CN1198935C

CN1198935C - 1,3－丙二醇的重组生产方法

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Publication number: CN1198935C
Application number: CNB97180074XA
Authority: CN
Inventors: N·S·杜恩－科莱曼; M·狄茨－托里斯; M·W·查瑟; D·特里布尔
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1996-11-13
Filing date: 1997-11-13
Publication date: 2005-04-27
Anticipated expiration: 2017-11-13
Also published as: IL129722A; AU733534B2; DE69736070D1; WO1998021341A2; BR9714313A; KR20000053213A; CN1244217A; IL129722A0; EP0942989B1; ES2336858T3; US6953684B2; US6136576A; EP0942989A1; AU5248498A; WO1998021339A1; ATE452979T1; CA2269088A1; DE69736070T2; JP4327909B2; EP0946732B1

Abstract

本发明提供了一种用于生物中从多种碳源生产1，3-丙二醇的改进方法，包括含有编码脱水酶蛋白质X的DNA或者编码蛋白质X以及蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3中至少一种的DNA的生物。蛋白质X可分离自二醇脱水酶或甘油脱水酶。本发明还提供了含有能够提高1，3-丙二醇产量的蛋白质X的宿主细胞。

Description

1，3-丙二醇的重组生产方法

相关申请

本发明是于1996年11月13日提交的美国临时申请60/030,601的部分继续申请，在此全部引入作为参考。

发明领域

本发明涉及分子生物学领域，并且特别地涉及用于在宿主细胞中生产1，3-丙二醇的改进的方法。特别地，本发明描述了宿主细胞中与1，3-丙二醇生产相关的基因簇的组分，包括蛋白质X，和蛋白质1、蛋白质2以及蛋白质3。尤其特别地本发明描述了为提高宿主细胞中1，3-丙二醇的产量之克隆基因的表达，该克隆基因分别编码或一起编码蛋白质X、蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3。

背景

1，3-丙二醇是在聚酯纤维的生产以及聚氨基甲酸乙酯和环状化合物的制造中具有潜在用途的一种单体。

已知多种能产生1，3-丙二醇的化学路线。例如，在磷化氢，水，一氧化碳，氢和一种酸存在时，氧化乙烯可以经过丙烯醛的催化溶液相水合作用再被还原成1，3-丙二醇，或者在一氧化碳和氢气存在时，烃类如甘油可以被具有来自周期表VIII组原子的催化剂转化成1，3-丙二醇。虽然有可能用这些方法产生1，3-丙二醇，但它们昂贵而且产生含有环境污染物的废液。

了解1，3-丙二醇可以通过甘油发酵来生产已经超过一个世纪。已经发现了能产生1，3-丙二醇的细菌菌株，如柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，梭状芽孢杆菌属(Clostridium)，肠杆菌属(Enterobacter)，泥杆菌属(Ilyobacter)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，乳酸杆菌属(Lactobacillus)和暗杆菌属(Pelobacter)中的菌株。在研究过的每一种情况中，甘油经过两步酶催化的反应步骤被转化成1，3-丙二醇。第一步，脱水酶催化甘油转化成3-羟基丙醛(3-HP)和水(方程式1)。第二步，3-HP被NAD⁺-偶联的氧化还原酶还原成1，3-丙二醇(方程式2)。

(方程式1)

(方程式2)

1，3-丙二醇不再被进一步代谢，因而以高浓度累积在基质中。总反应消耗一个辅助因子形式的还原单位，即还原型b-尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被氧化成尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)。

从甘油生产1，3-丙二醇通常在无氧条件下以甘油为唯一碳源并且无其它外源还原单位受体时进行。在这些条件下，在例如柠檬酸杆菌属，梭状芽孢杆菌属和克雷伯氏菌属的菌株中，可以经类似的途径加工甘油，首先涉及甘油被NAD⁺-(或NADP⁺-)偶联的甘油脱氢酶氧化成二羟丙酮(DHA)(方程式3)。DHA再被DHA激酶磷酸化成为磷酸二羟丙酮(DHAP)(方程式4)，从而可用于生物合成以及帮助通过例如酵解过程的ATP的产生。

(方程式3)

(方程式4)

与1，3-丙二醇途径相比，此途径可以给细胞提供碳和能量，产生而不是消耗NADH。

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和弗劳地柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)中，编码功能相关的甘油脱水酶(dhaB)、1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱氢酶(dhaD)和二羟丙酮激酶(dhaK)活性的基因被包括在dha调节子中。柠檬酸杆菌属和克雷伯氏菌属的dha调节子已在大肠杆菌(Escherichia coli)表达并且已表明能将甘油转化为1，3-丙二醇。甘油脱水酶(E.C.4.2.1.30)与二醇[1，2-丙二醇]脱水酶(E.C.4.2.1.28)相关但为不同基因编码的不同的酶。在鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和肺炎克雷伯氏菌中二醇脱水酶与pdu操纵子相关，见Bobik等人，1992，细菌学杂志(J.Bacteriol.)174：2253-2266和美国专利5,633,362。Tobimatsu等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271：22352-22357公开了编码甘油脱水酶蛋白质X的已命名为ORF4的肺炎克雷伯氏菌基因；Seyfried等人，1996，细菌学杂志(J.Bacteriol.)178：5793-5796公开了编码蛋白质X的已命名为ORF4的弗劳地柠檬酸杆菌的甘油脱水酶基因。Tobimatsu等人，1995，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)270：7142-7148公开了二醇脱水酶亚单位α，β和γ并证明了orf4的存在。Luers(1997，FEMS微生物学通讯154：337-345)公开了巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)的蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3的氨基酸序列。

已知制备甘油的生物学过程。绝大多数甘油产生菌是酵母菌，其次已知一些细菌，真菌和藻类也产生甘油。细菌和酵母菌都通过糖酵解中的果糖-1，6-二磷酸途径或者Embden Meyerhof Parnas途径将葡萄糖或其它碳水化合物转化为甘油，而特定的藻类将叶绿体中溶解的二氧化碳或碳酸氢盐转化为卡尔文循环中的三碳中间物。经过一系列步骤，此三碳中间物磷酸甘油酸转化为甘油醛3-磷酸，甘油醛3-磷酸可以容易地互变为其酮式异构体磷酸二羟丙酮并最终转变成为甘油。

特别地，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和番茄乳酸杆菌(Lactobacillus lycopersica)可合成甘油，并且已发现耐盐藻类Dunaliella sp和Asteromonas gracilis中产生甘油起到抗外部高盐浓度的保护作用(Ben-Amotz等人，Experientia 38，49-52，(1982))。类似地，许多耐渗透压酵母菌以合成甘油作为保护方式。酵母属(Saccharomyces)的大多数菌株在乙醇发酵中产生一些甘油并且可以应用渗透压力生理性地提高其产量(Albertyn等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)14，4135-4144，(1994))。本世纪早期通过使用加入“引导剂”如亚硫酸盐或碱的酵母菌培养物进行甘油的商业化生产。通过失活复合物的形成，引导剂阻断或抑制了乙醛转化为乙醇；因而，过量的还原单位(NADH)可用于生产甘油或被引导向用于还原的DHAP以产生甘油。此方法受亚硫酸盐导致的酵母菌生长的部分抑制反应的局限。用碱通过另外的机制产生过量的NADH单位可以部分克服这一局限。在此情况下，碱起始了康尼扎罗(Cannizarro)不对称反应，从两个单位的乙醛产生乙醇和乙酸。

来自糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)的编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因(DAR1，GPD1)已被克隆和测序(Wang等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)176，7091-7095，(1994))。将DAR1基因克隆进穿梭载体并用其转化大肠杆菌，结果表达产生了活性酶。Wang等人(出处同上)认识到DAR1受细胞渗透压环境的调节，但是并没有提出如何在重组生物中利用该基因提高1，3-丙二醇的产量。

其它的甘油3-磷酸脱氢酶已被分离：例如来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的立体专一编号的甘油-3-磷酸脱氢酶已被克隆和测序(Larason等人，分子微生物学(Mol.Microbiol.)10，1101，(1993))，并且Albertyn等人，(分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)14，4135-4144，(1994))描述了来自酿酒酵母的编码甘油-3-磷酸脱氢酶的GPD1的克隆。如Wang等人(出处同上)，Larason等人和Albertyn等人都认识到此基因调节的渗透压敏感性，但都没有提出如何用此基因在重组生物中生产1，3-丙二醇。

关于G3PDH的蛋白质，已从酿酒酵母中分离了甘油-3-磷酸酶并且鉴定了该蛋白质由GPP1和GPP2基因编码(Norbeck等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271，13875，(1996))。类似于编码G3PDH的基因，GPP2表现出渗透压敏感性。

虽然生产甘油和1，3-丙二醇的生物学方法都已知，但从未证明过用一个单独的重组生物能完成整个过程。

由于化学过程需要高能量而生物学过程需要昂贵的起始物甘油，上述生产1，3-丙二醇的化学和生物学方法都不很适合于工业规模的生产。需要一种要求低能量输入和不昂贵的起始物质的方法。更受欢迎的方法需要一种能将基本碳源如碳水化合物或糖类转化为所需1，3-丙二醇终产物的微生物。

虽然期望有一种生物能将除甘油或二羟丙酮之外的可发酵碳源转化为1，3-丙二醇，已证明这一尝试中存在巨大的难度。例如，Gottschalk等人(EP 373 230)描述了氢供体如果糖或葡萄糖的存在会干扰用于生产1，3-丙二醇的大多数菌株，包括弗劳地柠檬酸杆菌、Clostridium autobutylicum、丁酸梭菌和肺炎克雷伯氏菌的生长。在甘油和果糖或葡萄糖的共发酵中产生1，3-丙二醇的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)和布氏乳杆菌(Lactobacillus buchner)，当供给甘油作为唯一碳源时不能生长，并且虽然已经证明休止细胞能代谢葡萄糖或果糖，但它们不能产生1，3-丙二醇(Veiga DA Cunha等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)174，1013(1992))。相类似，已证明一株供给甘油和乙酸时产生1，3-丙二醇的多养型泥杆菌(Ilyobacterpolytropus)不能从甘油之外的碳底物(包括果糖和葡萄糖)产生1，3-丙二醇(Steib等人，微生物学文献(Arch.Microbiol.)140，139(1984))。最后Tong等人(生物化学生物技术学应用(Appl.Biochem.Biotech.)34，149(1992))已证明当无外源甘油时，用编码甘油脱水酶的dha调节子转化的大肠杆菌从葡萄糖和木糖都不能产生1，3-丙二醇。

已报道了促进由甘油生产1，3-丙二醇的尝试，此过程包括能提供还原单位的辅助底物，一般为可发酵糖类。已要求了共发酵甘油和葡萄糖的弗劳地柠檬酸杆菌和肺炎克雷伯氏菌DSM 4270的休止细胞产量提高(Gottschalk等人，出处同上，以及Tran-Dinh等人，DE 3734764)；但未要求共发酵甘油和葡萄糖的不产生1，3-丙二醇的肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955的生长细胞(I-T.Tong，博士论文，University ofWisconsin-Madison(1992))。已报道重组大肠杆菌的甘油和葡萄糖或果糖的共发酵的产量提高；然而，无甘油时不产生1，3-丙二醇(Tong等人，出处同上)。在这些系统中，提供用于细胞维持和生长的能量和碳时，单一生物用碳水化合物作为产生NADH的来源。这些公开的内容表明糖类并不进入产生1，3-丙二醇的碳途径。没有外源的甘油来源时无论如何也不产生1，3-丙二醇。因而这些文献的内容清楚地表明用单一的生物从一种碳源生产1，3-丙二醇是不可能的。

在评价宿主细胞的1，3-丙二醇产生中蛋白质X的作用时，各文献的内容极为混乱。在得到基因信息之前，McGee等人，1982，生物化学生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)108：547-551报道来自肺炎克雷伯氏菌ATCC 8724的二醇脱水酶包含通过大小(60K、51K、29K和15K道尔顿)和N-末端氨基酸序列鉴定的四个亚单位。与McGee正好相反，Tobimatsu等人1996，出处同上，报道了来自同一生物的二醇脱水酶的克隆、测序和表达，并且未发现脱水酶与51K道尔顿多肽相关联的证据。Tobimatsu等人1996，出处同上，得出结论蛋白质X多肽不是甘油脱水酶的亚单位，与GenBank登记号U30903中描述的蛋白质X是甘油脱水酶的大亚单位相反。Seyfried等人，出处同上，报道orfZ(蛋白质X)3′末端192bp的缺失对酶活性无影响，并推论orfZ不编码脱水酶活性所需的亚单位。最后，Skraly，F.A.(1997，名为“改善的1，3-丙二醇发酵的代谢工程”的论文)公开，在一个重组ORF3(蛋白质X)被打断产生一个大的融合蛋白的实验中，甘油脱水酶活性丧失，而在另一个实验中，与ORF3为完整的对照相比从甘油生产的1，3-丙二醇降低，但甘油脱水酶活性未失去。

本发明要解决的问题是用一种重组生物从例如葡萄糖或其它糖类的廉价碳底物以商业上可行的量进行1，3-丙二醇的生物学生产。1，3-丙二醇的生物学生产要求以甘油作为两步连续反应的底物，反应中脱水酶(一般为辅酶B₁₂依赖的脱水酶)将甘油转化为中间物3-羟基丙醛，3-羟基丙醛再被NADH(或NADPH)依赖的氧化还原酶还原为1，3-丙二醇。辅助因子需求的复杂性使在工业方法中利用完整细胞催化以将此反应程序用于1，3-丙二醇的生产成为必需。而且，为了使此过程在商业上可行，需要一种比甘油或二羟丙酮更廉价的原料并且需要达到高产量水平。葡萄糖和其它碳水化合物是合适的底物，但是如上所述，已知它们会干扰1，3-丙二醇的产生。因此还没有一种生物能将葡萄糖转化为1，3-丙二醇。

申请者已经解决了提出的问题并且本发明提供了用一种重组生物将可发酵碳源直接生物转化为1，3-丙二醇的方法。葡萄糖作为一种模式底物被采用并且生物转化适用于任何现有微生物。包含编码蛋白质X、蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3以及其它与1，3-丙二醇产生相关的蛋白质之基因的微生物，能够以高产量和很好的选择性通过甘油降解途径将葡萄糖和其它糖类转化为1，3-丙二醇。另外，本发明可以普遍性地适用于任何易于转化为1)甘油、2)二羟丙酮或3)甘油的氧化状态的三碳化合物(如甘油3-磷酸)或4)二羟丙酮的氧化状态的三碳化合物(如磷酸二羟丙酮或甘油醛3-磷酸)的碳底物。

发明概述

本发明涉及从单一微生物生产1，3-丙二醇的改进方法。本发明部分建立在此未曾预料的发现上，即在包含至少一个编码脱水酶活性的基因并且能够产生1，3-丙二醇的微生物中，编码蛋白质X的基因的存在与脱水酶活性的体内再激活以及此微生物中1，3-丙二醇的产量提高有关。本发明还部分建立在此未曾预料的发现上，即在包含至少一个编码脱水酶活性的基因并且能够产生1，3-丙二醇的宿主细胞中，编码蛋白质X的基因和至少一个编码选自蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3的一种蛋白质的基因的存在与脱水酶活性的体内再激活以及此微生物中1，3-丙二醇的产量提高有关。

因而，本发明提供了用能产生1，3-丙二醇的微生物来生产1，3-丙二醇的改进方法，所述微生物包含至少一种编码脱水酶活性的基因，此方法包含的步骤包括将编码蛋白质X的基因导入生物体产生转化的生物；然后在至少一种能在所述转化的宿主生物中被转化为1，3-丙二醇的碳源存在的情况下，并且在适合于产生1，3-丙二醇的条件下培养此转化的生物，其中碳源选自单糖、寡糖、多糖和一碳底物。

在一个优选实施方案中，改进了的生产1，3-丙二醇的方法还包括将至少一种编码选自蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3的一种蛋白质基因导入生物体。此微生物还可以包括如下的至少一种(a)编码甘油-3-磷酸脱氢酶活性的基因；(b)编码甘油-3-磷酸酶活性的基因；和(c)编码1，3-丙二醇氧化还原酶活性的基因。编码脱水酶活性、蛋白质X、蛋白质1、2或3的基因或其它1，3-丙二醇产生所必需的基因可以稳定地存在于宿主细胞基因组中或存在于宿主微生物中的复制型质粒中。

此方法还任选地包括回收1，3-丙二醇的步骤。在本发明的一个方面，碳源是葡萄糖。

微生物选自柠檬酸杆菌属，肠杆菌属，梭状芽孢杆菌属，克雷伯氏菌属，气杆菌属(Aerobacter)，乳杆菌属，曲霉属(Aspergillus)，酵母属，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，接合酵母属(Zygosaccharomyces)，毕氏酵母属(Pichia)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，假丝酵母属(Candida)，汉逊酵母属(Hansenula)，德巴利酵母属(Debaryomyces)，毛霉属(Mucor)，球拟酵母属(Torulopsis)，甲基细菌属(Methylobacter)，埃希氏菌属(Escherichia)，沙门氏菌属(Salmonella)，芽孢杆菌属(Bacillus)，链霉菌属(Streptomyces)和假单胞菌属(Pseudomonas)。

在一方面，蛋白质X衍生自甘油脱水酶基因簇，在另一方面蛋白质X衍生自二醇脱水酶基因簇。编码脱水酶活性的基因可能与此微生物同源或异源。在一个实施方案中，甘油脱水酶基因簇衍生自选自克雷伯氏菌属和柠檬酸杆菌属的生物。在另一个实施方案中，二醇脱水酶基因簇衍生自选自克雷伯氏菌属、梭状芽孢杆菌属和沙门氏菌属的生物。

在另一方面，本发明提供的重组微生物包含至少一个编码脱水酶活性的基因；至少一个编码甘油-3-磷酸酶的基因；和至少一个编码蛋白质X的基因，其中所述微生物能够从碳源产生1，3-丙二醇。碳源可以选自单糖、寡糖、多糖和一碳底物。在另一个实施方案中，此微生物还包含一个编码胞质甘油-3-磷酸脱氢酶的基因。在另一个实施方案中，此重组微生物还包含至少一个编码选自蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3的蛋白质的基因。此微生物选自柠檬酸杆菌属，肠杆菌属，梭状芽孢杆菌属，克雷伯氏菌属，气杆菌属，乳杆菌属，曲霉属，酵母属，裂殖酵母属，接合酵母属，毕氏酵母属，克鲁维酵母属，假丝酵母属，汉逊酵母属，德巴利酵母属，毛霉属，球拟酵母属，甲基细菌属，埃希氏菌属，沙门氏菌属，芽孢杆菌属，链霉菌属和假单胞菌属。在一方面，蛋白质X衍生自甘油脱水酶基因簇，在另一方面蛋白质X衍生自二醇脱水酶基因簇。在一方面，脱水酶活性与所述微生物异源，而在另一方面脱水酶活性与所述微生物同源。

本发明也提供了在能够产生1，3-丙二醇并且含有至少一种脱水酶活性的基因的微生物中脱水酶活性的体内再激活的方法，包括将编码蛋白质X的基因导入所述微生物的步骤。此微生物选自柠檬酸杆菌属，肠杆菌属，梭状芽孢杆菌属，克雷伯氏菌属，气杆菌属，乳杆菌属，曲霉属，酵母属，裂殖酵母属，接合酵母属，毕氏酵母属，克鲁维酵母属，假丝酵母属，汉逊酵母属，德巴利酵母属，毛霉属，球拟酵母属，甲基细菌属，埃希氏菌属，沙门氏菌属，芽孢杆菌属，链霉菌属和假单胞菌属。

在一方面，编码脱水酶活性的基因与所述微生物异源，而在另一方面编码脱水酶活性的基因与所述微生物同源。在一个实施方案中，编码蛋白质X的基因衍生自甘油脱水酶基因簇，在另一个实施方案中，编码蛋白质X的基因衍生自二醇脱水酶基因簇。

本发明也提供了包含编码蛋白质X、蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3的基因的表达载体和宿主细胞。

根据本发明的生产1，3-丙二醇方法的一个优点是与无编码蛋白质X的核酸的宿主细胞相比，编码蛋白质X的核酸存在时能产生1，3-丙二醇的宿主细胞中1，3-丙二醇的产量获得了未曾预料的提高。如后面所证明，含有编码dhaB 1、2和3以及蛋白质X的核酸的宿主细胞比含有编码dhaB 1、2和3但无编码蛋白质X的核酸的宿主细胞产生明显多的1，3-丙二醇。

本发明的另一个优点如后面所证明，是与无编码蛋白质X的核酸和编码蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3中至少一种的核酸之宿主细胞相比，同时含有编码蛋白质X的核酸和编码蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3中至少一种的核酸之产生1，3-丙二醇的宿主细胞获得了未曾预料的结果，宿主细胞的1，3-丙二醇产量提高。

本发明的生产方法的另一个优点如下所示，是与此微生物中编码蛋白质X的核酸存在相关的此微生物中脱水酶活性的体内再激活。

附图简述

图1阐明了质粒pHK28-26上的来自肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶基因簇的组分(SEQ ID NO：19)。此图中，orfY编码蛋白质1，orfX编码蛋白质2，orfW编码蛋白质3。DhaB-X指蛋白质X。

图2A-2G阐明了肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶蛋白质X(dhab4)(SEQ ID NO：59)的核苷酸和氨基酸序列。

图3阐明了肺炎克雷伯氏菌蛋白质1(SEQ ID NO：61)和弗劳地柠檬酸杆菌蛋白质1(SEQ ID NO：60)(图3中称为orfY)的氨基酸排列。

图4阐明了肺炎克雷伯氏菌蛋白质2(SEQ ID NO：63)和弗劳地柠檬酸杆菌蛋白质2(SEQ ID NO：62)(图4中称为orfX)的氨基酸排列。

图5阐明了肺炎克雷伯氏菌蛋白质3(SEQ ID NO：64)和弗劳地柠檬酸杆菌蛋白质3(SEQ ID NO：65)(图5中称为orfW)的氨基酸排列。

图6阐明了大肠杆菌DH5α细胞中质粒pHK28-26(包含dhaB亚单位1、2和3以及蛋白质X和编码蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3的开放阅读框架)与pDT24(包含dhaB亚单位1、2和3以及蛋白质X)的原位再激活比较。

图7阐明了大肠杆菌DH5α细胞中质粒pM7(包含编码dhaB亚单位1、2和3以及蛋白质X的基因)与质粒pM11(包含编码dhaB亚单位1、2和3的基因)的原位再激活比较。

图8A-8E阐明了肺炎克雷伯氏菌二醇脱水酶基因簇蛋白质X的核酸序列(SEQ ID NO：66)和氨基酸序列(SEQ ID NO：67)。

图9阐明了用大肠杆菌FM5/pDT24(FM5的描述见Amgen专利US 5,494,816，ATCC保藏号53911)生产1，3-丙二醇的标准的10公升发酵。

图10阐明了阐明了用大肠杆菌DH5α/pHK28-26生产1，3-丙二醇的标准10升发酵。

生物保藏和序列表简述

包含有编码甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)和甘油-3-磷酸酶(G3P磷酸酶)，甘油脱水酶(dhaB)，和1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)的基因的转化的大肠杆菌W2042(包含大肠杆菌宿主W1485和质粒pDT20和pAH42)按照国际认证的为专利申请目的的微生物保藏的布达佩斯条约的条款于1996年9月26日被美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏，保藏号为ATCC 98188。

包容含有编码甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)和甘油-3-磷酸酶(G3P磷酸酶)、甘油脱水酶(dhaB)和1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)的基因的质粒pMCK10、pMCK17、pMCK30和pMCK35的酿酒酵母YPH500按照国际认证的为专利申请目的的微生物保藏的布达佩斯条约的条款于1996年9月26日被ATCC保藏，保藏号为ATCC74392。

包容含有甘油脱水酶、蛋白质X、蛋白质1、2和3的克雷伯氏菌基因组约35kb的质粒pKP1的大肠杆菌DH5α按照布达佩斯条约的条款于1995年4月18日被ATCC保藏，保藏号为ATCC 69789。包容含有编码二醇脱水酶(包括蛋白质X)的克雷伯氏菌基因组一部分的质粒pKP4的大肠杆菌DH5α按照布达佩斯条约的条款于1995年4月18日被ATCC保藏，保藏号为ATCC 69790。

“ATCC”指的是位于12301 Parklawn Drive，Rockville，MD20852美国的美国典型培养物保藏中心国际保藏单位。命名是按照保藏物的保藏号。

发明详述

本发明涉及单一微生物中1，3-丙二醇的生产并且提供了于单一重组生物从可发酵碳源生产1，3-丙二醇的改进方法。此方法包括能产生1，3-丙二醇的一种微生物，此微生物含有编码脱水酶(dhaB)的同源或异源基因，至少一个编码蛋白质X的基因以及任选的至少一个编码选自蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3中一种蛋白质的基因。任选地，此微生物含有至少一个编码甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸酶和1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)的基因。将碳底物给予此重组微生物并从生长培养基中分离1，3-丙二醇。

本方法提供了可用于聚酯和其它聚合物生产的1，3-丙二醇单体的一种来源，其迅速、低廉而且无害于环境。

下列定义用于解释权利要求书和说明书。

术语“脱水酶基因簇”或“基因簇”指的是与宿主细胞中1，3-丙二醇的产生相关的一系列基因并且意在包括甘油脱水酶基因簇和二醇脱水酶基因簇。dha调节子指的是甘油脱水酶基因簇，见包含调节区域的图1。

术语“再生脱水酶活性”或“再激活脱水酶活性”指的是将无催化底物能力的脱水酶转化为有催化底物能力的脱水酶的现象，或者抑制脱水酶失活的现象，或者在体内延长脱水酶的有效半寿期的现象。

术语“甘油脱水酶”或“脱水酶”或“脱水酶活性”指的是起到能将甘油分子异构化或转化为产物3-羟基丙醛的酶活性作用的多肽。为本发明的目的，脱水酶包括优选底物分别为甘油和1，2-丙二醇的甘油脱水酶(GenBank U09771,U30903)和二醇脱水酶(GenBankD45071)。肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955的甘油脱水酶被分别等同于SEQ ID NO：1、2和3的基因dhaB1、dhaB2和dhaB3编码。dhaB1、dhaB2和dhaB3基因分别编码甘油脱水酶的a、b和c亚单位。

短语“脱水酶基因簇的蛋白质X”或“dhaB蛋白质X”或“蛋白质X”指的是与图2所示肺炎克雷伯氏菌脱水酶基因簇的蛋白质X相类似的蛋白质或者图8所示肺炎克雷伯氏菌二醇脱水酶基因簇的蛋白质X相类似的蛋白质。优选地，与宿主生物中无蛋白质X的1，3-丙二醇产量相比，蛋白质X能够增加宿主生物中1，3-丙二醇的产量。“相类似”表示编码此蛋白质的DNA与编码相应于克雷伯氏菌dhaB1、dhaB2和dhaB3的克雷伯氏菌蛋白质X的DNA位于相同的结构位置，即编码蛋白质X的DNA位于编码dhaB1-B3的核酸的3′端，或者表示蛋白质X与克雷伯氏菌二醇或甘油脱水酶蛋白质X具有整体氨基酸序列相似性。本发明包括与肺炎克雷伯氏菌的甘油或二醇脱水酶或弗劳地柠檬酸杆菌的蛋白质X具有至少50％；或至少65％；或至少80％；或至少90％或至少95％相似性的蛋白质X分子。

术语“蛋白质X”内包括的是蛋白质X，也指的是来自柠檬酸杆菌属dha调节子的ORF Z(Seyfried M.1996，细菌学杂志(J.Bacteriol.)178：5793-5796)。本发明也包含来自任何微生物的蛋白质X的氨基酸变体，只要蛋白质X变体保持了其重要功能特征，此特征为与无蛋白质X的宿主生物的1，3-丙二醇产量相比能提高宿主生物的1，3-丙二醇产量。

编码甘油脱水酶活性以及蛋白质X的克雷伯氏菌基因组的一部分被转化进大肠杆菌，转化的大肠杆菌于1995年4月18日按照布达佩斯条约的条款被ATCC保藏并被命名为ATCC保藏号69789。编码二醇脱水酶活性以及蛋白质X的克雷伯氏菌基因组的一部分被转化进大肠杆菌，转化的大肠杆菌于1995年4月18日按照布达佩斯条约的条款被ATCC保藏并被命名为ATCC保藏号69790。

发现克雷伯氏菌甘油脱水酶蛋白质X位于SEQ ID NO：19的碱基9749-11572位，将dhaK的第一个碱基作为位置编号第1。编码蛋白质X的弗劳地柠檬酸杆菌(ATCC保藏号CFU09771)的核酸被发现位于位置11261至13072。

本发明包括被重组导入宿主生物并在质粒上进行复制的编码脱水酶蛋白质X的基因以及稳定维持在宿主基因组中的编码脱水酶蛋白质X的基因。本发明包括提高1，3-丙二醇产量的方法，其中编码蛋白质X的基因与编码脱水酶活性和/或产生1，3-丙二醇必需的基因一起被转化进宿主细胞。编码蛋白质X、脱水酶活性的基因和/或其它基因可以在相同或不同的表达盒中。或者，编码蛋白质X的基因可以分开进行转化，或者提前或落后于编码脱水酶活性和/或其它活性的基因。本发明包括含有编码蛋白质X的内源核酸的宿主细胞以及无编码蛋白质X的内源核酸的宿主细胞。

术语“蛋白质1”、“蛋白质2”和“蛋白质3”指的是微生物内编码的分别类似于蛋白质1(SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61)(也称为orfY)，蛋白质2(SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：63)(也称为orfX)以及蛋白质3(SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65)(也称为orfW)的蛋白质。

