiCl/ ポリエチレングリコール・プロトコール（カタログ番号217406）を用いて形質転換した。あるいはまた、形質転換は、Zymo Research 社（Orange，CA）の凍結−EZ酵母形質転換キット（カタログ番号T2001）を用いて達成した。コロニーは、補足最少培地（SMM-０．６７％の酵母窒素ベース（アミノ酸なし）、２％のグルコース）で３〜４日間にわたって２９℃で、以下の添加物の１種以上を用いて増殖させた。すなわち、アデニンサルフェート（２０ｍｇ／Ｌ）、ウラシル（２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−トリプトファン（２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ヒスチジン（２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ロイシン（３０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−リジン（３０ｍｇ／Ｌ）の添加物である。コロニーを選択プレート（選択培地）に縞状に塗布し、液体培地への接種に用いた。使用するベクターに応じて、コロニーは、プラスミドＤＮＡの組込みの後に得られたもの、あるいはエピゾームの複製から得られたもののいずれかであった。単一の種類のプラスミドによる形質転換に加えて、２種以上のプラスミドによる同時形質転換を行った。形質転換したＳ．セレビシエにおけるdhaB活性の表現プラスミドpMCK1、pMCK10およびpMCK17により形質転換した菌株YPH499を、補足最少培地（アミノ酸を含有しない０．６７％の酵母窒素ベース、２％のグルコース、２％のラフィノース、２０ｍｇ／Ｌのアデニンサルフェート、３０ｍｇ／ＬのＬ−リジン、２０ｍｇ／ＬのＬ−ヒスチジンを含有）で増殖させた。細胞をホモジナイズし、抽出物をdhaB活性についてアッセイした。０．０２１ユニット／ｍｇの比活性が得られた。実施例１０Ｓ．セレビシエの形質転換体に対する代替複製および組換えプラスミドの構築汎用の表現プラスミドは、SnaBI/EcoRI ADH1プロモーター断片をpGAD/KAN2 から単離し、この断片を、HincIIおよびEcoRI で予め消化しておいたベクターpRS4 06(Stratagene 社，La Jolla，CA)に結合する。陽性のコロニーは、プラスミドによってコード化されるlacZアルファペプチドの挿入不活性化およびADH1プロモーター断片の存在により同定する。得られたプラスミド(pMCK3)をEcoRI およびS maIで消化し、プラスミドpGBT9 をEcoRI およびNaeIで消化することにより遊離させた0.2kb のADH1ターミネーター断片に結合する。得られたプラスミド(pMCK5 )は、ADH1プロモーターおよびターミネーターの双方の配列とURA3マーカーとを含有する。DhaT 表現用プラスミドの構築ベクターpMCK5 を、EcoRI で消化し、脱リン酸化した。dhaT遺伝子を、プラスミドpMP13 からEcoRI 断片として切り出し、pMCK5 に結合する。得られたプラスミド(pMCK7)は、ADH1プロモーターからの転写に対して正しい方向に挿入されているdhaTを有しており、かつURA3マーカーを含有している。組込みベクターpRS404をKpnIおよびSacIで消化する。フランキング・プロモーターおよびターミネーターを有するdhaT遺伝子は、プラスミドｐMCK7から KpnI/SacI 断片として切り出し、pRS404に結合する。得られたプラスミドは、AD H1プロモーターからの転写に対して正しい方向に挿入されているdhaTを有しており、かつTRP1マーカーを含有している。dhaB1 表現用プラスミドの構築ベクターpMCK5 をEcoRI で消化し、脱リン酸化する。dhaB1 遺伝子を、プラスミドpMP15 からEcoRI 断片として切り出し、pMCK5 と結合する。得られたプラスミド(pMCK8)は、ADH1プロモーターからの転写に対して正しい方向に挿入されているdhaB1 を有しており、かつURA3マーカーを含有している。組込みベクターpRS403をClaIおよびAatII で消化する。フランキング・プロモーターおよびターミネーターを有するdhaB1 遺伝子を、プラスミドpMCK8 からCl aI/AatII断片として切り出し、pRS403に結合する。得られたプラスミドは、ADH1 プロモーターからの転写に対して正しい方向に挿入されているdhaB1 を有しており、かつHIS3マーカーを含有する。複製プラスミドpYES2 をHindIII およびSnaBI で消化し、GAL1プロモーター・エレメントを、pGADGHからSnaBI およびHindIII で消化したADH1プロモーター断片による結合によって置き換える。pMP19 から得たdhaB1 HindIII およびXbaI断片を、改変したADHIプロモーターバージョンのpYES2 のそれらの部位に結合する。得られたプラスミドは、ADH1プロモーターからの転写に対して正しい方向に挿入されたdhaB1 を有し、かつURA3マーカーを含有する。ベクターpMCK4 をHindIII で消化し、脱リン酸化する。dhaB1 遺伝子を、プラスミドpMP15 からHindIII 断片として切り出し、ｐMCK4に結合する。得られたプラスミドは、ADH1プロモーターからの転写に対して正しい方向に挿入されたdhaB 1 を有し、かつLEU2マーカーを含有する。dhaB2 表現用プラスミドの構築ベクターpRS404、pRS405およびpRS406をSmaIで消化する。フランキング・プロモーターおよびターミネーターを有するdhaB2 遺伝子を、プラスミドpMCK17から SnaBI/NaeI断片として切り出し、組換えベクターの各々に結合する。得られたプラスミドは、ADH1プロモーターからの転写に対して正しい方向に挿入されている dhaB2 を有しており、かつLEU2、TRP1またはURA3マーカーのいずれかを含有する。実施例１１Ｓ．セレビシエのdha 形質転換体についてのスクリーニングおよびＤ−グルコースの１，３−プロパンジオールへの転化Ｓ．セレビシエのdha 遺伝子についてのスクリーニング Ura⁺、His⁺、Trp⁺またはLeu⁺形質転換体（実施例９および１０に記載の通り構築したもの）から得た染色体ＤＮＡを、PCR により、ピヒア・パストリスについて記載したような各遺伝子に特異的なプライマー（配列番号２〜９）を用いて分析する。dha 遺伝子で形質転換したＳ．セレビシエによるＤ−グルコースからの１，３− プロパンジオールの生産 dhaT、dhaB1、dhaB2 およびdhaB3 を含有する形質転換体（実施例９および１０に記載の通り構築したもの）を、振盪しながら、２９℃で、２０ｍｇ／Ｌのアデニンサルフェート、３０ｍｇ／ＬのＬ−リジン、1mg/L のビタミンＢ₁₂を補足したSMM 中で、好気的または嫌気的に増殖させる。増殖は、定常期に達するまで継続し、１，３−プロパンジオールの存在をHPLCによって測定する。形質転換体Ｓ．セレビシエpMCK1/10/17(HM)#A は寄託し、ATCC と命名した。実施例１２水素雰囲気下でのクロストリジウム・パストリアナム (Clostridium pasteurianum)(ATCC6013) によるＤ−グルコースからの１，３−プロパンジオールの生産クロストリジウム・パストリアナムに一般的な増殖条件クロストリジウム・パストリアナムATCC6013を、特記しない限り１０ｍＬの培地を含有する６０ｍＬ容の圧着密封した血清ビン内で増殖させた。培地を含有するこの圧着ビンに窒素を無菌的に吹込んだ後で、植菌した。ベース培地（培地Ａ）（ｐＨ７．２に調整したもの）は、以下の成分（ｇ／Ｌ）：１．４のKH₂PO₄、０．６９のNaH₂PO₄、１．８〜２．５のNH₄Cl、０．５０のKCl、０．５０のMgSO₄ ・ 7H₂O、０．０２５のCaCl₂、１．０の NaCl、２．０の酵母エキス、０．５０のシステイン・HCl、２．５の重炭酸ナトリウム、０．００８０のｐ−アミノ安息香酸、０．００００４０のビオチン、０．１０のクエン酸ナトリウム・2H₂O、０．０５０のFeSO₄・7H₂O、０．０１０のCoCl₂・6H₂O、０．００１０のMnCl₂・4H₂O、０．０００５０のZnCl₂、０．００２５のNa₂MoO₄・2H₂O、０．０１０のNiCl₂・6H₂ O、および０．００５０のCuSO₄・5H₂Oを含有しており、そこに、炭素成分を以下に示すように添加した。全てのインキュベーションは、３０℃で、250rpmで振盪しながら行った。５％グルコースを補足した培地Ａの１０ｍＬ容バッチに、約１５％(v/v)のグリセロールを含有するクロストリジウム・パストリアナムATCC6013の凍結保存物１ｍＬを２連で接種した。９６時間後、０．５ｍＬの増殖細胞懸濁液を１０ｍＬの新たに調製した培地に継代し、増殖を継続した。２４時間後、新たに接種したビンの中の雰囲気を水素を用いて３０psi の気圧に保ち、インキュベーションをさらに９６時間にわたって継続した。その水相を、最後の９６時間の最初と最後にサンプリングし、一般的方法の欄に記載されているようなHPLCによる分析に供した。結果を表１１に示す。実施例１３メチルビオローゲン存在下でのクロストリジウム・パストリアナムATCC6013 によるＤ−グルコースからの１，３−プロパンジオールの生産実験１．全細胞を実施例１２のプロトコールにしたがって増殖させた。１０ｍＬ容バッチの５％グルコースを補足した培地Ａ（実施例１２に記載のもの）に、１ｍＬのクロストリジウム・パストリアナムATCC6013の凍結保存（約１５％(v/v )のグリセロールを含有）を２連に接種した。９６時間後、０．５ｍＬの増殖細胞懸濁液を１０ｍＬの新たに調製した培地に継代し、増殖を継続した。２４時間後、メチルビオローゲン（１，１′−ジメチル−４，４′−ビピリジニウムジクロライド）を、新たに接種したビンに1mM の最終濃度で添加して、インキュベーションをさらに９６時間にわたって継続した。水相を、最後の９６時間の開始時および最後にサンプリングして、一般的方法の欄に記載のようなHPLCによる分析に供した。結果を表１２に示す。実験２：１％(v/v)グリセロール＋１％(w/v)グルコースを補足した培地Ａを、クロストリジウム・パストリアナムATCC6013の凍結ストック（約１５％(v/v) のグリセロールを含有）で培地２０ｍＬ当たり凍結ストックを０．２ｍＬの比率で接種した。４８時間後、１０ｍＬの細胞懸濁液を９０ｍＬの新たに調製した培地に添加して、増殖を２４時間にわたって継続した。１００ｍＬの細胞懸濁液を氷上で冷却し、嫌気的条件下で遠心分離によって細胞を集めた。この細胞を嫌気的緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）＋０．５ｇ／Ｌシステイン・HC l、予めN₂を吹込み、Ｎ₂下でオートクレーブ処理したもの）で３回洗浄し、嫌気的緩衝液に再懸濁して８ｍＬとした。２連の実験では、１ｍＬのこの細胞懸濁液を、１０ｍＬの培地Ａ（１％グルコースおよび０ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭのメチルビオローゲンを補足したもの）に接種し、２４０時間にわたってインキュベートした。最後の２４０時間の開始時と最後に水相をサンプリングして、一般的方法の欄に記載のようなHPLCによる分析に供した。結果を表１３に示す。実験３：クロストリジウム・パストリアナニウムATCC6013を最初にチオグリコレート培地（Difco(登録商標)）に保持し、続いて行われる全ての研究用として、０．４％グルコースを補足した培地Ａに移した。後者の培地に数回移した後、保存培養物の１ｍＬのアリコートを１０ｍＬの上記の培地中で一夜増殖させることによって、接種材料を調製した。新たに調製した培地のビン中にメチルビオローゲンを表１４に記載のような濃度で含有する一連の血清ビンに、１ｍＬの上記一夜の培養物を接種し、表１４に記載の時間にわたって再度インキュベートした。ビンは、グルコース利用性(glucose utilization)を測定するために一定時間毎にサンプリングし、１，３−プロパンジオールおよびグルコースの存在を一般的方法の欄に記載のようにしてHPLCにより分析した。表１４には、その分析結果をまとめる。実施例１４バシルス、ストレプトミセスおよびシュードモナス種の形質転換に使用するための汎用表現プラスミドの構築表現ベクターpTacIQ 大腸菌表現ベクターであるpTacIQは、pBR322（Sutcliffe ら、Cold Spring Ha rb．