DE69736070T2

DE69736070T2 - Rekombinantes Herstellungsverfahren für 1,3-Propandiol

Info

Publication number: DE69736070T2
Application number: DE69736070T
Authority: DE
Inventors: S. Nigel Los Gatos DUNN-COLEMAN; Maria San Mateo DIAZ-TORRES; W. Matthew Belmont CHASE; Donald Redwood City TRIMBUR
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1996-11-13
Filing date: 1997-11-13
Publication date: 2006-12-21
Anticipated expiration: 2017-11-14
Also published as: ATE329034T1; ID21487A; US6136576A; EP0946732A2; JP2001503636A; AU733534B2; WO1998021339A1; IL129722A; IL129722A0; EP0946732B1; BR9714313A; KR20000053213A; CN1239511A; DE69739715D1; CA2269088A1; ES2336858T3; AU5248498A; EP0942989B1; DK0946732T3; EP0942989A1

Description

Verwandte Anmeldungen
Die vorliegende Erfindung ist eine Teilfortführungs-Anmeldung der vorläufigen U.S.-Anmeldung 60/030 601, eingereicht am 13. November 1996, welche hierin in ihrer Gesamtheit einbezogen ist.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie und spezifisch verbesserte Verfahren für die Herstellung von 1,3-Propandiol in Wirtszellen. Insbesondere beschreibt die vorliegende Patentschrift Komponenten von Genclustern, welche mit der 1,3-Propandiol-Herstellung in Wirtszellen assoziiert sind, einschließlich Protein X und Protein 1, Protein 2 und Protein 3. Genauer gesagt, beschreibt die vorliegende Patentschrift die Expression klonierter Gene, welche Protein X, Protein 1, Protein 2 und Protein 3 codieren, entweder getrennt oder gemeinsam, für die gesteigerte Herstellung von 1,3-Propandiol in Wirtszellen.
Hintergrund
1,3-Propandiol ist ein Monomer mit potenzieller Nützlichkeit in der Herstellung von Polyesterfasern und die Herstellung von Polyurethanen und zyklischen Verbindungen.
Eine Vielzahl von chemischen Wegen zu 1,3-Propandiol ist bekannt. Beispielsweise kann Ethylenoxid zu 1,3-Propandiol umgewandelt werden über einem Katalysator in Gegenwart von Phosphin, Wasser, Kohlenmonoxid, Wasserstoff und einer Säure, durch die katalytische Lösungsphasen-Hydratation von Acrolein, gefolgt von Reduktion, oder aus Kohlenwasserstoffen, wie Glycerol, welche in Gegenwart von Kohlenmonoxid und Wasserstoff über Katalysatoren umgesetzt werden, die Atome aus der Gruppe VIII des Periodensystems aufweisen. Obwohl es möglich ist, 1,3-Propandiol durch diese Verfahren zu erzeugen, sind sie kostspielig und erzeugen Abfallströme, welche umweltverschmutzende Stoffe enthalten.
Für über ein Jahrhundert ist es bekannt gewesen, dass 1,3-Propandiol aus der Fermentierung von Glycerol hergestellt werden kann. Es sind Bakterienstämme gefunden worden, die zum Herstellen von 1,3-Propandiol in der Lage sind, beispielsweise in den Gruppen Citrobacter, Clostridium, Enterobacter, Ilyobacter, Klebsiella, Lactobacillus und Pelobacter. In jedem untersuchten Fall wird Glycerol zu 1,3-Propandiol in einer zweistufigen, enzymkatalysierten Reaktionsabfolge umgewandelt. Im ersten Schritt katalysiert eine Dehydratase die Umwandlung von Glycerol zu 3-Hydroxypropionaldehyd (3-HP) und Wasser (Gleichung 1). Im zweiten Schritt wird 3-HP zu 1,3-Propandiol reduziert durch eine NAD⁺-verknüpfte Oxidoreduktase (Gleichung 2). Glycerol^® 3-HP + H₂O (Gleichung 1) 3-HP + NADH + H⁺ ^® 1,3-Propandiol + NAD⁺ (Gleichung 2)
Das 1,3-Propandiol wird nicht weiter verstoffwechselt und akkumuliert sich, als Ergebnis, in einer hohen Konzentration in den Medien. Die Gesamtreaktion verbraucht ein Reduktionsäquivalent in der Form eines Cofaktors, reduziertem b-Nicotinamidadenindinukleotid (NADH), welches zu Nicotinamidadenindinukleotid (NAD⁺) oxidiert wird.
Die Herstellung von 1,3-Propandiol aus Glycerol wird im Allgemeinen unter anaeroben Bedingungen unter Verwendung von Glycerol als der einzigen Kohlenstoffquelle und in Abwesenheit von anderen exogenen Reduktionsäquivalent-Akzeptoren durchgeführt. Unter diesen Bedingungen, zum Beispiel in Stämmen von Citrobacter, Clostridium und Klebsiella, arbeitet ein Parallel-Weg für Glycerol, welcher zuerst die Oxidation von Glycerol zu Dihydroxyaceton (DHA) durch eine NAD⁺- (oder NADP⁺-)verknüpfte Glyceroldehydrogenase beinhaltet (Gleichung 3). Das DHA wird, im Anschluss an Phosphorylierung zu Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) durch eine DHA-Kinase (Gleichung 4), für die Biosynthese und zur Unterstützung von ATP-Erzeugung beispielsweise über Glycolyse verfügbar. Glycerol + NAD⁺ ^® DHA + NADH + H⁺ (Gleichung 3) DHA + ATP^® DHAP + ADP (Gleichung 4)
Im Gegensatz zum 1,3-Propandiol-Weg kann dieser Weg Kohlenstoff und Energie an die Zelle liefern und erzeugt eher NADH, als dieses zu verbrauchen.
In Klebsiella pneumoniae und Citrobacter freundii werden die Gene, codierend die funktionell verknüpften Aktivitäten von Glyceroldehydratase (dhaB), 1,3-Propandiol-Oxidoreduktase (dhaT), Glyceroldehydrogenase (dhaD) und Dihydroxyaceton-Kinase (dhaK), von dem dha-Regulon beinhaltet. Die dha-Regulons aus Citrobacter und Klebsiella sind in Escherichia coli exprimiert worden und von ihnen wurde gezeigt, Glycerol zu 1,3-Propandiol umzuwandeln. Glyceroldehydratase (E.C. 4.2.1.30) und Diol[1,2-Propandiol)-Dehydratase (E.C. 4.2.1.28) sind verwandte aber unterschiedliche Enzyme, welche von unterschiedlichen Genen codiert werden. In Salmonella typhimurium und Klebsiella pneumoniae ist Dioldehydratase mit dem pdu-Operon assoziiert, siehe Bobik, et al., 1992, J. Bacteriol. 174: 2253-2266, und U.S.-Patent 5 633 362. Tobimatsu et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 22352-22357, offenbaren das K.pneumoniae-Gen, codierend Glyceroldehydratase-Protein X, identifiziert als ORF 4; Segfried et al., 1996, J. Bacteriol. 178: 5793-5796, offenbaren das C.freundii-Glyceroldehydratase-Gen, welches Protein X codiert, identifiziert als ORF Z. Tobimatsu et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 7142-7148, offenbaren die Dioldehydratase-Untereinheiten α, β und γ und veranschaulichen die Gegenwart von orf 4. Luers (1997, FEMS Microbiology Letters 154: 337-345) offenbart die Aminosäuresequenz von Protein 1, Protein 2 und Protein 3 von Clostridium pasteurianum.
Biologische Verfahren für die Herstellung von Glycerol sind bekannt. Die überwiegende Mehrheit von Glycerol-Produzenten sind Hefen, aber von einigen Bakterien, anderen Pilzen und Algen ist ebenfalls bekannt, Glycerol herzustellen. Sowohl Bakterien als auch Hefen erzeugen Glycerol durch Umwandeln von Glucose und anderen Kohlenhydraten über den Fructose-1,6-bisphosphat-Weg in der Glycolyse oder durch den Embden-Meyerhof-Parnas-Weg, wohingegen bestimmte Algen gelöstes Kohlendioxid oder Bicarbonat in den Chloroplasten zu den 3-Kohlenstoff-Intermediaten des Calvin-Zyklus umwandeln. In einer Serie von Schritten wird das 3-Kohlenstoff-Intermediat, Phosphoglycerinsäure, zu Glyceraldehyd-3-phosphat umgewandelt, welches leicht zu seinem Keto-Isomer Dihydroxyacetonphosphat und letztendlich zu Glycerol konvertiert werden kann.
In spezifischer Weise synthetisieren die Bakterien Bacillus licheniformis und Lactobacillus lycopersica Glycerol, und eine Glycerol-Herstellung wird in den halotoleranten Algen Dunaliella sp. und Asteromonas gracilis zum Schutz gegen hohe äußere Salzkonzentrationen gefunden (Ben-Amotz et al., Experientia 38, 49-52 (1982)). In ähnlicher Weise synthetisieren verschiedene osmotolerante Hefen Glycerol als eine Schutzmaßnahme. Die meisten Stämme von Saccharomyces erzeugen etwas Glycerol während der alkoholischen Fermentierung, und dies kann physiologisch durch das Anwenden von osmotischen Stress erhöht werden (Albertyn et al., Mol. Cell. Biol. 14, 4135-4144 (1994)). Früher in diesem Jahrhundert wurde die kommerzielle Glycerol-Produktion durch die Verwendung von Saccharomyces-Kulturen erreicht, denen "Lenkungs-Reagenzien", wie Sulfite oder Alkalis, zugegeben wurden. Durch die Bildung eines inaktiven Komplexes blockieren oder inhibieren die Lenkungsmittel die Umwandlung von Acetaldehyd zu Ethanol; somit werden überschüssige Reduktionsäquivalente (NADH) verfügbar für oder "gelenkt" in Richtung auf DHAP für eine Reduktion zur Erzeugung von Glycerol. Dieses Verfahren ist durch die partielle Inhibition des Hefewachstums beschränkt, welche durch die Sulfite zustande kommt. Diese Beschränkung kann teilweise durch die Verwendung von Alkalis überwunden werden, welche überschüssige NADH-Äquivalente durch einen unterschiedlichen Mechanismus erzeugen. In dieser Ausführung initiierten die Alkalis eine Cannizarro-Disproportionierung unter Erhalt von Ethanol und Essigsäure aus zwei Äquivalenten Acetaldehyd.
Das Gen, das Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase (DAR1, GPD1) codieret, ist kloniert und sequenziert worden aus S. diastaticus (Wang et al., J. Bact. 176, 7091-7095 (1994)). Das DAR1-Gen wurde in einen Shuttle-Vektor kloniert und verwendet, um E. coli zu transformieren, wobei die Expression das aktive Enzym herstellte. Wang et al. (siehe oben) erkennen, dass DAR1 durch die zelluläre osmotische Umgebung reguliert wird, schlagen aber nicht vor, wie das Gen verwendet werden könnte, um 1,3-Propandiol-Produktion in einem rekombinanten Organismus zu verstärken.
Andere Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase-Enzyme sind isoliert worden: Zum Beispiel ist sn-Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase kloniert und sequenziert worden aus S. cerevisiae (Larason et al., Mol. Microbiol. 10, 1101, (1993)), und Albertyn et al. (Mol. Cell. Biol. 14, 4135, (1994)) lehren die Klonierung von GPD1, welches eine Glyerol-3-Phosphat-Dehydrogenase codiert, aus S. cerevisiae. Wie Wang et al. (oben) erkennen sowohl Albertyn et al. als auch Larason et al. die Osmo-Sensitivität der Regulierung dieses Gens, aber schlagen nicht vor, wie das Gen in der Herstellung von 1,3-Propandiol in einem rekombinanten Organismus verwendet werden könnte.
Wie bei G3PDH ist Glycerol-3-Phosphatase aus Saccharomyces cerevisiae isoliert worden, und das Protein wurde identifiziert als codiert von den GPP1- und GPP2-Genen (Norbeck et al., J. Biol. Chem. 271, 13875 (1996)). Wie die Gene, welche G3PDH codieren, erscheint es, dass GPP2 osmosensitiv ist.
Obwohl biologische Verfahren sowohl zur Glycerol- als auch 1,3-Propandiol-Produktion bekannt sind, ist es niemals demonstriert worden, dass das gesamte Verfahren durch einen einzelnen rekombinanten Organismus bewerkstelligt werden kann.
Weder die chemischen noch biologischen Verfahren, welche oben für die Herstellung von 1,3-Propandiol beschrieben wurden, sind gut geeignet für eine Produktion im industriellen Maßstab, weil die chemischen Verfahren energieintensiv sind und die biologischen Verfahren das kostspielige Ausgangsmaterial Glycerol erfordern. Ein Verfahren, welches einen niedrigen Energie-Eintrag und ein kostengünstiges Ausgangsmaterial erfordert, wird benötigt. Ein noch wünschenswerteres Verfahren würde einen Mikroorganismus beteiligen, welcher die Fähigkeit hätte, grundlegende Kohlenstoffquellen, wie Kohlenhydrate oder Zucker, in das gewünschte 1,3-Propandiol-Endprodukt umzuwandeln.
Obgleich eine Einzelorganismus-Umwandlung von fermentierbarer Kohlenstoffquelle, die von Glycerol oder Dihydroxyaceton verschieden ist, zu 1,3-Propandiol wünschenswert wäre, ist es dokumentiert worden, dass man bei einem solchen Unternehmen signifikante Schwierigkeiten zu überwinden hat. Zum Beispiel lehren Gottschalk et al. ( EP 373 230 ), dass das Wachstum der meisten, für die Produktion von 1,3-Propandiol nützlichen Stämme, einschließlich Citrobacter freundii, Clostridium autobutylicum, Clostridium butylicum und Klebsiella pneumoniae, von der Gegenwart eines Wasserstoffdonors, wie Fructose oder Glucose, gestört wird. Stämme von Lactobacillus brevis und Lactobacillus buchner, welche 1,3-Propandiol in Co-Fermentationen von Glycerol und Fructose oder Glucose herstellen, wachsen nicht, wenn Glycerol als die einzige Kohlenstoffquelle bereitgestellt wird, und, obwohl es gezeigt worden ist, dass ruhende Zellen Glucose oder Fructose metabolisieren können, erzeugen sie nicht 1,3-Propandiol (Veiga DA Cunha et al., J. Bacteriol. 174, 1013 (1992)). In ähnlicher Weise ist es gezeigt worden, dass ein Stamm von Ilyobacter polytropus, welcher 1,3-Propandiol herstellt, wenn Glycerol und Acetat bereitgestellt werden, nicht 1,3-Propandiol aus anderen Kohlenstoffquellen als Glyerol hertellen wird, wobei Fructose und Glucose eingeschlossen sind (Steib et al., Arch. Microbiol. 140, 139 (1984)). Schließlich haben Tong et al. (Appl. Biochem. Biotech. 34, 149 (1992)) gelehrt, dass rekombinanter Escherichia coli, welcher mit dem Glycerol-Dehydratase codierenden dha-Regulon transformiert ist, 1,3-Propandiol weder aus Glucose noch Xylose in Abwesenheit von exogenem Glycerol herstellt.
Bestrebungen, die Ausbeute an 1,3-Propandiol aus Glycerol zu verbessern, sind berichtet worden, wobei Co-Substrate, fähig zur Bereitstellung von Reduktionsäquivalenten, typischerweise fermentierbare Zucker, in das Verfahren eingeschlossen werden. Verbesserungen in der Ausbeute sind für ruhende Zellen von Citrobacter freundii und Klebsiella pneumoniae DSM 4270 beansprucht worden, welche Glycerol und Glucose co-fermentieren (Gottschalk et al., siehe oben, und Tran-Dinh et al., DE 3734 764 ); jedoch nicht für wachsende Zellen von Klebsiella pneumoniae ATCC 25955, welche Glycerol und Glucose co-fermentieren, welche kein 1,3-Propandiol herstellten (I.-T. Tong, Doktorarbeit, University of Wisconsin-Madison (1992)). Erhöhte Ausbeuten sind für die Co-Fermentation von Glycerol und Glucose oder Fructose durch ein rekombinantes Escherichia coli berichtet worden; allerdings wird kein 1,3-Propandiol in Abwesenheit von Glycerol hergestellt (Tong et al., siehe oben). In diesen Systemen verwenden Einzelorganismen das Kohlenhydrat als eine Quelle zur Erzeugung von NADH, während Energie und Kohlenstoff für Zell-Aufrechterhaltung oder -Wachstum vorgesehen werden. Diese Offenbarungen legen nahe, dass Zucker nicht in den Kohlenstoff-Fluss, welcher 1,3-Propandiol herstellt, eintreten. In keinem Fall wird 1,3-Propandiol in Abwesenheit einer exogenen Quelle für Glycerol hergestellt. Somit legt die Masse der Literatur in deutlicher Weise nahe, dass die Herstellung von 1,3-Propandiol aus einer Kohlenhydratquelle durch einen Einzelorganismus nicht möglich ist.