优选地，与宿主生物中无蛋白质X并且有蛋白质1、2和3中至少一种的1，3-丙二醇产量相比，宿主生物中有蛋白质X并且有蛋白质1、2和3中的至少一种能够增加宿主细胞中1，3-丙二醇的产量。类似于表示编码此蛋白质的DNA与编码各个蛋白质的DNA位于相同的结构位置，如图1所示，或者表示各个蛋白质与图3、4和5所示的各个SEQID NO具有整体序列氨基酸相似性。

本发明包括与SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61具有至少50％；或至少65％；或至少80％；或至少90％或至少95％相似性的蛋白质1分子。本发明包括与SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：63具有至少50％；或至少65％；或至少80％；或至少90％或至少95％相似性的蛋白质2分子。本发明包括与SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65具有至少50％；或至少65％；或至少80％；或至少90％或至少95％相似性的蛋白质3分子。

术语“蛋白质1”、“蛋白质2”和“蛋白质3”分别包括来自巴氏梭菌的orfY、orfX和orfW(Luers等人，出处同上)以及与巴氏梭菌的orfY、orfX或orfW具有至少50％；或至少65％；或至少80％；或至少90％或至少95％相似性的分子。本发明也包括来自任何微生物的蛋白质1、2和3的氨基酸变体，只要结合蛋白质X的该变体保留了其重要的功能特征，所述特征为与无这些蛋白质的宿主生物的1，3-丙二醇产量相比能提高宿主生物的1，3-丙二醇产量。

本发明包括提高1，3-丙二醇产量的一种方法，其中编码蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3中至少一种的基因与编码蛋白质X、脱水酶活性的基因和/或其它产生1，3-丙二醇必需的基因一起转化进宿主细胞。编码蛋白质1、2和3，蛋白质X，脱水酶活性的基因和/或其它基因可以位于相同或不同的表达盒。或者，编码蛋白质1、2和3中至少一种的基因可以分开进行转化，或者提前或落后于编码脱水酶活性和/或其它活性的基因。本发明包括具有编码蛋白质1、蛋白质2或蛋白质3的内源性核酸的宿主细胞以及无编码这些蛋白质的内源性核酸的宿主细胞。

术语“氧化还原酶”或“1，3-丙二醇氧化还原酶”指的是起到能将3-羟基丙醛还原为1，3-丙二醇的酶活性作用的多肽。1，3-丙二醇氧化还原酶包括例如dhaT基因(GenBank U09771，U30903)编码的多肽并且被命名为SEQ ID NO：4。

术语“甘油-3-磷酸脱氢酶”或“G3PDH”指的是起到能将磷酸二羟丙酮(DHAP)转化为甘油-3-磷酸的酶活性作用的多肽。在体内G3PDH可以是NADH-，NADPH-，或FAD依赖的。此酶活性的实例包括：NADH依赖的酶(EC 1.1.1.8)被包括GPD1(GenBank Z74071×2)或GPD2(GenBank Z35169×1)或GPD3(GenBankG984182)或DAR1(GenBank Z74071×2)的几种基因编码；NADPH依赖的酶(EC 1.1.1.94)被gpsA(GenBank U32164，G466746(cds 197911-196892)，和L45246)编码；以及FAD依赖的酶(EC 1.1.99.5)被GUT2(GenBank Z47047×23)或glpD(GenBank G147838)或glpABC(GenBank M20938)编码。

术语“甘油-3-磷酸酶”或“sn-甘油-3-磷酸酶”或“d，l-甘油磷酸酶”或“G3P磷酸酶”指的是起到催化甘油-3-磷酸转化为甘油的酶活性作用的多肽。G3P磷酸酶包括例如GPP1(GenBank Z47047×125)或GPP2(GenBank U18813×11)编码的多肽。

术语“甘油激酶”指的是依据反应条件，起到催化甘油转化为甘油-3-磷酸或催化甘油-3-磷酸转化为甘油的酶活性作用的多肽。甘油激酶包括例如GUT1(GenBank U11583×19)编码的多肽。

术语“GPD1”、“DAR1”、“OSG1”、“D2830”和“YDL022W”可以被互换使用并且指编码胞质甘油-3-磷酸脱氢酶，以SEQ ID NO：5的碱基序列为特征的基因。

术语“GPD2”指的是编码胞质甘油-3-磷酸脱氢酶并且以SEQ IDNO：6的碱基序列为特征的基因。

术语“GUT2”和“ YIL155C”可以被互换使用并且指编码线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶并且以SEQ ID NO：7的碱基序列为特征的基因。

术语“GPP1”、“RHR2”和“YIL053W”可以被互换使用并且指编码胞质甘油-3-磷酸酶并且以称为SEQ ID NO：8的碱基序列为特征的基因。

术语“GPP2”、“HOR2”和“YER062C”可以被互换使用并且指编码胞质甘油-3-磷酸酶并且以SEQ ID NO：9的碱基序列为特征的基因。

术语“GUT1”指的是编码胞质甘油激酶并且以SEQ ID NO：10的碱基序列为特征的基因。

术语“功能”或“酶功能”指的是酶在改变特定化学反应所需能量中的催化活性。可以理解的是这样一种活性可以应用于处于平衡的反应，其中产物或底物的产生可以在合适的条件下完成。

术语“多肽”和“蛋白质”可被互换使用。

术语“碳底物”或“碳源”指的是能被本发明的宿主生物代谢的碳源，并且特别是选自单糖、寡糖、多糖，和一碳底物或其混合物的碳源。

术语“宿主细胞”或“宿主生物”指的是能接受外源或异源基因并表达这些基因以产生活性基因产物的微生物。

术语“外源基因”、“外源DNA”、“异源基因”和“异源DNA”指的是用多种方法置于宿主生物中的对于一种生物为天然带有的遗传物质。此目的基因可以是天然产生的基因、突变的基因或合成的基因。

术语“重组生物”和“转化的宿主”指的是已被异源或外源基因或同源基因的额外拷贝转化的任何生物。本发明的重组生物表达编码用于从合适的碳底物生产1，3-丙二醇的甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)和甘油-3-磷酸酶(G3P磷酸酶)、甘油脱水酶(dhaB)和1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaB)的外源基因。

“基因”指的是表达特定蛋白质的核酸片段，包括位于编码区域之前(5′非编码区)和之后(3′非编码区)的调节序列。术语“天然的”和“野生型的”指的是对其本身的调节序列为天然的基因。

术语“编码”和“把……编码”指的是一个过程，通过此过程基因根据转录和翻译的机制产生氨基酸序列。可以理解的是此编码特定氨基酸序列的过程包括不导致编码的氨基酸改变的涉及碱基改变的DNA序列，或者涉及可能改变一或多个氨基酸，但不影响此DNA序列编码的蛋白质的功能特性的碱基改变的DNA序列。因此可以理解本发明所包括的多于特定的举例序列。序列的修饰，例如导致基本上不影响产生的蛋白质分子的功能特性的沉默突变之序列中的缺失、插入、或替换，也可以被考虑。例如，反映了遗传密码简并性或导致在给定位点产生化学上等同的氨基酸之基因序列的改变也加以考虑。因此，一种疏水性氨基酸丙氨酸的密码子可以被编码另一种疏水性较弱的残基如甘氨酸，或一种疏水性较强的残基如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的密码子替换。相类似，导致一种带负电荷的残基替换了另一种带负电荷的残基，例如天冬氨酸替换谷氨酸的替换，或者是一种带正电荷的残基替换了另一种带正电荷的残基，例如赖氨酸替换精氨酸的替换，也可以被认为是产生了生物学上等同的产物。导致蛋白质分子的N末端部分和C末端部分改变的核苷酸改变也不被认为会改变蛋白质的活性。在某些情况下，可能确实期望得到此序列的突变体用于研究改变对蛋白质生物学活性的影响。根据测定编码产物的生物学活性，每一种设计的修饰充分符合本领域的常规技术。而且，熟练的技术人员了解，本发明包括的序列也通过在严格的条件下(0.1×SSC，0.1％SDS，65℃)它们能与此处所举例的序列杂交的能力加以界定。

术语“表达”指的是从编码基因产物序列的基因转录和翻译成为基因产物。

术语“质粒”、“载体”和“盒”指的是经常携带不属于细胞的重要代谢部分的基因，并且通常以环状双链DNA分子的形式存在的染色体外元件单位。这种元件可以是衍生自任何来源的自主复制型序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线状或环状的单链或双链的DNA或RNA，其中很多核苷酸序列已经被连接或重组进一个独特的构件，该构件能将启动子片段和用于选定的基因产物的DNA序列以及合适的3′非翻译序列导入细胞。“转化盒”指的是一个特定载体，此载体包含外源基因并且具有能促进对特定的宿主细胞进行转化的除外源基因以外的元件。术语“表达盒”指的是一个特定载体，此载体包含一个外源基因并且具有能容许此基因在外源宿主中提高表达的元件。

术语“转化”和“转染”指的是核酸整合以后细胞对新基因的接受。接受的基因可以被整合进染色体DNA或者以染色体外复制型序列被导入。术语“转化体”指的是转化的产物。

术语“遗传性改变的”指的是通过转化或突变改变遗传物质的方法。

术语“经分离的”指的是从至少一种与其天然相关的组分中分出的蛋白质或DNA序列。

术语“同源的”指的是在革兰氏阳性宿主细胞中天然的或天然地产生的蛋白质或多肽。本发明包括通过重组DNA技术产生同源蛋白质的微生物。

重组生物的构建

包含编码对将碳底物转化为1，3-丙二醇的酶途径必需基因的重组生物可以用本领域熟知的技术来构建。如实施例9所讨论的，编码克雷伯氏菌dhaB1、dhaB2、dhaB3和蛋白质X的基因被用于转化大肠杆菌DH5α，如实施例10所讨论的，编码克雷伯氏菌蛋白质1、2和3中至少一个的基因以及编码蛋白质X的至少一个基因被用于转化大肠杆菌。

从例如为克雷伯氏菌属或酵母属的天然宿主分离编码甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)、甘油-3-磷酸酶(G3P磷酸酶)、甘油脱水酶(dhaB)，和1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)的基因，并且用其转化宿主菌株，例如大肠杆菌DH5α、ECL707、AA200或W1485；酿酒酵母菌株YPH500或肺炎克雷伯氏菌菌株ATCC25955或ECL2106。

基因的分离

从细菌基因组获得所需基因的方法是普通的方法而且为分子生物学领域所熟知。例如，如果此基因的序列已知，可以用限制性内切核酸酶酶解来建立合适的基因组文库，并且可用互补探针与所需基因序列互补的方法对其进行筛选。一旦分离出此序列，可以用标准的引物引导的扩增方法如聚合酶链式反应(PCR)(U.S.4,683,202)以获得适合于用合适的载体进行转化的量的DNA。

或者，可以建立粘粒文库，其中大片段的基因组DNA(35-45kb)可以被包装在载体中并用于转化合适的宿主。粘粒载体的独特性在于其能容纳大量的DNA。通常，粘粒载体具有外源DNA包装和其后的环化所需的至少一份拷贝的cos DNA序列。除cos序列之外，这些载体也包含一个复制起点如ColE1和抗药性标记如抗氨苄青霉素或新霉素的基因。用粘粒载体转化合适的细菌宿主的方法在Sambrook等人，分子克隆：实验手册，第二版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Sspring Harbon，NY(1989)中进行了详细描述。

对于克隆粘粒，一般用合适的限制性内切核酸酶分离和连接外源DNA使之邻近粘粒载体的cos区域。然后包含线性外源DNA的粘粒载体与DNA包装载体如细菌噬菌体I反应。在包装过程中cos位点被切开，外源DNA被包装进细菌病毒颗粒的头部。这些颗粒然后被用于转染适当的宿主细胞如大肠杆菌。一旦注入细胞，外源DNA在cos粘性末端的作用下环化。通过这种方式大片段的外源DNA可以被导入并在重组宿主细胞中表达。

编码甘油脱水酶(dhaB)和1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)的基因的分离和克隆

在本发明的上下文中，利用粘粒载体和粘粒转化方法以克隆来自已知含有能将甘油转化为1，3-丙二醇的基因之细菌菌株的大片段基因组DNA。特别地，用本领域熟知的方法分离肺炎克雷伯氏菌ATCC25955的基因组DNA，用限制性酶Sau3A将其酶切以插入粘粒载体Supercos1，用GigapackII包装提取物对其进行包装。然后用粘粒DNA转化构建的载体大肠杆菌XL1-Blue MR细胞。通过在甘油存在下培养细胞并分析基质中1，3-丙二醇的形成来筛选能将甘油转化为1，3-丙二醇的转化体。

分析了两个1，3-丙二醇阳性转化体，粘粒被命名为pKP1和pKP2。DNA测序显示与弗劳地柠檬酸杆菌的甘油脱水酶基因(dhaB)具有广泛的同源性，表明这些转化体包含编码甘油脱水酶基因的DNA。分析了其它的1，3-丙二醇阳性转化体，粘粒被命名为pKP4和pKP5。DNA测序显示这些粘粒携带编码二醇脱水酶基因的DNA。

编码蛋白质X、蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3的基因的分离

虽然本发明利用的是分离自克雷伯氏菌属粘粒的基因，其它的脱水酶基因和蛋白质X及蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3的来源包括但不限于柠檬酸杆菌属，梭状芽孢杆菌属，和沙门氏菌属。Tobimatsu等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271：22352-22357公开了肺炎克雷伯氏菌属的甘油脱水酶操纵子，其中蛋白质X被命名为ORF4；Seyfried等人，1996，细菌学杂志(J.Bacteriol.)178：5793-5796公开了弗劳地柠檬酸杆菌的甘油脱水酶操纵子，其中蛋白质X被命名为ORF Z。图8公开了克雷伯氏菌属的二醇脱水酶蛋白质X，图3、4和5公开了来自克雷伯氏菌属和柠檬酸杆菌属的蛋白质1、2和3的氨基酸序列。

编码G3PDH和G3P磷酸酶的基因

本发明提供了适合于在宿主细胞中表达G3PDH和G3P磷酸酶活性的基因。

已知编码G3PDH的基因。例如，GPD1已被从酵母属分离，并且具有编码SEQ ID NO：11给出的氨基酸序列的SEQ ID NO：5给出的碱基序列(Wang等人，出处同上)。相类似，G3PDH活性也已被从酵母属分离并由GPD2编码，GPD2具有编码SEQ ID NO：12给出的氨基酸序列的SEQ ID NO：6给出的碱基序列(Eriksson等人，分子微生物学(Mol.Microbiol)17，95，(1995))。

任何编码具有G3PDH活性多肽的基因都被认为适合于本发明的目的，其中此活性能催化磷酸二羟丙酮(DHAP)转化为甘油-3-磷酸(G3P)。而且，任何编码分别相应于基因GPD1、GPD2、GUT2、gpsA、glpD以及glpABC的亚单位的SEQ ID NO：11、12、13、14、15和16中任何一个给出的G3PDH氨基酸序列的基因都被认为能用于本发明，其中氨基酸序列包括不改变酶功能的氨基酸替换、缺失或添加。本领域技术人员知晓分离自其它来源的编码G3PDH的基因也适合应用于本发明。例如，从原核生物分离的GenBank保藏号为M34393，M20938，L06231，U12567，L45246，L45323，L45324，L45325，U32164和U39682的基因；从真菌分离的GenBank保藏号为U30625，U30876和X56162的基因；从昆虫分离的GenBank保藏号为X61223和X14179的基因；以及从哺乳动物来源分离的GenBank保藏号为U12424，M25558和X78593的基因。

已知编码G3P磷酸酶的基因。例如，GPP2已被从酿酒酵母分离，并且具有编码SEQ ID NO：17给出的氨基酸序列的SEQ ID NO：9给出的碱基序列(Norbeck等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem)271，第13875页，1996)。

任何编码G3P磷酸酶活性的基因都被认为适用于本发明的目的，其中此活性能催化甘油-3-磷酸转化为甘油。而且，任何编码SEQ IDNO：33和17给出的G3P磷酸酶氨基酸序列的基因都被认为能用于本发明，其中氨基酸序列包括不改变酶功能的氨基酸替换、缺失或添加。技术人员认为分离自其它来源的编码G3P磷酸酶的基因也适合应用于本发明。例如，可以用一或多个下列普通或特定磷酸酶实现甘油-3-磷酸的脱磷酸化以产生甘油：碱性磷酸酶(EC 3.1.3.1)[GenBankM19159，M29663，U02550或M33965]；酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)[GenBank U51210，U19789，U28658或L20566]；甘油-3-磷酸酶(EC3.1.3.-)[GenBank Z38060或U18813×11]；葡萄糖-1-磷酸酶(EC3.1.3.10)[GenBank M33807]；葡萄糖-6-磷酸酶(EC3.1.3.9)[GenBank U00445]；果糖-1，6-二磷酸酶(EC 3.1.3.11)[GenBankX12545或J03207]或磷酯酰甘油磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.27)[GenBankM23546和M23628]。

已知编码甘油激酶的基因。例如，来自酵母属的编码甘油激酶的GUT1已被分离并测序(Pavlik等人，当代遗传学(Curr.Genet.)24，21，(1993))，并且编码SEQ ID NO：18给出的氨基酸序列的SEQ ID NO：10给出了其碱基序列。技术人员知晓虽然在天然条件下甘油激酶催化甘油的降解，但在合适的反应能量条件下同一种酶应能进行甘油的合成，将甘油-3-磷酸转化为甘油。存在通过甘油激酶产生甘油的证据。在无氧或抑制呼吸的条件下，布氏锥虫(Trypanosomabrucei)在甘油-3-磷酸和ADP存在时产生甘油。此反应发生于酵解酶体(D.Hammond，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)260，15646-15654，(1985))。

宿主细胞

用于1，3-丙二醇重组生产的合适的宿主细胞可以为原核的或真核的，并且仅以宿主细胞表达活性酶的能力来限制。优选的宿主是一般应用于甘油或1，3-丙二醇的生产的那些，例如柠檬酸杆菌属，肠杆菌属，梭状芽孢杆菌属，克雷伯氏菌属，气杆菌属，乳杆菌属，曲霉属，酵母属，裂殖酵母属，接合酵母属，毕氏酵母属，克鲁维酵母属，假丝酵母属，汉逊酵母属，德巴利酵母属，毛霉属，球拟酵母属，甲基细菌属，埃希氏菌属，沙门氏菌属，芽孢杆菌属，链霉菌属和假单胞菌属。本发明中最优选的是大肠杆菌、克雷伯氏菌属的菌株以及酵母属的菌株。

腺苷钴胺素(辅酶B₁₂)对于甘油脱水酶活性是一种重要的辅助因子。这种辅酶是已知的最复杂的非聚合天然产物，并且其体内合成通过应用约30种基因产物进行。在原核生物中发现了辅酶B₁₂的合成，其中一些能够从头合成此化合物，而另一些能够进行部分反应。例如大肠杆菌不能形成咕啉环结构，但能够催化咕啉醇酰胺转化为类咕啉并且能引入脱氧腺苷基团。

真核生物不能从头合成辅酶B₁₂，并且作为代替从细胞外环境转运进维生素B₁₂，然后此化合物被细胞的酶转化为活性形式的化合物。已经描述了用于这一系列反应的三种酶的活性：1)水钴胺素还原酶(EC 1.6.99.8)将Co(III)还原为Co(II)；2)钴(II)胺素还原酶(EC1.6.99.9)将Co(II)还原为Co(I)；和3)钴(I)胺素腺苷转移酶(EC1.5.1.17)将5′脱氧腺苷部分从ATP转移到还原的类咕啉。最后一种酶的活性是三种当中表征最全面的一种，并且被鼠伤寒沙门氏杆菌的cobA、大肠杆菌的btuR和P.denitrificans的cobO编码。这三种钴(I)胺素腺苷转移酶基因已被克隆和测序。钴(I)胺素腺苷转移酶活性已在人成纤维细胞和分离的鼠线粒体中检测到(Fenton等人，生物化学生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)98，283-9，(1981))。涉及钴还原的两种酶表征不全面并且未得到基因序列。已有关于来自小眼虫(Euglena gracillus)的水钴胺素还原酶(Watanabe等人，生物化学生物物理学文献(Arch.Biochem.Biophys)305，421-7，(1993))以及来自鼠成纤维细胞的存在于微粒体和线粒体内膜部分的微粒体钴(II)胺素还原酶(Pezacka，(Biochem.Biophys.Acta)1157，167-77，(1993))的报道。

含维生素B₁₂的补充培养基可以满足许多微生物中甘油脱水酶活性所需的辅酶B₁₂的产生，但在一些情况下必需在体内另外补充或增加催化活性。真核生物中尤其需要增加了的辅酶B₁₂合成。有了已发表的编码钴(I)胺素腺苷转移酶的基因序列，本领域的技术人员能够完成此基因的克隆和表达。例如，设想酵母如酵母属可以被如此构建，使其除了含有对将碳底物(如葡萄糖)转化为1，3-丙二醇的必需的基因以外，还含有编码钴(I)胺素腺苷转移酶的基因。用于钴还原反应的基因的克隆和表达需要另外的途径。这可以建立在筛选到以乙醇胺为唯一氮源进行生长的大肠杆菌的基础上。在辅酶B₁₂存在时，乙醇胺裂解酶使细胞能在无其它氮源时生长。如果大肠杆菌细胞包含克隆的钴(I)胺素腺苷转移酶基因和来自另一种生物的随机克隆DNA，水钴胺素存在时在乙醇胺上的生长会被促进，并且如果随机克隆的DNA编码钴还原特性，应加以筛选以促进水钴胺素的腺苷化。

甘油脱水酶是一种多亚单位的酶，包含三个以a₂b₂g₂构型排列的蛋白质组分(Seyfried等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)5793-5796(1996))。此构型是一种无活性的脱辅基酶，其结合一分子的辅酶B₁₂后变成有催化活性的全酶。在催化反应中，全酶经过迅速的一级失活后变成无活性的复合物，其中辅酶B₁₂已被转移给羟基钴胺素(Z.Schneider和J.Pawelkiewicz，( ACTA Biochim.Pol)311-328(1966))。甘油脱水酶与作为底物的甘油反应的化学计量分析表明在失活以前每分子的酶催化100,000个反应(Z.Schneider和J.Pawelkiewicz，(ACTA Biochim.Pol.)311-328)。在体外此失活复合物只能通过用镁和亚硫酸盐的强化学处理，去除羟基钴胺素，以另加的辅酶B₁₂替换才能被再激活，(Z.Schneider等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)3388-3396(1970))。野生型肺炎克雷伯氏菌中失活的甘油脱水酶可以在辅酶B₁₂、腺苷5’-三磷酸(ATP)、和锰存在时在原位(甲苯化(toluenized)细胞)被再激活(S.Honda等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)1458-1465(1980))。已表明这种再激活是由于ATP依赖的用辅酶B₁₂替换无活性的钴胺素(K.Ushio等人，维生素营养学杂志(J.Nutr.Sci.Vitaminol.)225-236(1982))。经原位催化ATP、锰和辅酶B₁₂依赖的再激活处理的甲苯化细胞之细胞提取物就这种再激活而言是无活性的。因此，没有强化学还原处理或者细胞介导的失活辅助因子替换，每分子的甘油脱水酶只能催化100,000个反应。

本发明表明蛋白质X的存在对于体内脱水酶的再激活很重要，而且能产生1，3-丙二醇的宿主细胞在蛋白质X存在时其1，3-丙二醇产量提高。本发明也公开了与蛋白质X一起，蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3的存在也提高了产生1，3-丙二醇的宿主细胞的1，3-丙二醇产量。

除大肠杆菌和酵母属外，克雷伯氏菌属也是尤其优选的宿主。已知肺炎克雷伯氏菌在以甘油为唯一碳源生长时产生1，3-丙二醇。认为克雷伯氏菌可以被遗传性改变以从单糖、寡糖、多糖或一碳底物产生1，3-丙二醇。

为了改造这些菌株，最好能提供携带受一或多个组成型或诱导型启动子控制的基因的克雷伯氏菌宿主，这些基因可以单独或一起促进磷酸二羟丙酮转化为甘油以及甘油转化为1，3-丙二醇。分别编码甘油-3-磷酸脱氢酶和甘油-3-磷酸酶的DAR1和GPP2基因的导入提供了克雷伯氏菌从合适的碳源产生1，3-丙二醇的遗传机制。

编码蛋白质X、蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3或其它与1，3-丙二醇产生相关的酶基因(例如，G3PDH、G3P磷酸酶、dhaB和/或dhaT)可以被导入任何能在肺炎克雷伯氏菌中复制的质粒，或者它们可以被整合进肺炎克雷伯氏菌基因组。例如，已知肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955和肺炎克雷伯氏菌ECL 2106对四环素或氯霉素敏感；因而可以用能在肺炎克雷伯氏菌中复制并且能编码对这两种抗生素的一种或全部抗性的质粒载体将这些基因导入肺炎克雷伯氏菌。用目的基因转化克雷伯氏菌的方法普通并且为本领域所熟知，合适的方案，包括合适的载体和表达技术见Sambrook，出处同上。

载体和表达盒

本发明提供了用于在合适的宿主细胞中克隆、转化和表达蛋白质X、蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3以及其它与产生1，3-丙二醇相关的蛋白质(如G3PDH和G3P磷酸酶)的许多载体和转化以及表达盒。合适的载体是与所用细菌相适合的那些。合适的载体可以衍生自例如细菌、病毒(如噬菌体T7或M-13衍生的噬菌体)、粘粒、酵母或植物。获得和应用这些载体的方法为本领域的人所了解(Sambrook等人，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition)卷1，2，3冷泉港实验室，冷泉港(Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989))。

一般，载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、一个选择性标记以及容许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含一个位于5’区域的包含控制转录起始的基因以及一个位于3’区域的控制转录终止的DNA片段。虽然可以理解的是该控制区域不必衍生自对于所选作为生产宿主的特定菌种为天然的基因，最优选的是两个控制区域都衍生自与转化的宿主细胞同源的基因。

对于本领域的技术人员，用于指导蛋白质X和蛋白质1、蛋白质2或蛋白质3在期望宿主细胞中表达的起始控制区域或启动子是大量而且熟悉的。实际上任何能驱动这些基因的启动子都适用于本发明，包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在酵母属的表达)；AOX1(用于在毕氏酵母属的表达)；以及lac、trp、IP_L、IP_R、T7、tac、和trc(用于在大肠杆菌的表达)。

终止控制区域可以衍生自对优选宿主为天然的多种基因。或者，终止位点可以为非必需，但如果含有则为最优选的。

为了有效地表达此酶，编码此酶的DNA通过起始密码子有效地连接到选择的表达控制区域，这样表达导致了合适的信使RNA的形成。

为生产1，3-丙二醇目的之合适宿主的转化以及基因的表达

构建了合适的盒后用它们转化合适的宿主细胞。单独地或共同地包含dhaB活性、dhaB蛋白质X和至少一种蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3以及任选的包括1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)的盒的导入，可以用已知方法导入宿主细胞，例如转化(例如用钙渗透处理的细胞、电穿孔法)或利用重组噬菌体病毒的转染(Sambrook等人，出处同上)。在本发明中，用dhaB的亚单位1、2和3以及dha蛋白质X转化大肠杆菌DH5α。

另外，构建了包含编码甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)和甘油-3-磷酸酶(G3P磷酸酶)、甘油脱水酶(dhaB)以及1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)的大肠杆菌W2042(ATCC 98188)。另外，构建了包含质粒pMCK10、pMCK17、pMCK30和pMCK35的酿酒酵母YPH500(ATCC 74392)，其包含编码甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)和甘油-3-磷酸酶(G3P磷酸酶)、甘油脱水酶(ahaB)以及1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)的基因。上述的两种经转化的大肠杆菌和酵母菌都代表了本发明的优选的实施方案。

培养基和碳底物

本发明的发酵培养基必须包含合适的碳底物。合适的底物可以包括但不限于单糖如葡萄糖和果糖，寡糖如乳糖或蔗糖，多糖如淀粉或纤维素，或者其混合物，以及来自可再生原料如奶酪乳清液(cheesewhey permeate)，玉米浸汁，甜菜糖浆和大麦麦芽。另外，碳底物也可以是一碳底物如二氧化碳，或者已被证明经过代谢转化成为关键的生物化学中间物的甲醇。已报道甲基营养型酵母(Yamada等人，农业生物化学(Agric.Biol.Chem.)53(2)541-543，(1989))以及细菌(Hunter等人，生物化学(Biochemistry)24，4148-4155，(1985))可从一碳来源(例如甲醇、甲醛或甲酸盐)产生甘油。这些生物能同化氧化状态从甲烷到甲酸盐的一碳化合物并且产生甘油。碳同化的途径可以经过核酮糖一磷酸、丝氨酸、或木酮糖一磷酸(Gottschalk，细菌代谢( Bacterial Metabolism)第二版，Springer-Verlag：New York(1086))。核酮糖一磷酸途径涉及甲酸盐与核酮糖-5-磷酸缩合形成六碳糖，再变成果糖，最后成为三碳产物甘油醛-3-磷酸。相类似，在丝氨酸途径中，同化的一碳化合物经过甲叉四氢叶酸进入糖酵解途径。

已知甲基营养型生物除了利用一碳和二碳底物外，还能利用许多其它的含碳化合物如甲胺、葡萄糖胺以及许多氨基酸用于代谢活动。例如，已知甲基营养型酵母能利用碳源甲胺形成海藻糖或甘油(Bellion等人，(Microb.Growth C₁ Compd.)，[Int.Symp.]，7th(1993)，415-32，编者：Murrell，J.Collin；Kelly，Don P，出版：Intercept，Andover，英国)。相类似，很多假丝酵母属的种类能够代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，微生物学文献(Arch.Microbiol.)，153(5)，485-9(1990))。因此，本发明利用的碳源包括很多种类的含碳底物，并且仅受宿主生物要求的限制。

