CN1500877A - 利用单一微生物将可发酵碳源生物转化为1，3-丙二醇 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用单一微生物将一种碳底物生物转化为1，3－丙二醇的方法，所使用的微生物含有编码一种活性甘油脱水酶或二醇脱水酶的基因，本方法通过将这类微生物与一种碳底物在合适的发酵条件下接触来进行。

Description

利用单一微生物将可发酵碳源生物转化为1，3-丙二醇

本申请是申请日为1996年5月10日，申请号为96195288.1，发明名称为“利用单一微生物将可发酵碳源生物转化为1，3-丙二醇”的发明专利申请的分案申请。

                    发明领域

本发明包括利用单一微生物将一种可发酵的碳源生物转化为1，3-丙二醇的方法。

                    发明背景

1，3-丙二醇是一种在生产聚酯纤维中和在制造聚亚胺酯及环状化合物中具有潜在应用价值的单体。

已经知道有多种化学途径能够生产1，3-丙二醇。例如，可以利用一种催化剂，在存在磷化氢、水、一氧化碳、氢气和一种酸的情况下，通过丙烯醛的催化溶液相水合，然后还原，将环氧乙烷转化为1，3-丙二醇。或用碳氢化合物如甘油，在存在一氧化碳和氢气的条件下，使用含周期表第八族原子的催化剂进行反应来制备。虽然使用这些方法都能产生1，3-丙二醇，但它们非常昂贵，并且会产生含有环境污染物的废物。

人们在一个世纪前就已经知道，1，3-丙二醇可以通过发酵甘油来生产。已经在多种细菌例如柠檬酸杆菌属、梭菌属、肠杆菌属、泥杆菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属和暗杆菌属中发现了能够生产1，3-丙二醇的菌株。在每种已经研究的情况中，甘油都经两个酶促反应序列步骤转化为1，3-丙二醇，第一步，一种脱水酶催化甘油转化为3-羟基丙醛(3-HP)和水，方程1。第二步，3-HP被一种NAD⁺相连的氧化还原酶还原为1，3-丙二醇，方程2。1，3-丙二醇不再被进一步代谢，因而在培养基中高浓度积累。整个反应消耗等当量的还原性辅助因子-还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，NADH被氧化成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)。

                     (方程1)

    (方程2)

由甘油产生1，3-丙二醇一般以甘油为唯一碳源在厌氧条件下进行，并且没有其它外源的还原性等价受体。在这种条件下，在如柠檬酸杆菌属，梭菌属，和克雷伯氏菌属的菌株中，起作用的是一种甘油代谢的平行途径，这一途径包括，甘油首先被一种NAD⁺-(或NADP⁺-)连接的甘油脱氢酶氧化为二羟基丙酮(DHA)，方程3。DHA在一种DHA激酶的作用下磷酸化后产生磷酸二羟基丙酮(DHAP)(方程4)，就可通过如糖酵解途径用于生物合成和支持ATP的产生。相对于1，3-丙二醇途径，这一途径可以为细胞提供碳源和能量，并且产生而不是消耗NADH。

       (方程3)

              (方程4)

在肺炎克雷伯氏菌和弗氏柠檬酸杆菌中，编码功能相连的甘油脱水酶(dhaB)、1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱水酶(dhaD)和二羟基丙酮激酶(dhaK)活性的基因都包含在调节子dha中。柠檬酸杆菌属和克雷伯氏菌属的dha调节子已在大肠杆菌中获得了表达，并且都显示能将甘油转化为1，3-丙二醇。

制备甘油的生物过程已经知道，除一些细菌外，绝大多数甘油生产者是酵母，其它真菌和藻类也已知可产生甘油。细菌和酵母都通过糖酵解途径中的果糖-1，6-二磷酸途径或Embden Meyerhof Parnas途径转化葡萄糖或其它碳水化合物来生产甘油，但是，某些特定的藻类将叶绿体中溶解的二氧化碳和碳酸氢盐转化成卡尔文循环中的三碳中间产物。在一系列步骤中，这种三碳中间产物-磷酸甘油被转化为3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛很容易互变为其酮异构体-磷酸二羟丙酮，并最终转化为甘油。虽然生产甘油和1，3-丙二醇的生物方法都已经知道，但一直没能证明整个过程能由单一有机体来完成。

上面介绍的生产1，3-丙二醇的化学方法和生物方法都不能很好地适应于工业规模生产，因为化学过程消耗大量的能量，而生物过程需要昂贵的起始物质-甘油。因此需要一种只要求低能量输入和廉价起始物的方法。更需要这样一种方法，它应含有一种微生物，这种微生物能将基本碳源如碳水化合物或糖转化为所需的1，3-丙二醇终产物。

虽然需要能将可发酵碳源而不是甘油或二羟基丙酮转化为1，3-丙二醇的单一有机体转化，但已经证明这种努力需要克服重大的困难。例如，Gottschalk等人(EP 373 230)指出，多数对生产1，3-丙二醇有用的菌株如弗氏柠檬酸杆菌、Clostridium autobutylicum、丁酸梭菌和肺炎克雷伯氏菌，其生长会因存在氢供体如果糖或葡萄糖而受到干扰。短乳杆菌和布氏乳杆菌的菌株在甘油与果糖或葡萄糖中共发酵时能生产1，3-丙二醇，但在用甘油作唯一碳源时却不能生长，而且，虽然已经显示静止细胞能代谢葡萄糖或果糖，但它们不产生1，3-丙二醇(Veiga DA Cunha等，《细菌学杂志》174卷，1013页(1992))。同样，已经显示多养泥杆菌的一个菌株，当提供甘油和乙酸时能产生1，3-丙二醇，但在没有甘油时不能由碳水化合物包括果糖和葡萄糖产生1，3-丙二醇。(Steib，《(微生物学丛刊》(Arch.Microbiol.)140卷，139页(1984))。最后，Tong等人(《应用生物化学和生物技术》34卷，149页(1992))指出，转化有编码甘油脱水酶的dha调节子的重组大肠杆菌在没有外源甘油时，不能由葡萄糖或木糖产生1，3-丙二醇。

提高由甘油生产1，3-丙二醇的产量的努力已经有了报导，这些方法包含能提供还原性等价物的辅助底物，典型的辅助底物为可发酵的糖类。已有人宣称弗氏柠檬酸杆菌和肺炎克雷伯氏菌DSM4270的静止细胞在共发酵甘油和葡萄糖时，产量能够提高(Gottschalk等，上文；Tran-Dinh等，DE 3734 764)；但肺炎克雷伯氏菌ATCC25955的生长细胞在共发酵甘油和葡萄糖时不能产生1，3-丙二醇(I-T.Tong，Ph.D.论文，Wisconsin-Madison大学(1992))。用重组大肠杆菌在甘油与葡萄糖或果糖中共发酵时也有产量提高的报导；但在没有甘油时，不能产生1，3-丙二醇(Tong，上文)。在这些系统中，单一有机体将碳水化合物用作产生NADH的原料，并为细胞的维持和生长提供能量和碳。这些公开内容提示，糖类并没有进入产生1，3-丙二醇的碳流动。没有一种情况是在不含外源甘油的情况下产生了1，3-丙二醇。因此文献清楚地提示，用单一有机体由一种碳水化合物生产1，3-丙二醇是不可能的。

本发明解决的难题是用单一有机体由廉价的碳底物如葡萄糖或其它糖类生物生产1，3-丙二醇。这种生产1，3-丙二醇的生物法需要甘油作为一个两步顺序反应的底物，在这个两步顺序反应中，一种脱水酶(典型的酶是一种依赖辅酶B₁₂的脱水酶)将甘油转化为中间产物3-羟基丙醛，后者随后被一种依赖于NADH-(或NADPH)的氧化还原酶还原成1，3-丙二醇。由于所需的辅助因子非常复杂，因此用这种反应顺序生产1，3-丙二醇的工业方法必须使用完整细胞作为催化剂。而且，为使这种生产方法在经济上可行，需要比甘油或二羟基丙酮便宜一些的原料。葡萄糖和其它碳水化合物是合适的底物，但正如上面所讨论的，它们干扰1，3-丙二醇的生产。结果没有一种单一的有机体显示出能将葡萄糖转化成1，3-丙二醇。

本发明的申请者已经解决了上述难题，本发明提供使用单一有机体将一种可发酵碳源直接生物转化为1，3-丙二醇的方法。葡萄糖被用作为模式底物，而且这种生物转化方法可应用于任何存在的微生物。携带一种脱水酶基因的微生物能将葡萄糖和其它糖类通过甘油降解途径转化成1，3-丙二醇，产量和选择性都非常好。而且，本发明还可通用于包括任何一种能方便地转化为1)甘油、2)二羟基丙酮、或3)甘油氧化而成的C3化合物(例如甘油3-磷酸)或4)二羟基丙酮氧化而成的C3化合物(例如磷酸二羟基丙酮或甘油醛3-磷酸)的碳底物。

                      发明概述

本发明包括使用单一微生物将一种碳底物生物转化为1，3-丙二醇的方法，这种方法通过将所说的微生物与所说的底物接触来进行，所说的微生物至少带有一个能表达一种脱水酶的基因。这种微生物可以是野生型的，或者是遗传性状改变了的，例如一种重组微生物或微生物的一种突变体。脱水酶优选为一种甘油脱水酶或一种二醇脱水酶。

本发明进一步包括上述方法的产物。

本发明进一步包括一种粘粒，这种粘粒含有一个从肺炎克雷伯氏菌中分离的35kb的DNA片断，其中所说的DNA片断编码一种有活性的甘油脱水酶，其限制酶切图谱见图1的泳道1和泳道2。这种粘粒在转入一种微生物时，能代谢一种碳底物特别是葡萄糖产生1，3-丙二醇。

本发明进一步包括一种转化的微生物，这种转化的微生物包含宿主微生物和上面所说的粘粒或所说粘粒的编码一种活性功能蛋白但不是甘油脱水酶的任何DNA片断。

本发明还包括一种生产1，3-丙二醇的生物转化方法，这种生物转化方法包括，在合适的条件下将甘油与至少带有一个能表达一种脱水酶的基因的单一微生物接触，所用的微生物选自曲霉属、酵母属、接合酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、德巴利酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基菌属、沙门氏菌属、芽胞杆菌属、链霉菌属和假单胞菌属。

本发明还包括一种生产1，3-丙二醇的生物转化方法，这种生物转化方法包括，在合适的条件下将一种碳底物与至少带有一个能表达一种脱水酶的基因的单一微生物接触，其中所说的基因编码甘油脱水酶，并分离自克雷伯氏菌属、乳杆菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、暗杆菌属、泥杆菌属和梭菌属。

本发明还包括一种生产1，3-丙二醇的生物转化方法，这种生物转化方法包括，在合适的条件下将一种碳底物与至少带有一个能表达一种脱水酶的基因的单一微生物接触，其中所说的基因编码甘油脱水酶，并分离自克雷伯氏菌属和沙门氏菌属。

优选的宿主微生物选自柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷伯氏菌属、气杆菌属、乳杆菌属、曲霉属、酵母属、接合酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、德巴利酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、芽胞杆菌属、链霉菌属和假单胞菌属。

本发明包含的重组微生物在生物保藏物简述中进行阐述。

                        附图简述

图1显示粘粒pKP1、pKP2和pKP4的限制酶(EcoRI、BamHI、EcoRV和NotI)消化物及其在0.8％琼脂糖凝胶电泳上的分离图谱，上述粘粒图谱分别标记为泳道1、2和4。分子大小标准参照物上样在末端泳道。标记为数字1和2的泳道代表含有一个甘油脱水酶的粘粒。

图2显示pKP1的部分物理图谱和各基因以DNA序列为基础的位置。这些基因的鉴定基于推导出的开放阅读框与Genbank数据库的比较，比较所用的软件为Wisconsin大学的序列分析软件提供的Tfasta程序(Genetics Computer Group，1991年4月，第7版，575 Science Drive，Madison，WI53711)。

                    生物保藏物和序列表简述

含有粘粒pKP1的转化大肠杆菌DH5α依照《布达佩斯条约》于1995年4月18日保藏在ATCC，并被命名为ATCC69789，粘粒pKP1含有克雷伯氏菌基因组的编码甘油脱水酶的部分。含有粘粒pKP4的转化大肠杆菌DH5α依照《布达佩斯条约》于1995年4月18日保藏在ATCC，并被命名为ATCC69790，粘粒pKP4含有克雷伯氏菌基因组的编码二醇脱水酶的部分。转化有一个含dhaB操纵子的质粒的铜绿假单胞菌菌株PAO 2845:pDT9依照《布达佩斯条约》于1996年4月11日保藏在ATCC，并被命名为ATCC55760。转化有非复制型质粒的巴斯德毕赤酵母菌株MSP42.81依照《布达佩斯条约》于1996年4月11日保藏在ATCC，并被命名为ATCC74363，非复制型质粒上含有dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT基因的表达盒。转化有一个含有dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT操纵子的质粒的啤酒酵母菌株pMCK1/10/17(HM)#A，在本国际申请提交前依照《布达佩斯条约》于1996年5月9日保藏在ATCC，并被命名为ATCC74370。转化有一个含有dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT操纵子的质粒的浅青紫链霉菌菌株SL/14.2，在本国际申请提交前依照《布达佩斯条约》于1996年5月9日保藏在ATCC，并被命名为ATCC98052。转化有一个含有dhaB1、dhaB2和dhaB3操纵子的质粒的地衣芽胞杆菌菌株BG188/pM26(克隆#8)，在本国际申请提交前依照《布达佩斯条约》于1996年5月9日保藏在ATCC，并被命名为ATCC98051。转化有一个含有dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT操纵子的质粒的枯草芽胞杆菌菌株BG2864/pM27(克隆#1)，在本国际申请提交前依照《布达佩斯条约》于1996年5月9日保藏在ATCC，并被命名为ATCC98050。转化有一个含有dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT操纵子的质粒的黑曲霉株TGR40-13，在本国际申请提交前依照《布达佩斯条约》于1996年5月9日保藏在ATCC，并被命名为ATCC74369“ATCC”指位于12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 U.S.A的美国典型培养物保藏中心国际保藏处。命名是指保藏物的登记号。

本发明的申请人提供46个序列，这些序列遵循“专利申请中核苷酸和氨基酸序列标准表述的规定”(EPO局长决议的附录I和附录II，发表于OJ EPO的No 2增补件，12/1992)，并遵循37C.F.R.1.821-1.825和附录A和B(“含有核苷酸和/或氨基酸序列的申请文件的要求”)。

                       发明详述

本发明提供一个在单一有机体中由可发酵的碳源生物生产1，3-丙二醇的方法。这种方法包括一种含脱水酶的微生物，这种微生物与一种碳底物相接触，而1，3-丙二醇从生长培养基中分离。这种单一有机体可以是野生型有机体，或者可以是携带有编码脱水酶的基因的、遗传性状改变了的有机体。

本发明提供一个快速、廉价和符合环保的1，3-丙二醇单体来源，这种1，3-丙二醇单体在聚酯和其它聚合物的生产中非常有用。

在这里，下列词可用于权利要求和说明书的解释。

在这里，“核酸”一词指由单体(核苷酸)组成的大分子，它可以是单链的，也可以是双链的。核苷酸包含一分子的糖、磷酸以及一分子的嘌呤或嘧啶。“核酸片断”指所给核酸分子的一个部分。在高等植物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)参与DNA到蛋白质的信息转移。“基因组”指有机体中每个细胞所含的全部遗传物质。“核苷酸序列”一词指DNA或RNA的多聚物，它可以是单链的，也可以是双链的，并可选择地含有能掺入DNA或RNA多聚物的人工合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。

在这里，“基本上相同”指DNA序列可有并不引起所编码氨基酸改变的碱基改变，或者碱基改变使一个或多个氨基酸改变，但并不影响DNA序列所编码蛋白质的功能特性。所以应当理解本发明所包含的要大于序列特例。本发明也包括基本上不影响结果蛋白分子功能特性的序列修改，诸如在序列中产生沉默改变的删除、插入或替换。例如，本发明包括反映遗传密码简并性的基因序列改变，或在给定位点导致产生一个化学等价氨基酸的基因序列改变。因此，疏水性氨基酸丙氨酸的密码子可被编码另一个疏水性稍弱的氨基酸残基如甘氨酸的密码子取代，或可被编码疏水性更强的氨基酸残基的密码子取代，如被编码缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的密码子取代。同样，导致一个带负电荷的残基取代另一个带负电荷的残基的改变，如天冬氨酸取代谷氨酸，或一个带正电荷的残基取代另一个带正电荷的残基，如赖氨酸取代精氨酸，预计也可产生生物等价产物。导致蛋白分子的N末端部分和C末端部分改变的核苷酸改变也不一定改变蛋白的活性。在某些情况下，事实上需要使序列突变来研究改变对蛋白生物活性的影响。上面每种设想的修改和编码产物保留的生物活性的鉴定都是本领域的常规技术。而且，本领域的技术人员应知道，本发明所包括的“基本上相同”的序列也可由它们与这里所举的序列例子在严格条件下(0.1XSSC，0.1％SDS，65℃)杂交的能力来定义。

“基因”指表达一个特殊蛋白的核酸片断，包括编码序列前面(5′非编码区)和后面(3′非编码区)的调节序列。“天然”或“野生型”的基因指自然界中发现的带有其自身调节序列的基因。

“遗传改变的或遗传改变的微生物”指适用于本发明的、天然遗传机制经历了改变的任何微生物。微生物的遗传改变可通过含异源核酸片断的载体转化、诱变剂(例如，UV灯，乙磺酸)诱变、或其它任何能在细胞基因组中产生稳定改变的方法来进行。

“构建物”一词指任何来源的质粒、病毒、自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，它们可以是线型的或环状的、单链的或双链的DNA或RNA，在它们中，多种核苷酸序列组合或重组成一个独特的结构，这种独特的结构能将一个启动子片断、所选基因产物的DNA序列以及合适的3′非翻译序列导入一个细胞。

“转化”或“转染”指细胞在整合核酸后获得新的基因。所获得的基因可以整合在染色体中，也可作为染色体外复制序列导入。“转化子”指转化的产物。“遗传改变的”指用转化或突变的方法改变遗传物质的过程。

“表达”指由编码基因产物序列的基因经转录和翻译得到基因产物。

在这里，“质粒”或“载体”或“粘粒”指染色体外的遗传元件，它们常常带有不是细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常为双链环状的DNA分子形式。

“脱水酶”指任何能够将甘油分子异构或转化为3-羟基丙醛产物的酶。根据本发明的目的，脱水酶包括甘油脱水酶或二醇脱水酶，它们的优选底物分别为甘油和1，2-丙二醇。

“碳底物”或“碳源”的意思是任何能被一种微生物代谢的碳源，其中底物中至少有一个碳原子。本发明的前提是，碳底物不是甘油或二羟基丙酮。

                      重组有机体的构建

本发明的重组有机体含有将碳底物转化为1，3-丙二醇的酶促途径的编码基因，重组有机体可用本领域熟知的技术进行构建。在本发明中，编码脱水酶的基因可从一个天然宿主如克雷伯氏菌中分离，并用来转化大肠杆菌宿主菌株DH5α、ECL707和AA200。

从一个细菌的基因组中获取所需基因的方法在分子生物学领域中非常普通和熟知。例如，如果基因的序列是已知的，就用限制性内切酶消化来构建合适的基因组文库，并可用与所需基因序列互补的探针进行筛选。一旦分离到序列，就可用标准的引物指导下的扩增方法如聚合酶链反应(PCR)(U.S.4,683,202)扩增DNA，来获得大量适于用载体进行转化的DNA。

另外，可以构建粘粒文库，即可将大片断的基因组DNA(35-45kb)包装到载体中，用于转化合适的宿主。粘粒载体的独特性在于能容纳大量的DNA。粘粒一般至少有一个拷贝的cosDNA序列，cos序列对于外源DNA的包装及随后的环化是必需的。除了cos序列外，这些载体还含有复制的起始区域(Col E1)和药物抗性标记(如抗氨苄青霉素或抗新霉素的基因)。用粘粒来转化合适细菌宿主的方法在Sambrook，J.等，《分子克隆实验指南》，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press中有详细的介绍，在此引入作为参考。

对典型的粘粒克隆来说，外源DNA分离后，使用合适的限制性内切酶将其连接到粘粒载体的cos区域。然后含有线性外源DNA的粘粒载体与一个DNA包装载体如λ噬菌体反应。在包装过程中，cos位点被切割，外源DNA被包装到细菌病毒颗粒的头部。然后这些颗粒被用于转染合适的宿主细胞，例如大肠杆菌。一旦注射到细胞内部，外源DNA在cos粘性末端的影响下环化。通过这种方式，外源DNA的大片断能被导入重组宿主细胞，并在其中表达。

粘粒载体和粘粒转化方法在本发明的上下文中被用来从已知能将甘油加工成1，3丙二醇的细菌种属中克隆基因组DNA的大片断。特别是，来自肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA用本领域熟知的方法进行了分离，并用限制性内切酶Sau 3A消化，然后插入到粘粒载体Supercos 1TM，并用GigapackII包装抽提物包装。载体构建后，用此粘粒DNA转化大肠杆菌XL1-Blue MR细胞。使细胞在存在甘油的条件下生长，并分析培养基中1，3-丙二醇的形成，来筛选能够将甘油转化为1，3-丙二醇的转化子。

对两个1，3-丙二醇阳性的转化子进行了分析，并将其粘粒命名为pKP1和pKP2。DNA测序表明它们与来自弗氏柠檬酸杆菌的甘油脱水酶有着广泛的同源性，这证明这些转化子含有编码甘油脱水酶基因的DNA。对其它1，3-丙二醇阳性的转化子也进行了分析，它们的粘粒命名为pKP4和pKP5。DNA测序表明这些粘粒带有编码二醇脱水酶基因的DNA。

虽然本发明使用了来自一个克雷伯氏菌属粘粒的分离基因，脱水酶基因的其它来源还可包括但不限于柠檬酸杆菌属、梭菌属和沙门氏菌属。

能正向影响1，3-丙二醇产生的其它基因可在合适的宿主中表达。例如很可能非常需要甘油降解途径和/或其它途径中的特定酶超量表达，比现在在野生型细胞中发现的表达水平要高得多。这可通过将编码这些酶的基因选择性克隆到多拷贝质粒中或将这些基因置于一个诱导型或组成型的强启动子的后面来完成。超量表达所需蛋白的方法在分子生物学领域非常普通和熟知，在以上Sambrook文中可找到例子。而且，用本领域的技术人员熟知的方法对特定基因进行特异性地删除，会明显影响1，3-丙二醇的产生。这些方法的例子可在《酶学方法》，217卷，R.Wu编，Academic Press：San Diego(1993)中找至。

                         突变体

应当理解，除了举例所用的细胞，本发明还能使用有着单一或多个突变的细胞，这些突变被特别设计来增加1，3-丙二醇的产量。通常将碳原料偏离到不能产生1，3-丙二醇的途径的细胞，或出现明显的分解代谢产物阻遏的细胞，都可通过突变来消除这些表型缺陷。例如，许多野生型细胞可因培养基中的葡萄糖和副产物产生分解代谢阻遏。可以理解这些有机体的突变株，如能抵抗葡萄糖的阻遏而生产1，3-丙二醇，将在本发明中特别有用。

