JP2001504338A - 組み換え生物による１，３―プロパンジオールの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 様々な炭素基質からの１，３−プロパンジオールの生産のために有用なグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−ホスファターゼ、グリセロールデヒドラターゼ及び１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性をコードする遺伝子を含んでなる組み換え生物が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 組み換え生物による１，３−プロパンジオールの生産方法 発明の分野 本発明は分子生物学の分野及び所望する化合物の生産のための組み換え生物の 使用に関する。より具体的には、本発明は１，３−プロパンジオールの増大生産 のために、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）及びグリ セロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）、グリセロールデヒド ラターゼ（ｄｈａＢ）、並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ （ｄｈａＴ）のクローン化された遺伝子の別個または一緒のいずれかの発現を記 述する。 発明の背景 １，３−プロパンジオールはポリエステル繊維の製造並びにポリウレタン及び 環式化合物の製造に潜在的有用性を有するモノマーである。 １，３−プロパンジオールへの様々な化学経路が知られている。例えば、アク ロレインの触媒溶液相水和及びそれに続く還元により、ホスフィン、水、一酸化 炭素、水素及び酸の存在下で触媒でエチレンオキシドを１，３−プロパンジオー ルに転化することができ、またはグリセロールのような炭化水素から、周期表の VIII族からの原子を有する触媒で一酸化炭素及び水素の存在下で反応させること ができる。これらの方法により１，３−プロパンジオールを生成することは可能 であるが、それらは高価であり且つ環境汚染物質を含有する廃棄物の流れを生じ る。 グリセロールの発酵から１，３−プロパンジオールを生成できることは百年以 上の間知られている。１，３−プロパンジオールを生産することができるバクテ リア株は例えばシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔ ｅｒ ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロバクター（Ｅ ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ）、イリオバクター（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、クレブ シエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ ｓ ）及びペロバクター（Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ）の群に見いだされている。研究 された各場合で、グリセロールは２段階の酵素触媒反応順序で１，３−プロパン ジオールに転化される。第一段階では、デヒドラターゼがグリセロールの３−ヒ ドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰ）及び水への転化を触媒する（式１） 。第二段階では、ＮＡＤ⁺結合（ＮＡＤ⁺−ｌｉｎｋｅｄ）オキシドレダクターゼ により３−ＨＰが１，３−プロパンジオールに還元される（式２）。 グリセロール→３−ＨＰ＋Ｈ₂Ｏ （式１） ３−ＨＰ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺→１，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ⁺（式２） １，３−プロパンジオールはさらに代謝されず、その結果、培地中に高濃度で 蓄積する。全反応は補因子の形態の還元当量（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）、還元型 β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を消費し、それはニコ チンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ⁺）に酸化される。 通常、グリセロールからの１，３−プロパンジオールの生産は、グリセロール を唯一の炭素源として用いて嫌気的条件下で他の外因性還元当量受容体の非存在 下で実施される。これらの条件下で、例えば、シトロバクター、クロストリジウ ム及びクレブシエラの株では、グリセロールの並発経路が動き、それはまずＮＡ Ｄ⁺（またはＮＡＤＰ⁺）結合グリセロールデヒドロゲナーゼによるグリセロール のジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）への酸化を伴う（式３）。ＤＨＡはＤＨＡキ ナーゼによるジヒド ロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）へのリン酸化（式４）の後に、生合成のため 及び例えば解糖によるＡＴＰ生成を補助するために利用できるようになる。 グリセロール＋ＮＡＤ⁺→ＤＨＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺ （式３） ＤＨＡｆＡＴＰ→ＤＨＡＰ＋ＡＤＰ （式４） １，３−プロパンジオール経路と異なり、この経路は炭素及びエネルギーを細胞 に与えることができ、そしてＮＡＤＨを消費するよりむしろ生成する。 クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ）及びシトロバクター・フロインジイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄ ｉｉ ）では、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）、１，３−プロパンジオ ールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈ ａＤ ）及びジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）の機能的に連結した活性 をコードする遺伝子はｄｈａレギュロンにより包含される。シトロバクター及び クレブシエラからのｄｈａレギュロンはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ ｈｉａ ｃｏｌｉ ）で発現されており、そしてグリセロールを１，３−プロパン ジオールに転化することが示されている。 グリセロールの製造のための生物学的方法は知られている。グリセロール生産 体の圧倒的大多数は酵母であるが、いくつかのバクテリア、他の真菌及び藻類も グリセロールを生産することが知られている。バクテリア及び酵母は両方とも解 糖のフルクトース−１，６−ビスリン酸経路を通してグルコースもしくは他の炭 水化物を転化するかまたはエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路によりグリセ ロールを生産し、一方、あ る種の藻類は葉緑体中の溶存二酸化炭素もしくは重炭酸塩をカルビン回路の３炭 素中間体に転化する。一連の工程で、３炭素中間体のホスホグリセリン酸はグリ セルアルデヒド３−リン酸に転化され、それをそのケト異性体ジヒドロキシアセ トンリン酸に容易に相互転化することができ、そして最終的にグリセロールに転 化される。 特に、バクテリアのバシラス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈ ｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）及びラクトバシラス・リコペルシカ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ ｌｌｕｓ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃａ ）はグリセロールを合成し、そしてグリセロ ール生産は高い外部の塩濃度に対する防護のために耐塩性藻類ドゥナリエラ種（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓｐ． ）及びアステロモナス・グラシリス（Ａｓｔｅｒ ｏｍｏｎａｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ ）に見いだされる（Ｂｅｎ−Ａｍｏｔｚ等、Ｅ ｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ３８、４９−５２、（１９８２））。同様に、各種浸透 圧耐性（ｏｓｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ）酵母は防護手段としてグリセロールを合成 する。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の大部分の株はアルコー ル発酵中にいくらかのグリセロールを生産し、そして浸透圧ストレスの添加によ りこれを生理学的に増やすことができる（Ａｌｂｅｒｔｙｎ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ ｌ．Ｂｉｏｌ ．１４、４１３５−４１４４、（１９９４））。今世紀初期の商業 的グリセロール製造は、亜硫酸塩またはアルカリのような「スティアリング（ｓ ｔｅｅｒｉｎｇ）試薬」が添加されたサッカロミセス培養物の使用により実施さ れた。不活性複合体の形成により、舵取り剤はエタノールへのアセトアルデヒド の転化を阻止または阻害し；従って、過剰の還元当量（ＮＡＤＨ）は還元のため にＤＨＡＰが利用できるかまたはそれに「導かれ」てグリセロールを生成す る。この方法は亜硫酸塩による酵母の生育の部分的阻害により制限される。異な る機構で過剰のＮＡＤＨ当量を生じるアルカリの使用によりこの制限をある程度 克服することができる。この操作で、アルカリはカニッツァロ不均化を開始して ２当量のアセトアルデヒドからエタノールと酢酸を生成する。 グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ＤＡＲ１、 ＧＰＤ１）はサッカロミセス・ジアスタチカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ） からクローン化され、シークエンスされている（Ｗａｎｇ等、Ｊ．Ｂａｃｔ．１ ７６、７０９１−７０９５、（１９９４））。ＤＡＲ１遺伝子はシャトルベクタ ー中にクローン化され、そしてエシェリキア・コリを形質転換するために用いら れ、その場合、発現により活性酵素が生産された。Ｗａｎｇ等（上記）はＤＡＲ １が細胞の浸透圧環境により調節されることを認めるが、組み換え生物において １，３−プロパンジオール生産を高めるためにその遺伝子がどのように用いられ る可能性があるかを示唆していない。 他のグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素が単離されており；例え ば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））からｓｎ−グ リセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼがクローン化され、シークエンスされ ており（Ｌａｒａｓｏｎ等、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０、１１０１、（ １９９３））、そしてＡｌｂｅｒｔｙｎ等（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４ 、４１３５（１９９４））はサッカロミセス・セレビシエからのグリセロール− ３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＧＰＤ１のクローニングを教示してい る。Ｗａｎｇ等（上記）のように、Ａｌｂｅｒｔｙｎ等及びＬａｒａｓｏｎ等は この遺 伝子の調節の浸透圧感受性を認めるが、組み換え生物における１，３−プロパン ジオールの生産にその遺伝子がどのように用いられる可能性があるかを示唆して いない。 Ｇ３ＰＤＨでのように、グリセロール−３−ホスファターゼがサッカロミセス ・セレビシエから単離されており、そのタンパク質はＧＰＰ１及びＧＰＰ２遺伝 子によりコードされると同定されている（Ｎｏｒｂｅｃｋ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ ｈｅｍ ．２７１、１３８７５、（１９９６））。Ｇ３ＰＤＨをコードする遺伝子 のように、ＧＰＰ２は浸透圧感受性であるようである。 グリセロール及び１，３−プロパンジオールの両方の生産の生物学的方法は知 られているが、全工程を単一の組み換え生物により成し遂げることができること はこれまで一度も示されていない。 化学的方法はエネルギー集約的であり、そして生物学的方法は高価な出発原料 のグリセロールを必要とするので、１，３−プロパンジオールの製造に関して上 に記述した化学的または生物学的方法はいずれも工業規模生産には十分に適して いない。低いエネルギー入力及び安価な出発原料を必要とする方法が求められて いる。より望ましい方法は所望する１，３−プロパンジオール最終生成物に炭水 化物または糖類のような基本的な炭素源を転化する能力を有する微生物を含む。 １，３−プロパンジオールへのグリセロールまたはジヒドロキシアセトン以外 の発酵可能な炭素源の単一生物転化が望ましいが、そのような試みには克服すべ きかなりの難題があることが実証されている。例えば、Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ等 (ＥＰ ３７３ ２３０）はシトロバクター・フロインジイ、クロストリジウム・ オートブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄ ｉｕｍ ａｕｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌ ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ）及びクレブシエラ・ニューモニエを 初めとする１，３−プロパンジオールの生産のために有用な大部分の株の生育が フルクトースまたはグルコースのような水素供与体の存在により妨げられること を教示している。グリセロールとフルクトースまたはグルコースの同時発酵で１ ，３−プロパンジオールを生成するラクトバシラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａ ｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ）及びラクトバシラス・ブフナー（Ｌａｃｔｏｂａ ｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒ ）の株は、グリセロールが唯一の炭素源として与 えられる場合には生育せず、そして得られる細胞がグルコースまたはフルクトー スを代謝できることは示されているが、それらは１，３−プロパンジオールを生 成しない（Ｖｅｉｇａ ＤＡ Ｃｕｎｈａ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４ 、１０１３（１９９２））。同様に、グリセロール及びアセテートが与えられる 場合に１，３−プロパンジオールを生産するイリオバクター・ポリトロプス（Ｉ ｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ ）の株は、フルクトース及びグルコ ースを初めとするグリセロール以外の炭素基質から１，３−プロパンジオールを 生成しないことが示されている（Ｓｔｅｉｂ等、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ．１４０ 、１３９（１９８４））。，最後に、Ｔｏｎｇ等（Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃ ｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ．３４、１４９（１９９２））はグリセロールデヒドラ ターゼをコードするｄｈａレギュロンで形質転換された組み換えエシェリキア・ コリが外因性グリセロールの非存在下でグルコースまたはキシロースのいずれも から１，３−プロパンジオールを生産しないことを教示している。 グリセロールからの１，３−プロパンジオールの収率を上げる試みが報告され ており、その場合、還元当量を与えることができる補助基質、典型的には発酵可 能な糖類が工程に含まれる。収率の向上はグリセロール及びグルコースを同時発 酵するシトロバクター・フロインジイ及びクレブシエラ・ニューモニエＤＳＭ ４２７０の休止細胞に対して主張されているが（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ等、上記 及びＴｒａｎ−Ｄｉｎｈ等、ＤＥ ３７３４ ７６４）；グリセロール及びグルコ ースを同時発酵するクレブシエラ・ニューモニエＡＴＣＣ ２５９５５の増殖細 胞には主張されておらず、それらは１，３−プロパンジオールを生成しなかった （Ｉ−Ｔ．Ｔｏｎｇ、Ｐｈ．Ｄ．学位論文、ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒ ｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）−Ｍａｄｉｓｏｎ（１９９２））。増加 した収率は組み換えエシェリキア・コリによるグリセロールとグルコースまたは フルクトースの同時発酵に対して報告されているが；しかしながら、グリセロー ルの非存在下で１，３−プロパンジオールは生産されない（Ｔｏｎｇ等、上記） 。これらの系で、単一生物は細胞の維持または増殖のためにエネルギー及び炭素 を与えながらＮＡＤＨを生成する供給源として炭水化物を用いる。これらの開示 は１，３−プロパンジオールを生産する炭素の流れに糖類が入らないことを示唆 する。いずれの場合でもグリセロールの外因性供給源の非存在下で１，３−プロ パンジオールは生産されない。従って、文献のウェートから、単一生物による炭 水化物源からの１，３−プロパンジオールの生産は可能ではないことが明らかに 示唆される。 本発明により解決される問題はグルコースまたは他の糖類のような安価な炭素 基質からの単一組み換え生物による１，３−プロパンジオール の生物学的生産である。１，３−プロパンジオールの生物学的生産は２段階の連 続反応の基質としてグリセロールを必要とし、その場合、デヒドラターゼ酵素（ 典型的には補酵素Ｂ₁₂依存性デヒドラターゼ）がグリセロールを中間体の３−ヒ ドロキシプロピオンアルデヒドに転化し、次にそれはＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰ Ｈ）依存性オキシドレダクターゼにより１，３−プロパンジオールに転化される 。補因子条件の複雑さのために、１，３−プロパンジオールの製造にこの反応順 序を利用する工業的方法は全細胞触媒の使用を必要とする。さらに、この方法を 経済的に実用的にするために、グリセロールまたはジヒドロキシアセトンより安 価な供給原料が必要とされる。グルコース及び他の炭水化物は適当な基質である が、上に説明したように、それらは１，３−プロパンジオール生成を妨げること が知られている。その結果として、いかなる単一生物もグルコースを１，３−プ ロパンジオールに転化することが示されていない。 出願人等は提示した問題を解決し、そして本発明は単一の組み換え生物を用い て発酵可能な炭素源を直接１，３−プロパンジオールに生物転化することを規定 する。グルコースをモデル基質として用い、そして生物転化はあらゆる生存する 微生物に適用できる。グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ ）、グリセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）、グリセロー ルデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）及び１，３−プロパンジオールオキシドレダクタ ーゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子を保有する微生物は、グリセロール分解経 路により優れた収率及び選択性でグルコース及び他の糖類を１，３−プロパンジ オールに転化することができる。さらに、本発明を１）グリセロール、 ２）ジヒドロキシアセトンまたは３）グリセロールの酸化状態のＣ₃化合物（例 えば、グリセロール３−リン酸）または４）ジヒドロキシアセトンの酸化状態の Ｃ₃化合物（例えば、ジヒドロキシアセトンリン酸もしくはグリセルアルデヒド ３−リン酸）に容易に転化されるあらゆる炭素基質を含むように一般的に適用す ることができる。 