虽然认为所有上述碳底物和其混合物都适用于本发明，优选的碳底物是单糖、寡糖、多糖，和一碳底物。更优选的是糖类如葡萄糖，果糖，蔗糖和一碳底物如甲醇和二氧化碳。最优选的是葡萄糖。

除了合适的碳源外，发酵培养基必须包含本领域技术人员熟知的合适的矿物质、盐类、辅助因子、缓冲剂和其它组分，这些成分适合培养物的生长并且能促进产生甘油所需要的酶催化途径。尤其被关注的是钴(II)盐和/或维生素B₁₂或其前体。

培养条件

一般，在合适的培养基中30℃培养细胞。本发明中优选的培养基是普通的商业化制备的培养基如Luria Bertani(LB)培养基，Sabouraud Dextrose(SD)培养基或酵母粉麦芽汁提取物(YM)培养基。也可以用其它的特定或合成的培养基，用于特定微生物生长的合适的培养基应为微生物学或发酵学领域的技术人员熟知。反应基质中也可以加入已知能直接或间接调节降解物阻遏的物质，例如环腺苷2′：3′-一磷酸或环腺苷2′：5′-一磷酸。相类似，已知能调节酶活性并导致甘油产量提高的物质(例如亚硫酸盐、亚硫酸氢盐和碱)也可以与遗传操作一起使用或者作为其替代物。

用于发酵的合适的pH范围在pH5.0到pH9.0之间，其中pH6.0到pH8.0作为起始条件的优选范围。

反应可以在有氧或无氧条件下进行，其中优选无氧或微需氧条件。

分批和连续发酵

本方法用分批发酵的方法。经典的分批发酵是一个封闭的系统，其中基质的组分在发酵开始时确定并且在发酵过程中不进行人为的改变。因而，在发酵开始时基质中接种了所需的一种或多种生物，并且进行发酵时不向系统中再加入任何材料。然而一般，分批发酵是根据加入的碳源“批量”进行的，并且经常需要控制例如pH和氧浓度等因素。分批系统中的代谢物和生物量组分始终在改变直到发酵结束。在分批培养物中细胞经过稳定的迟滞期到达迅速生长的对数期，最后到达生长速率停止或暂停的静止期。如果不加以处理，静止期的细胞最后会死亡。通常处于对数期的细胞产生大量的终产物或代谢中间物。

标准的分批系统的变型之一是也适合于本发明的分批补料(Fed-Batch)发酵系统。在此标准分批系统的变型中，发酵进行时以增加的量加入底物。当降解物阻遏开始抑制细胞的代谢时以及期望基质中含有有限量的底物时，适合应用分批补料系统。难以测定分批补料系统中确切的底物浓度，因此根据可测量因素如pH、溶解氧和废气如CO₂的分压进行估计。分批发酵和分批补料发酵普通并且为本领域所熟知，应用举例参见Brock，出处同上。

也认为此方法可适用于连续发酵。连续发酵是一个开放系统，其中在发酵进行中将特定的发酵基质连续加入到生物反应器中，同时取出等量的一定条件的基质。连续发酵通常保持培养物始终处于高密度，其中的细胞主要处于对数生长期。

连续发酵容许调节影响细胞生长或终产物浓度的一个或多个因素。例如，有一种方法保持有限的营养物如碳源或氮源的水平维持固定的比率而允许其它因素的改变。在其它系统中许多影响生长的因素可以持续变化，而根据基质浊度测定的细胞浓度维持恒定。连续发酵系统意在维持稳定的生长条件的状态，因而在发酵中由于取出基质导致的细胞损失与细胞生长比率保持平衡。连续发酵工艺中调整营养物和生长因素的方法以及将产物得率最大化的技术为工业微生物领域所熟知，并且很多方法被Brock，出处同上详细描述。

本发明可以采用分批、分批补料或连续发酵工艺并且任何已知形式的发酵都是可行的。另外，可以考虑将细胞作为完整细胞催化剂固定于底物上并经历适合生产1，3-丙二醇的发酵条件。

1，3-丙二醇生产途径中的改变

代表性的酶催化途径从葡萄糖产生1，3-丙二醇可以用下面的一系列步骤完成。该系列代表了本领域技术人员了解的很多途径。在一系列步骤中葡萄糖被糖酵解途径的酶转化成磷酸二羟丙酮(DHAP)和3-磷酸甘油醛(3-PG)。然后通过DHAP水解形成二羟丙酮(DHA)后再被还原形成甘油，或者通过DHAP还原为甘油-3-磷酸(G3P)后再被水解都可形成甘油。水解步骤可以被任何种类的已知对其底物特异或非特异的细胞磷酸酶催化，或者可以通过重组将此活性引入宿主。还原步骤可以被NAD⁺(或NADP⁺)偶联的宿主酶催化，或者可以通过重组将此活性引入宿主。需要注意的是dha调节子包含一个催化方程式3所示可逆反应的甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)。

(方程式1)

(方程式2)

(方程式3)

如上面详细描述的，甘油经过中间产物3-羟基丙醛(3-HP)转化为1，3-丙二醇。在由宿主编码的或可通过重组引入宿主的脱水酶催化下由甘油产生中间产物3-HP(方程式1)。此脱水酶可以是甘油脱水酶(E.C.4.2.1.30)，二醇脱水酶(E.C.4.2.1.28)，或任何其它能催化此转化反应的酶。甘油脱水酶，而不是二醇脱水酶，由dha调节子编码。在NAD⁺(或NADP⁺)偶联的宿主酶或者通过重组引入宿主的酶活性催化下从3-HP产生1，3-丙二醇(方程式2)。这一生产1，3-丙二醇的终反应可以被1，3-丙二醇脱氢酶(E.C.1.1.1.202)或其它乙醇脱氢酶催化。

影响碳途径的突变和转化

包含改变的1，3-丙二醇产生途径的多种突变体生物可以应用于本发明。将磷酸丙糖异构酶突变(tpi-)引入微生物是通过碳途径改良性状的突变之应用例子。或者，降低乙醇(adh)或乳酸盐(ldh)产生的突变能增加用于生产1，3-丙二醇的NADH产量。其它的糖酵解中甘油醛-3-磷酸之后的步骤如磷酸甘油酸变位酶(pgm)的突变可以用于促进碳进入1，3-丙二醇的产生途径。抑制PEP损失的影响葡萄糖转运系统如PTS的突变也证明是有用的。阻断1，3-丙二醇产生途径的中间产物的替代途径如甘油分解途径(glp)的突变也可以用于本发明。突变可以针对结构基因以降低或促进酶的活性，或者针对调节基因以调节酶活性的表达水平。

或者，转化可以与突变结合以控制特定的酶活性，从而提高1，3-丙二醇的产量。因此期望通过修饰完整细胞催化剂来提高1，3-丙二醇的产量均属于本发明的范围。

1，3-丙二醇的鉴定和纯化

从发酵基质中纯化1，3-丙二醇的方法为本领域熟知。例如，通过将反应混合物进行有机溶剂抽提、蒸馏和柱层析可以从细胞基质获得丙二醇(U.S.5,356,812)。用于此方法的尤其合适的有机溶剂是环己烷(U.S.5,008,473)。

通过对基质进行高压液相层析(HPLC)分析可以直接鉴定1，3-丙二醇。本发明优选的一种方法是用分析离子交换柱以无梯度形式的0.01N的硫酸为流动相分析发酵基质。

G3PDH和G3P磷酸酶的鉴定和纯化

用酶分析方法测量蛋白质G3PDH和G3P磷酸酶的表达水平，G3PDH活性分析依据DHAP转化为G-3-P反应中的辅助底物NADH的光谱性质。NADH具有固有的UV/可见光吸收并且其吸收可以在340nm用分光光度法检测。通过测定反应中释放的无机磷酸的方法可以测定G3P磷酸酶的活性。最常用的检测方法是用可见光光谱分析测定兰色的钼磷酸铵复合物。

实施例

一般方法

磷酸化、连接和转化的步骤在本领域中众所周知。可在Sambrook等人，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Second Edition)卷1，2，3冷泉港实验室，冷泉港(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989))中找到适合用于下列实施例的技术。

适合细菌培养物维持和生长的材料和方法在本领域中众所周知。可在如普通细菌学方法手册( Manual of Methods for General Bacteriology)(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg G.和Briggs Phillips，编)，美国微生物学协会，Washington，DC.(1994)或者Thomas D.Brock生物技术学：工业微生物学教科书，第二版，( Biotechnology：A Txetbook of Industrial Microbiology，SecongEdition)Sinayer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)中找到适合用于下列实施例的技术。除非另外指明，所有用于细菌细胞生长和维持的试剂和材料可以从Aldrich Chemical(Milwaukee，WI)，DIFCO实验室(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或Sigma化学公司(St.Louis，MO)获得。

缩写的意思如下：“h”指小时，“min”指分钟，“sec”指秒，“d”指天，“mL”指毫升，“L”指升。

酶分析

用1，2-丙二醇为底物确定无细胞抽提物中甘油脱水酶的活性。基于醛与甲苯-2-噻唑酮腙的反应的此分析方法由Forage和Foster((Biochim.Biophys.Acta.)，569，249(1979))描述。如Johnson和Lin，细菌学杂志(J.Bacteriol.)，169，2050(1987)所描述，用1，3-丙二醇和NAD+为底物在溶液中或在平板胶中测定有时被称为1，3-丙二醇脱氢酶的1，3-丙二醇氧化还原酶的活性。如所描述的(R.M.Bell和J.E.Cronan，Jr.，生物化学杂志(J.Biol. Chem.)250：7153-8(1975))，在NADH或NADPH耗尽之后，用分光光度测定法测定NADH或NADPH依赖的甘油3-磷酸脱氢酶(G3PDH)的活性。

Honda等人(1980，甘油灭活的辅酶B 12依赖性酶、甘油脱水酶和二醇脱水酶的原位再激活细菌学杂志143：1458-1465)公开了测定脱水酶再激活的分析实验。

甘油-3-磷酸酶，GPP的分析

通过将抽提物与bis-Tris或MES和pH6.5的镁离子缓冲液中的有机磷酸底物孵育进行酶活性分析。使用的底物是l-a-甘油磷酸；d，l-a-甘油磷酸。分析中试剂的终浓度为：缓冲液(20mM bis-Tris或50mMMES)；MgCl₂(10mM)；以及底物(20mM)。如果样品中总蛋白很少并且用酸终止反应无可见沉淀发生，则方便地在比色杯中分析样品。此方法包括在含20mM底物(50mL，200mM)，50mM MES，10mM MgCl₂，pH6.5缓冲液的比色杯中孵育酶样品。磷酸酶分析终体积为0.5mL。将含酶样品加到反应混合物中；混合比色杯内成分，然后将比色杯放置于T＝37℃的循环水浴中5到10分钟，这取决于酶样品中磷酸酶活性范围是否为2到0.02U/mL。通过加入酸性钼酸盐试剂(0.4mL)终止酶反应。加入Fiske SubbaRow试剂(0.1mL)和蒸馏水(1.5mL)后，将溶液混合使之显色。10分钟后，用Cary 219 UV/可见分光光度计在660nm测样品的吸收值。将释放的无机磷酸盐的量与标准曲线比较，通过使用无机磷酸盐贮存液(0.65mM)和用终浓度范围从0.026到O.130mmol/mL的无机磷酸盐制备6个标准品制作标准曲线。

1，3-丙二醇的分离和鉴定

用HPLC监测甘油转化为1，3-丙二醇。用层析领域的技术人员可得的标准技术和材料进行分析。一种合适的方法应用使用UV(210nm)和RI检测的Waters Maxima 820 HPLC系统。将样品注射到装有Shodex SH-1011P前置柱(6mm×50mm)的Shodex SH-1011柱上(8mm×300mm，购自Waters，Milford，MA)，温度控制在50℃，用0.01NH₂SO₄作为流动相，流速为0.5mL/min。当期望进行定量分析时，用已知量的三甲基乙酸作为外标制备样品。一般，甘油(RI检测)、1，3-丙二醇(RI检测)和三甲基乙酸(UV和RI检测)的滞留时间分别为20.67min、26.08min和35.03min。

GC/MS证实了1，3-丙二醇的产生。用GC/MS领域的技术人员可得的标准技术和材料进行分析。一种合适的方法利用与Hewlett Packard5971 Series质量选择性检测器(EI)和HP-INNOWax柱(长30m，内径0.25mm.，薄膜厚0.25微米)连接的Hewlett Packard 5890 Series II气相色谱仪。比较产生的1，3-丙二醇和真正的1，3-丙二醇的滞留时间和质谱(m/e：57，58)。

GC/MS的另一方法涉及样品的衍生化。将30uL浓缩的(70％v/v)高氯酸加入到1.0mL样品(例如，培养物上清)中。混合后，冷冻并冷冻干燥样品。双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺：吡啶为1∶1的混合物(300uL)加到冻干物质中，剧烈混合并于65℃静置1小时。离心清除样品的不溶性物质。得到的液体分配成两相，上层用于分析。用DB-5柱(48m，内径0.25mm，薄膜厚0.25um；获自J&WScientific)层析样品，并且比较得自培养物上清的1，3-丙二醇衍生物与得自真正标准品的滞留时间和质谱。TMS衍生的1，3-丙二醇的质谱含有205、177、130和115AMU的特征性离子。

实施例1：用粘粒DNA克隆和转化大肠杆菌宿主细胞以表达1，3-丙二醇培养基

用合成S12培养基筛选有产生1，3-丙二醇的能力的细菌转化体。S12培养基含有：10mM硫酸铵，50mM磷酸钾缓冲液，pH7.0，2mMMgCl₂，0.7mM CaCl₂，50uM MnCl₂，1uM FeCl₃，1uM ZnCl₂，1.7uM CuSO₄，2.5uM CoCl₂，2.4uM Na₂MoO₄和2uM盐酸硫胺。

用于生长和发酵的培养基A包括：10mM硫酸铵；50mMMOPS/KOH缓冲液，pH7.5；5mM磷酸钾缓冲液，pH7.5；2mMMgCl₂；0.7mM CaCl₂；50uM MnCl₂；1uM ZnCl₂；1.72uM CuSO₄；2.53uM CoCl₂；2.42uM Na₂MoO₄；2uM盐酸硫胺；0.01％酵母抽提物；0.01％酪蛋白水解物；0.8ug/mL维生素B₁₂和50ug/mL氨苄青霉素。按要求培养基A补加0.2％甘油或0.2％甘油和0.2％D-葡萄糖。

细胞

肺炎克雷伯氏菌ECL2106(Ruch等，细菌学杂志，124，348(1075))，已知在文献中也为产气克雷伯氏菌或产气气杆菌，得自E.C.C.Lin(哈佛医学院，Cambridge，MA)并作为实验室培养物保藏。

肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。

大肠杆菌DH5α购自Gibco/BRL并且用从肺炎克雷伯氏菌ATCC25955分离的含有编码甘油或二醇脱水酶基因的粘粒DNA将其转化。含有甘油脱水酶的粘粒被称为pKP1和pKP2，含有二醇脱水酶的粘粒被称为pKP4。被转化的DH5α细胞被称为DH5α-pKP1、DH5α-pKP2和DH5α-pKP4。

大肠杆菌ECL707(Sprenger等，普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)，135，1255(1989))得自E.C.C.Lin(哈佛医学院，Cambridge，MA)并且相类似地用获自肺炎克雷伯氏菌的粘粒DNA将其转化。这些转化体被称为含有甘油脱水酶基因的ECL707-pKP1和ECL707-pKP2以及含有二醇脱水酶基因的ECL707-pKP4。

含有tpi基因突变的大肠杆菌AA200(Anderson等，普通微生物学杂志，62，329(1970))购自大肠杆菌基因储藏中心，耶鲁大学(New Haven，CT)并且用克雷伯氏菌的粘粒DNA将其转化以产生含有甘油脱水酶基因的重组体生物AA200-pKP1和AA200-pKP2以及含有二醇脱水酶基因的AA200-pKP4。

DH5α

用5mL LB培养基洗六个含有大约1000个菌落的经肺炎克雷伯氏菌DNA转染的大肠杆菌XL1-Blue MR的转化平皿并离心。沉淀细菌并将其重悬浮在5mL LB培养基+甘油中。将等量样品(50uL)接种于含有S12合成培养基以及0.2％甘油+每mL 400ng的B₁₂+0.001％酵母抽提物+50氨苄青霉素的15mL试管中。用培养基将试管加满至顶部，并用石蜡膜封口并且于30℃孵育。48小时后观察到轻微浑浊。如上所述在78小时和132小时分析等量样品的产物分布，等量样品对于1，3-丙二醇为阳性，后一个时间点含有增加量的1，3-丙二醇。

分级稀释对于1，3-丙二醇的产生测试为阳性的细菌，并且涂布到LB-50氨苄青霉素(amp)平板上以分离单个菌落。为产生1，3-丙二醇的目的分离了48个单菌落并对其再次检测。从6个非依赖性菌落分离了粘粒DNA并且将其转化进大肠杆菌DH5α中。为产生1，3-丙二醇的目的再次检测转化体。进一步表征了两个转化体并称其为Dh5α-pKP1和DH5α-pKP2。

将一个获自pKP1的12.1kb的EcoRI-SalI片段亚克隆进pIBI31(IBI Biosystem，New Haven，CT)，测序并称为pHK28-26(SEQ IDNO：19)。测序揭示了编码甘油脱水酶和调节作用必需基因的dha操纵子之相关开放阅读框架的基因座。参照SEQ ID NO：19，发现编码二羟基丙酮激酶的dhaK的开放阅读框架之片段位于1-399位碱基；发现编码甘油脱氢酶的dhaD的开放阅读框架之片段位于983-2107位碱基；发现编码抑制子的dhaR的开放阅读框架之片段位于2209-4134位碱基；发现编码1，3-丙二醇氧化还原酶的dhaT的开放阅读框架之片段位于5017-6180位碱基；发现编码甘油脱水酶α亚基的dhaB1的开放阅读框架之片段位于7044-8711位碱基；发现编码甘油脱水酶β亚基的dhaB2的开放阅读框架之片段位于8724-9308位碱基；发现编码甘油脱水酶γ亚基的dhaB3的开放阅读框架之片段位于9311-9736位碱基；以及发现编码未知功能蛋白质的dhaBX的开放阅读框架之片段位于9749-11572位碱基。

经获自肺炎克雷伯氏菌的包装粘粒DNA转染的大肠杆菌XL1-BlueMR之单菌落被接种进含200μL的S15培养基(硫酸铵，10mM；磷酸钾缓冲液，pH7.0，1mM；MOPS/KOH缓冲液，pH7.0，50mM；MgCl₂，2mM；CaCl₂，0.7mM；MnCl₂，50uM；FeCl₃，1uM；ZnCl₂，1uM；CuSO₄，1.72uM；CoCl₂，2.53uM； Na₂MoO₄，2.42uM和盐酸硫胺，2uM)+0.2％甘油+400ng/mL维生素B₁₂+0.001％酵母抽提物+50ug/mL氨苄青霉素的微滴定孔中。除微滴定孔外，也接种一块含有LB-50amp的主平皿。96小时后，取出100uL并在具有0.2微米尼龙膜过滤器的Rainin微离心管中离心。保留细菌并且对滤出物进行HPLC分析。筛选大约240个菌落后鉴定表明产生1，3-丙二醇的阳性菌落。鉴定了三个阳性菌落，其中两个在LB50-amp上生长而一个不能不能在其上生长。分离出在LB-50amp上生长的两个阳性菌落之一的单菌落并证实产生1，3-丙二醇，称之为pKP4。从含有pKP4的大肠杆菌菌株分离出粘粒DNA并且转化大肠杆菌菌株DH5α。证实称为DH5α-pKP4的非依赖性转化体能产生1，3-丙二醇。

ECL707：

用相应于pKP1、pKP4其中之一或单独的Supercos载体的粘粒肺炎克雷伯氏菌DNA转化大肠杆菌菌株ECL707，并将其分别命名为ECL707-pKP1、ECL707-pKP2、ECL707-pKP4和ECL707-sc。ECL707中glpK、gld和ptsD是缺陷型的，其分别编码用于磷酸烯醇丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统的二羟基丙酮的ATP依赖性甘油激酶、NAD⁺偶联的甘油脱氢酶和酶II。

将从LB50-amp平板上分离的20个均为粘粒转化的单菌落和5个单独的Supercos载体(阴性对照)转化的菌落转移到主LB-50amp平板上。为了确定这些分离物是否含有脱水酶活性也检测它们将甘油转化成1，3-丙二醇的能力。用无菌牙签将转化体转移到含有200uL补加了0.2％甘油或0.2％甘油加0.2％D-葡萄糖的培养基A之微量滴定板中。30℃孵育48小时后，用0.45微米尼龙过滤器过滤微量滴定板孔的内容物并对其进行HPLC层析。表1中给出了这些测试的结果。

表1由经转化的ECL707将甘油转化至1，3丙二醇

转化体甘油 ^* 甘油加葡萄糖 ^*

ECL707-pKP1 19/20 19/20

ECL707-pKP2 18/20 20/20

ECL707-pKP4 0/20 20/20

ECL707-sc 0/5 0/5

^*表示阳性分离物数目/测试的分离物总数

AA200：

用相应于pKP1、pKP2、pKP4其中之一和单独的Supercos载体的粘粒肺炎克雷伯氏菌DNA转化大肠杆菌菌株AA200并将其分别命名为AA200-pKP1、AA200-pKP2、AA200-pKP4和AA200-sc。菌株AA200为磷酸丙糖异构酶缺陷型(tpi)。

如描述大肠杆菌菌株ECL707时所述，分离了每种粘粒转化的20个单菌落和5个空载体转化菌落并检测了它们将甘油转化为1，3-丙二醇的能力。表2给出了这些测试的结果。

表2由经转化的AA200将甘油转化至1，3丙二醇

转化体甘油 ^* 甘油加葡萄糖 ^*

AA200-pKP1 17/20 17/20

AA200-pKP2 17/20 17/20

AA200-pKP4 2/20 16/20

AA200-sc 0/5 0/5

^*表示阳性分离物数目/测试的分离物总数

实施例2：重组体大肠杆菌利用DAR1、GPP2、dhaB和dhaT将D-葡

萄糖转化成1，3-丙二醇

构建用于大肠杆菌转化的一般目的之表达质粒

表达载体pTaclQ

大肠杆菌表达载体pTaclQ含有插入到pBR322的EcoRI的laclq基因(Sutcliffe等，(Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.)43，77(1979))(Farabaugh，自然(Nature)274，5673(1978)和tac启动子(Amann等，基因(Gene)25，167(1983)。多克隆位点和终止子序列(SEQ ID NO：20)取代了pBR322的从EcoRI到SphI的序列。

甘油脱水酶基因的亚克隆(dhaB1，2，3)

使用引物(SEQ ID NO：21和22)通过PCR从pHK28-26扩增dhaB3基因的开放阅读框架(在5′末端引入了一个EcoRI位点以及在3′末端引入了一个XbaI位点)。将产物亚克隆进pLitmus29(NewEngland Biolab，Inc.，Beverly，MA)以产生含有dhaB3的质粒pDHAB3。

使用限制性酶KpnI和EcoRI将包含获自pHK28-26的dhaB操纵子之4个基因的完整编码区域的区域克隆进pBluescriptII KS+(Stratagene，La Jolla，CA)以构建质粒pM7。

通过用ApaI和XbaI(删除部分dhaB3和所有的dhaBX)酶解含有dhaB(1，2，3，4)的质粒pM7去除dhaBX基因。纯化所得的5.9kb片段并将其与获自质粒pDHAB3的325-bp ApaI-XbaI片段连接(恢复dhaB3基因)以建立含有dhaB(1，2，3)的pM11。

使用引物(SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24)通过PCR从pHK28-26扩增dhaB1基因的开放阅读框架(在5′末端引入了一个HindIII位点和一个共有RBS核糖体结合位点以及在3′末端引入了一个XbaI位点)。将产物亚克隆进pLitmus28(New England Biolab，Inc.)以产生含有dhaB1的质粒pDT1。

将获自含有dhaB1基因、dhaB2基因和dhaB3基因的一部分的pM11之NotI-XbaI片段插入pDT1以建立dhaB表达质粒pDT2。将含有获自pDT2的dhaB(1，2，3)基因之HindIII-XbaI片段插入pTaclQ以建立pDT3。

1，3-丙二醇脱氢酶基因(dhaT)的亚克隆

将含有完整1，3-丙二醇脱氢酶(dhaT)基因的pHK28-26之KpnI-SacI片段亚克隆进pBluescriptII KS+得到了pAH1。使用合成引物(SEQ ID NO：25以及SEQ ID NO：26)从作为模板DNA的pAH1用PCR扩增dhaT基因(在5′末端引入了一个XbaI位点以及在3′末端引入了一个BamHI位点)。将产物亚克隆进pCR-Script(Stratagene)的SrfI位点产生含有dhaT的质粒pAH4和pAH5。质粒pAH4含有用于从pCR-Script中lac启动子开始表达的正确方向的dhaT基因，pAH5含有反方向的dhaT基因。将获自含有dhaT基因的pAH4之XbaI-BamHI片段插入pTaclQ产生质粒pAH8。将获自含有RBS和dhaT基因的pAH8之HindIII-BamHI片段插入pBluescript KS+建立pAH11。将获自含有RBS、dhaT基因和终止子的pAH8之HindIII-SalI片段插入pBluescriptII SK+建立pAH12。

dhaB(1，2，3)和dhaT的表达盒的构建

使用标准分子生物学方法从上述单独dhaB(1，2，3)和dhaT亚克隆组装dhaB(1，2，3)和dhaT的表达盒。将获自含有RBS、dhaT基因和终止子的pAH8之SpeI-KpnI片段插入pDT3的XbaI-KpnI位点以建立pAH23。去除pAH23的dhaB3和dhaT基因之间的SmaI-EcoRI片段以建立pAH26。用含有获自pDT2的EcoRI位点之SpeI-NotI片段取代pAH26的SpeI-NotI片段以产生pAH27。

dhaT和dhaB(1，2，3)表达盒的构建

使用标准分子生物学方法从前述单独的dhaB(1，2，3)和dhaT亚克隆组装dhaT和dhaB(1，2，3)的表达盒。将含有获自pDT3的dhaB(1，2，3)基因之SpeI-SacI片段插入pAH11的SpeI-SacI位点以建立pAH24。

用于增加大肠杆菌中甘油产量的甘油3-磷酸酶的克隆和表达

酿酒酵母的染色体Vλ克隆6592(Gene Bank，保藏号# U18813×11)得自ATCC。使用合成引物(SEQ ID NO：27以及SEQ IDNO：28)从作为靶DNA的λ克隆通过PCR克隆方法克隆到甘油3-磷酸磷酸酶(GPP2)基因(在5 ′末端引入了一个BamHI-RBS-XbaI位点以及在3′末端引入了一个SmaI位点)。将产物亚克隆进pCR-Script(Stratagene)的SrfI位点以产生含有GPP2的质粒pAH15。质粒pAH15含有对于从pCR-Script SK+中lac启动子表达为无活性方向的GPP2基因。将获自含有GPP2基因的pAH15之BamHI-SmaI片段插入pBlueScriptII SK+以产生质粒pAH19。PAH19含有对于从lac启动子表达为正确方向的GPP2基因。将获自含有GPP2基因的pAH19之XbaI-PstI片段插入pPHOX2以建立质粒pAH21。

用于表达dhaT、dhaB(1，2，3)和GPP2基因的质粒

将一个SalI-EcoRI-XbaI接头(SEQ ID NO：29和30)插入用限制性酶SalI-XbaI酶解的pAH5以产生pDT16。接头破坏了XbaI位点。然后将获自pDT16的1kb之SalI-MluI片段插入pAH24，取代了现存的SalI-MluI片段以建立pDT18。

将含有获自pDT18的dhaT和dhaB(1，2，3)之表达盒的4.1kb EcoRI-XbaI片段和含有获自pAH21的GPP2基因之1.0kb的XbaI-SalI片段插入用限制性酶EcoRI和SalI酶解的载体pMMB66EH(F^*ste等，基因(GENE)，48，119(1986))以建立pDT20。

用于在大肠杆菌中过量表达DAR1的质粒

使用合成引物(SEQ ID NO：46以及SEQ ID NO：47)从酿酒酵母基因组DNA通过PCR克隆分离DAR1。成功的PCR克隆在DAR1 5′末端引入一个NcoI位点，NcoI内的ATG是DAR1的起始甲硫氨酸。在DAR1的3’端翻译终止子之后引入一个BamHI位点。用NcoI+BamHI酶解PCR片段并将其克隆进表达质粒pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)内的相同位点以产生pDAR1A。

为了在DAR1的5′末端建立更好的核糖体结合位点，将通过合成引物(SEQ ID NO：48以及SEQ ID NO：49)退火得到的一个SpeI-PBS-NcoI接头插入pDAR1A的NcoI位点以建立pAH40。质粒pAH40含有对于从Trc99A(Pharmacia)的trc启动子表达为正确方向的新RBS和DAR1基因。将获自pDAR1A的NcoI-BamHI片段和通过合成引物(SEQ IDNO：31以及SEQ ID NO：32)退火得到的第二套SpeI-RBS-NcoI接头插入pBluescript II-SK+(Stratagene)的SpeI-BamHI位点以建立pAH41。构件pAH41含有氨苄青霉素抗性基因。将获自pDAR1A的NcoI-BamHI片段和通过合成引物(SEQ ID NO：31以及SEQ ID NO：32)退火得到的第二套SpeI-RBS-NcoI接头插入pBC-SK+(Stratagene)的SpeI-BamHI位点以建立pAH42。构件pAH42含有氯霉素抗性基因。