Die Masse der Literatur in Bezug auf die Rolle von Protein X in der 1,3-Propandiol-Herstellung durch eine Wirtszelle ist bestenfalls verwirrend. Vor der Verfügbarkeit von Gen-Informationen berichteten McGee et al., 1982, Biochem. Biophys. Res. Comm. 108: 547-551, dass Dioldehydratase aus K. pneumoniae ATCC 8724 aus vier Untereinheiten aufgebaut ist, welche durch Größe (60K, 51K, 29K und 15K Dalton) und die N-terminale Aminosäuresequenz identifiziert werden. Im direkten Gegensatz zu McGee berichten Tobimatsu et al. 1995, siehe oben, die Klonierung, Sequenzierung und Expression von Dioldehydratase aus demselben Organismus und finden keinen Beweis, welcher das 51K-Dalton-Polypeptid mit Dehydrase in Verbindung bringt. Tobimatsu et al. 1996, siehe oben, folgern, dass das Protein X-Polypetid nicht eine Untereinheit von Glyceroldehydratase ist, im Gegensatz zu Genbank-Zugangsnummer U30903, worin Protein X als eine große Untereinheit von Glyceroldehydratase beschrieben wird. Seyfried et al., siehe oben, berichten, dass eine Deletion von 192 bp von dem 3'-Ende von orfZ (Protein X) keinen Effekt auf Enzymaktivität aufwies, und folgern, dass orfZ nicht eine Untereinheit codiert, welche für Dehydrataseaktivität erforderlich ist. Schließlich offenbaren Skraly, F. A. (1997, Dissertation mit dem Titel "Metabolic Engineering of an Improved 1,3-Propandiol Fermentation") einen Verlust an Glyceroldehydratase-Aktivität in einem Experiment, worin rekombinantes ORF3 (Protein X) unter Erzeugung eines großen Fusionsproteins disruptiert wurde, jedoch nicht in einem anderen Experiment, worin 1,3-Propandiol-Herstellung aus Glycerol im Vergleich zu einer Kontrolle, worin ORF3 intakt war, vermindert war.
Das von der vorliegenden Erfindung zu lösende Problem ist die biologische Herstellung von 1,3-Propandiol durch einen einzelnen rekombinanten Organismus aus einem kostengünstigen Kohlenstoffsubstrat, wie Glucose oder anderen Zuckern, in kommerziell ausführbaren Mengen. Die biologische Herstellung von 1,3-Propandiol erfordert Glycerol als ein Substrat für eine zweistufige sequenzielle Reaktion, in welcher ein Dehydratase-Enzym (typischerweise eine Coenzym B₁₂-abhängige Dehydratase) Glycerol in eine Zwischenstufe, 3-Hydroxypropionaldehyd, umwandelt, welche dann durch eine NADH- (oder NADPH-) abhängige Oxidoreduktase zu 1,3-Propandiol reduziert wird. Die Komplexität der Cofaktor-Anforderungen macht die Verwendung eines Ganzzell-Katalysators für ein industrielles Verfahren notwendig, welches diese Reaktionsabfolge zur Herstellung von 1,3-Propandiol anwendet. Darüber hinaus, wird, um das Verfahren ökonomisch bestandsfähig zu machen, ein kostengünstigeres Einspeisematerial als Glycerol oder Dihydroyaceton benötigt, und hohe Produktionsspiegel sind wünschenswert. Glucose und andere Kohlenhydrate sind geeignete Substrate, aber stören, wie oben erörtert, die 1,3-Propandiol-Produktion. Als ein Ergebnis ist von keinem Einzelorganismus gezeigt worden, Glucose in 1,3-Propandiol umzuwandeln.
Die Anmelder haben das angegebene Problem gelöst, und die vorliegende Erfindung stellt die Biokonvertierung einer fermentierbaren Kohlenstoffquelle direkt zu 1,3-Propandiol unter Verwendung eines einzelnen rekombinanten Organismus bereit. Glucose wird als ein Modellsubstrat verwendet, und die Biokonversion ist auf einen beliebigen existierenden Mikroorganismus anwendbar. Mikroorganismen, welche die Gene beinhalten, codierend Protein X und Protein 1, Protein 2 und Protein 3, zusätzlich zu anderen Proteinen, die mit der Herstellung von 1,3-Propandiol assoziiert sind, sind in der Lage, Glucose und andere Zucker über den Glycerol-Abbauweg zu 1,3-Propandiol bei guten Ausbeuten und Selektivitäten umzuwandeln. Darüber hinaus kann die vorliegende Erfindung im Allgemeinen angewandt werden, um ein beliebiges Kohlenstoffsubstrat einzuschließen, welches leicht umgewandelt wird zu 1) Glycerol, 2) Dihydroxyaceton oder 3) C₃-Verbindungen im Oxidationszustand von Glycerol (z. B. Glycerol-3- Phosphat) oder 4) C₃-Verbindungen im Oxidationszustand von Dihydroxyaceton (z. B. Dihydroxyaceton-Phosphat oder Glyceraldehyd-3-Phosphat).
WO 96/35795 und WO 96/35796 wurden nach dem vorliegend beanspruchten Prioritätsdatum und vor dem Einreichungsdatum der vorliegenden Erfindung veröffentlicht.
WO 96/35795 betrifft ein Verfahren für die Biokonversion von Glycerol zu 1,3-Propandiol, in welchem Gene aus einem Bakterium, welches bekanntermaßen ein Dioldehydratase-Enzym zum 1,2-Propandiol-Abbau besitzt, in einen bakteriellen Wirt kloniert werden, und der Wirt in Gegenwart von Glycerol wachsen gelassen wird; und die Expression der Fremdgene in der Wirtszelle die enzymatische Umwandlung von Glycerol zu 1,3-Propandiol erleichtert, welches dann aus der Kultur isoliert wird.
Die WO 96/35796 betrifft ein Verfahren zur Biokonversion eines Kohlenstoffsubstrats zu 1,3-Propandiol durch einen einzelnen Organismus, welches Mikroorganismen verwendet, welche die Gene enthalten, die ein aktives Glycerol- oder Diol-Dehydratase-Enzym codieren. Das Verfahren umfasst das Kontaktieren dieser Organismen mit einem Kohlenstoffsubstrat unter den passenden Fermentationsbedingungen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Verfahren für die Herstellung von 1,3-Propandiol aus einem einzelnen Mikroorganismus. Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der unerwarteten Feststellung, dass die Gegenwart eines Gens, welches Protein X codiert, in einem Mikroorganismus, der mindestens ein Gen, das eine Dehydratase-Aktivität codiert, enthält und zum Produzieren von 1,3-Propandiol in der Lage ist, mit der in vivo-Reaktivierung von Dehydratase-Aktivität und erhöhter Produktion von 1,3-Propandiol in dem Mikroorganismus assoziiert ist. Die vorliegende Erfindung basiert, zum Teil, ebenfalls auf der unerwarteten Feststellung, dass die Gegenwart eines Protein X codierenden Gens und mindestens eines Gens, welches ein Protein codiert, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Protein 1, Protein 2 und Protein 3, in Wirtszellen, welche mindestens ein Gen enthalten, welches eine Dehydratase-Aktivität codiert, und zum Produzieren von 1,3-Propandiol in der Lage sind, mit einer in vivo-Reaktivierung der Dehydratase-Aktivität und gesteigerten Ausbeuten an 1,3-Propandiol in dem Mikroorganismus assoziiert ist.
Folglich sieht die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren für die Herstellung von 1,3-Propandiol aus einem Mikroorganismus vor, der zur Herstellung von 1,3-Propandiol in der Lage ist, wie in Patentanspruch 1 dargestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren für die verbesserte Herstellung von 1,3-Propandiol ferner das Einbringen mindestens eines Gens, codierend ein Protein, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Protein 1, Protein 2 und Protein 3, in den Organismus, wie dargestellt in Patentanspruch 2. Der Mikroorganismus kann ferner mindestens eines von (a) einem Gen, welches eine Glycerol-3-Phoshat-Dehydrogenase-Aktivität codiert; (b) einem Gen, das eine Glycerol-3-Phosphatase-Aktivität codiert; und (c) einem Gen, das 1,3-Propandiol-Oxidoreduktaseaktivität codiert, in dem Mikroorganismus umfassen. Gen(e), codierend eine Dehydratase-Aktivität, Protein X, Proteine 1, 2 oder 3, oder andere Gene, welche notwendig für die Herstellung von 1,3-Propandiol sind, können stabil in dem Wirtszellengenom beibehalten werden oder auf replizierenden Plasmiden, die sich im Wirtsmikroorganismus befinden, vorliegen.
Das Verfahren umfasst den Schritt der Gewinnung des 1,3-Propandiols. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Kohlenstoffquelle um Glucose.
Der Mikroorganismus wird gegebenenfalls gewählt aus der Gruppe von Gattungen, welche aus Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacer, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces und Pseudomonas besteht.
In einem Aspekt wird Protein X aus einem Glyceroldehydratase-Gencluster abgeleitet, und in einem anderen Aspekt wird Protein X aus einem Dioldehydratase-Gencluster abgeleitet. Das die Dehydratase-Aktivität codierende Gen kann bezüglich des Mikroorganismus homolog oder bezüglich des Mikroorganismus heterolog sein. In einer Ausführungsform wird der Glyceroldehydratase-Gencluster aus einem Mikroorganismus abgeleitet, welcher gewählt wird aus den Gattungen, bestehend aus Klebsiella und Citrobacter. In einer anderen Ausführungsform wird der Dioldehydratase-Gencluster aus einem Organismus abgeleitet, der aus den Gattungen gewählt wird, welche aus Klebsiella, Clostridium und Salmonella bestehen.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen rekombinanten Mikroorganismus bereit, wie dargelegt in Patentanspruch 21. In einer anderen Ausführungsform umfasst der rekombinante Mikroorganismus ferner mindestens ein Gen, das ein Protein codiert, welches gewählt wird aus der Gruppe, die aus Protein 1, Protein 2 und Protein 3 besteht, wie dargestellt in Anspruch 22. Der Mikroorganismus wird gegebenenfalls aus der Gruppe gewählt, die aus Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacer, Lactobacillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces und Pseudomonas besteht. In einem Aspekt wird Protein X aus einem Glyceroldehydratase-Gencluster abgeleitet. In einem anderen Aspekt wird Protein X aus einem Dioldehydratase-Gencluster abgeleitet. In einem Aspekt ist die Dehydratase-Aktivität bezüglich des Mikroorganismus heterolog, und in einem anderen Aspekt ist die Dehydratase-Aktivität bezüglich des Mikroorganismus homolog.
Die vorliegende Erfindung sieht ebenfalls ein Verfahren für die Verlängerung der Halbwertszeit von Glycerol- oder Dioldehydratase-Aktivität vor, wie dargestellt in Anspruch 36. Der Mikroorganismus wird gegebenenfalls gewählt aus der Gruppe, welche aus Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces und Pseudomonas besteht.
In einem Aspekt ist das Gen, welches die Dehydratase-Aktivität codiert, bezüglich des Mikroorganismus heterolog, und in einem anderen Aspekt ist das Gen, welches die Dehydratase-Aktivität codiert, bezüglich des Mikroorganismus homolog. In einer Ausführungsform wird das Gen, welches Protein X codiert, aus einem Glyceroldehydratase-Gencluster abgeleitet, und in einer anderen Ausführungsform wird das Gen, welches Protein X codiert, aus einem Dioldehydratase-Gencluster abgeleitet.
Die vorliegende Patentschrift stellt des Weiteren Expressionsvektoren und Wirtszellen, enthaltend Gene, welche Protein X, Protein 1, Protein 2 und Protein 3 codieren, bereit.
Ein Vorteil des Verfahrens zur Herstellung von 1,3-Propandiol gemäß der vorliegenden Erfindung ist die unerwartete erhöhte Produktion von 1,3-Propandiol in einer Wirtszelle, welche fähig ist, 1,3-Propandiol herzustellen, in Gegenwart von Protein X codierender Nukleinsäure im Vergleich zu der Wirtszelle, welcher Protein X codierende Nukleinsäure fehlt. Wie nachstehend aufgezeigt, ist eine Wirtszelle, die Nukleinsäure enthält, codierend dhaB 1, 2 und 3 sowie Protein X, in der Lage, signifikant mehr 1,3-Propandiol herzustellen, als eine Wirtszelle, die Nukleinsäure enthält, welche dhaB 1, 2 und 3 codiert und welcher X fehlt.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung, wie nachstehend aufgezeigt, ist, dass die Gegenwart von Nukleinsäure, welche Protein X codiert, zusammen mit Nukleinsäure, welche mindestens eines von Protein 1, Protein 2 und Protein 3 codiert, in einer Wirtszelle, die zur Herstellung von 1,3-Propandiol in der Lage ist, das unerwartete Ergebnis einer erhöhten Herstellung von 1,3-Propandiol in der Wirtszelle gegenüber der 1,3-Propandiol-Herstellung in der Wirtszelle ohne Protein X codierende Nukleinsäure neben Nukleinsäure, welche mindestens eines von Protein 1, Protein 2 und Protein 3 codiert, ergibt.
Noch ein anderer Vorteil des Herstellungsverfahrens der vorliegenden Erfindung, wie nachstehend gezeigt, ist die in vivo-Reaktivierung der Dehydratase-Aktivität in einem Mikroorganismus, welche mit der Gegenwart von Nukleinsäure, welche Protein X codiert, in dem Mikroorganismus assoziiert ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 veranschaulicht Komponenten des Glyceroldehydratase-Genclusters aus Klebsiella pneumoniae auf Plasmid pHK28-26 (SEQ ID NR. 19). In dieser Figur codiert orfY für Protein 1, orfX codiert Protein 2 und orfW codiert Protein 3. DhaB-X bezieht sich auf Protein X.
Die 2A-2G veranschaulichen die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von Klebsiella pneumoniae-Glyceroldehydratase-Protein X (dhab4) (SEQ ID NR.: 59).
Die 3 veranschaulicht die Aminosäure-Alignierung von Klebsiella pneumonia-Protein 1 (SEQ ID NR.: 61) und Citrobacter freundii-Protein 1 (SEQ ID NR.: 60) (in 3 bezeichnet als orfY).
Die 4 veranschaulicht die Aminiosäure-Alignierung von Klebsiella pneumonia-Protein 2 (SEQ ID NR.: 63) und Citrobacter freundii-Protein 2 (SEQ ID NR.: 62) (in 4 bezeichnet als orfX).
Die 5 veranschaulicht die Aminiosäure-Alignierung von Klebsiella pneumonia-Protein 3 (SEQ ID NR.: 64) und Citrobacter freundii-Protein 3 (SEQ ID NR.: 65) (in 5 bezeichnet als orfW).
Die 6 veranschaulicht den in situ-Reaktivierungsvergleich von Plasmiden pHK28-26 (welches dhaB-Untereinheiten 1, 2 und 3 sowie Protein X und die offenen Leserahmen, welche Protein 1, Protein 2 und Protein 3 codieren, enthält) gegenüber pDT24 (welches dhaB-Untereinheiten 1, 2 und 3 sowie Protein X enthält) in E. coli-DH5α-Zellen.
Die 7 veranschaulicht den in situ-Reaktivierungsvergleich von Plasmiden pM7 (enthaltend Gene, welche dhaB-Untereinheiten 1, 2 und 3 sowie Protein X codieren) gegenüber Plasmid pM11 (enthaltend Gene, welche dhaB-Untereinheiten 1, 2 und 3 codieren) in E. coli-DH5α-Zellen.
Die 8A-8E veranschaulichen die Nukleinsäure- (SEQ ID NR.: 66) und Aminosäure-Sequenz (SEQ ID NR.: 67) von K. pneumoniae-Dioldehydratase-Gencluster-Protein X.
Die 9 veranschaulicht eine standardmäßige 10-Liter-Fermentation zur 1,3-Propandiol-Herstellung unter Verwendung von E. coli FMS/pDT24 (FM5 wird beschrieben im Amgen-Patent US 5 494 816 , ATCC-Zugangsnummer 53911).
Die 10 veranschaulicht eine standardmäßige 10-Liter-Fermentation zur 1,3-Propandiol-Herstellung unter Verwendung von E. coli DH5alpha/pHK28-26.
Kurze Beschreibung von biologischen Hinterlegungen und Seguenzauflistung
Der transformierte E. coli W2042 (umfassend den E. coli-Wirt W1485 und Plasmide pDT20 und pAH42), enthaltend die Gene, welche Glycerol-3-Phosphatdehydrogenase (G3PDH) und Glycerol-3-Phosphatase (G3P-Phosphatase), Glyceroldehydratase (dhaB) sowie 1,3-Propandiol-Oxidoreduktase (dhaT) codieren, wurde am 26. September 1996 bei der ATCC unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke des Patentverfahrens hinterlegt und wird als ATCC 98188 bezeichnet.
S. cerevisiae YPH500, beinhaltend die Plasmide pMCK10, pMCK17, pMCK30 und pMCK35, enthaltend Gene, welche Glycerol-3-Phoshatdehydrogenase (G3PDH) und Glycerol-3-Phosphatase (G3P-Phosphatase), Glyceroldehydratase (dhaB) sowie 1,3-Propandiol-Oxidoreduktase (dhaT) codieren, wurde am 26. September 1996 bei der ATCC gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke des Patentverfahrens hinterlegt und wird als ATCC 74392 bezeichnet.
E. coli DH5α, enthaltend pKP1, welches etwa 35 kb eines Klebsiella-Genoms aufweist, das die Glyceroldehydratase, Protein X und Proteine 1, 2 und 3 enthält, wurde am 18. April 1995 bei der ATCC unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages hinterlegt und wurde als ATCC 69789 bezeichnet. E. Coli-DH5α, enthaltend pKP4, welches einen Abschnitt des Klebsiella-Genoms enthält, welcher Dioldehydratase-Enzym, einschließlich Protein X, codiert, wurde am 18. April 1995 bei der ATCC unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt und wurde als ATCC 69790 bezeichnet.
"ATCC" bezieht sich auf die Internationale Hinterlegungsstelle "American Type Culture Collection", welche unter 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA, ansässig ist. Die Bezeichnungen beziehen sich auf die Zugangsnummer des hinterlegten Materials.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von 1,3-Propandiol in einem einzelnen Mikroorganismus und sieht verbesserte Verfahren für die Herstellung von 1,3-Propandiol aus einer fermentierbaren Kohlenstoffquelle in einem einzelnen rekombinanten Organismus vor. Das Verfahren beinhaltet einen Mikroorganismus, der in der Lage ist, 1,3-Propandiol herzustellen, umfassend entweder homologe oder heterologe Gene, welche Dehydratase (dhaB) codieren, mindestens ein Gen, welches Protein X codiert, und gegebenenfalls mindestens eines der Gene, welche ein Protein codieren, das aus der Gruppe gewählt wird, die aus Protein 1, Protein 2 und Protein 3 besteht. Gegebenenfalls enthält der Mikroorganismus mindestens ein Gen, welches Glycerol-3-Phoshat-Dehydrogenase, Glycerol-3-Phosphatase und 1,3-Propandiol-Oxidoreduktase (dhaT) codiert. Der rekombinante Mikroorganismus wird mit einem Kohlenstoffsubstrat in Kontakt gebracht, und 1,3-Propandiol wird aus den Wachstumsmedien isoliert.