本発明の要約 本発明は （ｉ）（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする遺 伝子；（ｂ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性をコードする遺伝子；（ｃ ）デヒドラターゼ活性をコードする遺伝子；及び（ｄ）１，３−プロパンジオー ルオキシドレダクターゼ活性をコードする遺伝子の少なくとも１つを含んでなる 形質転換カセットで適当な宿主生物を形質転換し、ただし、形質転換カセットが （ａ）−（ｄ）の全てより少ない遺伝子を含んでなる場合には、適当な宿主生物 が内因性遺伝子を含んでなり、それにより得られる形質転換された宿主生物が少 なくとも１つの各々の遺伝子（ａ）−（ｄ）を含んでなり； （ii）形質転換された宿主生物を単糖、オリゴ糖、多糖または１炭素基質より なる群から選択される少なくとも１つの炭素源の存在下で適当な条件下で培養し 、それにより１，３−プロパンジオールが生成され；そして （iii）１，３−プロパンジオールを回収すること を含んでなる組み換え生物からの１，３−プロパンジオールの生産方法を提供す る。 本発明はさらに１，３−プロパンジオールの生産のためにグリセロー ル−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−ホスファターゼ、グリセ ロールデヒドラターゼ及び１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性 を発現することができる発現カセットを含んでなる形質転換された宿主を提供す る。 本方法に用いる適当な宿主生物はバクテリア、酵母及び糸状菌よりなる群から 選択される。より具体的には、適当な宿主生物はシトロバクター、エンテロバク ター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム、クレブシエラ、エロバ クター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバシラス、アスペルギルス（Ａｓｐｅ ｒｇｉｌｌｕｓ ）、サッカロミセス、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ）、ザイゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍ ｙｃｅｓ ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ ｙｃｅｓ ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ） 、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ト ルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃ ｔｅｒ ）、エシェリキア、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス、ス トレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ ）よりなる属の群から選択される。最も具体的には、適当な宿主生 物はエシェリキア・コリ、クレブシエラ種及びサッカロミセス種よりなる群から 選択される。本方法に用いる特定の形質転換された宿主生物は１）遺伝子ｄｈａ Ｂ１ 、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３及びｄｈａＴを含んでなる形質転換カセットで形 質転換されたサッカロミセス種で、その場合、それらの遺伝子はサッカロミセス 種ゲノム中に安定に組込まれる；及び２）遺伝子ＧＰＤ１及びＧＰＰ ２を含んでなる形質転換カセットで形質転換されたクレブシエラ種である。 本発明の好ましい炭素源はグルコースである。 本方法はさらに配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３に示されるアミ ノ酸配列に対応する遺伝子よりなる群から選択されるグリセロール−３−リン酸 デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子を用い、それらのアミノ酸配列はグリ セロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠 失または付加を包含する。また、本方法は配列番号３３及び配列番号１７に示さ れるアミノ酸配列に対応する遺伝子よりなる群から選択されるグリセロール−３ −ホスファターゼ酵素をコードする遺伝子も用い、それらのアミノ酸配列はグリ セロール−３−ホスファターゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または 付加を包含する。また、本方法は配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対応す るグリセロールキナーゼ酵素をコードする遺伝子も用い、そのアミノ酸配列はグ リセロールキナーゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含 する。また、本方法はｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２及びｄｈａＢ３を含んでなるデヒ ドラターゼ酵素をコードする遺伝子も用い、それらの遺伝子はそれぞれ配列番号 ３４、配列番号３５及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列に対応し、それら のアミノ酸配列はデヒドラターゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失また は付加を包含する。また、本方法は配列番号３７に示されるアミノ酸配列に対応 する１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ酵素をコードする遺伝子も 用い、そのアミノ酸配列は１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ酵素 の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包 含する。 また、本発明は （ａ）（１）配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロール− ３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子； （２）配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロール− ３−ホスファターゼ酵素をコードする遺伝子； （３）配列番号３４に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロールデ ヒドラターゼ酵素のαサブユニットをコードする遺伝子； （４）配列番号３５に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロールデ ヒドラターゼ酵素のβサブユニットをコードする遺伝子； （５）配列番号３６に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロールデ ヒドラターゼ酵素のγサブユニットをコードする遺伝子；及び （６）配列番号３７に示されるアミノ酸配列に対応する１，３−プロパ ンジオールオキシドレダクターゼ酵素をコードする遺伝子、を含んでなる遺伝子 の群、（ａ）（１）−（６）のそれぞれのアミノ酸配列は遺伝子（１）−（６） の酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する、並びに （ｂ）（ａ）の遺伝子の群で形質転換された宿主細胞で、それにより形質転換 された宿主細胞が単糖、オリゴ糖及び多糖よりなる群からまたは１炭素基質から 選択される少なくとも１つの基質で１，３−プロパンジオールを生産する、 を含んでなる形質転換された宿主細胞も包含する。 生物学的寄託及び配列表の簡単な説明 グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）及びグリ セロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）、グリセロールデヒド ラターゼ（ｄｈａＢ）並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ ）をコードする遺伝子を含有する（エシェリキア・コリ宿主Ｗ１４８５ 並びにプラスミドｐＤＴ２０及びｐＡＨ４２を含んでなる）形質転換されたエシ ェリキア・コリＷ２０４２を特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブ ダペスト条約の条件下でＡＴＣＣに１９９６年９月２６日に寄託し、そしてそれ をＡＴＣＣ ９８１８８と称する。 グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）及びグリセロール −３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）、グリセロールデヒドラターゼ （ｄｈａＢ）並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ ）をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＭＣＫ１０、ｐＭＣＫ１７、ｐＭ ＣＫ３０及びｐＭＣＫ３５を保有するサッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００ を特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条件下でＡ ＴＣＣに１９９６年９月２６日に寄託し、そしてそれをＡＴＣＣ ７４３９２と 称する。 「ＡＴＣＣ」は１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌ ｌｅ、ＭＤ ２０８５２ Ｕ．Ｓ．Ａ．に位置するＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ国際受託所をさす。名称は寄託したも のの受託番号をさす。 出願人等は特許出願におけるヌクレオチド及びアミノ酸配列の標準表示に関す る規則（ＯＪ ＥＰＯ、１２／１９９２への追補番号２中に公開された、ＥＰＯ の総裁の決定への付加条件Ｉ及びII）並びに３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１ ．８２５及び付録Ａ及びＢ（ヌクレオチド及び ／またはアミノ酸配列を含む出願開示のための条件）と適合する４９配列を提供 している。 発明の詳細な説明 本発明は単一の組み換え生物における発酵可能な炭素源からの１，３−プロパ ンジオールの生物学的生産方法を提供する。本方法はグリセロール−３−リン酸 デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）、グリセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐ ホスファターゼ）、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）及び１，３−プロ パンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子を含有する 微生物を含む。組み換え微生物を炭素基質と接触させ、そして１，３−プロパン ジオールを増殖培地から単離する。 本方法はポリエステル及び他のポリマーの製造に有用な１，３−プロパンジオ ールモノマーの迅速で安価で且つ環境的に信頼できる供給源を提供する。 以下の定義は請求及び明細書を説明するために用いられる。 「グリセロールデヒドラターゼ」または「デヒドラターゼ酵素」という用語は グリセロール分子を生成物の３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに異性化また は転化することができる酵素活性のポリペプチドをさす。本発明の目的のために は、デヒドラターゼ酵素はそれぞれグリセロール及び１，２−プロパンジオール という好ましい基質を有するグリセロールデヒドラターゼ（ジーンバンク（Ｇｅ ｎＢａｎｋ）Ｕ０９７７１、Ｕ３０９０３）及びジオールデヒドラターゼ（ジー ンバンク Ｄ４５０７１）を含む。クレブシエラ・ニューモニエＡＴＣＣ ２５９ ５５のグリセロールデヒドラターゼは配列番号１、２及び３としてそれぞれ同定 される遺伝子ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２及びｄｈａＢ３によりコードされる。ｄｈ ａＢ１ 、ｄｈａＢ２及びｄｈａＢ３遺伝子はそれぞれグリセロールデヒドラター ゼ酵素のα、β及びγサブユニットをコードする。 「オキシドレダクターゼ」または「１，３−プロパンジオールオキシドレダク ターゼ」という用語は、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの１，３−プロパ ンジオールへの還元を触媒することができる酵素活性のポリペプチドをさす。１ ，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼは例えば、ｄｈａＴ遺伝子（ジー ンバンクＵ０９７７１、Ｕ３０９０３）によりコードされるポリペプチドを含み 、それを列番号４として同定する。 「グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」または「Ｇ３ＰＤＨ」という 用語はジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）のグリセロール−３−リン酸（ Ｇ３Ｐ）への転化を触媒することができる酵素活性のポリペプチドをさす。イン ビボのＧ３ＰＤＨはＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨまたはＦＡＤ依存性である可能性があ る。この酵素活性の例は以下のものを含み：ＮＡＤＨ依存性酵素（ＥＣ １．１ ．１．８）はＧＰＤ１（ジーンバンク Ｚ７４０７１ｘ２）またはＧＰＤ２（ジ ーンバンク Ｚ３５１６９ｘ１）またはＧＰＤ３（ジーンバンク Ｇ９８４１８２ ）またはＤＡＲ１（ジーンバンク Ｚ７４０７１ｘ２）を初めとするいくつかの 遺伝子によりコードされ；ＮＡＤＰＨ依存性酵素（ＥＣ １．１．１．９４）はｇｐｓＡ （ジーンバンク Ｕ３２１６４、Ｇ４６６７４６（ｃｄｓ １９７９１１ −１９６８９２）及びＬ４５２４６）によりコードされ；そしてＦＡＤ依存性酵 素（ＥＣ １．１．９９．５）はＧＵＴ２（ジーンバンク Ｚ４７０４７ｘ２３） またはｇｌｐＤ（ジーンバンク Ｇ１ ４７８３８）またはｇｌｐＡＢＣ（ジーンバンク Ｍ２０９３８）によりコード される。 「グリセロール−３−ホスファターゼ」または「ｓｎ−グリセロール−３−ホ スファターゼ」または「ｄ，ｌ−グリセロールホスファターゼ」または「Ｇ３Ｐ ホスファターゼ」という用語は、グリセロール−３−リン酸のグリセロールへの 転化を触媒することができる酵素活性のポリペプチドをさす。Ｇ３Ｐホスファタ ーゼは例えばＧＰＰ１（ジーンバンク Ｚ４７０４７ｘ１２５）またはＧＰＰ２ （ジーンバンク Ｕ１８８１３ｘ１１）によりコードされるポリペプチドを含む 。 「グリセロールキナーゼ」という用語は、反応条件により、グリセロール−３ −リン酸へのグリセロールのまたはグリセロールへのグリセロール−３−リン酸 の転化を触媒することができる酵素活性のポリペプチドをさす。グリセロールキ ナーゼは例えばＧＵＴ１（ジーンバンク Ｕ１１５８３ｘ１９）によりコードさ れるポリペプチドを含む。 「ＧＰＤ１」、「ＤＡＲ１」、「ＯＳＧ１」、「Ｄ２８３０」及び「ＹＤＬ０ ２２Ｗ」という用語は互換的に用いられ、そして細胞質グリセロール−３−リン 酸デヒドロゲナーゼをコードし且つ配列番号５として示される塩基配列を特徴と する遺伝子をさす。 「ＧＰＤ２」という用語は細胞質グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ をコードし且つ配列番号６として示される塩基配列を特徴とする遺伝子をさす。 「ＧＵＴ２」及び「ＹＩＬ１５５Ｃ」という用語は互換的に用いられ、そして ミトコンドリアのグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードし且つ配 列番号７に示される塩基配列を特徴とする遺伝子をさす。 「ＧＰＰ１」、「ＲＨＲ２」及び「ＹＩＬ０５３Ｗ」という用語は互換的に用 いられ、そして細胞質グリセロール−３−ホスファターゼをコードし且つ配列番 号８に示される塩基配列を特徴とする遺伝子をさす。 「ＧＰＰ２」、「ＨＯＲ２」及び「ＹＥＲ０６２Ｃ」という用語は互換的に用 いられ、そして細胞質グリセロール−３−ホスファターゼをコードし且つ配列番 号９に示される塩基配列を特徴とする遺伝子をさす。 「ＧＵＴ１」という用語は細胞質グリセロールキナーゼをコードし且つ配列番 号１０として示される塩基配列を特徴とする遺伝子をさす。 「機能」または「酵素機能」という用語は特定の化学反応を実施するために必 要なエネルギーを変えることにおける酵素の触媒活性をさす。適当な条件下で生 成物または基質のいずれかの生成を成し遂げることができる平衡の反応にそのよ うな活性を適用することができると理解される。 「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は互換可能に用いられる。 「炭素基質」及び「炭素源」という用語は本発明の宿主生物が代謝することが できる炭素源、具体的には単糖、オリゴ糖、多糖及び１炭素基質またはそれらの 混合物よりなる群から選択される炭素源をさす。 「宿主細胞」または「宿主生物」という用語は外来または異種起源の遺伝子を 受け入れること及びそれらの遺伝子を発現して活性のある遺伝子産物を生産する ことができる微生物をさす。 「外来遺伝子」、「外来ＤＮＡ」、「異種起源の遺伝子」及び「異種起源のＤ ＮＡ」という用語は、様々な方法により宿主生物内に置かれたある生物に固有の 遺伝物質をさす。 「組み換え生物」及び「形質転換された宿主」という用語は異種起源または外 来遺伝子で形質転換されているあらゆる生物をさす。本発明の組み換え生物は適 当な炭素基質からの１，３−プロパンジオールの製造のためにグリセロール−３ −リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）及びグリセロール−３−ホスファター ゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）並びに １，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）をコードする外来 遺伝子を発現する。 「遺伝子」はコーディング領域の前（５’非コーディング）及び後（３’非コ ーディング）の調節配列を含む、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメント をさす。「天然」及び「野生型」という用語は遺伝子自体の調節配列と共に天然 に見いだされるような遺伝子をさす。 「コードする」及び「コーディング」という用語は、転写及び翻訳の機構を通 して遺伝子がアミノ酸配列を生成する方法をさす。特定のアミノ酸配列をコード する方法は、コードされるアミノ酸に変化を生じない塩基変異を含むことができ るか、または１個もしくはそれより多いアミノ酸を変える可能性があるが、ＤＮ Ａ配列によりコードされるタンパク質の機能特性に影響を及ぼさない塩基変異を 含むＤＮＡ配列を含有すると理解される。従って、本発明は特定の例示配列より 多くを包含すると理解される。また、得られるタンパク質分子の機能特性を実質 的に変えないサイレント変異を生じる配列中の欠失、挿入または置換のような配 列に対する改変も意図される。例えば、遺伝暗号の縮重を反映するかまたは与え られた部位で化学的に同等なアミノ酸の生成をもたらす遺伝子配列の改変が考え られる。従って、疎水性アミノ酸のアミノ酸アラニンのコドンをグリシンのよう な別のより疎水性が低い残基またはバリン、 ロイシンもしくはイソロイシンのようなより疎水的な残基をコードするコドンで 置換することができる。同様に、グルタミン酸の代わりのアスパラギン酸のよう な、ある負に荷電した残基の別のものでの置換またはアルギニの代わりのリシン のような、ある正に荷電した残基の別のものでの置換をもたらす変異も生物学的 に同等な生成物を生じると予想することができる。また、タンパク質分子のＮ末 端及びＣ末端部分の改変をもたらすヌクレオチド変異もタンパク質の活性を変え ないと予想される。ある場合には、実際、タンパク質の生物学的活性に対する改 変の影響を調べるために配列の突然変異体を作製することが望ましいことがある 。提示した改変の各々は、コードされる生成物の生物学的活性の保持の測定のよ うに、当該技術分野の日常技術の十分に範囲内である。さらに、本発明により包 含される配列が本明細書に例示される配列とストリンジェントな条件下（０．１ Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）でハイブリダイズするそれらの能力によ っても特定されることを当業者は理解する。 