Symp．Quant．Biol．43，77(1979)）のEcoRI に挿入されたlacIq 遺伝子(Fa rabaugh，Nature 274，5673(1978))およびtac プロモーター(Amannら、Gene 25 ，167(1983))を含有する。複数のクローニング部位およびターミネーター配列（配列番号１０）は、pBR322配列を、EcoRI からSphIへと置き換える。グリセロールデヒドラターゼ遺伝子(dhaB1,2,3)のサブクローニング dhaB3 遺伝子に対するオープン・リーディング・フレームを、pHK28-26から、 PCR により、プライマー（配列番号４１および４２）を用いて、EcoRI 部位を５ ′末端に、およびXbaI部位を３′末端に組込んで増幅した。生成物をpLitmus29( New England Biolab社，Inc.，Beverly，MA)にサブクローニングして、dhaB3 含有するプラスミドpDHAB3を得た。 pHK28-26から得たdhaBオペロンの4 種の遺伝子に対する全コード領域を含有する領域を、制限酵素KpnIおよびEcoRI を用いてpBluescriptII KS⁺(Stratagene社，La Jolla，CA)にクローニングして、プラスミドpM7 を調製した。このdhaBX 遺伝子は、dhaB(1,2,3,4)を含有するプラスミドpM7 を、ApaIおよびXbaIで消化すること（dhaB3 の部分およびdhaBX の全部を欠失すること）によって取り出した。得られた5.9kb の断片を精製し、プラスミドpDHAB3（dhaB3遺伝子を再保存している）から得られた325bp のApaI-XbaI 断片に結合して、dhaB (1,2,3)を含有するpM11を調製した。 dhaB1 遺伝子に対するオープン・リーディング・フレームを、pHK28-26から、 PCRにより、プライマー（配列番号１１および１２）を用いて増幅し、HindIII部位およびコンセンサスRBS リボソーム結合部位を５′末端に、およびXbaI部位を３′末端に組込んだ。この生成物を、pLitmus28 （New England Biolab，Inc.）にサブクローニングして、dhaB1 を含有するプラスミドpDT1を得た。 dhaB1 遺伝子、dhaB2 遺伝子およびdhaB3 遺伝子の一部を含有するPM11から得たNotI-XbaI 断片をpDT1に挿入して、dhaB表現プラスミドを作製した。pDT2から得たdhaB(1,2,3)遺伝子を含有するHindIII-XbaI断片をpTacIQに挿入して、pDT3 を調製した。１，３−プロパンジオールデヒドラターゼ遺伝子(dhaT)のサブクローニング完全な１，３−プロパンジオールデヒドラターゼ(dhaT)遺伝子を含有する、pH K28-26のKpnI-SacI 断片を、pBluescriptII KS⁺にサブクローニングして、プラスミドpAH1を構築した。このdhaT遺伝子を、鋳型DNA としてpAH1から、PCR により、合成プライマー（配列番号１３と配列番号１４）を用いて増幅して、XbaI 部位を５′末端に、およびBamHI 部位を３′末端に組込んだ。この生成物をpCR- Script（Stratagene社）のSrfI部位にサブクローニングして、dhaTを含有するプラスミドpAH4およびpAH5を得た。プラスミドpAH4は、dhaT遺伝子を、pCR-Script におけるlac プロモーターからの表現に対して正しい方向に含有し、pAH5は、dh aT遺伝子をその逆方向に含有する。dhaT遺伝子を含有するpAH4から得たXbaI-Bam HI断片を、pTacIQに挿入して、プラスミドpAH8を得た。RBS およびdhaT遺伝子を含有するpAH8から得たHindIII-BamHI 断片をpBluescriptII KS⁺に挿入して、pAH 11 を構築した。RBS を含有するpAH8から得たHindIII-SalI断片、dhaT遺伝子およびターミネーターをpBluescriptII KS+に挿入して、pAH12 を作製した。dhaB(1,2,3) およびdhaTの表現カセットの構築 dhaB(1,2,3)およびdhaTのための表現カセットは、上記のdhaB(1,2,3)およびdh aTサブクローンの各々から、標準的な分子生物学的方法を用いてアセンブリした。RBS を含有するPAH8から得たSpeI-KpnI 断片、dhaT遺伝子およびターミネーターをpDT3のXbaI-KpnI 部位に挿入して、pAH23 を作製した。pAH23 のdhaB3遺伝子とdhaT遺伝子との間にあるSmaI-EcoRI断片を除去して、pAH26 を作製した。pP DT2 由来のEcoRI 部位を含有するSpeI-NotI 断片を用いて、pAH26 のSpeI-NotI 断片を置き換えて、pAH27 を得た。dhaT およびdhaB(1,2,3)の表現カセットの構築 dhaTおよびdhaB(1,2,3)の表現カセットを、前述のdhaB(1,2,3)およびdhaTサブクローンの各々から、標準的な分子生物学的方法を用いてアセンブリした。pDT3 由来のdhaB(1,2,3)遺伝子を含有するSpeI-SacI 断片をpAH11 のSpeI-SacI部位に挿入して、pAH24 を作製した。実施例１５組換えストレプトミセス・リビダンスによる１，３−プロパンジオールの生産グルコースイソメラーゼ・プロモーターのサブクローニングベクターpCOs121 （配列番号１５）またはpCO121low(配列番号１６)から得たグルコースイソメラーゼ・プロモーターの2 種類のバージョンをPCR によって、プライマー（配列番号１７および１８）を用いて増幅して、SpeIおよびEcoRI位を５′末端に、およびHindIII 部位を３′末端に組込んだ。この生成物をpLitmu s29(New England Biolabs，Inc.，Berverly，MA)にサブクローニングして、プラスミドpDT7およびpDT8を得た。dhaB(1,2,3) およびdhaTの表現カセットの構築 pAH27 （実施例１４）由来のdhaB(1,2,3)およびdhaTのための4.1kb の表現カセットを、制限酵素HindIII およびSalIを用いてpDT7またはpDT8に挿入して、pD T11 およびpDT12 をそれぞれ得た。ストレプトミセスにおけるdhaB(1,2,3)およびdhaTの同時表現用のプラスミドの構築 4.3kb のdhaB(1,2,3)およびdhaTの表現カセットを、EcoRI およびSalIによる消化によりpDT11 またはpDT12 から取り出した。ベクターpIJ488-101を制限酵素 EcoRI およびXbaIで消化した。この表現カセットおよびベクターをSal-Xba リンカー（配列番号１９および２０）と共に結合し、pDT13 およびpDT14 をそれぞれ作製した。 pIJ488-101は、ストレプトミセス・リビダンス（Kendall およびCohen，J．Ba cteriol．170，4634(1988)）から得たpIJ101からの複製起点および大腸菌から得たpUC18 から構成される。これらの配列は、以下に由来する。すなわち、１〜２０８６番目の塩基はpIJ101（１〜２０８６）由来であり、７６８８〜８４３７番目の塩基はpIJ101（８０８０〜８８３０）由来である。２０８７〜３３６８番目の塩基は、S.アズレウス(S.azureus)(Thompsonら、Gene，20，51 (1982))からのチオストレプトン耐性遺伝子由来である。３３６９〜７６８７番目の塩基は、KpnI部位に挿入されたＳ．エリスレウス(S.erythreus)(前出のThom psonら)からのエリスロマイシン耐性遺伝子を含有するpUC18 由来である。ストレプトミセス・リビダンスのdhaB(1,2,3)およびdhaTによる形質転換プラスミドpDT13 またはpDT14 を、標準的な原形質形質転換技術（Hopwoodら、Genetic Manipulation of Stretomces，The Johns Foundation（1985））を用いてストレプトミセス・リビダンスTK23に形質転換した。形質転換体は、５０μ ｇ／ｍＬ）のチオストレプトンを含有する培地(plate)上で選択して、３０℃でインキュベートした。形質転換体から得た胞子を再度培地に拡げて、純粋な培養物を得た。グリセロールデヒドラターゼ活性の検出ストレプトミセス形質転換体を２５ｍＬのTSB （トリプトンソイブロス；Difc o，Detroit，MI；さらに、１％グルコース、２％グリセロール、１ｍｇ／ＬビタミンＢ₁₂、５０μｇ／ｍＬチオストレプトンを補足したもの）で３０℃で３日間にわたって増殖させた。細胞を遠心分離により収集し、１ｍＬの１００mMトリス緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁した。細胞をフレンチプレス（２０，０００ｐｓｉ）を用いて破砕し、細胞抽出物を、一般的方法の欄に記載のようにしてグリセロールデヒドラターゼについてアッセイした。pDT13 またはpDT14 のいずれかにより形質転換したＳ．リビダンスTK23（それぞれ、クローン番号８またはクローン番号２）から得た細胞抽出物は、０．１Ｕ／ｍｇの比活性を有するグリセロールデヒドラターゼを含有していた。組換えストレプトミセス・リビダンスにおける１，３−プロパンジオールの生産Ｓ．リビダンスTK23/pDT14（クローン番号２）（ATCC 、Ｓ．リビダンス株SL14.2としても同定される）をTSA プレートから接種し、２５０ｍＬ容のフラスコに入れた２５ｍＬのTSB(トリプトンソイブロス，Difco，Detroit，MI；さらに、１％グルコース、２％グリセロール、１ｍｇ／ＬビタミンＢ₁₂、５０μｇ／ｍＬチオストレプトンを補足したもの）中で増殖させた。振盪フラスコを３０℃ で激しく振盪しながら３日間にわたってインキュベートし、その後、一般的方法の欄に記載のようにして、上清のGC-MS 分析（TMS 誘導体）により、３ｍｇ／Ｌの１，３−プロパンジオールを検出した。実施例１６組換えストレプトミセス・リビダンスを用いたＤ−グルコースからの１，３−プロパンジオールの生産１，３−プロパンジオール生産を証明するための、pDT13 またはpDT14 を含有するストレプトミセス・リビダンスTK23における増殖は、３０℃で振盪フラスコ培養（エルレンマイヤー・フラスコ、液体体積：全容積の１／１０）で好気的に行う。富培地(rich media)の振盪フラスコにおける培養は、２日経過したTSA プレート（トリプチダーゼソイ寒天、BBL ＃11043）から接種することにより開始する。豊富培地は、TBS(トリプチカーゼソイブロス；BBL#11768)、液体ブイヨン（１Ｌ当たり、１６ｇのトリプトン、１０ｇの酵母エキス、および５ｇのNaClを含有）、培地Ｂ（１Ｌ当たり、１０．０ｇのグルコース、NTA をクエン酸に置き換えた２ｍＬの改変バルヒ(Balch)微量元素溶液、２．０ｇのNa₂CO₃、４．０ｇのK₂H PO₄、１ｍｇのビタミンＢ₁₂を補足したTSB、最終ｐＨ＝７．２）、または培地Ｃ（培地Ｂ、ｐＨ６．４）のいずれかである。改変バルヒ微量元素溶液の組成は、Methods for General and Molecular Bacteriology (P．Gerhardt ら編、p.158 ，American Society for Microbiology，Washington，D.C．(1994))に見出すことができる。最少培地振盪フラスコ内での培養は、２日経過した液体TSB 培養物から、1/30(v/v)の接種材料を用いて接種することにより開始する。最少培地は、MM322(１Ｌ当たり、１２．０ｇのグルコース、１１．３ｇのK₂HPO₄、１．０ｇの(NH₄)₂SO₄、０．２ｇのDifco 酵母エキス、０．１ｇのNaCl、２ｍｇのビタミンＢ₁₂、および１０ｍＬの上記のように改変した改変バルヒ微量元素溶液を含有、最終ｐＨ６．７(HCl))、培地Ｄ（１Ｌ当たり２ｇのNa₂CO₃を補足した培地MM322、最終ｐＨ７．２）、または培地Ｅ（培地Ｄ，最終ｐＨ６．４）である。培地ＢおよびＣおよび最少培地は、濾過滅菌し、他の培地はオートクレーブ処理する。振盪フラスコを、３０℃で激しく振盪しながら２日間にわたってインキュベートし、その後、それらをサンプリングして、上清をHPLC分析に供する。グルコースを添加し、培養物を１時間にわたって好気的条件下でインキュベートし、その後、培養物を２５ｍＬ容のガラス管（ほとんど上まで一杯になる）に移す。続いて、これらの管を嫌気的条件下で３０℃でインキュベートする。