Das vorliegende Verfahren sieht eine schnelle, kostengünstige und hinsichtlich der Umwelt verantwortungsbewusste Quelle von 1,3-Propandiol-Monomer vor, welches in der Produktion von Polyestern und anderen Polymeren brauchbar ist.
Die folgenden Definitionen sollen verwendet werden, um die Patentansprüche und die Beschreibung zu interpretieren.
Der Ausdruck "Dehydratase-Gencluster" oder "Gen-Cluster" bezieht sich auf den Satz von Genen, welche mit 1,3-Propandiol-Produktion in einer Wirtszelle assoziiert sind, und umfasst beabsichtigtermaßen Glyceroldehydratase-Gencluster sowie Dioldehydratase-Gencluster. Das dha-Regulon bezieht sich auf einen Glyceroldehydratase-Gencluster, wie veranschaulicht in der 1, welcher regulatorische Regionen einschließt.
Der Ausdruck "Regenerieren der Dehydratase-Aktivität" oder "Reaktivieren der Dehydratase-Aktivität" bezieht sich auf das Phänomen der Umwandlung einer Dehydratase, welche nicht zur Katalyse eines Substrates in der Lage ist, zu einer solchen, welche zur Katalyse eines Substrates in der Lage ist, oder auf das Phänomen der Inhibierung der Inaktivierung einer Dehydratase oder das Phänomen der Verlängerung der brauchbaren Halbwertszeit des Dehydratase-Enzyms in vivo.
Die Ausdrücke "Glyceroldehydratase" oder "Dehydratase-Enzym" oder "Dehydratase-Aktivität" beziehen sich auf die Polypeptid(e), verantwortlich für eine Enzymaktivität, welche in der Lage ist, ein Glycerolmolekül zu dem Produkt, 3-Hydroxypropionaldehyd, zu isomerisieren oder umzuwandeln. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung schließen die Dehydratase-Enzyme eine Glyceroldehydratase (GenBank U09771, U30903) und eine Dioldehydratase (GenBank D45071) ein, welche die bevorzugten Substrate Glycerol bzw. 1,2-Propandiol aufweisen.
Glyceroldehydratase von K. pneumoniae ATCC 25955 wird von den Genen dhaB1, dhaB2 und dhaB3 codiert, welche als SEQ ID NR.: 1, 2 bzw. 3 identifiziert sind. Die Gene dhaB1, dhaB2 und dhaB3 codieren die a-, b- bzw. c-Untereinheiten des Glyceroldehydratase-Enzyms.
Der Ausdruck "Protein X eines Dehydratase-Genclusters" oder "dhaB-Protein X" oder "Protein X" bezieht sich auf ein Protein, welches vergleichbar ist zu Protein X des Klebsiella pneumoniae-Dehydratase-Genclusters, wie gezeigt in 2, oder alternativ dazu vergleichbar ist zu Protein X von Klebsiella pneumoniae-Dioldehydratase-Gencluster, wie gezeigt in der 8. Vorzugsweise ist Protein X in der Lage, die Herstellung von 1,3-Propandiol in einem Wirtsorganismus gegenüber der Herstellung von 1,3-Propandiol in Abwesenheit von Protein X in dem Wirtsorganismus zu erhöhen. 'Vergleichbar sein' bedeutet, dass DNA, welche das Protein codiert, entweder in derselben strukturellen Lokalisierung wie Klebsiella-Protein X codierende DNA in Bezug auf Klebsiella-dhaB1, -dhaB2 und -dhaB3 vorliegt, d.h. Protein X codierende DNA liegt 3' zu dhaB1-B3 codierender Nukleinsäure, oder dass Protein X eine insgesamte Aminosäureähnlichkeit entweder zu Klebsiella-Diol- oder Glycerol-Dehydratase-Protein X aufweist. Die vorliegende Erfindung umfasst Protein-X-Moleküle, welche wenigstens 90 % oder wenigstens 95 % Ähnlichkeit zu dem Protein X von Glycerol- oder Dioldehydratase von K.pneumoniae oder zu dem Protein X von C. freundii aufweisen.
Eingeschlossen innerhalb des Ausdrucks "Protein X" ist Protein X, ebenfalls bezeichnet als ORF Z, aus dem Citrobacter-dha-Regulon (Segfried, M., 1996, J. Bacteriol. 178: 5793:5796). Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Aminosäurevariationen von Protein X, wie definiert in den Patentansprüchen, aus jedwedem Mikroorganismus, solange die Protein-X-Variante ihre essentiellen funktionellen Charakteristika der Erhöhung der Produktion von 1,3-Propandiol in einem Wirtsorganismus gegenüber der Produktion von 1,3-Propandiol in dem Wirtsorganismus in Abwesenheit von Protein X beibehält.
Ein Teil des Klebsiella-Genoms, codierend die Glyceroldehydratase-Enzym-Aktivität sowie Protein X, wurde in E. coli transformiert, und der transformierte E. coli wurde am 18. April 1995 bei der ATCC unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages hinterlegt und wurde als ATCC-Zugangsnummer 69789 bezeichnet. Ein Teil des Klebsiella-Genoms, codierend die Dioldehydratase-Enzym-Aktivität sowie Protein X, wurde in E. coli transformiert, und der transformierte E. coli wurde am 18. April 1995 bei der ATCC unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt und wurde als ATCC-Zugangsnummer 69790 bezeichnet.
Klebsiella-Glyceroldehydratase-Protein X findet sich an den Basen 9749-11572 von SEQ ID NR.: 19, wobei die erste Base von dhaK als Position Nummer 1 gezählt wird. Citrobacter freudii(ATCC-Zugangsnummer CFU09771)-Nukleinsäure, welche Protein X codiert, wird zwischen den Positionen 11261 und 13072 gefunden.
Die vorliegende Erfindung umfasst Gene, welche Dehydratase-Protein X codieren, welche rekombinant eingeführt werden und auf einem Plasmid im Wirtsorganismus replizieren, sowie Gene, welche stabil im Wirtsgenom beibehalten werden. Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren für die gesteigerte Produktion von 1,3-Propandiol, worin das Protein X codierende Gen in eine Wirtszelle transformiert wird, gemeinsam mit Genen, welche die Dehydratase-Aktivität codieren, und/oder anderen Genen, welche für die Herstellung von 1,3-Propandiol notwendig sind, wie definiert in den Ansprüchen.
Die Begriffe "Protein 1", "Protein 2" und "Protein 3" beziehen sich auf die Proteine, welche in einem Mikroorganismus codiert werden, welche vergleichbar sind zu Protein 1 (SEQ ID NR.: 60 oder SEQ ID NR.: 61) (ebenfalls bezeichnet als orfY), Protein 2 (SEQ ID NR.: 62 oder SEQ ID NR.: 63) (ebenfalls bezeichnet als orfX) bzw. Protein 3 (SEQ ID NR.: 64 oder SEQ ID NR.: 65) (ebenfalls bezeichnet als orfW).
Vorzugsweise ist, in Gegenwart von Protein X, mindestens eines von den Proteinen 1, 2 und 3 in der Lage zur Erhöhung der Produktion von 1,3-Propandiol in einem Wirtsorganismus gegenüber der Produktion von 1,3-Propandiol in Abwesenheit von Protein X und mindestens einem der Proteine 1, 2 und 3 in dem Wirtsorganismus. 'Vergleichbar sein' bedeutet, dass DNA, codierend das Protein, entweder in derselben strukturellen Lokalisierung ist wie DNA, codierend die jeweiligen Proteine, wie gezeigt in 1, oder dass die jeweiligen Proteine eine insgesamte Aminosäureähnlichkeit zu den jeweiligen SEQ ID-Nummern aufweisen, welche in den 3, 4 und 5 gezeigt sind.
Die vorliegende Erfindung umfasst Protein-1-Moleküle mit mindestens 90 % oder mindestens 95 % Ähnlichkeit zu SEQ ID NR.: 60 oder SEQ ID NR.: 61. Die vorliegende Erfindung umfasst Protein-2-Moleküle mit wenigstens 90 % oder wenigstens 95 % Ähnlichkeit zu SEQ ID NR.: 62 oder SEQ ID NR.: 63. Die vorliegende Erfindung umfasst Protein-3-Moleküle mit wenigstens 90 % oder wenigstens 95 % Ähnlichkeit zu SEQ ID NR.: 64 oder SEQ ID NR.: 65.
Eingeschlossen innerhalb der Begriffe "Protein 1 ", "Protein 2" bzw. "Protein 3" sind orfY, orfX und orfW aus Clostridium pasteurianum (Luers et al., siehe oben). Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Aminosäurevariationen der Proteine 1, 2, 3, wie definiert in den Ansprüchen, aus einem beliebigen Mikroorganismus, solange die Proteinvariante, in Kombination mit Protein X, ihre wesentlichen funktionellen Charakteristika der Erhöhung der Produktion von 1,3-Propandiol in einem Wirtsorganismus gegenüber der Produktion von 1,3-Propandiol in den Wirtsorganismus in ihrer Abwesenheit beibehält.
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren für die gesteigerte Produktion von 1,3-Propandiol, wobei die Gen(e), codierend mindestens eines von Protein 1, Protein 2 und Protein 3, in eine Wirtszelle transformiert wird/werden, gemeinsam mit Genen, welche Protein X, die Dehydratase-Aktivität codieren, und/oder anderen Genen, welche für die Produktion von 1,3-Propandiol notwendig sind, wie definiert in den Ansprüchen. Die Gen(e), codierend mindestens eines von Proteinen 1, 2 und 3, Protein X, Dehydratase-Aktivität, und/oder andere Gene können auf denselben oder unterschiedlichen Expressionskassetten vorliegen. Alternativ dazu können die Gen(e), codierend mindestens eines von Proteinen 1, 2 und 3, separat transformiert werden, entweder vor oder nach Genen, welche die Dehydratase-Aktivität und/oder andere Aktivitäten codieren. Die vorliegende Erfindung umfasst eine Wirtszelle mit endogener Nukleinsäure, codierend Protein 1, Protein 2 oder Protein 3, sowie eine Wirtszelle, welcher endogene Nukleinsäure, die die Proteine codiert, fehlt.
Die Begriffe "Oxidoreduktase" oder "1,3-Propandiol-Oxidoreduktase" beziehen sich auf die Polypeptid(e), verantwortlich für eine Enzymaktivität, welche zum Katalysieren der Reduktion von 3-Hydroxypropionaldehyd zu 1,3-Propandiol in der Lage ist. 1,3-Propandiol-Oxidoreduktase schließt beispielsweise das Polypeptid ein, welches von dem dhaT-Gen codiert wird (GenBank U09771, U30903) und welches als SEQ ID NR.: 4 identifiziert wird.
Die Ausdrücke "Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase" oder "G3PDH" beziehen sich auf die Polypeptid(e), verantwortlich für eine Enzymaktivität, welche zum Katalysieren der Umwandlung von Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) zu Glycerol-3-Phosphat (G3P) in der Lage ist. In vivo kann G3PDH NADH-, NADPH- oder FAD-abhängig sein. Beispiele dieser Enzymaktivität schließen die Folgenden ein: NADH-abhängige Enzyme (EC 1.1.1.8) werden von mehreren Genen codiert, einschließlich GPD1 (GenBank Z74071 × 2) oder GPD2 (GenBank Z35169 × 1) oder GPD3 (GenBank G984182) oder DAR1 (GenBank Z74071 × 2); ein NADPH-abhängiges Enzym (EC 1.1.1.94) wird codiert von gpsA (GenBank U32164, G466746 (cds 197911-196892) und L45246); und FAD-abhängige Enzyme (EC 1.1.99.5) werden codiert von GUT2 (GenBank Z47047 × 23) oder glpD (GenBank G147838) oder glpABC (GenBank M20938).
Die Ausdrücke "Glycerol-3-Phosphatase" oder "sn-Glycerol-3-Phosphatase" oder "d,l-Glycerolphosphatase" oder "G3P-Phosphatase" beziehen sich auf die Polypeptid(e), verantwortlich für eine Enzymaktivität, welche zum Katalysieren der Umwandlung von Glycerol-3-Phosphat zu Glycerol in der Lage ist. Die 3P-Phosphatasen schließen beispielsweise die Polypeptide ein, welche von GPP1 (GenBank Z47047 × 125) oder GPP2 (GenBank U18813 × 11) codiert werden.
Der Begriff "Glycerolkinase" bezieht sich auf die Polypeptid(e), verantwortlich für eine Enzymaktivität, fähig zum Katalysieren der Umwandlung von Glycerol zu Glycerol-3-Phosphat oder von Glycerol-3-Phosphat zu Glycerol, abhängig von den Reaktionsbedingungen. Glycerolkinase schließt, zum Beispiel, das Polypeptid ein, welches von GUT1 (GenBank U11583 × 19) codiert wird.
Die Ausdrücke "GPD1", "DAR1", "OSG1", "D2830" und "YDL022W" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Gen, welches eine cytosolische Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase codiert und charakterisiert ist durch die Basenequenz, welche als SEQ ID NR.: 5 angegeben ist.
Der Begriff "GPD2" bezieht sich auf ein Gen, welches eine cytosolische Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase codiert und gekennzeichnet ist durch die Basensequenz, welche als SEQ ID NR.: 6 angegeben ist.
Die Ausdrücke "GUT2" und "YIL155C" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Gen, welches eine mitochrondriale Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase codiert und gekennzeichnet ist durch die Basensequenz, welche in SEQ ID NR.: 7 angegeben ist.
Die Ausdrücke "GPP1 ", "RHR2" und "YIL053W" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Gen, welches eine cytosolische Glycerol-3-Phosphatase codiert und gekennzeichnet ist durch die Basensequenz, welche als SEQ ID NR.: 8 angegeben ist.
Die Ausdrücke "GPP2", "HOR2" und "YER062C" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Gen, welches eine cytosolische Glycerol-3-Phosphatase codiert und gekennzeichnet ist durch die Basensequenz, welche als SEQ ID NR.: 9 angegeben ist.
Der Begriff "GUT1" bezieht sich auf ein Gen, welches eine cytosolische Glycerolkinase codiert und durch die Basensequenz gekennzeichnet ist, welche als SEQ ID NR.: 10 angegeben ist.
Die Begriffe "Funktion" oder "Enzymfunktion" beziehen sich auf die katalytische Aktivität eines Enzyms hinsichtlich der Änderung der erforderlichen Energie, um eine spezifische chemische Reaktion durchzuführen. Es versteht sich, dass eine derartige Aktivität auf eine Reaktion im Gleichgewicht zutreffen kann, wobei die Produktion von entweder Produkt oder Substrat unter geeigneten Bedingungen bewerkstelligt werden kann.
Die Begriffe "Polypeptid" und "Protein" werden austauschbar verwendet.
Die Begriffe "Kohlenstoffsubstrat" und "Kohlenstoffquelle" beziehen sich auf eine Kohlenstoffquelle, die fähig ist, von Wirtsorganismen der vorliegenden Erfindung metabolisiert zu werden, und insbesondere auf Kohlenstoffquellen, welche gewählt werden aus der Gruppe, welche aus Monosacchariden, Oligosacchariden, Polysacchariden und Ein-Kohlenstoff-Substraten oder Mischungen hiervon besteht.
Die Begriffe "Wirtszelle" oder "Wirtsorganismus" beziehen sich auf einen Mikroorganismus, der zum Aufnehmen von fremden oder heterologen Genen und zum Exprimieren dieser Gene unter Erzeugung eines aktiven Genprodukts in der Lage ist.
Die Begriffe "fremdes Gen", "Fremd-DNA", "heterologes Gen" und "heterologe DNA" beziehen sich auf genetisches Material, welches bezüglich eines Organismus nativ ist, welches innerhalb eines Wirtsorganismus durch verschiedene Mittel eingebracht worden ist. Das Gen von Interesse kann ein natürlich vorkommendes Gen, ein mutiertes Gen oder ein synthetisches Gen sein.
Die Begriffe "rekombinanter Organismus" und "transformierter Wirt" beziehen sich auf jedweden Organismus, welcher mit heterologen oder fremden Genen oder Extra-Kopien von homologen Genen transformiert worden ist. Die rekombinanten Organismen der vorliegenden Erfindung exprimieren Fremdgene, codierend Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase (G3PDH) und Glycerol-3-Phosphatase (G3P-Phosphatase), Glyceroldehydratase (dhaB) und 1,3-Propandiol-Oxidoreduktase (dhaT), für die Herstellung von 1,3-Propandiol aus geeigneten Kohlenstoffstubstraten.
"Gen" bezieht sich auf ein Nukleinsäurefragment, welches ein spezifisches Protein exprimiert, einschließlich regulatorischer Sequenzen, welche der codierenden Region vorausgehen (5' nicht-codierend) und nachfolgen (3' nicht-codierend). Die Begriffe "nativ" und "Wildtyp" beziehen sich auf ein Gen, wie es in der Natur mit seinen eigenen regulatorischen Sequenzen gefunden wird.