「発現」という用語は遺伝子産物の配列をコードする遺伝子からの遺伝子産物 への転写及び翻訳をさす。 「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」という用語は細胞の主要な代 謝の一部ではない遺伝子をしばしば保有し、そして通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子 の形態の染色体外成分をさす。そのような成分は適切な３’非翻訳配列と共にプ ロモーターフラグメント及び選択した遺伝子産物のＤＮＡ配列を細胞中に導入す ることができる独特な構築物に多数のヌクレオチド配列を連結または再結合して いる、あらゆる起源に由来する１本または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの線状ま たは環状の自律的 複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよい 。「形質転換カセット」は外来遺伝子を含有し且つ外来遺伝子に加えて特定の宿 主細胞の形質転換を容易にする成分を有する特定のベクターをさす。「発現カセ ット」は外来遺伝子を含有し且つ外来遺伝子に加えて外来宿主におけるその遺伝 子の高められた発現を可能にする成分を有する特定のベクターをさす。 「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は核酸の取込み後の細 胞における新しい遺伝子の取得をさす。取得される遺伝子を染色体ＤＮＡ中に組 込むかまたは染色体外複製配列として導入することができる。「形質転換体」と いう用語は形質転換の産物をさす。 「遺伝的に改変された」という用語は形質転換または突然変異により遺伝物質 を変える工程をさす。組み換え生物の構築： 炭素基質の１，３−プロパンジオールへの転化の酵素経路をコードする必要な 遺伝子を含有する組み換え生物を当該技術分野でよく知られている技術を用いて 構築することができる。本発明では、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナー ゼ（Ｇ３ＰＤＨ）、グリセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ ）、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）及び１，３−プロパンジオールオ キシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子をクレブシエラまたはサッ カロミセスのような天然の宿主から単離し、そしてエシェリキア・コリＤＨ５α 、ＥＣＬ７０７、ＡＡ２００もしくはＷ１４８５；サッカロミセス・セレビシエ 株ＹＰＨ５００；またはクレブシエラ・ニューモニエ株ＡＴＣＣ ２５９５５も しくはＥＣＬ２１０６のような宿主株を形質転換するために用い た。遺伝子の単離 バクテリアゲノムから所望する遺伝子を得る方法は一般的であり、分子生物学 の当該技術分野でよく知られている。例えば、遺伝子の配列が既知である場合、 制限エンドヌクレアーゼ消化により適当なゲノムライブラリーを作製することが でき、そして所望する遺伝子配列に相補的なプローブでスクリーニングすること ができる。いったん配列が単離されると、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｕ ．Ｓ．４，６８３，２０２）のような標準的なプライマーによる増幅方法を用い てＤＮＡを増幅して適切なベクターを用いた形質転換のために適当なＤＮＡの量 を得ることができる。 あるいはまた、コスミドライブラリーを作製することができ、その場合、ゲノ ムＤＮＡの大きいセグメント（３５−４５ｋｂ）をベクター中にパッケージング し、適切な宿主を形質転換するために用いることができる。コスミドベクターは 大量のＤＮＡを受け入れることができる点で独特である。通常、コスミドベクタ ーは少なくとも１コピーのｃｏｓＤＮＡ配列を有し、それはパッケージング及び それに続く外来ＤＮＡの環化のために必要である。ｃｏｓ配列に加えてこれらの ベクターはＣｏｌＥ１のような複製起点及びアンピシリンまたはネオマイシンに 耐性の遺伝子のような薬剤耐性マーカーも含有する。適当なバクテリア宿主の形 質転換のためにコスミドベクターを用いる方法はＳａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、第２ 版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ ａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）中に詳しく記述されている。 コスミドをクローン化するために典型的には、外来ＤＮＡを単離し、そして適 切な制限エンドヌクレアーゼを用いてコスミドベクターのｃｏｓ領域の近くに連 結する。次に、直鎖状にした外来ＤＮＡを含有するコスミドベクターをバクテリ オファージλのようなＤＮＡパッケージング媒体と反応させる。パッケージング 工程中にｃｏｓ部位は切断され、外来ＤＮＡはバクテリアウイルス粒子の頭部中 にパッケージングされる。次に、これらの粒子を用いてエシュリキア・コリのよ うな適当な宿主細胞をトランスフェクトする。いったん細胞中に注入されると、 外来ＤＮＡはｃｏｓ付着末端の影響で環化する。このようにして、外来ＤＮＡの 大きいセグメントを組み換え宿主細胞に導入し、発現させることができる。グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）及び１，３−プロパンジオールオキシ ドレダクターゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子の単離及びクローニング グリセロールを１，３−プロパンジオールに処理することができる遺伝子を保 有することが知られているバクテリアの属からゲノムＤＮＡの大きいセグメント をクローン化するために本発明の文脈内ではコスミドベクター及びコスミド形質 転換法を用いた。具体的には、クレブシエラ・ニューモニエＡＴＣＣ ２５９５ ５からのゲノムＤＮＡを当該技術分野でよく知られている方法により単離し、コ スミドベクターＳｕｐｅｒｃｏｓ １中への挿入のために制限酵素Ｓａｕ ３Ａで 消化し、そしてＧｉｇａｐａｃｋIIパッケージング抽出物を用いてパッケージン グした。ベクターの構築後にエシュリキア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲ細胞を コ スミドＤＮＡで形質転換した。グリセロールの存在下で細胞を生育し、そして１ ，３−プロパンジオール形成に関して培地を分析することにより、グリセロール を１，３−プロパンジオールに転化する能力に関して形質転換体をスクリーニン グした。 １，３−プロパンジオール陽性の形質転換体のうち２個を分析し、それらのコ スミドをｐＫＰ１及びｐＫＰ２と命名した。ＤＮＡシークエンシングによりシト ロバクター・フロインジイからのグリセロールデヒドラターゼ遺伝子（ｄｈａＢ ）に対する大きい相同性が示され、これらの形質転換体がグリセロールデヒドラ ターゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含有することを表した。他の１，３−プロパ ンジオール陽性の形質転換体を分析し、それらのコスミドをｐＫＰ４及びｐＫＰ ５と命名した。ＤＮＡシークエンシングによりこれらのコスミドがジオールデヒ ドラターゼ遺伝子をコードするＤＮＡを保有することが示された。 本発明はクレブシエラコスミド内から単離された遺伝子を利用するが、デヒド ラターゼ遺伝子の別の起源はシトロバクター、クロストリジウム及びサルモネラ を含み、しかしそれらに限定されない。Ｇ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子 本発明は宿主細胞におけるＧ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼ活性の発現の ために適当な遺伝子を提供する。 Ｇ３ＰＤＨをコードする遺伝子は知られている。例えば、ＧＰＤ１がサッカロ ミセスから単離されており、配列番号５で示される塩基配列を有し、配列番号１ １に示されるアミノ酸配列をコードする（Ｗａｎｇ等、上記）。同様に、配列番 号６に示される塩基配列を有し、配列番号１２に示されるアミノ酸配列をコード するＧＰＤ２によりコードされるＧ３ ＰＤＨ活性もサッカロミセスから単離されている（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ等、Ｍｏｌ ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ．１７、９５、（１９９５））。 Ｇ３ＰＤＨ活性のポリペプチドをコードするあらゆる遺伝子が本発明の目的の ために適当であり、その場合、その活性はジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡ Ｐ）のグリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への転化を触媒することができると 考えられる。さらに、遺伝子ＧＰＤ１、ＧＰＤ２、ＧＵＴ２、ｇｐｓＡ、ｇｌｐ Ｄ及びｇｌｐＡＢＣのαサブユニットにそれぞれ相当する配列番号１１、１２、 １３、１４、１５及び１６のいずれかにより示されるようなＧ３ＰＤＨのアミノ 酸配列をコードするあらゆる遺伝子が本発明において機能的であり、その場合、 そのアミノ酸配列は酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含 すると考えられる。他の起源から単離されたＧ３ＰＤＨをコードする遺伝子も本 発明における使用のために適当であることを当業者は認識する。例えば、原核生 物から単離された遺伝子はジーンバンク登録Ｍ３４３９３、Ｍ２０９３８、Ｌ０ ６２３１、Ｕ１２５６７、Ｌ４５２４６、Ｌ４５３２３、Ｌ４５３２４、Ｌ４５ ３２５、Ｕ３２１６４及びＵ３９６８２を含み；真菌から単離された遺伝子はジ ーンバンク登録Ｕ３０６２５、Ｕ３０８７６及びＸ５６１６２を含み；昆虫から 単離された遺伝子はジーンバンク登録Ｘ６１２２３及びＸ１４１７９を含み；そ して哺乳類起源から単離された遺伝子はジーンバンク登録Ｕ１２４２４、Ｍ２５ ５５８及びＸ７８５９３を含む。 Ｇ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子は知られている。例えば、ＧＰＰ２ がサッカロミセス・セレビシエから単離されており、配列番号９で示される塩基 配列を有し、それは配列番号１７に示されるアミノ酸 配列をコードする（Ｎｏｒｂｅｃｋ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、ｐ１ ３８７５、１９９６）。， Ｇ３Ｐホスファターゼ活性をコードするあらゆる遺伝子が本発明の目的のた めに適当であり、その場合、その活性はグリセロール−３−リン酸のグリセロー ルへの転化を触媒することができると考えられる。さらに、配列番号３３及び１ ７により示されるようなＧ３Ｐホスファターゼのアミノ酸配列をコードするあら ゆる遺伝子が本発明において機能的であり、その場合、そのアミノ酸配列は酵素 の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含すると考えられる。他の 起源から単離されたＧ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子も本発明における 使用のために適当であることを当業者は認識する。例えば、グリセロールを生じ るためのグリセロール−３−リン酸の脱リン酸を１つまたはそれより多い以下の 一般的または特異的ホスファターゼで実施することができる：アルカリホスファ ターゼ（ＥＣ ３．１．３．１）［ジーンバンク Ｍ１９１５９、Ｍ２９６６３、 Ｕ０２５５０もしくはＭ３３９６５］；酸性ホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３ ．２）［ジーンバンク Ｕ５１２１０、Ｕ１９７８９、Ｕ２８６５８もしくはＬ ２０５６６］；グリセロール−３−ホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．−）［ ジーンバンク Ｚ３８０６０もしくはＵ１８８１３ｘ１１］；グルコース−１− ホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１０）［ジーンバンク Ｍ３３８０７］；グ ルコース−６−ホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．９）［ジーンバンク Ｕ００ ４４５］；フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１ １）［ジーンバンク Ｘ１２５４５もしくはＪ０３２０７］またはホスファチジ ルグリセロリン酸ホスファターゼ（ＥＣ ３．１． ３．２７）［ジーンバンクＭ ２３５４６及びＭ２３６２８］。 グリセロールキナーゼをコードする遺伝子は知られている。例えば、サッカロ ミセスからのグリセロールキナーゼをコードするＧＵＴ１が単離され、シークエ ンスされており（Ｐａｖｌｉｋ等、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２４、２１、（１９ ９３））、そしてその塩基配列は配列番号１０により示され、それは配列番号１ ８に示されるアミノ酸配列をコードする。グリセロールキナーゼは現実にはグリ セロールの分解を触媒するが、同じ酵素が適切な反応エネルギー条件下でグリセ ロール−３−リン酸をグリセロールに転化するようにグリセロールの合成におい て機能できることを当業者は認識する。グリセロールキナーゼによるグリセロー ル生成の証拠が存在する。嫌気的または呼吸阻害条件下で、トリパノソーマ・ブ ルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）はグリセロール−３−Ｐ及び ＡＤＰの存在下でグリセロールを生産する。その反応はグリコソームコンパート メント中で起こる(Ｄ．Ｈａｍｍｏｎｄ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０、１ ５６４６−１５６５４、(１９８５))。宿主細胞 Ｇ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼの発現によるグリセロールの組み換え生 産のために適当な宿主細胞は原核生物または真核生物のいずれであってもよく、 そして活性のある酵素を発現するそれらの能力によってのみ限定される。好まし い宿主はシトロバクター、エンテロバクター、クロストリジウム、クレブシエラ 、エロバクター、ラクトバシラス、アスペルギルス、サッカロミセス、シゾサッ カロミセス、ザイゴサッカロミセス、ピチア、クルイベロミセル、カンジダ、ハ ンセヌラ、デバリオミセス、ムコール、トルロプシス、メチロバクター、エシェ リキア、サ ルモネラ、バシラス、ストレプトミセス及びシュードモナスのようなグリセロー ルまたは１，３−プロパンジオールの生産のために典型的に有用なものである。 本発明において最も好ましいものはエシェリキア・コリ、クレブシエラ種及びサ ッカロミセス種である。 アデノシル−コバラミン（補酵素Ｂ₁₂）はグリセロールデヒドラターゼ活性の ために必須の補因子である。この補酵素は知られている最も複雑な非ポリマー天 然物であり、そのインビボでの合成は約３０の遺伝子の産物を用いて導かれる。 補酵素Ｂ₁₂の合成は原核生物において見いだされ、それらのあるものはその化合 物をデノボで合成することができ、一方、あるものは部分反応を実施することが できる。 例えば、エシェリキア・コリはコリン環構造を作ることができないが、コビナ ミドのコリノイドへの転化を触媒することができ、そして５’−デオキシアデノ シル基を導入することができる。 真核生物は補酵素Ｂ₁₂をデノボで合成することができず、代わりに細胞外環境 からビタミンＢ₁₂を輸送し、続いて、細胞の酵素によりその化合物をその化合物 の機能形態に転化する。この一連の反応に対して３つの酵素活性が記述されてい る。 １）アクアコバラミンレダクターゼ（ＥＣ １．６．９９．８）はＣｏ（III）を Ｃｏ（II）に還元し； ２）コブ（II）アラミン（ｃｏｂ（II）ａｌａｍｉｎ）レダクターゼ（ＥＣ １ ．６．９９．９）はＣｏ（II）をＣｏ（Ｉ）に還元し；そして ３）コブ（Ｉ）アラミン（ｃｏｂ（Ｉ）ａｌａｍｉｎ）アデノシルトランスフェ ラーゼ（ＥＣ ２．５．１．１７）はＡＴＰから５’デオキシアデノシン部分を 還元されたコリノイドに移す。この最後の酵素活性は それら３つのうちで最も特性化されており、サルモネラ・チフィムリウム(Ｓ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ）ではｃｏｂＡ、エシェリキア・コリではｂｔｕＲ、そ してシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ） ではｃｏｂＯによりコードされる。これら３個のコブ（Ｉ）アラミンアデノシル トランスフェラーゼ遺伝子はクローン化され、シークエンスされている。コブ（ Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ活性はヒト繊維芽細胞及び単離され たラットミトコンドリアで検出されている（Ｆｅｎｔｏｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ ．９８、２８３−９、（１９８１））。 コバルト還元に関与する２つの酵素は十分に特性化されておらず、遺伝子配列は 利用できない。ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ） からのアクアコバラミンレダクターゼの報告があり（Ｗａｔａｎａｂｅ等、Ａｒ ｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ ．３０５、４２１−７、（１９９３）） 、そしてミクロソームのコブ（III）アラミンレダクターゼはラット繊維芽細胞 からのミクロソーム及びミトコンドリアの内膜画分に存在する（Ｐｅｚａｃｋａ 、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１１５７、１６７−７７、（１ ９９３））。 ビタミンＢ₁₂を培養培地に補足することは、多くの微生物でグリセロールデヒ ドラターゼ活性のために補酵素Ｂ₁₂を生産する必要性を満たすことができるが、 ある場合には、さらなる触媒活性をインビボで添加または増加しなければならな い可能性がある。真核生物における補酵素Ｂ₁₂の高められた合成は特に望ましい 可能性がある。コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼをコードする 遺伝子の公開された配列を与えられれば、この遺伝子のクローニング及び発現を 当業者は成し遂げ ることができる。例えば、グルコースのような炭素基質の１，３−プロパンジオ ールへの転化をもたらすために必要な遺伝子に加えてコブ（Ｉ）アラミンアデノ シルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含有するようにサッカロミセスの ような酵母を構築することができると考えられる。コバルト還元のための遺伝子 のクローニング及び発現は異なる方法を必要とする。これは唯一のＮ₂源として のエタノールアミンでの生育に関するエシェリキア・コリにおける選択に基づく ことができる。補酵素Ｂ₁₂の存在下でエタノールアミンアンモニア−リアーゼに より他のＮ₂源の非存在下で細胞は生育できる。エシェリキア・コリ細胞がコブ （Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼのクローン化された遺伝子及び別 の生物からの無作為にクローン化されたＤＮＡを含有する場合、アクアコバラミ ンの存在下でのエタノールアミンでの生育は高められるはずであり、そして無作 為にクローン化されたＤＮＡがアクアコバラミンのアデノシル化を促進するコバ ルト還元特性をコードするかどうかに関して選択されるはずである。 エシェリキア・コリ及びサッカロミセスに加えて、クレブシエラは特に好まし い宿主である。クレブシエラ・ニューモニエの株は唯一の炭素としてグリセロー ルで生育すると１，３−プロパンジオールを生産することが知られている。単糖 、オリゴ糖、多糖または１炭素基質から１，３−プロパンジオールを生産するよ うにクレブシエラを遺伝的に改変することができると考えられる。 そのような株を作製するためには、１つまたはそれより多い構成的または誘導 性プロモーターの転写制御下で、ジヒドロキシアセトンリン酸のグリセロールへ の転化及びグリセロールの１，３−プロパンジオール への転化を促進する遺伝子を別々または一緒にクレブシエラ宿主に与えることが 都合よい。グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ及びグリセロール−３− ホスファターゼをそれぞれコードするＤＡＲ１及びＧＰＰ２遺伝子の導入により 、クレブシエラは適切な炭素基質から１，３−プロパンジオールを生産するため の遺伝子装置が与えられる。 それらの遺伝子（例えば、Ｇ３ＰＤＨ、Ｇ３Ｐホスファターゼ、ｄｈａＢ及び ／またはｄｈａＴ）をクレブシエラ・ニューモニエにおいて複製することができ るあらゆるプラスミドベクターで導入してもよく、またはそれらをクレブシエラ ・ニューモニエゲノム中に組込んでもよい。