产生突变体的方法在本领域中非常普通和熟知。例如，野生型细胞可暴露在各种试剂如辐射或化学诱变剂中，然后筛选所需要的表型。当用辐射来产生突变时，紫外线(UV)或离子辐射都可以使用。用于遗传突变的合适短波紫外线的波长范围为200nm至300nm，优选波长为254nm。这个波长的UV辐射原则上导致核酸序列中的鸟嘌呤和胞嘧啶改变为腺嘌呤和胸腺嘧啶。因为所有的细胞都有DNA修复机制，能修复多数UV诱导的突变，可加入试剂如咖啡碱和其它抑制剂来干扰修复过程，使有效突变的数量变得最大。使用波长在300nm至400nm范围的长波UV诱变也可以，但除非与多种激活剂如能与DNA作用的补骨质素染料联用，一般不如短波UV有效。

用化学试剂来产生突变体也非常有效，常用的物质包括能影响非复制DNA的化合物如HNO₂和NH₂OH，以及影响复制DNA的试剂如吖啶染料，吖啶染料因能引起移码突变而非常引人注目。用辐射或化学试剂产生突变体的特殊方法在本领域中文献非常多。例如见，Thomas D.Brock，《生物技术：工业微生物教程》，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.，或Deshpande，Mukund V.，《应用生物化学和生物技术》，36卷，227页，(1992)，这里引入作为参考。

诱变发生后，具有所需表型的突变体可用多种方法进行选择。随机筛选是最常用的，即选择能产生所需产物或中间产物的诱变细胞。另外，可使诱变群体在只有抗性克隆能够生长的选择培养基上生长来选择性地分离突变体。突变体选择的方法在工业微生物领域已经非常完备和熟知。见Brook，上文，DeMancilha等，《食品化学》，14卷，313页，(1984)。

            1，3-丙二醇产生途径中的突变和转化：

代表性的酶途径。从葡萄糖产生1，3-丙二醇可由下面的系列步骤来完成。这个步骤系列是本领域的技术人员所熟知的多种途径的代表。葡萄糖经过一系列步骤在糖酵解途径的酶催化下转化为磷酸二羟基丙酮(DHAP)和3-磷酸甘油醛(3-PG)。然后，甘油可由DHAP水解成二羟基丙酮(DHA)后还原形成，或由DHAP还原成甘油3-磷酸(G3P)后水解来形成。水解步骤可由各种已知没有底物特异性的细胞磷酸酶催化，或者这种活性可用转化来导入宿主。还原步骤可由一种NAD⁺(或NADP⁺)相连的宿主酶催化，或者这种活性可用转化来导入宿主。值得注意的是dha调节子含有一个甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)，这个酶催化方程3的逆反应。

                       (方程1)

      (方程2)

              (方程3)

甘油经3-羟基丙醛(3-HP)中间产物转化为1，3-丙二醇，这已在前面作了详细介绍。从甘油产生3-HP(方程1)是由脱水酶催化的，脱水酶可以由宿主编码或用转化的方法导入宿主。这种脱水酶可以是甘油脱水酶(E.C.4.2.1.30)、二醇脱水酶(E.C.4.2.1.28)或任何能够催化这个转化的酶。甘油脱水酶是由dha调节子编码的，而二醇脱水酶不是。从3-HP产生1，3-丙二醇(方程2)是由一种NAD⁺(或NADP⁺)相连的宿主酶催化，或者这种活性可用转化来导入宿主。这个产生1，3-丙二醇的最后反应可由1，3-丙二醇脱氢酶(E.C.1.1.1.202)或其它乙醇脱氢酶催化。

影响碳通道的突变和转化。多种在1，3-丙二醇产生途径含有变异的突变有机体在本发明中非常有用。例如将一个丙糖磷酸异构酶突变(tpi)引入本发明的微生物是一个应用突变来促进碳通道运行的例子。突变可直接针对一个结构基因来修复或提高一个酶的活性，或直接针对一个调节基因来调节一个酶活性的表达水平。

另外，转化和突变可组合使用来控制特定的酶活性，从而增加1，3-丙二醇的生成。因此，对能提高1，3-丙二醇产生的全细胞催化能力的修饰也在本发明的范围内。

                      培养基和碳底物

本发明的发酵培养基必须含有合适的碳底物。合适的碳底物包括但不局限于单糖(如葡萄糖和果糖)、寡糖(如乳糖和蔗糖)、多糖(如淀粉或纤维素)或其混合物和从可再生的原料(如酪清、玉米浆、蔗糖甜菜浆、大麦麦芽)获得的未纯化的混合物。另外，碳底物还可以是已经证明可代谢转化为关键生物化学中间物的一碳底物如二氧化碳或甲醇。由单一碳源(例如甲醇、甲醛或甲酸)生产甘油在嗜甲基酵母(K.Yamada等，《农业生物化学》，53卷第2期，541-543页，(1989))和细菌(Hunter等，《生物化学》，24卷，4148-4155页，(1985))中都已有报导。这些有机体能同化氧化状态的范围从甲醇到甲酸的单碳化合物，并产生甘油。碳同化的途径可通过核酮糖单磷酸、丝氨酸、或木酮糖单磷酸(Gottschalk，《细菌代谢》，第二版，Springer-Verlag：New York(1986))等途径。核酮糖单磷酸途径包括甲酸与核酮糖-5-磷酸结合而形成一个六碳糖，然后这个六碳糖转化为果糖并最终转化为三碳产物甘油醛-3-磷酸。同样，丝氨酸途径经过亚甲基四氢叶酸将一碳化合物同化到糖酵解途径中。

除了一种或两种碳底物外，嗜甲基有机体还已知有着利用多种含碳化合物(如甲胺和葡萄糖胺)和多种氨基酸的代谢活性。例如，嗜甲基酵母已知可利用甲胺的碳来形成海藻糖和甘油(Bellion等，《微生物在一碳化合物上的生长》(Microb.Growth Cl Compd)，[Int.Symp]，第7期(1993)，415-32页。编辑：Murrel，J.Collin；Kelly，Don P.出版：Intercept，Andover，UK)。同样，假丝酵母属的许多种能代谢丙氨酸或油酸(Sulter等，《微生物学丛刊》，(1990)，153卷第5期，485-9页)。应当理解本发明所用的碳源可包括多种含碳底物，并仅由有机体的选择来限制。

虽然可以理解上述所有提到的碳底物及其混合物在本发明中都是适用的，但优选的底物是葡萄糖、果糖、蔗糖或甲醇。

除了一种合适的碳源，发酵培养基还必须含有本领域的技术人员所熟知的合适的矿物质、盐、辅助因子、缓冲液和其它成分，这些成分应适于培养物的生长和启动1，3-丙二醇产生所必需的酶促途径。特别应当注意Co(II)的盐类和/或维生素B₁₂或其前体。

                          培养条件

细胞一般在合适的培养基中30℃进行培养。本发明优选的生长培养基为普通的商业制备培养基，例如Luria Bertani(LB)肉汤、SabouraudDextrose(SD)肉汤、或酵母培养基(YM)肉汤。其它的精确或合成的生长培养基也可以使用，而且特殊微生物生长的合适培养基应为微生物学和发酵科学领域的技术人员所熟知的。还可在反应培养基中使用已知能直接或间接调节代谢终产物抑制的试剂，如环腺苷2：3′-单磷酸。同样，还可将已知能调节酶活性从而导致1，3-丙二醇产生增加的化合物(如甲基紫精)与遗传操作结合使用，或用来代替遗传操作。

发酵的合适pH范围在pH5.0至pH9.0之间，其中pH6.0至pH8.0为优选的初始条件。

反应可在有氧或无氧的条件下进行，其中，优选的条件是无氧或微氧。

                  分批发酵和连续发酵

本方法包括一个分批发酵的方法。经典的分批发酵是一个封闭的系统，培养基的成分在发酵开始时设置好，并在发酵过程中不再人为改变。因此，在发酵开始时培养基与所需的有机体或有机体混合物一起接种，在发酵开始后不再向系统中加入任何东西。在典型情况下，“分批”发酵是就碳源的加入而言的，人们常常需要控制某些因素如pH和氧浓度。在分批发酵系统中，系统的代谢和各组分的生物量持续改变直到发酵结束。在分批培养物中，细胞从静止的延迟期进入高速生长的对数期并最后进入稳定期，在稳定期中，细胞的生长率降低或停止。如果不进行处理，处于稳定期的细胞会最终死亡。处于对数期的细胞通常产生大多数的终产物和中间物。

补料分批系统是标准分批系统的一个变化。补料分批发酵方法也适用于本发明，它除了包括经典的分批系统外，还包括在发酵过程中增加底物的量。补料分批系统在分解代谢物抑制细胞代谢时非常有用，因为在这种情况下需要限制培养基中的底物量。测定补料分批系统中的实际底物浓度非常困难，因而只能以可测量因素的变化为基础进行估计，例如用pH、溶解氧和废气如CO₂的分压的变化进行估计。分批发酵和补料分批发酵在本领域非常普通和熟知，相应的例子可在以上Brock文中找到。

虽然本发明以分批模式进行，但应当理解这些方法也适合于连续发酵方法。连续发酵是一个开放系统，在连续发酵中，一种精确发酵培养基被连续加入生物反应器中，同时等量的反应培养基被移出。连续发酵一般使培养物维持持续的高浓度，而细胞主要处于对数生长期。

连续发酵允许对影响细胞生长或终产物浓度的一个因素或多种因素进行调节。例如，一种方法能严格保持限制性养分如碳源或氮水平，而让其它参数改变。在其它系统中，可以连续改变多种影响生长的因子，而细胞浓度(用细胞浊度进行测量)保持恒定。连续系统尽量保持稳定的生长环境，因此，发酵中由于取出培养基而造成的细胞损失必须与细胞生长率相平衡。在连续发酵过程中调节养分和生长因子的方法以及使产物形成率达到最大的技术在工业微生物领域是众所周知的，而且多种方法已由Brock，上文，作了详细介绍。

应当理解，本发明可使用分批、补料分批或连续的方法实现，任何已知的发酵模式都是适用的。另外，应当理解细胞可作为全细胞催化物固定在底物上，为1，3-丙二醇的生成提供发酵环境。

                1，3-丙二醇的纯化和鉴定

从发酵培养基中纯化1，3-丙二醇的方法为本领域所熟知。例如，丙二醇可用下述方法从细胞培养基中获得，这个方法包括用一种有机溶剂抽提反应混合物、蒸馏和柱层析(U.S.5,356,812)。在这个过程中，一个特别好的有机溶剂是环己烷(U.S.5,008,473)。

可以通过对培养基进行高压液相色谱(HPLC)来直接鉴定1，3-丙二醇。在本发明中优选的方法是在一个分析用离子交换柱上，使用等梯度的0.01N的硫酸作流动相对发酵培养基进行分析。

                            细胞

适用于本发明的细胞包括那些携带脱水酶的细胞。应当理解，合适的细胞既可以是原核细胞也可以是真核细胞，并仅受它们表达活性脱水酶的能力的限制。在本发明中特别有用的细胞是能方便地应用于大规模发酵方法的细胞。这样的有机体在工业生物工程领域是众所周知的，它们的例子可在《应用于工业和农业的重组微生物》，Murooka等编辑，Marcel Dekker，Inc.，New YorK，New York(1994)中找到，包括发酵型的细菌以及酵母和丝状真菌。典型的酶可以是甘油脱水酶也可以是二醇脱水酶，其特异性底物分别为甘油和1，2-丙二醇。脱水酶能将甘油转化为羟基丙醛(3-HPA)，然后3-HPA转化为1，3-丙二醇。含有这个途径的细胞，可包括来自柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属和乳杆菌属的突变或重组有机体。为本领域的技术人员所熟知的能通过发酵产生甘油的微生物都可以作为重组脱水酶的宿主，例如曲霉属、酵母属、接合酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、Dunaliella、德巴利酵母属、毛霉属、球拟酵母属和甲基菌属。其它在本发明中适合用作宿主的细胞包括芽胞杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属和链霉菌属。若不囿于理论，可以认为，自然界中存在的、属于上面所提到种类的有机体都适用于本发明。

在申请人的实验工作基础上，应当理解多种细胞可用于本发明。例如申请人已经证明，在遗传和表型组合上差别很大的多种细胞都能将一种合适的碳底物生物转化为1，3-丙二醇，所举的细胞例子包括：一个组合有dha基因的肺炎克雷伯氏菌突变菌株、含有克雷伯氏菌属基因组中甘油或二醇脱水酶编码基因的元件的重组大肠杆菌菌株、和也用克雷伯氏菌属的元件转染并在编码磷酸丙糖异构酶的基因上带有一个突变的重组大肠杆菌(tpi^-)菌株。

虽然，即使在存在葡萄糖和木糖的情况下，含有来自肺炎克雷伯氏菌的dha调节子的大肠杆菌重组子也能将甘油转化为1，3-丙二醇(Tong等，《应用生物化学和生物技术》，34卷，149页(1992))。但在仅有葡萄糖存在的情况下，在这些有机体中不能检测到1，3-丙二醇。与这一公开内容不同，本发明的申请人发现，三株大肠杆菌在没有外源加入甘油存在的情况下由葡萄糖原料产生1，3-丙二醇，这三株大肠杆菌携带两种独立分离的、含来自肺炎克雷伯氏菌的dha调节子的粘粒中的一种。携带有含肺炎克雷伯氏菌dha调节子的粘粒载体pKP-1或pKP-2的大肠杆菌菌株ECL707，显示在没有外源加入甘油的情况下可以检测到由葡萄糖产生的1，3-丙二醇，虽然产量不高(实施例4)。从另一个宿主有机体-DH5α构建而来的重组大肠杆菌菌株也含有pKP-1或pKP-2粘粒载体，这种菌株被发现在合适的条件下由葡萄糖产生1，3-丙二醇比ECL707重组体有效得多，(实施例3)。在实施例4的条件下，由葡萄糖产生1，3-丙二醇更有效的菌株是含有粘粒载体pKP-1或pKP-2的重组大肠杆菌菌株AA200，实施例2，大肠杆菌AA200含有一个有缺陷的丙糖磷酸异构酶(tpi^-)。

从转化反应独立分离株的混合物中选择了AA200-pKP1的一个菌株作进一步的研究，这株细菌经过一个两阶段反应将葡萄糖转化为1，3-丙二醇。在第一阶段，菌株AA200-pKP1-5在不含葡萄糖和甘油的条件下生长到高细胞浓度。在第二阶段，将培养好的细胞悬浮在含有葡萄糖但没有甘油的培养基中，细胞就会以很高的转化率和选择性将葡萄糖转化为1，3-丙二醇，实施例5。虽然在免疫化学、色谱和遗传上不同，依赖于辅酶B₁₂的酶-甘油脱水酶(E.C.4.2.1.30)和二醇脱水酶(E.C.4.2.1.28)都能催化甘油转化为3-羟基丙醛。dha调节子中包含甘油脱水酶，但不含二醇脱水酶。肺炎克雷伯氏菌ATCC8724含有一个二醇脱水酶而不是甘油脱水酶，它能将甘油转化为1，3-丙二醇(Forage等，《细菌学杂志》，149卷，413页，(1982))。重组大肠杆菌菌株ECL707和AA200均含有能编码二醇脱水酶的粘粒pKP4，它们都能将葡萄糖转化为1，3-丙二醇，

实施例2和实施例4。

肺炎克雷伯氏菌ECL2106是从一个天然存在的菌株通过诱变制备而来的(Ruch等，《(细菌学杂志》124卷，348页，(1975))，它能够组成型表达dha调节子(Ruch等，上文；Johnson等，《细菌学杂志》164卷，479页(1985))。用同样方法制备了具有同样表型的肺炎克雷伯氏菌ATCC25955的一个衍生菌株(Forage等，《细菌学杂志》149卷，413页(1982))。克雷伯氏菌属dha结构基因的表达部分受一个抑制子的控制(dha R的产物)(Sprenger等，《普通微生物学杂志》135卷，1255页(1989))。本发明的申请人已经证示，含有组成型dha结构基因的ECL2106能在没有外源加入甘油的条件下，由葡萄糖原料生产1，3-丙二醇，实施例6。这与野生型的肺炎克雷伯氏菌ATCC25955相反。肺炎克雷伯氏菌ATCC25955在相同条件下不能产生可检测水平的1，3-丙二醇，实施例6。

ECL2016中dha结构基因的表达进一步受到分解代谢物表达的控制(Sprenger等，《普通微生物学杂志》135卷，1255页，(1989))。将必需的结构基因置于另外的启动子控制下能够消除分解代谢物抑制。这一点已在弗氏柠檬酸杆菌的1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)和产酸克雷伯氏菌的二醇脱水酶中得到了证实(Daniel等，《细菌学杂志》177卷，2151页(1995)和Tobimatsu等，《生物与化学杂志》270卷，7142页，(1995))。通过这种方式在ECL2106中消除分解代谢物抑制，成功地提高了在没有外源甘油的情况下由葡萄糖生产1，3-丙二醇的产量。按前述的方法使用合适的碳通道可进一步提高1，3-丙二醇产量，例如使用tpi^-突变。

因为柠檬酸杆菌和克雷伯氏菌的dha调节子非常相似。本领域的技术人员可以理解，在克雷伯氏菌中用来在没有外源甘油的条件下由葡萄糖生产1，3-丙二醇的技术也可用于柠檬酸杆菌。而且，因为丁酸梭菌的甘油代谢与肺炎克雷伯氏菌相同(Zeng等，《生物技术与生物工程》44卷，902页，(1994))，这些技术也可用于梭菌。

                        实施例

通用方法

磷酸化、连接和转化的过程是本领域众所周知的，在下面的实施例中适用的技术可在Sambrook，J等，《分子克隆实验指南》，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)中找到。

适用于细菌培养物维持和生长的材料和方法是本领域众所周知的。在下面的实施例中适用的技术可在《普通细菌学方法手册》(PhillippGerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，WillisA.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips，编辑)，美国微生物学会，Washington，DC(1994)中，或在Thomas D.Brock的《生物技术：工业微生物教程》，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA中找到。除非另行说明，所有用于细菌生长和维持的试剂和材料都购自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)和Sigma Chemical Company(St Louis，MO)。

缩写的含义如下：“h”指小时，“min”指分钟，“sec”指秒，“d”指天，“mL”指毫升，“L”指升，50amp为50ug/mL的氨苄青霉素，LB-50amp为含50ug/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani肉汤。

在表中使用了下列缩写。“Con”为转化，“Sel”是以碳为基础的选择性，“nd”指没有检测。

酶试验

无细胞抽提物中的甘油脱水酶用1，2-丙二醇作底物来测定。这个试验的基础是醛与甲基苯并-2-噻唑酮腙反应，详见Forage和Foster的介绍(《生物物理与生物化学学报》(B.B.A)569，249，(1979))。1，3-丙二醇氧化还原酶有时被称为1，3-丙二醇脱氢酶，其活性可按照Johson和Lin，《细菌学杂志》169卷，2050页(1987)介绍的方法进行测定。1，3-丙二醇的分离和鉴定

甘油到1，3-丙二醇的转化用HPLC来监测，使用色谱领域的技术人员常用的标准技术和材料进行分析。一个合适的方法是使用一台WatersMaxima 820 HPLC系统，并用UV(210nm)和RI进行检测。样品注入一个已装有Shodex SH-1011P预装柱(6mm×50mm)的Shodex SH-1011柱(8mm×300mm，购自Waters，Milford，MA)，温度控制在50℃，使用0.01N H₂SO₄作流动相，流速为0.5mL/min。当需要进行定量分析时，样品与作为外部标准的一定量的三甲基乙酸一起制备。一般来说，甘油(RI检测)、1，3-丙二醇(RI检测)和三甲基乙酸(UV和RI检测)的保留时间分别为20.67分、20.68分和35.03分。

1，3-丙二醇的产生用GC/MS来证实。使用GC/MS领域的技术人员常用的技术和材料进行分析。一个合适的方法是使用一台与HewlettPackard 5971系列质量选择检测器(EI)偶联的Hewlett Packard 5890系列II气相色谱和一个HP-INNOWax柱(30m长，0.25mm i.d.，0.25micro film厚)。所产生的1，3-丙二醇的保留时间和质谱图与确定的1，3-丙二醇(m/e：57，58)进行比较。

另一个GC/MS方法包含样品的衍生。在1.0mL样品(例如，培养物上清)中加入30uL浓(70％v/v)高氯酸，混匀后将样品冷冻并干燥。在干燥物中加入双(三甲基硅)三氯乙胺∶吡啶的1∶1混合物(300uL)，剧烈混匀，在65℃放置1小时。离心除去不溶物，获得的液体分为两相，用上层液体进行分析。在一个DB-5柱(48m，0.25mm I.D.，0.25um film厚；获自J&W Scientific)上对样品进行层析。从培养物上清中获得的1，3-丙二醇衍生物的保留时间和质谱图与确定的标准物进行比较。TMS衍生的1，3-丙二醇的质谱图包括205、177、130和115AMU的特征离子。

肺炎克雷伯氏菌粘粒文库的构建

肺炎克雷伯氏菌(ATCC25955)在100mL LB培养基中37℃通气培养8小时。使用DuPont Sorvall GLC 2.B离心机在室温下将细菌(每管25ml)3000rpm离心15分钟。取细菌沉淀并弃去上清。将细菌沉淀在-20℃冷冻。按下面指出的方法分离染色体DNA，并注意避免DNA剪切(即避免涡旋)。将每管细菌重新悬浮在2.5mL的50mM Tris-10mM EDTA中，加入500uL溶菌酶(1mg/mL)。温和悬浮细菌，并将悬液在37℃保温15分钟。在悬液中加入十二烷基硫酸钠至终浓度为0.5％。这会导致溶液变清。在悬液中加入蛋白酶K(50ug/mL)并55℃保温2小时。将试管取出转至一个冰槽中，并加入氯化钠至终浓度0.4M。在溶液中加入两倍体积的乙醇。用一根玻璃管插入界面使DNA温和地缠绕在其上。将DNA浸入一个含70％乙醇的试管中。真空干燥后，将DNA重新悬浮于50uL水中，并用分光光度法测定DNA的浓度。取小份DNA稀释后在0.5％的琼脂糖凝胶上观察DNA的完整性。

染色体DNA按Sambrook等，上文，介绍的方法用Sau 3A部分消化，DNA(0.2ug)用2单位的Sau 3A(Promega，Madison，WI)在室温下消化，反应总体积为200uL。在0、5、10和20分钟分别取样(50uL)，转入含5umol EDTA的试管中，将这些试管在70℃保温10分钟。取一份(2uL)在0.5％的琼脂糖凝胶上电泳分析，确定消化的水平，剩余的样品(48uL)在-20℃保存。将凝胶用溴化乙啶染色并在UV下观察来测定染色体的部分消化。观察到染色体DNA的大小随时间的延长而变小，这表明染色体DNA的变小是由于Sau 3A作用。用标准程序方法从剩余样品中抽提DNA(Sambrook等，上文)。

肺炎克雷伯氏菌的部分消化DNA粘粒文库用Supercos粘粒载体试剂盒和GigapackII包装抽提物制备，所用的试剂购自Stratagene(La Jolla，CA)。操作按厂家提供的说明进行。包装后的肺炎克雷伯氏菌用转染大肠杆菌XL1-Blue MR来测定，含有4×10⁴至1.0×10⁵的噬菌体滴度。

从6个大肠杆菌转化子中分离到了粘粒DNA，并发现它们含有大的DNA插入片断(25至30kb)。

                        实施例1

用粘粒DNA克隆和转化大肠杆菌宿主细胞来表达1，3-丙二醇培养基

合成培养基S12用来筛选能产生1，3-丙二醇的细菌转化子。S12培养基含有：10mM硫酸铵、50mM磷酸钾缓冲液，pH7.0、2mMMgCl₂、0.7mM CaCl₂、50uM MnCl₂、1uM FeCl₃、1uM ZnCl₂、1.7uM CuSO₄、2.5uM CoCl₂、2.4uM Na₂MoO₄和2uM盐酸硫胺素。