Die Begriffe "codierend" und "codieren" beziehen sich auf den Prozess, vermittels dessen ein Gen, über die Mechanismen von Transkription und Translation, eine Aminosäuresequenz herstellt. Es versteht sich, dass der Prozess des Codierens einer spezifischen Aminosäuresequenz DNA-Sequenzen einschließt, welche Basenänderungen beinhalten können, die keine Änderung in der codierten Aminosäure verursachen, oder welche Basenänderungen beinhalten, die eine oder mehrere Aminosäuren verändern können, aber die funktionellen Eigenschaften des von der DNA-Sequenz codierten Proteins nicht beeinflussen. Es versteht sich deshalb, dass die Erfindung mehr als die spezifischen beispielhaften Sequenzen umfasst. Modifikationen an der Sequenz, wie Deletionen, Insertionen oder Substitutionen in der Sequenz, welche stille Änderungen hervorrufen, welche die funktionellen Eigenschaften des resultierenden Proteinmoleküls nicht wesentlich beeinflussen, werden ebenfalls in Betracht gezogen. Beispielsweise werden Änderungen in der Gensequenz, welche die Degeneriertheit des genetischen Codes reflektieren oder welche zur Herstellung einer chemisch äquivalenten Aminosäure an einer gegebenen Stelle führen, in Betracht gezogen. So kann ein Codon für die Aminosäure Alanin, eine hydrophobe Aminosäure, durch ein Codon substituiert werden, welches einen anderen weniger hydrophoben Rest, wie Glycin, oder einen hydrophoberen Rest, wie Valin, Leucin oder Isoleucin, codiert. In ähnlicher Weise kann auch erwartet werden, dass Änderungen, welche zur Substitution eines negativ geladenen Restes durch einen anderen, wie Asparaginsäure für Glutaminsäure, oder eines positiv geladenen Restes durch einen anderen, wie Lysin für Arginin, führen, ein biologisch äquivalentes Produkt erzeugen. Von Nukleotidänderungen, welche zu einer Änderung der N-terminalen und C-terminalen Abschnitte des Proteinmoleküls führen, wird man ebenfalls nicht erwarten, dass sie die Aktivität des Proteins zu verändern. In manchen Fällen kann es in der Tat wünschenswert sein, Mutanten der Sequenz zu erzeugen, um den Effekt einer Änderung auf die biologische Aktivität des Proteins zu untersuchen. Jede der vorgeschlagenen Modifikationen liegt durchaus innerhalb der Routinefähigkeiten auf dem Fachgebiet, wie auch die Bestimmung der Beibehaltung von biologischer Aktivität in den codierten Produkten. Darüber hinaus erkennt der Fachmann auf dem Gebiet, dass Sequenzen, welche von dieser Erfindung umfasst werden, ebenfalls durch ihre Fähigkeit definiert sind, unter stringenten Bedingungen (0,1X SSC, 0,1 % SDS, 65 °C) mit den hierin exemplifizierten Sequenzen zu hybridisieren.
Der Begriff "Expression" bezieht sich auf die Transkription und Translation zu Genprodukt von einem Gen, das für die Sequenz des Genprodukts codiert.
Die Begriffe "Plasmid", "Vektor" und "Kassette" beziehen sich auf ein extrachromosomales Element, das häufig Gene trägt, welche nicht Teil des zentralen Metabolismus der Zelle sind, und das üblicherweise in der Form von kreisförmigen doppelsträngigen DNA-Molekülen vorliegt. Solche Elemente können autonom replizierende Sequenzen, Genom-integrierende Sequenzen, Phagen- oder Nukleotidsequenzen, linear oder kreisförmig, aus einer einzel- oder doppelsträngigen DNA oder RNA, aus einer beliebigen Quelle abgeleitet sein, wobei eine Anzahl von Nukleotidsequenzen zu einer einzigen Konstruktion verknüpft oder rekombiniert worden sind, welche zum Einbringen eines Promotorfragmentes und von DNA-Sequenz für ein gewähltes Genprodukt, neben passender 3'-untranslatierter Sequenz, in eine Zelle in der Lage ist. "Transformationskassette" bezieht sich auf einen spezifischen Vektor, der ein Fremd-Gen enthält und Elemente zusätzlich zu dem Fremd-Gen aufweist, welche die Transformation einer besonderen Wirtszelle erleichtern. "Expressionskassette" bezieht sich auf einen spezifischen Vektor, der ein Fremd-Gen enthält und Elemente zusätzlich zu dem Fremd-Gen aufweist, welche eine verstärkte Expression dieses Gens in einem fremden Wirt erlauben.
Die Begriffe "Transformation" und "Transfektion" beziehen sich auf die Erlangung von neuen Genen in einer Zelle nach der Einbringung von Nukleinsäure. Die erworbenen Gene können in chromosomale DNA integriert oder als extrachromosomale replizierende Sequenzen eingeführt werden. Der Begriff "Transformante" bezieht sich auf das Produkt einer Transformation.
Der Begriff "genetisch verändert" bezieht sich auf das Verfahren der Veränderung von Erbgut durch Transformation oder Mutation.
Der Begriff "isoliert" bezieht sich auf eine Protein- oder DNA-Sequenz, welche von mindestens einer Komponente entfernt wurde, mit der sie natürlicherweise assoziiert ist.
Der Begriff "homolog" bezieht sich auf Protein oder Polypeptid, welches nativ oder natürlich in einer grampositiven Wirtszelle vorkommend ist. Die Erfindung schließt Mikroorganismen ein, welche das homologe Protein über rekombinante DNA-Technologie herstellen.
KONSTRUKTION VON REKOMBINANTEN ORGANISMEN
Rekombinante Organismen, welche die notwendigen Gene enthalten, die den enzymatischen Weg für die Umwandlung eines Kohlenstoffsubstrates zu 1,3-Propandiol codieren, können unter Verwendung von Techniken, die im Fachgebiet gut bekannt sind, konstruiert werden. Wie in Beispiel 9 erörtert, wurden Gene, welche dhaB1, dhaB2, dhaB3 und Protein X aus Klebsiella codieren, verwendet, um E.coli DH5a zu transformieren, und in Beispiel 10 wurden Gene, welche mindestens eines der Klebsiella-Proteine 1, 2 und 3 codieren, sowie mindestens ein Protein X codierendes Gen verwendet, um E. coli zu transformieren.
Gene, die Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase (G3PDH), Glycerol-3-Phosphatase (G3P-Phosphatase), Glyceroldehydratase (dhaB) und 1,3-Propandiol-Oxidoreduktase (dhaT) codieren, wurden aus einem nativen Wirt, wie Klebsiella oder Saccharomyces isoliert und verwendet, um Wirtsstämme wie E.coli DH5a, ECL707, AA200 oder W1485; den Saccharomyces cerevisiae-Stamm YPH500; oder die Klebsiella pneumoniae-Stämme ATCC 25955 oder ECL 2106 zu transformieren.
Isolierung von Genen
Verfahren zum Erhalten von gewünschten Genen aus einem bakteriellen Genom sind üblich und im Fachgebiet der Molekularbiologie gut bekannt. Wenn beispielsweise die Sequenz des Gens bekannt ist, können geeignete genomische Bibliotheken durch Restriktionsendonuklease-Verdau erzeugt werden und können mit Sonden gescreent werden, die komplementär zu der gewünschten Gensequenz sind. Sobald die Sequenz isoliert ist, kann die DNA unter Anwendung von standardmäßigen Primer-gesteuertem Amplifikationsverfahren, wie Polymerasekettenreaktion (PCR) (U S. 4 683 202) amplifiziert werden, um Mengen an DNA zu erhalten, welche für eine Transformation unter Verwendung passender Vektoren geeignet sind.
Alternativ dazu können Cosmid-Bibliotheken erzeugt werden, worin große Segmente von genomischer DNA (35-45 kb) in Vektoren verpackt und verwendet werden können, um passende Wirte zu transformieren. Cosmimd-Vektoren sind einzigartig dahingehend, dass sie in der Lage sind, große Mengen an DNA aufzunehmen. Im Allgemeinen besitzen Cosmid-Vektoren wenigstens eine Kopie der cos-DNA-Sequenz, welche zur Verpackung und anschließenden Zirkularisierung der Fremd-DNA benötigt wird. Zusätzlich zu der cos-Sequenz werden diese Vektoren auch einen Replikationsursprung, wie ColE1, und Arzneimittelresistenzmarker, wie ein Resistenzgen gegen Ampicillin oder Neomycin, enthalten. Verfahren zur Verwendung von Cosmid-Vektoren für die Transformation von geeigneten bakteriellen Wirten sind gut beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe (1989), Cold Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989).
Zum Klonieren von Cosmiden wird typischerweise Fremd-DNA isoliert und, unter Anwendung der passenden Restriktionsendonukleasen, angrenzend an die cos-Region des Cosmid-Vektors ligiert. Cosmid-Vektoren, enthaltend die linearisierte Fremd-DNA werden dann mit einem DNA-Verpackungs-Vehikel, wie Bacteriophage I, umgesetzt. Während des Verpackungsprozesses werden die cos-Stellen gespalten, und die Fremd-DNA wird in den Kopfteil des bakteriellen Virenpartikels gepackt. Diese Partikel werden dann verwendet, um geeignete Wirtszellen, wie E. coli, zu transfizieren. Nach Injektion in die Zelle zirkularisiert die Fremd-DNA unter dem Einfluss der klebrigen cos-Enden. Auf diese Weise können große Segmente von Fremd-DNA in rekombinanten Wirtszellen eingeführt und exprimiert werden.
Isolierung und Klonierung von Genen, welche Glyceroldehydratase (dhaB) und 1,3-Propandiol-Oxidoreduktase (dhaT) codieren
Cosmid-Vektoren und Cosmid-Transformationsverfahren wurden innerhalb des Kontextes der vorliegenden Erfindung verwendet, um große Segmente an genomischer DNA aus Bakteriengattungen, welche bekannterweise Gene besitzen, die zur Verarbeitung von Glycerol zu 1,3-Propandiol in der Lage sind, zu klonieren. Spezifisch gesagt, wurde genomische DNA aus K. pneumoniae ATCC 25955 durch im Fachgebiet gut bekannte Verfahren isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3A zur Insertion in einen Cosmid-Vektor Supercos 1 verdaut und unter Verwendung von GigapackII-Verpackungsextrakten verpackt. Im Anschluss an die Konstruktion des Vektors wurden E. coli XL1-Blue MR-Zellen mit der Cosmid-DNA transformiert. Transformanten wurden hinsichtlich der Fähigkeit gescreent, Glycerol in 1,3-Propandiol umzuwandeln, durch Wachsenlassen der Zellen in Gegenwart von Glycerol und Analysieren der Medien hinsichtlich 1,3-Propandiol-Bildung.
Zwei der 1,3-Propandiol-positiven Transformanten wurden analysiert, und die Cosmide wurden pKP1 und pKP2 genannt. Eine DNA-Sequenzierung zeigte eine umfassende Homologie zu dem Glyceroldehydratase-Gen (dhaB) aus C. freundii, was zeigt, dass diese Transformanten DNA enthielten, welche das Glyceroldehydratase-Gen codiert. Andere bezüglich 1,3-Propandiol positive Transformanten wurden analysiert, und die Cosmide wurden pKP4 und pKP5 genannt.
Eine DNA-Sequenzierung enthüllte, dass diese Cosmide DNA trugen, welche ein Dioldehydratase-Gen codierte.
Isolierung von Genen, welche Protein X, Protein 1, Protein 2 und Protein 3 codieren
Obwohl die vorliegende Erfindung die isolierten Gene aus dem Inneren eines Klebsiella-Cosmids verwendet, schließen alternative Quellen von Dehydratase-Genen und Protein X und Protein 1 und Protein 2 und Protein 3, ohne aber darauf eingeschränkt zu sein, Citrobacter, Clostridia und Salmonella ein. Tobimatsu et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 22352-22357, offenbaren das K. pneumoniae-Glyceroldehydratase-Operon, wobei Protein X als ORF 4 identifiziert wird; Segfried et al, 1996, J. Bacteriol. 178: 5793-5796, offenbaren das C. freundii-Glyceroldehydratase-Operon, worin Protein X als ORF Z identifiziert wird. Die 8 beschreibt Klebsiella-Dioldehydratase-Protein-X, und die 3, 4 und 5 beschreiben Aminosäuresequenzen von Proteinen 1, 2 und 3 Klebsiella und Citrobacter.
Gene, welche G3PDH und G3P-Phosphatase codieren
Die vorliegende Erfindung sieht Gene vor, die für die Expression von G3PDH- und G3P-Phosphatase-Aktivitäten in einer Wirtszelle geeignet sind.
Gene, welche G3PDH codieren, sind bekannt. Zum Beispiel ist GPD1 aus Saccharomyces isoliert worden und besitzt die Basensequenz, welche von SEQ ID NR.: 5 angegeben ist, welche die Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID NR.: 11 angegeben wird (Wang et al., siehe oben). In ähnlicher Weise ist G3PDH-Aktivität auch aus Saccharomyces isoliert worden, codiert von GPD2 mit der Basensequenz, welche in SEQ ID NR.: 6 angegeben ist, codierend die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 12 angegeben ist (Eriksson et al., Mol. Microbiol. 17, 95 (1995).
Es wird in Betracht gezogen, dass jedwedes Gen, welches ein Polypeptid codiert, das für G3PDH-Aktivität verantwortlich ist, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wobei diese Aktivität in der Lage ist, die Umwandlung von Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) zu Glycerol-3-Phosphat (G3P) zu katalysieren. Ferner wird es in Betracht gezogen, dass jedwedes Gen, das die Aminosäuresequenz von G3PDH codiert, wie angegeben durch eine beliebige von SEQ ID NR.: 11, 12, 13, 14, 15 und 16, entsprechend den Genen GPD1, GPD2, GUT2, gpsA, glpD bzw. der a-Untereinheit von glpABC, in der vorliegenden Erfindung funktional sein wird, wobei diese Aminosäuresequenz Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen umfasst, welche die Funktion des Enzyms nicht ändern. Vom Fachmann auf dem Gebiet wird es richtig eingeschätzt werden, dass G3PDH codierende Gene, welche aus anderen Quellen isoliert sind, ebenfalls zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Zum Beispiel schließen Gene, welche aus Prokaryoten isoliert wurden, die GenBank-Zugänge M34393, M20938, L06231, U12567, L45246, L45323, L45324, L45325, U32164 und U39682 ein; Gene, welche aus Pilzen isoliert wurden, schließen die GenBank-Zugänge U30625, U30876 und X56162 ein; Gene, welche aus Insekten isoliert wurden, schließen die GenBank-Zugänge X61223 und X14179 ein; und Gene, welche aus Säugerquellen isoliert wurden, schließen die GenBank-Zugänge U12424, M25558 und X78593 ein.
Gene, welche G3P-Phosphatase codieren, sind bekannt. Zum Beispiel ist GPP2 aus Saccharomyces cerevisae isoliert worden und weist die Basensequenz auf, welche von SEQ ID NR.: 9 angegeben wird, welche die Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID NR.: 17 angegeben ist (Norbeck et al., J. Biol. Chem. 271, S. 13875, 1996).
Es wird in Betracht gezogen, dass ein beliebiges Gen, codierend eine G3P-Phosphatase-Aktivität, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wobei diese Aktivität zum Katalysieren der Umwandlung von Glycerol-3-Phosphat zu Glycerol in der Lage ist. Ferner wird es in Betracht gezogen, dass ein beliebiges Gen, codierend die Aminosäuresquenz von G3P-Phosphatase, wie angegeben durch SEQ ID NR.: 33 und 17, in der vorliegenden Erfindung funktionell sein wird, wobei diese Aminosäuresequenz Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen umfasst, welche die Funktion des Enzyms nicht verändern. Vom Fachmann wird es richtig eingeschätzt werden, dass Gene, codierend G3P-Phosphatase, welche aus anderen Quellen isoliert werden, ebenfalls zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Zum Beispiel kann die Dephosphorylierung von Glycerol-3-Phosphat zum Erhalt von Glycerol erzielt werden mit einer oder mehreren der folgenden allgemeinen oder spezifischen Phosphatasen: alkalische Phosphatase (EC 3.1.3.1) [GenBank M19159, M29663, U02550 oder M33965]; saure Phosphatase (EC 3.1.3.2) [GenBank U51210, U19789, U28658 oder L20566]; Glycerol-3-Phosphatase (EC 3.1.3.-) [GenBank Z38060 oder U18813 × 11]; Glucose-1-Phosphatase (EC 3.1.3.10) [GenBank M33807]; Glucose-6-Phosphatase (EC 3.1.3.9) [GenBank U00445]; Fructose-1,6-bisphosphatase (EC 3.1.3.11) [GenBank X12545 oder J03207] oder Phosphatidylglycerolphosphat-Phosphatase (EC 3.1.3.27) [GenBank M23546 und M23628].
Gene, welche Glycerol-Kinase codieren, sind bekannt. Zum Beispiel ist GUT1, welches die Glycerol-Kinase aus Saccharomyces codiert, isoliert und sequenziert worden (Pavlik et al., Curr. Genet. 24, 21 (1993)), und die Basensequenz wird von SEQ ID NR.: 10 angegeben, welche die Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID NR.: 18 angegeben ist. Vom erfahrenen Fachmann wird es richtig eingeschätzt werden, dass, obwohl Glycerol-Kinase in der Natur den Abbau von Glycerol katalysiert, dasselbe Enzym in der Lage sein wird, unter den passenden Reaktionsenergie-Bedingungen bei der Synthese von Glycerol zur Umwandlung von Glycerol-3-Phosphat zu Glycerol zu fungieren. Es gibt Beweise für die Glycerol-Produktion durch eine Glycerol-Kinase. Unter anaeroben oder Atmungs-Hemmungs-Bedingungen führt Trypanosoma brucei zur Entstehung von Glycerol in Gegenwart von Glycerol-3-P und ADP. Die Reaktion findet in dem Glycosomen-Kompartiment statt (D. Hammond, J. Biol. Chem. 260, 15646-15654 (1985)).
Wirtszellen
Geeignete Wirtszellen für die rekombinante Herstellung von 1,3-Propandiol können entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein und werden nur von der Fähigkeit der Wirtszelle, aktive Enzyme zu exprimieren, eingeschränkt. Bevorzugte Wirte werden diejenigen sein, welche typischerweise für die Herstellung von Glycerol oder 1,3-Propandiol nützlich sind, wie Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces und Pseudomonas. Am stärksten bevorzugt in der vorliegenden Erfindung werden E. coli, Klebsiella-Spezies und Saccharomyces-Spezies.