例えば、クレブシエラ・ニューモニ エＡＴＣＣ ２５９５５及びクレブシエラ・ニューモニエＥＣＬ ２１０６はテト ラサイクリンまたはクロラムフェニコールに感受性であることが知られており； 従って、クレブシエラ・ニューモニエにおいて複製すること及びこれらの抗生物 質のいずれかまたは両方に対する耐性をコードすることの両方ができるプラスミ ドベクターを用いてこれらの遺伝子をクレブシエラ・ニューモニエ中に導入する ことができる。目的の遺伝子でクレブシエラを形質転換する方法は一般的であり 、当該技術分野においてよく知られており、そして適切なベクター及び発現技術 を初めとする適当なプロトコルをＳａｍｂｒｏｏｋ、上記中に見いだすことがで きる。ベクター及び発現カセット 本発明は適当な宿主細胞へのＧ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼのクローニ ング、形質転換及び発現のために適当な様々なベクター及び形質転換及び発現カ セットを提供する。適当なベクターは用いるバクテリアと適合するものである。 適当なベクターは例えばバクテリア、（バク テリオファージＴ７もしくはＭ−１３由来のファージのような）ウイルス、コス ミド、酵母または植物から得ることができる。そのようなベクターを獲得及び使 用するためのプロトコルは当業者に知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ−１ 、２、３巻（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、（１９８９））。 典型的に、ベクターまたはカセットは関係のある遺伝子の転写及び翻訳を導く 配列、選択マーカー及び自律的複製または染色体組込みをさせる配列を含有する 。適当なベクターは転写開始制御を保有する遺伝子の５’の領域及び転写の終結 を制御するＤＮＡフラグメントの３’の領域を含んでなる。そのような制御領域 は生産宿主として選択された特定の種に固有の遺伝子に由来する必要はないと理 解されるが、両方の制御領域が形質転換される宿主細胞に相同な遺伝子から得ら れる場合が最も好ましい。 所望する宿主細胞においてＧ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼ遺伝子の発現 を導くために有用な開始制御領域またはプロモーターは非常に多く、そして当業 者によく知られている。（サッカロミセスにおける発現のために有用な）ＣＹＣ １、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤ Ｈ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰ１；（ピチアにお ける発現のために有用な）ＡＯＸ１；並びに（エシェリキア・コリにおける発現 のために有用な）ｌａｃ、ｔｒｐ、λＰ_L、λＰ_R、Ｔ７、ｔａｃ及びｔｒｃを初 めとするがそれらに限定されない、これらの遺伝子を導くことができる実質的に あ らゆるプロモーターが本発明のために適当である。 終結制御領域も好ましい宿主に固有の各種遺伝子から得ることができる。場合 により、終結部位が必要ない可能性があるが、しかしながら、含まれる場合が最 も好ましい。 本発明の酵素の有効な発現のために、発現が適切なメッセンジャーＲＮＡの形 成をもたらすように、酵素をコードするＤＮＡを選択した発現制御領域に開始コ ドンを通して機能的に連結する。１，３−プロパンジオールの生産のための適当な宿主の形質転換及び遺伝子の発 現 いったん適当なカセットが構築されると、それらを用いて適切な宿主細胞を形 質転換する。グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）及びグ リセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）、グリセロールデヒ ドラターゼ（ｄｈａＢ）並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ （ｄｈａＴ）をコードする遺伝子を含有するカセットを別々または一緒に宿主細 胞中に導入することを（例えば、カルシウム−透過性細胞、エレクトロポレーシ ョンを用いる）形質転換によるかまたは組み換えファージウイルスを用いるトラ ンスフェクションによるような既知の方法により成し遂げることができる（Ｓａ ｍｂｒｏｏｋ等、上記）。 本発明では、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）及び グリセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）、グリセロールデ ヒドラターゼ（ｄｈａＢ）並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクター ゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子を含有するエシェリキア・コリＷ２０４２（ ＡＴＣＣ ９８１８８）を作製した。 さらに、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）及びグリセ ロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）、グリセロールデヒドラ ターゼ（ｄｈａＢ）並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄ ｈａＴ ）をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＭＣＫ１０、ｐＭＣＫ１７ 、ｐＭＣＫ３０及びｐＭＣＫ３５を保有するサッカロミセス・セレビシエＹＰＨ ５００（ＡＴＣＣ ７４３９２）を構築した。上記の形質転換されたエシェリキ ア・コリ及びサッカロミセスは両方とも本発明の好ましい態様を表す。培地及び炭素基質： 本発明の発酵培地は適当な炭素基質を含まなければならない。適当な基質はグ ルコース及びフルクトースのような単糖、ラクトースもしくはショ糖のようなオ リゴ糖、澱粉もしくはセルロースのような多糖またはそれらの混合物、並びにチ ーズ乳清透過物、トウモロコシ浸し液（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ）、 テンサイ糖蜜及びオオムギモルトのような継続できる供給原料からの未精製混合 物を含むことができるがそれらに限定されない。さらに、炭素基質は重要な生化 学中間体への代謝転化が示されている二酸化炭素またはメタノールのような１炭 素基質であってもよい。 単一の炭素源（例えば、メタノール、ホルムアルデヒドまたはホルメート）か らのグリセロール生産はメチル栄養（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母（Ｙ ａｍａｄａ等、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３（２）５４１−５４３、 （１９８９））及びバクテリア（Ｈｕｎｔｅｒ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ２４、４１４８−４１５５、（１９８５））で報告されている。これらの生物は メタンからホルメートまで の酸化状態である単一の炭素化合物を同化してグリセロールを生産することがで きる。炭素同化の経路はリブロース１リン酸、セリンまたはキシルロース−１リ ン酸を通してであってもよい（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｍ ｅｔａｂｏｌｉｓｍ 、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏ ｒｋ（１９８６））。リブロース１リン酸経路はホルメートをリブロース−５− リン酸と縮合して６炭素糖を形成し、それがフルクトースそして最終的に３炭素 生成物のグリセルアルデヒド−３−リン酸になることを含む。同様に、セリン経 路は１炭素化合物をメチレンテトラヒドロ葉酸塩を経て解糖系に同化する。 １及び２炭素基質の利用に加えて、メチル栄養生物は代謝活動のためにメチル アミン、グルコサミン及び各種アミノ酸のような多数の他の炭素含有化合物も利 用することが知られている。例えば、メチル栄養酵母はトレハロースまたはグリ セロールを形成するためにメチルアミンからの炭素を利用することが知られてい る（Ｂｅｌｌｉｏｎ等、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｄ．、［ 国際シンポジウム］、第７回（１９９３）、４１５−３２．編集者：Ｍｕｒｒｅ ｌｌ、Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ、Ｄｏｎ Ｐ．出版社：Ｉｎｔｅｒｃｅｐ ｔ、Ａｎｄｏｖｅｒ、ＵＫ）。同様に、カンジダの様々な種はアラニンまたはオ レイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ等、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３ （５）。４８５−９（１９９０））。従って、本発明に利用する炭素源は多種多 様な炭素含有基質を包含することができ、そして宿主生物の条件によってのみ限 定される。 上記の炭素基質及びそれらの混合物の全てが本発明に適していると考えられる が、好ましい炭素基質は単糖、オリゴ糖、多糖及び１炭素基質 である。より好ましいものはグルコース、フルクトース、ショ糖のような糖類並 びにメタノール及び二酸化炭素のような単一炭素基質である。 最も好ましいものはグルコースである。 適切な炭素源に加えて、発酵培地は培養物の増殖及びグリセロール生成のため に必要な酵素経路の促進のために適当な、当業者に知られている適当な鉱物、塩 、補因子、バッファー及び他の成分を含まなければならない。Ｃｏ（II）塩及び ／またはビタミンＢ₁₂またはその前駆物質に特に注意を払う。培養条件 ： 典型的には、細胞を適切な培地中３０℃で増殖させる。本発明における好まし い増殖培地はルリア・ベルタニ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ））（ＬＢ）培地 、サブロー・デキストロース（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ Ｄｅｘｔｏｒｏｓｅ）（Ｓ Ｄ）培地または酵母麦芽エキス（Ｙｅａｓｔ Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ）（Ｙ Ｍ）培地のような一般の商業的に調製される培地である。他の特定または合成の 増殖培地を用いてもよく、特定の微生物の増殖のために適切な培地は微生物学ま たは発酵科学の当業者により知られている。また、カタボライト抑制を直接的ま たは間接的に調節することが知られている薬剤、例えば、サイクリックアデノシ ン２’：３’−１リン酸またはサイクリックアデノシン２’：５’−１リン酸の 使用を反応培地中に含んでもよい。同様に、グリセロール生成の増大を導く酵素 活性を調節することが知られている薬剤（例えば、亜硫酸塩、重亜硫酸塩及びア ルカリ）の使用を遺伝子操作と共にまたはその代わりとして用いることができる 。 発酵のために適当なｐＨの範囲はｐＨ５．０ないしｐＨ９．０の間 であり、その場合、ｐＨ６．０ないしｐＨ８．０が初期条件の範囲として好まし い。 好気的または嫌気的条件下で反応を実施することができ、その場合、嫌気的ま たは微好気的条件が好ましい。バッチ及び連続発酵 ： 本発明の方法は発酵のバッチ法を用いる。古典的なバッチ発酵は密閉系であり 、その場合、培地の組成は発酵の開始時に設定され、そして発酵中に人為的改変 を受けない。従って、発酵の開始時に適切な生物または複数の生物を培地に接種 し、そして系に何も添加せずに発酵を起こすことができる。しかしながら、典型 的には、バッチ発酵は炭素源の添加に関して「バッチ」であり、ｐＨ及び酸素濃 度のような因子を制御する試みがしばしばなされる。バッチ系の代謝産物及びバ イオマス組成は発酵を停止する時まで絶えず変化する。バッチ内で細胞は静止状 態の誘導期を経て高増殖の対数期に、そして最終的に増殖速度が減少するかまた は止まる定常期になる。処理されない場合、定常期の細胞は結局死ぬ。通常、対 数期の細胞が最終生成物または中間体の生成の大部分を生じる。 標準的なバッチ系に対する変形はＦｅｄ−バッチ発酵系であり、それも本発明 に適当である。典型的なバッチ系のこの変形では、発酵が進むにつれて基質を増 加して添加する。Ｆｅｄ−バッチ系はカタボライト抑制が細胞の代謝を抑制しが ちである場合及び培地中に制限された量の基質があることが望ましい場合に有用 である。Ｆｅｄ−バッチ系における実際の基質濃度の測定は困難であり、それ故 、ｐＨ、溶存酸素及びＣＯ₂のような廃ガスの分圧のような測定可能な因子の変 化に基づいて概算する。バッチ及びＦｅｄ−バッチ発酵は一般的であり、当該技 術分野で よく知られており、Ｂｒｏｃｋ、上記中に実施例を見いだすことができる。 また、本方法が連続発酵法に適応できることも考えられる。連続発酵は開放系 であり、その場合、特定の発酵培地が連続的にバイオリアクターに添加され、同 時に等量のならし培地が処理のために取り出される。通常、連続発酵は培養物を 一定の高密度で維持し、その場合、細胞は主として対数期増殖である。 連続発酵は細胞増殖または最終生成物濃度に影響を及ぼす１つの因子またはあ らゆる数の因子を調節することができる。例えば、ある方法では炭素源または窒 素レベルのような制限的栄養物質を固定した割合で維持し、そして全ての他のパ ラメーターを調節することができる。他の系では、培地濁度により測定される細 胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多数の因子を連続的に変えるこ とができる。連続系は定常状態増殖条件を維持するように努め、従って、取り出 される培地による細胞損失を発酵における細胞増殖速度で埋め合わせなければな らない。連続発酵法の栄養物質及び増殖因子を調節する方法並びに生成物形成の 割合を最大にする技術は工業微生物学の当該技術分野でよく知られており、様々 な方法がＢｒｏｃｋ、上記により詳細に記述されている。 バッチ、ｆｅｄ−バッチまたは連続法のいずれかを用いて本発明を実施するこ とができ、発酵のそのあらゆる既知の形態が適当である。さらに、細胞を全細胞 触媒として基質上に固定し、１，３−プロパンジオール生成の発酵条件に供する ことができると考えられる。１，３−プロパンジオール生成の代替経路 ： 代表的な酵素経路 グルコースからの１，３−プロパンジオールの生成を以下の一連の工程により 成し遂げることができる。この一連のものは当業者に知られている多数の経路の 代表である。グルコースは解糖系の酵素により一連の工程でジヒドロキシアセト ンリン酸（ＤＨＡＰ）及び３−ホスホグリセルアルデヒド（３−ＰＧ）に転化さ れる。次に、ＤＨＡＰのジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）への加水分解及びそれ に続く還元、またはＤＨＡＰのグリセロール３リン酸（Ｇ３Ｐ）への還元及びそ れに続く加水分解のいずれかによりグリセロールが形成される。基質に関して特 異的または非特異的であることが知られているあらゆる数の細胞性ホスファター ゼにより加水分解工程を触媒することができ、またはその活性を組み換えにより 宿主中に導入することができる。ＮＡＤ⁺（またはＮＡＤＰ⁺）結合宿主酵素によ り還元工程を触媒することができ、またはその活性を組み換えにより宿主中に導 入することができる。ｄｈａレギュロンが式３の可逆反応を触媒するグリセロー ルデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）を含有することは重要である。 グリセロール→３−ＨＰ＋Ｈ₂Ｏ （式１） ３−ＨＰ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺→１，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ⁺（式２） グリセロール＋ＮＡＤ⁺→ＤＨＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺ （式３） 上に詳細に記述されているようにグリセロールは中間体の３−ヒドロキシープロ ピオンアルデヒド（３−ＨＰ）を経て１，３−プロパンジオールに転化される。 中間体の３−ＨＰは宿主によりコードすることができるかまたは組み換えにより 宿主中に導入することができるデヒドラターゼ酵素によりグリセロールから生成 される（式１）。このデヒドラターゼはグリセロールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ． ４．２．１．３０）、ジオ ールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）またはこの転化を触媒するこ とができるあらゆる他の酵素であってもよい。グリセロールデヒドラターゼはｄ ｈａ レギュロンによりコードされるが、ジオールデヒドラターゼはそうではない 。１，３−プロパンジオールはＮＡＤ⁺（もしくはＮＡＤＰ⁺）結合宿主酵素によ り３−ＨＰから生成され（式２）、またはその活性を組み換えにより宿主中に導 入することができる。１，３−プロパンジオールの生成のこの最終反応を１，３ −プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２０２）または他 のアルコールデヒドロゲナーゼにより触媒することができる。炭素チャネリング（ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ）に影響を及ぼす突然変異及び形質転 換 １，３−プロパンジオール生産経路中に変異を含んでなる様々な突然変異体生 物は本発明に有用である。微生物へのトリオースリン酸イソメラーゼ突然変異（ｔｐｉ −）の導入は炭素チャネリングによる効率を上げるための突然変異の使用 の例である。あるいはまた、エタノール（ａｄｈ）またはラクテート（ｌｄｈ） の生成を減少する突然変異は１，３−プロパンジオールの生産に対するＮＡＤＨ の利用性を増す。ホスホグリセリン酸ムターゼ（ｐｇｍ）のようなグリセルアル デヒド−３−リン酸の後の解糖の工程のさらなる突然変異は１，３−プロパンジ オール生産経路への炭素の流れを増すために有用である。ＰＥＰの損失を防ぐＰ ＴＳのようなグルコース輸送をもたらす突然変異も有用となる可能性がある。ま た、グリセロール異化経路（ｇｌｐ）のような１，３−プロパンジオール生産経 路の中間体の代替経路を妨げる突然変異も本発明に有用である。突然変異は酵素 活性の活性を弱めるかもしくは上げるように 構造遺伝子に対してでもよく、または酵素活性の発現レベルを調節するように調 節遺伝子に対してでもよい。 あるいはまた、１，３−プロパンジオール生産の増大のために特定の酵素活性 を制御するように形質転換と突然変異を組み合わせることができる。従って、１ ，３−プロパンジオールの増加した生産をもたらす全細胞触媒の改変を予想する ことは本発明の範囲内である。１，３−プロパンジオールの同定及び精製 ： 発酵培地からの１，３−プロパンジオールの精製法法は当該技術分野で知られ ている。例えば、反応混合物を有機溶媒での抽出、蒸留及びカラムクロマトグラ フィーに供することにより細胞培地からプロパンジオールを得ることができる（ Ｕ．Ｓ．５，３５６，８１２）。この方法のための特に優れた有機溶媒はシクロ ヘキサンである（Ｕ．Ｓ．５，００８，４７３）。 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に培地を供することにより直接 １，３−プロパンジオールを同定することができる。本発明に好ましいものはア イソクラチックで０．０１Ｎ硫酸の移動相を用いて分析イオン交換カラムで発酵 培地を分析する方法である。Ｇ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼの同定及び精製 ： タンパク質Ｇ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼの発現のレベルを酵素アッセ イにより測定し、Ｇ３ＰＤＨ活性アッセイはＧ−３−ＰへのＤＨＡＰ転化におけ る補助基質のＮＡＤＨの分光特性による。ＮＡＤＨは固有のＵＶ／可視吸収を有 し、その消費を３４０ｎｍで分光光度計で調べることができる。反応で遊離され る無機リン酸塩を測定するあらゆる方法によりＧ３Ｐホスファターゼ活性を測定 することができる。最も一 般的に用いられる検出方法は青色に着色したリンモリブデン酸アンモニウム錯体 の可視分光測定を用いた。 実施例 一般法 リン酸化、ライゲーション及び形質転換の方法は当該技術分野でよく知られて いる。以下の実施例における使用のために適した技術をＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ． 等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ ｕａｌ 、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）中 に見いだすことができる。 バクテリア培養物の維持及び増殖のために適した材料及び方法は当該技術分野 でよく知られてい得る。