培养基A用于生长和发酵，它包含：10mM硫酸铵、50mMMOPS/KOH缓冲液，pH7.5、5mM磷酸钾缓冲液，pH7.5、2mMMgCl₂、0.7mM CaCl₂、50uM MnCl₂、1uM FeCl₃、1uM ZnCl₂、1.72uM CuSO₄、2.53uM CoCl₂、2.4uM Na₂MoO₄、2uM盐酸硫胺素、0.01％酵母抽提物、0.01％酪蛋白氨基酸、0.8ug/mL维生素B₁₂和50amp。根据需要，培养基A可补加0.2％的甘油或0.2％的甘油加0.2％的D-葡萄糖。

细胞

肺炎克雷伯氏菌ECL2106(Ruch等，《细菌学杂志》124卷，348页(1975))在文献中也被称为产气克雷伯氏菌或产气气杆菌。该菌获自E.C.C.Lin(Harvard Medical School，Cambridge，MA)，并作为实验室培养物保藏。

肺炎克雷伯氏菌ATCC25955购自美国典型培养物保藏中心(Rockville MD)。

大肠杆菌DH5α购自Gibco/BRL，并用分离自肺炎克雷伯氏菌ATCC25955、含有编码甘油或二醇脱水酶的基因的粘粒DNA进行了转化。含有甘油脱水酶的粘粒被确定为pKP1和pKP2，含有二醇脱水酶的粘粒被确定为pKP4。转化后的DH5α细胞被确定为DH5α-pKP1、DH5α-pKP2和DH5α-pKP4。

大肠杆菌ECL707(Sprenger等，《普通微生物学杂志》135卷，1255页(1989))获自E.C.C.Lin(Harvard Medical School，Cambridge，MA)，并转化有相同的来自肺炎克雷伯氏菌的粘粒DNA。含有甘油脱水酶基因的转化子被确定为ECL707-pKP1和ELC707-pKP2，含有二醇脱水酶基因的转化子被确定为ECL707-pKP4。

大肠杆菌AA200(Anderson等，《普通微生物学杂志》62卷，329页(1970))购自Genetic Stock Center，Yale Umversity(New Haven，CT)，这个菌株在tpi基因上有一个突变。用克雷伯氏菌粘粒DNA转化该菌株得到含有甘油脱水酶基因的AA200-pKP1和AA200-pKP2重组有机体，和含二醇脱水酶基因的AA200-pKP4重组有机体。

DH5α

用肺炎克雷伯氏菌DNA转染大肠杆菌XL1-Blue MR，选取约含1000个菌落的六个转化平板，用5mL LB培养基洗涤平板并离心。收集菌体并重新悬浮在5mL LB培养基+甘油中。取一份(50uL)接种到装有S12合成培养基并含有0.2％甘油+400ng/毫升的维生素B₁₂+0.001％酵母抽提物+50amp的15mL试管中。试管中装满培养基直至顶部，用封口膜封好并在30℃保温。48小时后观察到轻微的浑浊。按上面所述方法分别在78小时和132小时取一份培养物来分析产物的分布。各份培养物均为1，3-丙二醇阳性，时间点越后，产生的1，3-丙二醇越多。

将检测为1，3-丙二醇生成阳性的细菌系列稀释后涂布到LB-50amp平板上来分离单个的菌落。共分离到48个单菌落并再次检测它们能否产生1，3-丙二醇。从6个独立克隆中分离粘粒DNA并将其转化到大肠杆菌DH5α中。再次检测转化子能否产生1，3-丙二醇。对两个转化子做了进一步的分析，并将它们命名为DH5α-pKP1和DH5α-pKP2。

将pKP1中一段12.1kb的EcoRI-SalI片断亚克隆到pIBI31(IBIBiosystem，New Haven，CN)中，对这段序列做序列分析并将其命名为pHK28-26(SEQ ID NO：1)。测序结果揭示了编码甘油脱水酶的dhaT操纵子的相关开放阅读框和必需调节基因的位置，参见SEQ ID NO：1，在碱基1-399上发现了一个编码二羟基丙酮激酶的开放阅读框dhaK；在碱基983-2107上发现了编码甘油脱氢酶的开放阅读框dhaD；在碱基2209-4134上发现了编码抑制子的开放阅读框dhaR；在碱基5017-6180上发现了编码1，3-丙二醇氧化还原酶的开放阅读框dhaT；在碱基7044-8711上发现了编码甘油脱水酶α亚单位的开放阅读框dhaB1；在碱基8724-9308上发现了编码甘油脱水酶β亚单位的开放阅读框dhaB2；在碱基9311-9736上发现了编码甘油脱水酶γ亚单位的开放阅读框dhaB3；并在碱基9749-11572上发现了编码未知功能蛋白的开放阅读框dhaBX。

用来自肺炎克雷伯氏菌的包装好的粘粒转染大肠杆菌XL1-BlueMR，挑取单个菌落接种到含有200uL S15培养基(硫酸铵，10mM、磷酸钾缓冲液，pH7.0，1mM、MOPS/KOH，pH7.0、50mM、MgCl₂，2mM、CaCl₂，0.7mM、MnCl₂，50uM、FeCl₃，1uM、ZnCl₂，1uM、CuSO₄，1.72uM、CoCl₂，2.53uM、Na₂MoO₄，2.42uM和盐酸硫胺素，2uM)+0.2％甘油+400ng/mL维生素B₁₂+0.001％酵母抽提物+50ug/mL氨苄青霉素的微滴定孔中。除了接种微滴定孔外，还接种一个含LB-50amp的主平板，96小时后，取出100uL，在一个含0.2微米尼龙纤维膜的Rainin微离心管中离心，细菌留在膜上，将膜处理后做HLPC分析。在筛选了240个克隆后，鉴定到了证明能产生1，3-丙二醇的阳性克隆。共鉴定到了三个阳性克隆，其中两个能在LB-50amp上生长，另一个不能。从两个能在LB-50amp上生长的阳性克隆的一个中分离了一个单菌落，并证实这个菌落能产生1，3-丙二醇。这个菌落被命名为pKP4。从含有pKP4的大肠杆菌菌株中分离粘粒DNA，并用它来转化大肠杆菌DH5α，将一个独立的转化子命名为，DH5α-pKP4。这个转化子证实能产生1，3-丙二醇。

ECL707

用对应于pKP1、pKP2、pKP4的肺炎克雷伯氏菌DNA粘粒和Supercos空载体转化大肠杆菌ECL707菌株，所获得的转化子分别命名为ECL707-pKP1、ECL707-pKP2、ECL707-pKP4和ECL707-pKP-sc。ECL707含有缺陷的glpK、gld和ptsD，这三个基因分别编码ATP依赖的甘油激酶、NAD⁺相连的甘油脱氢酶和磷酸烯醇式丙酮酸依赖的磷酸转移酶系统的催化磷酸二羟基丙酮的酶II。

在LB-50amp平板上，从每次粘粒转化中分离20个单菌落，并从Supercos空载体(阴性对照)转化中分离5个单菌落，将它们转入一个LB-50amp主平板。同样检测这些菌落将甘油转化为1，3-丙二醇的能力，从而确定它们是否含有脱水酶活性。用无菌牙签将这些转化子转入微滴定板。微滴定板中含有200uL的培养基A，并补加有0.2％甘油或0.2％甘油+0.2％D-葡萄糖，再30℃保温48小时后，将微滴定板小孔中的内容物滤过一个0.45u的尼龙滤器，然后用HLPC进行层析。这些检测的结果在表1中给出。

                           表1

转化的ECL707将甘油转化为1，3-丙二醇：阳性菌落的数目/检测菌落 的数目

转化子             甘油        甘油+葡萄糖

ECL707-pKP1        19/20          19/20

ECL707-pKP2        18/20          20/20

ECL707-pKP4        0/20           20/20

ECL707-sc          0/5            0/5

AA200：

用对应于pKP1、pKP2、pKP4的肺炎克雷伯氏菌DNA粘粒和Supercos空载体转化大肠杆菌AA200菌株，所获得的转化子分别命名为AA200-pKP1、AA200-pKP2、AA200-pKP4和AA200-pKP-sc。菌株AA200在磷酸丙糖异构酶上有缺陷，(tpi^-)。

按在大肠杆菌ECL707中介绍的方法，从每次粘粒转化中分离20个单菌落，并从Supercos空载体转化中分离5个单菌落，检测这些菌落将甘油转化为1，3-丙二醇的能力，这些检测的结果见表2。

                       表2

转化的AA200将甘油转化为1，3-丙二醇：阳性菌落的数目/检测菌落 的数目

转化子               甘油          甘油+葡萄糖

AA200-pKP1           17/20            17/20

AA200-pKP2           17/20            17/20

AA200-pKP4           2/20             16/20

AA200-sc             0/5              0/5

                      实施例2

转化有含脱水酶活性的肺炎克雷伯氏菌DNA的大肠杆菌AA200菌株将D-葡萄糖转化为1，3-丙二醇

从含有肺炎克雷伯氏菌dha调节子粘粒pKP1或pKP2、肺炎克雷伯氏菌pdu操纵子粘粒pKP4或Supercos空载体的大肠杆菌菌株AA200中挑取单菌落，接种到装满培养基(约14mL实施例1中介绍的培养基A，并补加有10ug/mL的卡那霉素和0.2％的D-葡萄糖，加上或减去0.5-1.0mM的环腺苷酸-2′:3′单磷酸(cAMP))的玻璃血清瓶中。为避免与甘油接触，接种可用一个LB-50amp琼脂)平板或用相同培养基制备的液体培养物来进行。整个反应可在30℃保温约72小时并250rpm振荡。细菌的生长用600nM处的光吸收值的变化来测定，起始OD₆₀₀为0.020AU。葡萄糖减少和产物分布的量用HLPC来测定。单菌落用编号的后缀“-x”来表示。例如，AA200-pKP1-x。积累的结果见表3和表4。

                    表3

转化的大肠杆菌AA200菌株将0.2％的D-葡萄糖转化为1，3-丙二醇：无cAMP

转化子           OD₆₀₀  1，3-丙二醇(mM) 转化率(％) 选择性(％)

AA200-pKP1-3     0.056        0.05          17          1

AA200-pKP1-5     0.115        nd            0

     ..          0.007        nd            0

     ..          0.076        0.2           14          5

AA200-pKP1-20    0.116        nd            27          0

     ..         0.205      0.3      17      8

AA200-pKP2-10   0.098      0.2      13      7

AA200-pKP2-14   0.117      0.5      17      14

     ..         0.129      0.2      19      5

AA200-pKP2-20   0.094      nd       11      0

AA200-pKP4-4    0.198      0.1      28      2

AA200-pKP4-19   0.197      0.2      34      3

AA200-pKP4-20   0.206      0.1      38      1

AA200-sc-1      0.097      nd       22      0

     ..         0.176      nd       46      0

                          表4

转化的大肠杆菌AA200菌株将0.2％的D-葡萄糖转化为1，3-丙二醇：有cAMP

转化子          OD₆₀₀ 1，3-丙二醇(mM) 转化率(％) 选择性(％)

AA200-pKP1-3    0.102      0.5            19          12

AA200-pKP1-5    0.088      1.5            21          37

     ..         0.236      1.4            24          28

     ..         0.071      0.8            15          23

AA200-pKP1-20   0.153      nd             40          0

     ..         0.185      0.9            27          16

AA200-pKP2-10   0.098      0.2            13          7

AA200-pKP2-14   0.213      2.0            26          27

     ..         0.155      0.6            25          12

AA200-pKP2-20   0.198      1.2            40          14

AA200-pKP4-4    0.218      0.1            31          2

AA200-pKP4-19   0.223      0.2            37          3

AA200-pKP4-20   0.221      0.2            35          3

AA200-sc-1      0.111      nd             23          0

     ..         0.199      nd             49          0

     ..         0.122      nd             25          0

^a1，3-丙二醇的鉴定用通用方法中介绍的GC/MS方法证实。

                    实施例3

转化有含脱水酶活性的肺炎克雷伯氏菌DNA的大肠杆菌DH5α菌株将D-葡萄糖转化为1，3-丙二醇

按实施例2的方法，检测含肺炎克雷伯氏菌dha调节子粘粒pKP1或pKP2的大肠杆菌DH5α菌株将D-葡萄糖转化为1，3-丙二醇的能力。结果列于表5。

                          表5

转化的大肠杆菌菌株DH5α将0.2％的D-葡萄糖转化为1，3-丙二醇加上(+)和减去(-)cAMP

  转化子       OD₆₀₀ 1，3-丙二醇(mM) 转化率(％) 选择性(％)

DH5α-pKP1(-)  0.630      0.5          100        2

DH5α-pKP1(+)  0.774      0.6          100        3

DH5α-pKP2(-)  0.584      0.6          100        3

DH5α-pKP2(+)  0.699      0.7          100        3

                        实施例4

转化有含脱水酶活性的肺炎克雷伯氏菌DNA的大肠杆菌ECL707菌株将D-葡萄糖转化为1，3-丙二醇

按实施例2的方法，检测含肺炎克雷伯氏菌dha调节子粘粒pKP1或pPK2、肺炎克雷伯氏菌pdu操纵子粘粒pKP4或Supercos空载体的大肠杆菌ECL707菌株将D-葡萄糖转化为1，3-丙二醇的能力。在每次实验中，对转化进行定量。结果列于表6。

                         表6

转化的大肠杆菌菌株ECL707将D-葡萄糖转化为1，3-丙二醇有和没有cAMP

转化子          OD₆₀₀ 1，3-丙二醇(mM) OD₆₀₀  1，3-丙二醇(mM)

                       (没有cAMP)              (有cAMP)

ECL707-pKP1-1   0.607      0.1        0.475      0.1

ECL707-pKP1-3   0.619      0.1        0.422      0.1

ECL707-pKP1-7   0.582      0.2        0.522      0.2

ECL707-pKP1-10  0.593      0.1        0.408      0.1

ECL707-pKP1-18  0.584      0.1        0.433      0.1

ECL707-pKP2-4     0.588      0.1    0.408      0.1

ECL707-pKP2-5     0.630      0.1    0.516      0.2

ECL707-pKP2-8     0.542      0.1    0.486      0.1

ECL707-pKP2-15    0.589      0.1    0.485      0.1

ECL707-pKP2-19    0.577      0.1    0.504      0.1

ECL707-pKP4-8     0.499      nd     0.361      ＜0.1

ECL707-pKP4-9     0.544      nd     0.354      nd

ECL707-pKP4-10    0.515      nd     0.265      ＜0.1

ECL707-pKP4-14    0.512      nd     0.318      ＜0.1

ECL707-pKP4-17    0.545      nd     0.388      ＜0.1

ECL707-sc-1       0.592      nd     0.385      nd

                          实施例5

大肠杆菌菌株AA200-pKP1-5经过两个阶段将D-葡萄糖转化为1，3-丙二醇

将AA200-pkp1-5的单菌落接种在含50mL LB-amp培养基的Baffled瓶(250ml)中，细胞在30℃或37℃振荡(250rmp)生长增殖过夜。

将生长好的培养物离心(10分钟，10,000rpm，4℃)，并重新悬浮于不含葡萄糖的生产培养基中(10mM硫酸铵、5mM磷酸钾缓冲液，pH7.5、50mM MOPS缓冲液，pH7.5、0.01％酵母抽提物、0.01％酪蛋白氨基酸、0.8ug/mL维生素B₁₂和50ug/mL氨苄青霉素)。培养基中含有痕量的金属A：(0.08uM CoCl₂、0.06uM CuCl₂、7uM FeSO₄、2uM H₃BO₄、0.2uM MnCl₂、0.1uM Na₂MoO₄、0.08uM NiCl₂、0.3uMZnSO₄和0.03mM硫胺素)，或含有痕量的金属B(0.7mM CaCl₂、2.53uMCoCl₂、1.72uM CuSO₄、1.0uM FeCl₃、2mM MgCl₂、0.05mMMnCl₂、2.42uM Na₂MoO₄、1.0uM ZnCl₂和0.03mM硫胺素)。再次将细胞离心，并重新悬浮于50mL含D-葡萄糖的新鲜生产培养基中，将重新悬浮的细胞装入一个60mL用异丁烯橡胶隔膜封口的血清瓶中。将血清瓶振荡(250rpm)，并用一个注射器穿过隔膜取样，取出的样品在分析前用0.2u的滤膜过滤。结果见表7和表8。残留的葡萄糖用酶促分析(Biochemistry Analyzer，Yellow Srings Instruments Co.Inc)进行测定，1，3-丙二醇用HLPC分析。

                        表7

大肠杆菌AA200-pKP1-5将0.2％的D-葡萄糖转化为1，3-丙二醇先进行增殖反应^a

实验  时间(天) 葡萄糖(mM) 1，3-丙二醇(mM) 转化率(％) 选择性(％)

  #1     1        0.1          2.3           99        10

  #1     4        0.1          2.3           99        10

  #2     1        2.8          2.3           75        14

  #2     4        0.1          2.4           99        11

a：含有痕量金属A的反应物在37℃进行接种。

                       表8

大肠杆菌AA200-pKP1-5^a将1％的D-葡萄糖转化为1，3-丙二醇

时间(天)  葡萄糖(mM)  1，3-丙二醇(mM)  转化率(％)  选择性(％)

  0          53            0               0           0

  1          39            5.6             26          20

  2          35            8.3             34          23

  3          33            8.4             38          21^b

a：含有痕量金属B的反应物在30℃进行接种。

b：在反应结束时，1，3-丙二醇的存在用GC/MS和¹³C-NMR(300MHz)来证实。

                        实施例6

肺炎克雷伯氏菌ECL2106将D-葡萄糖转化为1，3-甘油醇但肺炎克雷伯氏菌ATCC25955不能转化

从一个含有肺炎克雷伯氏菌ECL2106或ATCC25955的LB琼脂平板中挑取细菌，小心接种到装满培养基(约14mL)的血清瓶中。培养基中含有50mM葡萄糖、3mM(NH₄)₂SO₄、0.9mM CaCl₂、4uM CoCl₂、0.06uM CuCl₂、7uM FeSO₄、2uM H₃BO₄、0.8mM MgSO₄、0.2uMMnCl₂、0.1uM Na₂MoO₄、0.08uM NiCl₂、0.3uM ZnSO₄、0.1mg/mLDL-半胱氨酸、10uM乙二胺四乙酸、0.8ug/mL维生素B₁₂、表9中标明的磷酸钾，以及50mM的HEPES或者MOPS缓冲液，PH7.5。反应物在30℃振荡(250rpm)47小时。或者反应按实施例2介绍的方法进行。结果在表9中给出。

                          表9

肺炎克雷伯氏菌ECL2106将D-葡萄糖转化为1，3甘油醇但肺炎克雷伯氏菌ATCC25955不能转化

菌株   缓冲液    Pi(mM)  葡萄糖(mM)  1，3-丙二醇(mM)

2106    MOPS      5.0      11.4          0.2

2106    MOPS      2.5      13.9          0.2

2106    MOPS      1.3      14.8          0.1

2106    MOPS      0.6      15.8          0.1

2106    HEPES     5.0      21.1          0.1

2106    HEPES     2.5      23.4          0.1

2106    HEPES     1.3      26.4          0.1

2106    HEPES     0.6      27.5          0.1

25955   MOPS      5.0      4.4           nd

25955   MOPS      2.5      5.4           nd

25955   MOPS      1.3      2.8           nd

25955   MOPS      0.6      7.8           nd

25955   HEPES     5.0      7.0           nd

25955   HEPES     2.5      13.5          nd

25955   HEPES     1.3      10.2          nd

25955   HEPES     0.6      17.8          nd

                    实施例7

             用重组巴斯德毕赤酵母生产1，3-丙二醇

通用表达质粒的构建

用来自pAO815(Invitrogen，San Diego，CA)的0.9kbEcoRI/XbalI片断取代pHIL-D4(Phillips，Petroleum，Bartlesville，OK)中的0.9kb EcoRI/XbalI片断，产生了含有下列元件的质粒pHIL-D4B2：5′AOX1，为巴斯德毕赤酵母的甲醇诱导型乙醇氧化酶I(AOX1)启动子；AOX1 term，为巴斯德毕赤酵母AOX1的转录终止区域；HIS4，为用于在his4宿主中进行筛选的巴斯德毕赤酵母组氨醇脱氢酶编码基因；Ran，是从转座子Tn903中获得的序列，它编码氨基糖苷-3′-磷酸转移酶，从而可在多种宿主中提供卡那霉素、新霉素和G418抗性，并可用作盒拷贝数目的指示；3′AOX1，为巴斯德毕赤酵母中AOX1的下游序列，与5′AOX1一起用于定点的载体整合；ori，为pBR322的DNA复制起点，使质粒能在大肠杆菌中操作；和amp，为来自pBR322的β-内酰胺酶基因，提供青霉素抗性。pHIL-D4B2的另一个特征是用将Bgl2/Xba1片段上的盒亚克隆到BamHI/Xba1位点的方法，能很容易地将多个表达盒(5′AOX1-基因-AOX1 term)放置在一个质粒上。

dhaB1和dhaB2共表达质粒的构建

使用5′端含有EcoRI位点的引物(dhaB1和dhaB2的引物分别为SEQID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5)，用PCR的方法从粘粒pKP1中扩增dhaB1和dhaB2的开放阅读框(10mM Tris pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，0.0001％明胶，200uM dATP，200uMdCTP，200uM dGTP，200uM dTTP，1uM每种引物，1-10ng靶DNA，25单位/mL Amplitaq^®DNA聚合酶Perkin Elmer Cetus，Norwalk CT)。PCR的参数为94℃，1分钟、55℃，1分钟、72℃，1分钟，共进行35个循环。将PCR产物亚克隆到pHIL-D4B2的EcoRI位点中，从而产生分别含有dhaB1和dhaB2的表达质粒pMP19和pMP20。

将pMP19的Bgl2/Xba1片断上的dhaB1表达盒亚克隆到pMP20的BamHI/Xba1位点上，从而产生pMP21。质粒pMP21含有dhaB2和dhaB1两者的表达盒，并含有HIS4选择标记。

dhaB3和dhaT共表达质粒的构建

使用5′端含有EcoRI位点的引物(dhaT和dhaB3的引物分别为SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9)，用PCR的方法从粘粒pKP1中扩增dhaT和dhaB3的开放阅读框。将PCR产物亚克隆到pHIL-D4B2的EcoRI位点中，从而产生分别含有dhaT和dhaB3的表达质粒pMP17和pMP18。

将pMP17的Bgl2/Xba1片断上的dhaT表达盒亚克隆到pMP18的BamHI/Xba1位点上，从而产生pMP22。质粒pMP22含有dhaT和dhaB3两者的表达盒。

从pRK20(Phillips Petroleum，Bartlesville，OK)中删除4.1kb的含有SUC2的EcoRI片断，产生pMP2。SUC2编码一个蔗糖酶，这个基因在毕赤酵母中可用作二级选择标记。从pMP2中删除4.0kb的含有lacZ的Hind3片断，产生pMP3。将pHIL-D4B2中含AOX1 term的0.4kb Hind3片断亚克隆到pMP3的Hind3位点中，产生pMP10。