２〜５日間インキュベートした後、上清中の１，３−プロパンジオールをHPLCによって一般的方法の欄に記載の通り検出する。実施例１７汎用プラスミド、バシルスでのdhaB(1-3)およびdhaTの過剰表現用プラスミドの構築、および組換えＢ．リヘニフォルミスおよびＢ．サチリスによる１，３−プロパンジオールの生産汎用表現プラスミドの構築複製性高コピー数シャトルベクターpVSO2 を用いて、dhaB(1-3)およびdhaTをバシルス中で同時表現させる。pVSO2 は、Ｂ．サチリスapr プロモーターに融合したバシルス・レンタス(Bacillus lentus)由来のアルカリセリンホスファターゼを担持するEcoRI/BamHI 断片を、pBS19 にクローニングすることによって構築した。pBS19 は、pBS42(BandおよびHenner，DNA 3，17(1984))の誘導体であり、そこにおいて、EcoRI/BamHI 断片が、pUC19(Boehringer Mannheim)由来のEcoRI/ HindIII ポリリンカーで置き換えられている。配列決定およびPCR 反応を促進するために、45bpの合成リンカー（配列番号２１）を、PCR によってプロテアーゼ遺伝子の終点と転写ターミネーターとの間に導入した。複製性低コピー数シャトルベクターｐSS15-Bを用いて、dhaB(1-3)および dhaTをバシルス中で同時表現させる。プラスミドpSS15-B は、プラスミドpHP13 （Haima ら、Mol．Gen．Genet．209，335(1987)）をHindIII/SalI（ポリリンカーに存在する部位）で消化し、その末端をT4DNA ポリメラーゼで充填（平滑化）し、再度結合して、pSS13 を得た。PVSO2 から得た2kb のEcoRI/BamHI 断片を、プラスミドpSS13 のEcoRI/BamHI 部位に挿入して、pSS15-B を作製した。dhaB(1-3) およびdhaTカセットの過剰表現用プラスミド dhaTの５′末端にバシルス・コンセンサス・リボゾーム結合部位を作製するために、合成プライマー（配列番号２２と配列番号２３）をアニーリングすることにより得たEcoRI/Xba リンカーを、pAH23 のEcoRI/XbaI部位に挿入して、pM17を得た。HindIII/BglII リンカーを、合成プライマー（配列番号２４と配列番号２５）を用いて、プラスミドｐM17 のHindIII/bglII 部位に添加して、dhaB1の５ ′末端のSalI部位を導入して、pM20を作製した。プラスミドpM20から得た０．３ｋｂのMluI/KpnI 断片を、プラスミドpAH4から得たMluI/KpnI 断片と置き換えて、HindIII 部位を導入して、pM21を作製した。 SalI-XbaI リンカー（配列番号２６および２７）を、制限酵素SalI-XbaI で消化してあるpAH5に挿入して、pDT15 を作製した。このリンカーは、XbaI部位を破壊してリーディング・フレームを変化させてdhaT遺伝子がプラスミドpSS15-B およびpVS2のプロテアーゼ・コード配列のオープン・リーディング・フレームと融合するようにした。pDT5から得た1kb のSalI-MluI 断片を、pAH24 に挿入し、既存のSalI-MluI 断片と置き換えて、pDT17 を作製した。 SalI-XbaI リンカー(配列番号２８および２９)を、制限酵素SalI-XbaI で消化したpAH5に挿入して、pDT16 を作製した。このリンカーは、XbaI部位を破壊してリーディング・フレームを変化させてdhaT遺伝子がプラスミドpUSH1(Schon およびSchuman、Gene 147，91(1994))のポリ−His コード配列のオープン・リーディング・フレームと融合するようにした。pDT16 から得た1kb のSalI-MluI 断片を、pAH24 に挿入し、既存のSalI-MluI 断片と置き換えて、pDT18 を作製した。プラスミドpDT4（dhaB(1-3)を含有）は、pDT2から得た2.7kb のEcoRI/XbaI断片を、EcoRI/XbaI で消化したpUC18(Boehringer Mannheim)に導入することによって構築した。バシルスにおけるdhaTおよびdhaB(1-3)カセットの過剰表現用プラスミド pDT17をSacIで消化し、末端をT4DNA ポリメラーゼで充填し、このＤＮＡをSal Iで消化して、dhaTおよびdhaBを含有する断片を遊離した。この断片を、HindIII (末端はT4DNA ポリメラーゼで平滑化してある)およびSalI消化したpSS15-B に結合して、pM27を作製した。lac をベースとする誘導体を用いたバシルスにおけるdhaB(1-3)の過剰表現用プラスミドプラスミドpDT4から得たdhaB(1-3)を含有する2.7kb のBglII/HindIII 断片を、pUSH1 のポリリンカーにあるHindIII/BamHI 部位にクローニングして、pM26を作製した。このdhaB1 遺伝子をpUSH1 のポリHis コード配列のオープン・リーディング・フレームに融合させた。プラスミドのバシルスへの形質転換プラスミドｐM26 およびpM27を、自然の形質転換（McCuenおよびThome，J．Ba cteriol．107，635-645(1971)）によりB.リヘニフォルミスBG307 に形質転換し、それぞれ、10ug/mL カナマイシンおよび30ug/mL クロラムフェニコールで選択した。同じプラスミドを、標準的な原形質形質転換技法（Pragaiら、Microbiolo gy，140，305（1994））を用いてB.リヘニフォルミス株BG188 に形質転換し、上記のようにして選択した。B.サチリス株BG2864を、自然の形質転換により、プラスミドpM27で形質転換した。プラスミドを含有する形質転換体を、10ug/mL のクロラムフェニコールを含有するLAプレート上で選択した。プラスミドpM26も、B.サチリス株1E62（Saito ら、Mol．Gen．Genet.，170，1 17(1979)）に形質転換し、プラスミドを含有する形質転換体を、10ug/mL のエリスロマイシンおよび20ug/mL のカナマイシンを含有するLAプレート上で選択した。全ての形質転換体を３０℃で増殖させた。グリセロールデヒドラターゼ活性の検出 pM26で形質転換したB.リヘニフォルミス株BG188 （クローン番号８）を、25mL のLB(Difco)＋１％グルコースおよび10ug/mL のカナマイシン中で、３０℃で一夜増殖させた。この細胞を遠心分離により収集し、1mL の0.1Mトリシン/KOH緩衝液（pH8.2）、50mMのKCl、1mM のジチオスレイトールおおび200uM のフェニルメチルスルホニルフルオライドに再懸濁した。細胞をフレンチプレス(20,000PSI) で破砕することにより細胞抽出物を得、一般的方法の欄に記載されている通りグリセロールデヒドラターゼについての分析を行った。0.036U/mgの比活性が得られた。１，３−プロパンジオールデヒドラターゼの比活性は、一般的方法の欄に記載の通り測定したところ、0.2U/mg であった。組換えバシルスにおける１，３−プロパンジオールの産生 pM26で形質転換したB.リヘニフォルミス株BG188(クローン番号８)（ATCC ）を、25mLのLB（Difco）＋１％グルコースおよび10ug/mL のカナマイシンを含有する振盪フラスコ内で３０℃で一夜、激しく振盪させながら増殖させ、その後、1mL を用いて、25mLのLB＋１％グルコース、1%グリセロール、0. 33ug/mL ビタミンB12、および10ug/mL カナマイシンを含有する250mL 容フラスコに接種した。振盪フラスコを30℃で激しく振盪しながらインキュベートし、９時間増殖させた後、一般的方法の欄に記載の通りGC/MS(TMS 誘導)により、300ug /L の１，３−プロパンジオールが検出された。 PM27で形質転換したB.サチリス株BG2864（クローン番号１）（ATCC ）を、25mLのLB＋１％グルコース、1%グリセロール、0.33ug/mL ビタミンB₁₂、および10ug/mL のクロラムフェニコールを含有する振盪フラスコ（250mL 容）内で増殖させた。振盪フラスコは、３０℃で激しく振盪しながらインキュベートし、４３時間増殖させた後、１，３−プロパンジオールを検出した。組換えバシルスにおける３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの産生バシルスの発酵を、全容量15.5L のBiolafitte発酵槽内で、処理体積が最初は７リットルとし、操作を行う間に9.5 リットルまで上昇させた。好気的条件は、空気を、７リットル／分の速度で、羽根車速度が650rpmで、および背圧が0.8bar で通気させることにより確実にした［好気的条件は、溶存酸素(DO)の％（100%の DOを大気圧で定義した）で定義し、インストールしたDOプローブを用いて測定し、最少値３５％のDOを好気的であると考えた］。ｐＨは、10% H₂SO₄または28% N H₄OH の自動的添加により6.70に保持した。温度は３０℃に保持した。下記の化合物をタンクにバッチ添加し１２１℃で３０分間滅菌した：（ｇ／ｌ）で6 NaH₂PO₄・1H₂O、10 K₂HPO₄、1.5 NaCl、10(NH₄)₂SO₄、0.2 FeCl₃、１．５トリプトン、６酵母エキス、１０ｍＬバルヒ改変微量元素溶液(Methods for Gen eral and Molecular Bacteriology （P．Gerhardt ら編）、p.1518，American So ciety for Microbiology，Washington，DC(1994))、および2MAZUDF204(特注消泡剤)。滅菌後、３５０ｇの５０％グルコース供給材料をカナマイシンおよびクロランフェニコール（ともに最終濃度１０ｍｇ／ｌ以下）とともに添加した。 0.6Lの２４時間経過したバシルス・リヘニフォルミスBG188/pM26（クローン番号８）［振盪フラスコで、LBG 1%（＝10g トリプトン、5g酵母エキス、5g NaCl1 0g グルコース）中で増殖させたもの］を用いて、上記発酵槽に接種した。この培養物を増殖させ、グルコースを排出した。pHが目標の6.60よりも高くなると、グルコースの供給を開始した（50% グルコース、オートクレーブ処理、0.7g/ 分の速度）。４５時間後、栄養物の添加を行った（50mlのバルヒの微量元素溶液、 14g のK₂HPO₄、14g の酵母エキス、14mLのビタミン溶液、pHを6.60に設定、濾過滅菌）。７０時間後、ビタミンＢ₁₂を、最終濃度が10mg/Lになるまで添加した。最初の92時間は、%DO を好気性レベルに保持した。グルコースは、操作を行っている間中、（多少）過剰に存在した［好気的部分の間（最初の92時間）では0.2 〜12g/L、O₂制限部分（92〜164 時間）の間では、0.2 〜36g/L）。87時間後に取り出したサンプルでは、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの存在が疑われたので、上清サンプルを還元剤である水素化ホウ素ナトリウムで処理した後、１，３−プロパンジオールの検出により確認した。実施例１８バシルスにおけるdhaTおよびdhaB(1-3)カセットの過剰表現用のプラスミドバシルスにおけるdhaTおよびdhaB(1-3)の過剰表現用プラスミドプラスミドpM21から得たSalI/HindIII断片（dhaB(1-3)およびdhaTを含有）を5 kb のSal/HindIII pVSO2 ベクターと結合して、pM22を作製する。PM22は、dhaB およびdhaTを、高コピー数ベクター内でapa プロモーター下に有する。プラスミドpM21から得たSalI/HindIII断片を、pSS15-B から得た5.8kb のSal/ HindIII 断片と結合して、pM23を作製する。PM23は、低コピー数ベクター内でap a プロモーター下にdhaBおよびdhaTを有する。バシルスにおけるdhaTおよびdhaB(1-3)カセットの過剰表現用プラスミド pDT17 SacIで消化し、末端をT4ポリメラーゼで充填し、このDNA をSalIで消化して、dhaTおよびdhaBを含有する断片を放出する。この断片を、HindIII （末端をT4DNA ポリメラーゼで平滑化した）およびSalIで消化したpVSO2 と結合して、pM25を得る。lac をベースとする誘発系を用いたバシルスにおけるdhaTおよびdhaB(1-3)の過剰表現用プラスミド pDT18 をSacI で消化し、末端をT4ポリメラーゼで充填し、このDNA をSalIで消化して、dhaTおよびdhaB（この両方の遺伝子は、バシルス・コンセンサス・リボゾーム結合部位を含有）を含有する断片を放出する。