DAR1和GPP2的表达盒的构建

使用标准分子生物学方法从上述单独的DAR1和GPP2亚克隆组装DAR1和GPP2的表达盒。将含有RBS和GPP2基因的获自pAH19之BamHI-PstI片段插入pAH40以建立pAH43。将含有RBS和GPP2基因的获自pAH19之BamHI-PstI片段插入pAH41以建立pAH44。将含有RBS和GPP2基因的获自pAH19之相同的BamHI-PstI片段插入pAH42以建立pAH45。

如下改造位于GPP2 5′末端的核糖体结合位点。将由合成引物GATCCAGGAAACAGA以及CTAGTCTGTTTCCTG与含有GPP2基因的获自pAH19之XbaI-PstI片段退火得到的BamHI-RBS-SpeI接头插入pAH40的BamHI-PstI位点以建立pAH48。质粒pAH48含有对于从Trc99A(Pharmacia，Piscataway，N.J.)的trc启动子表达为正确方向的DAR1基因、改造的RBS和GPP2基因。

大肠杆菌菌株的构建

大肠杆菌W1485是野生型K-12菌株(ATCC 12345)。用质粒pDT20和pAH42转化此菌株并在补加了50mg/mL羧苄青霉素和10mg/mL氯霉素的LA(Luria Agar，Difco)平板上对其进行选择。

从葡萄糖产生1，3-丙二醇

将大肠杆菌W1485/pDT20/pAH42从平板转移到50mL培养基中，每升培养基含有：22.5g葡萄糖，6.85g K₂HPO₄，6.3g(NH₄)₂SO₄，0.5g NaHCO₃，2.5g NaCl，8g酵母抽提物，8g胰蛋白胨，2.5mg维生素B₁₂，2.5mL改进的Balch微量元素溶液，50mg羧苄青霉素和10mg氯霉素，终pH6.8(HCl)，然后过滤除菌。在普通和分子细菌学方法( Methods for General and Molecular Bacteriology)(P.Gerhardt等人，编，158页，美国微生物学协会，Washington，DC(1994))中能找到改进的Balch微量元素溶液的组分。在37℃，300转/分孵育6小时后，加入0.5g葡萄糖和IPTG(终浓度＝0.2mM)并且转速降到100转/分。通过GC/MS分析样品。24小时后，W1485/pDT20/pAH42产生1.1g/L的甘油和195mg/L的1，3-丙二醇。

实施例3：dhaB和dhaT在酿酒酵母中的克隆和表达

为4个dha基因的每一个都构建了能作为复制游离基因元件存在的表达质粒。对于所有的表达质粒来说存在酵母ADH1启动子，并通过含有一种或多种限制性内切酶识别位点的DNA片段与酵母ADH1转录终止子分开。每个表达质粒也含有用于在含有氨苄青霉素的培养基上筛选大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因、用于在大肠杆菌中维持质粒的复制起点以及用于在酿酒酵母中维持的2微米(micron)的复制起点。酵母使用的并且存在于表达质粒上的选择性营养标记为下列之一：编码咪唑甘油磷酸脱水酶的HIS3基因、编码乳清酸核苷5’-磷酸脱羧酶的URA3基因、编码N-(5’-磷酸核苷)-邻氨基苯甲酸异构酶的TRP1基因和编码β-异丙基苹果酸脱氢酶的LEU2。

使用在5’末端引入了EcoRI位点的引物(对于dhaT、dhaB3、dhaB2、dhaB1分别为SEQ ID NO：38与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40与SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42与SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44与SEQ ID NO：45)通过PCR从pHK28-26(SEQ ID NO：19)扩增dhaT、dhaB3、dhaB2和dhaB1的开放阅读框架(10mM Tris pH8.3，50mMKCl，1.5mM MgCl₂，0.0001％明胶，200mM dATP，200mM dCTP，200mM dGTP，200mM dTTP，1mM每种引物，1-10ng靶DNA，25单位/mLAmplitaq^* DNA聚合酶(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk CT))。PCR参数是94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，35个循环。将产物亚克隆进pHIL-D4(Phillips Petroleum，Bartlllesville，OK)的EcoRI位点以产生分别含有dhaT、dhaB3、dhaB2和dhaB1的质粒pMP13、pMP14、pMP20和pMP15。

dhaB1表达质粒pMCK10的构建

用HindIII酶解7.8kb的复制型质粒pGADGH(Clontech，Palo Alto，CA)，经去磷酸化并与获自pMP15的dhaB1之HindIII片段连接。得到的质粒(pMCK10)含有对于从ADH1启动子开始的转录为正确方向的dhaB1并含有LEU2标记。

dhaB2表达质粒pMPCK17的构建

用HindIII酶解质粒pGADGH(Clontech，Palo Alto，CA)并通过与HindIII-XmnI和EcoRI-XmnI接头(New England Biolabs，Beverly，MA)连接将单链末端变为EcoRI末端。带有正确EcoRI末端的质粒的选择可通过如下方法实现：与获自质粒pUC4K(Pharmacia Biotech，Uppsala)的EcoRI片段上的卡那霉素抗性基因连接，转化进大肠杆菌菌株DH5α并用含有25mg/mL卡那霉素的LB平板选择。用SnaBI和EcoRI酶解得到的质粒(pGAD/KAN2)并且分离含ADH1启动子的1.8kb片段。用SnaBI和EcoRI酶解质粒pGBT9(Clontech，Palo Alto，CA)，并且通过用SnaBI和EcoRI酶解使1.5kb的ADH1/GAL4片段被从pGAD/KAN2分离到的1.8kb的ADH1启动子片段取代。得到的载体(pMCK11)是含ADH1启动子和终止子以及TRP1标记的酵母中的复制型质粒。用EcoRI酶解质粒pMCK11，将其去磷酸化并与获自pMP20的dhaB2之EcoRI片段连接。得到的质粒(pMCK17)有对于从ADH1启动子开始的转录为正确方向的dhaB2并含有TRP1标记。

dhaB3表达质粒pMCK30的构建

用NaeI和PvuII酶解质粒pGBT9(Clontech)并且将1kb的TRP1基因从该载体中除去。TRP1基因被获自质粒pRS406(Stratagene)的称为1.7kb之AatII/NaeI片段的URA3基因取代以产生中间载体pMCK32。在1.5kb的SnaBI/EcoRI片段上将pMCK32上存在的截短的ADH1启动子去除，并用获自质粒pGAD/KAN2的1.8kb之SnaBI/EcoRI片段上的全长ADH1启动子将其取代以产生载体pMCK26。使用pMCK26上单一EcoRI位点插入带有质粒pMP14的dhaB3的EcoRI片段而产生pMCK30。pMCK30复制型表达质粒有对于从ADH1启动子开始的表达为正确方向的dhaB3并且有URA3标记。

dha表达质粒pMCK35的构建

用NaeI和PvuII酶解质粒pGBT9(Clontech)并且将1kb的TRP1基因从该载体中除去。TRP1基因被获自质粒pRS403(Stratagene)的称为XmnI/NaeI片段的HIS3基因取代以产生中间载体pMCK33。在1.5kb的SnaBI/EcoRI片段上将存在于pMCK33上的截短的ADH1启动子去除并用获自质粒pGAD/KAN2的1.8kb之SnaBI/EcoRI片段上的全长ADH1启动子将其取代以产生载体pMCK31。使用pMCK31上的单一EcoRI位点插入带有质粒pMP13的dhaT的EcoRI片段而产生pMCK35。PMCK35复制型表达质粒有对于从ADH1启动子开始的表达为正确方向的dhaT并且有HIS3标记。

用dha表达质粒转化酿酒酵母

使用Frozen-EZ酵母转化试剂盒(Catalog# T2001)(ZymoResearch，Orange，CA)用1-2mg质粒DNA转化购自Stratagene(La Jolla，CA)的酿酒酵母株YPH500(ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-D63 his3-D200 leu2-D1)(Sikorski R.S.和Hieter P.，遗传学(Genetics)122，19-27，(1989))。用补加了一种或多种如下附加物的补充基础培养基(SMM-0.67％的无氨基酸酵母氮基质，2％葡萄糖)于29℃培养菌落3-4天：硫酸腺嘌呤(20mg/L)、尿嘧啶(20mg/L)、L-色氨酸(20mg/L)、L-组氨酸(20mg/L)、L-亮氨酸(30mg/L)、L-赖氨酸(30mg/L)。将菌落在选择性平板上划线并将其接种于液体培养基。

dha基因的酿酒酵母转化体的筛选

使用对每个基因特异的引物(SEQ ID NO：38-45)用PCR方法分析获自URA⁺、HIS⁺、TRP⁺、LEU⁺转化体的染色体DNA。证实了所有4个开放阅读框架的存在。

dhaB和dhaT活性在经转化的酿酒酵母中的表达

用体外酶分析证明了有活性的甘油脱水酶(dhaB)和1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)的存在。另外，western印迹分析实验证实了从所有4个开放阅读框架表达的蛋白质。

将用质粒pMCK10、pMCK17、pMCK30和pMCK35转化的酵母株YPH500接种于含有0.67％的无氨基酸酵母氮基质、2％葡萄糖、20mg/L硫酸腺嘌呤和30mg/L L-赖氨酸的补充基础培养基。将细胞匀浆并分析抽提物的dhaB活性。对于甘油脱水酶得到0.12单位/mg蛋白质的比活性，以及对于1，3-丙二醇氧化还原酶得到0.024单位/mg蛋白质的比活性。

实施例4：使用重组体酿酒酵母从D-葡萄糖产生1，3-丙二醇

将含有质粒pMCK10、pMCK17、pMCK30和pMCK35的酿酒酵母YPH500在BiostatB发酵罐(B Braun Biotech，Inc.)中培养，最初的1.0L基础培养基含有20g/L葡萄糖、6.7g/L无氨基酸的酵母氮基质、40mg/L硫酸腺嘌呤和60mg/L L-赖氨酸·HCl。在生长过程中，加入另外的酵母氮基质等同物、腺嘌呤和赖氨酸。用另外加入的10％磷酸和2M NaOH将发酵罐控制在pH5.5，30℃以及通过搅拌控制保持40％的溶解氧压力。38小时后，离心收集细胞(OD₆₀₀＝5.8AU)并将其重新悬浮在基础培养基(6.7g/L的无氨基酸酵母氮基质，20mg/L硫酸腺嘌呤，30mg/L L-赖氨酸·HCl，以及50mM磷酸钾缓冲液，pH7.0)。

在无光和无氧气(氮气喷雾)存在下，在10mL卷缩的血清瓶中制备存在于总体积为4mL的补加了0.5％葡萄糖，5ug/mL辅酶B₁₂和0、10、20或40mM氯喹的基础培养基中的含细胞(OD₆₀₀＝20AU)反应混合物，于30℃振摇孵育。30小时后，取出等量样品并进行HPLC分析。结果见表3。

表3利用重组酿酒酵母生产1，3-丙二醇

反应氯奎(mM) 1，3-丙二醇(mM)

1 0 0.2

2 10 0.2

3 20 0.3

4 40 0.7

实施例5：使用dhaB和dhaT整合进基因组的酿酒酵母双重转化体从 D-葡萄糖生产1，3-丙二醇

实施例5预言性地证明了用dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT转化酿酒酵母以及将这些基因稳定地整合进酵母基因组以从葡萄糖产生1，3-丙二醇。

表达盒的构建

为在酿酒酵母中进行这些基因的葡萄糖诱导的高水平组成性表达，构建了4个表达盒(dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT)。这些表达盒由以下组成：(i)获自酿酒酵母株S288C的磷酸甘油酯激酶(PGK)启动子；(ii)基因dhaB1、dhaB2、dhaB3或dhaT其中之一；以及(iii)获自酿酒酵母株S288C的PGK终止子。使用通过重叠延伸(overlapextension)(Horton等，生物技术(Bio Techniques)，8：528-535，(1990))的基于PCR技术的基因剪切来重组DNA序列以产生用于最佳表达各个基因的这些无缝连接表达盒。这些表达盒被单独克隆进含有适合酵母表达质粒多盒克隆的限制性位点之合适载体(pLITMUS39)。

酵母整合载体的构建

构建用于将表达盒整合进酵母基因组的载体。这些载体含有以下元件：(i)被亚克隆进表达盒的多克隆区；(ii)用于选择稳定酵母转化体的单一标记；(iii)允许转化酵母前在大肠杆菌中进行基因操作的复制起点和选择性标记。一个整合载体含有URA3营养缺陷型标记(YIp352b)，而另一个整合载体含有LYS2营养缺陷型标记(pKP7)。

酵母表达质粒的构建

将dhaB1和dhaB2的表达盒亚克隆进YIp352b(表达质粒#1)的多克隆区，并将dhaB3和dhaT的表达盒亚克隆进pKP7(表达质粒#2)的多克隆区。

用表达质粒转化酵母

使用Frozen-EZ酵母转化试剂盒(Zymo Research，Orange，CA)用表达质粒#1转化酿酒酵母(ura3，lys2)，并在缺乏尿嘧啶的平板上选择转化体。染色体DNA的PCR分析证实了dhaB1和dhaB2表达盒的整合。使用Frozen-EZ酵母转化试剂盒用表达质粒#2再次转化选择出来的转化体，并在缺乏赖氨酸的平板上选择双重转化体。染色体DNA的PCR分析证实了dhaB3和dhaT表达盒的整合。染色体DNA的PCR分析证实了双重转化体中所有4个表达盒(dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT)的存在。

产生于双重转化酵母的蛋白质

Western印迹分析证实了由获自双重转化酵母的dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaT编码的蛋白质的产生。

获自双重转化酵母的酶活性

用上面一般方法中所述的酶分析证实了获自双重转化酵母的有活性的甘油脱水酶和有活性的1，3-丙二醇脱氢酶。

用双重转化酵母生产1，3-丙二醇

如实施例4中所述基本上证明了双重转化酵母从葡萄糖生产1，3-丙二醇。

实施例6：构建含有DA1/GPP2或dhaT/dhaB1-3质粒并将其转化进

克雷伯氏菌属

肺炎克雷伯氏菌(ATCC25955)、肺炎克雷伯氏菌(ECL2106)和产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)(ATCC 8724)天然地对氨苄青霉素(最高150ug/mL)和卡那霉素(最高50ug/mL)有抗性，但对四环素(10ug/mL)和氯霉素(25ug/mL)敏感。因此，编码对后两个抗生素有抗性的复制质粒可能用于作为这些克雷伯氏菌菌株的克隆载体。成功地通过用中等拷贝数的质粒pBR322(New England biolabs，Beverly，MA)用电穿孔法将野生型肺炎克雷伯氏菌(ATCC25955)、葡萄糖去阻遏的肺炎克雷伯氏菌(ECL2106)和产酸克雷伯氏菌(ATCC 8724)转化为四环素抗性。该过程通过如下步骤完成：将10mL的过夜培养物接种于1L LB(1％(w/v)Bacto-胰胨(Difco，Detriot，MI)，0.5％(w/v)Bacto-酵母抽提物(Difco)和0.5％(w/v)NaCl(Sigma，St.Louis，MO))中，培养物在37℃下孵育至OD₆₀₀为0.5-0.7。细胞在冰上冷却，4000×g离心15分钟收集，并将其重新悬浮于1L无菌的10％冰冷甘油中。重复离心收集细胞并逐次悬浮于500mL、20mL和最后2mL无菌的10％冰冷甘油中。对于电穿孔法，将40uL细胞与1-2uL DNA在预冷的0.2cm小管中混合，使用BioRad基因脉冲仪(BioRad，Richmond，CA)以200Ω，2.5kV对其进行脉冲4-5毫秒。将1mL SOC培养基(2％(w/v)Bacto-胰胨(Difco)，0.5％(w/v)Bacto-酵母抽提物(Difco)，10mM NaCl，10mM MgCl₂，10mM MgSO₄，2.5mM KCl和20mM葡萄糖)加入到细胞中，并且在将悬浮液转移到17×100mm无菌聚丙烯试管之后，在37℃，225转/分下孵育培养物1小时。如所示，在选择性培养基上涂布等量样品。对获自非依赖性四环素抗性转化体的质粒DNA的分析显示出pBR322典型的限制性内切酶酶解模式，提示在含有四环素(10ug/mL)的LB中37℃过夜培养后载体可稳定维持。因而，该载体和衍生物例如编码氨苄青霉素、四环素和氯霉素抗性的pBR329(ATCC 37264)可被用来将DAR1/GPP2和dhaT/dhaB1-3表达盒导入肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌中。

基于DAR1和GPP2基因的已知DNA序列，可通过PCR介导的扩增从酿酒酵母基因组得到它们。然后在一个或多个可被用于指导它们在含葡萄糖的培养基中表达的启动子控制下将其转化进肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌。为了方便，从通过用PvuII限制性内切酶酶解质粒pAH44得到的2.4kb的DNA片段中得到这些基因，籍此这些基因已排列在表达盒中并且受大肠杆菌lac启动子的控制。将该DNA片段连接到经PvuII酶解的pBR329上，导致其氯霉素抗性基因的插入失活。使用连接的DNA转化大肠杆菌DH5α(Gibco，Gaithersberg，MD)。根据它们的四环素(10ug/mL)抗性选择转化体并筛选它们对氯霉素(25ug/mL)的敏感性。对获自四环素抗性、氯霉素敏感转化体的质粒DNA的分析证实了期望的质粒的存在，质粒中P_lac-dar1-gpp2表达盒以任一方向被亚克隆进pBR329的PvuII位点。如所述通过电穿孔法分别将这些称为pJSP1A(顺时针方向)和pJSP1B(逆时针方向)的质粒转化进肺炎克雷伯氏菌(ATCC 25955)、肺炎克雷伯氏菌(ECL2106)和产酸克雷伯氏菌(ATCC 8724)。根据重组体的四环素(10ug/mL)抗性对其进行选择并筛选其对氯霉素(25ug/mL)的敏感性。对分离自非依赖性转化体的质粒的限制性分析显示了仅有期望的酶解模式，并证实了37℃下进行抗生素选择性时它们可以被稳定地保持。在生长培养基中加入IPTG(0.2-2.0mM)可增强DAR1和GPP2基因的表达。

基于4个肺炎克雷伯氏菌的dhaB(1-3)和dhaT基因的已知DNA序列，可通过PCR介导的扩增从肺炎克雷伯氏菌基因组得到这些基因。然后在一个或多个可用于指导这些基因在含葡萄糖培养基中表达的启动子控制下将它们转化进肺炎克雷伯氏菌。为了方便，从通过用KpnI/SacI限制性内切酶酶解质粒pAH24得到的大约4.0kb的DNA片段中获得这些基因，籍此这些基因已排列在表达盒中并且受大肠杆菌lac启动子的控制。将该DNA片段与经类似酶解的pBC-KS+(Strategene，LaJolla，CA)连接并将其用于转化大肠杆菌DH5α。根据转化体的氯霉素(25ug/mL)抗性对其进行选择，并在含X-gal的LB琼脂上筛选其白色菌落表型。获自表明为白色菌落的抗氯霉素转化体质粒DNA的限制性分析证实了期望的被称为PJSP2质粒的存在，其中dhaT-dhaB(1-3)基因被亚克隆进该质粒，在大肠杆菌lac启动子的控制下。

为了促进葡萄糖转化为1，3-丙二醇，通过电穿孔法分别将该质粒转化入已含有P_lac-dar1-gpp2表达盒的肺炎克雷伯氏菌(ATCC25955)(pJSP1A)、肺炎克雷伯氏菌(ECL2106)(pJSP1A)和产酸克雷伯氏菌(ATCC 8724)(pJSP1A)。根据共转化体对四环素(10ug/mL)和氯霉素(25ug/mL)的抗性对其进行选择。对分离自非依赖性共转化体的质粒的限制性分析显示了期望的pJSP1A和pJSP2的酶解模式。培养基中加入IPTG(0.2-2.0mM)可增强DAR1、GPP2、dhaB(1-3)和dhaT基因的表达。

实施例7：肺炎克雷伯氏菌从葡萄糖产生1，3-丙二醇

为了用葡萄糖生产1，3-丙二醇，在不同条件下(见表4)将均用pJSP1A转化的肺炎克雷伯氏菌菌株ECL 2106和2106-47以及用pJSP1A和pJSP2转化的ATCC 25955培养于5L Applikon发酵罐中。如Bauer等，应用环境微生物学(Appl.Environ.Micraobiol.)56，1296(1990)中所述，菌株2104-47是得自氟乙酸盐/乳酸盐选择性平板的ECL 2106的耐氟乙酸盐衍生物。在每一种情况下，使用的培养基含有50-100mM磷酸钾缓冲液，pH7.5，40mM(NH₄)₂SO₄，0.1％(w/v)酵母抽提物，10μM CoCl₂，6.5μM CuCl₂，100μM FeCl₃，18μMFeSO₄，5μM H₃BO₃，50μM MnCl₂，0.1μM Na₂MoO₄，25μMZnCl₂，0.82mM MgSO₄，0.9mM CaCl₂和10-20g/L葡萄糖。另外加入葡萄糖，使剩余的葡萄糖保持过量。温度控制在37℃，并且用5N KOH或NaOH将pH控制在7.5。为了维持质粒加入合适的抗生素；也加入指定浓度的IPTG(异丙基-b-D-巯基半乳糖吡喃糖苷)。对于无氧发酵，反应器中喷入0.1vvm氮气；当dO设置点为5％时，反应器中喷入1vvm空气并且在培养基中补加维生素B₁₂。最终浓度和总产量(g/g)见表4。

表4肺炎克雷伯氏菌从葡萄糖生产1，3-丙二醇

生物	dO	IPTG，mM	维生素B12，mg/L	效价g/L	产率g/g
生物	dO	IPTG，mM	维生素B12，mg/L	效价g/L	产率g/g	25955[pJSP1A/pJSP2]	0	0.5	0	8.1	16％
25955[pJSP1A/pJSP2]	5％	0.2	0.5	5.2	4％	25955[pJSP1A/pJSP2]	0	0.5	0	8.1	16％
25955[pJSP1A/pJSP2]	5％	0.2	0.5	5.2	4％	2106[pJSP1A]	0	0	0	4.9	17％
2106[pJSP1A]	5％	0	5	6.5	12％	2106[pJSP1A]	0	0	0	4.9	17％
2106[pJSP1A]	5％	0	5	6.5	12％	2106-47[pJSP1A]	5％	0.2	0.5	10.9	12％

实施例8：含有dar1、gpp2、dhaB和dhaT的重组肺炎克雷伯氏菌将碳底物转化为1，3-丙二醇

A.不同的肺炎克雷伯氏菌重组菌株将D-果糖转化为1，3-丙二醇

将肺炎克雷伯氏菌(ATCC 25955 pJSP1A)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC 25955 pJSP1A/pJSP2)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC 2106pJSP1A)和肺炎克雷伯氏菌(ATCC 2106 pJSP1A/pJSP2)的单菌落从琼脂平板转移进分隔的培养试管中，在含有合适抗生素的Luria-Bertani(LB)培养基中传代培养过夜。50mL培养瓶中含有45mL过滤除菌的基础培养基，其称为LLMM/F，其中每升含有：10g果糖；1g酵母抽提物；50mmol磷酸钾，pH7.5；40mmol(NH₄)₂SO₄；0.09mmol氯化钙；2.38mg CoCl₂·6H₂O；0.88mg CuCl₂·2H₂O；27mgFeCL₃·2H₂O；5mg FeSO₄·7H₂O.0.31mg H₃BO₃；10mg MnCl₂·4H₂O；0.023mg Na₂MoO₄·2H₂O；3.4mg ZnCl₂；0.2gMgSO₄·7H₂O。对于利用任一单个质粒重组体的反应在培养基中加入10ug/mL的四环素；对于利用双重质粒重组体的反应加入10ug/mL四环素和25ug/mL氯霉素。在接种2mL传代培养物前培养基被充分喷入氮气。在某些培养瓶中加入终浓度为0.5mM的IPTG(I)。培养瓶加盖，然后在37℃，100转/分下在New Brunswick Series 25孵育箱/摇床中孵育。反应进行至少24小时或直到大部分碳底物转化为产物。HPLC分析样品。表5描述了不同的克雷伯氏菌重组体从果糖产生1，3-丙二醇(3G)的产量。

表5利用重组克雷伯氏菌从D-果糖生产1，3-丙二醇

[3G]

克雷伯氏菌菌株培养基转化

(g/L)

产碳率％

2106 pBR329 LLMM/F 100 0 0

2106 pJSP1A LLMM/F 50 0.66 15.5

2106 pJSP1A LLMM/F+I 100 0.11 1.4

2106 LLMM/F 58 0.26 5

pJSP1 A/pJSP2

25955 pBR329 LLMM/F 100 0 0

25955 pJSP1A LLMM/F 100 0.3 4

25955 pJSP1A LLMM/F+I 100 0.15 2

25955 LLMM/F 100 0.9 11

pJSP1A/pJSP2

25955 LLMM/F+I 62 1.0 20

pJSP1A/pJSP2

B.肺炎克雷伯氏菌(ATCC 25955 pJSP1A/pJSP2)将不同的碳底物转化成1，3-丙二醇：

取肺炎克雷伯氏菌(ATCC 25955 pJSP1A/pJSP2)冰冻储存培养物的等量样品(0.1mL)转移到250mL带挡板培养瓶中的50mL种子培养基中。每升种子培养基含有：0.1mol NaK/PO₄缓冲液，pH7.0；3g(NH₄)₂SO₄；5g葡萄糖，0.15g MgSO₄·7H₂O，10mL 100X微量元素溶液，25mg氯霉素，10mg四环素和1g酵母抽提物。每升100X微量元素溶液含有：10g柠檬酸，1.5g CaCl₂·2H₂O，2.8g FeSO₄·7H₂O，0.39gZnSO₄·7H₂O，0.38g CuSO₄·5H₂O，0.2g CoCl₂·6H₂O和0.3gMnCl₂·4H₂O。用KOH或H₂SO₄将得到的溶液滴定到pH7.0。葡萄糖、微量元素、抗生素和酵母抽提物分开灭菌。种子接种物在35℃和250转/分培养过夜。

反应设计是半需氧的。系统由在留有铝箔条部分开口的125mL密封培养瓶中的130mL反应培养基组成。每升反应培养基含有：3g(NH₄)₂SO₄；20g碳底物；0.15mol NaK/PO₄缓冲液，pH7.5；1g酵母抽提物；0.15g MgSO₄·7H₂O；0.5mmol IPTG；10mL 100X微量元素溶液；25mg氯霉素；以及10mg四环素。用KOH或H₂SO₄将得到的溶液滴定到pH7.5。碳源是：D-葡萄糖(Glc)；D-果糖(Frc)；D-乳糖(Lac)；D-蔗糖(Suc)；D-麦芽糖(Mal)；以及D-甘露糖(Man)。培养基中加入一些玻璃珠以促进混合。加入种子接种物起始反应，使细胞悬浮液I₆₀₀nm测定的光密度开始为0.1AU。35℃：250转/分孵育培养瓶。24小时后用HPLC测定3G的产生。表6描述了从不同碳底物产生1，3-丙二醇的产量。

表6利用重组克雷伯氏菌25955pJSP1A/pJSP2从多种碳底物生产1，3-丙二醇

1，3-丙二醇(g/L)

碳底物实验1 实验2 实验3

Glc 0.89 1 1.6

Frc 0.19 0.23 0.24

Lac 0.15 0.58 0.56

Suc 0.88 0.62

Mal 0.05 0.03 0.02

Man 0.03 0.05 0.04

实施例9：使用dhaBX基因改善1，3-丙二醇产生

实施例9证明了当引入编码蛋白质X的基因时促进了1，3-丙二醇的产生。

表达载体pTaclQ的构建

将含有laclq基因(Farabaugh，P.J.1978，自然274(5673)765-769)和tac启动子(Amann等，1983，基因25，167-178)的大肠杆菌表达载体pTaclQ插入pBR322的限制性内切酶位点EcoRI(Sutcliffe，1979，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.43，77-90)。多克隆位点和终止子序列(SEQ ID NO：50)取代了pBR322中从EcoRI到SphI的序列。

亚克隆甘油脱水酶基因(dhaB1，2，3，X)

用限制性内切酶KpnI和EcoRI将含有获自pHK28-26的dhaB操纵子之克雷伯氏菌dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaBX的全部编码区的区域克隆进pBluescriptIIKS+(Stratagene)以建立质粒pM7。

用在5’末端引入了一个EcoRI位点以及在3’末端引入了一个XbaI位点的引物(SEQ ID NO：51和SEG ID NO：52)利用PCR从pHK28-26扩增dhaB3的开放阅读框架。将产物亚克隆进pLitmus29(NEB)以产生含有dhaB3的质粒pDHAB3。

通过用ApaI和XbaI酶解质粒pM7，纯化5.9kb片段并将其与获自质粒pDHAB3的325bp之ApaI-XbaI片段连接以去除dhaBX基因，建立含有dhaB1、dhaB2和dhaB3的pM11。

用5’末端引入了一个HindIII位点和一个共有核糖体结合位点以及在3’末端引入了一个XbaI位点的引物(SEQ ID NO：53与SEQ IDNO：54)利用PCR从pHK28-26扩增dhaB1的开放阅读框架。将产物亚克隆进pLitmus28(NEB)以产生含有dhaB1的质粒pDT1。

将获自含有dhaB1基因、dhaB2基因和dhaB3基因一部分的pM11之NotI-XbaI片段插入pDT1以建立dhaB表达质粒pDT2。将含有获自pDT2的dhaB(1，2，3)基因的HindIII-XbaI片段插入pTaclQ以建立pDT3。

亚克隆TMG脱氢酶基因(dhaT)