Adenosyl-Cobalamin (Coenzym B₁₂) ist ein essentieller Cofaktor für Glyceroldehydratase-Aktivität. Das Coenzym ist das komplexeste bekannte nicht-polymere Naturprodukt, und seine Synthese in vivo wird unter Verwendung der Produkte von etwa 30 Genen gesteuert. Die Synthese von Coenzym B₁₂ wird in Prokaryoten gefunden, von denen einige in der Lage sind, die Verbindung de novo zu synthetisieren, wohingegen andere Teil-Reaktionen ausführen können. E. coli kann zum Beispiel die Corrin-Ringstruktur nicht herstellen, ist aber in der Lage, die Umwandlung von Cobinamid zu Corrinoid zu katalysieren, und kann die 5'-Desoxyadenosyl-Gruppe einführen.
Eukaryoten sind nicht in der Lage, Coenzym B₁₂ de novo zu synthetisieren und transportieren anstatt dessen Vitamin B₁₂ aus dem extrazellulären Milieu mit anschließender Umwandlung der Verbindung zu ihrer funktionellen Form der Verbindung durch zelluläre Enzyme. Drei Enzymaktivitäten sind für diese Serie von Reaktionen beschrieben worden. 1) Aquacobalamin-Reduktase (EC 1.6.99.8) reduziert Co(III) zu Co(II); 2) Cob(II)alamin-Reduktase (EC 1.6.99.9) reduziert Co(II) zu Co(I); und 3) Cob(I)alamin-Adenosyltransferase (EC 2.5.1.17) transferiert eine 5'-Desoxyadenosin-Einheit von ATP auf das reduzierte Corrinoid. Diese letztgenannte Enzymaktivität ist die unter den dreien am besten charakterisierte und wird von cobA in S. ryphimurium, btuR in E. coli und cobO in P. denitrificans codiert. Diese drei Cob(I)alamin-Adenosyltransferase-Gene sind kloniert und sequenziert worden. Cob(I)alamin-Adenosyltransferase-Aktivität ist in menschlichen Fibroblasten und in isolierten Ratten-Mitochondrien (Fenton et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 98, 283-9, (1981;) nachgewiesen worden. Die zwei an der Kobalt-Reduktion beteiligten Enzyme sind kaum charakterisiert, und Gensequenzen sind nicht verfügbar. Es gibt Berichte über eine Aquacobalamin-Reduktase aus Euglena gracilis (Watanabe et al., Arch. Biochem. Biophys., 305, 421-7 (1993), und eine mikrosomale Cob(III)alamin-Reduktase ist in den mikrosomalen und mitochondrialen Innenmembran-Fraktionen aus Ratten-Fibroblasten vorhanden (Pezacka, Biochim. Biophys. Acta, 1157, 167-77 (1993)).
Das Ergänzen von Kulturmedien mit Vitamin B₁₂ kann der Notwendigkeit zur Herstellung von Coenzym B₁₂ für Glyceroldehydratase-Aktivität in vielen Mikroorganismen genügen, aber in einigen Fällen müssen zusätzliche katalytische Aktivitäten zugegeben oder in vivo erhöht werden. Eine gesteigerte Synthese von Coenzym B₁₂ in Eukaryoten kann besonders wünschenswert sein. Im Hinblick auf die veröffentlichten Sequenzen für Gene, welche Cob(I)alamin-Adenosyltransferase codieren, könnte die Klonierung und Expression dieses Gens vom Fachmann auf dem Gebiet bewerkstelligt werden. Es wird zum Beispiel in Betracht gezogen, dass Hefe, wie Saccharomyces, so konstruiert werden könnte, dass sie Gene, welche Cob(I)alamin-Adenosyltransferase codieren, zusätzlich zu den Genen enthält, welche notwendig sind, um eine Umwandlung eines Kohlenstoffsubstrates wie Glucose zu 1,3-Propandiol zu bewirken. Die Klonierung und Expression der Gene zur Kobaltreduktion erfordert eine unterschiedliche Herangehensweise. Diese könnte auf einer Selektion in E. coli hinsichtlich Wachstum auf Ethanolamin als einziger N₂-Quelle basieren. In Gegenwart von Coenzym B₁₂ ermöglicht Ethanolamin-Ammoniak-Lyase ein Wachstum von Zellen in Abwesenheit von anderen N₂-Quellen. Wenn E.coli-Zellen ein kloniertes Gen für Cob(I)alamin-Adenosyl-Transferase und statistisch klonierte DNA aus einem anderen Organismus enthalten, sollte das Wachstum auf Ethanolamin in Gegenwart von Aquacobalamin verstärkt werden und eine Selektion dafür erfolgen, wenn die statistisch klonierte DNA Kobalt-Reduktions-Eigenschaften zur Erleichterung der Adenosylierung von Aquacobalamin codiert.
Glyceroldehydratase ist ein Multi-Untereinheit-Enzym, das aus drei Proteinkomponenten besteht, welche in einer a₂b₂g₂-Konfiguration angeordnet sind (M. Seyfreid et al., J. Bacteriol., 5793-5796 (1996)). Diese Konfiguration ist ein inaktives Apo-Enzym, welches ein Molekül Coenzym B₁₂ bindet, um zu dem katalytisch aktiven Holo-Enzym zu werden. Während der Katalyse erfährt das Holo-Enzym eine rasche Inaktivierung erster Ordnung, wodurch es ein inaktiver Komplex wird, in welchem das Coenzym B₁₂ zu Hydroxycobalamin umgewandelt worden ist (Z. Schneider und J. Pawelkiewicz, ACTA Biochim. Pol., 311-328 (1966)). Eine stöchiometrische Analyse der Reaktion von Glyceroldehydrotase mit Glycerol als Substrat enthüllte, dass jedes Molekül Enzym 100000 Reaktionen vor der Inaktivierung katalysiert (Z. Schneider und J. Pawelkiewicz, ACTA Biochim. Pol., 311-328 (1966)). In vitro kann dieser inaktive Komplex nur reaktiviert werden durch Entfernung des Hydroxycobalamins durch starke chemische Behandlung mit Magnesium und Sulfit und Ersetzen mit zusätzlichem Coenzym B₁₂ (Z. Schneider et al., J. Biol. Chem., 3388-3396 (1970)). Inaktivierte Glyceroldehydratase in Wildtyp-Klebsiella pneumoniae kann in situ reaktiviert werden (mit Toluol behandelte Zellen) in Gegenwart von Coenzym B₁₂, Adenosin-5'-triphosphat (ADP) und Mangan (S. Honda et al., J. Bacteriol. 1458-1465 (1980)). Es wurde gezeigt, dass diese Reaktivierung auf der ATP-abhängigen Ersetzung des inaktivierten Cobalamins mit Coenzym B₁₂ beruht (K. Ushio et al., J. Nutr. Sci. Vitaminol. 225-236 (1982)). Zellextrakt aus mit Toluol behandelten Zellen, welche in situ die von ATP, Mangan und Coenzym B₁₂ abhängige Reaktivierung katalysieren, sind in Hinsicht auf diese Reaktivierung inaktiv. Ohne eine starke chemische reduktive Behandlung oder zellvermittelte Ersetzung des inaktivierten Cofaktors kann Glyceroldehydratase daher nur 100000 Reaktionen pro Molekül katalysieren.
Die vorliegende Erfindung demonstriert, dass das Vorhandensein von Protein X wichtig für eine in vivo-Reaktivierung der Dehydratase ist, und die Herstellung von 1,3-Propandiol in einer Wirtszelle, die zur Erzeugung von 1,3-Propandiol in der Lage ist, in Gegenwart von Protein X erhöht wird. Die vorliegende Erfindung offenbart auch, dass die Gegenwart von Protein 1, Protein 2 und Protein 3, in Kombination mit Protein X, ebenfalls die Herstellung von 1,3-Propandiol in einer Wirtszelle, die zur Produktion von 1,3-Propandiol in der Lage ist, erhöhte.
Zusätzlich zu E. coli und Saccharomyces ist Klebsiella ein besonders bevorzugter Wirt. Stämme von Klebsiella pneumoniae erzeugen bekanntermaßen 1,3-Propandiol bei Wachsenlassen auf Glycerol als dem einzigen Kohlenstoff. Es wird in Betracht gezogen, dass Klebsiella genetisch verändert werden kann, um 1,3-Propandiol aus Monosacchariden, Oligosacchariden, Polysacchariden oder Ein-Kohlenstoff-Substraten herzustellen.
Um derartige Stämme zu konstruieren, wird es vorteilhaft sein, den Klebsiella-Wirt mit Genen, welche die Umwandlung von Dihydroxyacetonphosphat zu Glycerol und die Umwandlung von Glycerol zu 1,3-Propandiol entweder separat oder gemeinsam erleichtern, unter der transkriptionellen Steuerung von einem oder mehreren konstitutiven oder induzierbaren Promotoren auszustatten. Die Einführung der DAR1- und GPP2-Gene, welche Glycerol-3-Phoshat-Dehydrogenase bzw. Glycerol-3-Phosphatase codieren, wird Klebsiella mit der genetischen Maschinerie ausstatten, um 1,3-Propandiol aus einem geeigneten Kohlenstoffsubstrat herzustellen.
Die Gene, welche Protein X, Protein 1, Protein 2 und Protein 3 oder andere mit 1,3-Propandiol-Herstellung assoziierte Enzyme (z. B. G3PDH, G3P-Phosphatase, dhaB und/oder dhaT) codieren, können auf jedwedem Plasmidvektor, der zur Replikation in K. pneumoniae fähig ist, eingeführt werden, oder sie können in das K. pneumoniae-Genom integriert werden. Zum Beispiel ist bekannt, dass K. pneumoniae ATCC 25955 und K. pneumoniae ECL 2106 empfindlich gegenüber Tetracyclin oder Chloramphenicol sind; somit können Plasmidvektoren, welche sowohl in der Lage zum Replizieren in K. pneumoniae sind als auch Resistenz gegen eines oder beide dieser Antibiotika codieren, verwendet werden, um diese Gene in K. pneumoniae einzubringen. Verfahren zum Transformieren von Klebsiella mit Genen von Interesse sind üblich und im Fachgebiet gut bekannt, und geeignete Protokolle, einschließlich passender Vektoren und Expressionstechniken, können in Sambrook, siehe oben, gefunden werden.
Vektoren und Expressionskassetten
Die vorliegende Erfindung sieht eine Vielzahl von Vektoren und Transformations- und Expressionskassetten vor, welche für die Klonierung, Transformation und Expression von Protein X, Protein 1, Protein 2 und Protein 3 sowie anderen Proteinen, welche mit 1,3-Propandiol-Herstellung assoziiert sind, z. B. G3PDH und G3P-Phosphortase, in einer) geeignete(n) Wirtszelle geeignet sind. Geeignete Vektoren werden diejenigen sein, welche mit dem verwendeten Bakterium kompatibel sind. Geeignete Vektoren können, zum Beispiel, aus einem Bakterium, einem Virus (wie Bakteriophage T7 oder einem von M-13 abgeleiteten Phagen), einem Cosmid, einer Hefe oder einer Pflanze abgeleitet werden. Protokolle zum Erhalten und Verwenden derartiger Vektoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual – Bände 1, 2, 3 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)).
Typischerweise enthält der Vektor oder die Kassette Sequenzen, welche Transkription und Translation des relevanten Gens steuern, einen selektierbaren Marker und Sequenzen, welche die autonome Replikation oder chromosomale Integration gestatten. Geeignete Vektoren umfassen eine Region 5' zu dem Gen, welche transkriptionelle Initiations-Kontrollen beinhaltet, und eine Region 3' zu dem DNA-Fragment, welche die transkriptionelle Termination steuert. Es wird am stärksten bevorzugt, wenn beide Kontrollregionen aus Genen abgeleitet sind, welche hinsichtlich der transformierten Wirtszelle homolog sind, obwohl es sich versteht, dass solche Steuerungsregionen nicht aus den Genen abgeleitet sein müssen, welche hinsichtlich der als Produktionswirt gewählten spezifischen Spezies nativ sind.
Initiations-Steuerungsregionen oder Promotoren, welche zum Lenken der Expression des Proteins X und von Protein 1, Protein 2 und Protein 3 in der gewünschten Wirtszelle brauchbar sind, sind zahlreich und dem Fachmann auf dem Gebiet vertraut. Praktisch jeder beliebige Promotor, welcher in der Lage zum Lenken dieser Gene ist, ist für die vorliegende Erfindung geeignet, einschließlich, ohne aber darauf eingeschränkt zu sein, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (nützlich zur Expression in Saccharomyces); AOX1 (nützlich zur Expression in Pichia) und lac, trp, IP_L, IP_R, T7, tac und trc (nützlich zur Expression in E. coli).
Terminations-Steuerungsregionen können ebenfalls aus verschiedenen Genen abgeleitet werden, welche hinsichtlich der bevorzugten Wirte nativ sind. Gegebenenfalls kann eine Terminationsstelle unnötig sein, wobei es jedoch am stärksten bevorzugt ist, wenn sie eingeschlossen ist.
Für eine effektive Expression der vorliegenden Enzyme wird DNA, welche die Enzyme codiert, funktionsfähig über Initiationscodons an ausgewählte Expressions-Steuerungsregionen verknüpft, sodass eine Expression zur Bildung der entsprechenden Botschafter-RNA führt.
Transformation von geeigneten Wirten und Expression von Genen für die Herstellung von 1,3-Propandiol
Sobald geeignete Kassetten konstruiert sind, werden sie verwendet, um passende Wirtszellen zu transformieren. Die Einbringung der Kassette, welche dhaB-Aktivität, dhaB-Protein X und mindestens eines von Protein 1, Protein 2 und Protein 3 und gegebenenfalls 1,3-Propandiol-Oxidoreduktase (dhaT), entweder separat oder zusammen, enthält, in die Wirtszelle kann durch bekannte Vorgehensweisen bewerkstelligt werden, wie durch Transformation (z. B. unter Verwendung von Calcium-permeabilisierten Zellen, Elektroporation) oder durch Transfektion unter Verwendung eines rekombinanten Phagen-Virus (Sambrook et al., siehe oben). In der vorliegenden Erfindung wurde E. coli DH5a mit dhaB-Untereinheiten 1, 2 und 3 und dha-Protein X transformiert.
Zusätzlich dazu wurde E. coli W2042 (ATCC 98188), welcher die Gene enthält, die Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase (G3PDH) und Glycerol-3-Phosphatase (G3P-Phosphatase), Glycerol-Dehydratase (dhaB) und 1,3-Propandiol-Oxidoreduktase (dhaT) codieren, erzeugt. Weiterhin wurde S. cerevisiae YPH500 (ATCC 74392), beinhaltend die Plasmide pMCK10, pMCK17, pMCK30 und pMCK35, welche Gene enthalten, codierend Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase (G3PDH) und Glycerol-3-Phosphatase (G3P-Phosphatase), Glycerol-Dehydratase (dhaB) und 1,3-Propandiol-Oxidoreduktase (dhaT), konstruiert. Beide der oben erwähnten, transformierten E. coli wie auch Saccharomyces repräsentieren bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.
Medien und Kohlenstoffsubstrate:
Fermentationsmedien in der vorliegenden Erfindung müssen geeignete Kohlenstoffsubstrate enthalten. Geeignete Substrate können, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Monosaccharide, wie Glucose und Fructose, Oligosaccharide, wie Lactose oder Saccharose, Polyaccharide, wie Stärke oder Zellulose, oder Mischungen davon sowie ungereinigte Mischungen aus erneuerbaren Einspeisematerialien, wie Käse-Molke-Permeat, Mais-Sirup (Cornsteep-Liquor), Zuckerrübenmolasse und Gerstenmalz, einschließen. Zusätzlich dazu kann das Kohlenstoffsubstrat auch in Ein-Kohlenstoff-Substraten, wie Kohlendioxid oder Methanol bestehen, für welche eine metabolische Umwandlung zu biochemischen Schlüssel-Zwischenstufen demonstriert worden ist. Die Glycerol-Herstellung aus Einzel-Kohlenstoff-Quellen (z. B. Methanol, Formaldehyd oder Formiat) ist in methylotrophen Hefen (Yamada et al., Agric. Biol. Chem. 53(2) 541-543 (1989)) und in Bakterien (Hunter et al., Biochemistry, 24, 4148-4155 (1985)) berichtet worden. Diese Organismen können Einzel-Kohlenstoff-Verbindungen, welche hinsichtlich des Oxidationszustands von Methan zu Formiat reichen, assimilieren und Glycerol herstellen. Der Weg der Kohlenstoff-Assimilierung kann über Ribulose-Monophosphat, über Serin oder über Xylulose-Monophosphat verlaufen (Gottschalk, Bacterial Metabolism, zweite Ausgabe, Springer-Verlag: New York (1986)). Der Ribulose-Monophosphat-Weg beinhaltet die Kondensation von Formiat mit Ribulose-5-Phosphat unter Bildung eines 6-Kohlenstoff-Zuckers, welcher zu Fructose und letztendlich zum Drei-Kohlenstoff-Produkt Glyceraldehyd-3-Phosphat wird. Desgleichen assimiliert der Serin-Weg die Ein-Kohlenstoff-Verbindung in den glycolytischen Weg über Methylentetrahydrofolat.