用来自pMP22的含有dhaB3和dhaT表达盒的5.0kbBgl2/Xba1片断取代pMP10中的2.0kb的Bgl2/Xba1片断，产生pMP23。将来自pRK20含SUC2的5.4kb的Pst1/Bgl2片断亚克隆到pSP73(Progema，Madison，WI)的Pst1/Bgl2位点中，产生pMP11a。用EcoRI切割质粒pMP11a，然后用T4 DNA聚合酶补齐并重新连接，产生pMP11b。用来自pMP11b的含有SUC2的5.4kb Bgl2/Pst1片断取代pMP10中的1.1kb的Pst/Bgl2片断，产生pMP12。

用来自pMP12含SUC2的5.2kb Sca1/Bg12片断取代pMP23的1.0kbSca1/Bgl2片断，产生pMP24质粒pMP24含dhaT和dhaB3两者的表达盒和SUC2选择标记。

用dhaB1/dhaB2表达质粒pMP21转化巴斯德毕赤酵母

使用Gregg等介绍的原生质体转化法(《分子细胞生物学》第5卷，3376页，(1985))，用1-2ug Bgl线性化的质粒pMP21转化巴斯德毕赤酵母菌株GTS115(his4)(Phillips Petroleum，Bartlesville，OK)。细胞在不含组氨酸的平板上30℃再生3-4天。质粒整合到染色体上后，转化子开始生长。将转化子收集到一个YPD(1％Bacto酵母抽提物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)主平板上。

筛选含有dhaB1和dhaB2的巴斯德毕赤酵母转化子

从上面介绍的his⁺转化子中制备染色体DNA，并用dhaB1和dhaB2特异的引物进行PCR分析。使转化子在补加有G418(Sigma，St.Louis，MO)的YPD培养基中生长，培养基中补加的G418的水平不断提高直至2000ug/mL。用这种方法可从含有dhaB1和dhaB2两者的转化子中选择高拷贝数的菌株。能够抵抗高水平的G418表明表达盒的明显增加。

用dhaB3/dhaT表达质粒pMP24第二次转化巴斯德毕赤酵母

采用原生质体转化法，用质粒pMP24再次转化上面介绍的对高水平G418有抗性的转化子。转化后的细胞首先在非选择平板上30℃培养2天进行再生，从平板上刮取含再生细胞的上层琼脂，在20mL水中涡旋混匀。使细胞通过四层薄棉布后，离心沉淀细胞，并重新悬浮于10mL水中。将悬液分成200uL的小份，涂布到蔗糖平板上，30℃温育2天。质粒整合到染色体上后，所有的转化子开始生长。转化子表现为小菌落背景上的大菌落，分离转化子。将转化子在Msu培养基(每升，13.4克有/无氨基酸的酵母氮源，10克蔗糖，0.4克生物素)中30℃振荡培养24小时。然后在Msu平板(Msu培养基加15g/mL的琼脂)划线并30℃培养2天。将分离的大菌落点种到一个YPD主平板上。

筛选含有dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT以及它们对应的酶活性的巴斯德毕赤酵母双重转化子

从上面介绍的suc⁺双重转化子中制备染色体DNA，用dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT特异的引物对染色体做PCR分析。从而证明所有四个开放阅读框的存在。

使用体外酶试验来证明活性的甘油脱水酶(dhaB)和1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)的存在。另外，用Western印迹可以证实所有开放阅读框表达的蛋白。用来分析上述蛋白的无细胞抽提物按下面的方法进行制备。含有dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT的双重转化子在MGY(每升，13.4克有/无氨基酸的酵母氮源，0.4毫克生物素，10毫升甘油)中30℃通气振荡培养2天。离心沉淀细胞，重新悬浮在MM(每升，13.4克有/无氨基酸的酵母氮源，0.4克生物素，5毫升甲醇)中，按上面的方法温育，约24小时后，收集细胞，重新悬浮在缓冲液(0.1M tricene/KOH缓冲液，pH8.2，50mM KCl，2％1，2-丙二醇)中，机械破碎(使用玻棒，在存在玻璃珠的情况下涡旋)，然后离心。

有一菌株对dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT以及它们对应的酶活性的存在都显示出阳性，将这株菌命名为MSP42.81，并用于进一步的研究。

用重组的巴斯德毕赤酵母体内生产1，3-丙二醇

在一个装有1.5L基本培养基的BiostatB发酵罐中(B Braun Biotech，Inc.)培养巴斯德毕赤酵母MSP42.81(ATCC74363)，基本培养基含有8.5g/L KH₂PO₄、2.1g/L(NH₄)₂SO₄、10g/L甘油、2.3g/L MgSO₄7H₂O、0.18g/L CaSO₄2H₂O和0.29mL/L PTMI。PTMI是矿物质溶液的储存液，它包含24mM CuSO₄、4.8mM KI、18mM MnSO₄、0.8mMNa₂MoO₄、0.3mM H₃BO₃、2.1mM CoCl₂、7OmM ZnSO₄、26mMH₂SO₄、234mM FeSO₄和0.8mM生物素。发酵罐的pH值用加入2MNH₄OH的方法控制在pH5.0，温度控制在30℃，溶解氧分压用通气控制的方法控制在30％。使用在YM肉汤中培养的巴斯德毕赤酵母MSP42.81作种子培养物。发酵罐中接种20mL种子培养物。

当甘油被消耗后(接种后约24小时)，加入甲醇原料来诱导AOX启动子。甲醇原料中含有1升甲醇、5mL PTMI和5mL用水制备的浓度为0.2g/L生物素储存液。甲醇用手工方式加入并使其平均浓度为0.5％，甲醇的浓度用HPLC分析来测定。诱导15小时后，从反应器中取出50mL的细胞(OD₆₀₀＝20AU)。

将50mL细胞悬液沉淀，重新悬浮于12.5mL充有氮气的基础培养基(6.7g/L酵母氮源，3.0g/L酵母抽提物，1.0g/L K₂HPO₄，1.0g/L KH₂PO₄，3.0g/L(NH₄)₂SO₄，滴定至pH7.2，过滤除菌)。在细胞悬液中加入辅酶B₁₂至终浓度为20ug/mL。辅酶B₁₂事先在充有氮气的水中制备成2mg/mL的储存液。用基本培养基制备三种培养基储存液，它们分别含有1％的葡萄糖、0.5％的葡萄糖和0.5％甘油(w/v)、和1％甘油(w/v)，同时还制备氯喹储存液(1.06g/50mL，pH7.2)。

在10mL绉纹(crimp)密封的血清瓶中装入2mL培养基储存液和1mL氯喹与水的混合物，使其终浓度为表10中列出的浓度，并且在加入1mL的细胞和辅酶B₁₂混合物前充入氮气。将血清瓶在30℃振荡温育，用HPLC分析加入细胞后立即取出的样品和温育24小时后取出的样品。结果见表10。

                    表10

        用重组巴斯德毕赤酵母体内生产1，3-丙二醇

反应     培养基^a       氯喹(mM)  1，3-丙二醇(mM)

1        葡萄糖^b          0         0.04

2        葡萄糖            2.5       0.2

3        葡萄糖            5         0.1

4        葡萄糖            10        0.1

5        葡萄糖^b/甘油     0         0.2

6        葡萄糖/甘油       2.5       0.4

7        葡萄糖/甘油       5.0       0.4

8        葡萄糖/甘油       10.0      1.2^c

9        甘油              0         0.2

10       甘油              2.5       0.3

11       甘油              5.0       0.3

12       甘油              10        1.4^c

^a除非指明，24小时内各底物的利用率均低于10％。

^b24小时后没有葡萄糖残留。

^c1，3-丙二醇的存在用通用方法中介绍的GC/MS来证实。

                      实施例8

用巴斯德毕赤酵母双重转化子由D-葡萄糖生产1，3-丙二醇

在一个装有1.5L基本培养基的BiostatB发酵罐中(B Braun Biotech，Inc.)培养巴斯德毕赤酵母MSP42.81，基本培养基含有8.5g/L KH₂PO₄、2.1g/L(NH₄)₂SO₄、10g/L葡萄糖、2.3g/L MgSO₄7H₂O、0.18g/LCaSO₄2H₂O和0.29mL/L PTMI。或者，发酵和诱导条件与实施例7中介绍的相同。诱导15小时后，从发酵罐中取出50mL细胞。

细胞悬液按实施例7中介绍的方法进行处理，不同之处在于使用一个调整的基本培养基(6.7g/L酵母氮源，1.0g/L K₂HPO₄，1.0g/L KH₂PO₄，3.0g/L(NH₄)₂SO₄，滴定至pH7.2，过滤除菌)。三种培养基储存液也用这种调整的基本培养基制备。其它的溶液都相同。按已介绍的方法制备反应混合物，30℃振荡温育。用HPLC对加入细胞后立即取出的样品和接种75小时后取出的样品进行分析。在含有葡萄糖作为碳源和5mM氯喹的反应中，产生了0.17mM的1，3-丙二醇。

                   实施例9

构建用于在啤酒酵母中转化和表达dhaB和dhaT的质粒

通用表达质粒的构建

构建了两种类型的表达质粒，一种是能通过重组整合到染色体中的质粒，另一种是以游离复制元件形式存在的质粒。每种类型的通用质粒都含有一个酵母启动子。酵母启动子和酵母转录终止子为含有一个或多个限制性内切酶识别位点的DNA片断分隔，每种类型的通用表达载体还含有：β-内酰胺酶的编码基因，用于在含有氨苄青霉素的平板上对大肠杆菌进行筛选；一个复制起始区域，使质粒在大肠杆菌中维持；以及一个2微米的游离元件复制起始区域或者与在啤酒酵母染色体中发现的介导DNA重组或整合到染色体中的序列同源的序列。在酵母中使用并存在于表达质粒的营养选择标记为下列中的一个：编码咪唑甘油磷酸酯脱水酶的HIS3基因、编码乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶的URA3基因、编码N-(5′-磷酸核糖)邻氨基苯甲酸异构酶的TRP1基因和编码β-异丙基苹果酸脱氢酶的LEU2基因。所用的酵母启动子为ADH1或GAL1，转录终止子为ADH1、CYC1或AOX1，后者来自巴斯德毕赤酵母。

质粒pGADGH(Clontech，Palo Alto，CA)用HindIII消化，然后与HindIII-XmnI和EcoRI-XmnI接头(New England Biolabs，Beverly，MA)连接，使单链末端转变为EcoRI末端。含有正确EcoRI末端的质粒按如下方法进行选择：将上述处理的质粒与质粒pUC4K(Pharmacia Biotech，Uppsala)的含卡那霉素抗性基因的EcoRI片断连接，然后转化大肠杆菌DH5α，并在含有25mg/mL卡那霉素的平板上进行筛选。得到的质粒(pGAD/KAN2)用SnaBI和EcoRI消化，分离出带有ADH1启动子的1.8kb片断。质粒pGBT9(Clontech，Palo Alto，CA)用SnaBI和EcoRI消化，用从SnaBI和EcoRI消化的pGAD/KAN2中分离的1.8kb ADH1启动子片断取代其中的1.5kb ADH1/GAL4片断。得到的载体(pMCK11)为带有一个ADH1启动子和终止子以及一个TRP1标记的复制型酵母质粒。

质粒pGADGH用SnaBI和HindIII消化，并分离含有ADH1启动子的1.8kb片断。将此片断与事先用SmaI和HindIII消化的载体pRS405(Stratagene，La Jolla，CA)连接。用质粒编码的LacZα肽的插入失活和ADH1启动子的存在来挑选阳性克隆。得到的质粒(pMCK4)含有一个ADH1启动子和一个LEU2标记。

将pGBT9的含有ADH1终止子的大约0.2kb NaeI-EcoRI片断与用EcoRI-HindIII消化的pRS403(Stratagene，La Jolla，CA)连接，产生约48kb的质粒pRVN5。将pGAD/KAN2中含有ADH1启动子的约2.0kb的SnaBI-EcoRI片断与用SmalI-EcoRI消化的pRVN5连接，产生约6.8kb的质粒pRVN6。质粒pRVN6带有ADH1启动子和终止子以及它们之间的一个单一EcoRI克隆位点。

pGADGH的0.4kb的HindIII片断含有一个额外的XmnI位点。将这一片断删除，载体重新连接产生7.0kb的载体pGAD-D3。载体pGAD-D3用XmnI消化，纯化含有ADH1启动子和终止子以及它们之间的一个HindIII克隆位点的约2.4kb片断。pRS404(Stratagene，La Jolla，CA)用PVuII消化，纯化3.8kb的含有TRP1的较大片断，将其与pGAD-D3的XmnI启动子和终止子片断连接，产生质粒pRVN11。

使用5′端含有EcoRI位点的引物(dhaT、dhaB3和dhaB1的引物分别为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO 9、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)，用PCR的方法从质粒pHK28-26(SEQID No：1)中扩增dhaT、dhaB3和dhaB1的开放阅读框(10mM Tris pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，0.0001％明胶，200uL dATP，200uMdCTP，200uM dGTP，200uM dTTP，1uM每种引物，1-10ng靶DNA，25单位/mL Amplitaq^®DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，Norwalk CT))。PCR的参数为94℃，1分钟、55℃，1分钟、72℃，1分钟，共进行35个循环。将PCR产物亚克隆到pHIL-D4(Phillips Petroleum，Bartlesville，OK)的EcoRI位点中，从而产生分别含有dhaT、dhaB3和dhaB1的质粒pMP13、pMP14和pMP15。

dhaT表达质粒的构建

复制型质粒pGAD/KAN2用EcoRI消化，去除卡那霉素抗性片断，去磷酸化后与pMP13的dhaT EcoRI片断连接，得到的质粒(pMCK13)含有从ADH1启动子可正确转录的dhaT，并含有一个LEU2标记。

质粒pRNV6用EcoRI消化，并与pMP13的dhaT EcoRI片断连接，得到的质粒(pRVN6T)含有从ADH1启动子可正确转录的dhaT，并含有一个HIS3标记。

dhaB1表达质粒的构建

复制型质粒pGADGH用HindIII消化，去磷酸化后与pMP15的dhaB1HindIII片断连接，得到的质粒(pMCK10)含有从ADH1启动子可正确转录的dhab1，并含有一个LEU2标记。

dhaB2表达质粒的构建

复制型质粒pMCK11用EcoRI消化，去磷酸化后与pMP20的dhaB2EcoRI片断连接，得到的质粒(pMCK17)含有从ADH1启动子可正确转录的dhaB2，并含有一个TRP1标记。

质粒pRS403用SmaI消化，并与pCMK17的SnaBI/NaeI dhaB2片断连接，得到的质粒(pMCK21)含有从ADH1启动子可正确转录的dhaB2，并含有一个HIS3标记。

dhaB3表达质粒的构建

复制型质粒pYES2(Invitrogen，San Diego，CA)用EcoRI消化，去磷酸化后与pMP14的dhaB3 EcoRI片断连接，得到的质粒(pMCK1)含有从GAL1启动子可正确转录的dhaB3，并含有一个URA3标记。

复制型质粒pGAD/KAN2用EcoRI消化，去磷酸化后与pMP14的dhaB3 EcoRI片断连接，得到的质粒(pMCK15)含有从ADH1启动子可正确转录的dhaB3，并含有一个LEU2标记。

质粒pRS404用Pst和HincII消化，并与pCMK15的PstI/EcoRV dhaB3片断连接，得到的质粒(pMCK20)含有从ADH1启动子可正确转录的dhaB3，并含有一个TRP1标记。

用dhaT表达质粒转化啤酒酵母

应用Stratagene发表的LiCl/聚乙二醇程序(Catalog#217406)，用1-2ug质粒DNA转化啤酒酵母菌株YPH499(ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-del63 his3-del200 1leu2-dell)(Stratagene，La Jolla，CA)。另外也可用一个Zymo Reserach(Orange，CA)的Frozen-EZ酵母转化试剂盒(Catalog#T2001)进行转化。转化克隆在补加有下列成分中的一种或多种的基础培养基(SMM-0.67％无氨基酸的酵母氮源，2％葡萄糖)中29℃培养3～4天，补加成分为：腺嘌呤硫酸(20mg/L)、尿嘧啶(20mg/L)、L-色氨酸(20mg/L)、L-组氨酸(30mg/L)、L-亮氨酸(30mg/L)、L-赖氨酸(30mg/L)。取菌落在选择平板上划线和接种到液体培养基。根据所用的载体，菌落或者在质粒整合到染色体上后开始生长，或者在游离体复制后开始生长。除了用单一类型的质粒进行转化，还可用两种或更多的质粒进行共转化。

dhaB的活性在转化的啤酒酵母中的表达

用质粒pMCK1、pMCK10和pMCK17转化的菌株YPH499在含有0.67％无氨基酸的酵母氮源、2％半乳糖、2％蜜三糖、20mg/L腺嘌呤硫酸、30mg/L L-赖氨酸、和20mg/L组氨酸的加富的基础培养基上进行培养。将细胞匀浆后，用抽提物分析其dhaB活性。结果得到0.021单位/mg的特异活性。

                     实施例10

构建其它用于啤酒酵母转化的复制型和整合型质粒

分离pGAD/KAN2的SnaBI/EcoRI ADH1片断，将此片断与事先用HincIII和EcoRI消化的载体pRS406(Stratagene，La Jolla，CA)连接，构建了一个通用表达载体。阳性克隆用质粒编码的lacZα肽插入失活和ADH1启动子片段的存在来鉴定。得到的质粒(pMCK3)用EcoRI和SmaI消化，并与EcoRI和NaeI消化的pGBT9的0.2kb ADH1终止子片段连接，得到的质粒(pMCK5)含有ADH启动子和终止子两者的序列，并含有一个URA3标记。

dhaT表达质粒的构建

载体pMCK5用EcoRI消化，并去磷酸化，从质粒pMP13中切下含dhaT的EcoRI片断，并与pMCK5连接，得到的质粒(pMCK7)含有从ADH1启动子可正确转录的dhaT，并含有一个URA3标记。

整合载体pRS404用KpnI和SacI消化，从质粒pMCK7中切下含有dhaT基因及其两翼的启动子和终止子的KpnI/SacI片断，并与pRS404连接，得到的质粒含有从ADH1启动子可正确转录的dhaT，并含有一个TRP1标记。

dhaB1表达质粒的构建

载体pMCK5用EcoRI消化，并去磷酸化，从质粒pMP15中切下含dhaB1的EcoRI片断，并与pMCK5连接，得到的质粒(pMCK8)含有从ADH1启动子可正确转录的dhaB1，并含有一个URA3标记。

整合载体pRS403用ClaI和AatII消化，从质粒pMCK8中切下含有dhaB1基因及其两翼的启动子和终止子的ClaI/AatII片断，并与pRS403连接，得到的质粒含有从ADH1启动子可正确转录的dhaB1，并含有一个HIS3标记。

复制型质粒pYES2用HindIII和SnaBI消化，与用SnaBI和HindIII消化的pGAGH的ADH1启动子片断连接，来取代其GAL1启动子元件。将pMP19的dhaB1 HindIII和XbaI片断与经过修饰的含有ADH1启动子的pYES2的相应位点连接，得到的质粒含有从ADH1启动子可正确转录的dhaB1，并含有一个URA3标记。

载体pMCK4用HindIII消化，并去磷酸化，从质粒pMP15中切下含dhaB1的HindIII片断，并与pMCK4连接，得到的质粒含有从ADH1启动子可正确转录的dhaB1，并含有一个LEU2标记。

dhaB2表达质粒的构建

载体pRS404、pRS405和pPRS406用SmaI消化，从质粒pMCK17中切下含有dhaB2基因及其两翼的启动子和终止子的SnaBI/NaeI片断，并分别与上述三种整合载体连接，得到的质粒含有从ADH1启动子可正确转录的dhaB2，并含有一个LEU2、TRP1或URA3标记。

                        实施例11

在啤酒酵母中筛选dhaT转化子及其将D-葡萄糖转化为1，3-丙二醇筛选含有dhaT基因的啤酒酵母

从按照实施例9和实施例10的方法构建的Ura⁺、His⁺、Trp⁺或Leu⁺转化子中提取染色体DNA，使用在巴斯德毕赤酵母中介绍的(SEQ IDNO：2-9)每个基因的特异引物，用PCR进行分析。

转化有dhaT基因的啤酒酵母由D-葡萄糖生产1，3-丙二醇

按照实施例9和10中介绍的方法构建的含有dhaT、dhaB1、dhaB2和dhaB3的转化子，在补加有20mg/L腺嘌呤硫酸、30mg/L L-赖氨酸和1mg/L维生素B₁₂的SMM中29℃有氧或无氧条件下振荡培养。培养至稳定期后，用HPLC测定1，3-丙二醇的存在。啤酒酵母转化子pMCK1/10/17(HM)#A申请了保藏，并被命名为ATCC______。

                     实施例12

巴斯德梭菌ATCC6013在氢气环境下由D-葡萄糖生产1，3-丙二醇巴斯德梭菌的一般生长条件

除非特别指明，巴斯德梭菌ATCC6013在装有10mL培养基绉纹密封的血清瓶中进行培养，装有培养基的绉纹瓶在接种前无菌操作充入氢气。基础培养基(培养基A)的pH值调节至pH7.2，它包含以下成分(g/L)：KH₂PO₄，1.4、NaH₂PO₄，0.69、NH₄Cl，1.8-2.5、KCl，0.50、MgSO₄7H₂O，0.50、CaCl₂，0.025、NaCl，1.0、酵母抽提物，2.0、半胱氨酸HCl，0.50、碳酸氢钠，2.5、对氨基苯甲酸，0.0080、生物素，0.000040、柠檬酸钠2H₂O，0.10、FeSO₄7H₂O，0.050、CoCl₂6H₂O，0.010、MnCl₂4H₂O，0.0010、ZnCl₂，0.00050、Na₂MoO₄2H₂O，0.0025、NiCl₂6HO，0.010和CuSO₄5H₂O，0.0050，并按下面的指示在培养基A中加入碳源。所有的温育均在30℃、250rpm振荡进行。

在一批10mL补加有5％葡萄糖的培养基A中，接种1mL约含15％(v/v)甘油的巴斯德梭菌ATCC6013冻存液进行增菌。96小时后，取0.5mL培养的细胞悬液转接到10mL新鲜培养基中继续培养。24小时后，用氢气将新接种小瓶中的气压调至30psi。继续培养96小时。在最后96小时阶段的开始和结尾分别取水相样品，用通用方法中介绍的HPLC进行分析。结果见表11。

                       表11

在氢气气体条件下巴斯德梭菌ATCC6013将D-葡萄糖转化为1，3-丙二醇

时间(小时) 增菌  葡萄糖(mM)  甘油(mM)  1，3-丙二醇(mM)^a

 0          A      114         nd             2.7

 96         A      47          nd             3.4

0        B        119        0.1        2.0

96       B        59         0.1        2.5

^a1，3-丙二醇的存在用通用方法中介绍的GC/MS来证实。

                        实施例13

巴斯德梭菌ATCC6013在甲基紫精存在的条件下由D-葡萄糖生产1，3-丙二醇

实验1。所有细胞均按照实施例12中的程序进行培养。在一批10mL补加有5％葡萄糖的培养基A(实施例12中介绍)中，接种1mL含15％(v/v)甘油的巴斯德梭菌ATCC6013冻存液进行增菌。96小时后，取0.5mL培养的细胞悬液转接到10mL新鲜培养基中继续培养。24小时后，在新接种小瓶中加入甲基紫精(1，1′-2甲基-4，4′-二氯联吡啶)至终浓度为1mM。继续培养96小时。在最后96小时阶段的开始和结尾分别取水相样品，用通用方法中介绍的HPLC进行分析。结果见表12。