この断片を、HindIII （末端をT4DNA ポリメラーゼで平滑化した）およびSalIで消化したpVSO2 と結合して、pM24を得る。実施例１９組換えバシルスによるＤ−グルコースの１，３−プロパンジオールへの転化バシルスの増殖条件バシルス・リヘニフォルミスおよびバシルス・サチリスによる１，３−プロパンジオール産生を証明するための増殖は、（指示するように）３０℃または３５ ℃で、振盪フラスコ培養（エルレンマイヤー・フラスコ）中および15.5L （全容積）容のBiolafitte発酵槽（処理容積：７〜10L）中で好気的に進行する。 LBG （1L当たり、16g のトリプトン、10g のグルコース、10g の酵母エキス、および5gのNaClを含有）振盪フラスコ中での培養は、１日経過のTSA プレート（トリプチカーゼソイ寒天、BBL#11043)から接種することから開始する。これらの振盪フラスコを用いて、発酵槽または振盪フラスコのいずれかに接種し、そこにおいて、D −グルコースの１，３−プロパンジオールへの転化に固有の証拠が示される。振盪フラスコでのバッチ培養富培地は、TSB （トリプチカーゼソイブロス；BBL#11768）、LBG、培地Ｂ（1L 当たり、10.0g のグルコース、2mL のNTA がクエン酸で置き換わっている改変バルヒの微量元素溶液、2.0gのNa₂CO₃、4.0gのK₂HPO₄、1mg のビタミンB₁₂補足したTSB、最終ｐH ＝7.2）、または培地C （培地B、ｐH6.4）のいずれかである。改変バルヒの微量元素溶液の組成は、改変バルヒ微量元素溶液の組成は、Me thods for General and Molecular Bacteriology(P．Gerhardt ら編、p.158，Am erican Society for Microbiology，Washington，D.C．(1994))に見出すことができる。最少培地は、MM322 （1L当たり、12.0g のグルコース、11.3gのK₂HPO₄ 、1.0gの(NH₄)₂SO₄、0.2gのDifco 酵母エキス、0.1gのNaCl、２mgのビタミンＢ₁ ₂ 、および10mLの上記のように改変した改変バルヒ微量元素溶液を含有、最終ｐH 6.7（HCl））、培地D （1L当たり2gのNa₂CO₃を補足した培地MM322、最終ｐH7.2 ）、または培地E （培地D,最終ｐH6.4）のいずれかである。培地ＢおよびＣおよび最少培地は、濾過滅菌し、他の培地はオートクレーブ処理する。振盪フラスコを、30℃で激しく振盪しながら１日間にわたってインキュベートし、その後、それらをサンプリングして、上清をHPLC分析に供する。グルコースを添加し、培養物を１時間にわたって好気的条件下でインキュベートし、その後、培養物を25mL容のガラス管（ほとんど上まで一杯になる）に移す。続いて、これらの管を嫌気的条件下で３０℃でインキュベートする。１〜５日間インキュベートした後、上清中の１，３−プロパンジオールをHPLCによって一般的方法の欄に記載の通り検出する。発酵槽内でのバッチ培養および添加バッチ培養振盪フラスコからの全容量600ml の培養物（LBG 培地）を用いて、発酵槽に6. 4Lの培地を接種し、１バッチとし、30分間（最少培地）または45分間（富培地）にわたってオートクレーブ処理する。この発酵槽における典型的な最少培地は培地D であり、典型的な「富(rich)」培地は、さらに50g の酵母エキス(/L)を含有する培地D である。オートクレーブ処理してある濾過滅菌した添加物（ビタミンＢ₁₂、または栄養要求に対する補償物質）の添加を、発酵槽の蓋にあるシリンジ (syringue)および隔膜ポートを用いて発酵後に行う。背圧(BP、0.1 〜0.5bar)、通気（1 分間当たりの空気の量(L)、0.4 〜１vvm）、攪拌（rpm、200 〜600）、温度（T、３０〜３７℃）、溶存酸素 (%DO)、およびｐH （5.8 〜7.2、NH₄OH およびH₂SO₄またはH₃PO₄の添加）をモニターし、指示通りの所望の値に調整する。接種を行った後、細胞をバッチ内で最初の14時間にわたって増殖させ、その後、グルコースの供給を開始する。嫌気的な増殖／産生では、指示通りrpm および BPのいずれかを低下させ、さらに流入する空気をＮ₂で置き換えることにより%DO が０％になるようにする。発酵槽および振盪フラスコをサンプリングして、我々の標準的な手順にしたがって（一般的方法の欄に概説されている）、上清をＯＤ₅₅₀の読取（増殖）および酵素的グルコース・アッセイに供し、上清をさらにHPLC分析用に調製する。上清には、１，３−プロパンジオールが存在する。実施例２０ dhaB(1,2,3) およびdhaTによるシュードモナスの形質転換および１，３−プロパンジオール産生の実証シュードモナスにおけるdhaB(1,2,3)およびdhaTの同時表現用プラスミドの構築 pAH27 から得たdhaB(1,2,3)およびdhaTのための4.1kb の表現カセットを、制限酵素EcoRI およびSalIを用いて、ベクターpMMB66EH（Fuste ら、Gene，48，11 9(1986)）およびpMMB207(Moralesら、Gene，97，39(1991))に挿入して、pDT10 およびpDT9をそれぞれ作製した。pDT9 表現プラスミドによるP.エルギノーサPAO2845 の形質転換Ｐ．エルギノーサPAO2845 細胞は、Ｌ−ブイヨン中で、３７℃で、200rpmで振盪しながら一夜増殖させることにより形質転換用に調製した。この培養物の1:25 の接種を25mLの新たに予備加温し予備通気したＬ−ブイヨンに行った。この新たな培養物を、初期対数期まで、３７℃、200rpmで２〜３時間インキュベートした。遠心分離により回収した細胞を、10mLの氷冷した0.15M MgCl₂(5%ジメチルスルホキシドを含有)で2 回洗浄し、2mL のジメチルスルホキシド溶液に再懸濁した。この細胞懸濁液(0.2mL)を、100 〜200ng のpDT9 DNAと合わせ、氷上に60分間にわたって静置した。この反応混合物に３７℃で２分間にわたって熱ショックを与え、氷に５分間にわたって移した。Ｌ−ブイヨン(0.5mL)を添加し、細胞を２０分間にわたって３７℃でインキュベートした。37.5ug/Lのクロラムフェニコールを補足した栄養寒天プレートから単一コロニーを得た。pDT10 のP.エルギノーサPAO1への接合転移(conjugal transfer) プラスミドpDT10を、FigurskiおよびHelinskiの方法（Proc．Natl．Acad．Sci ．U.S.A.，76，1648(1979)）によりPAO1に交配した(mated)。pDT10 を大腸菌AC8 0（Chakrarty ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，75，3109(1978)）に形質転換して、ドナー菌株を作製した。ヘルパー菌株は、pRK2013 （FugurskiおよびHe linski、前出）を含有する大腸菌HB101 であった。受容菌株は、シュードモナス・エルギノーサPAO1(Royleら、J．Bacteriol.，145，145(1981))」であった。上記菌株の各々の培養物(5mL)をLB中で３７℃で一夜増殖させた。細胞を0.9%NaCl で洗浄し、200 μL に再懸濁した。この細胞を一緒に混合して、LAプレート(Lui ra Agar，Difco)に拡げた。このプレートを、３７℃で6 時間にわたってインキュベートした。細胞をプレートから取り出し、250 μg/mLのカルベニシリンを含有するPIA(Difco)プレートに移し、一夜増殖させた。同じ培地から単一コロニーを単離した。グリセロールデヒドラターゼおよび１，３−プロパンジオールデヒドラターゼの活性の検出シュードモナス・エルギノーサPAO1/pDT10を、25mLの２XYT （16g/L の酵母エキス、16g/L のトリプトン、5g/LのNaCl）(250μg/mLのカルベニシリン、0.1mM のIPTGを補足したもの)で３７℃で一夜増殖させた。細胞を遠心分離により収集し、1mL の100mM トリス緩衝液(pH7.4)に再懸濁した。細胞をフレンチプレスで1 5,000psi で破砕した。粗抽出物を、標準的なアッセイを用いて、グリセロールデヒドラターゼおよび１，３−プロパンジオールデヒドラターゼの活性についてアッセイした。タンパク質の測定は、Bio-Rad(Bradford)Protein Assayにより行った。グリセロールデヒドラターゼの比活性は5U/mg であった。１，３−プロパンジオールデヒドラターゼの比活性は20U/mgであった。同様にして調製した、 pDT9で形質転換したP.エルギノーサPAO2845 の粗抽出物は、0.05U/mgのグリセロールデヒドラターゼ活性を含有していた。プラスミドpDT9を含有するシュードモナス・エルギノーサによる１，３−プロパンジオールの産生 pDT9プラスミドを含有するシュードモナス・エルギノーサPAO2845(ATCC 55760 )を、３７℃で一夜、200rpmで振盪させながら、25μg/mLのクロラムフェニコールを補足した2XYT培地中で増殖させた。一夜増殖させた後、細胞懸濁液のアリコートを、増殖培地（３部の2XYT培地＋1 部のHEPES0.1培地；0.25%(w/v)のグルコース、0.2%(w/v)のKNO₃、25μg/mLのクロラムフェニコール、50mg/Lの酵母エキス、および80mg/Lの栄養ブロスを補足したもの）に移し、OD₆₆₀が0.5 〜0.8AU の細胞懸濁液を得た。HEPES0.1培地は以下の成分を含有する。すなわち、NH4Cl 9.52mM；MgCl₂・6H₂O 0.523mM；K₂SO₄ 0.276mM ；HEPES （N-［2-ヒドロキシエチル］ピペラジン-N- ［2-エタンスルホン酸］）40mM；トリシン（N-トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）4mM ；FeSO₄・7H₂O 0.010mM；K₂HPO₄ 0.132mM；および以下の成分の最終濃度（g/L）を付与する微量の無機質：クエン酸ナトリウム・6H₂O 0.001、FeSO₄・7H₂O 0.0005、CoCl₂・6H₂O0.0001、MnCl₂・4H₂O 0.0000 1、ZnCl₂ 0.000005、Na₂MoO₄・2H₂O 0.000025、NiCl₂・6H₂O 0.0001、CuSO₂・2H₂O 0.00005である。３０℃で250rpmで振盪しながら約1 時間増殖させた後、0.5mM のIPTG（イソプロピル−β-D- チオガラクトシド）をその増殖培地に添加し、細胞の増殖を継続した。さらに約5 時間にわたって増殖させた後、細胞を遠心分離によって室温で回収した。細胞を産生培地（0.25%(w/v)のグルコース、0.2%(w/v )のKNO3、25μg/mLのクロラムフェニコール、50mg/Lの酵母エキスおよび80mg/L の栄養ブロスを補足したHEPES0.1培地）で３回洗浄した。２連で、洗浄した細胞を、0.2%(v/v)のグリセロールを含有する産生培地に最初に回収した体積になるよう再懸濁した。細胞懸濁液を窒素雰囲気下で３０℃で250rpmで振盪しながらインキュベートした。約1 時間後、５μg/mL の補酵素Ｂ₁₂（５，６−ジメチル−ベンズイミダゾリルコパミド５−デオキシアデノシン）をその細胞懸濁液に添加し、インキュベートを３０℃で250rpmで振盪しながら継続した。細胞懸濁液のサンプルを一定期間毎に集め、生成物の分析に供した。回収に際して、細胞を、サンプルから遠心分離によって除去し、水系の上清を分析するまで凍結保存した。認証標準物質に基づく検定を伴うHPLCによる分析により、これらの細胞懸濁液が１，３−プロパンジオールを産生したことを示した。この結果を表１５に示す。産生物の同定は、一般的方法の欄に記載の通りGC/MS により確認した。実施例２１シュードモナス・エルギノーサを用いたD −グルコースからの１，３−プロパンジオールの産生 PGSC（Pseudomonas Genetic Stock Center，East Carolina School of Medici ne，Greenville，NC）からのシュードモナス・エルギノーサ株PAO2845 をベース培地HEPES0.1で増殖させる。この培地は以下の成分であった。