Zusätzlich zur Verwendung von Ein- und Zwei-Kohlenstoffsubstraten ist es ebenfalls bekannt, dass methylotrophe Organismen eine Reihe von anderen kohlenstoffhaltigen Verbindungen, wie Methylamin, Glucosamin und eine Vielzahl von Aminosäuren, für die Stoffwechselaktivität verwerten. Zum Beispiel ist bekannt, dass methylotrophe Hefen den Kohlenstoff aus Methylamin zur Bildung von Trehalose oder Glycerol verwerten (Bellion et al., Microb. Growth C1 Compd., [Int. Symp.], 7. (1993) 415-32. Herausgeber: Murell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, GB). In ähnlicher Weise werden verschiedene Spezies von Candida Alanin oder Ölsäure metabolisieren (Sulter et al., Arch. Microbiol. 153(5), 485-9 (1990)). Somit kann die in der vorliegenden Erfindung verwendete Kohlenstoffquelle eine große Vielzahl von kohlenstoffhaltigen Substraten umfassen und wird nur von den Anforderungen des Wirtsorganismus eingeschränkt.
Obwohl es in Betracht gezogen wird, dass alle der oben erwähnten Kohlenstoffsubstrate und Mischungen davon in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind bevorzugte Kohlenstoffsubstrate Monosaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide und Ein-Kohlenstoff-Substrate. Stärker bevorzugt werden Zucker wie Glucose, Fructose, Saccharose und Einzel-Kohlenstoff-Substrate wie Methanol und Kohlendioxid. Am stärksten bevorzugt ist Glucose.
Zusätzlich zu einer passenden Kohlenstoffquelle müssen Fermentationsmedien geeignete Mineralien, Salze, Cofaktoren, Puffer und andere dem Fachmann auf dem Gebiet bekannte Komponenten, welche für das Wachstum der Kulturen und die Förderung des zur Glycerol-Herstellung notwendigen enzymatischen Weges geeignet sind, enthalten. Besondere Aufmerksamkeit erfahren die Co(II)-Salze und/oder Vitamin B₁₂ oder Vorläufer davon.
Kulturbedingunungen:
Typischerweise werden Zellen bei 30 °C in passenden Medien wachsen gelassen. Bevorzugte Wachstumsmedien in der vorliegenden Erfindung sind übliche kommerziell hergestellte Medien, wie Luria-Bertani(LB)-Nährmedium, Sabouraud-Dextrose(SD)-Nährmedium oder Hefe-Malz-Extrakt(YM)-Nährmedium. Andere definierte oder synthetische Wachstumsmedien können ebenfalls verwendet werden, und das passende Medium zum Wachstum des jeweiligen Mikroorganismus wird einem Fachmann auf dem Gebiet der Mikrobiologie oder Fermentationswissenschaft bekannt sein. Die Verwendung von Mitteln, welche bekanntermaßen Katabolit-Repression direkt oder indirekt modulieren, z. B. cyclisches Adenosin-2':3'-Monophosphat oder cyclisches Adenosin-2':5'-Monophosphat, kann ebenfalls in die Reaktionsmedien eingebunden werden. In ähnlicher Weise kann die Verwendung von Mitteln, welche bekanntermaßen enzymatische Aktivitäten modulieren (Sulphite, Bisulphite und Alkalis), die zur Steigerung der Glycerolproduktion führen, in Verbindung mit oder als eine Alternative zu genetischen Manipulationen eingesetzt werden.
Geeignete pH-Bereiche für die Fermentierung liegen zwischen pH 5,0 bis pH 9,0, wobei pH 6,0 bis pH 8,0 als Bereich für die Anfangsbedingung bevorzugt wird.
Reaktionen können unter aeroben oder anaeroben Bedingungen durchgeführt werden, wobei anaerobe oder mikroaerobe Bedingungen bevorzugt werden.
Satzweise und kontinuierliche Fermentationen:
Das vorliegende Verfahren wendet eine Satz-Methode zur Fermentierung an. Ein klassische Chargen- bzw. Satz-Fermentation ist ein geschlossenes System, wobei die Zusammensetzung der Medien am Beginn der Fermentierung eingestellt und während der Fermentierung nicht künstlichen Veränderungen unterworfen wird. Somit wird, am Beginn der Fermentierung, das Medium mit dem gewünschten Organismus oder Organismen angeimpft, und eine Fermentation wird stattfinden gelassen, wobei dem System nichts zugesetzt wird. Typischerweise ist eine Satz-Fermentation allerdings "Charge" in Hinsicht auf die Zugabe der Kohlenstoffquelle, und häufig werden Versuche unternommen, Faktoren, wie pH und Sauerstoffkonzentration zu regulieren. Die Metabolit- und Biomassen-Zusammensetzungen des Satz-Systems ändern sich fortwährend bis zu dem Zeitpunkt, an welchem die Fermentation gestoppt wird. Innerhalb von Satzkulturen gelangen bzw. moderieren Zellen über eine statische Verzögerungs- bzw. lag-Phase zu einer log-Phase bzw. logarithmischen Phase von hohem Wachstum und schließlich zu einer stationären Phase, bei welcher die Wachstumsrate verringert oder angehalten wird. Falls unbehandelt, werden die Zellen in der stationären Phase letztendlich sterben. Zellen in der logarithmischen Phase sind im Allgemeinen für die Hauptmasse der Produktion von Endprodukt oder Zwischenstufe verantwortlich.
Eine Variation an dem standardmäßigen Satzsystem ist das "Fed-Batch"-Fermentationssystem, welches in der vorliegenden Erfindung ebenfalls geeignet ist. In dieser Variation eines typischen Satzsystems wird das Substrat in Zuwächsen zugesetzt, während die Fermentation voranschreitet. Fed-Batch-Systeme sind nützlich, wenn eine Katabolitrepression dazu fähig ist, den Stoffwechsel der Zellen zu inhibieren, und falls es wünschenswert ist, dass beschränkte Mengen an Substrat im Medium vorliegen. Die Messung der tatsächlichen Substratkonzentration in Fed-Batch-Systemen ist schwierig und wird deshalb auf der Grundlage der Änderung von messbaren Faktoren, wie pH, gelöstem Sauerstoff und dem Partialdruck von Abfallgasen, wie CO₂, abgeschätzt. Satz- und Fed-Batch-Fermentationen sind üblich und im Fachgebiet gut bekannt, und Beispiele können in Brock, siehe oben, gefunden werden.
Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, dass das Verfahren an kontinuierliche Fermentationsmethoden anpassbar sein wird. Eine kontinuierliche Fermentierung ist ein offenes System, worin ein definiertes Fermentationsmedium kontinuierlich in einen Bioreaktor zugesetzt und eine gleiche Menge an konditioniertem Medium simultan zur Verarbeitung entnommen wird. Eine kontinuierliche Fermentation hält die Kulturen im Allgemeinen bei einer konstanten hohen Dichte, wobei Zellen vorwiegend im log-Phasen-Wachstum vorliegen.
Die kontinuierliche Fermentation ermöglicht die Modulation von einem Faktor oder einer beliebigen Anzahl von Faktoren, welche Zellwachstum oder Endprodukt-Konzentration beeinflussen. Zum Beispiel wird ein Verfahren einen limitierenden Nährstoff, wie die Kohlenstoffquelle oder den Stickstoffspiegel, bei einer festgelegten Rate beibehalten, und allen anderen Parametern gestatten, sich abzumildern. In anderen Systemen kann eine Anzahl an Faktoren, welche das Wachstum beeinflussen, kontinuierlich verändert werden, während die Zellkonzentration, gemessen durch die Mediumstrübung, konstant gehalten wird. Kontinuierliche Systeme streben danach, Fließgleichgewichts-Wachstumsbedingungen beizubehalten, und somit muss der Zellverlust, der daraus herrührt, dass Medium abgezogen wird, gegenüber der Zellwachstumsrate in der Fermentation ausgeglichen werden. Verfahren zum Modulieren von Nährstoffen und Wachstumsfaktoren für kontinuierliche Fermentierungsverfahren sowie Techniken zur Maximierung der Rate der Produktbildung sind im Fachgebiet der industriellen Mikrobiologie gut bekannt, und eine Vielzahl von Verfahren werden von Brock, siehe oben, ausführlich aufgeführt.
Die vorliegende Erfindung kann unter Anwendung entweder von Satz-, Fed-Batch- oder kontinuierlichen Verfahren ausgeführt werden, und jedweder bekannte Modus zur Fermentierung wird geeignet sein. Darüber hinaus wird es in Betracht gezogen, dass Zellen auf einem Substrat als Ganzzell-Katalysatoren immobilisiert und Fermentationsbedingungen für die 1,3-Propandiol-Herstellung unterworfen werden können.
Abänderungen im 1,3-Propandiol-Herstellungsweg:
Repräsentativer Enzym-Weg. Die Herstellung von 1,3-Propandiol aus Glucose kann durch die folgende Reihe von Schritten bewerkstelligt werden. Diese Reihe ist repräsentativ für eine Anzahl von Wegen, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Glucose wird in einer Serie von Schritten durch Enzyme des glycolytischen Weges zu Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) und 3-Phosphoglyceraldehyd (3-PG) umgewandelt. Glycerol wird dann entweder durch Hydrolyse von DHAP zu Dihydroxyaceton (DHA), gefolgt von Reduktion, oder Reduktion von DHAP zu Glycerol-3-Phosphat (G3P), gefolgt von Hydrolyse, gebildet. Der Hydrolyseschritt kann durch eine beliebige Anzahl von zellulären Phosphatasen katalysiert werden, welche bekanntermaßen spezifisch oder nicht-spezifisch in Bezug auf ihre Substrate sind, oder die Aktivität kann durch Rekombination in den Wirt eingeführt werden. Der Reduktionsschritt kann durch ein NAD⁺(oder NADP⁺)-verknüpftes Wirtsenzym katalysiert werden, oder die Aktivität kann mittels Rekombination in den Wirt eingeführt werden. Es ist bemerkenswert, dass das dha-Regulon eine Glyceroldehydrogenase (E.C. 1.1.1.6) enthält, welche die reversible Reaktion von Gleichung 3 katalysiert. Glycerol^® 3-HP + H₂O (Gleichung 1) 3-HP + NADH + H⁺ ^® 1,3-Propandiol + NAD⁺ (Gleichung 2) Glycerol + NAD⁺ ^® DHA + NADH + H⁺ (Gleichung 3)
Glycerol wird über die Zwischenstufe 3-Hydroxypropionaldehyd (3-HP) in 1,3-Propandiol umgewandelt, wie es ausführlich oben beschrieben worden ist. Die Zwischenstufe 3-HP wird aus Glycerol hergestellt (Gleichung 1) durch ein Dehydratase-Enzym, welches von dem Wirt codiert werden kann oder durch Rekombination in den Wirt eingeführt werden kann. Diese Dehydratase kann Glyceroldehydratase (E.C. 4.2.1.30), Dioldehydratase (E.C. 4.2.1.28) oder ein beliebiges anderes Enzym sein, welches zum Katalysieren dieser Transformation in der Lage ist. Glyceroldehydratase, aber nicht Dioldehydratase, wird von dem dha-Regulon codiert. 1,3-Propandiol wird aus 3-HP (Gleichung 2) produziert durch ein NAD⁺(oder NADP⁺)-verknüpftes Wirtsenzym, oder die Aktivität kann durch Rekombination in den Wirt eingeführt werden. Diese letztendliche Reaktion bei der Herstellung von 1,3-Propandiol kann durch 1,3-Propandiol-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.202) oder andere Alkohol-Dehydrogenasen katalysiert werden.
Mutationen und Transformationen, welche Kohlenstoff-"Channeling" beeinflussen. Eine Vielzahl von mutanten Organismen, welche Variationen im 1,3-Propandiol-Herstellungsweg umfassen, wird in der vorliegenden Erfindung nützlich sein. Die Einführung einer Triosephosphatisomerase-Mutation (tpi-) in den Mikroorganismus ist ein Beispiel der Anwendung einer Mutation zur Verbesserung des Leistungsverhaltens durch Kohlenstoff-Channeling bzw. -Kanalisierung. Alternativ dazu werden Mutationen, welche die Erzeugung von Ethanol (adh) oder Lactat (ldh) verringern, die Verfügbarkeit von NADH für die Herstellung von 1,3-Propandiol erhöhen. Zusätzliche Mutationen in Schritten der Glycolyse nach Glyceraldehyd-3-Phosphat, wie Phosphoglycerat-Mutase (pgm), wären nützlich zur Erhöhung des Stroms an Kohlenstoff zu dem 1,3-Propandiol-Herstellungsweg. Mutationen, welche den Glucose-Transport beeinflussen, wie PTS, welche den Verlust von PEP verhindern würden, können sich ebenfalls als nützlich erweisen. Mutationen, welche alternative Wege für Zwischenstufen des 1,3-Propandiol-Herstellungsweges blockieren, wie den Glycerol-katabolischen Weg (glp), werden ebenfalls für die vorliegende Erfindung nützlich sein. Die Mutation kann auf ein Strukturgen gerichtet sein, so dass die Aktivität einer enzymatischen Aktivität beeinträchtigt oder verbessert wird, oder kann auf ein regulatorisches Gen gerichtet sein, so dass die Expressionshöhe einer enzymatischen Aktivität moduliert wird.
Alternativerweise können Transformationen und Mutationen so kombiniert werden, dass bestimmte Enzymaktivitäten für die Steigerung von 1,3-Propandiol-Herstellung gesteuert werden. Somit liegt es innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, Modifikationen eines Ganzzell-Katalysators zu antizipieren, welche zu einer erhöhten Produktion von 1,3-Propandiol führen.
Identifizierung und Reinigung von 1,3-Propandiol:
Verfahren für die Reinigung von 1,3-Propandiol aus Fermentationsmedien sind im Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel können Propandiole aus Zellmedien durch Unterwerfen der Reaktionsmischung an eine Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, Destillation und Säulenchromatographie (U.S. 5 356 812) erhalten werden. Ein besonders gutes organisches Lösungsmittel für dieses Verfahren ist Cyclohexan (U.S. 5 008 473).
1,3-Propandiol kann direkt identifiziert werden durch Unterziehen der Medien an Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-Analyse. In der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bevorzugt, worin Fermentationsmedium auf einer analytischen Ionenaustauschsäule unter Verwendung einer beweglichen Phase von 0,01 N Schwefelsäure in einer isokratischen Weise analysiert wird.
Identifizierung und Reinigung von G3PDH und G3P-Phosphatase:
Die Spiegel der Expression der Proteine G3PDH und G3P-Phosphatase werden durch Enzym-Assays bzw. einen G3PDH-Aktivitäts-Assay, welcher auf den Spektraleigenschaften des Co-Substrates, NADH, bei der DHAP-Umwandlung zu G-3-P beruht, gemessen. NADH besitzt eine intrinsische UV/Sichtbar-Absorption, und seine Aufzehrung kann spektrophotometrisch bei 340 nm verfolgt werden. G3P-Phosphatase-Aktivität kann durch jedwedes Verfahren zum Messen des in der Reaktion freigesetzten anorganischen Phosphats gemessen werden. Das am häufigsten verwendete Nachweisverfahren setzte die sichtbare spektroskopische Bestimmung eines blau gefärbten Phosphomolybdat-Ammonium-Komplexes ein.
BEISPIELE
ALLGEMEINE VERFAHREN
Vorgehensweisen für Phosphorylierungen, Ligationen und Transformationen sind im Fachgebiet gut bekannt. Techniken, welche geeignet zur Anwendung in den folgenden Beispielen sind, können in Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) gefunden werden.
Für das Aufrechterhalten und das Wachstum von Bakterienkulturen geeignete Materialien und Methoden sind im Fachgebiet gut bekannt. Zur Verwendung in den folgenden Beispielen geeignete Techniken können gefunden werden, wie dargestellt in Manual of Methods for General Bateriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg und G. Briggs Phillips (Hrsg.), American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994)) oder von Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, zweite Ausgabe, Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA (1989). Alle Reagenzien und Materialien, welche für das Wachstum und das Aufrechterhalten von Bakterienzellen verwendet wurden, wurden erhalten von Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD), oder Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), es sei denn, es wird anders lautend angegeben.
Die Bedeutung von Abkürzungen ist wie folgend: "h" bedeutet Stunde(n), "min" bedeutet Minute(n), "sec" bedeutet Sekunde(n), "d" bedeutet Tag(e), "ml" bedeutet Milliliter, "1" bedeutet Liter.
ENZYM-ASSAYS
Glyceroldehydratase-Aktivität in zellfreien Extrakten wurde bestimmt unter Verwendung von 1,2-Propandiol als Substrat. Der Assay, der auf der Reaktion von Aldehyden mit Methylbenzo-2-thiazolon-Hydrazon basiert, ist von Forage und Foster beschrieben worden (Biochim. Biophys. Acta, 569, 249 (1979)). Die Aktivität von 1,3-Propandiol-Oxidoreduktase, welche manchmal als 1,3-Propandiol-Dehydrogenase bezeichnet wird, wurde in Lösung oder in Flachgelen unter Verwendung von 1,3-Propandiol und NAD⁺ als Substrate bestimmt, wie es ebenfalls beschrieben worden ist; Johnson und Lin, J. Bacteriol., 169, 2050 (1987). NADH- oder NADPH-abhängige Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase(G3PDH)-Aktivität wurde spektrophotometrisch bestimmt, wobei das Verschwinden von NADH oder NADPH verfolgt wurde, wie es beschrieben worden ist (R. M. Bell und J. E. Cronan, Jr., J. Biol. Chem, 250: 7153-8 (1975)).
Honda et al. (1980, In Situ Reactivation of Glycerol-Inactivated Coenzyme B₁₂-Dependent Enzymes, Glycerol Dehydratase and Diol Dehydratase, Journal of Bacteriology 143: 1458-1465) offenbaren einen Assay, welcher die Reaktivation von Dehydratasen misst.