                       表12

在甲基紫精存在的条件下巴斯德梭菌ATCC6013将D-葡萄糖转化为1，3-丙二醇

时间(小时) 增菌  葡萄糖(mM)  甘油(mM) 1，3-丙二醇(mM)^a

    0        A      113         0.3          2.4

    96       A      28          1.8          3.4

    0        B      87          0.3          2.1

    96       B      40          3.2          4.4

^a1，3-丙二醇的存在用通用方法中介绍的GC/MS来证实。

实验2。在补加有1％(v/v)甘油+1％(w/v)葡萄糖的培养基中接种巴斯德梭菌ATCC6013的冻存物，该冻存物中含有约15％(v/v)的甘油，接种量为每20mL接种0.2mL冻存物。48小时后，取10mL细胞悬液加入到90mL新鲜培养基中，继续培养24小时。将100mL细胞悬液在冰上冷却，在无氧条件下离心收集细胞。用无氧的缓冲液(50mM磷酸缓冲液，pH7.2+0.5g/L半胱氨酸HCl，事先充有氮气并在氮气环境下高压灭菌)洗涤3次，并重新悬浮于8mL体积的无氧缓冲液中。在增菌试验中，将1mL这种细胞悬液接种到10mL补加有1％葡萄糖和0mM、1mM、5mM或10mM甲基紫精的培养基A中，温育240小时，在最后240小时阶段的开始和结尾分别取水相样品，用通用方法中介绍的HPLC进行分析。结果见表13。

                        表13

在甲基紫精(MV)存在的条件下巴斯德梭菌ATCC6013将D-葡萄糖转化为1，3-丙二醇

MV(mM) 时间(小时) 增菌  葡萄糖(mM) 甘油(mM) 1，3-丙二醇(mM)^a

  0       0        A        38        nd        nd

  ..      240      A^b      40        nd        nd

  ..      0        B        nd        nd        nd

  ..      240      B^b      nd        nd        nd

  1       0        A        40        nd        nd

  ..      240      A^b      nd        4         1

  ..      0        B        45        nd        nd

  ..      240      B^b      nd        5         2

  5       0        A        37        nd        nd

  ..      240      A        nd        4         2

  ..      0        B        38        nd        nd

  ..      240      B        nd        3         1

  10      0        A        40        nd        nd

  ..      240      A        nd        2         5

  ..      0        B        43        nd        nd

  ..      240      B        nd        3         1

^a1，3-丙二醇的存在用通用方法中介绍的GC/MS来证实。

^b在120小时，葡萄糖消耗后，加入外源甘油至终浓度为1％。

实验3。在下面的所有研究中，巴斯德梭菌TACC6013首先维持在巯基乙醇酸盐培养基(Difco^®)中，然后转接到补加有0.4％葡萄糖的培养基A中。在后一种培养基中多次传代后，在10mL上面介绍的培养基中接种1mL分装的储存培养物培养过夜制备种子培养物。在一系列装有新鲜培养基并含有表14指示的甲基紫精浓度的血清瓶中，接种1mL过夜培养物，按表14标出的时间再次培养。从各瓶中间隔取样分析葡萄糖的利用并用通用方法中介绍的HPLC分析1，3-丙二醇和葡萄糖的存在。表14概括了分析的结果。

                  表14

        巴斯德梭菌ATCC 6013由葡萄糖生产1，3-丙二醇

瓶  甲基紫精(mM) 时间(天)  葡萄糖(mM) 1，3-丙二醇(mM)^a

1      0          0          22.5            0

1      0          5          0               0

2      0.1        0          26.5            0

2      0.1        5          0               0

3      1.0        0          25.3            0

3      1.0        5          10.0            2.4

3      1.0        9          0               2.4

^a1，3-丙二醇的鉴定用通用方法中介绍的GC/MS来证实。

                      实施例14

构建用于转化芽孢杆菌属、链霉菌属和假单胞菌属的种类的通用表达质粒

表达载体pTacIQ

大肠杆菌表达载体pTacIQ含有插入在pBR322(Sutcliffe等。ColdSpring Harb.Symp.Quant.Biol 43卷，77页(1979))的EcoRI位点的laclq基因(Farabaugh，《自然》274卷，5673页(1978))和tac启动子(Amann等。《基因》25卷，167页(1983))。一个多克隆位点和终止序列(SEQ IDNO：10)取代了pBR322的EcoRI和SphI之间的序列。

亚克隆甘油脱水酶基因(dhaB1、2、3)

使用5′末端含有一个EcoRI位点、3′末端含有一个XbaI位点的引物(SEQ ID NO：41和42)，用PCR从pHK28-26扩增dhaB3基因的开放阅读框。将PCR产物亚克隆到pLitmus29(New England Biolab，Inc.，Beverly.MA)中，产生含有dhaB3的质粒pDHAB3。

使用限制性内切酶KpnI和EcoRI，将包含有dhaB3操纵子的四个基因的全部编码区的区域从pHK28-26中亚克隆到pBluescriptIIKS+(Stratagene，La Jolla，CA)中，产生质粒pM7。

用ApaI和XbaI消化含有dhaB(1，2，3，4)的质粒pM7，移去dhaBX基因(删除部分的dhaB3和全部的dhaBX)。将剩下的5.9kb片断纯化，并与质粒pDHAB3的325-bp的ApaI-XbaI片断连接(恢复dhaB3基因)，产生含有dhaB(1、2、3)的pM11。

使用5′末端含有一个HindIII位点和一个共有的RBS核糖体结合位点、3′末端含有一个XbaI位点的引物(SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12)，用PCR从pHK28-26扩增dhaB1基因的开放阅读框。将PCR产物亚克隆到pLitmus28(New England Biolab，Inc.，Beverly，MA)中，产生含有dhaB1的质粒pDT1。

pM11的NotI-XbaI片断含有dhaB1的部分基因、dhaB2基因和dhaB3基因，将这一片断插入pDT1中产生dhaB表达质粒pDT2。将含有dhaB(1、2、3)的pDT2的HindIII-XbaI片断插入pTacIQ，产生pDT3。

亚克隆1，3-丙二醇脱氢酶基因(dhaT)

将含有全部1，3-丙二醇脱氢酶(dhaT)基因的pHK28-26的KpnI-SacI片断亚克隆到pBluescrptII KS+中，产生质粒pAH1。使用5′末端含有一个XbaI位点、3′末端含有一个BamHI位点的合成引物(SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14)，以pAH1为模板DNA用PCR扩增dhaT基因。将PCR产物亚克隆到pCR-Script(Stratagene)的SrfI位点，产生含有dhaT的质粒pAH4和pAH5。质粒pAH4含有从pCR-Script的lac启动子可正确表达的dhaT基因，而质粒pAH5则含有相反方向的dhaT基因。将来自pAH4、含有dhaT基因的XbaI-BamHI片断插入pTacIQ产生质粒pAH8将含有RBS和dhaT基因的pAH8的HindIII-BamHI片断插入pBluescriptII KS+，产生pAH11。将含有RBS、dhaT基因和终止子的pAH8的HindIII-SalI片断插入pBluescriptII SK+，产生pAH12。构建dhaB(1、2、3)和dhaT的表达盒

应用分子生物学的标准方法，用上面介绍的单个的dhaB(1、2、3)和dhaT亚克隆装配了一个dhaB(1、2、3)和dhaT表达盒。将含有RBS、dhaT基因和终止子的pAH8的SpeI-KpnI片断插入pDT3的XbaI-KpnI位点，产生pAH23。将dhaB3和dhaT基因之间的SmaI-EcoRI片断移去，产生pAH26。用含有一个EcoRI位点的pDT2的SpeI-NotI片断取代pAH26的SpeI-NotI片断，产生pAH27。

构建dhaT和dhaB(1、2、3)的表达盒

应用分子生物学的标准方法，用上面介绍的单个的dhaB(1、2、3)和dhaT亚克隆装配了一个dhaT和dhaB(1、2、3)表达盒。将含有dhaB(1、2、3)基因的pDT3的SpeI-SacI片断插入pAH11的SpeI-SacI位点，产生pAH24。

                            实施例15

                用重组的浅青紫链霉菌生产1，3-丙二醇

葡萄糖异构酶启动子的亚克隆

使用5′末端含有一个SpeI位点和一个EcoRI位点、3′末端含有一个HindIII位点的引物(SEQ ID NO：17和18)，用PCR从pCOs121(SEQ IDNO：15)或pCO121low(SEQ ID NO：16)中扩增两个版本的葡萄糖异构酶启动子。将PCR产物亚克隆到pLitmus29(New England Biolab，Inc.，Beverly，MA)中，产生质粒pDT7和pDT8。

构建dhaB(1、2、3)和dhaT的表达盒

使用限制性内切酶HindIII和SalI，将pAH27中4.1kb的dhaB(1、2、3)和dhaT的表达盒(实施例14)插入到pDT7或pDT8中，分别产生pDT11和pDT12。

构建在链霉菌中共表达dhaB(1、2、3)和dhaT的质粒

用EcoRI和SalI消化pDT11或pDT12，移去4.3kb的dhaB(1、2、3)和dhaT的表达盒。载体pIJ488-101用限制性内切酶EcoRI和XbaI消化。表达盒和载体与SalI-XbaI接头SEQ ID No：19和SEQ ID No：20连接，分别产生pDT13和pDT14。

  pIJ488-101含有浅青紫链霉菌的pIJ101(Kendall和Cohen，《(细菌学杂志》170卷，4634页(1988))和大肠杆菌的pUC18(Norrander等，《基因》26卷，101页(1983))的复制起始区域。序列来源如下：碱基1-2086来自pIJ101(1-2086)，碱基7688-8437来自pIJ101(8080-8830)。碱基2087-3368来自远青链霉菌(Thompson等，《基因)》20卷，51页(1982))的硫链丝菌肽抗性基因。碱基3369-7687来自pUC18并在KpnI位点插入有红色糖多孢菌的红霉素抗性基因(Thompson等，上文)。

用dhaB(1、2、3)和dhaT转化浅青紫链霉菌

使用标准的原生质体转化技术(Hopwood等，《链霉菌的遗传操作》，TheJohn Innes Foundation(1985))，将质粒pDT13和pDT14转化至浅青紫链霉菌TK23。在含有50ug/mL硫链丝菌肽的平板上30℃温育选择转化子。转化子的孢子重新铺板以获得纯培养。

甘油脱水酶活性的检测

链霉菌转化子在25mL补加有1％葡萄糖、2％甘油、1mg/L维生素B₁₂、50ug/mL硫链丝菌肽的TSB(大豆蛋白胨肉汤，Difco，Detroit，MI)中30℃培养3天。离心收集细胞并重新悬浮在1mL的100mM Tris缓冲液，pH7.4中。用弗氏压碎器(20,000psi)破碎细胞，用细胞抽提物按通用方法中的介绍分析其甘油脱水酶活性。转化有pDT13(克隆8#)或pDT14(克隆2#)的浅青紫链霉菌TK23的细胞抽提物含有特异活性为0.1U/mg的甘油脱水酶。

在重组浅青紫链霉菌中生产1，3-丙二醇

浅青紫链霉菌TK23/pDT14(克隆2#)(ATCC______，也被鉴定为浅青紫链霉菌菌株SL14.2)从一个TSA平板上接种到一个250mL的瓶中进行培养，瓶中装有25mL补加有1％葡萄糖、2％甘油、1mg/L维生素B₁₂、50ug/mL硫链丝菌肽的TSB(大豆蛋白胨肉汤，Difco，Detroit，MI)。摇瓶在30℃温育并剧烈振荡三天，培养三天后，按通用方法中的介绍，用GC-MS分析(TMS衍生)在上清中检测到3mg/mL的1，3-丙二醇。

                    实施例16

用重组的浅青紫链霉菌由D-葡萄糖生产1，3-丙二醇

在证明含有pDT13或pDT14的浅青紫链霉菌TK23生产1，3-丙二醇时，细菌培养在30℃通气的摇瓶(锥形瓶，液体体积为总体积的1/10)中进行。

加富培养基摇瓶中的培养用两天的TSA-平板(tryticase大豆琼脂；BBL#11043)接种开始。加富培养基可以是TSB(tryticase大豆肉汤；BBL#11768)、液体肉汤(每升含有16g蛋白胨，10g酵母抽提物，和5g NaCl)、培养基B(TSB每升补加：10.0g葡萄糖，2mL NTA被柠檬酸取代的调整的Balch′s痕量元素溶液，2.0g Na₂CO₃，4.0g K₂HPO₄，1mg维生素B₁₂，最终pH＝7.2)、或培养基C(培养基B，pH＝6.4)。调整的Balch′s痕量元素溶液的组分可在《普通和分子细菌学方法》(P.Gerhardt等编辑，158页，美国微生物学会，Washington，DC(1994))中查到。基本培养基摇瓶中的培养用两天的TSB液体培养物接种开始，接种量为1/30(v/v)。基本培养基可以是：MM322(每升含有：12.0g葡萄糖，11.3g K₂HPO₄，10g(NH₄)₂SO₄，0.2g Difco酵母抽提物，0.1g NaCl，2mg维生素B₁₂，和10mL上面介绍的调整的Balch′s痕量元素溶液，最终pH6.7(HCl))；培养基D(补加有2.0g Na₂CO₃/L的培养基MM322，最终pH7.2)、或培养基E(培养基D，最终pH6.4)。培养基B和C以及基本培养基用过滤除菌，其它培养基用高压灭菌。

摇瓶在30℃温育两天并剧烈振荡，然后上清取样做HPLC分析。加入葡萄糖，培养物在有氧条件下温育1小时，然后将培养物转移到一个25mL体积的玻璃试管中(接近装至顶部)。然后这些试管在无氧条件下30℃继续温育。温育2-5天后，用通用方法中介绍的HPLC检测上清中的1，3-丙二醇。

                    实施例17

构建通用质粒、质粒用于在芽孢杆菌中超量表达dhaB(1-3)和dhaT以及用重组的地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生产1，3-丙二醇构建通用表达质粒

复制型高拷贝穿梭载体pVS02用于在芽孢杆菌中共表达dhaB(1-3)和dhaT。pVS02是通过将与枯草芽孢杆菌的apr启动子融合且携带一个碱性丝氨酸蛋白酶的EcoRI/BamHI片断克隆到pBS19中构建而来。pBS19是pBS42(Band和Henner，《DNA》第3卷，17页(1984))的一个衍生物，在pBS19中pBS42的EcoRI/BamHI片断被pUC19(Boehringer Mannheim)的EcoRI/HindIII多接头取代。为了便于测序和PCR反应，用PCR方法将一个45bp的合成接头(SFQ ID NO：21)引入蛋白酶基因末端与转录终止子之间。

复制型低拷贝穿梭载体pSS15-B用于在芽孢杆菌中共表达dhaB(1-3)和dhaT。质粒pSS15-B的构建方法如下：用HindIII/SalI(位点在多接头中)消化质粒pHP13(Haima等，《分子和普通遗传学》209卷，335页(1987))，用T4DNA聚合酶将末端补齐，重新连接产生pSS13。将pnVS02的2kb的EcoRI/BamHI片断插入pSS13的EcoRI/BamHI位点，就产生了pSS15-B。

超量表达dhaB(1-3)和dhaT盒的质粒

为在dhaT的5′末端产生一个芽孢杆菌共有的核糖体结合位点，将一个由合成引物(SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23)退火得到的EcoRI/XbaI接头插入pAH23的EcoRI/XbaI位点，产生pM17。为在dhaB1的5′末端引入一个SalI位点，将一个用合成引物(SEQ ID NO：24和SEQ IDNO：25)退火得到的HindII/bglII接头加到pM17的HindII/bglII位点，产生pM20。将质粒pM20的0.3kb的MluI/KpnI片断用质粒pAH4的0.3kb的MluI/KpnI片断取代，引入一个HindIII位点，从而产生pM21。

将一个SalI-XbaI接头(SEQ ID NO：26和27)插入到用限制性内切酶SalI-XbaI消化的pAH5中，产生pDT15。这个接头消除了XbaI位点并改变了阅读框，使dhaT基因与质粒pSS15-B和pVS2的蛋白酶编码序列的开放阅读框融合。然后，将pDT15的1kb的SalI-MluI片断插入到pAH24中，取代原来的SalI-MluI片断，产生pDT17。

将一个SalI-XbaI接头(SEQ ID NO：28和29)插入到用限制性内切酶SalI-XbaI消化的pAH5中，产生pDT16。这个接头消除了XbaI位点并改变了阅读框，使dhaT基因与pUSH1(Schon和Schuman，《基因》147卷，91页(1994))的poly-His编码序列的开放阅读框融合。然后，将pDT16的1kb的SalI-MluI片断插入到pAH24中，取代原来的SalI-MluI片断，产生pDT18。

质粒pDT4(含有dahB(1-3))用将pDT2的2.7kb的EcoRI/XbaI片断引入用EcoRI/XbaI消化的pUC18(Boehringer Mannheim)来构建。在芽孢杆菌中超量表达dhaB(1-3)和dhaT盒的质粒

pDT17用SacI消化，末端用T4聚合酶补齐，DNA用SalI消化以释放含有dahT和dahB的片断。将此片断与用HindIII(末端用T4聚合酶补平)和SalI消化的pSS15-B连接，产生pM27。

使用乳糖诱导系统在芽孢杆菌中超量表达dhaB(1-3)的质粒

将含有dahB(1-3)的质粒pDT4的2.7kb BglII/HindIII片断克隆到pUSH1的多接头的HindIII/BamHI位点，产生pM26。dahB1基因与pUSH1的poly-His编码序列的开放阅读框融合。

将质粒转化进芽孢杆菌

用自然转化的方法(McCuen和Thorne，《细菌学杂志》107卷，636-645页(1971))将质粒pM26和pM27转化进地衣芽孢杆菌BG307。并分别在10ug/mL卡那霉素和30ug/mL氯霉素中进行筛选。用标准的原生质体转化技术(Pragai等，《微生物学》140卷，305页(1994))将同样的质粒转化进地衣芽孢杆菌BG188，并按前述的方法进行筛选。枯草芽孢杆菌BG2864按自然转化的方法用pM27进行转化。含有质粒的转化子在含有10ug/mL氯霉素的LA平板上进行筛选。

还将pM26转化进枯草芽孢杆菌菌株1E62(Saito等，《分子和普通遗传学》170卷，117页(1979))，含有质粒的转化子在含有10ug/mL红霉素和20ug/mL卡那霉素的LA平板上进行筛选。

所有的转化子均生长在30℃。

甘油脱水酶活性的检测

转化有pM26(克隆#8)的地衣芽孢杆菌菌株BG188在25mL补加有1％葡萄糖和10ug/mL卡那霉素的LB(Difco)中30℃生长过夜。离心收集细胞并重新悬浮在1mL的0.1M Tricine/KOH缓冲液，pH8.2，50mMKCl，1mM二硫苏糖醇和200uM苯甲基磺酰氟中。在弗氏压碎器(20,000psi)中破碎细胞并收集细胞抽提物，按通用方法中的介绍分析其甘油脱水酶活性。得到了0.036U/mg的特异活性。按通用方法中的介绍，测量1，3-丙二醇脱氢酶的特异活性，为0.2U/mg。

在重组芽孢杆菌中生产1，3-丙二醇

转化有pM26(克隆#8)的地衣芽孢杆菌菌株BG188(ATCC)在装有25mL补加了1％葡萄糖和10ug/mL卡那霉素的LB(Difco)的摇瓶中30℃剧烈振荡生长过夜。然后取1mL接种到装有25mL补加了1％葡萄糖、1％甘油、0.33ug/mL维生素B₁₂、和10ug/mL卡那霉素的LB的250mL摇瓶中。摇瓶在30℃温育并剧烈振荡，生长9小时后，按通用技术中的介绍，用GC/SM(TMS衍生)检测到300ug/mL的1，3-丙二醇转化有pM27(克隆#1)的枯草芽孢杆菌菌株BG2864(ATCC_____)在装有25mL补加了1％葡萄糖、1％甘油、0.33ug/mL维生素B₁₂、和10ug/mL氯霉素的LB的250mL摇瓶中进行生长。摇瓶在30℃温育并剧烈振荡，生长43小时后，检测1，3-丙二醇。

重组芽孢杆菌生产3-羟基丙醛

芽孢杆菌发酵在一个总体积为15.5升的Biolafitte发酵罐中进行，开始的工作体积为7升，在发酵过程中增加到9.5升。有氧环境用650rpm的叶轮速率和0.8bar的负压、7升/分钟的通气速率来保证(有氧环境用％溶解氧(100％DO为大气压时的溶解氧)来定义，这一值用安装的DO-探针进行测量；35％DO被认为是有氧的最小值)。pH值用自动加入H₂SO₄或28％NH₄OH的方法维持在pH6.70。温度维持在30℃。

将下列组分分批加入罐内，121℃灭菌30分钟：(克/升)6NaH₂PO₄H₂O、10K₂HPO₄、1.5NaCl、10(NH₄)₂SO₄、0.2FeCl₃、1.5蛋白胨、6酵母抽提物、10mL Balch′s调整的痕量元素溶液(《普通和分子细菌学方法》(P.Gerhardt等，编辑)，158页，美国微生物学会，Washington，DC(1994))和2 MAZU DF204(一种常规消泡剂)。灭菌后，加入350克50％的葡萄糖原料，并同时加入卡那霉素和氯霉素(均至终浓度为10mg/mL)

从在LBG1％(＝10g蛋白胨，5g酵母抽提物，5g NaCl，10g葡萄糖)的摇瓶中生长了24小时的地衣芽孢杆菌BG188/pM26(克隆#8)中取0.6升接种发酵罐。然后使培养物生长，消耗葡萄糖。当pH升至6.60时，加入葡萄糖原料(50％葡萄糖，高压灭菌，0.7克/分钟)。45小时后，加入营养物质(50mL Balch′s痕量元素溶液，14克K₂HPO₄，14克酵母抽提物，14ml维生素溶液，pH调至6.60，过滤除菌)。70小时后，加入维生素B₁₂至终浓度10mg/L。在前92小时，％DO保持在有氧水平。在发酵过程中葡萄糖为(少量)过量存在(有氧期为0.2-12g/L(前92小时)；O₂-限制期为2.0-36g/L(92-164小时))。在87小时所取的样品中，怀疑有3-羟基丙醛存在，通过用还原剂硼氢化钠处理样品后检测1，3-丙二醇得到了证实。

                  实施例18

其它在芽孢杆菌中超量表达dhaT和dhaB(1-3)盒的质粒在芽孢杆菌中超量表达dhaT和dhaB(1-3)盒的质粒

将含有dhaB(1-3)和dhaT的质粒pM21的SalI/HindIII片断与5kb的Sal/HindIII pVS02载体连接，产生pM22。pM22含有处于一个高拷贝载体上的apr启动子控制下的dhaB和dhaT。

将pM21的SalI/HindIII片断与5.8kb的pSS15-B的Sal/HindIII片断连接，产生pM23。pM23含有处于一个低拷贝载体上的apr启动子控制下的dhaB和dhaT。

在芽孢杆菌中超量表达dhaT和dhaB(1-3)盒的质粒

pDT17用SacI消化，末端用T4DNA聚合酶补齐，DNA用SalI消化以释放含有dahT和dahB的片断。将此片断与用HindIII(末端用T4聚合酶补平)和SalI消化的pVS02连接，产生pM25。