すなわち、NH₄Cl 9.52mM；MgCl₂・6H₂O 0.523mM；K₂SO₄ 0.276mM ；HEPES （N-［2-ヒドロキシエチル］ピペラジン-N- ［2-エタンスルホン酸］）40mM；トリシン（N-トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）4mM ；FeSO4・7H₂O 0.010mM；K₂HPO₄0.132mM ；および以下の成分の最終濃度（g/L）を付与する微量の無機質：クエン酸ナトリウム・6H₂O 0.001、FeSO₄・7H₂O 0.0005、CoCl₂・6H₂O 0.0001、 MnCl₂・4H₂O 0.00001、ZnCl₂ 0.000005、Na₂MoO₄・2H₂O 0.000025、NiCl₂・6H₂O0.0 001、CuSO₂・2H₂O 0.00005である。HEPES0.1は全ての実験に用いる。補足成分がある場合には特記する。遺伝子分断によるＰ．エルギノーサPAO2845 のグリセロール陰性突然変異体の構築Ｐ．エルギノーサPAO2845 は、栄養ブロス(Difco、Detroit，MI)で３７℃で20 0rpmで振盪させながら一夜増殖させる。細胞を遠心分離により回収し、DNA を細胞から標準的なアルカリ溶菌操作(Sambrook 1989)により抽出する。glpR（グリセロール代謝調節タンパク質遺伝子、Genbank ACCESSION#M60805）のオープン・リーディング・フレームを、P.エルギノーサPAO2845 から、PCR により、プライマーJJ-gplR-5′およびJJ-glpR-3′（それぞれ配列番号３０および３１）を用いて増幅し、EcoRI 部位を５′末端に組込む。このDNA 断片を、プラスミドpARO18 0(Parke，Gene 93，135，(1990))に、その特異的なEcoRI 切断部位に結合して、プラスミドpJJ10 を得る。pJJ10 結合反応混合物から得たDNA で形質転換した大腸菌を、50μg/mLのアンピシリンおよび0.08mg/mL のXgal（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド）を含有する栄養寒天(Difco，Detroi t，MI)に拡げる。白色のコロニーはglpR挿入の可能性が高いことを示すものであり、これを拾い上げて、50μg/mLのアンピシリンを補足したLB培地に移す。３７ ℃で200rpmで振盪させながら一夜増殖させた後回収した細胞から、pJJ10DNAを回収する。 pUC4K （Pharmacia Cat．No．27-4958-01）から得たカナマイシン・カセット領域をPCR により、適当に設計したプライマー（配列番号３２および３３）を用いて、該領域を増幅して、フラグメントの末端を制限酵素Styl(Promega社，Madi son，WI)に適合するように修飾して、4kb の断片pUC4K-stylを得る。このpUC4K- stylDNA 断片を、プラスミドpJJ10 のglpR遺伝子内にあるStyl部位にサブクローニングして、プラスミドpJJ11 を得る。PJJ11 結合反応混合物から得たDNA で形質転換した大腸菌を、25μg/mLのカナマイシンおよび50μg/mLのアンピシリンを補足したLB培地に拡げる。５〜20個の単離コロニーから得たDNA をそれぞれ回収して、続いて25μg/mLのカナマイシンおおび50μg/mLのアンピシリンを補足したLB培地で３７℃で一夜増殖させる。所望のプラスミドDNA の存在をゲル電気泳動により確認する。Ｐ．エルギノーサPAO2845 を標準的なプロトコールに従ってpJJ11DNAで形質転換する。簡単に述べると、P.エルギノーサの細胞を、Ｌ−ブイヨンで３７℃で一夜、200rpmで振盪しながら増殖させることにより、形質転換用に調製する。この一夜の培養物の1:25の接種を25mLの新たに予備加温し予備通気したＬ−ブイヨンで行う。この新たな培養物を、３７℃、200rpmで２〜３時間（初期対数期まで）インキュベートする。細胞を遠心分離し、上清をデカンテーションする。回収した細胞を、10mLの氷冷した無菌0.15M MgCl₂ （5%ジメチルスルホキシドを含有）に再懸濁し、氷上で５〜１０分間にわたって保持する。細胞を遠心分離し、上清から分離し、10mLの氷冷した無菌0.15M MgCl₂ （5%ジメチルスルホキシドを含有）に再懸濁し、氷上で５〜１０分間にわたって保持する。最後の遠心分離および上清からの分離を行った後、細胞を２mLの氷冷した無菌0.15M MgCl₂ （5%ジメチルスルホキシドを含有）に再懸濁する。この冷細胞濃縮物の0.2mL のアリコートを、100 〜200ng のpJJ11 DNA と一緒に合わせて、予め冷却しておいた1.5mL容のポリプロピレン製遠沈管に入れ、この混合物を氷上に６０分間にわたって保持する。この遠沈管を迅速に３７℃の水浴に２分間にわたって移し、直ちに氷中に 5 分間にわたって戻す。約0.5mL のＬ−ブイヨンを添加し、細胞を0.3 〜１時間にわたって穏やかに振盪しながら３７℃でインキュベートする。回収インキュベーションに続いて、この細胞懸濁液の10μL および50μL のアリコートを、50μ g/mLのカナマイシンを補足した栄養寒天プレートに拡げる。選択培地上に現れたコロニーを、1%のコハク酸または1%のグリセロールを補足したHEPES0.1培地を用いた寒天プレート上での増殖についてスクリーニングする。グリセロール上では増殖できないが、コハク酸上では増殖可能なコロニーを、15% グリセロール中に凍結することにより、後の使用のために保存する。ｐDT９によるgplR−P.エルギノーサPAO2845 の形質転換Ｐ．エルギノーサを、上記の方法により、形質転換用に調製する。0.2mL の冷細胞濃縮物を、100 〜200ng のpDT9 DNAと一緒に合わせて、予め冷却しておいた 1.5mL 容のポリプロピレン製遠沈管に入れ、この混合物を氷上に６０分間にわたって保持する。この遠沈管を迅速に３７℃の水浴に２分間にわたって移し、直ちに氷中に５分間にわたって戻す。約0.5mL のＬ−ブイヨンおよび細胞を0.3 〜１時間にわたって穏やかに振盪しながら３７℃でインキュベートする。回収インキュベーションに続いて、この細胞懸濁液の10μL および50μL のアリコートを、 37.5μg/mLのクロラムフェニコールを補足した栄養寒天プレートに拡げる。gplR −P.エノレギノーサPAO2845 形質転換体のpDT9の存在についてのスクリーニング上記から得た形質転換体を、37.5μg/mLのクロラムフェニコールを補足した栄養寒天プレートに拡げ、37℃で一夜増殖させる。これらの選択培地上に現れたコロニーから、約20個を拾い上げ、37.5μg/mLのクロラムフェニコールを含有する 10mLの栄養ブロス（Difco，Detroit，MI）に移し、３７℃で200rpmで振盪させながら一夜増殖させる。選択した形質転換体においてpDT9プラスミドの存在を確認するために、プラスミドDNA を抽出し、精製し、EcoRI(Promega 社，Madison，W I)で切断する。直鎖状にしたDNA の分子量を、ゲル電気泳動により分析する。さらに、dhaT、dhaB1、dhaB2 およびdhaB3 に共通する配列を有するプライマー対（それぞれ、配列番号３４と３５、３６と３７、８と９）を用いたPCR 増幅、続いて行われるゲル電気泳動を用いた断片の分子量の特徴付けを用いて、所望の遺伝子の存在を確認する。pDT9 により形質転換したglpR−P.エルギノーサの代謝スクリーニング１〜２０個のコロニーを、上記の陽性の形質転換体から選び出して、さらなる特徴付けに供する。細胞を、37.5μg/L のクロラムフェニコールを補足した栄養ブロスで、３０℃で250rpmで振盪しながら一夜、好気的に増殖させる。細胞を、 1:8 の希釈率で1.5mM のIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を有する同じ培地に移し、４〜６時間にわたって増殖させる。細胞を遠心分離により回収し、10g/L のグリセロール、0.03g/L の牛肉エキス、0.05g/L のペプトン、 0.05g/L の酵母エキス（全て、Difco 製、Detroit，WI）および0.2%のKNO₃を補足したHEPES0.1培地で1 回洗浄する。この細胞を、最初の体積の1/5 で、空気の隙間がないようにして、小さなビン中で再懸濁し、３０℃で100rpmで振盪しながら１８〜７２時間にわたってインキュベートする。細胞を遠心分離により除去し、上清を、HPLCにより、1,3-プロパンジオールの存在について分析する。さらに、1,3-プロパンジオールの化学的同定を、ガスクロマトグラフィー−質量ペクトル測定により確認する。pDT9 により形質転換したglpR−P.エルギノーサPAO2845(ATCC55760)によるグルコースからの１，３−プロパンジオールの産生上記のスクリーニング操作から、グリセロールから最大量の1,3-プロパンジオールを産生する１〜５個のコロニーを、37.5μg/L のクロラムフェニコールを補足した栄養ブロスで、３０℃で250rpmで振盪しながら一夜、好気的に増殖させる。細胞を、1:8 の希釈率で1.5mM のIPTGを有する同じ培地に移し、４〜６時間にわたって増殖させ、遠心分離により回収し、10g/L のグルコース、0.03g/L の牛肉エキス、0.05g/L のペプトン、0.05g/L の酵母エキスおよび0.2%のKNO₃を補足したHEPES0.1培地で1 回洗浄する。この細胞を、最初の体積の1/5 で、空気の隙間がないようにして、小さなビン中で再懸濁する。細胞を、３０℃で100rpmで振盪しながら約３６時間にわたってインキュベートする。細胞を遠心分離により除去し、上清を、HPLCにより、1,3-プロパンジオールの存在について分析する。さらに、1,3-プロパンジオールの化学的同定を、ガスクロマトグラフィー−質量ペクトル測定により確認する。実施例２２アスペルギルス・ニガーにおけるdhaB1、dhaB2、dhaB3 およびdhaTの表現用の表現セットの構築汎用表現カセット(pAEX) プラスミドpGPTpyrG（Berka ら、“The development of gene expression sysmtems for filamentous fungi”，Biotechnol．Adv．7:127-154(1989)）から得た、アスペルギルス・ニガーglaAプロモーターおよびターミネーターの適切な調節に十分な部分を含有する1.4kb のSpeI-EcpRI断片を、pLITMUS39 （New Engl and Biolabs 社，Beverly，MA）のポリリンカーにあるSpeIおよびEcoRI 部位に結合した。Ａ．ニガーの各クローン表現カセット各クレプシエラ・ニューモニエdhaBサブユニットおよびdgaTのオープン・リーディング・フレーム(ORF's)を、同じクローニング戦略を用いて、クローニングし、汎用プラスミドベクター(pAEX)に結合した。 dhaB ORFおよびdhaT ORFの各々を PCR増幅するためのプライマー対は、全遺伝子オペロンの既知の配列に基づいて、各ORF の５′末端および３′末端の配列に合致(マッチ)するように設計した（dhaB1、dhaB2、dhaB3 およびdhaT：それぞれ、配列番号３８と１２、３９と４０、４１と４２、４５と４６、４３と４４）。合致配列に加えて、各ORF の５′末端に対するプライマーは、EcoRI 切断部位、続いてBglII 切断部位を配列の５′最末端に、さらに各ORF の最初のATG の上流に5 個の塩基配列CAGCA を含有するように設計した。各ORFの３′末端に合致するように設計されたプライマーは、クローンの３′最末端に、翻訳停止コドンの下流にXbalI 切断部位を配置していた。 dhaBおよびdhaT ORFに対する各クローン断片を、PCR により、プラスミドpHK2 6-28（全部のK.ニューモニエdha オペロンを含有）から、上記のプライマーを用いて増幅した。各ORF クローン断片は、それらの分子量（dhaB1 ＝1540bp、dhaB 2 ＝607bp、dhaB3 ＝448bp、dhaBX ＝1846bp、dhaT＝1187bp）に基づいて単離した。PCR プライマーにおいて設計された特異的EcoRI およびXbal切断部位を用いて、dhaBおよびdhaT ORF断片の各々を、pLITMUS29 （New England Biolabs 社）のポリリンカーにあるEcoRI およびXbal切断部位に結合した。pLITMUS29 にある dhaB2 およびdhaB3 クローンは、塩基配列決定により、正しいことが確認された。