以下の実施例における使用のために適した技術をＭａｎ ｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ｏｇｙ （Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒ ａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌ ｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｅｉｇ及びＧ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉ ｌｌｉｐｓ、編集、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９９４））中またはＴｈｏｍ ａｓ Ｄ．ＢｒｏｃｋによるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏ ｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 、第２版、Ｓｉｎ ａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ（１ ９８９）中に記述されたように見いだすことができる。他に記載しないかぎり、 バクテリア細胞の増殖及び維持のため に用いた全ての試薬及び材料をＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗ ａｕｋｅｅ、ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ 、ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）またはＳｉ ｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購 入した。 略語の意味は以下のとおりであり：「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を 意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｍＬ」はミリリット ルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味する。酵素アッセイ 無細胞抽出物中のグリセロールデヒドラターゼ活性を１，２−プロパンジオー ルを基質として用いて測定した。メチルベンゾ−２−チアゾロンヒドラゾンとア ルデヒドの反応に基づくそのアッセイはＦｏｒａｇｅ及びＦｏｓｔｅｒ（Ｂｉｏ ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ 、５６９、２４９（１９７９））により記 述されている。同様に記述されているように、１，３−プロパンジオールデヒド ロゲナーゼとも呼ばれれ１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼの活性 を１，３−プロパンジオール及びＮＡＤ⁺を基質として用いて溶液中またはスラ ブゲル中で測定した。Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＬｉｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、 １６９、２０５０（１９８７）。記述されているように（Ｒ．Ｍ．Ｂｅｌｌ及び Ｊ．Ｅ．Ｃｒｏｎａｎ、Ｊｒ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０；７１５３− ８（１９７５））、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消失により、ＮＡＤＨまたはＮ ＡＤＰＨ依存性グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）活性を 分光光度計で測定した。グリセロール−３−ホスファターゼ、ＧＰＰのアッセイ ビス−ＴｒｉｓまたはＭＥＳ及びマグネシウムバッファー、ｐＨ６．５中で抽 出物を有機リン酸エステル基質とインキュベートすることにより酵素活性のアッ セイを実施した。用いた基質は１−α−グリセロールリン酸；ｄ，ｌ−α−グリ セロールリン酸であった。アッセイにおける試薬の最終濃度は：バッファー（２ ０ｍＭビス−Ｔｒｉｓまたは５０ｍＭ ＭＥＳ）：ＭｇＣｌ₂（１０ｍＭ）；及び 基質（２０ｍＭ）である。 サンプル中の全タンパク質が少なく、酸クエンチで目に見える沈殿が生じない場 合、サンプルをキュベット中で都合よくアッセイした。この方法は２０ｍＭの基 質（５０μＬ、２００ｍＭ）、５０ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、ｐＨ６ ．５バッファーを含有するキュベット中で酵素サンプルをインキュベートするこ とを含んだ。最終ホスファターゼアッセイ容量は０．５ｍＬであった。酵素を含 有するサンプルを反応混合物に添加し；キュベットの中身を混合し、次に、キュ ベットをＴ＝３７℃で循環する水浴中に酵素サンプル中のホスファターゼ活性が ２から０．０２Ｕ／ｍＬまでの範囲であるかどうかにより５ないし１２０分間置 いた。酸性モリブデン酸塩試薬（０．４ｍＬ）の添加により酵素反応をクエンチ した。Ｆｉｓｋｅ ＳｕｂｂａＲｏｗ試薬（０．１ｍＬ）及び蒸留水（１．５ｍ Ｌ）を添加した後、溶液を混合し、発色させた。１０分後にサンプルの吸光度を Ｃａｒｙ ２１９ ＵＶ／可視分光光度計を用いて６６０ｎｍで読み取った。スト ック無機リン酸塩溶液（０．６５ｍＭ）を用いて０．０２６から０．１３０μｍ ｏｌ／ｍＬまでの範囲の最終無機リン酸塩濃度を有する６個の標準液を調製する ことにより作成した標準曲線に遊離された無機リン酸塩の量を比較した。１，３−プロパンジオールの単離及び同定 １，３−プロパンジオールへのグリセロールの転化をＨＰＬＣにより調べた。 クロマトグラフィーの当業者が利用できる標準技術及び材料を用いて分析を実施 した。一つの適当な方法はＵＶ（２１０ｎｍ）及びＲＩ検出を用いてＷａｔｅｒ ｓ Ｍａｘｉｍａ ８２０ ＨＰＬＣシステムを利用した。０．５ｍＬ／分の流 速で０．０１Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄を移動相として用いて、５０℃に温度温度された、Ｓ ｈｏｄｅｘ ＳＨ−１０１１Ｐプレカラム（６ｍｍｘ５０ｍｍ）を備えたＳｈｏ ｄｅｘ ＳＨ−１０１１カラム（８ｍｍｘ３００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆ ｏｒｄ、ＭＡから購入した）にサンプルを注入した。定量分析が所望される場合 には、外部標準として既知量のトリメチル酢酸を用いてサンプルを調製した。典 型的に、グリセロール（ＲＩ検出）、１，３−プロパンジオール（ＲＩ検出）及 びトリメチル酢酸（ＵＶ及びＲＩ検出）の保持時間はそれぞれ２０．６７分、２ ６．０８分及び３５．０３分であった。 １，３−プロパンジオールの生成をＧＣ／ＭＳにより確かめた。ＧＣ／ＭＳの 当業者が利用できる標準技術及び材料を用いて分析を実施した。一つの適当な方 法はＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ５９７１シリーズ質量選択的検出器及び ＨＰ−ＩＮＮＯＷａｘカラム（３０ｍの長さ、０．２５ｍｍのｉ．ｄ．、０．２ ５ミクロンフィルムの厚さ）に連結されたＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ５ ８９０シリーズIIガスクロマトグラフを利用した。生成された１，３−プロパン ジオールの保持時間及び質量スペクトルを真の１，３−プロパンジオール（ｍ／ ｅ：５７、５８）のものに比較した。 ＧＣ／ＭＳの代わりの方法はサンプルの誘導化を含んだ。１．０ｍＬのサンプ ル（例えば、培養上清）に３０μＬの濃（７０％ｖ／ｖ）過 塩素酸を添加した。混合した後、サンプルを冷凍し、凍結乾燥した。ビス（トリ メチルシリル）トリフルオロアセトアミド：ピリジンの１：１混合物（３００μ Ｌ）を凍結乾燥物質に添加し、強く混合し、６５℃で１時間置いた。遠心分離に よりサンプルから不溶物を除いた。得られた液体は２相に分配し、上層を分析に 用いた。サンプルをＤＢ−５カラム（４８ｍ、０．２５ｍｍＩ．Ｄ．、０．２５ μｍフィルムの厚さ；Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから）でクロマトグラフィ ーにより分離し、培養上清から得られた１，３−プロパンジオール誘導体の保持 時間及び質量スペクトルを真の基準から得られたものに比較した。ＴＭＳで誘導 された１，３−プロパンジオールの質量スペクトルは２０５、１７７、１３０及 び１１５ＡＭＵの特性イオンを含有する。 実施例１ １，３−プロパンジオールの発現のためのコスミドＤＮＡでのクローニング及び エシェリキア・コリ宿主細胞の形質転換 培地 １，３−プロパンジオールを製造する能力に関するバクテリア形質転換体のス クリーニングに合成Ｓ１２培地を用いた。Ｓ１２培地は：１０ｍＭ硫酸アンモニ ウム、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ ７．０、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、 ０．７ｍＭ ＣａＣｌ₂、５０μＭ ＭｎＣｌ₂、１μＭ ＦｅＣｌ₃、１μＭ Ｚｎ Ｃｌ、１．７μＭ ＣｕＳＯ₄、２．５μＭ ＣｏＣｌ₂、２．４μＭ Ｎａ₂ＭｎＯ₄ 及び２μＭチアミン塩酸塩を含む。 増殖及び発酵のために用いた培地Ａは：１０ｍＭ硫酸アンモニウム；５０ｍＭ ＭＯＰＳ／ＫＯＨバッファー、ｐＨ ７．５；５ｍＭリン酸 カリウムバッファー、ｐＨ７．５；２ｍＭ ＭｇＣｌ₂；０．７ｍＭ ＣａＣｌ₂； ５０μＭ ＭｎＣｌ₂；１μＭ ＦｅＣｌ₃；１μＭ ＺｎＣｌ；１．７２μＭ Ｃｕ ＳＯ₄；２．５３μＭ ＣｏＣｌ₂；２．４２μＭ Ｎａ₂ＭｎＯ₄；２μＭチアミン 塩酸塩；０．０１％酵母エキス；０．０１％カザミノ酸；０．８μｇ／ｍＬビタ ミンＢ₁₂及び５０μｇ／ｍＬアンピシリンからなった。必要な場合、０．２％グ リセロールまたは０．２％グリセロール＋０．２％Ｄ−グルコースのいずれかを 培地Ａに補足した。細胞 ： 文献でクレブシエラ・エロゲネス（Ｋ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）またはエロバク ター・エロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）としても知ら れているクレブシエラ・ニューモニエＥＣＬ２１０６（Ｒｕｃｈ等、Ｊ．Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ ．、１２４、３４８(１９７５)）をＥ．Ｃ．Ｃ．Ｌｉｎ（Ｈａｒｖ ａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から得、 実験室培養物として維持した。 クレブシエラ・ニューモニエＡＴＣＣ ２５９５５をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）か ら購入した。 エシェリキア・コリＤＨ５αをＧｉｂｃｏ／ＢＲＬから購入し、グリセロール またはジオールデヒドラターゼ酵素のいずれかをコードする遺伝子を含有するク レブシエラ・ニューモニエＡＴＣＣ ２５９５５から単離されたコスミドＤＮＡ で形質転換した。グリセロールデヒドラターゼを含有するコスミドをｐＫＰ１及 びｐＫＰ２として同定し、ジオールデヒドラターゼ酵素を含有するコスミドをｐ ＫＰ４として同定した。形 質転換されたＤＨ５αをＤＨ５α−ｐＫＰ１、ＤＨ５α−ｐＫＰ２及びＤＨ５α −ｐＫＰ４として同定した。 エシェリキア・コリＥＣＬ７０７（Ｓｐｒｅｎｇｅｒ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ ．、１３５、１２５５（１９８９））をＥ．Ｃ．Ｃ．Ｌｉｎ（Ｈａ ｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から 得、クレブシエラ・ニューモニエからのコスミドＤＮＡで同様に形質転換した。 これらの形質転換体をグリセロールデヒドラターゼ遺伝子を含有するＥＣＬ７０ ７−ｐＫＰ１及びＥＣＬ７０７−ｐＫＰ２並びにジオールデヒドラターゼ遺伝子 を含有するＥＣＬ７０７−ｐＫＰ４として同定した。 ｔｐｉ遺伝子（Ａｎｄｅｒｓｏｎ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６ ２、３２９（１９７０））に突然変異を含有するエシェリキア・コリＡＡ２００ をＥ．Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｙａｌｅ Ｕｎ ｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）から購入し、クレブシエラコス ミドＤＮＡで形質転換してグリセロールデヒドラターゼ遺伝子を含有する組み換 え生物ＡＡ２００−ｐＫＰ１及びＡＡ２００−ｐＫＰ２並びにジオールデヒドラ ターゼ遺伝子を含有するＡＡ２００−ｐＫＰ４を得た。ＤＨ５α ： クレブシエラ・ニューモニエＤＮＡでトランスフェクトした約１，０００コロ ニーのエシェリキア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲを含有する６枚の形質転換プ レートを５ｍＬのＬＢ培地で洗浄し、遠心分離した。バクテリアをペレットにし 、５ｍｌのＬＢ培地＋グリセロールに再懸濁した。０．２％グリセロール＋４０ ０ｎｇ／ｍＬのビタミンＢ₁₂＋０． ００１％酵母エキス＋５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＳ１２合成培地を含有 する１５ｍＬのチューブにアリコート（５０μＬ）を接種した。培地でチューブ を最上部まで満たし、パラフィルムで包み、３０℃でインキュベートした。４８ 時間後にわずかな濁りが見られた。７８時間及び１３２時間で上記のように生成 物区分に関して分析したアリコートは１，３−プロパンジオールに関して陽性で あり、後者の時点は増加した量の１，３−プロパンジオールを含有した。 １，３−プロパンジオール生産に関して陽性結果であるバクテリアを単一コロ ニーを単離するために連続希釈してＬＢ−５０ａｍｐプレートで培養した。４８ 個の単一コロニーが単離され、それらを再び１，３−プロパンジオールの生産に 関して調べた。６個の別個のクローンからコスミドＤＮＡを単離し、エシェリキ ア・コリ株ＤＨ５α中に形質転換した。形質転換体を再び１，３−プロパンジオ ールの生産に関して調べた。２個の形質転換体をさらに特性化し、ＤＨ５α−ｐ ＫＰ１及びＤＨ５α−ｐＫＰ２と称した。 ｐＩＢＩ３１（ＩＢＩ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）中 にサブクローン化した、ｐＫＰ１からの１２．１ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフ ラグメントをシークエンスし、ｐＨＫ２８−２６（配列番号１９）と称した。シ ークエンシングからグリセロールデヒドラターゼをコードするｄｈａオペロンの 関係のあるオープンリーディングフレーム及び調節のために必要な遺伝子の遺伝 子座が明らかになった。配列番号１９に関して、ジヒドロキシアセトンキナーゼ をコードするｄｈａＫのオープンリーディングフレームのフラグメントは塩基１ −３９９で見いだされ；グリセロールデヒドロゲナーゼをコードするオープンリ ーディングフレームｄｈａＤは塩基９８３−２１０７で見いだされ；リプレッサ ーをコードするオープンリーディングフレームｄｈａＲは塩基２２０９−４１３ ４に見いだされ；１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする オープンリーディングフレームｄｈａＴは塩基５０１７−６１８０で見いだされ ；αサブユニットグリセロールデヒドラターゼをコードするオープンリーディン グフレームｄｈａＢ１は塩基７０４４−８７１１に見いだされ；βサブユニット グリセロールデヒドラターゼをコードするオープンリーディングフレームｄｈａ Ｂ２ は塩基８７２４−９３０８に見いだされ；γサブユニットグリセロールデヒ ドラターゼをコードするオープンリーディングフレームｄｈａＢ３は塩基９３１ １−９７３６に見いだされ；そして未知の機能のタンパク質をコードするオープ ンリーディングフレームｄｈａＢＸは塩基９７４９−１１５７２に見いだされる 。 クレブシエラ・ニューモニエからのパッケージングされたコスミドＤＮＡでト ランスフェクトしたエシェリキア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲの単一コロニー を２００μＬのＳ１５培地（硫酸アンモニウム、１０ｍＭ；リン酸カリウムバッ ファー、ｐＨ７．０、１ｍＭ；ＭＯＰＳ／ＫＯＨバッファー、ｐＨ７．０、５０ ｍＭ；ＭｇＣｌ₂、２ｍＭ；ＣａＣｌ₂、０．７ｍＭ；ＭｎＣｌ₂、５０μＭ；Ｆ ｅＣｌ₃、１μＭ；ＺｎＣｌ、１μＭ；ＣｕＳＯ₄、１．７２μＭ；ＣｏＣｌ₂、 ２．５３μＭ；Ｎａ₂ＭｎＯ₄、２．４２μＭ；及びチアミン塩酸塩、２μＭ）＋ ０．２％グリセロール＋４００ｎｇ／ｍＬのビタミンＢ₁₂＋０．００１％酵母エ キス＋５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するマイクロタイターウェル中に接種 した。マイクロタイターウェルに加えて、ＬＢ−５０ａｍｐ を含有するマスタープレートにも接種した。９６時間後に１００μＬを取り出し 、０．２ミクロンのナイロン膜フィルターを含有するＲａｉｎｉｎ微量遠心管で 遠心分離した。バクテリアは保持され、濾過液をＨＰＬＣ分析のために処理した 。約２４０コロニーをスクリーニングした後、１，３−プロパンジオール生産を 示す陽性クローンを同定した。３個の陽性クローンを同定し、それらのうち２個 はＬＢ−５０ａｍｐで生育し、１個は生育しなかった。ＩＢ−５０ａｍｐで生育 した２個の陽性クローンのうちの１個から単離し、そして１，３−プロパンジオ ールの生産に関して確かめた単一コロニーをｐＫＰ４と称した。ｐＫＰ４を含有 するエシェリキア・コリ株からコスミドＤＮＡを単離し、エシェリキア・コリ株 ＤＨ５αを形質転換した。ＤＨ５α−ｐＫＰ４と命名した別個の形質転換体を１ ，３−プロパンジオールの生産に関して確かめた。ＥＣＬ７０７ ： ｐＫＰ１、ｐＫＰ２、ｐＫＰ４のいずれかに相当するコスミドクレブシエラ・ ニューモニエＤＮＡまたはＳｕｐｅｒｃｏｓベクターのみでエシェリキア・コリ 株ＥＣＬ７０７を形質転換し、それぞれ、ＥＣＬ７０７−ｐＫＰ１、ＥＣＬ７０ ７−ｐＫＰ２、ＥＣＬ７０７−ｐＫＰ４及びＥＣＬ７０７−ｓｃと命名した。Ｅ ＣＬ７０７はＡＴＰ依存性グリセロールキナーゼ、ＮＡＤ⁺−結合グリセロール デヒドロゲナーゼ及びホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラー ゼ系のジヒドロキシアセトンの酵素IIをそれぞれコードするｇｌｐＫ、ｇｌｄ及 びｐｔｓＤを欠損している。 ＬＢ−５０ａｍｐプレートから単離された、各コスミド形質転換体の２０個の 単一コロニー及び５個のＳｕｐｅｒｃｏｓベクターのみ（陰性 コントロール）の形質転換体をマスターＬＢ−５０ａｍｐプレートに移した。ま た、これらの単離体がデヒドラターゼ活性を含有するかどうかを決定するために グリセロールを１，３−プロパンジオールに転化するそれらの能力に関しても試 験した。０．２％グリセロールまたは０．２％グリセロール＋０．２％Ｄ−グル コースのいずれかを補足した２００μＬの培地Ａを含有するマイクロタイタープ レートに形質転換体を滅菌したつまようじで移した。３０℃で４８時間インキュ ベーション後、マイクロタイタープレートウェルの中身を０．４５ミクロンナイ ロンフィルターを通して濾過し、ＨＰＬＣでクロマトグラフィーにより分離した 。これらの試験の結果を表１に示す。表１ 形質転換されたＥＣＬ７０７による１，３−プロパンジオールへのグリセロール の転化 ＊（陽性の単離体の数／試験した単離体の数）ＡＡ２００ ： ｐＫＰ１、ｐＫＰ２、ｐＫＰ４のいずれかに相当するコスミドクレブシエラ・ ニューモニエＤＮＡまたはＳｕｐｅｒｃｏｓベクターのみでエシェリキア・コリ 株ＡＡ２００を形質転換し、それぞれ、ＡＡ２００−ｐＫＰ１、ＡＡ２００−ｐ ＫＰ２、ＡＡ２００−ｐＫＰ４及びＡＡ２００−ｓｃと命名した。株ＡＡ２００ はトリオースリン酸イソメラーゼを 欠損している（ｔｐｉ ^-）。 各コスミド形質転換体の２０個の単一コロニー及び５個の空のベクター形質転 換体を単離し、そしてエシェリキア・コリ株ＥＣＬ７０７に対して記述したよう にグリセロールを１，３−プロパンジオールに転化するそれらの能力に関して試 験した。これらの試験の結果を表２に示す。 表２ 形質転換されたＡＡ２００による１，３−プロパンジオールへのグリセロールの 転化 ＊（陽性の単離体の数／試験した単離体の数） 実施例２ ＤＡＲ１、ＧＰＰ２、ｄｈａＢ及びｄｈａＴを用いた 組み換えエシェリキア・コリによる１，３−プロパン ジオールへのＤ−グルコースの転化 エシェリキア・コリの形質転換における使用のための汎用発現プラスミドの構築 発現ベクターｐＴａｃＩＱ エシェリキア・コリ発現ベクター、ｐＴａｃＩＱはｐＢＲ３２２（Ｓｕｔｃｌ ｉｆｆｅ等、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉ ｏｌ ．４３、７７（１９７９））のＥｃｏＲＩ中に挿入されたｌａｃＩｑ遺伝子 （Ｆａｒａｂａｕｇｈ、Ｎａｔｕｒｅ ２７ ４、５６７３（１９７８））及びｔａｃプロモーター（Ａｍａｎｎ等、Ｇｅｎｅ ２５、１６７（１９８３））を含有する。マルチプルクローニング部位及びタ ーミネーター配列（配列番号２０）がＥｃｏＲＩからＳｐｈＩまでのｐＢＲ３２ ２配列に置き換わる。グリセロールデヒドラターゼ遺伝子（ｄｈａＢ１、２、３）のサブクローニング プライマー（配列番号２１及び２２）を用いてＰＣＲによりｐＨＫ２８−２６ からｄｈａＢ３遺伝子のオープンリーディングフレーム（５’末端にＥｃｏＲＩ 部位そして３’末端にＸｂａＩ部位を含む）を増幅した。生成物をｐＬｉｔｍｕ ｓ２９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、 ＭＡ）中にサブクローン化してｄｈａＢ３を含有するプラスミドｐＤＨＡＢ３を 作製した。 ｐＨＫ２８−２６からのｄｈａＢオペロンの４個の遺伝子の全コーディング領 域を含有する領域を制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔII ＫＳ⁺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中にクロー ン化してプラスミドｐＭ７を作製した。 ｄｈａＢ（１、２、３、４）を含有するプラスミドｐＭ７をＡｐａＩ及びＸｂ ａＩで消化する（ｄｈａＢ３の一部及びｄｈａＢＸの全部を欠失する）ことによ りｄｈａＢＸ遺伝子を除いた。得られた５．９ｋｂのフラグメントを精製し、プ ラスミドｐＤＨＡＢ３からの３２５ｂｐ ＡｐａＩ−ＸｂａＩフラグメントと連 結して（ｄｈａＢ３遺伝子を元に戻す）ｄｈａＢ（１、２、３）を含有するｐＭ １１を作製した。 プライマー（配列番号２３及び配列番号２４）を用いてＰＣＲによりｐＨＫ２ ８−２６からｄｈａＢ１遺伝子のオープンリーディングフレー ム（５’末端にＨｉｎｄIII部位及び共通ＲＢＳリボソーム結合部位そして３’ 末端にＸｂａＩ部位を含む）を増幅した。生成物をｐＬｉｔｍｕｓ２９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ，Ｉｎｃ．）中にサブクローン化してｄｈａＢ １ を含有するプラスミドｐＤＴ１を作製した。 ｄｈａＢ１遺伝子の一部、ｄｈａＢ２遺伝子及びｄｈａＢ３遺伝子を含有する Ｍ１１からのＮｏｔＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐＤＴ１中に挿入してｄｈａＢ 発現プラスミド、ｐＤＴ２を作製した。ｐＤＴ２からのｄｈａＢ（１、２、３） 遺伝子を含有するＨｉｎｄIII−ＸｂａＩフラグメントをｐＴａｃＩＱ中に挿入 してｐＤＴ３を作製した。１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｄｈａＴ）のサブクローニ ング 完全な１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＴ）遺伝子を含有 する、ｐＨＫ２８−２６のＫｐｎＩ−ＳａｃＩフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔII ＫＳ⁺中にサブクローン化してプラスミドｐＡＨ１を作製した。合成プ ライマー（配列番号２５と配列番号２６）を用いて鋳型ＤＮＡとしてｐＡＨ１か らＰＣＲによりｄｈａＴ遺伝子（５’末端にＸｂａＩ部位そして３’末端にＢａ ｍＨＩ部位を含む）を増幅した。生成物をｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ）中にＳｒｆＩ部位でサブクローン化してｄｈａＴを含有するプラスミ ドｐＡＨ４及びｐＡＨ５を作製した。プラスミドｐＡＨ４はｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐ ｔ中のｌａｃプロモーターからの発現のために正しい向きにｄｈａＴ遺伝子を含 有し、そしてｐＡＨ５は反対向きにｄｈａＴ遺伝子を含有する。ｄｈａＴ遺伝子 を含有するｐＡＨ４からのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＴａｃＩＱ中 に挿入してプラスミドｐＡＨ８を作製した。Ｒ ＢＳ及びｄｈａＴ遺伝子を含有するｐＡＨ８からのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフ ラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳ⁺中に挿入してｐＡＨ１１を作製し た。ＲＢＳ、ｄｈａＴ遺伝子及びターミネーターを含有するｐＡＨ８からのＨｉ ｎｄIII−ＳａｌＩフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳ⁺中に挿入し てｐＡＨ１２を作製した。ｄｈａＢ（１、２、３）及びｄｈａＴの発現カセットの構築 標準的な分子生物学方法を用いて上記の個々のｄｈａＢ（１、２、３）及びｄ ｈａＴ サブクローンからｄｈａＢ（１、２、３）及びｄｈａＴの発現カセットを 組み立てた。ＲＢＳ、ｄｈａＴ遺伝子及びターミネーターを含有するｐＡＨ８か らのＳｐｅＩ−ＫｐｎＩフラグメントをｐＤＴ３のＸｂａＩ−ＫｐｎＩ部位中に 挿入してｐＡＨ２３を作製した。ｐＡＨ２３のｄｈａＢ３とｄｈａＴ遺伝子の間 のＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを除いてｐＡＨ２６を作製した。ｐＤＴ２ からのＥｃｏＲＩ部位を含有するＳｐｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントを用いてｐＡ Ｈ２６のＳｐｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントを置き換えてｐＡＨ２７を作製した。ｄｈａＴ及びｄｈａＢ（１、２、３）の発現カセットの構築 標準的な分子生物学方法を用いて先に記述した個々のｄｈａＢ（１、２、３） 及びｄｈａＴサブクローンからｄｈａＴ及びｄｈａＢ（１、２、３）の発現カセ ットを組み立てた。ｐＤＴ３からのｄｈａＢ（１、２、３）遺伝子を含有するＳ ｐｅＩ−ＳａｃＩフラグメントをｐＡＨ１１中にＳｐｅＩ−ＳａｃＩ部位で挿入 してｐＡＨ２４を作製した。エシェリキア・コリにおける増加したグリセロール生産のためのグリセロール３ −ホスファターゼのクローニング及び発現 サッカロミセス・セレビシエ染色体Ｖラムダクローン６５９２（ジー ンバンク、受託番号Ｕ１８８１３ｘ１１）をＡＴＣＣから購入した。合成プライ マー（配列番号２７と配列番号２８）を用いて標的ＤＮＡとしてそのラムダクロ ーンからＰＣＲクローニングによりグリセロール３−リン酸ホスファターゼ（Ｇ ＰＰ２）遺伝子（５’末端にＢａｍＨＩ−ＲＢＳ−ＸｂａＩ部位そして３’末端 にＳｍａＩ部位を含む）をクローン化した。生成物をｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にＳｒｆＩ部位でサブクローン化してＧＰＰ２を含有す るプラスミドｐＡＨ１５を作製した。プラスミドｐＡＨ１５はｐＣＲ−Ｓｃｒｉ ｐｔ ＳＫ⁺中のｌａｃプロモーターからの発現のために不活性の向きにＧＰＰ２ 遺伝子を含有する。ＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１５からのＢａｍＨＩ−Ｓ ｍａＩフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ⁺中に挿入してプラスミド ｐＡＨ１９を作製した。ｐＡＨ１９はｌａｃプロモーターからの発現のために正 しい向きにＧＰＰ２遺伝子を含有する。ＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１９か らのＸｂａＩ−ＰｓｔＩフラグメントをｐＰＨＯＸ２中に挿入してプラスミドｐ ＡＨ２１を作製した。ｄｈａＴ、ｄｈａＢ（１、２、３）及びＧＰＰ２遺伝子の発現のためのプラスミ ド 制限酵素ＳａｌＩ−ＸｂａＩで消化したｐＡＨ５中にＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ− ＸｂａＩリンカー（配列番号２９及び３０）を挿入してｐＤＴ１６を作製した。 そのリンカーはＸｂａＩ部位を消失させる。次に、ｐＤＴ１６からの１ｋｂＳａ ｌＩ−ＭｌｕＩフラグメントをｐＡＨ２４中に挿入し、存在するＳａｌＩ−Ｍｌ ｕＩフラグメントを置き換えてｐＤＴ１８を作製した。 ｐＤＴ１８からのｄｈａＴ及びｄｈａＢ（１、２、３）の発現カセッ トを含有する４．１ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメント及びｐＡＨ２１か らのＧＰＰ２遺伝子を含有する１．０ｋｂ ＸｂａＩ−ＳａｌＩフラグメントを 制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化したベクター 中に挿入してｐＤＴ２０を作製した。エシェリキア・コリにおけるＤＡＲ１の過剰発現のためのプラスミド 合成プライマー（配列番号４６と配列番号４７）を用いてサッカロミセス・セ レビシエゲノムＤＮＡからＰＣＲクローニングによりＤＡＲ１を単離した。成功 したＰＣＲクローニングはＤＡＲ１の５’末端にＮｃｏＩ部位を配置し、その場 合、ＮｃｏＩ内のＡＴＧはＤＡＲ１の開始メチオニンである。ＤＡＲ１の３’末 端では翻訳ターミネーターの後にＢａｍＨＩ部位が導入される。ＰＣＲフラグメ ントをＮｃｏＩ＋ＢａｍＨＩで消化し、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）内の同じ部位中 にクローン化してｐＤＡＲ１Ａを得た。 より優れたリボソーム結合部位をＤＡＲ１の５’末端に作製するために、合成 プライマー（配列番号４８と配列番号４９）をアニーリングすることにより得ら れるＳｐｅＩ−ＲＢＳ−ＮｃｏＩリンカーをｐＤＡＲ１ＡのＮｃｏＩ部位中に挿 入してｐＡＨ４０を作製した。プラスミドｐＡＨ４０はＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）のｔｒｃプロモーターからの発現のために正しい向きに新しいＲＢ Ｓ及びＤＡＲ１遺伝子を含有する。ｐＤＡＲ１ＡからのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩフ ラグメント及び合成プライマー（配列番号３１と配列番号３２）をアニーリング することにより得られる２組目のＳｐｅＩ−ＲＢＳ−ＮｃｏＩリンカーをｐＢｌ ｕｅｓｃｒｉｐｔ II−ＳＫ⁺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ 部位中に挿入してｐＡＨ４１を作製した。構築物ｐＡＨ４１はアンピシリン耐性 遺伝子を含有する。ｐＤＡＲ１ＡからのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメント及び 合成プライマー（配列番号３１と配列番号３２）をアニーリングすることにより 得られる２組目のＳｐｅＩ−ＲＢＳ−ＮｃｏＩリンカーをｐＢＣ−ＳＫ⁺（Ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ部位中に挿入してｐＡＨ４２を作製 した。構築物ｐＡＨ４２はクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有する。ＤＡＲ１及びＧＰＰ２の発現カセットの構築 標準的な分子生物学方法を用いて上記の個々のＤＡＲ１及びＧＰＰ２サブクロ ーンからＤＡＲ１及びＧＰＰ２の発現カセットを組み立てた。ＲＢＳ及びＧＰＰ ２遺伝子を含有するｐＡＨ１９からのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントをｐＡ Ｈ４０中に挿入してｐＡＨ４３を作製した。ＲＢＳ及びＧＰＰ２遺伝子を含有す るｐＡＨ１９からのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントをｐＡＨ４１中に挿入し てｐＡＨ４４を作製した。ＲＢＳ及びＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１９から の同じＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントをｐＡＨ４２中にも挿入してｐＡＨ４ ５を作製した。エシェリキア・コリ株の構築 エシェリキア・コリＷ１４８５は野生型Ｋ−１２株（ＡＴＣＣ １２４３５） である。この株をプラスミドｐＤＴ２０及びｐＡＨ４２で形質転換し、５０μｇ ／ｍＬのカルベニシリン及び１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補足した ＬＡ（ルリア寒天、Ｄｉｆｃｏ）で選択した。グルコースからの１，３−プロパンジオールの生産 １リットル当たり２２．５ｇのグルコース、６．８５ｇのＫ₂ＨＰＯ₄、６．３ ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．５ｇのＮａＨＣＯ₃、２．５ｇのＮａＣｌ、８ｇの酵 母エキス、８ｇのトリプトン、２．５ｍｇのビタミンＢ₁₂、２．５ｍＬの修正バ ルチ（Ｂａｌｃｈ’ｓ）微量元素溶液、５０ｍｇのカルベニシリン及び１０ｍｇ のクロラムフェニコールを含有し、最終ｐＨ６．８（ＨＣｌ）、次に濾過滅菌し た５０ｍＬの培地にエシェリキア・コリＷ１４８５／ｐＤＴ２０／ｐＡＨ４２を プレートから移す。修正バルチ微量元素溶液の組成をＭｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｐ ．Ｇｅｒｈａｒｄｔ等、編集、ｐ１５８、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９９４） ）中に見いだすことができる。３７℃、３００ｒｐｍで６時間インキュベートし た後、０．５ｇのグルコース及びＩＰＴＧ（最終濃度＝０．２ｍＭ）を添加し、 振盪を１００ｒｐｍに下げた。サンプルをＧＣ／ＭＳにより分析した。２４時間 後に、Ｗ１４８５／ｐＤＴ２０／ｐＡＨ４２は１．１ｇ／Ｌのグリセロール及び １９５ｍｇ／ｍＬの１，３−プロパンジオールを生産した。 実施例３ サッカロミセス・セリビシエにおけるｄｈａＢ及びｄｈａＴのクローニング及び 発現 複製するエピソーム成分として存在することができる発現プラスミドを４個の ｄｈａ遺伝子の各々に対して構築した。全ての発現プラスミドには酵母ＡＤＨ１ プロモーターが存在し、１つまたはそれより多い制限エンドヌクレアーゼの認識 部位を含有するＤＮＡのフラグメントで酵母 ＡＤＨ１転写ターミネーターから隔てられている。また、各発現プラスミドはア ンピシリンを含有する培地でのエシェリキア・コリにおける選択のためのβ−ラ クタマーゼ遺伝子、エシェリキア・コリにおけるプラスミドの維持のための複製 起点及びサッカロミセス・セリビシエにおける維持のための２ミクロン複製起点 も含有する。酵母に対して用い、発現プラスミド上に存在する選択栄養マーカー は以下のもの：イミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼをコードするＨ ＩＳ３遺伝子、オロチジン５’−リン酸脱炭酸酵素をコードするＵＲＡ３遺伝子 、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸イソメラーゼをコードするＴ ＲＰ１遺伝子及びβ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするＬＥ Ｕ２のいずれかであった。 ５’末端にＥｃｏＲＩ部位を含むプライマー（ｄｈａＴ、ｄｈａＢ３、ｄｈａ Ｂ２ 及びｄｈａＢ１に対してそれぞれ配列番号３８と配列番号３９、配列番号４ ０と配列番号４１、配列番号４２と配列番号４３及び配列番号４４と配列番号４ ５）を用いてＰＣＲによりｐＨＫ２８−２６（配列番号１９）からｄｈａＴ、ｄ ｈａＢ３ 、ｄｈａＢ２及びｄｈａＢ１のオープンリーディングフレームを増幅し た（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ）１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、０．０００１％ゼラチン、２００μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＣＴＰ、２０ ０μＭ ｄＧＴＰ、２００μＭ ｄＴＴＰ、１μＭの各プライマー、１−１０ｎｇ の標的ＤＮＡ、２５ユニット／ｍＬ Ａｍｐｌｉｔａｑ^TM（商標）ＤＮＡポリメ ラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ））。 ＰＣＲパラメーターは９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分、３５サイク ルであった。生成物をｐＨＩＬ−Ｄ４（Ｐｈ ｉｌｌｉｐｓ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＯＫ）のＥｃ ｏＲＩ部位中にサブクローン化してｄｈａＴ、ｄｈａＢ３、ｄｈａＢ２及びｄｈ ａＢ１ をそれぞれ含有するプラスミドｐＭＰ１３、ｐＭＰ１４、ｐＭＰ２０及び ｐＭＰ１５を作製した。ｄｈａＢ１発現プラスミドｐＭＣＫ１０の構築 ７．８ｋｂの複製プラスミドｐＧＡＤＧＨ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａ ｌｔｏ、ＣＡ）をＨｉｎｄIIIで消化し、脱リン酸化し、そしてｐＭＰ１５から のｄｈａＢ１ ＨｉｎｄIIIフラグメントに連結した。得られたプラスミド（ｐＭ ＣＫ１０）はＡＤＨ１プロモーターからの転写のために正しい向きのｄｈａＢ１ を有し、そしてＬＥＵ２マーカーを含んだ。ｄｈａＢ２発現プラスミドｐＭＣＫ１７の構築 プラスミドｐＧＡＤＧＨ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を ＨｉｎｄIIIで消化し、ＨｉｎｄIII−ＸｍｎＩ及びＥｃｏＲＩ−ＸｍｎＩアダプ ター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）との ライゲーションにより一本鎖末端をＥｃｏＲＩ末端に転化した。プラスミドｐＵ Ｃ４Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ）からのＥｃｏ ＲＩフラグメント上のカナマイシン耐性遺伝子に連結し、エシェリキア・コリ株 ＤＨ５α中に形質転換し、そして２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ プレートで選択することにより正しいＥｃｏＲＩ末端を有するプラスミドの選択 を実施した。得られたプラスミド（ｐＧＡＤ／ＫＡＮ２）をＳｎａＢＩ及びＥｃ ｏＲＩで消化し、ＡＤＨ１プロモーターを含む１．８ｋｂのフラグメントを単離 した。プラスミドｐＧＢＴ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａ ｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）をＳｎａＢＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、１．５ｋｂのＡ ＤＨ１／ＧＡＬ４フラグメントをＳｎａＢＩ及びＥｃｏＲＩでの消化によりｐＧ ＡＤ／ＫＡＮ２から単離した１．８ｋｂのＡＤＨ１プロモーターフラグメントで 置き換えた。得られたベクター（ｐＭＣＫ１１）はＡＤＨ１プロモーター及びタ ーミネーター並びにＴＲＰ１マーカーを有する酵母における複製プラスミドであ る。プラスミドｐＭＣＫ１１をＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化し、そしてｐＭ Ｐ２０からのｄｈａＢ２ ＥｃｏＲＩフラグメントに連結した。得られたプラス ミド（ｐＭＣＫ１７）はＡＤＨ１プロモーターからの転写のために正しい向きのｄｈａＢ２ を有し、そしてＴＲＰ１マーカーを含んだ。ｄｈａＢ３発現プラスミドｐＭＣＫ３０の構築 プラスミドｐＧＢＴ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＮａｅＩ及びＰｖｕIIで消化し 、１ｋｂのＴＲＰ１遺伝子をこのベクターから除いた。ＴＲＰ１遺伝子をプラス ミドｐＲＳ４０６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からの１．７ｋｂ ＡａｔII／Ｎａ ｅＩフラグメントとして与えられるＵＲＡ３遺伝子で置き換えて中間ベクターｐ ＭＣＫ３２を得た。ｐＭＣＫ３２上に存在する欠失したＡＤＨ１プロモーターを １．５ｋｂ ＳｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントで取り除き、プラスミドｐＧ ＡＤ／ＫＡＮ２からの１．８ｋｂ ＳｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント上の全 長のＡＤＨ１プロモーターで置き換えてベクターｐＭＣＫ２６を得た。ｐＭＣＫ ２６上の唯一のＥｃｏＲＩ部位を用いてプラスミドｐＭＰ１４からのｄｈａＢ３ を含むＥｃｏＲＩフラグメントを挿入してｐＭＣＫ３０を得た。