使用乳糖诱导系统在芽孢杆菌中超量表达dhaB(1-3)和dhaT盒的质粒pDT18用SacI消化，末端用T4DNA聚合酶补齐，DNA用SalI消化以释放含有dahT和dahB的片断，两个基因都含有一个芽孢杆菌共有的核糖体结合位点。将此片断与用HindIII(末端用T4聚合酶补平)和SalI消化的pUSH1连接，产生pM24。

                     实施例19

重组芽孢杆菌将D-葡萄糖转化为1，3-丙二醇

芽孢杆菌的生长条件

在证明地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生产1，3-丙二醇时，细菌的生长在一个摇瓶(锥形瓶)和15.5L(总体积)Biolafitte发酵罐(工作体积为7-10L)中、30℃或35℃(按照指示)有氧条件下进行。

在LBG(每升含有：16g蛋白胨，10g葡萄糖，10g酵母抽提物和5gNaCl)摇瓶中的培养用培养了一天的TSA(Trypticase大豆琼脂，BBL#11043)平板接种起始。然后用这些摇瓶去接种发酵罐或摇瓶，来证明D-葡萄糖确实转化为1，3-丙二醇。

摇瓶中的分批培养物

加富培养基可以是TSB(Trypticase大豆肉汤，BBL#11768)、LBG、培养基B(TSB每升补加：10.0g葡萄糖，2mL NTA被柠檬酸取代的调整的Balch′s痕量元素溶液，2.0g Na₂CO₃，4.0g K₂HPO₄，1mg维生素B₁₂，最终pH＝7.2)、或培养基C(培养基B，pH＝6.4)。调整的Balch′s痕量元素溶液的组分可在《普通和分子细菌学方法》(P.Gerhardt等，编辑，158页，美国微生物学会，Washington，DC(1994))中查到。基本培养基可以是：MM322(每升含有：12.0g葡萄糖，11.3g K₂HPO₄，1.0g(NH₄)₂SO₄，0.2gDfico酵母抽提物，0.1g NaCl，2mg维生素B₁₂，和10mL上面介绍的调整的Balch′s痕量元素溶液，最终pH6.7(HCl))、培养基D(补加有2.0gLNa₂CO₃的培养基MM322，最终pH7.2)、或培养基E(培养基D，最终pH6.4)。培养基B和C以及基本培养基用过滤除菌，其它培养基用高压灭菌。

摇瓶在30℃温育一天并剧烈振荡，然后上清取样做HPLC分析。加入葡萄糖，培养物在有氧条件下温育1小时，然后将培养物转移到一个25mL体积的玻璃试管中(接近装至顶部)。然后这些试管在无氧条件下30℃继续温育。温育1-5天后，用通用方法中介绍的HPLC检测上清中的1，3-丙二醇。

在发酵罐中分批培养和补料分批培养

从一个摇瓶中取总体积为600mL的培养物(LBG培养基)，接种到装有6.4L培养基的发酵罐中，发酵罐中的培养基为分批加入并高压灭菌30分钟(基本培养基)或45分钟(加富培养基)。发酵罐中典型的基本培养基是培养基D，典型的“加富”培养基是另加有50g酵母抽提物/L的培养基D。发酵罐灭菌后，用注射器和发酵罐盖上的隔膜接口加入滤膜除菌的添加物(维生素B₁₂或营养缺陷型的补偿物)。

对负压(BP，0.1-0.5bar)、通气(升空气每分钟，0.4-1vvm)、搅拌(rpm，200-600)、温度(T，30-37℃)、溶解氧(％DO)、和pH(5.8-7.2，加入NH₄OH和H₂SO₄或H₃PO₄)进行监测，并按照指示控制在所需值。

接种后，细胞以分批发酵模式先生长14小时，然后开始加入葡萄糖原料。对于厌氧生长/生产，可以按照指示通过降低rpm和BP或用N₂取代空气使％DO降至0。

从发酵罐和摇瓶中取上清样品进行OD₅₅₀读数(生长)和酶促葡萄糖试验；同时制备上清样品按照通用技术中列出的标准程序进行HPLC分析。上清中存在1，3-丙二醇。

                      实施例20

用dhaB(1-3)和dhaT转化假单胞菌并证明其生产1，3-丙二醇构建在假单胞菌中共表达dhaB(1-3)和dhaT的质粒

使用限制性内切酶EcoRI和SalI，将pAH27的4.1kb的dhaB(1-3)和dhaT表达盒插入载体pMMB66EH(Füste等，《基因》48卷，119页(1986))和pMMB207(Morales等，《基因》97卷，39页(1991))，分别产生pDT10和pDT9。

用pDT9表达质粒转化铜绿假单胞菌PAO2845

转化用的铜绿假单胞菌PAO2845通过在L-肉汤中37℃ 200rpm振荡培养过夜来制备。将种子培养物按1∶25接种到25mL经过预热和预通气的新鲜L-肉汤中。将此新鲜培养物在37℃ 200rpm温育2-3小时至对数期早期。离心收集细胞，用10ml冰冷的含5％二甲基亚砜的0.15M MgCl₂洗涤两次，并悬浮于2mL的二甲基亚砜溶液。将细胞悬液(0.2mL)与100-200ng的pDT9 DNA混合，冰上放置60分钟。反应混合物在37℃热刺激2分钟，然后转置冰上5分钟。加入L-肉汤(0.5mL)，细胞在37℃温育20分钟。从补加有37.5ug/mL氯霉素的营养琼脂平板中挑取单菌落。

将pDT10接合转移至铜绿假单胞菌PAO1

质粒pDT10用Figurski和Helinski的方法(《美国国家科学院院报》，76卷，1648页(1979))接合转移至PAO1。将pDT10转化到大肠杆菌AC80(Chakratrty等，《美国国家科学院院报》，75卷，3109页(1978))中来产生一个供体菌株。辅助菌株是含有pRK2013(Figurski和Helinski，上文)的大肠杆菌HB101。受体菌株是铜绿假单胞菌PAO1(Royle等，《细菌学杂志》145卷，145页(1981))。每种菌株的培养物(5ml)均在LB中37℃生长过夜。细胞用0.9％NaCl洗涤，并重新悬浮于200uL。将细胞混合在一起并涂布到LA平板(Luria琼脂，Difco)上。平板在37℃温育6小时。将细胞从平板中取出，转移到含有250ug/mL羧苄青霉素的PIA(Difco)平板中，生长过夜。在相同培养基上挑选单菌落。

检测甘油脱水酶活性和1，3-丙二醇脱氢酶活性

铜绿假单胞菌PAO1/pDT10在25mL补加有250ug/mL羧苄青霉素、0.1mM IPTG的2XYT(16g/L酵母抽提物，16g/L蛋白胨，5g/L NaCl)中37℃过夜培养。离心收集细胞，并重新悬浮在1mL 100mM的Tris缓冲液pH7.4中。细胞用弗氏压碎器在/5,000psi进行破碎。然后用粗抽提物按标准方法分析甘油脱水酶活性和1，3-丙二醇脱氢酶活性。蛋白测定使用Bio-Rad(Bradford)蛋白试验。甘油脱水酶的特异活性为5U/mg。1，3-丙二醇脱氢酶的特异活性为20U/mg。用同样方法制备转化有pDT9的铜绿假单胞菌PAO2845粗抽提物，它含有0.05U/mg的甘油脱水酶活性。

用含有pDT9质粒的铜绿假单胞菌生产1，3-丙二醇

含有pDT9的铜绿假单胞菌PAO2845(ATCC55760)在补加有25ug/mL氯霉素的2XYT培养基中37℃和200rpm振荡培养过夜。生长过夜后，取一份细胞悬液转移到生长培养基(3份2XYT培养基+1份HEPES0.1培养基，补加有0.25％(w/v)葡萄糖，0.2％(w/v)KNO₃，25ug/mL氯霉素，50mg/L酵母抽提物，和80mg/L营养肉汤)中，使细胞悬液的OD₆₆₀nm达到0.5-0.8AU。HEPES0.1培养基含有以下组分：NH₄Cl，9.52mM；MgCl₂6H₂O，0.523mM；K₂SO₄，0.276mM；HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N-[2-乙磺酸])，40mM；tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)，4mM；FeSO₄7H₂O，0.010mM；K₂HPO₄，0.132mM；和下列组分的痕量矿物质并使其终浓度(g/L)如下：柠檬酸钠6H₂O，0.001；FeSO₄7H₂O，0.0005；CoCl₂6H₂O，0.0001；MnCl₂4H₂O，0.00001；ZnCl₂，0.000005；Na₂MoO₄2H₂O，0.000025；NiCl₂6H₂O，0.0001；CuSO₂2H₂O，0.00005。30℃ 250rpm振荡培养约1小时后，在生长培养基中加入0.5mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，让细胞继续生长。在生长约5小时后，在室温下离心收集细胞。细胞用生产培养基洗涤三次，生产培养基为补加有0.25％(w/v)葡萄糖、0.2％(w/v)KNO₃、25ug/mL氯霉素、50mg/L酵母抽提物和80mg/L营养肉汤的HEPES 0.1培养基。在增菌时，洗涤后的细胞用原收集体积的含有0.2％(v/v)甘油的生产培养基重新悬浮。细胞悬液在氮气环境下37℃ 250rpm振荡温育。约1小时后，在细胞悬液中加入5ug/mL的辅酶B₁₂(5，6-二甲基-苯并咪唑钴胺-5-脱氧腺苷)并继续在30℃250rpm振荡温育。从细胞悬液中周期取样进行产物分析。在收集样品时，从样品中离心去除细胞，在分析前将上清水相冻存在-20℃。

HPLC分析用已知的标准物校准后显示这些细胞悬液产生了1，3-丙二醇。结果见表15。按照通用方法中的介绍用GC/MS分析来证实产物。

                     表15

含有pDT9质粒的铜绿假单胞菌生产1，3-丙二醇

样品             时间(小时)    1，3-丙二醇(mM)

 A                0               0

 A                24              5.1

 B                0               0

 B                24              5.6

                          实施例21

             用铜绿假单胞菌由D-葡萄糖生产1，3-丙二醇

一般生长条件

获自PGSC(Pseudomonas Genetic Stock Center，East Carolina School ofMedicine，Greenville，NC)的铜绿假单胞菌PAO2845在基础培养基-HEPES0.1中进行培养，HEPES0.1含有以下组分：NH₄Cl，9.52mM；MgCl₂6H₂O，0.523mM；K₂SO₄，0.276mM；HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N-[2-乙磺酸])，40mM；Tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)，4mM；FeSO₄7H₂O，0.010mM；K₂HPO₄，0.132mM；和下列组分的痕量矿物质并使其终浓度(g/L)如下：柠檬酸钠6H₂O，0.001；FeSO₄7H₂O，0.0005；CoCl₂6H₂O，0.0001；MnCl₂4H₂O，0.00001；ZnCl₂，0.000005；Na2MoO₄2H₂O，0.000025；NiCl₂6H₂O，0.0001；CuSO₂2H₂O，0.00005HEPES0.1用于所有的实验，在补加其它物质时会注明。

用基因间断的方法构建铜绿假单胞菌PAO2845的甘油阴性突变体

铜绿假单胞菌PAO2845在营养肉汤(Difco，Detroit，MI)中37℃、200rpm振荡培养过夜。离心回收细胞，用标准的碱裂解程序(Sambrook，1989)从细胞中抽提DNA。使用5′末端带有EcoRI位点的引物JJ-gplR-5′和JJ-glpR-3′(分别为SEQ ID NOS：30和31)，用PCR方法从铜绿假单胞菌PAO2845中扩增glpR(甘油分解代谢调节蛋白基因，GenbankACCESSION#M60805)的开放阅读框。然后将这个DNA片断插入到质粒pARO180(Parke，《基因》93卷，135页，(1990))的单一EcoRI位点，产生质粒pJJ10。用pJJ10连接混合物的DNA转化大肠杆菌，并涂布到含有50ug/mL氨苄青霉素和0.08mg/mL Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的营养琼脂(Difco，Detroit，MI)上。将很可能含有glp插入的白色菌落挑出，转至补加有50ug/mL氨苄青霉素的LB培养基中。37℃、200rpm振荡培养过夜后收集细胞，并从细胞中回收pJJ10。

用PCR方法从pUC4K(Pharmacia Cat.No.27-4958-01)中扩增卡那霉素盒区域，引物(SEQ ID No32和33)除设计用来扩增该区域外，还将扩增片断的末端修饰，使之能被限制性内切酶Styl(Promega，Madison，WI)识别。扩增的结果得到4kb的pUC4K-styl片断。将pUC4K-styl DNA片断亚克隆到质粒pJJ10上glpR基因内的Styl位点，产生质粒pJJ11。用pJJ11连接混合物的DNA转化大肠杆菌，并涂布到补加有25ugmL卡那霉素和50ug/mL氨苄青霉素的LB琼脂上。挑取5-20个单菌落，在补加有25ug/mL卡那霉素和50ug/mL氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜后，分别回收DNA。用凝胶电泳证实所需质粒DNA的存在。

按照标准程序用pJJ11 DNA转化铜绿假单胞菌PAO2845。主要过程是，铜绿假单胞菌在L-肉汤中37℃、200rpm振荡培养过夜，来制备用于转化的细胞。将此过夜培养物1∶25接种至25ml预热并预先通气的新鲜L-肉汤中。新鲜的培养物在37℃、200rpm振荡温育2-3小时(至对数期早期)。离心细胞并弃上清。将收集的细胞重新悬浮在10ml无菌的、冰冷的、含5％二甲基亚砜的0.15M MgCl₂中，并冰上放置5-10分钟。离心将细胞与上清分离，重新悬浮在10ml无菌的、冰冷的、含5％二甲基亚砜的0.15M MgCl₂中，并冰上放置5-10分钟。最后再次离心弃去上清，将细胞重新悬浮在2ml无菌的、冰冷的、含5％二甲基亚砜的0.15M MgCl₂中。将每份0.2ml的冰冷细胞浓缩物与100-200ng pJJ11DNA混合在预冷的1.5ml聚丙烯离心管中，并将混合物在冰上放置60分钟。然后将离心管迅速转移到37℃水浴槽内2分钟，并立即放回冰上5分钟。加入大约0.5mlL-肉汤，在37℃轻轻振荡温育0.3-1小时。温育复苏后，取每份10uL和50uL的细胞悬液涂布到补加有50ug/mL卡那霉素的营养琼脂平板上。从选择平板上长出的菌落中筛选能在补加有1％琥珀酸或1％甘油的HEPES0.1培养基琼脂平板上生长的克隆。不能在甘油上生长但能在琥珀酸上生长的克隆冻存于15％的甘油以备后用。

用pDT9转化gplR^--铜绿假单胞菌PAO2845

按上面介绍的方法制备转化用的铜绿假单胞菌。将每份0.2ml的冰冷细胞浓缩物与100-200ng pDT9 DNA混合在预冷的1.5ml聚丙烯离心管中，并将混合物在冰上放置60分钟。然后将离心管迅速转移到37℃水浴槽内2分钟，并立即放回冰上5分钟。加入大约0.5ml L-肉汤，在37℃轻轻振荡温育0.3-1小时。温育复苏后，取每份10uL和50uL的细胞悬液涂布到补加有37.5ug/mL氯霉素的营养琼脂平板上。

筛选含有pDT9的gplR^--铜绿假单胞菌PAO2845转化子

将上面的转化子在补加有37.5ug/mL氯霉素的营养琼脂平板上铺板并37℃培养过夜。从这些选择平板上长出的菌落中挑取约20个，转至10mL含有37.5ug/mL氯霉素的营养肉汤(Difco，Detroit，MI)中，37℃、200rpm振荡培养过夜。为证实所选的转化子中存在pDT9质粒，将质粒DNA抽提、纯化并用EcoRI(Promega，Madison，WI)酶切。用凝胶电泳分析线型DNA的分子量。另外，在用凝胶电泳分析线型DNA的分子量后，使用与dhaT、dhaB1、dhaB2和dhaB3序列相同的引物对(分别为SEQ ID NO：34和35，36和37，8和9，4和5)，用PCR扩增的方法来证实所需基因的存在。

对转化有pDT9的gplR^--铜绿假单胞菌PAO2845进行分解代谢筛选

从上面的阳性转化子中选择1至20个克隆做进一步分析。细胞在补加有37.5ug/L氯霉素的营养肉汤中37℃、250rpm振荡有氧生长过夜。将细胞按1∶8的稀释比例转入加有1.5mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的相同培养基中，继续生长4-6小时。离心收集细胞，并用补加有10g/L甘油、0.03g/L小牛抽提物、0.05g/L蛋白胨、0.05g/L酵母抽提物(均为Difco，Detroit，MI)和0.2％KNO₃的HEPES1.0培养基洗涤一次。然后将细胞重新悬浮于1/5的原始体积，装入一个小瓶使瓶中没有空间剩余。在30℃、100rpm振荡温育18-72小时。离心去除细胞，用HPLC分析上清中1，3-丙二醇的存在。另外，用气相色谱-质谱鉴别了1，3-丙二醇。

转化有pDT9的gplR^--铜绿假单胞菌PAO2845(ATCC55760)由D-葡萄糖生产1，3-丙二醇

按照上面的筛选程序，选择1至5个能最大量地由甘油生产1，3-丙二醇的克隆。在补加有37.5ug/L氯霉素的营养肉汤中30℃、250rpm振荡有氧生长过夜。将细胞按1∶8的稀释比例转入加有1.5mM IPTG的相同培养基中，继续生长4-6小时。离心收集细胞，并用补加有10g/L甘油、0.03g/L小牛抽提物、0.05g/L蛋白胨、0.05g/L酵母抽提物和0.2％KNO₃的HEPES0.1培养基洗涤一次。然后将细胞重新悬浮于1/5的原始体积，装入一个小瓶使瓶中没有空间剩余。在30℃、100rpm振荡温育约36小时。离心去除细胞，用HPLC分析上清中1，3-丙二醇的存在。另外，用气相色谱-质谱鉴别了1，3-丙二醇。

                       实施例22

构建在黑曲霉中表达dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT的表达盒通用表达盒(pAEX)：

质粒pGPTpyrG(Berka等，“发展丝状真菌的表达系统”《生物技术进展》第7卷，127-154页(1989))的1.4kb的SpeI-EcoRV片断含有足够用于适当调节黑曲霉gla A启动子和终止子的部分，将此片断连接到pLITMUS39(New England Biolabs，Beverly，MA)的多接头的SpeI和EcoRV位点。

黑曲霉的单个克隆表达盒

使用相同的克隆策略，分别克隆单个的肺炎克雷伯氏菌dhaB亚单位和dhaT的开放阅读框(ORF′s)，并将它们与通用表达载体(pAEX)连接：

根据已知的完整基因操纵子的序列，设计用于PCR扩增单个的dhaBORF和dhaT ORF的引物对，使它们与每种ORF的5′末端和3′末端的序列匹配(dhaB1、dhaB2、dhaB3、dhaBX和dhaT的引物对分别为：SEQID NO：38和12，39和40，41和42，45和46，43和44)。除了序列匹配外，每种ORF的5′末端引物还设计包含一个EcoRI限制酶切位点，在5′最末端还含有一个BglII限制酶切位点，并在每种ORF的第一个ATG上游还有5个碱基的CAGCA序列。设计用来与每种ORF的3′末端匹配的引物在克隆的3′最末端、转录终止子的下游还含有一个XbaI限制酶切位点。

dhaB和dhaT ORF′s的单个克隆片断，使用上面介绍的引物，用PCR方法从含有完整的肺炎克雷伯氏菌dhaT操纵子的质粒pHK26-28中扩增。单个ORF克隆片断根据它们各自的分子量进行分离(dhaB1＝1540bp；dhaB2＝607bp；dhaB3＝448bp；dhaBX＝1846bp；dhaT＝1187bp)。利用PCR引物中设计的EcoRI和XbaI限制酶切位点，将每种单个的dhaB和dhaTORF片断连接到pLITMUS29(New England Biolabs，Beverly，MA)的多接头的EcoRI和XbaI位点。测序证明pLITMUS29中的dhaB2和dhaB3克隆是正确的。将pLITMUS29中dhaB1克隆编码区的1363bp的单一NcoI-EcoRV片断去除，用pHK26-28的相同酶切片断取代。将pLITMUS29中dhaT克隆编码区的783bp的单一Tth111I-MluI片断用pHK26-28的相同酶切片断取代。将pLITMUS29中dhaBX克隆编码区的1626bp的单一EcoRV片断用pM7(含有肺炎克雷伯氏菌的dhaB操纵子)的相同酶切片断取代。对dhaB1、dhaBX和dhaT的5′和3′末端各测序约250bp，证明其序列是正确的，但都含有一些取代片断的序列。

将pLITMUS29的分别含有dhaB1、dhaB2、dhaB3、dhaBX和dhaT克隆的ORF的单一BglII-XbaI限制酶切片断，分别连接到通用表达载体pAEX的BglII-XbaI限制酶切位点上，使每个克隆的表达均置于黑曲霉glaA启动子和终止子的控制下。获得的载体根据其ORF进行命名，即：pAEX:dhaB1、pAEX:dhaB2、pAEX:dhaB3、pAEX:dhaBX和pAEX:dhaT。

黑曲霉的双表达盒载体：

从载体pAEX:dhaB1中分离含有dhaB1表达盒的单一SnaB1-StuI限制酶切片断(包括黑曲霉的glaA启动子、dhB1的ORF和终止子)，将该片断连接到pAEX:dhaB2载体的单一SnaB1限制酶切位点上。将含有构巢曲霉pyrG营养缺陷型选择标记的pBH2(Ward等，《(实验真菌学》13卷(Exp.Myc.)，289页(1989))的约2.2kb的ScaI-SmaI限制酶切片断，连接到含有dhaB1和dhaB2表达盒的载体的单一StuI限制酶切位点上，这一载体命名为pAEX:B1+B2。

分别从pAEX:dhaB3和pAEX:dhaT载体中，分离含有dhaB3和dhaT完整表达盒的单一SpeI-HindIII限制酶切片断。将这两个表达盒片断同时按顺序连接到载体pUC18的单一HindIII限制酶切位点上，这一载体命名为pAEX:B3+T。

dhaB和dhaT基因在曲霉属中的转化、转化子分离、表达盒整合的证实和表达

应用(Campbell等的方法，“使用硝酸盐还原酶的同源niaD基因提高黑曲霉的转化效率”，《当代遗传》16卷，53-56页(1989))用两种表达载体pAEX:B1+B2和pAEX:B3+T共转化黑曲霉株FS1(pyrG-)。根据在不含尿嘧啶核苷的选择培养基上的生长能力选择转化子。用HindIII和SpeI消化转化子的基因组DNA，来释放预知分子量的片断，从而证明完整表达盒的整合。每种表达盒的检测通过分别使用单个基因的探针用Southern分析来完成。dhaB2蛋白的存在使用抗-dhaB抗体用Western分析进行检测。