Assay für Glycerol-3-Phosphatase, GPP
Der Assay auf Enzymaktivität wurde durchgeführt mittels Inkubieren des Extraktes mit einem organischen Phosphatsubstrat in einem bis-Tris- oder MES- und Magnesium-Puffer, pH 6,5. Das verwendete Substrat war 1-a-Glycerolphosphat; d,l-a-Glycerolphosphat. Die Endkonzentrationen der Reagenzien in dem Assay sind: Puffer (20 mM bis-Tris, oder 50 mM MES); MgCl₂ (10 mM); und Substrat (20 mM). Wenn das Gesamtprotein in der Probe niedrig war, und keine sichtbare Ausfällung mit einer Säure-Abschreckung stattfindet, wurde die Probe zweckdienlicherweise in der Küvette geassayt. Dieses Verfahren beinhaltete das Inkubieren einer Enzymprobe in einer Küvette, welche 20 mM Substrat (50 ml, 200 mM), 50 mM MES, 10 mM MgCl₂, pH 6,5-Puffer enthielt. Das letztendliche Phosphatase-Assayvolumen belief sich auf 0,5 ml. Die enzymhaltige Probe wurde der Reaktionsmischung zugegeben; der Inhalt der Küvette wurde gemischt, und dann wurde die Küvette in ein zirkulierendes Wasserbad bei T = 37 °C während 5 bis 120 Minuten eingebracht – abhängig davon, ob die Phosphataseaktivität in der Enzymprobe im Bereich von 2 bis 0,02 U/ml lag. Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugeben des sauren Molybdat-Reagenz (0,4 ml) abgelöscht. Nachdem das Fiske SubbaRow-Reagenz (0,1 ml) und destilliertes Wasser (1,5 ml) zugegeben wurden, wurde die Lösung gemischt und sich entwickeln gelassen. Nach 10 Minuten wurde die Absorption der Proben bei 660 nm unter Verwendung eines Cary 219 UV/Vis-Spektrophotometers abgelesen. Die Menge an freigesetztem anorganischem Phosphat wurde mit einer Standardkurve verglichen, welche unter Verwendung einer anorganischen Phosphat-Stammlösung (0,65 mM) und Herstellen von 6 Standards mit anorganischen Phosphat-Endkonzentrationen im Bereich von 0,026 bis 0,130 mmol/ml aufgestellt worden war.
Isolation und Identifikation von 1,3-Propandiol
Die Umwandlung von Glycerol zu 1,3-Propandiol wurde durch HPLC verfolgt. Analysen wurden ausgeführt unter Anwendung von Standardtechniken und von Materialien, welche dem Fachmann auf dem Gebiet der Chromatographie verfügbar sind. Ein geeignetes Verfahren verwendete ein Waters Maxima 820 HPLC-System unter Verwendung von UV (210 nm)- und RI-Detektion. Proben wurden auf eine Shodex SH-1011-Säule (8 mm × 300 mm, erworben von Waters, Milford, MA) injiziert, ausgestattet mit einer Shodex SH-1011P-Vorsäule (6 mm × 50 mm), welche hinsichtlich Temperatur auf 50 °C reguliert war, unter Verwendung von 0,01 N H₂SO₄ als mobiler Phase bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min. Wenn eine quantitative Analyse gewünscht war, wurden Proben mit einer bekannten Menge an Trimethylessigsäure als externem Standard hergestellt. Typischerweise beliefen sich die Retentionszeiten von Glycerol (RI-Detektion), 1,3-Propandiol (RI-Detektion) und Trimethylessigsäure (UV und RI-Detektion) auf 20,67 min, 26,08 min bzw. 35,03 min.
Die Herstellung von 1,3-Propandiol wurde durch GC/MS bestätigt. Analysen wurden unter Anwendung von Standardtechniken und Materialien durchgeführt, welche dem Fachmann auf dem Gebiet der GC/MS zur Verfügung stehen. Ein geeignetes Verfahren verwendete einen Hewlett Packard 5890 Series II-Gaschromatograph, der an einen Hewlett Packard 5971-Series massenselektiven Detektor (EI) und eine HP-INNOWax-Säule (30 m Länge, 0,25 mm Innendurchmesser, 0,25 Mikrometer Filmdicke) gekoppelt war. Die Retentionszeit und das Massenspektrum von dem erzeugten 1,3-Propandiol wurden mit denjenigen von authentischem 1,3-Propandiol (m/e: 57, 58) verglichen.
Ein alternatives Verfahren für GC/MS beinhaltete die Derivatisierung der Probe. Zu 1,0 ml an Probe (z. B. Kulturüberstand) wurden 30 μl konzentrierte (70 % v/v) Perchlorsäure zugesetzt. Nach dem Mischen wurde die Probe gefroren und lyophylisiert. Ein 1:1-Gemisch von Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid:Pyridin (300 μl) wurde zu dem lyophilisierten Material zugegeben, heftig vermischt und eine Stunde lang bei 65 °C platziert. Die Probe wurde von unlöslichem Material durch Zentrifugation geklärt. Die resultierende Flüssigkeit teilte sich in zwei Phasen, von denen die obere für die Analyse verwendet wurde. Die Probe wurde auf einer DB-S-Säule (48 m, 0,25 mm Innendurchmesser, 0,25 μm Filmdicke; von J&W Scientific) chromatographiert, und die Retentionszeit und das Massenspektrum des aus Kulturüberständen erhaltenen 1,3-Propandiol-Derivates wurden mit denjenigen verglichen, welche aus authentischen Standards erhalten worden waren. Das Massenspektrum von TMS-derivatisiertem 1,3-Propandiol enthält die charakteristischen Ionen von 205, 177, 130 und 115 AMU.
BEISPIEL 1
KLONIERUNG UND TRANSFORMATION VON E. COLI-WIRTSZELLEN MIT COSMID-DNA FÜR DIE EXPRESSION VON 1,3-PROPANDIOL
Medien
Synthetisches S12-Medium wurde im Screening von bakteriellen Transformanten hinsichtlich der Fähigkeit, 1,3-Propandiol herzustellen, eingesetzt. S12-Medium enthält: 10 mM Ammoniumsulfat, 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, 2 mM MgCl₂, 0,7 mM CaCl₂, 50 μM MnCl₂, 1 μM FeCl₃, 1 μM ZnCl, 1,7 μM CuSO₄, 2,5 μM CoCl₂, 2,4 μM Na₂MoO₄ und 2 μM Thiaminhydrochlorid.
Das Medium A, welches zum Wachstum und zur Fermentation verwendet wurde, bestand aus 10 mM Ammoniumsulfat; 50 mM MOPS/KOH-Puffer, pH 7,5; 5 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5; 2 mM MgCl₂; 0,7 mM CaCl₂; 50 μM MnCl₂; 1 μM FeCl₃; 1 μM ZnCl; 1,72 μM CuSO₄; 2,53 μM CoCl₂; 2,42 μM Na₂MoO₄; 2 μM Thiaminhydrochlorid; 0,01 % Hefeextrakt; 0,01 % Casaminosäure; 0,8 μg/ml Vitamin B₁₂; und 50 μg/ml Amp. Das Medium A wurde entweder mit 0,2 % Glycerol oder 0,2 % Glycerol plus 0,2 % D-Glucose ergänzt, wie erforderlich.
Zellen:
Klebsiella pneumoniae ECL2106 (Ruch et al., J. Bacteriol., 124, 348 (1975)), in der Literatur ebenfalls bekannt als K. aerogenes oder Aerobacer aerogenes, wurde von E. C. C. Lin (Harvard Medical School, Cambridge, MA) erhalten und wurde als eine Laboratoriumskultur aufrechterhalten.
Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 wurde von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erworben.
E. coli DH5a wurde von Gibco/BRL erworben und wurde mit der Cosmid-DNA transformiert, welche aus Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 isoliert wurde, enthaltend ein Gen, das entweder ein Glycerol- oder Diol-Dehydratase-Enzym codiert. Cosmide, welche die Glyceroldehydratase enthielten, wurden als pKP1 und pKP2 identifiziert, und Cosmide, welche das Dioldehydratase-Enzym enthielten, wurden als pKP4 identifiziert. Transformierte DH5a-Zellen wurden als DH5a-pKP1, DH5a-pKP2 und DH5a-pKP4 identifiziert.
E. coli ECL707 (Sprenger et al., J. Gen. Microbiol., 135, 1255 (1989)) wurde von E. C. C. Lin (Harvard Medical School, Cambridge, MA) erhalten und wurde in ähnlicher Weise mit Cosmid-DNA aus Klebsiella pneumoniae transformiert. Diese Transformanten wurden als ECL707-pKP1 und ECL707-pKP2, welche das Glyceroldehydratase-Gen enthielten, und ECL707-pKP4, enthaltend das Dioldehydratase-Gen, identifiziert.
E. coli AA200, welcher eine Mutation in dem tpi-Gen (Anderson et al., J. Gen Microbiol., 62, 329 (1970)) enthielt, wurde von dem E. coli Genetic Stock Center, Yale University (New Haven, CT) erworben und wurde mit Klebsiella-Cosmid-DNA transformiert, um die rekombinanten Organismen AA200-pKP1 und AA200-pKP2, welche das Glyceroldehydratase-Gen enthielten, sowie AA200-pKP4, welcher das Dioldehydratase-Gen enthielt, zu ergeben.
DH5a:
Sechs Transformationsplatten, welche ungefähr 1000 Kolonien von E. coli XL1-Blue MR, transfiziert mit K. pneumoniae-DNA, enthielten, wurden mit 5 ml LB-Medium gewaschen und zentrifugiert. Die Bakterien wurden pellettiert und in 5 ml LB-Medium + Glycerol resuspendiert. Ein Aliquot (50 μl) wurde in ein 15-ml-Röhrchen, welches synthetisches S 12-Medium mit 0,2 % Glycerol + 400 ng pro ml Vitamin B₁₂ + 0,001 % Hefeextrakt + 50 amp enthielt, inokuliert. Das Röhrchen wurde mit dem Medium bis zur Oberkante gefüllt und mit Parafilm eingewickelt und bei 30 °C inkubiert. Eine leichte Turbidität wurde nach 48 h beobachtet. Aliquots, welche bei 78 h und 132 h hinsichtlich der Produktverteilung analysiert wurden, wie oben stehend beschrieben, waren positiv hinsichtlich 1,3-Propandiol, wobei die letztgenannten Zeitpunkte erhöhte Mengen an 1,3-Propandiol enthielten.
Die Bakterien, welche sich als positiv hinsichtlich 1,3-Propandiol-Produktion im Test erwiesen, wurden seriell verdünnt und auf LB-50amp-Platten ausplattiert, um Einzelkolonien zu isolieren. 48 Einzelkolonien wurden isoliert und erneut hinsichtlich der Herstellung von 1,3-Propandiol überprüft. Cosmid-DNA wurde auch aus 6 unabhängigen Klonen isoliert und in den E. coli-Stamm DH5a transformiert. Die Transformanten wurden erneut hinsichtlich der Herstellung von 1,3-Propandiol überprüft. Zwei Transformanten wurden weiter charakterisiert und als DH5a-pKP1 und DH5a-pKP2 bezeichnet.
Ein 12,1 kb großes EcoRI-SalI-Fragment aus pKP1, subkloniert in pIBI31 (IBI Biosystem, New Haven, CT), wurde sequenziert und als pHK28-26 (SEQ ID NR.: 19) bezeichnet. Eine Sequenzierung enthüllte die Orte der relevanten offenen Leserahmen des dha-Operons, codierend Glyceroldehydratase, und für die Regulierung notwendige Gene. Unter Bezugnahme auf SEQ ID NR.: 19 wurde ein Fragment des offenen Leserahmens für dhaK, codierend Dihydroxyaceton-Kinase, an den Basen 1-399 gefunden; der offene Leserahmen dhaD, codierend Glyceroldehydrogenase, wird an Basen 983-2107 gefunden, der offene Leserahmen dhaR, codierend den Repressor, wird bei den Basen 2209-4134 gefunden, der offene Leserahmen dhaT; codierend 1,3-Propandiol-Oxidoreduktase, wird an Basen 5017-6180 gefunden; der offene Leserahmen dhaB1, codierend die Alpha-Untereinheit von Glyceroldehydratase, wird an Basen 7044-8711 gefunden; der offene Leserahmen dhaB2, codierend die Beta-Untereinheit von Glyceroldehydratase, wird an Basen 8724-9308 gefunden; der offene Leserahmen dhaB3, codierend die Gamma-Untereinheit von Glyceroldehydratase, wird an Basen 9311-9736 gefunden; und der offene Leserahmen dhaBX codierend ein Protein von unbekannter Funktion, wird bei den Basen 9749-11572 gefunden.
Einzelne Kolonien von E. coli XL1-Blue MR, welche mit verpackter Cosmid-DNA aus K. pneumoniae transfiziert worden waren, wurden in Mikrotiter-Vertiefungen inokuliert, welche 200 μl an S15-Medium (Ammoniumsulfat 10 mM; Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, 1 mM; MOPS/-KOH-Puffer, pH 7,0, 50 mM; MgCl₂, 2 mM; CaCl₂, 0,7 mM; MnCl₂, 50 μM; FeCl₃, 1 μM, ZnCl, 1 μM; CuSO₄, 1,72 μM; CoCl₂, 2,53 μM; Na₂MoO₄, 2,42 μM; und Thiaminhydrochlorid, 2 μM) + 0,2 % Glycerol + 400 ng/ml Vitamin B₁₂ + 0,001 % Hefeextrakt + 50 μg/ml Ampicillin enthielten. Zusätzlich zu den Mikrotitervertiefungen wurde auch eine Master-Platte, welche LB-50 amp enthielt, inokuliert. Nach 96 h wurden 100 μl entnommen und in einem Rainin-Mikrofugenröhrchen, das einen 0,2-Mikrometer-Nylon-Membranfilter enthält, zentrifugiert. Bakterien wurden zurückgehalten, und das Filtrat wurde für die HPLC-Analyse verarbeitet. Positive Klone, welche eine 1,3-Propandiol-Herstellung aufzeigten, wurden nach Screening von ungefähr 240 Kolonien identifiziert. Es wurden drei positive Klone identifiziert, von denen zwei auf LB-50 amp gewachsen waren, und dies bei einem von ihnen nicht der Fall war. Eine einzelne Kolonie, die aus einem der zwei positiven, auf LB-50 amp herangezogenen Klone isoliert und hinsichtlich der Produktion von 1,3-Propandiol überprüft wurde, wurde als pKP4 bezeichnet. Cosmid-DNA wurde aus E. coli-Stämmen isoliert, welche pKP4 enthielten, und der E. coli-Stamm DH5a wurde transformiert. Eine als DH5a-pKP4 bezeichnete unabhängige Transformante wurde hinsichtlich der Herstellung von 1,3-Propandiol überprüft.
ECL707:
E. coli-Stamm ECL707 wurde mit Cosmid-K.pneumoniae-DNA, entsprechend zu einem von pKP1, pKP2, pKP4, oder dem Supercos-Vektor allein transformiert und als ECL707-pKP1, ECL707-pKP2, ECL707-pKP4 bzw. ECL707-sc bezeichnet. ECL707 ist hinsichtlich glpK, gld und ptsD defizient, welche die ATP-abhängige Glycerolkinase, NAD⁺-verknüpfte Glyceroldehydrogenase bzw. Enzym II für Dihydroxyaceton des Phosphoenoipyruvat-abhängigen Phosphotransferase-Systems codieren.
Zwanzig Einzelkolonien von jeder Cosmid-Transformation und fünf von Transformation mit Supercos-Vektor allein (Negativkontrolle), isoliert von LB-50amp-Platten, wurden auf eine Master-LB-50amp-Platte transferiert. Diese Isolate wurden ebenfalls hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, Glycerol in 1,3-Propandiol umzuwandeln, um zu bestimmen, ob sie Dehydratase-Aktivität enthielten. Die Transformanten wurden mit einem sterilen Zahnstocher auf Mikrotiterplatten überführt, enthaltend 200 μl an Medium A, supplementiert entweder mit 0,2 Glycerol oder 0,2 % Glycerol plus 0,2 % D-Glucose. Nach 48-stündiger Inkubation bei 30 °C wurden die Inhalte der Mikrotiterplattenvertiefungen durch einen 0,45-Mikrometer-Nylonfilter filtriert und mittels HPLC chromatographiert. Die Ergebnisse dieser Tests sind in der Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Umwandlung von Glycerol zu 1,3-Propandiol durch transformierte ECL707

* (Anzahl von positiven Isolaten/Anzahl von getesteten Isolaten)

AA200:
E. coli-Stamm AA200 wurde mit Cosmid-K.pneumoniae-DNA, entsprechend einem von pKP1, pKP2, pKP4 und dem Supercos-Vektor allein transformiert, und AA200-pKP1, AA200-pKP2, AA200-pKP4 bzw. AA200-sc genannt. Der Stamm AA200 ist defizient hinsichtlich Triosephosphat-Isomerase (tpi^–).
Zwanzig einzelne Kolonien von jeder Cosmid-Transformation und fünf der Leer-Vektor-Transformation wurden isoliert und hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, Glycerol zu 1,3-Propandiol umzuwandeln, wie es für den E. coli-Stamm ECL707 beschrieben wurde. Die Ergebnisse dieser Tests sind in der Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Umwandlung von Glycerol zu 1,3-Propandiol durch transformierten AA200

* (Anzahl von positiven Isolaten/Anzahl von getesteten Isolaten)

BEISPIEL 2
UMWANDLUNG VON D-GLUCOSE ZU 1,3-PROPANDIOL DURCH REKOMBINANTEN E. coli UNTER VERWENDUNG VON DAR1, GPP2, dhaB UND dhaT
Konstruktion von Mehrzweck-Expressionsplasmiden zur Verwendung in der Transformation von Escherichia coli
Der Expressionsvektor pTacIQ
Der E. coli-Expressionsvektor pTacIQ enthält das lacIq-Gen (Farabaugh, Nature 274, 5673 (1978)) und den tac-Promotor (Amann et al., Gene 25, 167 (1983)) inseriert in die EcoRI von pBR322 (Sutcliffe et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 43, 77 (1979)). Eine Mehrfach-Klonierungsstelle und Terminatorsequenz (SEQ ID NR.: 20) ersetzen die pBR322-Sequenz von EcoRI bis SphI.