ｐＭＣＫ３０複 製発現プラスミドはＡＤＨ１プロモーターからの発現のための向きのｄｈａＢ３ を有し、そしてＵＲＡ３マーカーを含んだ。ｄｈａＴ発現プラスミドｐＭＣＫ３５の構築 プラスミドｐＧＢＴ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＮａｅＩ及びＰｖｕIIで消化し 、１ｋｂのＴＲＰ１遺伝子をこのベクターから除いた。ＴＲＰ１遺伝子をプラス ミドｐＲＳ４０３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのＸｍｎＩ／ＮａｅＩフラグメ ントとして与えられるＨＩＳ３遺伝子で置き換えて中間ベクターｐＭＣＫ３３を 得た。ｐＭＣＫ３３上に存在する欠失したＡＤＨ１プロモーターを１．５ｋｂ ＳｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントで取り除き、プラスミドｐＧＡＤ／ＫＡＮ ２からの１．８ｋｂ ＳｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント上の全長のＡＤＨ１ プロモーターで置き換えてベクターｐＭＣＫ３１を得た。ｐＭＣＫ３１上の唯一 のＥｃｏＲＩ部位を用いてプラスミドｐＭＰ１３からのｄｈａＴを含むＥｃｏＲ Ｉフラグメントを挿入してｐＭＣＫ３５を得た。ｐＭＣＫ３５複製発現プラスミ ドはＡＤＨ１プロモーターからの発現のための向きのｄｈａＴを有し、そしてＨ ＩＳ３マーカーを含んだ。ｄｈａ発現プラスミドでのサッカロミセス・セレビシエの形質転換 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から購入したサッカロミセ ス・セレビシエ株ＹＰＨ５００（ｕｒａ３−５２ ｌｙｓ２−８０１ ａｄｅ２− １０１ ｔｒｐ１−△６３ ｈｉｓ３−△２００ ｌｅｕ２−△１）（Ｓｉｋｏｒ ｓｋｉ Ｒ．Ｓ．及びＨｉｅｔｅｒ Ｐ．、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２２、１９− ２７、（１９８９））をＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換キット（カタログ番号 Ｔ２００１）（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ）を用いて１− ２μｇのプラスミドＤＮＡで形質転換した。１つまたはそれより多い以下のもの ：アデニン硫酸（２０ｍｇ／Ｌ）、ウラシル（２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−トリプト ファン（２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ヒスチジン（２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ロイシン（３ ０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−リシン（３０ｍｇ／Ｌ）を添加して補足最小培地（ＳＭＭ− ０．６７％のアミノ酸を含まない酵母窒素塩基（ｂａｓｅ）、２％グルコース） でコロニーを２９℃で３−４日間増殖させた。 コロニーを選択プレート上に延ばし、液体培地に接種するために用いた。ｄｈａ遺伝子に関するサッカロミセス・セレビシエ形質転換体のスクリーニング ＵＲＡ⁺、ＨＩＳ⁺、ＴＲＰ⁺、ＬＥＵ⁺形質転換体からの染色体ＤＮＡを各遺伝 子に特異的なプライマー（配列番号３８−４５）を用いてＰＣＲにより分析した 。４個全てのオープンリーディングフレームの存在が確かめられた。形質転換されたサッカロミセス・セレビシエにおけるｄｈａＢ及びｄｈａＴ活性 の発現 インビトロ酵素アッセイを用いて活性のあるグリセロールデヒドラターゼ（ｄ ｈａＢ ）及び１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）の存 在を示した。さらに、ウェスタンブロット分析により４個全てのオープンリーデ ィングフレームからのタンパク質発現が確かめられた。 プラスミドｐＭＣＫ１０、ｐＭＣＫ１７、ｐＭＣＫ３０及びｐＭＣＫ３５の群 で形質転換された株ＹＰＨ５００を０．６７％のアミノ酸を含まない酵母窒素塩 基、２％グルコース、２０ｍｇ／Ｌアデニン硫酸及び３０ｍｇ／ＬＬ−リシンを 含有する補足最小培地で増殖させた。細胞をホモジナイズし、抽出物をｄｈａＢ 活性に関してアッセイした。グリセロールデヒドラターゼには０．１２ユニット ／ｍｇタンパク質、そし て１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼには０．０２４ユニット／ｍ ｇタンパク質の比活性が得られた。実施例４ 組み換えサッカロミセス・セレビシエを用いたＤ−グルコースからの１，３−プ ロパンジオールの生産 プラスミドｐＭＣＫ１０、ｐＭＣＫ１７、ｐＭＣＫ３０及びｐＭＣＫ３５の群 を保有するサッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００を最初に２０ｇ／Ｌのグル コース、６．７ｇ／Ｌのアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、４０ｍｇ／Ｌのアデ ニン硫酸及び６０ｍｇ／ＬのＬ−リシンＨＣｌを含有する１．０Ｌの最小培地中 でＢｉｏｓｔａｔＢファーメンター（Ｂ Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ ．）で増殖させた。増殖の期間中に、さらなる当量の酵母窒素塩基、アデニン及 びリシンを添加した。１０％のリン酸及び２ＭのＮａＯＨの添加でｐＨ５．５、 ３０℃、及び振盪制御により４０％の溶存酸素圧力にファーメンターを制御した 。 ３８時間後に、細胞（ＯＤ₆₀₀＝５．８ＡＵ）を遠心分離により集め、基本培地 （６．７ｇ／Ｌのアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、２０ｍｇ／Ｌアデニン硫酸 、３０ｍｇ／ＬＬ−リシンＨＣｌ及び５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ ７．０）に再懸濁した。 ０．５％のグルコース、５μｇ／ｍＬの補酵素Ｂ₁₂及び０、１０、２０または ４０ｍＭのクロロキンを補足した４ｍＬの全容量の基本培地中に細胞（ＯＤ₆₀₀ ＝２０ＡＵ）を含有する反応混合物を１０ｍＬのクリンプ密封血清ボトル中に光 及び酸素の非存在下で（窒素分散）調製し、振盪しながら３０℃でインキュベー トした。３０時間後にアリコートを取り出し、ＨＰＬＣにより分析した。結果を 表３に示す。表３ 組み換えサッカロミセス・セレビシエを用いた１，３−プロパンジオールの生産 実施例５ Ｄ−グルコースからの１，３−プロパンジオールの生産のための、ｄｈａＢ及び ｄｈａＴがゲノム中に組込まれているサッカロミセス・セレビシエ二重形質転換 体の使用 実施例５はグルコースからの１，３−プロパンジオールの製造のためのｄｈａ Ｂ１ 、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３及びｄｈａＴでのサッカロミセス・セレビシエの 形質転換及び酵母ゲノム中へのそれらの遺伝子の安定な組込みをｐｈｒｏｐｈｅ ｔｉｃａｌｌｙに示す。発現カセットの構築 ４個の発現カセット（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３及びｄｈａＴ）を 酵母のサッカロミセス・セレビシエにおけるこれらの遺伝子のグルコース誘導性 で高レベルの構成的発現のために構築する。これらのカセットは（ｉ）サッカロ ミセス・セレビシエ株Ｓ２８８Ｃからのホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ） プロモーター；（ii）遺伝子ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３またはｄｈａ Ｔ のいずれか；及び（iii）サッカロミセス・セレビシエ株Ｓ２８８ＣからのＰ ＧＫターミネーター からなる。重複伸長によるＰＣＲに基づく遺伝子スプライシングの技術（Ｈｏｒ ｔｏｎ等、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、８：５２８−５３５、（１９９０）） を用いてＤＮＡ配列を再結合し、各遺伝子の最適発現のために継目なく連結され たこれらのカセットを作製する。酵母発現プラスミドにおいて複数のカセットク ローニングができる制限部位を有する適当なベクター（ｐＬＩＴＭＵＳ３９）中 にこれらのカセットを別個にクローン化する。酵母組込みベクターの構築 酵母ゲノム中への発現カセットの組込みをもたらすために用いるベクターを構 築する。これらのベクターは以下の成分：（ｉ）発現カセットをサブクローン化 するポリクローニング領域；（ii）安定な酵母形質転換体を選択するために用い る独特なマーカー；（iii）酵母を形質転換する前のエシェリキア・コリにおけ る遺伝子操作を可能にする複製起点及び選択マーカーを含有する。一つの組込み ベクターはＵＲＡ３栄養要求性マーカーを含有し（ＹＩｐ３５２ｂ）、もう一つ の組込みベクターはＬＹＳ２栄養要求性マーカーを含有する（ｐＫＰ７）。酵母発現プラスミドの構築 ｄｈａＢ１及びｄｈａＢ２の発現カセットをＹＩｐ３５２ｂのポリクローニン グ領域中にサブクローン化し（発現プラスミド＃１）、そしてｄｈａＢ３及びｄ ｈａＴ の発現カセットをｐＫＰ７のポリクローニング領域中にサブクローン化す る（発現プラスミド＃２）。発現プラスミドでの酵母の形質転換 Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒ ａｎｇｅ、ＣＡ）を用いてサッカロミセス・セレビシエ（ｕｒ ａ３ 、ｌｙｓ２）を発現プラスミド＃１で形質転換し、そしてウラシルを欠いた プレートで形質転換体を選択する。ｄｈａＢ１及びｄｈａＢ２の発現カセットの 組込みを染色体ＤＮＡのＰＣＲ分析により確かめる。選択した形質転換体をＦｒ ｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換キットを用いて発現プラスミド＃２で再形質転換し 、そしてリシンを欠いたプレートで二重形質転換体を選択する。ｄｈａＢ３及びｄｈａＴ の発現カセットの組込みを染色体ＤＮＡのＰＣＲ分析により確かめる。 二重形質転換体中の４個全ての発現カセット（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａ Ｂ３ 、ｄｈａＴ）の存在を染色体ＤＮＡのＰＣＲ分析により確かめる。二重に形質転換された酵母からのタンパク質の生産 二重に形質転換された酵母からのｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３及びｄ ｈａＴ によりコードされるタンパク質の生産をウェスタンブロット分析により確 かめる。二重に形質転換された酵母からの酵素活性 二重に形質転換された酵母からの活性グリセロールデヒドラターゼ及び活性１ ，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを上の一般法で記述したような酵素ア ッセイにより確かめる。二重に形質転換された酵母からの１，３−プロパンジオールの生産 二重に形質転換された酵母におけるグルコースからの１，３−プロパンジオール の生産を本質的に実施例４に記述したように示す。 実施例６ ＤＡＲ１／ＧＰＰ２またはｄｈａＴ／ｄｈａＢ１−３を含有するプラスミドの構 築及びクレブシエラ種への形質転換 クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２５９５５）、クレブシエ ラ・ニューモニエ（ＥＣＬ２１０６）及びクレブシエラ・オキシトカ(Ｋ．ｏｘ ｙｔｏｃａ ）（ＡＴＣＣ ８７２４）は生来アンピシリン（１５０μｇ／ｍＬま で）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍＬまで）に耐性であるが、テトラサイクリ ン（１０μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）に感受性で ある。その結果、これら後者２つの抗生物質に対する耐性をコードする複製プラ スミドはこれらのクレブシエラ株のクローニングベクターとして潜在的に有用で ある。中等度コピー数のプラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ ｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）のエレクトロポレーションにより、野生 型のクレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２５９５５）、グルコースにより 活性化されるクレブシエラ・ニューモニエ（ＥＣＬ２１０６）及びクレブシエラ ・オキシトカ（ＡＴＣＣ ８７２４）をうまくテトラサイクリン耐性に形質転換 した。以下の方法によりこれを成し遂げた。１０ｍＬの一晩培養物を１ＬのＬＢ （１％（ｗ／ｖ）バクトートリプトン（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ）（Ｄｉ ｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）、０．５％（ｗ／ｖ）バクト−酵母エキス（Ｄ ｉｆｃｏ）及び０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、 ＭＯ））中に接種し、培養物を０．５−０．７のＯＤ₆₀₀まで３７℃でインキュ ベートした。細胞を氷上で冷やし、４０００ｘｇで１５分間の遠心分離により集 め、そして１Ｌのよく冷えた滅菌した１０％グリセロール中に再懸濁した。細胞 を遠心分離により繰り返し集め、段階的に５００ｍＬ、２０ｍＬ、そして最後に ２ｍＬのよく冷えた滅菌した１０％グリセロール中に再懸濁した。エレクトロポ レーションのために、冷やした０．２ｃｍキュベット中で４０μＬの細胞を１− ２μＬのＤＮＡと混合し、Ｂｉ ｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ） を用いて２００Ω、２．５ｋＶで４−５ミリ秒間パルスを与えた。１μＬのＳＯ Ｃ培地（２％（ｗ／ｖ）バクトートリプトン(Ｄｉｆｃｏ)、０．５％（ｗ／ｖ） バクト−酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、１０μＭ ＮａＣｌ、１０μＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０μＭ ＭｇＳＯ₄、２．５μＭ ＫＣｌ及び２０μＭグルコース）を細胞に 添加し、懸濁液を１７ｘ１００ｍｍの滅菌したポリプロピレンチューブに移した 後、培養物を３７℃、２２５ｒｐｍで１時間インキュベートした。アリコートを 示したような選択培地上で培養した。別個のテトラサイクリン耐性形質転換体か らのプラスミドＤＮＡの分析からｐＢＲ３２２の典型的な制限エンドヌクレアー ゼ消化パターンが示され、ベクターがテトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）を含 有するＬＢ中３７℃で一晩培養後に安定に維持されたことを示す。従って、クレ ブシエラ・ニューモニエ及びクレブシエラ・オキシトカ中にＤＡＲ１／ＧＰＰ２ 及びｄｈａＴ／ｄｈａＢ１−３発現カセットを導入するためにこのベクター並び にアンピシリン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールに対する耐性をコ ードするｐＢＲ３２９（ＡＴＣＣ ３７２６４）のような誘導体を用いることが できる。 ＤＡＲ１及びＧＰＰ２遺伝子をそれらの既知のＤＮＡ配列に基づいて、サッカ ロミセス・セレビシエゲノムからＰＣＲでの増幅により得ることができる。次に 、グルコースを含有する培地中でそれらの遺伝子の発現を導くために用いること ができる１つまたはそれより多いプロモーターの制御下でそれらをクレブシエラ ・ニューモニエまたはクレブシエラ・オキシトカ中に形質転換する。便宜上、プ ラスミドｐＡＨ４４のＰｖｕII制限エンドヌクレアーゼでの消化により得られる ２．４ｋｂ ＤＮＡ フラグメント上にそれらの遺伝子を得、それによりそれらの遺伝子はすでにエシ ェリキア・コリｌａｃプロモーターの制御下で発現カセット中に配置されている 。このＤＮＡフラグメントをＰｖｕIIで消化したｐＢＲ３２９に連結し、そのク ロラムフェニコール耐性遺伝子の挿入不活化を生じた。連結されたＤＮＡを用い てエシェリキア・コリＤＨ５α（Ｇｉｂｃｏ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ ）を形質転換した。形質転換体をテトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）に対する それらの耐性により選択し、そしてクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）に 対するそれらの感受性に関してスクリーニングした。テトラサイクリン耐性、ク ロラムフェニコール感受性の形質転換体からのプラスミドＤＮＡの分析により、 Ｐ_lac−ｄａｒ１−ｇｐｐ２発現カセットがｐＢＲ３２９のＰｖｕII部位にいず れかの向きでサブクローン化された予想されるプラスミドの存在が確かめられた 。ｐＪＳＰ１Ａ（時計回りの向き）及びｐＪＳＰ１Ｂ（反時計回りの向き）と命 名したこれらのプラスミドを記述したようにクレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴ ＣＣ ２５９５５）、クレブシエラ・ニューモニエ（ＥＣＬ２１０６）及びクレ ブシエラ・オキシトカ（ＡＴＣＣ ８７２４）中にエレクトロポレーションによ り別個に形質転換した。形質転換体をテトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）に対 するそれらの耐性により選択し、そしてクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ ）に対するそれらの感受性に関してスクリーニングした。別個の形質転換体から 単離されたプラスミドの制限分析から、予想される消化パターンのみが示され、 それらが抗生物質選択で３７℃で安定に維持されることが確かめられた。増殖培 地へのＩＰＴＧ（０．２−２．０ｍＭ）の添加によりＤＡＲ１及びＧＰＰ２遺伝 子の発現を高めることがで きる。 クレブシエラ・ニューモニエのｄｈａＢ（１−３）及びｄｈａＴの４個の遺伝 子をそれらの既知のＤＮＡ配列に基づいてクレブシエラ・ニューモニエゲノムか らＰＣＲでの増幅により得ることができる。次に、これらの遺伝子をグルコース を含有する培地中でそれらの発現を導くために用いることができる１つまたはそ れより多いプロモーターの制御下でクレブシエラ・ニューモニエ中に形質転換す る。便宜上、プラスミドｐＡＨ２４のＫｐｎＩ／ＳａｃＩ制限エンドヌクレアー ゼでの消化により得られる約４．０ｋｂ ＤＮＡフラグメント上にそれらの遺伝 子を得、それによりそれらの遺伝子はすでにエシェリキア・コリｌａｃプロモー ターの制御下で発現カセット中に配置されている。このＤＮＡフラグメントを同 様に消化したｐＢＣ−ＫＳ⁺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ） に連結し、そしてエシェリキア・コリＤＨ５αを形質転換するために用いた。形 質転換体をクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）に対するそれらの耐性によ り選択し、そしてＸ−ｇａｌを含有するＬＢ寒天上で白色コロニー表現型に関し てスクリーニングした。 白色コロニー表現型を示すクロラムフェニコール耐性形質転換体からのプラスミ ドＤＮＡの制限分析により、ｄｈａＴ−ｄｈａＢ（１−３）遺伝子がエシェリキ ア・コリｌａｃプロモーターの制御下にサブクローン化されたｐＪＳＰ２と命名 された予想されるプラスミドの存在が確かめられた。 ３Ｇへのグルコースの転化を高めるために、このプラスミドをすでにＰ_lac−ｄａｒ１ −ｇｐｐ２発現カセットを含有するクレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴ ＣＣ ２５９５５）（ｐＪＳＰ１Ａ）、クレブシエラ・ ニューモニエ（ＥＣＬ２１０６）（ｐＪＳＰ１Ａ）及びクレブシエラ・オキシト カ（ＡＴＣＣ ８７２４）（ｐＪＳＰ１Ａ）中にエレクトロポレーションにより 別個に形質転換した。共形質転換体（ｃｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）をテトラ サイクリン（１０μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）の 両方に対するそれらの耐性により選択した。別個の共形質転換体から単離された プラスミドの制限分析から、ｐＪＳＰ１Ａ及びｐＪＳＰ２の両方に対して予想さ れる消化パターンが示された。培地へのＩＰＴＧ（０．２−２．０ｍＭ）の添加 によりＤＡＲ１、ＧＰＰ２、ｄｈａＢ（１−３）及びｄｈａＴ遺伝子の発現を高 めることができる。 