每种ORF的表达按下述方法进行检测，将整合有pAEX:B1+B2和pAEX:B3+T载体的转化子培养在10％CLS培养基(玉米浆(50％固体)，10％(w/v)；NaH₂PO₄H₂O，1.0g/L；MgSO₄，0.50g/L；麦芽糖，100.0g/L；葡萄糖，10.0g/L；Mazu消泡剂，0.003％(v/v))中，作为种子培养物。按1/10体积将这种种子培养物转入MBM碳培养基(NaH₂PO₄，0.70g/L；K₂HPO₄，0.70g/L；KH₂PO₄，0.70g/L；MgSO₄7H₂O，1.40g/L；(NH₄)₂SO₄，10.5g/L；CaCl₂2H₂O，0.70g/L；NH₄NO₃，3.50g/L；柠檬酸钠，14g/L；FeCl₂4H₂O，1.0mg/L；ZnCl₂，5.87mg/L；CuCl₂H₂O，0.42mg/L；MnCl₂4H₂O，0.21mg/L；Na₂B₄O₇10H₂O，0.07mg/L；叶酸，0.174mg/L；吡哆醇HCl，6.12mg/L；核黄素，183mg/L；泛酸，23.60mg/L；烟酸，26.66mg/L；生物素，0.49mg/L；硫胺素HCl，1.39mg/L；麦芽糖，120.0g/L；羧苄青霉素，0.035mg/L；链霉素，0.035mg/L；吐温80，0.07％(w/v)；Mazu消泡剂，0.14％(v/v))中来诱导glaA启动子。从转化子培养物中分离mRNA(Fast Track 2 Kit，Invitrogen Corp.)，并用化学发光(Genius^®System，Boehringer-Mannheim)做Nouthern分析来检测每个基因的转录信息。使用每个dhaB和dhaTORF的基因片断作探针，用Nouthern杂交证明了摇瓶培养物中dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT的协同转录。

选择那些显示能转录所有转化基因的分离克隆，进一步用pAEX:dhaBX转化。用pAEX:dhaBX和pAA10(3.2kb，pUC18的含有构巢曲霉amdS选择标记的Acc1-Asp718限制酶切片断)共转化这些克隆。新转化的培养物在含有乙酰胺作为唯一碳源的培养基中进行选择。使用引物KpdhaBX-5′和KpdhaBX-3′(SEQ ID NO：45和46)，用PCR从基因组DNA中扩增dhaBX ORF，证明了能利用乙酰胺作为唯一碳源的转化子菌落含有整合的dhaBX ORF。

黑曲霉株FS1生产甘油

黑曲霉株FS1在10％CSL培养基中培养作为种子培养物，将种子培养物按1∶10的稀释比例转入MBM碳培养基+12％麦芽糖。培养物上清中含有6g/L的曲霉产生的甘油。甘油分析用HPLC进行。

重组黑曲霉生产1，3-丙二醇

曲霉发酵在一个总体积为15.5升的Biolafitte发酵罐中进行，开始的工作体积为8升，在发酵过程中增加到11升。有氧环境用700-800rpm的叶轮速率和1.1bar的负压、10升/分钟的通气速率来保证(有氧环境用％溶解氧(100％DO为大气压时的溶解氧)来定义，这一值用安装的DO-探针进行测量；35％DO被认为是有氧的最小值)。pH值用自动加入10％H₃PO₄或28％NH₄OH的方法维持在pH5.60。温度维持在32℃。

将下列组分分批加入罐内，121℃灭菌30分钟：2g/LNaH2PO4H₂O、17g/L(NH₄)₂SO₄、1g/L MgSO₄、2g/L吐温80、45g/L Promosoy-100(一种含70％蛋白的大豆浓缩物)、6g/L玉米浆(50％固体)、10g/L麦芽糖、和2g/L MAZU DF204(一种传统的消泡剂)。灭菌后，加入500克50％的Maltrin150原料，并同时加入羧苄青霉素和链霉素(均至终浓度为10mg/L)

取1升在装有10％CSL的摇瓶中生长了45小时、转化有两种表达载体pAEX:B1+B2和pAEX:B3+T的黑曲霉株(菌株TGR40)接种发酵罐。使培养物在有氧的情况下生长28小时，然后开始以0.8-1.0g/分钟的速率加入原料(50％Maltrin150溶液，加热灭菌)。让培养继续进行20小时，在这个过程中，由于细胞的O₂需求，％DO降至实际上为零(在发酵的剩余阶段，培养物维持在零至5％)。然后(接种后第48小时)，在8小时的一段时间内加入甘油直至终浓度为163g/L。Maltrin原料在接种后第97小时停止加入，负压和通气量分别降至0.2bar和4L/分钟(0.5vvm)，加入辅酶B₁₂至终浓度为10mg/L。当培养至122小时后，收集肉汤，离心，并在1L上清中加入0.2L的乙醇。

取1L去除细胞的发酵肉汤在真空下蒸馏，产生约60mL的黑色浆状物。将这种浆状物离心，收集到约40mL的液体上清。然后用40mL乙醇处理这种液体，以通过离心来去除残留的固体。从倾析的液体中取少量作样品用HPLC进行分析，发现其中含有1，3-丙二醇：1，3-丙二醇用GC/MS得以证实。

本发明的申请人已经申请保藏了一个重组黑曲霉株TGR-10-13(ATCC)，该菌株含有编码dhaB(1-3)、dhaBx和dhaT的DNA片断。

                         实施例23

        用重组黑曲霉从麦芽糖生产1，3-丙二醇

曲霉发酵在一个总体积为15.5升的Biolafitte发酵罐中进行，开始的工作体积为8升，在发酵过程中增加到11升。有氧环境用700-800rpm的叶轮速率和1.1bar的负压、10升/分钟的通气速率来保证(有氧环境用％溶解氧(100％DO为大气压时的溶解氧)来定义，这一值用安装的DO-探针进行测量；35％DO被认为是有氧的最小值)。pH值用自动加入10％H₃PO₄或28％NH₄OH的方法维持在pH5.60。温度维持在32℃。

将下列组分分批加入罐内，121℃灭菌30分钟：2g/LNaH₂PO₄H₂O、17g/L(NH₄)₂SO₄、1g/L MgSO₄、2g/L吐温80、45g/LPromosoy-100(一种含70％蛋白的大豆浓缩物)、6g/L玉米浆(50％固体)、10g/L麦芽糖、和2g/L MAZU DF204(一种传统的消泡剂)。灭菌后，加入500克50％的Maltrin150原料，并同时加入羧苄青霉素和链霉素(均至终浓度为10mg/L)。

取1升在装有10％CSL(见实施例22)的摇瓶中生长了40-48小时的转化有dhaB1、dhaB2、dhaB3、dhaB4、和dhaT基因的黑曲霉株接种发酵罐。使培养物生长30-35小时，然后开始以1g/分钟的速率加入原料(50％Maltrin150溶液，加热灭菌)。让培养在O₂限制条件下(％DO为零，完全通气)继续进行5小时。然后停止加入Maltrin原料，当测量到上清中的葡萄糖实际上为零时，将rpm降低至150，BP降低至0.2，并停止通气。向发酵罐中以7L/分钟的速率充入无氧气体混合混合物(5％H₂，5％CO₂，90％N2)共30分钟。然后关闭气体的进口和出口，BP维持在0.4bar，加入辅酶B₁₂至终浓度为5mg/L。最后，取肉汤样品离心，制备用于HPLC和GC分析的上清。在上清中检测到了1，3-丙二醇。

实施例2路氏乳杆菌(ATCC23272)由非甘油底物生产1.3-丙二醇

路氏乳杆菌(ATCC23272)维持在MRS(Difco，Detroit，MI)平板上。将平板上的菌落接种到装有70mL补加了25mM NaHCO₃的乳杆菌MRS肉汤(Difco#0881-17)的250mL锥形瓶中。将瓶在无氧的气体环境(5-7％H₂，2-8％CO₂，85-93％N₂)下32℃温育。

对乳杆菌MRS肉汤做HPLC分析显示了甘油组分的保留时间。将乳杆菌MRS肉汤用碱煮沸法处理后，用HPLC和酶促试验分析其甘油含量。在多数情况下，在起始培养基中可检测到0.25g/L的甘油，如果所有这些甘油都转化为1，3-丙二醇。0.21g/L的1，3-丙二醇可以说是由甘油生产而来的。

经过10天的温育，从路氏乳杆菌培养瓶中取样，用HPLC和GC-MS进行分析，并与起始培养基样品进行比较。用培养基中存在的甘油校正后，1.35g/L的1，3-丙二醇是路氏乳杆菌由非甘油的底物生产而来的。

                          序列表

(1)一般信息

(i)申请人：

  (A)名称：E.I.DUPONT DE NEMOURS AND COMPANY

  (B)街道：1007 MARKET STREET

  (C)城市：WILMINGTON

  (D)州：DELAWARE

  (E)国家：U.S.A.

  (F)邮政编码(ZIP)：19898

  (G)电话：302-892-8112

  (H)传真：302-773-0164

(i)申请人：

  (A)名称：GENENCOR INTERNATIONAL，INC．

  (B)街道：4 CAMBRIDGE PLACE

           1870 SOUTH WINTON ROAD

  (C)城市：ROCHESTER

  (D)州：NEW YORK

  (E)国家：U.S.A.

  (F)邮政编码(ZIP)：14618

  (G)电话：

  (H)传真：

(ii)发明名称：利用单一微生物将可发酵碳源生物转化为1，3-丙二醇

(iii)序列数：46

(iv)计算机可读形式

  (A)介质类型：3.50英寸软盘

  (B)计算机：IBM

  (C)操作系统：MICROSOFT WINDOWS 3.1

  (D)软件：MICROSOFT WORD 6.0

(v)现申请数据：

  (A)申请号：

  (B)申请日：

  (C)分类号：

(vi)在先申请数据：

  (A)申请号：08/440,293

  (B)申请日：1995年5月12日

(vii)代理人/代理机构信息：

  (A)姓名：LINDA AXAMETHY FLOYD

  (B)登记号：33，692

  (C)参考/备案号码：CR-9715-B

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：12145碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：1：