将含有TMG脱氢酶(dhaT)基因之pHK28-26的KpnI-SacI片段亚克隆进pBluescriptII KS+以建立质粒pAH11。利用在5’末端引入了一个XbaI位点以及在3’末端引入了一个BamHI位点的合成引物(SEQID NO：55与SEQ ID NO：56)从作为模板DNA的pAH1通过PCR克隆dhaT基因。将产物亚克隆进pCR-Script(Stratagene)的SrfI位点以产生含有dhaT的质粒pAH4和pAH5。pAH4含有对于从pCR-Script中lac启动子开始的表达为正确方向的dhaT基因，pAH5含有反向的dhaT基因。将获自含dhaT基因的pAH4的XbaI-BamHI片段插入pTaclQ以产生质粒pAH8。将获自含RBS和dhaT基因的pAH8之HindII-BamHI片段插入pBluescriptII KS+以建立pAH11。

dhAT和dhaB(1，2，3)表达盒的构建

使用标准分子生物学方法用前述单独的dhaB(1，2，3)和dhaT亚克隆组装dhaT和dhaB(1，2，3)的表达盒。将含有获自pDT3的dhaB(1，2，3)基因的SpeI-SacI片段插入pAH11的SpeI-SacI位点以建立pAH24。将SalI-XbaI接头(SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58)插入用限制性酶SalI-XbaI酶解的pAH5以建立pDT16。接头破坏了XbaI位点。获自pDT16的1kb之SalI-MluI片段被插入pAH24，取代已现有的SalI-MluI以建立pDT18。

用于在大肠杆菌中过度表达dhaT和dhaB(1，2，3，X)的质粒

纯化含有获自质粒pM7的dhaB1基因、dhaB2、dhaB3和dhaBX一部分的4.4kb之NotI-XbaI片段，将其与获自质粒pDT18的4.1kb之NotI-XbaI片段连接(恢复dhaB1)以建立含有dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaBX的pM33。

大肠杆菌菌株

大肠杆菌DH5α得自BRL(Difco)。用质粒pM7、pM11、pM33或pDT18转化该菌株并在含有100ug/ml羧苄青霉素的LA平板上对其进行选择。

1，3-丙二醇的产生

在加了100ug/mL羧苄青霉素的LA平板上培养含有质粒pM7、pM11、pM33或pDT18的大肠杆菌DH5α，37℃过夜。获自每种质粒的一个菌落被用于接种在加了0.005g/L维生素B₁₂、0.2mM IPTG、200ug/mL羧苄青霉素和5ml改良的Balch微量元素溶液(在普通和分子细菌学方法(P.Gerhardt等编，158页，美国微生物协会，Washington，DC，1994)中能找到其组成)的25ml培养基(0.2MKH₂PO₄，2.0g/L柠檬酸，2.0g/L MgSO₄·7H₂O，1.2ml/LH₂SO₄(98％)，0.3g/L柠檬酸铁铵，0.2g CaCl₂·2H₂O，5g/L酵母抽提物，10g/L葡萄糖，30g/L甘油)中，终pH 6.8(NH₄OH)，然后在250mL锥形瓶中过滤除菌。在37℃振摇(300转/分)孵育摇瓶数天，在此期间用标准步骤取样进行HPLC分析。最终产量见表4。

总的说来，如表7所示，结果显示在表达dhaB(1，2，3)或dhaT-dhaB(1，2，3)的质粒中dhaBX的表达大大增加了1，3-丙二醇的产量。

表7dhaBX表达对大肠杆菌产生1，3-丙二醇的影响

菌株时间(天数) 1，3-丙二醇(mg/L)^*

DH5a/pM7(dhaB1，2，3，X) 1 1500

2 2700

DH5a/pM11(dhaB1，2，3) 1 ＜200μg

2 ＜200μg

DH5a/pM33(dhaT-dhaB1，2，3，X) 2 1200

DH5a/pDT18(dhaT-dhaB1，2，3) 2 88

^*表达为数次实验的平均值

引物

SEQ ID NO：50-MCS-终止子

5AGCTTAGGAGTCTAGAATATTGAGCTCGAATTCCCGGGCATGCGGTACCGGATCCAGAAAA

AGCCCGCACCTGACAGTGCGGGCTTTTTTTTT 3′

SEQ ID NO：51-dhaB3-5′端 EcoRI

GGAATTCAGATCTCAGCAATGAGCGAGAAAACCATGC

SEQ ID NO 52：dhaB3-3′端 Xbal

GCTCTAGATTAGCTTCCTTTACGCAGC

SEQ ID NO 53：dhaB1 5′端 HindIlI-SD

5′GGCCAAGCTTAAGGAGGAATTAAATGAAAAG 3′

SEQ ID NO 54：dhaB1 3′端-Xbal

5′GCTCTAGATTATTCAATGGTGTCGGG 3′

SEQ ID NO 55：dhaT 5′端-Xbal

5′GCGCCGTCTAGAATTATGAGCTATCGTATGTTTGATTATCTG 3′

SEQ ID NO 56：dhaT 3′端 BamHI

5′TCTGATACGGGATCCTCAGAATGCCTGGCGGAAAAT 3′

SEQ ID NO 57：pUSH接头1：

5′TCGACGAATTCAGGAGGA 3′

SEQ ID NO 58：pUSH接头2：

5′CTAGTCCTCCTGaaTTCG 3′

实施例10

甘油脱水酶活性的再激活

实施例10证明了在含有至少一个编码蛋白质X基因的微生物中甘油脱水酶活性的体内再激活。

如实施例9所述，构建了质粒pM7和pM11并将其转化进大肠杆菌DH5α细胞。培养转化的细胞并根据Honda等人(1980，甘油失活的辅酶B₁₂依赖性酶、甘油脱水酶和二醇脱水酶的原位再激活，细菌学杂志143：1458-1465)的方法分析1，3-丙二醇的产生。

材料和方法

细胞的甲苯化

细胞生长至对数中期，并在生长较早时，即0.2＞OD600＜0.8时于室温离心收集细胞。室温下用50mM KPO₄ pH8.0清洗收集的细胞。将细胞在50mM KPO₄ pH8.0中重新悬浮至OD₆₀₀为20-30。绝对的OD值不是关键性的。将较少细胞群体重新悬浮在较少体积内。如果在此时加入辅酶B₁₂，则余下步骤在黑暗中进行。将甲苯加入到1％终体积的细胞悬液中并在室温下剧烈振摇悬液5分钟。离心悬液使细胞成团。室温下用50mM KPO₄ pH8.0清洗细胞两次(每次25mL)。加入甲苯前将细胞团重新悬浮于所用过的相同体积中并将其转移至干净试管。测定并记录甲苯化细胞的OD₆₀₀，于4℃贮存。

完整细胞甘油脱水酶分析

为了检测脱水酶活性的存在于37℃分析甲苯处理过的细胞。如下所示进行三套反应：无ATP、在0时加入ATP以及在10分钟加入ATP。

无ATP：100ul 2M甘油

100ul 150uM辅酶B₁₂

700ul 缓冲液(0.03M KPO₄/0.5M KCl，pH8.0)

T＝0分钟ATP： 100ul 2M甘油

100ul 150uM辅酶B₁₂

600ul 缓冲液(0.03M KPO₄/0.5M KCl，pH8.0)

100ul 30mM ATP/30mM MnCl₂

T＝10分钟ATP：100ul 2M甘油

100ul 150uM辅酶B₁₂

700ul 缓冲液(0.03M KPO₄/0.5M KCl，pH8.0)

加100ul缓冲液而不是辅酶B₁₂以制备每一个上述条件的对照。混合试管。这些试管的每一个中都加入50ul MBTH(3-甲基-2-苯基-噻唑啉酮腙)(在375mM甘氨酸/HCl pH2.7中为6mg/ml)，并在冰水中继续孵育。反应管于37℃水浴中放置几分钟以平衡到37℃。将盛有足够所有分析管使用的甲苯化细胞的试管放置于37℃水浴中几分钟以平衡到37℃。将含有2.5倍稀释(在分析缓冲液中)的30mM ATP/30mMMncl₂(每个12mM)的试管放置于37℃水浴中几分钟以平衡到37℃。在所有的试管中加入100ul细胞悬浮液，并于0、1、2、3、4、5、10、15、20和30分钟时取样。在每个时间点，取100ul反应物并立即加入到50ul冰冷的MBTH中，振荡，并将其置于冰水浴中。在T＝10分钟时，取一份样品并加入到MBTH中，然后尽可能快地加入100ul 2.5倍稀释的ATP/Mn。收集到所有的样品后，将样品试管架置于沸水浴中煮沸3分钟。在冰水浴中冷却试管30秒。将500ul新鲜制备的3.3mg/mlFeCl₃·6H₂O加入到试管中并且振荡试管。室温下孵育试管30分钟，用水稀释10倍，然后离心收集细胞和颗粒。在670nm测定吸收值并稀释细胞使OD低于1.0。

活性计算举例

稀释因子乘以所测OD₆₇₀以测定吸收值。对于反应组扣除空白吸收值并扣除T0的A670nm。绝对A670nm除以53.4(3羟基-丙醛的mM消光系数)，mM浓度乘以时程中任何反应的稀释度。因为使用了1ml反应物，3羟基-丙醛的浓度(umol/ml)除以分析中使用的mg干重(通过OD₆₀₀计算并且1 OD₆₀₀＝0.436mg干重)，得到每毫克细胞干重中的醛微摩尔系数。

结果

如图6所示，分析完整大肠杆菌细胞在未加入和加入ATP和Mn++时甘油脱水酶的再激活。结果显示含有带dhaB1，2和3以及蛋白质X质粒的细胞有再激活催化性失活的甘油脱水酶之能力。含有蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3的细胞再激活催化性失活的甘油脱水酶之能力增加。

如图7所示，分析完整大肠杆菌细胞在未加入和加入ATP和Mn++时甘油失活的甘油脱水酶的再激活。结果显示含有dhaB亚基1、2和3以及X的细胞有再激活催化性失活的甘油脱水酶之能力。缺乏蛋白质X基因的细胞无再激活催化性失活的甘油脱水酶之能力。

图9和10阐明了含有质粒pHK28-26(图1)的宿主细胞在适合产生1，3-丙二醇的条件下培养时，比被pDT24转化并在适合产生1，3-丙二醇的条件下培养的宿主细胞能产生更多的1，3-丙二醇。质粒pDT24是pDT18(实施例9中所述)的衍生物并含有dhaT、dhaB1、2、3和蛋白质X，但缺乏蛋白质1、2和3。

序列表

(1)一般信息

(i)申请人：MARIA DIAZ-TORRES

NIGEL DUNN-COLEMAN

MATTHEW CHASE

(ii)发明名称：1，3-丙二醇的重组生产方法

(iii)序列数目：49

(iv)联系地址：

(A)地址：GENENCOR INTERNATIONAL，INC.

(B)街道：4 Cambridge Place

1870 South Winton Road

(C)城市：Richester

(D)州：纽约

(E)国家：美国

(F)邮政编码(ZIP)：14618

(v)计算机可读信息：

(A)介质类型：3.5#软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：Microsoft Windows 3.1

(D)软件：Microword 2.0c

(vi)当前申请数据：

(A)申请号：未分配

(B)递交日：1997年11月13日

(C)分类：

(vi)在先申请数据：

(A)申请号：60/030，601

(B)递交日：1996年11月13日

(C)分类：

(viii)代理人/代理机构信息：

(A)姓名：GLAISTER，DEBRA

(B)登记号：33,888

(C)文献/卷号：gc 369-2

(ix)通讯信息：

(A)电话：(650)864-7620

(B)传真：(650)845-6504

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1668个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假设：非

(iv)反义：非

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(A)生物：DHAB1

(xi)SEQ ID NO：1的序列描述

ATGAAAAGAT CAAAACGATT TGCAGTACTG GCCCAGCGCC CCGTCAATCA GGACGGGCTG 60

ATTGGCGAGT GGCCTGAAGA GGGGCTGATC GCCATGGACA GCCCCTTTGA CCCGGTCTCT 120

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GACATGATCG ACCGATTTAT CGCCGATTAC GCGATCAACG TTGAGCGCAC AGAGCAGGCA 240

ATGCGCCTGG AGGCGGTGGA AATAGCCCGT ATGCTGGTGG ATATTCACGT CAGCCGGGAG 300

GAGATCATTG CCATCACTAC CGCCATCACG CCGGCCAAAG CGGTCGAGGT GATGGCGCAG 360

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AACCAGTGCC ACGTCACCAA TCTCAAAGAT AATCCGGTGC AGATTGCCGC TGACGCCGCC 480

GAGGCCGGGA TCCGCGGCTT CTCAGAACAG GAGACCACGG TCGGTATCGC GCGCTACGCG 540

CCGTTTAACG CCCTGGCGCT GTTGGTCGGT TCGCAGTGCG GCCGCCCCGG CGTGTTGACG 600

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TCCGGCACCG GATCCGAAGC GCTGATGGGC TATTCGGAGA GCAAGTCGAT GCTCTACCTC 840

GAATCGCGCT GCATCTTCAT TACTAAAGGC GCCGGGGTTC AGGGACTGCA AAACGGCGCG 900

GTGAGCTGTA TCGGCATGAC CGGCGCTGTG CCGTCGGGCA TTCGGGCGGT GCTGGCGGAA 960

AACCTGATCG CCTCTATGCT CGACCTCGAA GTGGCGTCCG CCAACGACCA GACTTTCTCC 1020

CACTCGGATA TTCGCCGCAC CGCGCGCACC CTGATGCAGA TGCTGCCGGG CACCGACTTT 1080

ATTTTCTCCG GCTACAGCGC GGTGCCGAAC TACGACAACA TGTTCGCCGG CTCGAACTTC 1140

GATGCGGAAG ATTTTGATGA TTACAACATC CTGCAGCGTG ACCTGATGGT TGACGGCGGC 1200

CTGCGTCCGG TGACCGAGGC GGAAACCATT GCCATTCGCC AGAAAGCGGC GCGGGCGATC 1260

CAGGCGGTTT TCCGCGAGCT GGGGCTGCCG CCAATCGCCG ACGAGGAGGT GGAGGCCGCC 1320

ACCTACGCGC ACGGCAGCAA CGAGATGCCG CCGCGTAACG TGGTGGAGGA TCTGAGTGCG 1380

GTGGAAGAGA TGATGAAGCG CAACATCACC GGCCTCGATA TTGTCGGCGC GCTGAGCCGC 1440

AGCGGCTTTG AGGATATCGC CAGCAATATT CTCAATATGC TGCGCCAGCG GGTCACCGGC 1500

GATTACCTGC AGACCTCGGC CATTCTCGAT CGGCAGTTCG AGGTGGTGAG TGCGGTCAAC 1560

GACATCAATG ACTATCAGGG GCCGGGCACC GGCTATCGCA TCTCTGCCGA ACGCTGGGCG 1620

GAGATCAAAA ATATTCCGGG CGTGGTTCAG CCCGACACCA TTGAATAA 1668

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：585个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假设：非

(iv)反义：非

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(A)生物：DHAB2

(xi)SEQ ID NO：2的序列描述

GTGCAACAGA CAACCCAAAT TCAGCCCTCT TTTACCCTGA AAACCCGCGA GGGCGGGGTA 60

GCTTCTGCCG ATGAACGCGC CGATGAAGTG GTGATCGGCG TCGGCCCTGC CTTCGATAAA 120

CACCAGCATC ACACTCTGAT CGATATGCCC CATGGCGCGA TCCTCAAAGA GCTGATTGCC 180

GGGGTGGAAG AAGAGGGGCT TCACGCCCGG GTGGTGCGCA TTCTGCGCAC GTCCGACGTC 240

TCCTTTATGG CCTGGGATGC GGCCAACCTG AGCGGCTCGG GGATCGGCAT CGGTATCCAG 300

TCGAAGGGGA CCACGGTCAT CCATCAGCGC GATCTGCTGC CGCTCAGCAA CCTGGAGCTG 360

TTCTCCCAGG CGCCGCTGCT GACGCTGGAG ACCTACCGGC AGATTGGCAA AAACGCTGCG 420

CGCTATGCGC GCAAAGAGTC ACCTTCGCCG GTGCCGGTGG TGAACGATCA GATGGTGCGG 480

CCGAAATTTA TGGCCAAAGC CGCGCTATTT CATATCAAAG AGACCAAACA TGTGGTGCAG 540

GACGCCGAGC CCGTCACCCT GCACATCGAC TTAGTAAGGG AGTGA 585

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：426个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(ii)分子类型：DNA(基因组)

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(A)生物：DHAB3

(xi)SEQ ID NO：3的序列描述

ATGAGCGAGA AAACCATGCG CGTGCAGGAT TATCCGTTAG CCACCCGCTG CCCGGAGCAT 60

ATCCTGACGC CTACCGGCAA ACCATTGACC GATATTACCC TCGAGAAGGT GCTCTCTGGC 120

GAGGTGGGCC CGCAGGATGT GCGGATCTCC CGCCAGACCC TTGAGTACCA GGCGCAGATT 180

GCCGAGCAGA TGCAGCGCCA TGCGGTGGCG CGCAATTTCC GCCGCGCGGC GGAGCTTATC 240

GCCATTCCTG ACGAGCGCAT TCTGGCTATC TATAACGCGC TGCGCCCGTT CCGCTCCTCG 300

CAGGCGGAGC TGCTGGCGAT CGCCGACGAG CTGGAGCACA CCTGGCATGC GACAGTGAAT 360

GCCGCCTTTG TCCGGGAGTC GGCGGAAGTG TATCAGCAGC GGCATAAGCT GCGTAAAGGA 420

AGCTAA 426

(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1164个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(ii)分子类型：DNA(基因组)

(vi)初始来源：

(A)生物：DHAT

(xi)SEQ ID NO：4的序列描述

ATGAGCTATC GTATGTTTGA TTATCTGGTG CCAAACGTTA ACTTTTTTGG CCCCAACGCC 60

ATTTCCGTAG TCGGCGAACG CTGCCAGCTG CTGGGGGGGA AAAAAGCCCT GCTGGTCACC 120

GACAAAGGCC TGCGGGCAAT TAAAGATGGC GCGGTGGACA AAACCCTGCA TTATCTGCGG 180

GAGGCCGGGA TCGAGGTGGC GATCTTTGAC GGCGTCGAGC CGAACCCGAA AGACACCAAC 240

GTGCGCGACG GCCTCGCCGT GTTTCGCCGC GAACAGTGCG ACATCATCGT CACCGTGGGC 300

GGCGGCAGCC CGCACGATTG CGGCAAAGGC ATCGGCATCG CCGCCACCCA TGAGGGCGAT 360

CTGTACCAGT ATGCCGGAAT CGAGACCCTG ACCAACCCGC TGCCGCCTAT CGTCGCGGTC 420

AATACCACCG CCGGCACCGC CAGCGAGGTC ACCCGCCACT GCGTCCTGAC CAACACCGAA 480

ACCAAAGTGA AGTTTGTGAT CGTCAGCTGG CGCAAACTGC CGTCGGTCTC TATCAACGAT 540

CCACTGCTGA TGATCGGTAA ACCGGCCGCC CTGACCGCGG CGACCGGGAT GGATGCCCTG 600

ACCCACGCCG TAGAGGCCTA TATCTCCAAA GACGCTAACC CGGTGACGGA CGCCGCCGCC 660

ATGCAGGCGA TCCGCCTCAT CGCCCGCAAC CTGCGCCAGG CCGTGGCCCT CGGCAGCAAT 720

CTGCAGGCGC GGGAAAACAT GGCCTATGCT TCTCTGCTGG CCGGGATGGC TTTCAATAAC 780

GCCAACCTCG GCTACGTGCA CGCCATGGCG CACCAGCTGG GCGGCCTGTA CGACATGCCG 840

CACGGCGTGG CCAACGCTGT CCTGCTGCCG CATGTGGCGC GCTACAACCT GATCGCCAAC 900

CCGGAGAAAT TCGCCGATAT CGCTGAACTG ATGGGCGAAA ATATCACCGG ACTGTCCACT 960

CTCGACGCGG CGGAAAAAGC CATCGCCGCT ATCACGCGTC TGTCGATGGA TATCGGTATT 1020

CCGCAGCATC TGCGCGATCT GGGGGTAAAA GAGGCCGACT TCCCCTACAT GGCGGAGATG 1080

GCTCTAAAAG ACGGCAATGC GTTCTCGAAC CCGCGTAAAG GCAACGAGCA GGAGATTGCC 1140

GCGATTTTCC GCCAGGCATT CTGA 1164

(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1380个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(ii)分子类型：DNA(基因组)

(vi)初始来源：

(A)生物：GPD1

(xi)SEQ ID NO：5的序列描述

CTTTAATTTT CTTTTATCTT ACTCTCCTAC ATAAGACATC AAGAAACAAT TGTATATTGT 60

ACACCCCCCC CCTCCACAAA CACAAATATT GATAATATAA AGATGTCTGC TGCTGCTGAT 120

AGATTAAACT TAACTTCCGG CCACTTGAAT GCTGGTAGAA AGAGAAGTTC CTCTTCTGTT 180

TCTTTGAAGG CTGCCGAAAA GCCTTTCAAG GTTACTGTGA TTGGATCTGG TAACTGGGGT 240

ACTACTATTG CCAAGGTGGT TGCCGAAAAT TGTAAGGGAT ACCCAGAAGT TTTCGCTCCA 300

ATAGTACAAA TGTGGGTGTT CGAAGAAGAG ATCAATGGTG AAAAATTGAC TGAAATCATA 360

AATACTAGAC ATCAAAACGT GAAATACTTG CCTGGCATCA CTCTACCCGA CAATTTGGTT 420

GCTAATCCAG ACTTGATTGA TTCAGTCAAG GATGTCGACA TCATCGTTTT CAACATTCCA 480

CATCAATTTT TGCCCCGTAT CTGTAGCCAA TTGAAAGGTC ATGTTGATTC ACACGTCAGA 540

GCTATCTCCT GTCTAAAGGG TTTTGAAGTT GGTGCTAAAG GTGTCCAATT GCTATCCTCT 600

TACATCACTG AGGAACTAGG TATTCAATGT GGTGCTCTAT CTGGTGCTAA CATTGCCACC 660

GAAGTCGCTC AAGAACACTG GTCTGAAACA ACAGTTGCTT ACCACATTCC AAAGGATTTC 720

AGAGGCGAGG GCAAGGACGT CGACCATAAG GTTCTAAAGG CCTTGTTCCA CAGACCTTAC 780

TTCCACGTTA GTGTCATCGA AGATGTTGCT GGTATCTCCA TCTGTGGTGC TTTGAAGAAC 840

GTTGTTGCCT TAGGTTGTGG TTTCGTCGAA GGTCTAGGCT GGGGTAACAA CGCTTCTGCT 900

GCCATCCAAA GAGTCGGTTT GGGTGAGATC ATCAGATTCG GTCAAATGTT TTTCCCAGAA 960

TCTAGAGAAG AAACATACTA CCAAGAGTCT GCTGGTGTTG CTGATTTGAT CACCACCTGC 1020

GCTGGTGGTA GAAACGTCAA GGTTGCTAGG CTAATGGCTA CTTCTGGTAA GGACGCCTGG 1080

GAATGTGAAA AGGAGTTGTT GAATGGCCAA TCCGCTCAAG GTTTAATTAC CTGCAAAGAA 1140

GTTCACGAAT GGTTGGAAAC ATGTGGCTCT GTCGAAGACT TCCCATTATT TGAAGCCGTA 1200

TACCAAATCG TTTACAACAA CTACCCAATG AAGAACCTGC CGGACATGAT TGAAGAATTA 1260

GATCTACATG AAGATTAGAT TTATTGGAGA AAGATAACAT ATCATACTTC CCCCACTTTT 1320

TTCGAGGCTC TTCTATATCA TATTCATAAA TTAGCATTAT GTCATTTCTC ATAACTACTT 1380

(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：2946个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(vi)初始来源：

(A)生物：GPD2

(xi)SEQ ID NO：6的序列描述

GAATTCGAGC CTGAAGTGCT GATTACCTTC AGGTAGACTT CATCTTGACC CATCAACCCC 60

AGCGTCAATC CTGCAAATAC ACCACCCAGC AGCACTAGGA TGATAGAGAT AATATAGTAC 120

GTGGTAACGC TTGCCTCATC ACCTACGCTA TGGCCGGAAT CGGCAACATC CCTAGAATTG 180

AGTACGTGTG ATCCGGATAA CAACGGCAGT GAATATATCT TCGGTATCGT AAAGATGTGA 240

TATAAGATGA TGTATACCCA ATGAGGAGCG CCTGATCGTG ACCTAGACCT TAGTGGCAAA 300

AACGACATAT CTATTATAGT GGGGAGAGTT TCGTGCAAAT AACAGACGCA GCAGCAAGTA 360

ACTGTGACGA TATCAACTCT TTTTTTATTA TGTAATAAGC AAACAAGCAC GAATGGGGAA 420

AGCCTATGTG CAATCACCAA GGTCGTCCCT TTTTTCCCAT TTGCTAATTT AGAATTTAAA 480

GAAACCAAAA GAATGAAGAA AGAAAACAAA TACTAGCCCT AACCCTGACT TCGTTTCTAT 540

GATAATACCC TGCTTTAATG AACGGTATGC CCTAGGGTAT ATCTCACTCT GTACGTTACA 600

AACTCCGGTT ATTTTATCGG AACATCCGAG CACCCGCGCC TTCCTCAACC CAGGCACCGC 660

CCCAGGTAAC CGTGCGCGAT GAGCTAATCC TGAGCCATCA CCCACCCCAC CCGTTGATGA 720

CAGCAATTCG GGAGGGCGAA AATAAAACTG GAGCAAGGAA TTACCATCAC CGTCACCATC 780

ACCATCATAT CGCCTTAGCC TCTAGCCATA GCCATCATGC AAGCGTGTAT CTTCTAAGAT 840

TCAGTCATCA TCATTACCGA GTTTGTTTTC CTTCACATGA TGAAGAAGGT TTGAGTATGC 900

TCGAAACAAT AAGACGACGA TGGCTCTGCC ATTGGTTATA TTACGCTTTT GCGGCGAGGT 960

GCCGATGGGT TGCTGAGGGG AAGAGTGTTT AGCTTACGGA CCTATTGCCA TTGTTATTCC 1020

GATTAATCTA TTGTTCAGCA GCTCTTCTCT ACCCTGTCAT TCTAGTATTT TTTTTTTTTT 1080

TTTTTGGTTT TACTTTTTTT TCTTCTTGCC TTTTTTTCTT GTTACTTTTT TTCTAGTTTT 1140

TTTTCCTTCC ACTAAGCTTT TTCCTTGATT TATCCTTGGG TTCTTCTTTC TACTCCTTTA 1200

GATTTTTTTT TTATATATTA ATTTTTAAGT TTATGTATTT TGGTAGATTC AATTCTCTTT 1260

CCCTTTCCTT TTCCTTCGCT CCCCTTCCTT ATCAATGCTT GCTGTCAGAA GATTAACAAG 1320

ATACACATTC CTTAAGCGAA CGCATCCGGT GTTATATACT CGTCGTGCAT ATAAAATTTT 1380

GCCTTCAAGA TCTACTTTCC TAAGAAGATC ATTATTACAA ACACAACTGC ACTCAAAGAT 1440

GACTGCTCAT ACTAATATCA AACAGCACAA ACACTGTCAT GAGGACCATC CTATCAGAAG 1500

ATCGGACTCT GCCGTGTCAA TTGTACATTT GAAACGTGCG CCCTTCAAGG TTACAGTGAT 1560

TGGTTCTGGT AACTGGGGGA CCACCATCGC CAAAGTCATT GCGGAAAACA CAGAATTGCA 1620

TTCCCATATC TTCGAGCCAG AGGTGAGAAT GTGGGTTTTT GATGAAAAGA TCGGCGACGA 1680

AAATCTGACG GATATCATAA ATACAAGACA CCAGAACGTT AAATATCTAC CCAATATTGA 1740

CCTGCCCCAT AATCTAGTGG CCGATCCTGA TCTTTTACAC TCCATCAAGG GTGCTGACAT 1800

CCTTGTTTTC AACATCCCTC ATCAATTTTT ACCAAACATA GTCAAACAAT TGCAAGGCCA 1860

CGTGGCCCCT CATGTAAGGG CCATCTCGTG TCTAAAAGGG TTCGAGTTGG GCTCCAAGGG 1920

TGTGCAATTG CTATCCTCCT ATGTTACTGA TGAGTTAGGA ATCCAATGTG GCGCACTATC 1980

TGGTGCAAAC TTGGCACCGG AAGTGGCCAA GGAGCATTGG TCCGAAACCA CCGTGGCTTA 2040

CCAACTACCA AAGGATTATC AAGGTGATGG CAAGGATGTA GATCATAAGA TTTTGAAATT 2100

GCTGTTCCAC AGACCTTACT TCCACGTCAA TGTCATCGAT GATGTTGCTG GTATATCCAT 2160

TGCCGGTGCC TTGAAGAACG TCGTGGCACT TGCATGTGGT TTCGTAGAAG GTATGGGATG 2220

GGGTAACAAT GCCTCCGCAG CCATTCAAAG GCTGGGTTTA GGTGAAATTA TCAAGTTCGG 2280

TAGAATGTTT TTCCCAGAAT CCAAAGTCGA GACCTACTAT CAAGAATCCG CTGGTGTTGC 2340

AGATCTGATC ACCACCTGCT CAGGCGGTAG AAACGTCAAG GTTGCCACAT ACATGGCCAA 2400

GACCGGTAAG TCAGCCTTGG AAGCAGAAAA GGAATTGCTT AACGGTCAAT CCGCCCAAGG 2460

GATAATCACA TGCAGAGAAG TTCACGAGTG GCTACAAACA TGTGAGTTGA CCCAAGAATT 2520

CCCAATTATT CGAGGCAGTC TACCAGATAG TCTACAACAA CGTCCGCATG GAAGACCTAC 2580

CGGAGATGAT TGAAGAGCTA GACATCGATG ACGAATAGAC ACTCTCCCCC CCCCTCCCCC 2640

TCTGATCTTT CCTGTTGCCT CTTTTTCCCC CAACCAATTT ATCATTATAC ACAAGTTCTA 2700

CAACTACTAC TAGTAACATT ACTACAGTTA TTATAATTTT CTATTCTCTT TTTCTTTAAG 2760

AATCTATCAT TAACGTTAAT TTCTATATAT ACATAACTAC CATTATACAC GCTATTATCG 2820

TTTACATATC ACATCACCGT TAATGAAAGA TACGACACCC TGTACACTAA CACAATTAAA 2880

TAATCGCCAT AACCTTTTCT GTTATCTATA GCCCTTAAAG CTGTTTCTTC GAGCTTTTCA 2940

CTGCAG 2946

(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：3178个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(vi)初始来源：