実施例７ クレブシエラ・ニューモニエによるグルコースからの１，３−プロパンジオール の生産 両方ともｐＪＳＰ１Ａで形質転換されたクレブシエラ・ニューモニエ株ＥＣＬ ２１０６及び２１０６−４７、並びにｐＪＳＰ１ＡとｐＪＳＰ２で形質転換さ れたＡＴＣＣ ２５９５５をグルコースからの１，３−プロパンジオールの生産 のために様々な条件下（表４参照）で５ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎファーメンター中 で増殖させた。株２１０６−４７はＢａｕｅｒ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ．５６、１２９６（１９９０）中に記述されたようにフルオ ロ酢酸／乳酸選択プレートから得られたＥＣＬ２１０６のフルオロ酢酸耐性の誘 導体である。各場合で、用いた培地は５０−１００ｍＭのリン酸カリウムバッフ ァー、ｐＨ７．５、４０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１％（ｗ／ｖ）酵母エキス 、１０μＭ ＣｏＣｌ₂、６．５μＭ ＣｕＣｌ₂、１００μＭ ＦｅＣ ｌ₃、１８μＭ ＦｅＳＯ₄、５μＭ Ｈ₃ＢＯ₃、５０μＭ ＭｎＣｌ₂、０．１μＭ Ｎａ₂ＭｎＯ₄、２５μＭ ＺｎＣｌ₂、０．８２ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．９ｍＭ Ｃ ａＣｌ₂及び１０−２０ｇ／Ｌグルコースを含有した。さらにグルコースを供給 し、残存グルコースを過剰に維持した。温度を３７℃に制御し、そしてｐＨを５ Ｎ ＫＯＨまたはＮａＯＨで７，５に制御した。適切な抗生物質をプラスミドの 維持のために含み；ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド ）を同様に示した濃度で添加した。嫌気発酵には、０．１ｖｖｍの窒素を反応器 中に分散させ；ｄＯ整定値が５％である場合は１ｖｖｍの空気を反応器中に分散 させ、そして培地にビタミンＢ₁₂を補足した。最終濃度及び全体収率（ｇ／ｇ） を表４に示す。 表４ クレブシエラ・ニューモニエによるグルコースからの１，３−プロパンジオール の生産 実施例８ ｄａｒ１、ｇｐｐ２、ｄｈａＢ及びｄｈａＴを含有する組み換えクレブシエラ・ ニューモニエによる１，３−プロパンジオールへの炭素基質の転化 Ａ．各種クレブシエラ・ニューモニエ組み換え株による１，３−プロパンジオー ルへのＤ−フルクトースの転化 クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２５９５５ ｐＪＳＰ１Ａ）、クレブ シエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２５９５５ ｐＪＳＰ１Ａ／ｐＪＳＰ２）、ク レブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２１０６ ｐＪＳＰ１Ａ）及びクレブシエ ラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２１０６ ｐＪＳＰ１Ａ／ｐＪＳＰ２）の単一コロ ニーを寒天プレートから移し、別個の培養管中で適切な抗生物質剤を含有するル リア−ベルタニ（ＬＢ）培地中で一晩継代培養した。１リットル当たり：１０ｇ のフルクトース；１ｇの酵母エキス；５０ｍｍｏｌｅのリン酸カリウム、ｐＨ７ ．５；４０ｍｍｏｌｅ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄；０．０９ｍｍｏｌｅの塩化カルシウム ；２．３８ｍｇ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ；０．８８ｍｇ ＣｕＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ；２７ ｍｇ ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ；５ｍｇ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ；０．３１ｍｇ Ｈ₃ＢＯ₃ ；１０ｍｇ ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ；０．０２３ｍｇＮａ₂ＭｎＯ₄・２Ｈ₂Ｏ；３ ．４ｍｇ ＺｎＣｌ₂；０．２ｇ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを含有するＬＬＭＭ／Ｆと して明示される４５ｍＬの滅菌濾過した最小培地を含む５０ｍＬのフラスコ（？ ）。単一のプラスミド組み換え体のいずれかを用いる反応には１０μｇ／ｍＬの テトラサイクリン；二重のプラスミド組み換え体のいずれかを用いる反応には１ ０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン及び２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを 培地に添加した。２ｍＬの継代培養物を接種する前に培地に窒素を完全に分散さ せた。いくつかのフラスコには０．５ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧを添加した。フ ラスコに蓋をし、次に、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋシリーズ２５インキュベー ター／振盪機中で３７℃、１００ｒｐｍでイ ンキュベートした。少なくとも２４時間かまたは大部分の炭素基質が生成物に転 化されるまで反応を実施した。サンプルをＨＰＬＣにより分析した。表５に各種 クレブシエラ組み換え体によりフルクトースから生産された１，３−プロパンジ オールの収率を記述する。 表５ 組み換えクレブシエラを用いたＤ−フルクトースからの１，３−プロパンジオー ルの生産 Ｂ．クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２５９５５ ｐＪＳＰ１Ａ／ｐＪＳ Ｐ２）による各種炭素基質の１，３−プロパンジオールへの転化： クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２５９５５ ｐＪＳＰ１Ａ／ｐＪＳＰ ２）の冷凍したストック培養物のアリコート（０．１ｍＬ）を２５０ｍＬバッフ ル付きフラスコ中の５０ｍＬの種培地に移した。種培地は１リットル当たり；０ ．１モルＮａＫ／ＰＯ₄バッファー、ｐＨ７．０；３ｇ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄；５ｇグ ルコース、０．１５ｇ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１０ｍＬ １００Ｘ微量元素溶液、 ２５ｍｇクロラムフェ ニコール、１０ｍｇテトラサイクリン及び１ｇの酵母エキスを含んだ。１００Ｘ 微量元素は１リットル当たり：１０ｇクエン酸、１．５ｇ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ 、２．８ｇ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．３９ｇ ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．３８ｇ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、０．２ｇ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ及び０．３ｇ ＭｎＣｌ₂・ ４Ｈ₂Ｏを含んだ。得られた溶液をＫＯＨまたはＨ₂ＳＯ₄のいずれかでｐＨ７． ０に滴定した。グルコース、微量元素、抗生物質及び酵母エキスを別個に滅菌し た。種接種材料を３５℃及び２５０ｒｐｍで一晩増殖させた。 反応設計は半好気的であった。系はアルミホイル片で部分的に開いたままの１ ２５ｍＬの密封フラスコ中の１３０ｍＬの反応培地からなった。反応培地は１リ ットル当たり：３ｇ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄；２０ｇ炭素基質；０．１５モルＮａＫ／ ＰＯ₄バッファー、ｐＨ７．５；１ｇ酵母エキス；０．１５ｇ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂ Ｏ；０．５ｍｍｏｌｅ ＩＰＴＧ；１０ｍＬ １００Ｘ微量元素溶液；２５ｍｇ クロラムフェニコール；及び１０ｍｇテトラサイクリンを含んだ。得られた溶液 をＫＯＨまたはＨ₂ＳＯ₄でｐＨ７．５に滴定した。炭素源は：Ｄ−グルコース（ Ｇｌｃ）；Ｄ−フルクトース（Ｆｒｃ）；Ｄ−ラクトース（Ｌａｃ）；Ｄ−ショ 糖（Ｓｕｃ）；Ｄ−マルトース（Ｍａｌ）；及びＤ−マンニトール（Ｍａｎ）で あった。混合を高めるために数個のガラスビーズを培地中に含んだ。細胞懸濁液 の吸光度がλ₆₀₀ｎｍで測定した場合に０．１ＡＵで始まるように種接種材料を 添加することにより反応を開始した。フラスコを３５℃：２５０ｒｐｍでインキ ュベートした。２４時間後にＨＰＬＣにより３Ｇ生成を測定した。表６に各種炭 素基質から生産された１，３−プロパンジオールの収率を記述する。表６ 組み換えクレブシエラ２５９５５ ｐＪＳＰ１Ａ／ｐＪＳＰ２を用いた各種炭素 基質からの１，３−プロパンジオールの生産

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１２月３日（１９９８．１２．３） 【補正内容】 ７． 形質転換された宿主生物が遺伝子ＧＰＤ１及びＧＰＰ２を含んでなる形 質転換カセットで形質転換されたクレブシエラ種である請求の範囲１の方法。 ８． 炭素源がグルコースである請求の範囲１の方法。 ９． グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子が 配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対応す る遺伝子よりなる群から選択され、それらのアミノ酸配列がグリセロール−３− リン酸デヒドロゲナーゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を 包含する請求の範囲１の方法。 １０． グリセロール−３−ホスファターゼ酵素をコードする遺伝子が配列番 号３３及び配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対応する遺伝子よりなる群か ら選択され、それらのアミノ酸配列がグリセロール−３−ホスファターゼ酵素の 機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する請求の範囲１の方法。 １１． グリセロール−３−ホスファターゼ活性をコードする遺伝子が配列番 号１８に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロールキナーゼ酵素であり、そ のアミノ酸配列がグリセロールキナーゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠 失または付加を包含する請求の範囲１の方法。 １２． デヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子がｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２及 びｄｈａＢ３を含んでなり、それらの遺伝子がそれぞれ配列番号３４、配列番号 ３５及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列に対応し、それらのアミノ酸配列 がデヒドラターゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含す る請求の範囲１の方法。 １３． １，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ酵素をコー ドする遺伝子が配列番号３７に示されるアミノ酸配列に対応し、そのアミノ酸配 列が１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ酵素の機能を変えないアミ ノ酸置換、欠失または付加を包含する請求の範囲１の方法。 １４． （ａ）（１）配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対応するグリセ ロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子； （２）配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対応するグリセ ロール−３−ホスファターゼ酵素をコードする遺伝子； （３）配列番号３４に示されるアミノ酸配列に対応するグリセ ロールデヒドラターゼ酵素のα−サブユニットをコードする遺伝子； を含んでなる遺伝子の群 を含んでなる形質転換された宿主細胞。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｐ 7/18 //(Ｃ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ヘイニイ，シヤロン・ロレツタ アメリカ合衆国ペンシルベニア州19123フ イラデルフイア・ノースランドルフストリ ート963 (72)発明者 ナガラジヤン，バサンサ アメリカ合衆国デラウエア州19807ウイル ミントン・デイキンソンレイン13 (72)発明者 ネア，ラメシユ・ブイ アメリカ合衆国デラウエア州19809ウイル ミントン・クロイスターロード905―デイ (72)発明者 ナカムラ，チヤールズ・イー アメリカ合衆国デラウエア州19703クレイ モント・マウントバーノンドライブ２ (72)発明者 ペイン，マーク・スコツト アメリカ合衆国デラウエア州19808ウイル ミントン・ニユーエルドライブ2408 (72)発明者 ピカタジオ，スチーブン・ケネス アメリカ合衆国ペンシルベニア州19350ラ ンデンバーグ・メドウウツドレイン17 (72)発明者 デイアズ―トレス，マリア アメリカ合衆国カリフオルニア州94401サ ンマテオ・ノースイー１カミノリールナン バー118 58 (72)発明者 フス，アミイ・クアング―フア アメリカ合衆国カリフオルニア州94065レ ツドウツドシテイ・キールソンサークル 528 (72)発明者 ラロウ，リチヤード・デイ アメリカ合衆国カリフオルニア州94043マ ウンテンビユー・イージイストリート197 エイ (72)発明者 トリンバー，ドナルド・イー アメリカ合衆国カリフオルニア州94601レ ツドウツドシテイ・オーチヤードアベニユ ー349 (72)発明者 ホワイテド，グレゴリー・エム アメリカ合衆国カリフオルニア州94002ベ ルモント・サウスロード304

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ｉ）（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性をコード する遺伝子； （ｂ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性をコードする遺伝 子： （ｃ）デヒドラターゼ活性をコードする遺伝子； （ｄ）１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性をコ ードする遺伝子 の少なくとも１つを含んでなる形質転換カセットで適当な宿主生物を形質転換し 、ただし、形質転換カセットが全てより少ない（ａ）−（ｄ）の遺伝子を含んで なる場合には、適当な宿主生物が内因性遺伝子を含んでなり、それにより得られ る形質転換された宿主生物が少なくとも１つの各々の遺伝子（ａ）−（ｄ）を含 んでなり； （ii）形質転換された宿主生物を単糖、オリゴ糖、多糖または１炭素基 質よりなる群から選択された少なくとも１つの炭素源の存在下で適当な条件下で 培養し、それにより１，３−プロパンジオールが生成され；そして （iii）１，３−プロパンジオールを回収すること 含んでなる組み換え生物からの１，３−プロパンジオールの生産方法。 ２． 形質転換カセットが遺伝子（ａ）−（ｄ）の全てを含んでなる請求の範 囲１の方法。 ３． 適当な宿主生物がバクテリア、酵母及び糸状菌よりなる群から選択され る請求の範囲１の方法。 ４． 適当な宿主生物がシトロバクター、エンテロバクター、クロス トリジウム、クレブシエラ、エロバクター、ラクトバシラス、アスペルギルス、 サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ザイゴサッカロミセス、ピチア、クルイ ベロミセス、カンジダ、ハンセヌラ、デバリオミセス、ムコール、トルロプシス 、メチロバクター、エシェリキア、サルモネラ、バシラス、ストレプトミセス及 びシュードモナスよりなる属の群から選択される請求の範囲３の方法。 ５． 適当な宿主生物がエシェリキア・コリ、クレブシエラ種及びサッカロミ セス種よりなる群から選択される請求の範囲４の方法。 ６． 形質転換された宿主生物が遺伝子ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３ 及びｄｈａＴを含んでなる形質転換カセットで形質転換されたサッカロミセス種 であり、その場合にそれらの遺伝子がサッカロミセス種ゲノム中に安定に組込ま れる請求の範囲１の方法。 ７． 形質転換された宿主生物が遺伝子ＧＰＤ１及びＧＰＰ２を含んでなる形 質転換カセットで形質転換されたクレブシエラ種である請求の範囲１の方法。 ８． 炭素源がグルコースである請求の範囲１の方法。 ９． グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子が 配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対応す る遺伝子よりなる群から選択され、それらのアミノ酸配列がグリセロール−３− リン酸デヒドロゲナーゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を 包含する請求の範囲１の方法。 １０． グリセロール−３−ホスファターゼ酵素をコードする遺伝子が配列番 号３３及び配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対応する遺伝子よりなる群か ら選択され、それらのアミノ酸配列がグリセロール− ３−ホスファターゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含 する請求の範囲１の方法。 １１． グリセロールキナーゼ酵素をコードする遺伝子が配列番号１８に示さ れるアミノ酸配列に対応し、そのアミノ酸配列がグリセロールキナーゼ酵素の機 能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する請求の範囲１の方法。 １２． デヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子がｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２及 びｄｈａＢ３を含んでなり、それらの遺伝子がそれそれ配列番号３４、配列番号 ３５及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列に対応し、それらのアミノ酸配列 がデヒドラターゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含す る請求の範囲１の方法。 １３． １，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ酵素をコードする遺 伝子が配列番号３７に示されるアミノ酸配列に対応し、そのアミノ酸配列が１， ３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換 、欠失または付加を包含する請求の範囲１の方法。 １４． （ａ）（１）配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対応するグリセ ロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子； （２）配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対応するグリセ ロール−３−ホスファターゼ酵素をコードする遺伝子； （３）配列番号３４に示されるアミノ酸配列に対応するグリセ ロールデヒドラターゼ酵素のα−サブユニットをコードする遺伝子； （４）配列番号３５に示されるアミノ酸配列に対応するグリセ ロールデヒドラターゼ酵素のβ−サブユニットをコードする遺伝子； （５）配列番号３６に示されるアミノ酸配列に対応するグリセ ロールデヒドラターゼ酵素のγ−サブユニットをコードする遺伝子；及び （６）配列番号３７に示されるアミノ酸配列に対応する１，３ −プロパンジオールオキシドレダクターゼ酵素をコードする遺伝子、 を含んでなる遺伝子の群、（ａ）（１）−（６）のそれぞれのアミノ酸配列は遺 伝子（１）−（６）の酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包 含する、並びに （ｂ）（ａ）の遺伝子の群で形質転換された宿主細胞で、それにより 形質転換された宿主細胞が単糖、オリゴ糖及び多糖よりなる群からまたは１炭素 基質から選択された少なくとも１つの基質で１，３−プロパンジオールを生産す る、 を含んでなる形質転換された宿主細胞。