pLITMUS29 にあるdhaB1 クローンのコード領域から得られた特異的1363bpNcol -EcoRV切断断片を除去し、pHK26-28から得られた対応する切断断片で置き換えた。pLITMUS29 にあるdhaTクローンのコード領域から得られた特異的783bp Tth111I-MluI切断断片は、pHK26-28から得られた対応する切断断片で置き換えた。pLITMUS29 にあるdhaBX クローンのコード領域から得られた特異的 1626bpEcoRV 切断断片は、pM7 （K.ニューモニエ dhaB オペロンを含有）から得られた対応する切断断片で置き換えた。dhaB1、dhaBX およびdhaTクローンの５ ′および３′末端の配列（約250pb、置換された断片からの幾つかの配列を含有）は、塩基配列決定により、正しいことが確認された。 pLITMUS29 にあるdhaB1、dhaB2、dhaB3、dhaBX およびdhaTクローンのORFを含有する特異的BglII-Xbal切断断片を、個別に、汎用表現ベクターpAEXにあるBglI I-Xbal切断部位に結合し、各クローンの表現をA.ニガーglaAプロモーターおよびターミネーターの制御下においた。得られたベクターは、それぞれ、各ORFによって、pAEX:dhaB1、pAEX:dhaB2、pAEX:dhaB3、pAEX:dhaBXおよびpAEX:dhaTと命名した。Ａ．ニガーに対する二重表現カセットベクター dhaB1 表現カセットを含有する特異的SnaBI-Stul切断断片（A.ニガーglaAプロモーター、dhaB1 ORF、およびターミネーターから構成される）を、ベクターpAE X:dhaB1から単離し、pAEX:dhaB2ベクターの特異的SnaB1 切断部位に結合した。p BH2（Wardら、Exp．Myc.，13，289，(1989)）から得られた約2.2kb のScal-Smal 切断断片（アスペルギルス・ニジュランスpyrG栄養要求選択マーカーを含有する）を、dhaB1 およびdhaB2 表現カセットを含有するベクターにある特異的Stul 制限部位に結合した。このベクターを、pAEX:B1+B2と命名した。 dhaB3 およびdhaTの全表現カセットを含有するユニークなSpel-HindIII切断断片を、pAEX:dhaB3ベクターおよびpAEX:dhaT ベクターからそれぞれ単離した。この２種の表現カセット断片を、ベクターｐUC18にある特異的HindIII 切断部位に、同時に、一列に並べて結合した。このベクターをpAEX:B3+T と命名した。アスペルギルスにおけるdhaBおよびdhaT遺伝子の形質転換、形質転換体の単離、表現カセットの組込みの確認および表現アスペルギルス・ニガー株FS1（pyrG−）を、Campbellらの方法(Campbell、“ Improved transformation efficiency of A．niger using homologous niaD gen e for nitrate reductase”，Curr．Genet.，16:53-56，(1989))を用いて、２種の表現ベクターpAEX:B1+B2およびpAEX:B3+T と共に同時形質転換した。形質転換体を、ウリジンを含有しない選択培地での増殖能力によって選択した。形質転換体のゲノムDNA を、HindIII およびSpelで消化して、予期した分子量の断片を放出し、無傷の表現カセットが組込まれたことを実証した。各表現カセットの検出は、サザン(Southern)解析によって、各遺伝子を別個に用いてプローブして行った。DhaB2 タンパク質の存在は、ウエスタン解析により、抗dhaB抗体を用いて検出した。各ORF の表現は、形質転換体（pAEX:B1+B2ベクターおよびpAEX:B3+T ベクターが組込まれている）を、種培養として、10%CSL培地［コーン・スティープ・リカー(50%固形分)、10%(w/v)；NaH₂PO₄・H₂O 1.0g/L；MgSO₄ 0.50g/L ；マルトース1 00.0g/L；グルコース10.0g/L ；およびMazu 消泡剤0.003%(v/v)］中で増殖させ、次に、1/10体積の該種培養をMBM 炭素培地［NaHPO₄ 0.70g/L；K₂HPO₄0.70g/L ；KH₂PO₄ 0.70g/L；MgSO₄・7H₂O 1.40g/L；(NH₄)₂SO₄ 10.5g/L ；CaCl₂・2H₂O 0.7 0g/L；NH₄NO₃ 3.50g/L；クエン酸ナトリウム 14g/L；FeCl₂・4H₂O 1.0mg/L；ZnCl₂ 5.87mg/L；CuCl₂・2H₂O 0.42mg/L ；MnCl₂・4H₂O 0.21mg/L ；Na₂B₄O7・10H₂O 0. 07mg/L；葉酸0.174mg/L ；ピリドキシンHCl 6.21mg/L；リボフラビン 1.83mg/L ；パントテン酸23.60mg/L ；ニコチン酸26.66mg/L ；ビオチン0.49mg/L；チアミンHCl 1.39mg/L；マルトース120.0g/L；カルベニシリン0.035mg/L ；ストレプトマイシン0.035mg/L ；ツイーン80 0.07%(w/v)；およびMazu消泡剤0.14%(v/v)］に移してglaAプロモーターの誘発を行うことにより試験した。ｍRNA を、形質転換体の培養物から単離し（Fast Track2Kit，Invitrogen Corp.）、化学ルミネセンス(Genius(登録商標)System，Boehringer-Mannheim)を用いてノーザン解析を行って、各遺伝子から転写されたメッセージを検出した。振盪フラスコ培養物中のdhaB1、dhaB2、 dhaB3 およびdhaT遺伝子の同調転写は、ノーザン・ハイブリダイゼーションにより、dhaBおよびdhaTのORF の各々の遺伝子断片でプローブして、証明した。形質転換された遺伝子の全てを転写することが証明された単離コロニーを選んで、pAEX:dhaBXでさらに形質転換した。これらの単離物は、pAEX:dhaBXおよびpA A10 （3.2kb、アスペルギルス・ニジュランスamdS選択マーカーをpUC18 中に含有するAccl-Asp718 切断断片）で同時形質転換した。これらの新たに形質転換した培養物は、アセトアミドを単一の炭素源として含有する培地上で選択した。アセトアミドを単一の炭素源として利用することが可能な形質転換体のコロニーは、プライマーKpdhaBX-5′およびKpdhaBX-3′（配列番号４５および４６）を用いたゲノムDNA からのdhaBX ORF のPCR 増幅により組込まれたdhaBX のORF を有することが証明された。Ａ．ニガー株FSI によるグリセロールの産生アスペルギルス・ニガー株FS1 を、種培養として10%CSL培地で増殖させ、1:10 希釈物としてMBM 炭素培地＋１２％マルトースに移した。培養上清は、アスペルギルスにより産生された6g/Lのグリセロールを含有することが証明された。グリセロールの分析は、HPLCにより行った。組換えＡ．ニガーによる１，３−プロパンジオールの産生アスペルギルスの発酵は、全15.5L 容のBiolafitte発酵槽で、処理体積が最初に8L、業の間に11L まで増加させて行った。好気的条件は、空気を10L/分の速度で、羽根車速度が700 〜800rpmで、および背圧が1.1barで通気させることにより確実にした［好気的条件は、溶存酸素(DO)の％（100%のDOを大気圧で定義した）で定義し、インストールしたDOプローブを用いて測定し、最少値３５％のDOを好気的であると考えた］。ｐＨは、10% H₃PO₄または28% NH₄OH の自動的添加により5.60に保持した。温度は３２℃に保持した。以下の化合物を一回分としてタンクに入れ、121 ℃で３０分間にわたって滅菌した。すなわち、2g/LのNaH₂PO₄・H₂O、17g/L の(NH₄)₂SO₄、1g/LのMgSO₄、2g/L のツイーン80、45g/L のPromosoy-100（70% タンパク質の大豆濃縮物）、6g/Lのコーン・スティープ・リカー（50% 固形分）、10g/L のマルトース、および2g/L のMAZU DF204（特注の消泡剤）。滅菌後、500gの50%Maltrin 150供給材料を添加し、それと一緒にカルベニシリンおよびストレプトマイシン（共に、最終濃度を 10mg/Lまで）を添加した。２種類の表現ベクターpAEX:B1+B2およびpAEX:B3+T で形質転換し、10%CSLを含有する振盪フラスコで増殖させた４５時間経過したアスペルギルス・ニガー株（菌株TGR40）の1Lを用いて、発酵槽に接種した。培養物をバッチ式で、十分に好気的に、28時間にわたって増殖させた後に、供給材料（50% マルトリン（Maltri n 150 溶液、加熱滅菌）を0.8 〜1.0g/ 分の速度で開始した。この培養物をさらに２０時間にわたって処理し、その間に、%DO は事実上ゼロまで下降した。これは、細胞のＯ₂要求によるものである（培養物は、処理の間ずっと、ゼロ〜5%のままであった）。その後（つまり、接種の４８時間後）、８時間にわたってグリセロールを供給し、最終のグリセロール濃度が163g/Lになるまで行った。マルトリンの供給は、接種の９７時間後に停止し、背圧および通気をそれぞれ0.2barおよび４L/分まで低減した。培養物が１２２時間経過したら、ブロスを回収し、遠心分離し、0.2Lのエタノールを1Lの上清に添加した。 1Lの無細胞発酵ブロスを減圧蒸留して、約60mLの暗色のスラリーを得た。このスラリーを遠心分離し、約40mLの液体上清を回収した。この液体を、40mLのエタノールで処理して、残留固形分を析出させた。この析出物を遠心分離により除去した。デンカンテーションした液体の少量のサンプルをHPLCにより分析し、１，３−プロパンジオールを含有することがわかった。このプロパンジオールの同定は、GC/MS によって確認した。出願人は、dhaB(1-3)、dhaBx およびdhaTをコードするDNA を含有する組換えアスペルギルス・ニガー株TGR40-13を寄託している（ATCC ）。実施例２３組換えＡ．ニガーを用いたマルトースからの１，３−プロパンジオールの産生アスペルギルスの発酵を、全容量15.5L のBiolafitte発酵槽内で、処理体積が最初は８リットルとし、操作を行う間に11リットルまで上昇させて行う。好気的条件は、空気を、10リットル／分の速度で、羽根車速度が700 〜800rpmで、および背圧が1.1barで通気させることにより確実にする［好気的条件は、溶存酸素(D O)の％（100%のDOを大気圧で定義した）で定義し、インストールしたDOプローブを用いて測定し、最少値３５％のDOを好気的であると考える］。ｐＨは、10%H₂S O₄または28% NH₄OH の自動的添加により5.60に保持した。温度は３２℃に保持する。以下の化合物を一回分としてタンクに入れ、121 ℃で３０分間にわたって滅菌した。すなわち、2g/LのNaH₂PO₄・H₂O、17g/L の(NH₄)₂SO₄、1g/LのMgSO₄、2g/L のツイーン80、45g/L のPromosoy-100（70% タンパク質の大豆濃縮物）、6g/Lのコーン・スティープ・リカー（50% 固形分）、10g/L のマルトース、および2g/L のMAZU DF204（特注の消泡剤）。滅菌後、500gの50%Maltrin 150供給材料を添加し、それと一緒にカルベニシリンおよびストレプトマイシン（共に、最終濃度を 10mg/Lまで）を添加する。 dhaB1、dhaB2、dhaB3、dhaB4 およびdhaBT 遺伝子で形質転換し、10%CSL（実施例２２で定義したもの）を含有する振盪フラスコで増殖させた４０〜４８時間経過したアスペルギルス・ニガー株の1Lを用いて、発酵槽に接種した。培養物を３０〜３５時間にわたって増殖させた後に、供給（50% マルトリン（Maltrin 15 0 溶液、加熱滅菌）を１g/分の速度で開始する。この培養物をさらに５時間にわたってＯ₂を制限した条件下（%DO がゼロ、十分な通気下）で処理する。その後、マルトリンの供給を停止し、測定した上清中のグルコースが事実上ゼロになったら、rpm を150 に下げ、BPを0.2 にし、通気を停止する。発酵槽を嫌気的気体混合物（5% H₂、5%CO₂、90%N₂）で7L/ 分の速度で３０分間にわたって洗う。気体導入口および排出口を閉じ、BPを0.4barに保持し、補酵素B₁₂を添加して最終濃度を5mg/L とする。全体を通して、ブロスサンプルを遠心分離し、HPLCおよびGC分析用に上清を調製する。１，３−プロパンジオールは、上清に検出される。実施例２４ラクトバシルス・レウテリ(Lactobacillus reuteri)(ATCC23272)によるグリセロール以外の基質からの１，３−プロパンジオールの産生ラクトバシルス・レウテリ（ATCC23272）を、MRS(Difco 、Detroit，MI)プレートに保持した。プレートから得られたコロニーを用いて、250mL 容エルレンマイヤー・フラスコ内の、25mM NaHCO₃を補足した70mLのラクトバシルスMRS ブイヨン（Difco,#088-17）に接種した。このフラスコを、嫌気的雰囲気下（５〜７％H2、２〜８％CO2、85〜93％N2）でインキュベートした。ラクトバシルスMRS ブイヨンのHPLC分析は、グリセロールの保持時間を有する成分を示した。ラクトバシルスMRS ブイヨンを、アルカリ沸騰により処理し、グリセロールについてHPLCおよび酵素アッセイにより分析した。多くとも、最初の培地からは0.25g/L のグリセロールが検出できた。このグリセロールの全部が１，３−プロパンジオールに転化された場合、0.21g/L のプロパンジオールがグリセロールから生産されていると言えるであろう。 10日間のインキュベーション後、ラクトバシルス・レウテリ培養フラスコから得たサンプルを取り出し、HPLCおよびGC-MS により分析し、最初の培地サンプルと比較した。培地中に存在するグリセロールについて補正すると、1.35g/L の１，３−プロパンジオールがラクトバシルス・レウテリによってグリセロール以外の基質から産生されたことになる。