(A)生物：GUT2

(xi)SEQ ID NO：7的序列描述

CTGCAGAACT TCGTCTGCTC TGTGCCCATC CTCGCGGTTA GAAAGAAGCT GAATTGTTTC 60

ATGCGCAAGG GCATCAGCGA GTGACCAATA ATCACTGCAC TAATTCCTTT TTAGCAACAC 120

ATACTTATAT ACAGCACCAG ACCTTATGTC TTTTCTCTGC TCCGATACGT TATCCCACCC 180

AACTTTTATT TCAGTTTTGG CAGGGGAAAT TTCACAACCC CGCACGCTAA AAATCGTATT 240

TAAACTTAAA AGAGAACAGC CACAAATAGG GAACTTTGGT CTAAACGAAG GACTCTCCCT 300

CCCTTATCTT GACCGTGCTA TTGCCATCAC TGCTACAAGA CTAAATACGT ACTAATATAT 360

GTTTTCGGTA ACGAGAAGAA GAGCTGCCGG TGCAGCTGCT GCCATGGCCA CAGCCACGGG 420

GACGCTGTAC TGGATGACTA GCCAAGGTGA TAGGCCGTTA GTGCACAATG ACCCGAGCTA 480

CATGGTGCAA TTCCCCACCG CCGCTCCACC GGCAGGTCTC TAGACGAGAC CTGCTGGACC 540

GTCTGGACAA GACGCATCAA TTCGACGTGT TGATCATCGG TGGCGGGGCC ACGGGGACAG 600

GATGTGCCCT AGATGCTGCG ACCAGGGGAC TCAATGTGGC CCTTGTTGAA AAGGGGGATT 660

TTGCCTCGGG AACGTCGTCC AAATCTACCA AGATGATTCA CGGTGGGGTG CGGTACTTAG 720

AGAAGGCCTT CTGGGAGTTC TCCAAGGCAC AACTGGATCT GGTCATCGAG GCACTCAACG 780

AGCGTAAACA TCTTATCAAC ACTGCCCCTC ACCTGTGCAC GGTGCTACCA ATTCTGATCC 840

CCATCTACAG CACCTGGCAG GTCCCGTACA TCTATATGGG CTGTAAATTC TACGATTTCT 900

TTGGCGGTTC CCAAAACTTG AAAAAATCAT ACCTACTGTC CAAATCCGCC ACCGTGGAGA 960

AGGCTCCCAT GCTTACCACA GACAATTTAA AGGCCTCGCT TGTGTACCAT GATGGGTCCT 1020

TTAACGACTC GCGTTTGAAC GCCACTTTAG CCATCACGGG TGTGGAGAAC GGCGCTACCG 1080

TCTTGATCTA TGTCGAGGTA CAAAAATTGA TCAAAGACCC AACTTCTGGT AAGGTTATCG 1140

GTGCCGAGGC CCGGGACGTT GAGACTAATG AGCTTGTCAG AATCAACGCT AAATGTGTGG 1200

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TGCCGGACTC CCCGCTAAAC GACAACTCCA AGATCAAGTC GACTTTCAAT CAAATCTCCG 1320

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ACTCCCCGAA GGATATGGGT TTGTTGGACG TCAGAACCTC TGATGGCAGA GTGATGTTCT 1440

TTTTACCTTG GCAGGGCAAA GTCCTTGCCG GCACCACAGA CATCCCACTA AAGCAAGTCC 1500

CAGAAAACCC TATGCCTACA GAGGCTGATA TTCAAGATAT CTTGAAAGAA CTACAGCACT 1560

ATATCGAATT CCCCGTGAAA AGAGAAGACG TGCTAAGTGC ATGGGCTGGT GTCAGACCTT 1620

TGGTCAGAGA TCCACGTACA ATCCCCGCAG ACGGGAAGAA GGGCTCTGCC ACTCAGGGCG 1680

TGGTAAGATC CCACTTCTTG TTCACTTCGG ATAATGGCCT AATTACTATT GCAGGTGGTA 1740

AATGGACTAC TTACAGACAA ATGGCTGAGG AAACAGTCGA CAAAGTTGTC GAAGTTGGCG 1800

GATTCCACAA CCTGAAACCT TGTCACACAA GAGATATTAA GCTTGCTGGT GCAGAAGAAT 1860

GGACGCAAAA CTATGTGGCT TTATTGGCTC AAAACTACCA TTTATCATCA AAAATGTCCA 1920

ACTACTTGGT TCAAAACTAC GGAACCCGTT CCTCTATCAT TTGCGAATTT TTCAAAGAAT 1980

CCATGGAAAA TAAACTGCCT TTGTCCTTAG CCGACAAGGA AAATAACGTA ATCTACTCTA 2040

GCGAGGAGAA CAACTTGGTC AATTTTGATA CTTTCAGATA TCCATTCACA ATCGGTGAGT 2100

TAAAGTATTC CATGCAGTAC GAATATTGTA GAACTCCCTT GGACTTCCTT TTAAGAAGAA 2160

CAAGATTCGC CTTCTTGGAC GCCAAGGAAG CTTTGAATGC CGTGCATGCC ACCGTCAAAG 2220

TTATGGGTGA TGAGTTCAAT TGGTCGGAGA AAAAGAGGCA GTGGGAACTT GAAAAAACTG 2280

TGAACTTCAT CCAAGGACGT TTCGGTGTCT AAATCGATCA TGATAGTTAA GGGTGACAAA 2340

GATAACATTC ACAAGAGTAA TAATAATGGT AATGATGATA ATAATAATAA TGATAGTAAT 2400

AACAATAATA ATAATGGTGG TAATGGCAAT GAAATCGCTA TTATTACCTA TTTTCCTTAA 2460

TGGAAGAGTT AAAGTAAACT AAAAAAACTA CAAAAATATA TGAAGAAAAA AAAAAAAAGA 2520

GGTAATAGAC TCTACTACTA CAATTGATCT TCAAATTATG ACCTTCCTAG TGTTTATATT 2580

CTATTTCCAA TACATAATAT AATCTATATA ATCATTGCTG GTAGACTTCC GTTTTAATAT 2640

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AATAGTACCA TTTAGAACGC CCAATATTCA CATTGTGTTC AAGGTCTTTA TTCACCAGTG 2940

ACGTGTAATG GCCATGATTA ATGTGCCTGT ATGGTTAACC ACTCCAAATA GCTTATATTT 3000

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(2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：816个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(vi)初始来源：

(A)生物：GPP1

(xi)SEQ ID NO：8的序列描述

ATGAAACGTT TCAATGTTTT AAAATATATC AGAACAACAA AAGCAAATAT ACAAACCATC 60

GCAATGCCTT TGACCACAAA ACCTTTATCT TTGAAAATCA ACGCCGCTCT ATTCGATGTT 120

GACGGTACCA TCATCATCTC TCAACCAGCC ATTGCTGCTT TCTGGAGAGA TTTCGGTAAA 180

GACAAGCCTT ACTTCGATGC CGAACACGTT ATTCACATCT CTCACGGTTG GAGAACTTAC 240

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GGTGAAATCC CAGAAAAGTA CGGTGAACAC TCCATCGAAG TTCCAGGTGC TGTCAAGTTG 360

TGTAATGCTT TGAACGCCTT GCCAAAGGAA AAATGGGCTG TCGCCACCTC TGGTACCCGT 420

GACATGGCCA AGAAATGGTT CGACATTTTG AAGATCAAGA GACCAGAATA CTTCATCACC 480

GCCAATGATG TCAAGCAAGG TAAGCCTCAC CCAGAACCAT ACTTAAAGGG TAGAAACGGT 540

TTGGGTTTCC CAATTAATGA ACAAGACCCA TCCAAATCTA AGGTTGTTGT CTTTGAAGAC 600

GCACCAGCTG GTATTGCTGC TGGTAAGGCT GCTGGCTGTA AAATCGTTGG TATTGCTACC 660

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TACTTATACG CTAAGGATGA CTTGTTGAAA TGGTAA 816

(2)SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：753个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(ii)分子类型：DNA(基因组)

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(A)生物：GPP2

(xi)SEQ ID NO：9的序列描述

ATGGGATTGA CTACTAAACC TCTATCTTTG AAAGTTAACG CCGCTTTGTT CGACGTCGAC 60

GGTACCATTA TCATCTCTCA ACCAGCCATT GCTGCATTCT GGAGGGATTT CGGTAAGGAC 120

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(i)序列特征：

(A)长度：2520个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(vi)初始来源：

(A)生物：GUT1

(xi)SEQ ID NO：10的序列描述

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TTGATCTCCC AACATGGCGC ACTGACGACT CTAGCATTTT GGTTCCCACA TTTGCAAGAG 1680

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GTGGCTGGTG CTGTGGTCCA ATGGCTACGT GATAATTTAC GATTGATCGA TAAATCAGAG 1800

GATGTCGGAC CGATTGCATC TACGGTTCCT GATTCTGGTG GCGTAGTTTT CGTCCCCGCA 1860

TTTAGTGGCC TATTCGCTCC CTATTGGGAC CCAGATGCCA GAGCCACCAT AATGGGGATG 1920

TCTCAATTCA CTACTGCCTC CCACATCGCC AGAGCTGCCG TGGAAGGTGT TTGCTTTCAA 1980

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GACTTTTTAG AGGAAATTTC CGACGTCACA TATGAAAAGT CGCCCCTGTC GGTTCTGGCA 2100

GTGGATGGCG GGATGTCGAG GTCTAATGAA GTCATGCAAA TTCAAGCCGA TATCCTAGGT 2160

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GCAGCCAATA TGGCTTTCAA GGATGTGAAC GAGCGCCCAT TATGGAAGGA CCTACACGAT 2280

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(2)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：391个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑类型：未知

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)初始来源：

(A)生物：GPD1

(xi)SEQ ID NO：11的序列描述

Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn

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Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu

20 25 30

Lys Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr

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Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe

50 55 60

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65 70 75 80

Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu

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100 105 110

Asp Ser Val Lys Asp Val Asp Ile Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln

115 120 125

Phe Leu Pro Arg Ile Cys Ser Gln Leu Lys Gly His Val Asp Ser His

130 135 140

Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Ala Lys Gly

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Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Glu Glu Leu Gly Ile Gln Cys

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Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His

180 185 190

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Glu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg

210 215 220

Pro Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile

225 230 235 240

Cys Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu

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Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

Thr Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Leu Met Ala Thr

305 310 315 320

Ser Gly Lys Asp Ala Trp Glu Cys Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln

325 330 335

Ser Ala Gln Gly Leu Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu

340 345 350

Thr Cys Gly Ser Val Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln

355 360 365

Ile Val Tyr Asn Asn Tyr Pro Met Lys Asn Leu Pro Asp Met Ile Glu

370 375 380

Glu Leu Asp Leu His Glu Asp

385 390

(2)SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：384个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑类型：未知

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)初始来源：

(A)生物：GPD2

(xi)SEQ ID NO：12的序列描述

Met Thr Ala His Thr Asn Ile Lys Gln His Lys His Cys His Glu Asp

1 5 10 15

His Pro Ile Arg Arg Ser Asp Ser Ala Val Ser Ile Val His Leu Lys

20 25 30

Arg Ala Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr

35 40 45

Thr Ile Ala Lys Val Ile Ala Glu Asn Thr Glu Leu His Ser His Ile

50 55 60

Phe Glu Pro Glu Val Arg Met Trp Val Phe Asp Glu Lys Ile Gly Asp

65 70 75 80

Glu Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr

85 90 95

Leu Pro Asn Ile Asp Leu Pro His Asn Leu Val Ala Asp Pro Asp Leu

100 105 110

Leu His Ser Ile Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Phe Asn Ile Pro His

115 120 125

Gln Phe Leu Pro Asn Ile Val Lys Gln Leu Gln Gly His Val Ala Pro

130 135 140

His Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Leu Gly Ser Lys

145 150 155 160

Gly Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Val Thr Asp Glu Leu Gly Ile Gln

165 170 175

Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu

180 185 190

His Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Leu Pro Lys Asp Tyr Gln

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Ile Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Ala Cys Gly Phe Val

245 250 255

Glu Gly Met Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Leu

260 265 270

Gly Leu Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser

275 280 285

Lys Val Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile

290 295 300

Thr Thr Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Thr Tyr Met Ala

305 310 315 320

Lys Thr Gly Lys Ser Ala Leu Glu Ala Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly

325 330 335

Gln Ser Ala Gln Gly Ile Ile Thr Cys Arg Glu Val His Glu Trp Leu

340 345 350

Gln Thr Cys Glu Leu Thr Gln Glu Phe Pro Ile Ile Arg Gly Ser Leu

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Pro Asp Ser Leu Gln Gln Arg Pro His Gly Arg Pro Thr Gly Asp Asp

370 375 380

(2)SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：614个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑类型：未知

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)初始来源：

(A)生物：GUT2

(xi)SEQ ID NO：13的序列描述

Met Thr Arg Ala Thr Trp Cys Asn Ser Pro Pro Pro Leu His Arg Gln

1 5 10 15

Val Ser Arg Arg Asp Leu Leu Asp Arg Leu Asp Lys Thr His Gln Phe

20 25 30

Asp Val Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ala Thr Gly Thr Gly Cys Ala Leu

35 40 45

Asp Ala Ala Thr Arg Gly Leu Asn Val Ala Leu Val Glu Lys Gly Asp

50 55 60

Phe Ala Ser Gly Thr Ser Ser Lys Ser Thr Lys Met Ile His Gly Gly

65 70 75 80

Val Arg Tyr Leu Glu Lys Ala Phe Trp Glu Phe Ser Lys Ala Gln Leu

85 90 95

Asp Leu Val Ile Glu Ala Leu Asn Glu Arg Lys His Leu Ile Asn Thr

100 105 110

Ala Pro His Leu Cys Thr Val Leu Pro Ile Leu Ile Pro Ile Tyr Ser

115 120 125

Thr Trp Gln Val Pro Tyr Ile Tyr Met Gly Cys Lys Phe Tyr Asp Phe

130 135 140

Phe Gly Gly Ser Gln Asn Leu Lys Lys Ser Tyr Leu Leu Ser Lys Ser

145 150 155 160

Ala Thr Val Glu Lys Ala Pro Met Leu Thr Thr Asp Asn Leu Lys Ala

165 170 175

Ser Leu Val Tyr His Asp Gly Ser Phe Asn Asp Ser Arg Leu Asn Ala

180 185 190

Thr Leu Ala Ile Thr Gly Val Glu Asn Gly Ala Thr Val Leu Ile Tyr

195 200 205

Val Glu Val Gln Lys Leu Ile Lys Asp Pro Thr Ser Gly Lys Val Ile

210 215 220

Gly Ala Glu Ala Arg Asp Val Glu Thr Asn Glu Leu Val Arg Ile Asn

225 230 235 240

Ala Lys Cys Val Val Asn Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Asp Ala Ile Leu

245 250 255

Gln Met Asp Arg Asn Pro Ser Gly Leu Pro Asp Ser Pro Leu Asn Asp

260 265 270

Asn Ser Lys Ile Lys Ser Thr Phe Asn Gln Ile Ser Val Met Asp Pro

275 280 285

Lys Met Val Ile Pro Ser Ile Gly Val His Ile Val Leu Pro Ser Phe

290 295 300

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Arg Val Met Phe Phe Leu Pro Trp Gln Gly Lys Val Leu Ala Gly Thr

325 330 335

Thr Asp Ile Pro Leu Lys Gln Val Pro Glu Asn Pro Met Pro Thr Glu

340 345 350

Ala Asp Ile Gln Asp Ile Leu Lys Glu Leu Gln His Tyr Ile Glu Phe

355 360 365

Pro Val Lys Arg Glu Asp Val Leu Ser Ala Trp Ala Gly Val Arg Pro

370 375 380

Leu Val Arg Asp Pro Arg Thr Ile Pro Ala Asp Gly Lys Lys Gly Ser

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515 520 525

Asn Leu Val Asn Phe Asp Thr Phe Arg Tyr Pro Phe Thr Ile Gly G1u

530 535 540

Leu Lys Tyr Ser Met Gln Tyr Glu Tyr Cys Arg Thr Pro Leu Asp Phe

545 550 555 560

Leu Leu Arg Arg Thr Arg Phe Ala Phe Leu Asp A1a Lys Glu Ala Leu

565 570 575

Asn Ala Val His Ala Thr Val Lys Val Met Gly Asp Glu Phe Asn Trp

580 585 590

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Gln Gly Arg Phe Gly Val

610

(2)SEQ ID NO：14的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：339个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑类型：未知

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)初始来源：

(A)生物：GPSA

(xi)SEQ ID NO：14的序列描述

Met Asn Gln Arg Asn Ala Ser Met Thr Val Ile Gly Ala Gly Ser Tyr

1 5 10 15

Gly Thr Ala Leu Ala Ile Thr Leu Ala Arg Asn Gly His Glu Val Val

20 25 30

Leu Trp Gly His Asp Pro Glu His Ile Ala Thr Leu Glu Arg Asp Arg

35 40 45

Cys Asn Ala Ala Phe Leu Pro Asp Val Pro Phe Pro Asp Thr Leu His

50 55 60

Leu Glu Ser Asp Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ala Ser Arg Asn Ile Leu

65 70 75 80

Val Val Val Pro Ser His Val Phe Gly Glu Val Leu Arg Gln Ile Lys

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Pro Leu Met Arg Pro Asp Ala Arg Leu Val Trp Ala Thr Lys Gly Leu

100 105 110

Glu Ala Glu Thr Gly Arg Leu Leu Gln Asp Val Ala Arg Glu Ala Leu

115 120 125

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130 135 140

Glu Leu Ala Ala Gly Leu Pro Thr Ala Ile Ser Leu Ala Ser Thr Asp

145 150 155 160

Gln Thr Phe Ala Asp Asp Leu Gln Gln Leu Leu His Cys Gly Lys Ser

165 170 175

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Ala Val Lys Asn Val Ile Ala Ile Gly Ala Gly Met Ser Asp Gly Ile

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Gly Phe Gly Ala Asn Ala Arg Thr Ala Leu Ile Thr Arg Gly Leu Ala

210 215 220

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Met Gly Met Ala Gly Leu Gly Asp Leu Val Leu Thr Cys Thr Asp Asn

245 250 255

Gln Ser Arg Asn Arg Arg Phe Gly Met Met Leu Gly Gln Gly Met Asp

260 265 270

Val Gln Ser Ala Gln Glu Lys Ile Gly Gln Val Val Glu Gly Tyr Arg

275 280 285

Asn Thr Lys Glu Val Arg Glu Leu Ala His Arg Phe Gly Val Glu Met

290 295 300

Pro Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Gln Val Leu Tyr Cys Gly Lys Asn Ala

305 310 315 320

Arg Glu Ala Ala Leu Thr Leu Leu Gly Arg Ala Arg Lys Asp Glu Arg

325 330 335

Ser Ser His

(2)SEQ ID NO：15的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：501个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑类型：未知

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)初始来源：

(A)生物：GLPD

(xi)SEQ ID NO：15的序列描述

Met Glu Thr Lys Asp Leu Ile Val Ile Gly Gly Gly Ile Asn Gly Ala

1 5 10 15

Gly Ile Ala Ala Asp Ala Ala Gly Arg Gly Leu Ser Val Leu Met Leu

20 25 30

Glu Ala Gln Asp Leu Ala Cys Ala Thr Ser Ser Ala Ser Ser Lys Leu

35 40 45

Ile His Gly Gly Leu Arg Tyr Leu Glu His Tyr Glu Phe Arg Leu Val

50 55 60

Ser Glu Ala Leu Ala Glu Arg Glu Val Leu Leu Lys Met Ala Pro His

65 70 75 80

Ile Ala Phe Pro Met Arg Phe Arg Leu Pro His Arg Pro His Leu Arg

85 90 95

Pro Ala Trp Met Ile Arg Ile Gly Leu Phe Met Tyr Asp His Leu Gly

100 105 110

Lys Arg Thr Ser Leu Pro Gly Ser Thr Gly Leu Arg Phe Gly Ala Asn

115 120 125

Ser Val Leu Lys Pro Glu Ile Lys Arg Gly Phe Glu Tyr Ser Asp Cys

130 135 140

Trp Val Asp Asp Ala Arg Leu Val Leu Ala Asn Ala Gln Met Val Val

145 150 155 160

Arg Lys Gly Gly Glu Val Leu Thr Arg Thr Arg Ala Thr Ser Ala Arg

165 170 175

Arg Glu Asn Gly Leu Trp Ile Val Glu Ala Glu Asp Ile Asp Thr Gly

180 185 190

Lys Lys Tyr Ser Trp Gln Ala Arg Gly Leu Val Asn Ala Thr Gly Pro

195 200 205

Trp Val Lys Gln Phe Phe Asp Asp Gly Met His Leu Pro Ser Pro Tyr

210 215 220

Gly Ile Arg Leu Ile Lys Gly Ser His Ile Val Val Pro Arg Val His

225 230 235 240

Thr Gln Lys Gln Ala Tyr Ile Leu Gln Asn Glu Asp Lys Arg Ile Val

245 250 255

Phe Val Ile Pro Trp Met Asp Glu Phe Ser Ile Ile Gly Thr Thr Asp

260 265 270

Val Glu Tyr Lys Gly Asp Pro Lys Ala Val Lys Ile Glu Glu Ser Glu

275 280 285

Ile Asn Tyr Leu Leu Asn Val Tyr Asn Thr His Phe Lys Lys Gln Leu

290 295 300

Ser Arg Asp Asp Ile Val Trp Thr Tyr Ser Gly Val Arg Pro Leu Cys

305 310 315 320

Asp Asp Glu Ser Asp Ser Pro Gln Ala Ile Thr Arg Asp Tyr Thr Leu

325 330 335

Asp Ile His Asp Glu Asn Gly Lys Ala Pro Leu Leu Ser Val Phe Gly

340 345 350

Gly Lys Leu Thr Thr Tyr Arg Lys Leu Ala Glu His Ala Leu Glu Lys

355 360 365

Leu Thr Pro Tyr Tyr Gln Gly Ile Gly Pro Ala Trp Thr Lys Glu Ser

370 375 380

Val Leu Pro Gly Gly Ala Ile Glu Gly Asp Arg Asp Asp Tyr Ala Ala

385 390 395 400

Arg Leu Arg Arg Arg Tyr Pro Phe Leu Thr Glu Ser Leu Ala Arg His

405 410 415

Tyr Ala Arg Thr Tyr Gly Ser Asn Ser Glu Leu Leu Leu Gly Asn Ala

420 425 430

Gly Thr Val Ser Asp Leu Gly Glu Asp Phe Gly His Glu Phe Tyr Glu

435 440 445

Ala Glu Leu Lys Tyr Leu Val Asp His Glu Trp Val Arg Arg Ala Asp

450 455 460

Asp Ala Leu Trp Arg Arg Thr Lys Gln Gly Met Trp Leu Asn Ala Asp

465 470 475 480

Gln Gln Ser Arg Val Ser Gln Trp Leu Val Glu Tyr Thr Gln Gln Arg

485 490 495

Leu Ser Leu Ala Ser

500

(2)SEQ ID NO：16的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：542个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑类型：未知

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)初始来源：

(A)生物：GLPABC

(xi)SEQ ID NO：16的序列描述

Met Lys Thr Arg Asp Ser Gln Ser Ser Asp Val Ile Ile Ile Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ala Thr Gly Ala Gly Ile Ala Arg Asp Cys Ala Leu Arg Gly Leu

20 25 30

Arg Val Ile Leu Val Glu Arg His Asp Ile Ala Thr Gly Ala Thr Gly

35 40 45

Arg Asn His Gly Leu Leu His Ser Gly Ala Arg Tyr Ala Val Thr Asp

50 55 60

Ala Glu Ser Ala Arg Glu Cys Ile Ser Glu Asn Gln Ile Leu Lys Arg

65 70 75 80

Ile Ala Arg His Cys Val Glu Pro Thr Asn Gly Leu Phe Ile Thr Leu

85 90 95

Pro Glu Asp Asp Leu Ser Phe Gln Ala Thr Phe Ile Arg Ala Cys Glu

100 105 110

Glu Ala Gly Ile Ser Ala Glu Ala Ile Asp Pro Gln Gln Ala Arg Ile

115 120 125

Ile Glu Pro Ala Val Asn Pro Ala Leu Ile Gly Ala Val Lys Val Pro

130 135 140

Asp Gly Thr Val Asp Pro Phe Arg Leu Thr Ala Ala Asn Met Leu Asp

145 150 155 160

Ala Lys Glu His Gly Ala Val Ile Leu Thr Ala His Glu Val Thr Gly

165 170 175

Leu Ile Arg Glu Gly Ala Thr Val Cys Gly Val Arg Val Arg Asn His

180 185 190

Leu Thr Gly Glu Thr Gln Ala Leu His Ala Pro Val Val Val Asn Ala

195 200 205

Ala Gly Ile Trp Gly Gln His Ile Ala Glu Tyr Ala Asp Leu Arg Ile

210 215 220

Arg Met Phe Pro Ala Lys Gly Ser Leu Leu Ile Met Asp His Arg Ile

225 230 235 240

Asn Gln His Val Ile Asn Arg Cys Arg Lys Pro Ser Asp Ala Asp Ile

245 250 255

Leu Val Pro Gly Asp Thr Ile Ser Leu Ile Gly Thr Thr Ser Leu Arg

260 265 270

Ile Asp Tyr Asn Glu Ile Asp Asp Asn Arg Val Thr Ala Glu Glu Val

275 280 285

Asp Ile Leu Leu Arg Glu Gly Glu Lys Leu Ala Pro Val Met Ala Lys

290 295 300

Thr Arg Ile Leu Arg Ala Tyr Ser Gly Val Arg Pro Leu Val Ala Ser

305 310 315 320

Asp Asp Asp Pro Ser Gly Arg Asn Leu Ser Arg Gly Ile Val Leu Leu

325 330 335

Asp His Ala Glu Arg Asp Gly Leu Asp Gly Phe Ile Thr Ile Thr Gly

340 345 350

Gly Lys Leu Met Thr Tyr Arg Leu Met Ala Glu Trp Ala Thr Asp Ala

355 360 365

Val Cys Arg Lys Leu Gly Asn Thr Arg Pro Cys Thr Thr Ala Asp Leu

370 375 380

Ala Leu Pro Gly Ser Gln Glu Pro Ala Glu Val Thr Leu Arg Lys Val

385 390 395 400

Ile Ser Leu Pro Ala Pro Leu Arg Gly Ser Ala Val Tyr Arg His Gly

405 410 415

Asp Arg Thr Pro Ala Trp Leu Ser Glu Gly Arg Leu His Arg Ser Leu

420 425 430

Val Cys Glu Cys Glu Ala Val Thr Ala Gly Glu Val Gln Tyr Ala Val

435 440 445

Glu Asn Leu Asn Val Asn Ser Leu Leu Asp Leu Arg Arg Arg Thr Arg

450 455 460

Val Gly Met Gly Thr Cys Gln Gly Glu Leu Cys Ala Cys Arg Ala Ala

465 470 475 480

Gly Leu Leu Gln Arg Phe Asn Val Thr Thr Ser Ala Gln Ser Ile Glu

485 490 495

Gln Leu Ser Thr Phe Leu Asn Glu Arg Trp Lys Gly Val Gln Pro Ile

500 505 510

Ala Trp Gly Asp Ala Leu Arg Glu Ser Glu Phe Thr Arg Trp Val Tyr

515 520 525

Gln Gly Leu Cys Gly Leu Glu Lys Glu Gln Lys Asp Ala Leu

530 535 540

(2)SEQ ID NO：17的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：250个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑类型：未知

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)初始来源：

(A)生物：GPP2

(xi)SEQ ID NO：17的序列描述

Met Gly Leu Thr Thr Lys pro Leu Ser Leu Lys Val Asn Ala Ala Leu

1 5 10 15

Phe Asp Val Asp Gly Thr Ile Ile Ile Ser Gln Pro Ala Ile Ala Ala

20 25 30

Phe Trp Arg Asp Phe Gly Lys Asp Lys Pro Tyr Phe Asp Ala Glu His

35 40 45

Val Ile Gln Val Ser His Gly Trp Arg Thr Phe Asp Ala Ile Ala Lys

50 55 60

Phe Ala Pro Asp Phe Ala Asn Glu Glu Tyr Val Asn Lys Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Ile Pro Val Lys Tyr Gly Glu Lys Ser Ile Glu Val Pro Gly Ala