GTCGACCACC ACGGTGGTGA CTTTAATGCC GCTCTCATGC AGCAGCTCGG TGGCGGTCTC       60

AAAATTCAGG ATGTCGCCGG TATAGTTTTT GATAATCAGC AAGACGCCTT CGCCGCCGTC      120

AATTTGCATC GCGCATTCAA ACATTTTGTC CGGCGTCGGC GAGGTGAATA TTTCCCCCGG      180

ACAGGCGCCG GAGAGCATGC CCTGGCCGAT ATAGCCGCAG TGCATCGGTT CATGTCCGCT      240

GCCGCCGCCG GAGAGCAGGG CCACCTTGCC AGCCACCGGC GCGTCGGTGC GGGTCACATA      300

CAGCGGGTCC TGATGCAGGG TCAGCTGCGG ATGGGCTTTA GCCAGCCCCT GTAATTGTTC      360

ATTCAGTACA TCTTCAACAC GGTTAATCAG CTTTTTCATT ATTCAGTGCT CCGTTGGAGA      420

AGGTTCGATG CCGCCTCTCT GCTGGCGGAG GCGGTCATCG CGTAGGGGTA TCGTCTGACG      480

GTGGAGCGTG CCTGGCGATA TGATGATTCT GGCTGAGCGG ACGAAAAAAA GAATGCCCCG      540

ACGATCGGGT TTCATTACGA AACATTGCTT CCTGATTTTG TTTCTTTATG GAACGTTTTT      600

GCTGAGGATA TGGTGAAAAT GCGAGCTGGC GCGCTTTTTT TCTTCTGCCA TAAGCGGCGG      660

TCAGGATAGC CGGCGAAGCG GGTGGGAAAA AATTTTTTGC TGATTTTCTG CCGACTGCGG      720

GAGAAAAGGC GGTCAAACAC GGAGGATTGT AAGGGCATTA TGCGGCAAAG GAGCGGATCG      780

GGATCGCAAT CCTGACAGAG ACTAGGGTTT TTTGTTCCAA TATGGAACGT AAAAAATTAA      840

CCTGTGTTTC ATATCAGAAC AAAAAGGCGA AAGATTTTTT TGTTCCCTGC CGGCCCTACA      900

GTGATCGCAC TGCTCCGGTA CGCTCCGTTC AGGCCGCGCT TCACTGGCCG GCGCGGATAA      960

CGCCAGGGCT CATCATGTCT ACATGCGCAC TTATTTGAGG GTGAAAGGAA TGCTAAAAGT     1020

TATTCAATCT CCAGCCAAAT ATCTTCAGGG TCCTGATGCT GCTGTTCTGT TCGGTCAATA     1080

TGCCAAAAAC CTGGCGGAGA GCTTCTTCGT CATCGCTGAC GATTTCGTAA TGAAGCTGGC     1140

GGGAGAGAAA GTGGTGAATG GCCTGCAGAG CCACGATATT CGCTGCCATG CGGAACGGTT     1200

TAACGGCGAA TGCAGCCATG CGGAAATCAA CCGTCTGATG GCGATTTTGC AAAAACAGGG     1260

CTGCCGCGGC GTGGTCGGGA TCGGCGGTGG TAAAACCCTC GATACCGCGA AGGCGATCGG     1320

TTACTACCAG AAGCTGCCGG TGGTGGTGAT CCCGACCATC GCCTCGACCG ATGCGCCAAC     1380

CAGCGCGCTG TCGGTGATCT ACACCGAAGC GGGCGAGTTT GAAGAGTATC TGATCTATCC     1440

GAAAAACCCG GATATGGTGG TGATGGACAC GGCGATTATC GCCAAAGCGC CGGTACGCCT     1500

GCTGGTCTCC GGCATGGGCG ATGCGCTCTC CACCTGGTTC GAGGCCAAAG CTTGCTACGA     1560

TGCGCGCGCC ACCAGCATGG CCGGAGGACA GTCCACCGAG GCGGCGCTGA GCCTCGCCCG     1620

CCTGTGCTAT GATACGCTGC TGGCGGAGGG CGAAAAGGCC CGTCTGGCGG CGCAGGCCGG     1680

GGTAGTGACC GAAGCGCTGG AGCGCATCAT CGAGGCGAAC ACTTACCTCA GCGGCATTGG     1740

CTTTGAAAGC AGTGGCCTGG CCGCTGCCCA TGCAATCCAC AACGGTTTCA CCATTCTTGA     1800

AGAGTGCCAT CACCTGTATC ACGGTGAGAA AGTGGCCTTC GGTACCCTGG CGCAGCTGGT     1860

GCTGCAGAAC AGCCCGATGG ACGAGATTGA AACGGTGCAG GGCTTCTGCC AGCGCGTCGG     1920

CCTGCCGGTG ACGCTCGCGC AGATGGGCGT CAAAGAGGGG ATCGACGAGA AAATCGCCGC     1980

GGTGGCGAAA GCTACCTGCG CGGAAGGGGA AACCATCCAT AATATGCCGT TTGCGGTGAC     2040

CCCGGAGAGC GTCCATGCCG CTATCCTCAC CGCCGATCTG TTAGGCCAGC AGTGGCTGGC     2100

GCGTTAATTC GCGGTGGCTA AACCGCTGGC CCAGGTCAGC GGTTTTTCTT TCTCCCCTCC     2160

GGCAGTCGCT GCCGGAGGGG TTCTCTATGG TACAACGCGG AAAAGGATAT GACTGTTCAG     2220

ACTCAGGATA CCGGGAAGGC GGTCTCTTCC GTCATTGCCC AGTCATGGCA CCGCTGCAGC     2280

AAGTTTATGC AGCGCGAAAC CTGGCAAACG CCGCACCAGG CCCAGGGCCT GACCTTCGAC     2340

TCCATCTGTC GGCGTAAAAC CGCGCTGCTC ACCATCGGCC AGGCGGCGCT GGAAGACGCC     2400

TGGGAGTTTA TGGACGGCCG CCCCTGCGCG CTGTTTATTC TTGATGAGTC CGCCTGCATC     2460

CTGAGCCGTT GCGGCGAGCC GCAAACCCTG GCCCAGCTGG CTGCCCTGGG ATTTCGCGAC     2520

GGCAGCTATT GTGCGGAGAG CATTATCGGC ACCTGCGCGC TGTCGCTGGC CGCGATGCAG     2580

GGCCAGCCGA TCAACACCGC CGGCGATCGG CATTTTAAGC AGGCGCTACA GCCATGGAGT     2640

TTTTGCTCGA CGCCGGTGTT TGATAACCAC GGGCGGCTGT TCGGCTCTAT CTCGCTTTGC     2700

TGTCTGGTCG AGCACCAGTC CAGCGCCGAC CTCTCCCTGA CGCTGGCCAT CGCCCGCGAG     2760

GTGGGTAACT CCCTGCTTAC CGACAGCCTG CTGGCGGAAT CCAACCGTCA CCTCAATCAG     2820

ATGTACGGCC TGCTGGAGAG CATGGACGAT GGGGTGATGG CGTGGAACGA ACAGGGCGTG     2880

CTGCAGTTTC TCAATGTTCA GGCGGCGAGA CTGCTGCATC TTGATGCTCA GGCCAGCCAG     2940

GGGAAAAATA TCGCCGATCT GGTGACCCTC CCGGCGCTGC TGCGCCGCGC CATCAAACAC     3000

GCCCGCGGCC TGAATCACGT CGAAGTCACC TTTGAAAGTC AGCATCAGTT TGTCGATGCG     3060

GTCATCACCT TAAAACCGAT TGTCGAGGCG CAAGGCAACA GTTTTATTCT GCTGCTGCAT     3120

CCGGTGGAGC AGATGCGGCA GCTGATGACC AGCCAGCTCG GTAAAGTCAG CCACACCTTT    3180

GAGCAGATGT CTGCCGACGA TCCGGAAACC CGACGCCTGA TCCACTTTGG CCGCCAGGCG    3240

GCGCGCGGCG GCTTCCCGGT GCTACTGTGC GGCGAAGAGG GGGTCGGGAA AGAGCTGCTG    3300

AGCCAGGCTA TTCACAATGA AAGCGAACGG GCGGGCGGCC CCTACATCTC CGTCAACTGC    3360

CAGCTATATG CCGACAGCGT GCTGGGCCAG GACTTTATGG GCAGCGCCCC TACCGACGAT    3420

GAAAATGGTC GCCTGACCCG CCTTGAGCTG GCCAACGGCG GCACCCTGTT TCTGGAAAAG    3480

ATCGAGTATC TGGCGCCGGA GCTGCAGTCG GCTCTGCTGC AGGTGATTAA GCAGGGCGTG    3540

CTCACCCGCC TCGACGCCCG GCGCCTGATC CCGGTGGATG TGAAGGTGAT TGCCACCACC    3600

ACCGTCGATC TGGCCAATCT GGTGGAACAG AACCGCTTTA GCCGCCAGCT GTACTATGCG    3660

CTGCACTCCT TTGAGATCGT CATCCCGCCG CTGCGCGCCC GACGCAACAG TATTCCGTCG    3720

CTGGTGCATA ACCGGTTGAA GAGCCTGGAG AAGCGTTTCT CTTCGCGACT GAAAGTGGAC    3780

GATGACGCGC TGGCACAGCT GGTGGCCTAC TCGTGGCCGG GGAATGATTT TGAGCTCAAC    3840

AGCGTCATTG AGAATATCGC CATCAGCAGC GACAACGGCC ACATTCGCCT GAGTAATCTG    3900

CCGGAATATC TCTTTTCCGA GCGGCCGGGC GGGGATAGCG CGTCATCGCT GCTGCCGGCC    3960

AGCCTGACTT TTAGCGCCAT CGAAAAGGAA GCTATTATTC ACGCCGCCCG GGTGACCAGC    4020

GGGCGGGTGC AGGAGATGTC GCAGCTGCTC AATATCGGCC GCACCACCCT GTGGCGCAAA    4080

ATGAAGCAGT ACGATATTGA CGCCAGCCAG TTCAAGCGCA AGCATCAGGC CTAGTCTCTT    4140

CGATTCGCGC CATGGAGAAC AGGGCATCCG ACAGGCGATT GCTGTAGCGT TTGAGCGCGT    4200

CGCGCAGCGG ATGCGCGCGG TCCATGGCCG TCAGCAGGCG TTCGAGCCGA CGGGACTGGG    4260

TGCGCGCCAC GTGCAGCTGG GCAGAGGCGA GATTCCTCCC CGGGATCACG AACTGTTTTA    4320

ACGGGCCGCT CTCGGCCATA TTGCGGTCGA TAAGCCGCTC CAGGGCGGTG ATCTCCTCTT    4380

CGCCGATCGT CTGGCTCAGG CGGGTCAGGC CCCGCGCATC GCTGGCCAGT TCAGCCCCCA    4440

GCACGAACAG CGTCTGCTGA ATATGGTGCA GGCTTTCCCG CAGCCCGGCG TCGCGGGTCG    4500

TGGCGTAGCA GACGCCCAGC TGGGATATCA GTTCATCGAC GGTGCCGTAG GCCTCGACGC    4560

GAATATGGTC TTTCTCGATG CGGCTGCCGC CGTACAGGGC GGTGGTGCCT TTATCCCCGG    4620

TGCGGGTATA GATACGATAC ATTCAGTTTC TCTCACTTAA CGGCAGGACT TTAACCAGCT    4680

GCCCGGCGTT GGCGCCGAGC GTACGCAGTT GATCGTCGCT ATCGGTGACG TGTCCGGTAG    4740

CCAGCGGCGC GTCCGCCGGC AGCTGGGCAT GAGTGAGGGG TATCTCGCCG GACGCGCTGA    4800

GCCCGATACC CACCCGCAGG GGCGAGCTTC TGGCCGCCAG GGCGCCCAGC GCAGCGGCGT    4860

CACCGCCTCC GTCATAGGTT ATGGTCTGGC AGGGGACCCC CTGCTCCTCC AGCCCCCAGC     4920

ACAGCTCATT GATGGCGCCG GCATGGTGCC CGCGCGGATC GTAAAACAGG CGTACGCCTG     4980

GCGGTGAAAG CGACATGACG GTCCCCTCGT TAACACTCAG AATGCCTGGC GGAAAATCGC     5040

GGCAATCTCC TGCTCGTTGC CTTTACGCGG GTTCGAGAAC GCATTGCCGT CTTTTAGAGC     5100

CATCTCCGCC ATGTAGGGGA AGTCGGCCTC TTTTACCCCC AGATCGCGCA GATGCTGCGG     5160

AATACCGATA TCCATCGACA GACGCGTGAT AGCGGCGATG GCTTTTTCCG CCGCGTCGAG     5220

AGTGGACAGT CCGGTGATAT TTTGGCCCAT CAGTTCAGCG ATATCGGCGA ATTTCTGCGG     5280

GTTGGCGATC AGGTTGTAGC GCGCCACATG CGGCAGCAGG ACAGCGTTGG CCACGCCGTG     5340

CGGCATGTCG TACAGGCCGC CCAGCTGGTG CGCCATGGCG TGCACGTAGC CGAGGTTGGC     5400

GTTATTGAAA GCCATCCCGG CCAGCAGAGA AGCATAGGCC ATGTTTTCCC GCGCCTGCAG     5460

ATTGCTGCCG AGGGCCACGG CCTGGCGCAG GTTGCGGGCG ATGAGGCGGA TCGCCTGCAT     5520

GGCGGCGGCG TCCGTCACCG GGTTAGCGTC TTTGGAGATA TAGGCCTCTA CGGCGTGGGT     5580

CAGGGCATCC ATCCCGGTCG CCGCGGTCAG GGCGGCCGGT TTACCGATCA TCAGCAGTGG     5640

ATCGTTGATA GAGACCGACG GCAGTTTGCG CCAGCTGACG ATCACAAACT TCACTTTGGT     5700

TTCGGTGTTG GTCAGGACGC AGTGGCGGGT GACCTCGCTG GCGGTGCCGG CGGTGGTATT     5760

GACCGCGACG ATAGGCGGCA GCGGGTTGGT CAGGGTCTCG ATTCCGGCAT ACTGGTACAG     5820

ATCGCCCTCA TGGGTGGCGG CGATGCCGAT GCCTTTGCCG CAATCGTGCG GGCTGCCGCC     5880

GCCCACGGTG ACGATGATGT CGCACTGTTC GCGGCGAAAC ACGGCGAGGC CGTCGCGCAC     5940

GTTGGTGTCT TTCGGGTTCG GCTCGACGCC GTCAAAGATC GCCACCTCGA TCCCGGCCTC     6000

CCGCAGATAA TGCAGGGTTT TGTCCACCGC GCCATCTTTA ATTGCCCGCA GGCCTTTGTC     6060

GGTGACCAGC AGGGCTTTTT TCCCCCCCAG CAGCTGGCAG CGTTCGCCGA CTACGGAAAT     6120

GGCGTTGGGG CCAAAAAAGT TAACGTTTGG CACCAGATAA TCAAACATAC GATAGCTCAT     6180

AATATACCTT CTCGCTTCAG GTTATAATGC GGAAAAACAA TCCAGGGCGC ACTGGGCTAA     6240

TAATTGATCC TGCTCGACCG TACCGCCGCT AACGCCGACG GCGCCAATTA CCTGCTCATT     6300

AAAAATAACT GGCAGGCCGC CGCCAAAAAT AATAATTCGC TGTTGGTTGG TTAGCTGCAG     6360

ACCGTACAGA GATTGTCCTG GCTGGACCGC TGACGTAATT TCATGGGTAC CTTGCTTCAG     6420

GCTGCAGGCG CTCCAGGCTT TATTCAGGGA AATATCGCAG CTGGAGACGA AGGCCTCGTC     6480

CATCCGCTGG ATAAGCAGCG TGTTGCCTCC GCGGTCAACT ACGGAAAACA CCACCGCCAC     6540

GTTGATCTCA GTGGCTTTTT TTTCCACCGC CGCCGCCATT TGCTGGGCGG CGGCCAGGGT     6600

GATTGTCTGA ACTTGTTGGC TCTTGTTCAT CATTCTCTCC CGCACCAGGA TAACGCTGGC    6660

GCGAATAGTC AGTAGGGGGC GATAGTAAAA AACTATTACC ATTCGGTTGG CTTGCTTTAT    6720

TTTTGTCAGC GTTATTTTGT CGCCCGCCAT GATTTAGTCA ATAGGGTTAA AATAGCGTCG    6780

GAAAAACGTA ATTAAGGGCG TTTTTTATTA ATTGATTTAT ATCATTGCGG GCGATCACAT    6840

TTTTTATTTT TGCCGCCGGA GTAAAGTTTC ATAGTGAAAC TGTCGGTAGA TTTCGTGTGC    6900

CAAATTGAAA CGAAATTAAA TTTATTTTTT TCACCACTGG CTCATTTAAA GTTCCGCTAT    6960

TGCCGGTAAT GGCCGGGCGG CAACGACGCT GGCCCGGCGT ATTCGCTACC GTCTGCGGAT    7020

TTCACGTTTT GACCCGATGA ACAATGAAAA GATCAAAACG ATTTGCAGTA CTGGCCCAGC    7080

GCCCCGTCAA TCAGGACGGG CTGATTGGCG AGTGGCCTGA AGAGGGGCTG ATCGCCATGG    7140

ACAGCCCCTT TGACCCGGTC TCTTCAGTAA AAGTGGACAA CGGTCTGATC GTCGAACTGG    7200

ACGGCAAACG CCGGGACCAG TTTGACATGA TCGACCGATT TATCGCCGAT TACGCGATCA    7260

ACGTTGAGCG CACAGAGCAG GCAATGCGCC TGGAGGCGGT GGAAATAGCC CGTATGCTGG    7320

TGGATATTCA CGTCAGCCGG GAGGAGATCA TTGCCATCAC TACCGCCATC ACGCCGGCCA    7380

AAGCGGTCGA GGTGATGGCG CAGATGAACG TGGTGGAGAT GATGATGGCG CTGCAGAAGA    7440

TGCGTGCCCG CCGGACCCCC TCCAACCAGT GCCACGTCAC CAATCTCAAA GATAATCCGG    7500

TGCAGATTGC CGCTGACGCC GCCGAGGCCG GGATCCGCGG CTTCTCAGAA CAGGAGACCA    7560

CGGTCGGTAT CGCGCGCTAC GCGCCGTTTA ACGCCCTGGC GCTGTTGGTC GGTTCGCAGT    7620

GCGGCCFCCC CGGCGTGTTG ACGCAGTGCT CGGTGGAAGA GGCCACCGAG CTGGAGCTGG    7680

GCATGCGTGG CTTAACCAGC TACGCCGAGA CGGTGTCGGT CTACGGCACC GAAGCGGTAT    7740

TTACCGACGG CGATGATACG CCGTGGTCAA AGGCGTTCCT CGCCTCGGCC TACGCCTCCC    7800

GCGGGTTGAA AATGCGCTAC ACCTCCGGCA CCGGATCCGA AGCGCTGATG GGCTATTCGG    7860

AGAGCAAGTC GATGCTCTAC CTCGAATCGC GCTGCATCTT CATTACTAAA GGCGCCGGGG    7920

TTCAGGGACT GCAAAACGGC GCGGTGAGCT GTATCGGCAT GACCGGCGCT GTGCCGTCGG    7980

GCATTCGGGC GGTGCTGGCG GAAAACCTGA TCGCCTCTAT GCTCGACCTC GAAGTGGCGT    8040

CCGCCAACGA CCAGACTTTC TCCCACTCGG ATATTCGCCG CACCGCGCGC ACCCTGATGC    8100

AGATGCTGCC GGGCACCGAC TTTATTTTCT CCGGCTACAG CGCGGTGCCG AACTACGACA    8160

ACATGTTCGC CGGCTCGAAC TTCGATGCGG AAGATTTTGA TGATTACAAC ATCCTGCAGC    8220

GTGACCTGAT GGTTGACGGC GGCCTGCGTC CGGTGACCGA GGCGGAAACC ATTGCCATTC    8280

GCCAGAAAGC GGCGCGGGCG ATCCAGGCGG TTTTCCGCGA GCTGGGGCTG CCGCCAATCG    8340

CCGACGAGGA GGTGGAGGCC GCCACCTACG CGCACGGCAG CAACGAGATG CCGCCGCGTA   8400

ACGTGGTGGA GGATCTGAGT GCGGTGGAAG AGATGATGAA GCGCAACATC ACCGGCCTCG   8460

ATATTGTCGG CGCGCTGAGC CGCAGCGGCT TTGAGGATAT CGCCAGCAAT ATTCTCAATA   8520

TGCTGCGCCA GCGGGTCACC GGCGATTACC TGCAGACCTC GGCCATTCTC GATCGGCAGT   8580

TCGAGGTGGT GAGTGCGGTC AACGACATCA ATGACTATCA GGGGCCGGGC ACCGGCTATC   8640

GCATCTCTGC CGAACGCTGG GCGGAGATCA AAAATATTCC GGGCGTGGTT CAGCCCGACA   8700

CCATTGAATA AGGCGGTATT CCTGTGCAAC AGACAACCCA AATTCAGCCC TCTTTTACCC   8760

TGAAAACCCG CGAGGGCGGG GTAGCTTCTG CCGATGAACG CGCCGATGAA GTGGTGATCG   8820

GCGTCGGCCC TGCCTTCGAT AAACACCAGC ATCACACTCT GATCGATATG CCCCATGGCG   8880

CGATCCTCAA AGAGCTGATT GCCGGGGTGG AAGAAGAGGG GCTTCACGCC CGGGTGGTGC   8940

GCATTCTGCG CACGTCCGAC GTCTCCTTTA TGGCCTGGGA TGCGGCCAAC CTGAGCGGCT   9000

CGGGGATCGG CATCGGTATC CAGTCGAAGG GGACCACGGT CATCCATCAG CGCGATCTGC   9060

TGCCGCTCAG CAACCTGGAG CTGTTCTCCC AGGCGCCGCT GCTGACGCTG GAGACCTACC   9120

GGCAGATTGG CAAAAACGCT GCGCGCTATG CGCGCAAAGA GTCACCTTCG CCGGTGCCGG   9180

TGGTGAACGA TCAGATGGTG CGGCCGAAAT TTATGGCCAA AGCCGCGCTA TTTCATACA    9240

AAGAGACCAA ACATGTGGTG CAGGACGCCG AGCCCGTCAC CCTGCACATC GACTTAGTAA   9300

GGGAGTGACC ATGAGCGAGA AAACCATGCG CGTGCAGGAT TATCCGTTAG CCACCCGCTG   9360

CCCGGAGCAT ATCCTGACGC CTACCGGCAA ACCATTGACC GATATTACCC TCGAGAAGGT   9420

GCTCTCTGGC GAGGTGGGCC CGCAGGATGT GCGGATCTCC CGCCAGACCC TTGAGTACCA   9480

GGCGCAGATT GCCGAGCAGA TGCAGCGCCA TGCGGTGGCG CGCAATTTCC GCCGCGCGGC   9540

GGAGCTTATC GCCATTCCTG ACGAGCGCAT TCTGGCTATC TATAACGCGC TGCGCCCGTT   9600

CCGCTCCTCG CAGGCGGAGC TGCTGGCGAT CGCCGACGAG CTGGAGCACA CCTGGCATGC   9660

GACAGTGAAT GCCGCCTTTG TCCGGGAGTC GGCGGAAGTG TATCAGCAGC GGCATAAGCT   9720

GCGTAAAGGA AGCTAAGCGG AGGTCAGCAT GCCGTTAATA GCCGGGATTG ATATCGGCAA   9780

CGCCACCACC GAGGTGGCGC TGGCGTCCGA CTACCCGCAG GCGAGGGCGT TTGTTGCCAG   9840

CGGGATCGTC GCGACGACGG GCATGAAAGG GACGCGGGAC AATATCGCCG GGACCCTCGC   9900

CGCGCTGGAG CAGGCCCTGG CGAAAACACC GTGGTCGATG AGCGATGTCT CTCGCATCTA   9960

TCTTAACGAA GCCGCGCCGG TGATTGGCGA TGTGGCGATG GAGACCATCA CCGAGACCAT  10020

TATCACCGAA TCGACCATGA TCGGTCATAA CCCGCAGACG CCGGGCGGGG TGGGCGTTGG  10080

CGTGGGGACG ACTATCGCCC TCGGGCGGCT GGCGACGCTG CCGGCGGCGC AGTATGCCGA  10140

GGGGTGGATC GTACTGATTG ACGACGCCGT CGATTTCCTT GACGCCGTGT GGTGGCTCAA  10200

TGAGGCGCTC GACCGGGGGA TCAACGTGGT GGCGGCGATC CTCAAAAAGG ACGACGGCGT  10260

GCTGGTGAAC AACCGCCTGC GTAAAACCCT GCCGGTGGTG GATGAAGTGA CGCTGCTGGA  10320

GCAGGTCCCC GAGGGGGTAA TGGCGGCGGT GGAAGTGGCC GCGCCGGGCC AGGTGGTGCG  10380

GATCCTGTCG AATCCCTACG GGATCGCCAC CTTCTTCGGG CTAAGCCCGG AAGAGACCCA  10440

GGCCATCGTC CCCATCGCCC GCGCCCTGAT TGGCAACCGT TCCGCGGTGG TGCTCAAGAC  10500

CCCGCAGGGG GATGTGCAGT CGCGGGTGAT CCCGGCGGGC AACCTCTACA TTAGCGGCGA  10560

AAAGCGCCGC GGAGAGGCCG ATGTCGCCGA GGGCGCGGAA GCCATCATGC AGGCGATGAG  10620

CGCCTGCGCT CCGGTACGCG ACATCCGCGG CGAACCGGGC ACCCACGCCG GCGGCATGCT  10680

TGAGCGGGTG CGCAAGGTAA TGGCGTCCCT GACCGGCCAT GAGATGAGCG CGATATACAT  10740

CCAGGATCTG CTGGCGGTGG ATACGTTTAT TCCGCGCAAG GTGCAGGGCG GGATGGCCGG  10800

CGAGTGCGCC ATGGAGAATG CCGTCGGGAT GGCGGCGATG GTGAAAGCGG ATCGTCTGCA  10860

AATGCAGGTT ATCGCCCGCG AACTGAGCGC CCGACTGCAG ACCGAGGTGG TGGTGGGCGG  10920

CGTGGAGGCC AACATGGCCA TCGCCGGGGC GTTAACCACT CCCGGCTGTG CGGCGCCGCT  10980

GGCGATCCTC GACCTCGGCG CCGGCTCGAC GGATGCGGCG ATCGTCAACG CGGAGGGGCA  11040

GATAACGGCG GTCCATCTCG CCGGGGCGGG GAATATGGTC AGCCTGTTGA TTAAAACCGA  11100

GCTGGGCCTC GAGGATCTTT CGCTGGCGGA AGCGATAAAA AAATACCCGC TGGCCAAAGT  11160

GGAAAGCCTG TTCAGTATTC GTCACGAGAA TGGCGCGGTG GAGTTCTTTC GGGAAGCCCT  11220

CAGCCCGGCG GTGTTCGCCA AAGTGGTGTA CATCAAGGAG GGCGAACTGG TGCCGATCGA  11280

TAACGCCAGC CCGCTGGAAA AAATTCGTCT CGTGCGCCGG CAGGCGAAAG AGAAAGTGTT  11340

TGTCACCAAC TGCCTGCGCG CGCTGCGCCA GGTCTCACCC GGCGGTTCCA TTCGCGATAT  11400

CGCCTTTGTG GTGCTGGTGG GCGGCTCATC GCTGGACTTT GAGATCCCGC AGCTTATCAC  11460

GGAAGCCTTG TCGCACTATG GCGTGGTCGC CGGGCAGGGC AATATTCGGG GAACAGAAGG  11520

GCCGCGCAAT GCGGTCGCCA CCGGGCTGCT ACTGGCCGGT CAGGCGAATT AAACGGGCGC  11580

TCGCGCCAGC CTCTCTCTTT AACGTGCTAT TTCAGGATGC CGATAATGAA CCAGACTTCT  11640

ACCTTAACCG GGCAGTGCGT GGCCGAGTTT CTTGGCACCG GATTGCTCAT TTTCTTCGGC  11700

GCGGGCTGCG TCGCTGCGCT GCGGGTCGCC GGGGCCAGCT TTGGTCAGTG GGAGATCAGT  11760

ATTATCTGGG GCCTTGGCGT CGCCATGGCC ATCTACCTGA CGGCCGGTGT CTCCGGCGCG  11820

CACCTAAATC CGGCGGTGAC CATTGCCCTG TGGCTGTTCG CCTGTTTTGA ACGCCGCAAG  11880

GTGCTGCCGT TTATTGTTGC CCAGACGGCC GGGGCCTTCT GCGCCGCCGC GCTGGTGTAT  11940

GGGCTCTATC GCCAGCTGTT TCTCGATCTT GAACAGAGTC AGCATATCGT GCGCGGCACT  12000

GCCGCCAGTC TTAACCTGGC CGGGGTCTTT TCCACGTACC CGCATCCACA TATCACTTTT  12060

ATACAAGCGT TTGCCGTGGA GACCACCATC ACGGCAATCC TGATGGCGAT GATCATGGCC  12120

CTGACCGACG ACGGCAACGG AATTC                                        12145

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：30碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：2：

GGGAATTCAT GAAAAGATCA AAACGATTTG

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：29碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：3：

GCGAATTCTT ATTCAATGGT GTCGGGCTG

(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：30碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：4：

GCGAATTCAT GCAACAGACA ACCCAAATTC

(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：25碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：5：

GCGAATTCAC TCCCTTACTA AGTCG

(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：27碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：6：

GCGAATTCAT GAGCTATCGT ATGTTTG

(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：28碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：7：

GCGAATTCAG AATGCCTGGC GGAAAATC

(2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：28碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：8：

GGGAATTCAT GAGCGAGAAA ACCATGCG

(2)SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：27碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：9：

GCGAATTCTT AGCTTCCTTT ACGCAGC

(2)SEQ ID NO：10的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：94碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：10：

AGCTTAGGAG TCTAGAATAT TGAGCTCGAA TTCCCGGGCA

TGCGGTACCG GATCCAGAAA AAAGCCCGCA CCTGACAGTG

CGGGCTTTTT TTTT

(2)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：33碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：11：

GGCCAAGCTT AAGGAGGTTA ATTAAATGAA AAG

(2)SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：26碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：12：

GCTC TAGATT ATTCAATGGT GTCGGG

(2)SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：42碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：13：

GCGCCGTCTA GAATTATGAG CTATCGTATG TTTGATTATC TG

(2)SEQ ID NO：14的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：36碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：14：

TCTGATACGG GATCCTCAGA ATGCCTGGCG GAAAAT

(2)SEQ ID NO：15的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：181碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：15：

CGATCTGTGC TGTTTGCCAC GGTATGCAGC ACCAGCGCGA

GATTATGGGC TCGCACGCTC GACTGTCGGA CGGGGGCACT

GGAACGAGAA GTCAGGCGAG CCGTCACGCC CTTGACAATG

CCACATCCTG AGCAAATAAT TCAACCACTA AACAAATCAA

CCGCGTTTCC CGGAGGTAAC C

(2)SEQ ID NO：16的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：149碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：16：

CGATCTGTGC TGTTTGCCAC GGTATGCAGC ACCAGCGCGA

GATTATGGGC TCGCACGCTC GACTGTCGGA CGGGGGCACT

GGAACATGCC ACATCCTGAG CAAATAATTC AACCACTAAA

CAAATCAACC GCGTTTCCCG GAGGTAACC

(2)SEQ ID NO：17的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：33碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：17：

GGAATTCACT AGTCGATCTG TGCTGTTTGC CAC

(2)SEQ ID NO：18的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：33碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：18：

GGGGAAGCTT GGTTACCTCC GGGAAACGCG GTT

(2)SEQ ID NO：19的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：16碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：19：

TCGACCACAA GGAGGA

(2)SEQ ID NO：20的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：16碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：20：

CTAGTCCTCC TTGTGG

(2)SEQ ID NO：21的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：45碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：21：

ACTGGCCGTC GTTTTACTCG AGTCGTGACT GGGAAAACCC

TGGCG

(2)SEQ ID NO：22的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：14碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：22：

AATTCAAAGG AGGT

(2)SEQ ID NO：23的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：14碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：23：

CTAGACCTCC TTTG

(2)SEQ ID NO：24的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：19碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：24：

AGCTTGTCGA CCATGAAAA

(2)SEQ ID NO：25的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：19碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：25：

GATCTTTTCA TGGTCGACA

(2)SEQ ID NO：26的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：13碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：26：

TCGACCAGGA GGA

(2)SEQ ID NO：27的信息：

  (i)序列特征：

  (A)长度：13碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：27：

CTAGTCCTCC TGG

(2)SEQ ID NO：28的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：18碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：28：

TCGACGAATT CAGGAGGA

(2)SEQ ID NO：29的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：18碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：29：

CTAGTCCTCC TGAATTCG

(2)SEQ ID NO：30的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：23碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：30：

ATGTACAAGA TCCTGATCGC CGA

(2)SEQ ID NO：31的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：22碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：31：

TCAGCGGCGC AGGTAGGCGG CG

(2)SEQ ID NO：32的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：31碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：32：

ATGACCAAGG GCCGGATCCG TCGACCTGCA G

(2)SEQ ID NO：33的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：32碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：33：

CTACCCTTGG CCCCGGATCC GTCGACCTGC AG

(2)SEQ ID NO：34的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：23碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：34：

CACGGCCTGG CGCAGGTTGC GGG

(2)SEQ ID NO：35的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：21碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：35：

GGCAGCCCGC ACGATTGCGG C

(2)SEQ ID NO：36的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：21碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：36：

GCGGAAAACC GCCTGGATCG C

(2)SEQ ID NO：37的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：21碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：37：

GGGTTCAGGG ACTGCAAAAC G

(2)SEQ ID NO：38的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：35碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：38：

GGAATTCAGA TCTCAGCAAT GAAAAGATCA AAACG

(2)SEQ ID NO：39的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：34碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：39：

GGAATTCAGA TCTCAGCAAT GCAACAGACA ACCC

(2)SEQ ID NO：40的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：28碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：40：

GCTCTAGATC ACTCCCCTTA CTAAGTCG

(2)SEQ ID NO：41的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：37碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：41：

GGAATTCAGA TCTCAGCAAT GAGCGAGAAA ACCATGC

(2)SEQ ID NO：42的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：27碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：42：

GCTCTAGATT AGCTTCCTTT ACGCAGC

(2)SEQ ID NO：43的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：38碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：43：

GGAATTCAGA TCTCAGCAAT GAGCTATCGT ATGTTTGA

(2)SEQ ID NO：44的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：24碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：44：

GCTCTAGATC AGAATGCCTG GCGG

(2)SEQ ID NO：45的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：35碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：45：

GGAATTCAGA TCTAGCAATG CCGTTAATAG CCGGG

(2)SEQ ID NO：46的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：26碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑构型：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列表述：SEQ ID NO：46：

GCTCTAGATT AATTCGCCTG ACCGGC

Claims (14)

1.一种生产1，3-丙二醇的生物转化方法，包括在合适的条件下，使甘油与一种至少含有一个能表达脱水酶的基因的单一微生物接触，这种微生物选自曲霉属、酵母属、接合酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、德巴利酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属和假单胞菌属。

2.一种含有约35kb的DNA片断、分离自肺炎克雷伯氏菌的粘粒，其中DNA片断编码一种活性甘油脱水酶，其限制酶切图谱见图1的泳道1和2。

3.一种包含一个宿主微生物和权利要求2的粘粒的转化微生物。

4.权利要求3的转化微生物，其中宿主微生物是大肠杆菌，其ATCC登记号为69789。

5.一种包含一个宿主微生物、一个分离自肺炎克雷伯氏菌的第一DNA片断和至少一个分离自肺炎克雷伯氏菌的第二DNA片断的转化微生物，其中第一DNA片断编码活性甘油脱水酶，其限制酶切图谱为图1中泳道1和泳道2，第二DNA片断编码不是甘油脱水酶的一种活性功能蛋白。

6.一种重组的假单胞菌菌株，包含一个编码dhaB1、dhaB2和dhaB3以及dhaT的DNA片断，其ATCC登记号为55760。

7.一种重组的巴斯德毕赤酵母菌株，包含一个编码dhaB1、dhaB2和dhaB3以及dhaT的DNA片断，其ATCC登记号为74363。

8.一种重组的啤酒酵母菌株pMCK1/10/17(MH)#A，包含一个编码dhaB1、dhaB2和dhaB3以及dhaT的DNA片断，其ATCC登记号为______。

9.一种重组的地衣芽孢杆菌菌株BG188/pM26(克隆#8)，包含一个编码dhaB1、dhaB2和dhaB3的DNA片断，其ATCC登记号为______。

10.一种重组的枯草芽孢杆菌菌株BG2864/pM27(克隆#1)，包含一个编码dhaB1、dhaB2和dhaB3以及dhaT的DNA片断，其ATCC登记号为______。

11.一种重组的浅青紫链霉菌菌株SL14-2，包含一个编码dhaB1、dhaB2和dhaB3以及dhaT的DNA片断，其ATCC登记号为______。

12.一种重组的黑曲霉株TGR40-13，包含一个编码dhaB1、dhaB2以及dhaB3以及dhaT的DNA片断，其ATCC登记号为______。

13.一种表达脱水酶的重组真核微生物。

14.选自酵母和丝状真菌的权利要求13的重组真核微生物。

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