【手続補正書】【提出日】１９９７年１２月８日【補正内容】請求の範囲１．適当な条件下で、グリセロールまたはジヒドロキシアセトン以外の炭素基質を、デヒドラターゼ酵素を表現できる少なくとも１つの遺伝子を有する単一の微生物に接触させることを特徴とする１，３−プロパンジオールを製造するための生物転化方法。２．適当な条件下で、グリセロールを、デヒドラターゼ酵素を表現できる少なくとも１つの遺伝子を有する単一の微生物に接触させる工程を具えることを特徴とする１，３−プロパンジオールを製造するための生物転化方法であって、前記微生物が、アスペルギルス（Aspergillus）属、サッカロミセス（Saccharomyces属、ジゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）属、ピヒア（Pichia）属、クリベロミセス（Kluyveromyces）属、カンジダ（Candida）属、ハンゼヌラ（Hansenul a）属、デバリオミセス（Debaryomyces）属、ムーコル（Mucor）属、トルロプシス（Torulopsis）属、サルモネラ（Salmonella）属、バシルス（Bacillus）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属およびシュードモナス（Pseudomonas）属からなる群から選ばれることを特徴とする生物転化方法。３．前記遺伝子が、グリセロールデヒドラターゼをコードし、かつクレプシエラ（Klebsiella）属、ラクトバシルス（Lactobacillus）属、エンテロバクター（E nterobacter）属、シトロバクター（Citrobacter）属、ペロバクター（Pelobact er）属、イリオバクター（Ilyobacter）属およびクロストリジウム（Clostridiu m）属からなる群から単離されることを特徴とする請求項１に記載の方法。４．前記遺伝子が、ジオールデヒドラターゼをコードし、かつクレプシエラ属およびサルモネラ属からなる群から単離されることを特徴とする請求項１に記載の方法。５．前記デヒドラターゼ酵素が、グリセロールデヒドラターゼ酵素またはジオールデヒドラターゼ酵素であることを特徴とする請求項１に記載の方法。６．前記微生物が、dhaB1、dhaB2 およびdhaB3 および／またはdhaTをコードする少なくとも１種のDNA 断片で形質転換されることを特徴とする請求項１に記載の方法。７．前記微生物が、シトロバクター（Citrobacter）属、エンテロバクター（Ent erobacter）属、クロストリジウム（Clostridium）属、クレプシエラ（Klebsiel la）属、エロバクター（Aerobacter）属、ラクトバシルス（Lactobacillus）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、サッカロミセス（Saccharomyces）属、ジゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）属、ピヒア（Pichia）属、クリベロミセス（Kluyveromyces）属、カンジダ（Candida）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、デバリオミセス（Debaryomyces）属、ムコール（Mucor）属、トルロプシス（Torulopsis）属、メチロバクター（Methylobacter）属、エシェリキア（Esche richia）属、サルモネラ（Salmonella）属、バシルス（Bacillus）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属およびシュードモナス（Pseudomonas）属からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の方法。８．前記微生物が、グリセロールデヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子またはジオールデヒロラターゼ酵素をコードする遺伝子のいずれかによって形質転換された組換え微生物、および１，３−プロパンジオールの産生を促進する表現型を有する突然変異微生物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項７に記載の方法。９．前記微生物が、クレプシエラ（Klebsiella）属、エンテロバクター（Enterobacter）属およびシトロバクター（Citrobacter）属からなる群から選ばれるか、あるいは組換えエシェリキア（Escherichia）属の細菌からなる群から選ばれることを特徴とする請求項７に記載の方法。１０．前記微生物が組換え大腸菌であることを特徴とする請求項９に記載の方法。１１．前記微生物が、組換えストレプトミセスエスピー（Streptomyces s.p. ）、バシルスエスピー（Bacillus s.p．）、シュードモナスエスピー（Pseu domonas s.p.）、サッカロミセスエスピー（Saccharomyces s.p.）、アスペルギルスエスピー（Aspergillus s.p.）、ラクトバシルスエスピー（Lactobac illus s.p.）、およびピヒアエスピー（Pichia s.p．）からなる群から選ばれ、かつ前記組換え微生物が、dhaB1、dhaB2、およびdhaB3 および／またはdhaTをコードする少なくとも１つのDNA 断片によって形質転換されて、前記生物が活性なデヒドラターゼ酵素を表現し、かつ前記炭素基質がモノサッカライドであることを特徴とする請求項８に記載の方法。１２．前記微生物が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ）、枯草菌（バシルス・サチリス；Bacillus subtilis）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）、およびバシルス・リヘニフォルミス（Bacillus lichenif ormis）からなる群から選ばれ、かつ前記組換え微生物が、dhaB1、dhaB2、およびdhaB3 および／またはdhaTをコードする少なくとも１つのDNA 断片によって形質転換されて、前記生物が活性なデヒドラターゼ酵素を表現し、かつ前記炭素基質がモノサッカライドであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。１３．前記微生物が、クレプシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）由来のグリセロールデヒドラターゼ遺伝子を含有する組換え大腸菌であることを特徴とする請求項１または１０に記載の方法。１４．前記炭素基質が少なくとも単一の炭素原子を有し、該炭素基質がグリセロールまたはジヒドロキシアセトン以外であることを特徴とする請求項１に記載の方法。１５．前記炭素基質が、モノサッカライド、オリゴサッカライドおよびポリサッカイライドからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１４に記載の方法。１６．前記炭素基質がグルコースであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。１７．前記炭素基質がアルコールであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。１８．前記微生物を前記炭素基質と接触させる工程の前に、さらに、前記微生物を培地中で増殖させる工程を具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。１９．請求項１〜１５のいずれかに記載の方法によって製造される１，３−プロパンジオール。２０．クレプシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）から単離した約３５ｋｂのDNA 断片を包含し、該DNA 断片が図１の第１欄および第２欄の制限酵素消化を有する活性グリセロールデヒドラターゼ酵素をコードしているコスミド。２１．宿主微生物と請求項２０に記載のコスミドとを含有することを特徴とする形質転換微生物。２２．前記宿主微生物が大腸菌であり、前記微生物がATCC受託番号第69789 号に指定されていることを特徴とする請求項２１に記載の形質転換微生物。２３．宿主微生物と、クレプシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）から単離される第1 のDNA 断片と、クレプシエラ・ニューモニエ（Klebsiella p neumoniae）から単離される少なくとも1 種の第2 のDNA 断片とを含有し、前記第１のDNA 断片が、図１の第１欄および第２欄の制限酵素消化を有する活性グリセロールデヒドラターゼ酵素をコードし、かつ、前記第2 のDNA 断片が、グリセロールデヒドラターゼ酵素以外の活性機能性タンパク質をコードすることを特徴とする形質転換微生物。２４． dhaB1、dhaB2、およびdhaB3 および／またはdhaTをコードするDNA 断片を含有し、かつATCC受託番号第55760 号に指定されていることを特徴とする組換えシュードモナスエスピー（Pseudomonas s.p.）。２５． dhaB1、dhaB2、およびdhaB3 および／またはdhaTをコードするDNA 断片を含有し、かつATCC受託番号第74363 号に指定されていることを特徴とする組換えピヒア・パストリス。２６． dhaB1、dhaB2、およびdhaB3 および／またはdhaTをコードするDNA 断片を含有し、かつATCC受託番号第号に指定されていることを特徴とする組換えサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株ｐMCK1/10/ 17(MH)#A。２７． dhaB1、dhaB2、およびdhaB3 をコードするDNA 断片を含有し、かつATCC 受託番号第号に指定されていることを特徴とする組換えバシルス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）株BG188/pM26（クローン＃８）。２８． dhaB1、dhaB2、およびdhaB3 および／またはdhaTをコードするDNA 断片を含有し、かつATCC受託番号第号に指定されていることを特徴とする組換えバシルス・サチルス（Bacillus subtilis）株BG2864/pM27（クローン＃１）。２９． dhaB1、dhaB2、およびdhaB3 およびdhaTをコードするDNA 断片を含有し、かつATCC受託番号第号に指定されていることを特徴とする組換えストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）株SL14-2。３０． dhaB1、dhaB2、dhaB3 およびdhaTをコードするDNA 断片を含有し、かつA TCC受託番号第号に指定されていることを特徴とする組換えアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）株TGR40-13。３１．デヒドラターゼ酵素を表現する組換え真核微生物。３２．酵母および糸状菌からなる群から選ばれることを特徴とする請求項３１に記載の組換え真核微生物。３３．さらに、１，３−プロパンジオールを回収する工程を具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｐ 7/18 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ラッフェンド，リサ，アンアメリカ合衆国 19703−2422 デラウェア州クレイモントマウントヴァーノンドライブ２ (72)発明者ナガラジャン，ヴァサンサアメリカ合衆国 19807−3131 デラウェア州ウィルミントンディキンソンレーン 13 (72)発明者ナカムラ，チャールズ，エドウィンアメリカ合衆国 19703−2422 デラウェア州クレイモントマウントヴァーノンドライブ２