85 90 95

Val Lys Leu Cys Asn Ala Leu Asn Ala Leu Pro Lys Glu Lys Trp Ala

100 105 110

Val Ala Thr Ser Gly Thr Arg Asp Met Ala Gln Lys Trp Phe Glu His

115 120 125

Leu Gly Ile Arg Arg Pro Lys Tyr Phe Ile Thr Ala Asn Asp Val Lys

130 135 140

Gln Gly Lys Pro His Pro Glu Pro Tyr Leu Lys Gly Arg Asn Gly Leu

145 150 155 160

Gly Tyr Pro Ile Asn Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser Lys Val Val Val

165 170 175

phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Ala Ala Gly Lys Ala Ala Gly Cys

180 185 190

Lys Ile Ile Gly Ile Ala Thr Thr Phe Asp Leu Asp Phe Leu Lys Glu

195 200 205

Lys Gly Cys Asp Ile Ile Val Lys Asn His Glu Ser Ile Arg Val Gly

210 215 220

Gly Tyr Asn Ala Glu Thr Asp Glu Val Glu Phe Ile Phe Asp Asp Tyr

225 230 235 240

Leu Tyr Ala Lys Asp Asp Leu Leu Lys Trp

245 250

(2)SEQ ID NO：18的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：709个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑类型：未知

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)初始来源：

(A)生物：GUT1

(xi)SEQ ID NO：18的序列描述

Met Phe Pro Ser Leu Phe Arg Leu Val Val Phe Ser Lys Arg Tyr Ile

1 5 10 15

Phe Arg Ser Ser Gln Arg Leu Tyr Thr Ser Leu Lys Gln Glu Gln Ser

20 25 30

Arg Met Ser Lys Ile Met Glu Asp Leu Arg Ser Asp Tyr Val Pro Leu

35 40 45

Ile Ala Ser Ile Asp Val Gly Thr Thr Ser Ser Arg Cys Ile Leu Phe

50 55 60

Asn Arg Trp Gly Gln Asp Val Ser Lys His Gln Ile Glu Tyr Ser Thr

65 70 75 80

Ser Ala Ser Lys Gly Lys Ile Gly Val Ser Gly Leu Arg Arg Pro Ser

85 90 95

Thr Ala Pro Ala Arg Glu Thr Pro Asn Ala Gly Asp Ile Lys Thr Ser

100 105 110

Gly Lys Pro Ile Phe Ser Ala Glu Gly Tyr Ala Ile Gln Glu Thr Lys

115 120 125

Phe Leu Lys Ile Glu Glu Leu Asp Leu Asp Phe His Asn Glu Pro Thr

130 135 140

Leu Lys Phe Pro Lys Pro Gly Trp Val Glu Cys His Pro Gln Lys Leu

145 150 155 160

Leu Val Asr Val Val Gln Cys Leu Ala Ser Ser Leu Leu Ser Leu Gln

165 170 175

Thr Ile Asn Ser Glu Arg Val Ala Asn Gly Leu Pro Pro Tyr Lys Val

180 185 190

Ile Cys Met Gly Ile Ala Asn Met Arg Glu Thr Thr Ile Leu Trp Ser

195 200 205

Arg Arg Thr Gly Lys Pro Ile Val Asn Tyr Gly Ile Val Trp Asn Asp

210 215 220

Thr Arg Thr Ile Lys Ile Val Arg Asp Lys Trp Gln Asn Thr Ser Val

225 230 235 240

Asp Arg Gln Leu Gln Leu Arg Gln Lys Thr Gly Leu Pro Leu Leu Ser

245 250 255

Thr Tyr Phe Ser Cys Ser Lys Leu Arg Trp Phe Leu Asp Asn Glu Pro

260 265 270

Leu Cys Thr Lys Ala Tyr Glu Glu Asn Asp Leu Met Phe Gly Thr Val

275 280 285

Asp Thr Trp Leu Ile Tyr Gln Leu Thr Lys Gln Lys Ala Phe Val Ser

290 295 300

Asp Val Thr Asn Ala Ser Arg Thr Gly Phe Met Asn Leu Ser Thr Leu

305 310 315 320

Lys Tyr Asp Asn Glu Leu Leu Glu Phe Trp Gly Ile Asp Lys Asn Leu

325 330 335

Ile His Met Pro Glu Ile Val Ser Ser Ser Gln Tyr Tyr Gly Asp Phe

340 345 350

Gly Ile Pro Asp Trp Ile Met Glu Lys Leu His Asp Ser Pro Lys Thr

355 360 365

Val Leu Arg Asp Leu Val Lys Arg Asn Leu Pro Ile Gln Gly Cys Leu

370 375 380

Gly Asp Gln Ser Ala Ser Met Val Gly Gln Leu Ala Tyr Lys Pro Gly

385 390 395 400

Ala Ala Lys Cys Thr Tyr Gly Thr Gly Cys Phe Leu Leu Tyr Asn Thr

405 410 415

Gly Thr Lys Lys Leu Ile Ser Gln His Gly Ala Leu Thr Thr Leu Ala

420 425 430

Phe Trp Phe Pro His Leu Gln Glu Tyr Gly Gly Gln Lys Pro Glu Leu

435 440 445

Ser Lys Pro His Phe Ala Leu Glu Gly Ser Val Ala Val Ala Gly Ala

450 455 460

Val Val Gln Trp Leu Arg Asp Asn Leu Arg Leu Ile Asp Lys Ser Glu

465 470 475 480

Asp Val Gly Pro Ile Ala Ser Thr Val Pro Asp Ser Gly Gly Val Val

485 490 495

Phe Val Pro Ala Phe Ser Gly Leu Phe Ala Pro Tyr Trp Asp Pro Asp

500 505 510

Ala Arg Ala Thr Ile Met Gly Met Ser Gln Phe Thr Thr Ala Ser His

515 520 525

Ile Ala Arg Ala Ala Val Glu Gly Val Cys Phe Gln Ala Arg Ala Ile

530 535 540

Leu Lys Ala Met Ser Ser Asp Ala Phe Gly Glu Gly Ser Lys Asp Arg

545 550 555 560

Asp Phe Leu Glu Glu Ile Ser Asp Val Thr Tyr Glu Lys Ser Pro Leu

565 570 575

Ser Val Leu Ala Val Asp Gly Gly Met Ser Arg Ser Asn Glu Val Met

580 585 590

Gln Ile Gln Ala Asp Ile Leu Gly Pro Cys Val Lys Val Arg Arg Ser

595 600 605

Pro Thr Ala Glu Cys Thr Ala Leu Gly Ala Ala Ile Ala Ala Asn Met

610 615 620

Ala Phe Lys Asp Val Asn Glu Arg Pro Leu Trp Lys Asp Leu His Asp

625 630 635 640

Val Lys Lys Trp Val Phe Tyr Asn Gly Met Glu Lys Asn Glu Gln Ile

645 650 655

Ser Pro Glu Ala His Pro Asn Leu Lys Ile Phe Arg Ser Glu Ser Asp

660 665 670

Asp Ala Glu Arg Arg Lys His Trp Lys Tyr Trp Glu Val Ala Val Glu

675 680 685

Arg Ser Lys Gly Trp Leu Lys Asp Ile Glu Gly Glu His Glu Gln Val

690 695 700

Leu Glu Asn Phe Gln

705

(2)SEQ ID NO：19的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：12145个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(vi)初始来源：

(A)生物：PHK28-26

(xi)SEQ ID NO：19的序列描述

GTCGACCACC ACGGTGGTGA CTTTAATGCC GCTCTCATGC AGCAGCTCGG TGGCGGTCTC 60

AAAATTCAGG ATGTCGCCGG TATAGTTTTT GATAATCAGC AAGACGCCTT CGCCGCCGTC 120

AATTTGCATC GCGCATTCAA ACATTTTGTC CGGCGTCGGC GAGGTGAATA TTTCCCCCGG 180

ACAGGCGCCG GAGAGCATGC CCTGGCCGAT ATAGCCGCAG TGCATCGGTT CATGTCCGCT 240

GCCGCCGCCG GAGAGCAGGG CCACCTTGCC AGCCACCGGC GCGTCGGTGC GGGTCACATA 300

CAGCGGGTCC TGATGCAGGG TCAGCTGCGG ATGGGCTTTA GCCAGCCCCT GTAATTGTTC 360

ATTCAGTACA TCTTCAACAC GGTTAATCAG CTTTTTCATT ATTCAGTGCT CCGTTGGAGA 420

AGGTTCGATG CCGCCTCTCT GCTGGCGGAG GCGGTCATCG CGTAGGGGTA TCGTCTGACG 480

GTGGAGCGTG CCTGGCGATA TGATGATTCT GGCTGAGCGG ACGAAAAAAA GAATGCCCCG 540

ACGATCGGGT TTCATTACGA AACATTGCTT CCTGATTTTG TTTCTTTATG GAACGTTTTT 600

GCTGAGGATA TGGTGAAAAT GCGAGCTGGC GCGCTTTTTT TCTTCTGCCA TAAGCGGCGG 660

TCAGGATAGC CGGCGAAGCG GGTGGGAAAA AATTTTTTGC TGATTTTCTG CCGACTGCGG 720

GAGAAAAGGC GGTCAAACAC GGAGGATTGT AAGGGCATTA TGCGGCAAAG GAGCGGATCG 780

GGATCGCAAT CCTGACAGAG ACTAGGGTTT TTTGTTCCAA TATGGAACGT AAAAAATTAA 840

CCTGTGTTTC ATATCAGAAC AAAAAGGCGA AAGATTTTTT TGTTCCCTGC CGGCCCTACA 900

GTGATCGCAC TGCTCCGGTA CGCTCCGTTC AGGCCGCGCT TCACTGGCCG GCGCGGATAA 960

CGCCAGGGCT CATCATGTCT ACATGCGCAC TTATTTGAGG GTGAAAGGAA TGCTAAAAGT 1020

TATTCAATCT CCAGCCAAAT ATCTTCAGGG TCCTGATGCT GCTGTTCTGT TCGGTCAATA 1080

TGCCAAAAAC CTGGCGGAGA GCTTCTTCGT CATCGCTGAC GATTTCGTAA TGAAGCTGGC 1140

GGGAGAGAAA GTGGTGAATG GCCTGCAGAG CCACGATATT CGCTGCCATG CGGAACGGTT 1200

TAACGGCGAA TGCAGCCATG CGGAAATCAA CCGTCTGATG GCGATTTTGC AAAAACAGGG 1260

CTGCCGCGGC GTGGTCGGGA TCGGCGGTGG TAAAACCCTC GATACCGCGA AGGCGATCGG 1320

TTACTACCAG AAGCTGCCGG TGGTGGTGAT CCCGACCATC GCCTCGACCG ATGCGCCAAC 1380

CAGCGCGCTG TCGGTGATCT ACACCGAAGC GGGCGAGTTT GAAGAGTATC TGATCTATCC 1440

GAAAAACCCG GATATGGTGG TGATGGACAC GGCGATTATC GCCAAAGCGC CGGTACGCCT 1500

GCTGGTCTCC GGCATGGGCG ATGCGCTCTC CACCTGGTTC GAGGCCAAAG CTTGCTACGA 1560

TGCGCGCGCC ACCAGCATGG CCGGAGGACA GTCCACCGAG GCGGCGCTGA GCCTCGCCCG 1620

CCTGTGCTAT GATACGCTGC TGGCGGAGGG CGAAAAGGCC CGTCTGGCGG CGCAGGCCGG 1680

GGTAGTGACC GAAGCGCTGG AGCGCATCAT CGAGGCGAAC ACTTACCTCA GCGGCATTGG 1740

CTTTGAAAGC AGTGGCCTGG CCGCTGCCCA TGCAATCCAC AACGGTTTCA CCATTCTTGA 1800

AGAGTGCCAT CACCTGTATC ACGGTGAGAA AGTGGCCTTC GGTACCCTGG CGCAGCTGGT 1860

GCTGCAGAAC AGCCCGATGG ACGAGATTGA AACGGTGCAG GGCTTCTGCC AGCGCGTCGG 1920

CCTGCCGGTG ACGCTCGCGC AGATGGGCGT CAAAGAGGGG ATCGACGAGA AAATCGCCGC 1980

GGTGGCGAAA GCTACCTGCG CGGAAGGGGA AACCATCCAT AATATGCCGT TTGCGGTGAC 2040

CCCGGAGAGC GTCCATGCCG CTATCCTCAC CGCCGATCTG TTAGGCCAGC AGTGGCTGGC 2100

GCGTTAATTC GCGGTGGCTA AACCGCTGGC CCAGGTCAGC GGTTTTTCTT TCTCCCCTCC 2160

GGCAGTCGCT GCCGGAGGGG TTCTCTATGG TACAACGCGG AAAAGGATAT GACTGTTCAG 2220

ACTCAGGATA CCGGGAAGGC GGTCTCTTCC GTCATTGCCC AGTCATGGCA CCGCTGCAGC 2280

AAGTTTATGC AGCGCGAAAC CTGGCAAACG CCGCACCAGG CCCAGGGCCT GACCTTCGAC 2340

TCCATCTGTC GGCGTAAAAC CGCGCTGCTC ACCATCGGCC AGGCGGCGCT GGAAGACGCC 2400

TGGGAGTTTA TGGACGGCCG CCCCTGCGCG CTGTTTATTC TTGATGAGTC CGCCTGCATC 2460

CTGAGCCGTT GCGGCGAGCC GCAAACCCTG GCCCAGCTGG CTGCCCTGGG ATTTCGCGAC 2520

GGCAGCTATT GTGCGGAGAG CATTATCGGC ACCTGCGCGC TGTCGCTGGC CGCGATGCAG 2580

GGCCAGCCGA TCAACACCGC CGGCGATCGG CATTTTAAGC AGGCGCTACA GCCATGGAGT 2640

TTTTGCTCGA CGCCGGTGTT TGATAACCAC GGGCGGCTGT TCGGCTCTAT CTCGCTTTGC 2700

TGTCTGGTCG AGCACCAGTC CAGCGCCGAC CTCTCCCTGA CGCTGGCCAT CGCCCGCGAG 2760

GTGGGTAACT CCCTGCTTAC CGACAGCCTG CTGGCGGAAT CCAACCGTCA CCTCAATCAG 2820

ATGTACGGCC TGCTGGAGAG CATGGACGAT GGGGTGATGG CGTGGAACGA ACAGGGCGTG 2880

CTGCAGTTTC TCAATGTTCA GGCGGCGAGA CTGCTGCATC TTGATGCTCA GGCCAGCCAG 2940

GGGAAAAATA TCGCCGATCT GGTGACCCTC CCGGCGCTGC TGCGCCGCGC CATCAAACAC 3000

GCCCGCGGCC TGAATCACGT CGAAGTCACC TTTGAAAGTC AGCATCAGTT TGTCGATGCG 3060

GTGATCACCT TAAAACCGAT TGTCGAGGCG CAAGGCAACA GTTTTATTCT GCTGCTGCAT 3120

CCGGTGGAGC AGATGCGGCA GCTGATGACC AGCCAGCTCG GTAAAGTCAG CCACACCTTT 3180

GAGCAGATGT CTGCCGACGA TCCGGAAACC CGACGCCTGA TCCACTTTGG CCGCCAGGCG 3240

GCGCGCGGCG GCTTCCCGGT GCTACTGTGC GGCGAAGAGG GGGTCGGGAA AGAGCTGCTG 3300

AGCCAGGCTA TTCACAATGA AAGCGAACGG GCGGGCGGCC CCTACATCTC CGTCAACTGC 3360

CAGCTATATG CCGACAGCGT GCTGGGCCAG GACTTTATGG GCAGCGCCCC TACCGACGAT 3420

GAAAATGGTC GCCTGAGCCG CCTTGAGCTG GCCAACGGCG GCACCCTGTT TCTGGAAAAG 3480

ATCGAGTATC TGGCGCCGGA GCTGCAGTCG GCTCTGCTGC AGGTGATTAA GCAGGGCGTG 3540

CTCACCCGCC TCGACGCCCG GCGCCTGATC CCGGTGGATG TGAAGGTGAT TGCCACCACC 3600

ACCGTCGATC TGGCCAATCT GGTGGAACAG AACCGCTTTA GCCGCCAGCT GTACTATGCG 3660

CTGCACTCCT TTGAGATCGT CATCCCGCCG CTGCGCGCCC GACGCAACAG TATTCCGTCG 3720

CTGGTGCATA ACCGGTTGAA GAGCCTGGAG AAGCGTTTCT CTTCGCGACT GAAAGTGGAC 3780

GATGACGCGC TGGCACAGCT GGTGGCCTAC TCGTGGCCGG GGAATGATTT TGAGCTCAAC 3840

AGCGTCATTG AGAATATCGC CATCAGCAGC GACAACGGCC ACATTCGCCT GAGTAATCTG 3900

CCGGAATATC TCTTTTCCGA GCGGCCGGGC GGGGATAGCG CGTCATCGCT GCTGCCGGCC 3960

AGCCTGACTT TTAGCGCCAT CGAAAAGGAA GCTATTATTC ACGCCGCCCG GGTGACCAGC 4020

GGGCGGGTGC AGGAGATGTC GCAGCTGCTC AATATCGGCC GCACCACCCT GTGGCGCAAA 4080

ATGAAGCAGT ACGATATTGA CGCCAGCCAG TTCAAGCGCA AGCATCAGGC CTAGTCTCTT 4140

CGATTCGCGC CATGGAGAAC AGGGCATCCG ACAGGCGATT GCTGTAGCGT TTGAGCGCGT 4200

CGCGCAGCGG ATGCGCGCGG TCCATGGCCG TCAGCAGGCG TTCGAGCCGA CGGGACTGGG 4260

TGCGCGCCAC GTGCAGCTGG GCAGAGGCGA GATTCCTCCC CGGGATCACG AACTGTTTTA 4320

ACGGGCCGCT CTCGGCCATA TTGCGGTCGA TAAGCCGCTC CAGGGCGGTG ATCTCCTCTT 4380

CGCCGATCGT CTGGCTCAGG CGGGTCAGGC CCCGCGCATC GCTGGCCAGT TCAGCCCCCA 4440

GCACGAACAG CGTCTGCTGA ATATGGTGCA GGCTTTCCCG CAGCCCGGCG TCGCGGGTCG 4500

TGGCGTAGCA GACGCCCAGC TGGGATATCA GTTCATCGAC GGTGCCGTAG GCCTCGACGC 4560

GAATATGGTC TTTCTCGATG CGGCTGCCGC CGTACAGGGC GGTGGTGCCT TTATCCCCGG 4620

TGCGGGTATA GATACGATAC ATTCAGTTTC TCTCACTTAA CGGCAGGACT TTAACCAGCT 4680

GCCCGGCGTT GGCGCCGAGC GTACGCAGTT GATCGTCGCT ATCGGTGACG TGTCCGGTAG 4740

CCAGCGGCGC GTCCGCCGGC AGCTGGGCAT GAGTGAGGGC TATCTCGCCG GACGCGCTGA 4800

GCCCGATACC CACCCGCAGG GGCGAGCTTC TGGCCGCCAG GGCGCCCAGC GCAGCGGCGT 4860

CACCGCCTCC GTCATAGGTT ATGGTCTGGC AGGGGACCCC CTGCTCCTCC AGCCCCCAGC 4920

ACAGCTCATT GATGGCGCCG GCATGGTGCC CGCGCGGATC GTAAAACAGG CGTACGCCTG 4980

GCGGTGAAAG CGACATGACG GTCCCCTCGT TAACACTCAG AATGCCTGGC GGAAAATCGC 5040

GGCAATCTCC TGCTCGTTGC CTTTACGCGG GTTCGAGAAC GCATTGCCGT CTTTTAGAGC 5100

CATCTCCGCC ATGTAGGGGA AGTCGGCCTC TTTTACCCCC AGATCGCGCA GATGCTGCGG 5160

AATACCGATA TCCATCGACA GACGCGTGAT AGCGGCGATG GCTTTTTCCG CCGCGTCGAG 5220

AGTGGACAGT CCGGTGATAT TTTCGCCCAT CAGTTCAGCG ATATCGGCGA ATTTCTCCGG 5280

GTTGGCGATC AGGTTGTAGC GCGCCACATG CGGCAGCAGG ACAGCGTTGG CCACGCCGTG 5340

CGGCATGTCG TACAGGCCGC CCAGCTGGTG CGCCATGGCG TGCACGTAGC CGAGGTTGGC 5400

GTTATTGAAA GCCATCCCGG CCAGCAGAGA AGCATAGGCC ATGTTTTCCC GCGCCTGCAG 5460

ATTGCTGCCG AGGGCCACGG CCTGGCGCAG GTTGCGGGCG ATGAGGCGGA TCGCCTGCAT 5520

GGCGGCGGCG TCCGTCACCG GGTTAGCGTC TTTGGAGATA TAGGCCTCTA CGGCGTGGGT 5580

CAGGGCATCC ATCCCGGTCG CCGCGGTCAG GGCGGCCGGT TTACCGATCA TCAGCAGTGG 5640

ATCGTTGATA GAGACCGACG GCAGTTTGCG CCAGCTGACG ATCACAAACT TCACTTTGGT 5700

TTCGGTGTTG GTCAGGACGC AGTGGCGGGT GACCTCGCTG GCGGTGCCGG CGGTGGTATT 5760

GACCGCGACG ATAGGCGGCA GCGGGTTGGT CAGGGTCTCG ATTCCGGCAT ACTGGTACAG 5820

ATCGCCCTCA TGGGTGGCGG CGATGCCGAT GCCTTTGCCG CAATCGTGCG GGCTGCCGCC 5880

GCCCACGGTG ACGATGATGT CGCACTGTTC GCGGCGAAAC ACGGCGAGGC CGTCGCGCAC 5940

GTTGGTGTCT TTCGGGTTCG GCTCGACGCC GTCAAAGATC GCCACCTCGA TCCCGGCCTC 6000

CCGCAGATAA TGCAGGGTTT TGTCCACCGC GCCATCTTTA ATTGCCCGCA GGCCTTTGTC 6060

GGTGACCAGC AGGGCTTTTT TCCCCCCCAG CAGCTGGCAG CGTTCGCCGA CTACGGAAAT 6120

GGCGTTGGGG CCAAAAAAGT TAACGTTTGG CACCAGATAA TCAAACATAC GATAGCTCAT 6180

AATATACCTT CTCGCTTCAG GTTATAATGC GGAAAAACAA TCCAGGGCGC ACTGGGCTAA 6240

TAATTGATCC TGCTCGACCG TACCGCCGCT AACGCCGACG GCGCCAATTA CCTGCTCATT 6300

AAAAATAACT GGCAGGCCGC CGCCAAAAAT AATAATTCGC TGTTGGTTGG TTAGCTGCAG 6360

ACCGTACAGA GATTGTCCTG GCTGGACCGC TGACGTAATT TCATGGGTAC CTTGCTTCAG 6420

GCTGCAGGCG CTCCAGGCTT TATTCAGGGA AATATCGCAG CTGGAGACGA AGGCCTCGTC 6480

CATCCGCTGG ATAAGCAGCG TGTTGCCTCC GCGGTCAACT ACGGAAAACA CCACCGCCAC 6540

GTTGATCTCA GTGGCTTTTT TTTCCACCGC CGCCGCCATT TGCTGGGCGG CGGCCAGGGT 6600

GATTGTCTGA ACTTGTTGGC TCTTGTTCAT CATTCTCTCC CGCACCAGGA TAACGCTGGC 6660

GCGAATAGTC AGTAGGGGGC GATAGTAAAA AACTATTACC ATTCGGTTGG CTTGCTTTAT 6720

TTTTGTCAGC GTTATTTTGT CGCCCGCCAT GATTTAGTCA ATAGGGTTAA AATAGCGTCG 6780

GAAAAACGTA ATTAAGGGCG TTTTTTATTA ATTGATTTAT ATCATTGCGG GCGATCACAT 6840

TTTTTATTTT TGCCGCCGGA GTAAAGTTTC ATAGTGAAAC TGTCGGTAGA TTTCGTGTGC 6900

CAAATTGAAA CGAAATTAAA TTTATTTTTT TCACCACTGG CTCATTTAAA GTTCCGCTAT 6960

TGCCGGTAAT GGCCGGGCGG CAACGACGCT GGCCCGGCGT ATTCGCTACC GTCTGCGGAT 7020

TTCACCTTTT GAGCCGATGA ACAATGAAAA GATCAAAACG ATTTGCAGTA CTGGCCCAGC 7080

GCCCCGTCAA TCAGGACGGG CTGATTGGCG AGTGGCCTGA AGAGGGGCTG ATCGCCATGG 7140

ACAGCCCCTT TGACCCGGTC TCTTCAGTAA AAGTGGACAA CGGTCTGATC GTCGAACTGG 7200

ACGGCAAACG CCGGGACCAG TTTGACATGA TCGACCGATT TATCGCCGAT TACGCGATCA 7260

ACGTTGAGCG CACAGAGCAG GCAATGCGCC TGGAGGCGGT GGAAATAGCC CGTATGCTGG 7320

TGGATATTCA CGTCAGCCGG GAGGAGATCA TTGCCATCAC TACCGCCATC ACGCCGGCCA 7380

AAGCGGTCGA GGTGATGGCG CAGATGAACG TGGTGGAGAT GATGATGGCG CTGCAGAAGA 7440

TGCGTGCCCG CCGGACCCCC TCCAACCAGT GCCACGTCAC CAATCTCAAA GATAATCCGG 7500

TGCAGATTGC CGCTGACGCC GCCGAGGCCG GGATCCGCGG CTTCTCAGAA CAGGAGACCA 7560

CGGTCGGTAT CGCGCGCTAC GCGCCGTTTA ACGCCCTGGC GCTGTTGGTC GGTTCGCAGT 7620

GCGGCCGCCC CGGCGTGTTG ACGCAGTGCT CGGTGGAAGA GGCCACCGAG CTGGAGCTGG 7680

GCATGCGTGG CTTAACCAGC TACGCCGAGA CGGTGTCGGT CTACGGCACC GAAGCGGTAT 7740

TTACCGACGG CGATGATACG CCGTGGTCAA AGGCGTTCCT CGCCTCGGCC TACGCCTCCC 7800

GCGGGTTGAA AATGCGCTAC ACCTCCGGCA CCGGATCCGA AGCGCTGATG GGCTATTCGG 7860

AGAGCAAGTC GATGCTCTAC CTCGAATCGC GCTGCATCTT CATTACTAAA GGCGCCGGGG 7920

TTCAGGGACT GCAAAACGGC GCGGTGAGCT GTATCGGCAT GACCGGCGCT GTGCCGTCGG 7980

GCATTCGGGC GGTGCTGGCG GAAAACCTGA TCGCCTCTAT GCTCGACCTC GAAGTGGCGT 8040

CCGCCAACGA CCAGACTTTC TCCCACTCGG ATATTCGCCG CACCGCGCGC ACCCTGATGC 8100

AGATGCTGCC GGGCACCGAC TTTATTTTCT CCGGCTACAG CGCGGTGCCG AACTACGACA 8160

ACATGTTCGC CGGCTCGAAC TTCGATGCGG AAGATTTTGA TGATTACAAC ATCCTGCAGC 8220

GTGACCTGAT GGTTGACGGC GGCCTGCGTC CGGTGACCGA GGCGGAAACC ATTGCCATTC 8280

GCCAGAAAGC GGCGCGGGCG ATCCAGGCGG TTTTCCGCGA GCTGGGGCTG CCGCCAATCG 8340

CCGACGAGGA GGTGGAGGCC GCCACCTACG CGCACGGCAG CAACGAGATG CCGCCGCGTA 8400

ACGTGGTGGA GGATCTGAGT GCGGTGGAAG AGATGATGAA GCGCAACATC ACCGGCCTCG 8460

ATATTGTCGG CGCGCTGAGC CGCAGCGGCT TTGAGGATAT CGCCAGCAAT ATTCTCAATA 8520

TGCTGCGCCA GCGGGTCACC GGCGATTACC TGCAGACCTC GGCCATTCTC GATCGGCAGT 8580

TCGAGGTGGT GAGTGCGGTC AACGACATCA ATGACTATCA GGGGCCGGGC ACCGGCTATC 8640

GCATCTCTGC CGAACGCTGG GCGGAGATCA AAAATATTCC GGGCGTGGTT CAGCCCGACA 8700

CCATTGAATA AGGCGGTATT CCTGTGCAAC AGACAACCCA AATTCAGCCC TCTTTTACCC 8760

TGAAAACCCG CGAGGGCGGG GTAGCTTCTG CCGATGAACG CGCCGATGAA GTGGTGATCG 8820

GCGTCGGCCC TGCCTTCGAT AAACACCAGC ATCACACTCT GATCGATATG CCCCATGGCG 8880

CGATCCTCAA AGAGCTGATT GCCGGGGTGG AAGAAGAGGG GCTTCACGCC CGGGTGGTGC 8940

GCATTCTGCG CACGTCCGAC GTCTCCTTTA TGGCCTGGGA TGCGGCCAAC CTGAGCGGCT 9000

CGGGGATCGG CATCGGTATC CAGTCGAAGG GGACCACGGT CATCCATCAG CGCGATCTGC 9060

TGCCGCTCAG CAACCTGGAG CTGTTCTCCC AGGCGCCGCT GCTGACGCTG GAGACCTACC 9120

GGCAGATTGG CAAAAACGCT GCGCGCTATG CGCGCAAAGA GTCACCTTCG CCGGTGCCGG 9180

TGGTGAACGA TCAGATGGTG CGGCCGAAAT TTATGGCCAA AGCCGCGCTA TTTCATATCA 9240

AAGAGACCAA ACATGTGGTG CAGGACGCCG AGCCCGTCAC CCTGCACATC GACTTAGTAA 9300

GGGAGTGACC ATGAGCGAGA AAACCATGCG CGTGCAGGAT TATCCGTTAG CCACCCGCTG 9360

CCCGGAGCAT ATCCTGACGC CTACCGGCAA ACCATTGACC GATATTACCC TCGAGAAGGT 9420

GCTCTCTGGC GAGGTGGGCC CGCAGGATGT GCGGATCTCC CGCCAGACCC TTGAGTACCA 9480

GGCGCAGATT GCCGAGCAGA TGCAGCGCCA TGCGGTGGCG CGCAATTTCC GCCGCGCGGC 9540

GGAGCTTATC GCCATTCCTG ACGAGCGCAT TCTGGCTATC TATAACGCGC TGCGCCCGTT 9600

CCGCTCCTCG CAGGCGGAGC TGCTGGCGAT CGCCGACGAG CTGGAGCACA CCTGGCATGC 9660

GACAGTGAAT GCCGCCTTTG TCCGGGAGTC GGCGGAAGTG TATCAGCAGC GGCATAAGCT 9720

GCGTAAAGGA AGCTAAGCGG AGGTCAGCAT GCCGTTAATA GCCGGGATTG ATATCGGCAA 9780

CGCCACCACC GAGGTGGCGC TGGCGTCCGA CTACCCGCAG GCGAGGGCGT TTGTTGCCAG 9840

CGGGATCGTC GCGACGACGG GCATGAAAGG GACGCGGGAC AATATCGCCG GGACCCTCGC 9900

CGCGCTGGAG CAGGCCCTGG CGAAAACACC GTGGTCGATG AGCGATGTCT CTCGCATCTA 9960

TCTTAACGAA GCCGCGCCGG TGATTGGCGA TGTGGCGATG GAGACCATCA CCGAGACCAT 10020

TATCACCGAA TCGACCATGA TCGGTCATAA CCCGCAGACG CCGGGCGGGG TGGGCGTTGG 10080

CGTGGGGACG ACTATCGCCC TCGGGCGGCT GGCGACGCTG CCGGCGGCGC AGTATGCCGA 10140

GGGGTGGATC GTACTGATTG ACGACGCCGT CGATTTCCTT GACGCCGTGT GGTGGCTCAA 10200

TGAGGCGCTC GACCGGGGGA TCAACGTGGT GGCGGCGATC CTCAAAAAGG ACGACGGCGT 10260

GCTGGTGAAC AACCGCCTGC GTAAAACCCT GCCGGTGGTG GATGAAGTGA CGCTGCTGGA 10320

GCAGGTCCCC GAGGGGGTAA TGGCGGCGGT GGAAGTGGCC GCGCCGGGCC AGGTGGTGCG 10380

GATCCTGTCG AATCCCTACG GGATCGCCAC CTTCTTCGGG CTAAGCCCGG AAGAGACCCA 10440

GGCCATCGTC CCCATCGCCC GCGCCCTGAT TGGCAACCGT TCCGCGGTGG TGCTCAAGAC 10500

CCCGCAGGGG GATGTGCAGT CGCGGGTGAT CCCGGCGGGC AACCTCTACA TTAGCGGCGA 10560

AAAGCGCCGC GGAGAGGCCG ATGTCGCCGA GGGCGCGGAA GCCATCATGC AGGCGATGAG 10620

CGCCTGCGCT CCGGTACGCG ACATCCGCGG CGAACCGGGC ACCCACGCCG GCGGCATGCT 10680

TGAGCGGGTG CGCAAGGTAA TGGCGTCCCT GACCGGCCAT GAGATGAGCG CGATATACAT 10740

CCAGGATCTG CTGGCGGTGG ATACGTTTAT TCCGCGCAAG GTGCAGGGCG GGATGGCCGG 10800

CGAGTGCGCC ATGGAGAATG CCGTCGGGAT GGCGGCGATG GTGAAAGCGG ATCGTCTGCA 10860

AATGCAGGTT ATCGCCCGCG AACTGAGCGC CCGACTGCAG ACCGAGGTGG TGGTGGGCGG 10920

CGTGGAGGCC AACATGGCCA TCGCCGGGGC GTTAACCACT CCCGGCTGTG CGGCGCCGCT 10980

GGCGATCCTC GACCTCGGCG CCGGCTCGAC GGATGCGGCG ATCGTCAACG CGGAGGGGCA 11040

GATAACGGCG GTCCATCTCG CCGGGGCGGG GAATATGGTC AGCCTGTTGA TTAAAACCGA 11100

GCTGGGCCTC GAGGATCTTT CGCTGGCGGA AGCGATAAAA AAATACCCGC TGGCCAAAGT 11160

GGAAAGCCTG TTCAGTATTC GTCACGAGAA TGGCGCGGTG GAGTTCTTTC GGGAAGCCCT 11220

CAGCCCGGCG GTGTTCGCCA AAGTGGTGTA CATCAAGGAG GGCGAACTGG TGCCGATCGA 11280

TAACGCCAGC CCGCTGGAAA AAATTCGTCT CGTGCGCCGG CAGGCGAAAG AGAAAGTGTT 11340

TGTCACCAAC TGCCTGCGCG CGCTGCGCCA GGTCTCACCC GGCGGTTCCA TTCGCGATAT 11400

CGCCTTTGTG GTGCTGGTGG GCGGCTCATC GCTGGACTTT GAGATCCCGC AGCTTATCAC 11460

GGAAGCCTTG TCGCACTATG GCGTGGTCGC CGGGCAGGGC AATATTCGGG GAACAGAAGG 11520

GCCGCGCAAT GCGGTCGCCA CCGGGCTGCT ACTGGCCGGT CAGGCGAATT AAACGGGCGC 11580

TCGCGCCAGC CTCTCTCTTT AACGTGCTAT TTCAGGATGC CGATAATGAA CCAGACTTCT 11640

ACCTTAACCG GGCAGTGCGT GGCCGAGTTT CTTGGCACCG GATTGCTCAT TTTCTTCGGC 11700

GCGGGCTGCG TCGCTGCGCT GCGGGTCGCC GGGGCCAGCT TTGGTCAGTG GGAGATCAGT 11760

ATTATCTGGG GCCTTGGCGT CGCCATGGCC ATCTACCTGA CGGCCGGTGT CTCCGGCGCG 11820

CACCTAAATC CGGCGGTGAC CATTGCCCTG TGGCTGTTCG CCTGTTTTGA ACGCCGCAAG 11880

GTGCTGCCGT TTATTGTTGC CCAGACGGCC GGGGCCTTCT GCGCCGCCGC GCTGGTGTAT 11940

GGGCTCTATC GCCAGCTGTT TCTCGATCTT GAACAGAGTC AGCATATCGT GCGCGGCACT 12000

GCCGCCAGTC TTAACCTGGC CGGGGTCTTT TCCACGTACC CGCATCCACA TATCACTTTT 12060

ATACAAGCGT TTGCCGTGGA GACCACCATC ACGGCAATCC TGATGGCGAT GATCATGGCC 12120

CTGACCGACG ACGGCAACGG AATTC 12145

(2)SEQ ID NO：20的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：94个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：20的序列描述

AGCTTAGGAG TCTAGAATAT TGAGCTCGAA TTCCCGGGCA TGCGGTACCG GATCCAGAAA 60

AAAGCCCGCA CCTGACAGTG CGGGCTTTTT TTTT 94

(2)SEQ ID NO：21的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：37个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：21的序列描述

GGAATTCAGA TCTCAGCAAT GAGCGAGAAA ACCATGC 37

(2)SEQ ID NO：22的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：22的序列描述

GCTCTAGATT AGCTTCCTTT ACGCAGC 27

(2)SEQ ID NO：23的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：23的序列描述

GGCCAAGCTT AAGGAGGTTA ATTAAATGAAAAG 33

(2)SEQ ID NO：24的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：24的序列描述

GCTCTAGATT ATTCAATGGT GTCGGG 26

(2)SEQ ID NO：25的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：42个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：25的序列描述

GCGCCGTCTA GAATTATGAG CTATCGTATG TTTGATTATC TG 42

(2)SEQ ID NO：26的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：36个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：26的序列描述

TCTGATACGG GATCCTCAGA ATGCCTGGCG GAAAAT 36

(2)SEQ ID NO：27的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：51个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：27的序列描述

GCGCGGATCC AGGAGTCTAG AATTATGGGA TTGACTACTA AACCTCTATC T 51

(2)SEQ ID NO：28的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：36个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：28的序列描述

GATACGCCCG GGTTACCATT TCAACAGATC GTCCTT 36

(2)SEQ ID NO：29的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：18个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：29的序列描述

TCGACGAATT CAGGAGGA 18

(2)SEQ ID NO：30的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：18个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：30的序列描述

CTAGTCCTCC TGAATTCG 18

(2)SEQ ID NO：31的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：19个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：31的序列描述

CTAGTAAGGA GGACAATTC 19

(2)SEQ ID NO：32的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：19个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：32的序列描述

CATGGAATTG TCCTCCTTA 19

(2)SEQ ID NO：33的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：271个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑类型：未知

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)初始来源：

(A)生物：GPP1

(xi)SEQ ID NO：33的序列描述

Met Lys Arg Phe Asn Val Leu Lys Tyr Ile Arg Thr Thr Lys Ala Asn

1 5 10 15

Ile Gln Thr Ile Ala Met Pro Leu Thr Thr Lys Pro Leu Ser Leu Lys

20 25 30

Ile Asn Ala Ala Leu Phe Asp Val Asp Gly Thr Ile Ile Ile Ser Gln

35 40 45

Pro Ala Ile Ala Ala Phe Trp Arg Asp Phe Gly Lys Asp Lys Pro Tyr

50 55 60

Phe Asp Ala Glu His Val Ile His Ile Ser His Gly Trp Arg Thr Tyr

65 70 75 80

Asp Ala Ile Ala Lys Phe Ala Pro Asp Phe Ala Asp Glu Glu Tyr Val

85 90 95

Asn Lys Leu Glu Gly Glu Ile Pro Glu Lys Tyr Gly Glu His Ser Ile

100 105 110

Glu Val Pro Gly Ala Val Lys Leu Cys Asn Ala Leu Asn Ala Leu Pro

115 120 125

Lys Glu Lys Trp Ala Val Ala Thr Ser Gly Thr Arg Asp Met Ala Lys

130 135 140

Lys Trp Phe Asp Ile Leu Lys Ile Lys Arg Pro Glu Tyr Phe Ile Thr

145 150 155 160

Ala Asn Asp Val Lys Gln Gly Lys Pro His Pro Glu Pro Tyr Leu Lys

165 170 175

Gly Arg Asn Gly Leu Gly Phe Pro Ile Asn Glu Gln Asp Pro Ser Lys

180 185 190

Ser Lys Val Val Val Phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Ala Ala Gly

195 200 205

Lys Ala Ala Gly Cys Lys Ile Val Gly Ile Ala Thr Thr Phe Asp Leu

210 215 220

Asp Phe Leu Lys Glu Lys Gly Cys Asp Ile Ile Val Lys Asn His Glu

225 230 235 240

Ser Ile Arg Val Gly Glu Tyr Asn Ala Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu

245 250 255

Ile Phe Asp Asp Tyr Leu Tyr Ala Lys Asp Asp Leu Leu Lys Trp

260 265 270

(2)SEQ ID NO：34的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：555个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑类型：未知

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)初始来源：

(A)生物：DHAB1

(xi)SEQ ID NO：34的序列描述

Met Lys Arg Ser Lys Arg Phe Ala Val Leu Ala Gln Arg Pro Val Asn

1 5 10 15

Gln Asp Gly Leu Ile Gly Glu Trp Pro Glu Glu Gly Leu Ile Ala Met

20 25 30

Asp Ser Pro Phe Asp Pro Val Ser Ser Val Lys Val Asp Asn Gly Leu

35 40 45

Ile Val Glu Leu Asp Gly Lys Arg Arg Asp Gln Phe Asp Met Ile Asp

50 55 60

Arg Phe Ile Ala Asp Tyr Ala Ile Asn Val Glu Arg Thr Glu Gln Ala

65 70 75 80

Met Arg Leu Glu Ala Val Glu Ile Ala Arg Met Leu Val Asp Ile His

85 90 95

Val Ser Arg Glu Glu Ile Ile Ala Ile Thr Thr Ala Ile Thr Pro Ala

100 105 110

Lys Ala Val Glu Val Met Ala Gln Met Asn Val Val Glu Met Met Met

115 120 125

Ala Leu Gln Lys Met Arg Ala Arg Arg Thr Pro Ser Asn Gln Cys His

130 135 140

Val Thr Asn Leu Lys Asp Asn Pro Val Gln Ile Ala Ala Asp Ala Ala

145 150 155 160

Glu Ala Gly Ile Arg Gly Phe Ser Glu Gln Glu Thr Thr Val Gly Ile

165 170 175

Ala Arg Tyr Ala Pro Phe Asn Ala Leu Ala Leu Leu Val Gly Ser Gln

180 185 190

Cys Gly Arg Pro Gly Val Leu Thr Gln Cys Ser Val Glu Glu Ala Thr

195 200 205

Glu Leu Glu Leu Gly Met Arg Gly Leu Thr Ser Tyr Ala Glu Thr Val

210 215 220

Ser Val Tyr Gly Thr Glu Ala Val Phe Thr Asp Gly Asp Asp Thr Pro

225 230 235 240

Trp Ser Lys Ala Phe Leu Ala Ser Ala Tyr Ala Ser Arg Gly Leu Lys

245 250 255

Mat Arg Tyr Thr Ser Gly Thr Gly Ser Glu Ala Leu Met Gly Tyr Ser

260 265 270

Glu Ser Lys Ser Met Leu Tyr Leu Glu Ser Arg Cys Ile Phe Ile Thr

275 280 285

Lys Gly Ala Gly Val Gln Gly Leu Gln Asn Gly Ala Val Ser Cys Ile

290 295 300

Gly Met Thr Gly Ala Val Pro Ser Gly Ile Arg Ala Val Leu Ala Glu

305 310 315 320

Asn Leu Ile Ala Ser Met Leu Asp Leu Glu Val Ala Ser Ala Asn Asp

325 330 335

Gln Thr Phe Ser His Ser Asp Ile Arg Arg Thr Ala Arg Thr Leu Met

340 345 350

Gln Met Leu Pro Gly Thr Asp Phe Ile Phe Ser Gly Tyr Ser Ala Val

355 360 365

Pro Asn Tyr Asp Asn Met Phe Ala Gly Ser Asn Phe Asp Ala Glu Asp

370 375 380

Phe Asp Asp Tyr Asn Ile Leu Gln Arg Asp Leu Met Val Asp Gly Gly

385 390 395 400

Leu Arg Pro Val Thr Glu Ala Glu Thr Ile Ala Ile Arg Gln Lys Ala

405 410 415

Ala Arg Ala Ile Gln Ala Val Phe Arg Glu Leu Gly Leu Pro Pro Ile

420 425 430

Ala Asp Glu Glu Val Glu Ala Ala Thr Tyr Ala His Gly Ser Asn Glu

435 440 445

Met Pro Pro Arg Asn Val Val Glu Asp Leu Ser Ala Val Glu Glu Met

450 455 460

Met Lys Arg Asn Ile Thr Gly Leu Asp Ile Val Gly Ala Leu Ser Arg

465 470 475 480

Ser Gly Phe Glu Asp Ile Ala Ser Asn Ile Leu Asn Met Leu Arg Gln

485 490 495

Arg Val Thr Gly Asp Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Ile Leu Asp Arg Gln

500 505 510

Phe Glu Val Val Ser Ala Val Asn Asp Ile Asn Asp Tyr Gln Gly Pro

515 520 525

Gly Thr Gly Tyr Arg Ile ser Ala Glu Arg Trp Ala Glu Ile Lys Asn

530 535 540

Ile Pro Gly Val Val Gln Pro Asp Thr Ile Glu

545 550 555

(2)SEQ ID NO：35的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：194个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑类型：未知

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)初始来源：

(A)生物：DHAB2

(xi)SEQ ID NO：35的序列描述

Met Gln Gln Thr Thr Gln Ile Gln Pro Ser Phe Thr Leu Lys Thr Arg

1 5 10 15

Glu Gly Gly Val Ala Ser Ala Asp Glu Arg Ala Asp Glu Val Val Ile

20 25 30

Gly Val Gly Pro Ala Phe Asp Lys His Gln His His Thr Leu Ile Asp

35 40 45

Met Pro His Gly Ala Ile Leu Lys Glu Leu Ile Ala Gly Val Glu Glu

50 55 60

Glu Gly Leu His Ala Arg Val Val Arg Ile Leu Arg Thr Ser Asp Val

65 70 75 80

Ser Phe Met Ala Trp Asp Ala Ala Asn Leu Sar Gly Ser Gly Ile Gly

85 90 95

Ile Gly Ile Gln Ser Lys Gly Thr Thr Val Ile His Gln Arg Asp Leu

100 105 110

Leu Pro Leu Ser Asn Leu Glu Leu Phe Ser Gln Ala Pro Leu Leu Thr

115 120 125

Leu Glu Thr Tyr Arg Gln Ile Gly Lys Asn Ala Ala Arg Tyr Ala Arg

130 135 140

Lys Glu Ser Pro Ser Pro Val Pro Val Val Asn Asp Gln Met Val Arg

145 150 155 160

Pro Lys Phe Met Ala Lys Ala Ala Leu Phe His Ile Lys Glu Thr Lys

165 170 175

His Val Val Gln Asp Ala Glu Pro Val Thr Leu His Ile Asp Leu Val

180 185 190

Arg Glu

(2)SEQ ID NO：36的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：140个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑类型：未知

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)初始来源：

(A)生物：DHAB3

(xi)SEQ ID NO：36的序列描述

Met Ser Glu Lys Thr Met Arg Val Gln Asp Tyr Pro Leu Ala Thr Arg

1 5 10 15

Cys Pro Glu His Ile Leu Thr Pro Thr Gly Lys Pro Leu Thr Asp Ile

20 25 30

Thr Leu Glu Lys Val Leu Ser Gly Glu Val Gly pro Gln Asp Val Arg

35 40 45

Ile Ser Arg Gln Thr Leu Glu Tyr Gln Ala Gln Ile Ala Glu Gln Met

50 55 60

Gln His Ala Val Ala Arg Asn Phe Arg Arg Ala Ala Glu Leu Ile Ala

65 70 75 80

Ile Pro Asp Glu Arg Ile Leu Ala Ile Tyr Asn Ala Leu Arg Pro Phe

85 90 95

Arg Ser Ser Gln Ala Glu Leu Leu Ala Ile Ala Asp Glu Leu Glu His

100 105 110

Thr Trp His Ala Thr Val Asn Ala Ala Phe Val Arg Glu Ser Ala Glu

115 120 125

Val Tyr Gln Gln Arg His Lys Leu Arg Lys Gly Ser

130 135 140

(2)SEQ ID NO：37的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：387个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑类型：未知

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)初始来源：

(A)生物：DHAT

(xi)SEQ ID NO：37的序列描述

Met Ser Tyr Arg Met Phe Asp Tyr Leu Val Pro Asn Val Asn Phe Phe

1 5 10 15

Gly Pro Asn Ala Ile Ser Val Val Gly Glu Arg Cys Gln Leu Leu Gly

20 25 30

Gly Lys Lys Ala Leu Leu Val Thr Asp Lys Gly Leu Arg Ala Ile Lys

35 40 45

Asp Gly Ala Val Asp Lys Thr Leu His Tyr Leu Arg Glu Ala Gly Ile

50 55 60

Glu Val Ala Ile Phe Asp Gly Val Glu pro Asn Pro Lys Asp Thr Asn

65 70 75 80

Val Arg Asp Gly Leu Ala Val Phe Arg Arg Glu Gln Cys Asp Ile Ile

85 90 95

Val Thr Val Gly Gly Gly Ser Pro His Asp Cys Gly Lys Gly Ile Gly

100 105 110

Ile Ala Ala Thr His Glu Gly Asp Leu Tyr Gln Tyr Ala Gly Ile Glu

115 120 125

Thr Leu Thr Asn Pro Leu Pro Pro Ile Val Ala Val Asn Thr Thr Ala

130 135 140

Gly Thr Ala Ser Glu Val Thr Arg His Cys Val Leu Thr Asn Thr Glu

145 150 155 160

Thr Lys Val Lys Phe Val Ile Val Ser Trp Arg Lys Leu Pro Ser Val

165 170 175

Ser Ile Asn Asp Pro Leu Leu Met Ile Gly Lys Pro Ala Ala Leu Thr

180 185 190

Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Leu Thr His Ala Val Glu Ala Tyr Ile

195 200 205

Ser Lys Asp Ala Asn Pro Val Thr Asp Ala Ala Ala Met Gln Ala Ile

210 215 220

Arg Ieu Ile Ala Arg Asn Leu Arg Gln Ala Val Ala Leu Gly Ser Asn

225 230 235 240

Leu Gln Ala Arg Glu Asn Met Ala Tyr Ala Ser Leu Leu Ala Gly Met

245 250 255

Ala Phe Asn Asn Ala Asn Leu Gly Tyr Val His Ala Met Ala His Gln

260 265 270

Leu Gly Gly Leu Tyr Asp Met Pro His Gly Val Ala Asn Ala Val Leu

275 280 285

Leu Pro His Val Ala Arg Tyr Asn Leu Ile Ala Asn Pro Glu Lys Phe

290 295 300

Ala Asp Ile Ala Glu Leu Met Gly Glu Asn Ile Thr Gly Leu Ser Thr

305 310 315 320

Leu Asp Ala Ala Glu Lys Ala Ile Ala Ala Ile Thr Arg Leu Ser Met

325 330 335

Asp Ile Gly Ile Pro Gln His Leu Arg Asp Leu Gly Val Lys Glu Ala

340 345 350

Asp Phe Pro Tyr Met Ala Glu Met Ala Leu Lys Asp Gly Asn Ala Phe

355 360 365

Ser Asn Pro Arg Lys Gly Asn Glu Gln Glu Ile Ala Ala Ile Phe Arg

370 375 380

Gln Ala Phe

385

(2)SEQ ID NO：38的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：38的序列描述

GCGAATTCAT GAGCTATCGT ATGTTTG 27

(2)SEQ ID NO：39的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：39的序列描述

GCGAATTCAG AATGCCTGGC GGAAAATC 28

(2)SEQ ID NO：40的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：40的序列描述

GGGAATTCAT GAGCGAGAAA ACCATGCG 28

(2)SEQ ID NO：41的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：41的序列描述

GCGAATTCTT AGCTTCCTTT ACGCAGC 27

(2)SEQ ID NO：42的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：42的序列描述

GCGAATTCAT GCAACAGACA ACCCAAATTC 30

(2)SEQ ID NO：43的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：25个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：43的序列描述

GCGAATTCAC TCCCTTACTA AGTCG 25

(2)SEQ ID NO：44的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：44的序列描述

GGGAATTCAT GAAAAGATCA AAACGATTTG 30

(2)SEQ ID NO：45的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：45的序列描述

GCGAATTCTT ATTCAATGGT GTCGGGCTG 29

(2)SEQ ID NO：46的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：34个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：46的序列描述

TTGATAATAT AACCATGGCT GCTGCTGCTG ATAG 34

(2)SEQ ID NO：47的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：47的序列描述

GTATGATATG TTATCTTGGA TCCAATAAAT CTAATCTTC 39

(2)SEQ ID NO：48的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：48的序列描述

CATGACTAGT AAGGAGGACA ATTC 24

(2)SEQ ID NO：49的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)SEQ ID NO：49的序列描述

CATGGAATTG TCCTCCTTAC TAGT 24

Claims

1.一种用于从微生物产生1，3-丙二醇的方法，包含如下步骤：

a)获得能产生1，3-丙二醇的重组微生物，该微生物包含至少一种编码脱水酶活性的核酸和一种编码蛋白质X的核酸，

其中编码蛋白质X的核酸分离自甘油脱水酶基因簇或二醇脱水酶基因簇，其中甘油脱水酶基因簇来自选自克雷伯氏菌属和柠檬酸杆菌属种类的生物；二醇脱水酶基因簇来自选自克雷伯氏菌属、梭状芽孢杆菌属和沙门氏菌属种类的生物，

其中，蛋白质X与SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：67或登记号为U09771的弗劳地柠檬酸杆菌氨基酸序列有至少90％的氨基酸序列相似性，并且没有酶活性；以及

b)在至少一种能被转化为1，3-丙二醇的碳源存在下以及在适合产生1，3-丙二醇的条件下培养该重组微生物，其中碳源选自单糖、寡糖、多糖以及一碳底物，且其中该重组微生物中1，3-丙二醇的产量高于无蛋白质X的重组微生物中1，3-丙二醇的产量。

2.权利要求1的方法，其还包含回收1，3-丙二醇的步骤。

3.权利要求1的方法，其中重组微生物选自柠檬酸杆菌属，肠杆菌属，梭状芽孢杆菌属，克雷伯氏菌属，气杆菌属，乳杆菌属，曲霉属，酵母属，裂殖酵母属，接合酵母属，毕氏酵母属，克鲁维酵母属，假丝酵母属，汉逊酵母属，德巴利酵母属，毛霉属，球拟酵母属，甲基细菌属，埃希氏菌属，沙门氏菌属，芽孢杆菌属，链霉菌属和假单胞菌属。

4.权利要求3的方法，其中重组微生物选自大肠杆菌和克雷伯氏菌属的种。

5.权利要求1的方法，其中该重组微生物包含至少一种编码选自蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3的蛋白质的核酸，其中

蛋白质1与SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61具有至少95％的氨基酸序列相似性；

蛋白质2与SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：63具有至少95％的氨基酸序列相似性；且

蛋白质3与SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65具有至少95％的氨基酸序列相似性。

6.权利要求5的方法，其中蛋白质1有如SEQ ID NO：60或SEQ IDNO：61所示的序列。

7.权利要求5的方法，其中蛋白质2有如SEQ ID NO：62或SEQ IDNO：63所示的序列。

8.权利要求5的方法，其中蛋白质3有如SEQ ID NO：64或SEQ IDNO：65所示的序列。

9.权利要求1的方法，其中编码脱水酶活性的核酸对于该生物为异源。

10.权利要求1的方法，其中编码脱水酶活性的核酸对于该生物为同源。

11.权利要求1的方法，其中编码蛋白质X的核酸稳定地维持在宿主基因组内。

12.权利要求5的方法，其中至少一个编码选自蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3的蛋白质的核酸被稳定地维持在宿主基因组内。

13.权利要求1的方法，其中碳源是葡萄糖。

14.权利要求1的方法，其中编码蛋白质X的核酸有如SEQ IDNO：59所示的序列。

15.权利要求1的方法，其中编码蛋白质X的核酸具有SEQ IDNO：67所示的序列。

16.一种能从碳源产生1，3-丙二醇的重组微生物，该重组微生物包含a)至少一种编码脱水酶活性的核酸；b)至少一种编码甘油-3-磷酸酶的核酸；以及c)至少一种编码蛋白质X的核酸，

其中，蛋白质X与SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：67或登记号为U09771的弗劳地柠檬酸杆菌氨基酸序列有至少90％的氨基酸序列相似性，并且没有酶活性，而且其中该重组微生物中1，3-丙二醇的产量高于无蛋白质X的重组微生物中1，3-丙二醇的产量。

17.权利要求16的重组微生物，其还包含d)至少一种编码选自蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3的蛋白质的核酸，其中

18.权利要求17的重组微生物，其中蛋白质1有如SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61所示的序列。

19.权利要求17的重组微生物，其中蛋白质2有如SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：63所示的序列。

20.权利要求17的重组微生物，其中蛋白质3有如SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65所示的序列。

21.权利要求16的重组微生物，其中该编码脱水酶活性的核酸对于该微生物为异源。

22.权利要求16的重组微生物，其中该编码脱水酶活性的核酸对于该微生物为同源。

23.权利要求16的重组微生物，其选自柠檬酸杆菌属，肠杆菌属，梭状芽孢杆菌属，克雷伯氏菌属，气杆菌属，乳杆菌属，曲霉属，酵母属，裂殖酵母属，接合酵母属，毕氏酵母属，克鲁维酵母属，假丝酵母属，汉逊酵母属，德巴利酵母属，毛霉属，球拟酵母属，甲基细菌属，埃希氏菌属，沙门氏菌属，芽孢杆菌属，链霉菌属和假单胞菌属。

24.权利要求23的重组微生物，其中该重组微生物是大肠杆菌或克雷伯氏菌属的种。

25.权利要求16的重组微生物，其中编码蛋白质X的核酸有如SEQID NO：59中所示的序列。

26.权利要求16的重组微生物，其中编码蛋白质X的核酸具有SEQID NO：67所示的序列。

27.一种用于在能产生1，3-丙二醇并含有至少一个编码脱水酶活性的核酸之经转化的微生物中延长脱水酶活性的半寿期的方法，包含将编码蛋白质X的核酸引入该微生物，

28.权利要求27的方法，其中编码脱水酶活性的核酸对于该微生物为异源。

29.权利要求27的方法，其中编码脱水酶活性的核酸对于该微生物为同源。

30.权利要求27的方法，其还包含将至少一种编码选自蛋白质1、蛋白质2和蛋白质3的蛋白质的核酸引入该微生物的步骤，其中

31.权利要求27的方法，其中微生物选自柠檬酸杆菌属，肠杆菌属，梭状芽孢杆菌属，克雷伯氏菌属，气杆菌属，乳杆菌属，曲霉属，酵母属，裂殖酵母属，接合酵母属，毕氏酵母属，克鲁维酵母属，假丝酵母属，汉逊酵母属，德巴利酵母属，毛霉属，球拟酵母属，甲基细菌属，埃希氏菌属，沙门氏菌属，芽孢杆菌属，链霉菌属和假单胞菌属。

32.权利要求31的方法，其中所述微生物是大肠杆菌或克雷伯氏菌属的种。