Claims

【特許請求の範囲】１．適当な条件下で、炭素基質を、デヒドラターゼ酵素を表現できる少なくとも１つの遺伝子を有する単一の微生物に接触させることを特徴とする１，３−プロパンジオールを製造するための生物転化方法。２．適当な条件下で、グリセロールを、デヒドラターゼ酵素を表現できる少なくとも１つの遺伝子を有する単一の微生物に接触させる工程を具えることを特徴とする１，３−プロパンジオールを製造するための生物転化方法であって、前記微生物が、アスペルギルス（Aspergillus）属、サッカロミセス（Saccharomyces属、ジゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）属、ピヒア（Pichia）属、クリベロミセス（Kluyveromyces）属、カンジダ（Candida）属、ハンゼヌラ（Hansenul a）属、デバリオミセス（Debaryomyces）属、ムーコル（Mucor）属、トルロプシス（Torulopsis）属、サルモネラ（Salmonella）属、バシルス（Bacillus）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属およびシュードモナス（Pseudomonas）属からなる群から選ばれることを特徴とする生物転化方法。３．前記遺伝子が、グリセロールデヒドラターゼをコードし、かつクレプシエラ（Klebsiella）属、ラクトバシルス（Lactobacillus）属、エンテロバクター（E nterobacter）属、シトロバクター（Citrobacter）属、ペロバクター（Pelobact er）属、イリオバクター（Ilyobacter）属およびクロストリジウム（Clostridiu m）属からなる群から単離されることを特徴とする請求項１に記載の方法。４．前記遺伝子が、ジオールデヒドラターゼをコードし、かつクレプシエラ属およびサルモネラ属からなる群から単離されることを特徴とする請求項１に記載の方法。５．前記デヒドラターゼ酵素が、グリセロールデヒドラターゼ酵素またはジオールデヒドラターゼ酵素であることを特徴とする請求項１に記載の方法。６．前記微生物が、dhaB1、dhaB2 およびdhaB3 および／またはdhaTをコードする少なくとも１種のDNA 断片で形質転換されることを特徴とする請求項１に記載の方法。７．前記微生物が、シトロバクター（Citrobacter）属、エンテロバクター（Ent erobacter）属、クロストリジウム（Clostridium）属、クレプシエラ（Klebsiel la）属、エロバクター（Aerobacter）属、ラクトバシルス（Lactobacillus）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、サッカロミセス（Saccharomyces）属、ジゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）属、ピヒア（Pichia）属、クリベロミセス（Kluyveromyces）属、カンジダ（Candida）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、デバリオミセス（Debaryomyces）属、ムコール（Mucor）属、トルロプシス（Torulopsis）属、メチロバクター（Methylobacter）属、エシェリキア（Esche richia）属、サルモネラ（Salmonella）属、バシルス（Bacillus）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属およびシュードモナス（Pseudomonas）属からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の方法。８．前記微生物が、グリセロールデヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子またはジオールデヒロラターゼ酵素をコードする遺伝子のいずれかによって形質転換された組換え微生物、および１，３−プロパンジオールの産生を促進する表現型を有する突然変異微生物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項７に記載の方法。９．前記微生物が、クレプシエラ（Klebsiella）属、エンテロバクター（Entero bacter）属およびシトロバクター（Citrobacter）属からなる群から選ばれるか、あるいは組換えエシェリキア（Escherichia）属の細菌からなる群から選ばれることを特徴とする請求項７に記載の方法。１０．前記微生物が組換え大腸菌であることを特徴とする請求項９に記載の方法。１１．前記微生物が、組換えストレプトミセスエスピー（Streptomyces s.p. ）、バシルスエスピー（Bacillus s.p．）、シュードモナスエスピー（Pseu domonas s.p.）、サッカロミセスエスピー（Saccharomyces s.p.）、アスペルギルスエスピー（Aspergillus s.p.）、ラクトバシルスエスピー（Lactobac illus s.p.）、およびピヒアエスピー（Pichia s.p．）からなる群から選ばれ、かつ前記組換え微生物が、dhaB1、dhaB2、およびdhaB3 および／またはdhaTをコードする少なくとも１つのDNA 断片によって形質転換されて、前記生物が活性なデヒドラターゼ酵素を表現し、かつ前記炭素基質がモノサッカライドであることを特徴とする請求項８に記載の方法。１２．前記微生物が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ）、枯草菌（バシルス・サチリス；Bacillus subtilis）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）、およびバシルス・リヘニフォルミス（Bacillus lichenif ormis）からなる群から選ばれ、かつ前記組換え微生物が、dhaB1、dhaB2、およびdhaB3 および／またはdhaTをコードする少なくとも１つのDNA 断片によって形質転換されて、前記生物が活性なデヒドラターゼ酵素を表現し、かつ前記炭素基質がモノサッカライドであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。１３．前記微生物が、クレプシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）由来のグリセロールデヒドラターゼ遺伝子を含有する組換え大腸菌であることを特徴とする請求項１または１０に記載の方法。１４．前記炭素基質が少なくとも単一の炭素原子を有し、該炭素基質がグリセロールまたはジヒドロキシアセトン以外であることを特徴とする請求項１に記載の方法。１５．前記炭素基質が、モノサッカライド、オリゴサッカライドおよびポリサッカイライドからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１４に記載の方法。１６．前記炭素基質がグルコースであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。１７．前記炭素基質がアルコールであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。１８．前記微生物を前記炭素基質と接触させる工程の前に、さらに、前記微生物を培地中で増殖させる工程を具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。１９．請求項１〜１５のいずれかに記載の方法によって製造される１，３−プロパンジオール。２０．図１の第１欄および第２欄の制限酵素消化を有する活性グリセロールデヒドラターゼ酵素をコードするDNA 断片を含有するクレプシエラ・ニューモニエ（ Klebsiella pneumoniae）から単離した約３５ｋｂのコスミド。２１．宿主微生物と請求項２０に記載のコスミドとを含有することを特徴とする形質転換微生物。２２．前記宿主微生物が大腸菌であり、前記微生物がATCC受託番号第69789 号に指定されていることを特徴とする請求項２１に記載の形質転換微生物。２３．宿主微生物と、クレプシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）から単離される第1 のDNA 断片と、クレプシエラ・ニューモニエ（Klebsiella p neumoniae）から単離される少なくとも1 種の第2 のDNA 断片とを含有し、前記第１のDNA 断片が、図１の第１欄および第２欄の制限酵素消化を有する活性グリセロールデヒドラターゼ酵素をコードし、かつ、前記第2 のDNA 断片が、グリセロールデヒドラターゼ酵素以外の活性機能性タンパク質をコードすることを特徴とする形質転換微生物。２４． dhaB1、dhaB2、およびdhaB3 および／またはdhaTをコードするDNA 断片を含有し、かつATCC受託番号第55760 号に指定されていることを特徴とする組換えシュードモナスエスピー（Pseudomonas s.p.）。２５． dhaB1、dhaB2、およびdhaB3 および／またはdhaTをコードするDNA 断片を含有し、かつATCC受託番号第74363 号に指定されていることを特徴とする組換えピヒア・パストリス。２６． dhaB1、dhaB2、およびdhaB3 および／またはdhaTをコードするDNA 断片を含有し、かつATCC受託番号第号に指定されていることを特徴とする組換えサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株ｐMCK1/10/ 17(MH)#A。２７． dhaB1、dhaB2、およびdhaB3 をコードするDNA 断片を含有し、かつATCC 受託番号第号に指定されていることを特徴とする組換えバシルス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）株BG188/pM26（クローン＃８）。２８． dhaB1、dhaB2、およびdhaB3 および／またはdhaTをコードするDNA 断片を含有し、かつATCC受託番号第号に指定されていることを特徴とする組換えバシルス・サチルス（Bacillus subtilis）株BG2864/pM27（クローン＃１）。２９． dhaB1、dhaB2、およびdhaB3 およびdhaTをコードするDNA 断片を含有し、かつATCC受託番号第号に指定されていることを特徴とする組換えストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）株SL14-2。３０． dhaB1、dhaB2、dhaB3 およびdhaTをコードするDNA 断片を含有し、かつA TCC受託番号第号に指定されていることを特徴とする組換えアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）株TGR40-13。３１．デヒドラターゼ酵素を表現する組換え真核微生物。３２．酵母および糸状菌からなる群から選ばれることを特徴とする請求項３１に記載の組換え真核微生物。３３．さらに、１，３−プロパンジオールを回収する工程を具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。