Subklonierung der Glyceroldehydratase-Gene (dhaB1, 2, 3)
Der offene Leserahmen für das dhaB3-Gen (beinhaltend eine EcoRI-Stelle am 5'-Ende und eine XbaI-Stelle am 3'-Ende) wurde aus pHK28-26 mittels PCR unter Verwendung von Primern (SEQ ID NR.: 21 und 22) amplifiziert. Das Produkt wurde in pLitmus29 (New England Biolab, Inc., Beverly, MA) subkloniert, um das Plasmid pDHAB3 zu erzeugen, welches dhaB3 enthielt.
Die Region, enthaltend die gesamte codierende Region für die vier Gene des dhaB-Operons aus pHK28-26, wurde in pBluescriptII KS+ (Stratagene, La Jolla, CA) unter Verwendung der Restriktionsenzyme KpnI und EcoRI kloniert, wodurch das Plasmid pM7 erzeugt wurde.
Das dhaBX-Gen wurde durch Verdau des Plasmids pM7, welches dhaB(1,2,3,4) enthielt, mit ApaI und XbaI (unter Deletion eines Teils von dhaB3 und der Gesamtheit von dhaBX) entfernt. Das resultierende 5,9 kb große Fragment wurde gereinigt und mit dem 325 bp großen ApaI-XbaI- Fragment aus Plasmid pDHAB3 ligiert (unter Wiederherstellung des dhaB3-Gens), wodurch pM11 erzeugt wird, welches dhaB(1,2,3) enthält.
Der offene Leserahmen für das dhaB1-Gen (beinhaltend eine HindIII-Stelle und eine Konsensus-RBS-Ribosomenbindungsstelle am 5'-Ende und eine XbaI-Stelle am 3'-Ende) wurde aus pHK28-26 mittels PCR unter Verwendung von Primern (SEQ ID NR.: 23 und SEQ ID NR.: 24) amplifiziert. Das Produkt wurde in pLitmus28 (New England Biolab, Inc.) subkloniert, um das Plasmid pDT1 zu erzeugen, welches dhaB1 enthält.
Ein NotI-XbaI-Fragment aus pM11, enthaltend einen Teil des dhaB1-Gens, das dhaB2-Gen und das dhaB3-Gen, wurde in pDT1 inseriert, um das dhaB-Expressionsplasmid pDT2 zu erzeugen. Das HindIII-XbaI-Fragment, enthaltend die dhaB(1,2,3)-Gene aus pDT2, wurde in pTacIQ inseriert, um pDT3 zu erzeugen.
Subklonierung des 1,3-Propandiol-Dehydrogenase-Gens (dhaT)
Das KpnI-SacI-Fragment von pHK28-26, enthaltend das vollständige 1,3-Propandiol-Dehydrogenase(dhaT)-Gen, wurde in pBluescriptII KS+ subkloniert, wodurch das Plasmid pAH1 erzeugt wurde. Das dhaT-Gen (beinhaltend eine XbaI-Stelle am 5'-Ende und eine BamHI-Stelle am 3'-Ende) wurde mittels PCR aus pAH1 als Matrizen-DNA unter Anwendung von synthetischen Primern (SEQ ID NR.: 25 mit SEQ ID NR.: 26) amplifiziert. Das Produkt wurde in pCR-Script (Stratagene) an der SrfI-Stelle subkloniert, um die Plasmide pAH4 und pAH5 zu erzeugen, welche dhaT enthalten. Das Plasmid pAH4 enthält das dhaT-Gen in der korrekten Orientierung für eine Expression vom lac-Promotor in pCR-Script aus, und pAH5 enthält das dhaT-Gen in der entgegengesetzten Orientierung. Das XbaI-BamHI-Fragment aus pAH4, enthaltend das dhaT-Gen, wurde in pTacIQ inseriert, um das Plasmid pAH8 zu erzeugen. Das HindIII-BamHI-Fragment aus pAH8, enthaltend die RBS und dhaT-Gen, wurde in pBluescriptII KS+ inseriert, um pAH11 zu erzeugen. Das HindIII-SalI-Fragment aus pAH8, enthaltend die RBS, dhaT-Gen und Terminator, wurde in pBluescriptII SK+ inseriert, um pAH12 zu erzeugen.
Konstruktion einer Expressionskassette für dhaB(1,2,3) und dhaT
Eine Expressionskassette für die dhaB(1,2,3) und dhaT wurde aus den individuellen dhaB(1,2,3)- und dhaT-Subklonen, welche oben beschrieben wurden, unter Anwendung von standardmäßigen molekularbiologischen Methoden zusammengefügt. Das SpeI-KpnI-Fragment aus pAH8, welches die RBS, dhaT-Gen und Terminator enthält, wurde in die XbaI-KpnI-Stellen von pDT3 inseriert, um pAH23 zu erzeugen. Das SmaI-EcoRI-Fragment zwischen dem dhaB3- und dhaT-Gen von pAH23 wurde entfernt, um pAH 26 zu erzeugen. Das SpeI-NotI-Fragment, welches eine EcoRI-Stelle aus pDT2 enthält, wurde verwendet, um das SpeI-NotI-Fragment von pAH26 zu ersetzen, um pAH27 zu erzeugen.
Konstruktion einer Expressionskassette für dhaT und dhaB(1,2,3)
Eine Expressionskassette für dhaT und dhaB(1,2,3) wurde aus den individuellen dhaB(1,2,3)- und dhaT-Subklonen, welche vorausgehend beschrieben sind, unter Anwendung von standardmäßigen Molekularbiologie-Methoden konstruiert. Ein SpeI-SacI-Fragment, enthaltend die dhaB(1,2,3)-Gene aus pDT3 wurde in pAH11 an den SpeI-SacI-Stellen inseriert, um pAH24 zu erzeugen.
Klonierung und Expression von Glycerol-3-Phosphatase für eine gesteigerte Glycerolherstellung in E. coli
Der Saccharomyces cerevisae-Chromosom V-Lambda-Klon 6592 (Gene Bank, Zugangs-# U18813 × 11) wurde von der ATCC erhalten. Das Glycerol-3-Phosphat-Phosphatase (GPP2)-Gen (beinhaltend eine BamHI-RBS-XbaI-Stelle am 5'-Ende und eine SmaI-Stelle am 3'-Ende) wurde durch PCR-Klonierung aus dem Lambda-Klon als Ziel-DNA unter Verwendung von synthetischen Primern (SEQ ID NR.: 27 mit SEQ ID NR.: 28) kloniert. Das Produkt wurde in pCR-Script (Stratagene) an der SrfI-Stelle subkloniert, um die Plasmide pAH15 zu erzeugen, enthaltend GPP2. Das Plasmid pAH15 enthält des GPP2-Gen in der inaktiven Orientierung für eine Expression von dem lac-Promotor in pCR-Script SK+ aus. Das BamHI-SmaI-Fragment aus pAH15, welches das GPP2-Gen enthält, wurde in pBlueScriptII SK+ inseriert, um das Plasmid pAH19 zu erzeugen. Das pAH19 enthält das GPP2-Gen in der korrekten Orientierung für eine Expression von dem lac-Promotor aus. Das XbaI-PstI-Fragment aus pAH19, welches das GPP2-Gen enthält, wurde in pPHOX2 inseriert, um das Plasmid pAH21 zu erzeugen.
Plasmide für die Expression von dhaT-, dhaB(1,2,3)- und GPP2-Genen
Ein SalI-EcoRI-XbaI-Linker (SEQ ID NR.: 29 und 30) wurde in pAH5 inseriert, welches mit den Restriktionsenzymen SalI-XbaI verdaut wurde, um pDT16 zu erzeugen. Der Linker zerstört die XbaI-Stelle. Das 1 kb große SalI-MluI-Fragment aus pDT16 wurde dann in pAH24 inseriert, wodurch das existierende SalI-MulI-Fragment ersetzt wurde, um pDT18 zu erzeugen.
Das 4,1 kb große EcoRI-XbaI-Fragment, welches die Expressionskassette für dhaT und dhaB(1,2,3) aus pDT18 enthält, und das 1,0 kb große XbaI-SalI-Fragment, welches das GPP2-Gen aus pAH21 enthält, wurden in den Vektor pMMB66EH (Füste et al., GENE, 48, 119 (1986)) inseriert, welcher mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SalI verdaut worden war, wodurch pDT20 erzeugt wurde.
Plasmide für die Überexpression von DAR1 in E. coli
DAR1 wurde durch PCR-Klonierung aus genomischer S. cerevisiae-DNA unter Verwendung von synthetischen Primern (SEQ ID NR.: 46 mit SEQ ID NR.: 47) isoliert. Die erfolgreiche PCR-Klonierung platziert eine NcoI-Stelle am 5'-Ende von DAR1, wobei das ATG innerhalb von NcoI das DAR1-Initiator-Methionin ist. Am 3'-Ende von DAR1 wird eine BamHI-Stelle im Anschluss an den Translationsterminator eingeführt. Die PCR-Fragmente wurden mit NcoI plus BamHI verdaut und in die gleichen Stellen innerhalb des Expressionsplasmids pTrc99A (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) kloniert, um pDAR1A zu ergeben.
Um eine bessere Ribosomenbindungsstelle am 5'-Ende von DAR1 zu erzeugen, wurde ein SpeI-RBS-NcoI-Linker, der erhalten wurde durch Aneinanderlagern von synthetischen Primern (SEQ ID NR.: 48 mit SEQ ID NR.: 49), in die NcoI-Stelle von pDAR1A inseriert, um pAH40 zu erzeugen. Das Plasmid pAH40 enthält die neue RBS und das DARI-Gen in der korrekten Orientierung für eine Expression vom trc-Promotor vom Trc99A (Pharmacia) aus. Das NcoI-BamHI-Fragment aus pDAR1A und ein zweiter Satz von SpeI-RBS-NcoI-Linker, erhalten durch Aneinanderlagern von synthetischen Primern (SEQ ID NR.: 31 mit SEQ ID NR.: 32), wurden in die SpeI-BamHI-Stelle von pBluescriptII-SK+ (Stratagene) inseriert, um pAH41 zu erzeugen. Das Konstrukt pAH41 enthält ein Ampicillin-Resistenzgen. Das NcoI-BamHI-Fragment aus pDAR1A und ein zweiter Satz von SpeI-RBS-NcoI-Linker, erhalten durch Aneinanderlagern von synthetischen Primern (SEQ ID NR.: 31 mit SEQ ID NR.: 32) wurde in die SpeI-BamH-Stelle von pBC-5K+ (Stratagene) inseriert, um pAH42 zu erzeugen. Das Konstrukt pAH42 enthält ein Chloramphenicol-Resistenzgen.
Konstruktion einer Expressionskassette für DAR1 und GPP2
Eine Expressionskassette für DAR1 und GPP2 wurde aus den oben beschriebenen individuellen DAR1- und GPP2-Subklonen unter Anwendung von molekularbiologischen Standardverfahren zusammengefügt. Das BamHI-PstI-Fragment aus pAH19, welches die RBS und das GPP2-Gen enthält, wurde in pAH40 inseriert, um pAH43 zu erzeugen. Das BamHI-PstI-Fragment aus pAH19, welches die RBS und das GPP2-Gen enthält, wurde in pAH41 inseriert, um pAH44 zu erzeugen. Das gleiche BamHI-PstI-Fragment aus pAH19, welches die RBS und das GPP2-Gen enthält, wurde auch in pAH42 inseriert, um pAH45 zu erzeugen.
Die Ribosomen-Bindungsstelle am 5'-Ende von GPP2 wurde wie folgend modifiziert. Ein BamHI-RBS-SpeI-Linker, der erhalten wurde durch Aneinanderlagern von synthetischen Primern GATCCAGGAAACAGA mit CTAGTCTGTTTCCTG an das XbaI-PstI-Fragment aus pAH19, welches das GPP2-Gen enthält, wurde in die BamHI-PstI-Stelle von pAH40 inseriert, um pAH48 zu erzeugen. Das Plasmid pAH48 enthält das DAR1-Gen, die modifizierte RBS und das GPP2-Gen in der korrekten Orientierung für eine Expression von dem trc-Promotor von pTrc99A (Pharmacia, Piscataway, N. J.) aus.
E. coli-Stamm-Konstruktion
E. coli W1485 ist ein Wildtyp-K-12-Stamm (ATCC 12435). Dieser Stamm wurde mit den Plasmiden pDT20 und pAH42 transformiert und auf LA-Platten (Luria Agar, Difco), welche mit 50 mg/ml Carbencillim und 10 mg/ml Chloramphenicol ergänzt waren, selektiert.
Herstellung von 1,3-Propandiol aus Glucose
E. coli W1845/pDT20/pAH42 wurde von der Platte in 50 ml eines Mediums überführt, welches pro Liter 22,5 g Glucose, 6,85 g K₂HPO₄, 6,3 g (NH₄)₂SO₄, 0,5 g NaHCO₃, 2,5 g NaCl, 8 g Hefeextrakt, 8 g Trypton, 2,5 mg Vitamin B₁₂, 2,5 ml modifizierte Balch-Spurenelementlösung, 50 mg Carbencillim und 10 mg Chloramphenicol, End-pH 6,8 (HCl), enthielt sowie sterilfiltriert worden war. Die Zusammensetzung von modifizierter Balch-Spurenelementlösung kann in Methods for General and Molecular Bacteriology (Hrsg.: P. Gerhardt et al., S. 158, American Society for Microbiology, Washington, DC (1994)) gefunden werden. Nach Inkubieren bei 37 °C, 300 U/min während 6 h wurden 0,5 g Glucose und IPTG (Endkonzentration = 0,2 mM) zugegeben, und das Schütteln wurde auf 100 U/min vermindert. Proben wurden mittels GC/MS analysiert. Nach 24 h erzeugte WI485/pDT20/pAH42 1,1 g/l Glycerol und 195 mg/l 1,3-Propandiol.
BEISPIEL 3
KLONIERUNG UND EXPRESSION VON dhaB UND dhaT IN Saccharomyces cerevisiae
Expressionsplasmide, welche als replizierende episomale Elemente existieren konnten, wurden für jedes der vier dha-Gene konstruiert. Für alle Expressionsplasmide war ein Hefe-ADH1-Promotor vorhanden und von einem Hefe-ADH1-Transkriptionsterminator durch Fragmente von DNA getrennt, welche Erkennungsstellen für eine oder mehrere Restriktionsendonukleasen enthielten. Jedes Expressionsplasmid enthielt auch das Gen für b-Lactamase für eine Selektion in E. coli auf Medien, welche Ampicillin enthalten, einen Replikationsursprung für die Plasmidaufrechterhaltung in E. coli und einen "2-Mikro"-Replikationsursprung zur Aufrechterhaltung in S. cerevisiae. Die für Hefe verwendeten und auf den Expressionsplasmiden vorhandenen selektierbaren Nährstoff-Marker waren eines der Folgenden: Imidazolglyceroiphosphat-Dehydratase codierendes HIS3-Gen, URA3-Gen, welches Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase codiert, TRP1-Gen, codierend N-(5'-Phosphoribosyl)-anthranilat-Isomerase, und LEU2, welches b-Isopropylmalat-Dehydrogenase codiert.
Die offenen Leseraster für dhaT, dhaB3, dhaB2 und dhaB1 wurden aus pHK28-26 (SEQ ID NR.: 19) durch PCR unter Verwendung von Primern (SEQ ID NR.: 38 mit SEQ ID NR.: 39, SEQ ID NR.: 40 mit SEQ ID NR.: 41, SEQ ID NR.: 42 mit SEQ ID NR.: 43, und SEQ ID NR.: 44 mit SEQ ID NR.: 45 für dhaT, dhaB3, dhaB2 bzw. dhaB1 ), beinhaltend EcoRI-Stellen an den 5'-Enden, amplifiziert (10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,0001 % Gelatine, 200 mM dATP, 200 mM dCTP, 200 mM dGTP, 200 mM dTTP, 1 mM jedes Primers, 1-10 ng Ziel-DNA, 25 Units/ml Amplitaqä-DNA-Polymesse (Perkin-Eimer Cetus, Norwalk CT)). Die PCR-Parameter beliefen sich auf 1 min. bei 94 °C, 1 min. bei 55 °C, 1 min. bei 72 °C, 35 Zyklen. Die Produkte wurden in die EcoRI-Stelle von pHIL-D4 (Phillips Petroleum, Bartlesville, OK) subkloniert, um die Plasmide pMP 13, pMP 14, pMP20 und pMP 15 zu erzeugen, welche dhaT, dhaB3, dhaB2 bzw. dhaB1 enthielten.
Konstruktion des dhaB1-Expressionsplasmides pMCK10
Das 7,8 kb große replizierende Plasmid pGADGH (Clontech, Palo Alto, CA) wurde mit HindIII verdaut, dephosphoryliert und an das dhaB1-HindIII-Fragment aus pMP 15 ligiert. Das resultierende Plasmid (pMCK10) wies dhaB1 in korrekter Orientierung für eine Transkription von dem ADH1-Promotor aus auf und enthielt einen LEU2-Marker.
Konstruktion des dhaB2-Expressionsplasmids pMCK17
Das Plasmid pGADGH (Clontech, Palo Alto, CA) wurde mit HindIII verdaut, und die einzelsträngigen Enden wurden zu EcoRI-Enden umgewandelt durch Ligation mit HindIII-XmnI- und EcoRI-XmnI-Adaptoren (New England Biolabs, Beverly, MA). Eine Selektion hinsichtlich Plasmiden mit korrekten EcoRI-Enden wurde durch Ligation an ein Kanamycin-Resistenzgen auf einem EcoRI-Fragment aus Plasmid pUC4K (Pharmacia Biotech, Uppsala), Transformation in den E.coli-Stamm DH5a und Selektion auf LB-Platten, welche 25 mg/ml Kanamycin enthielten, bewerkstelligt. Das resultierende Plasmid (pGAD/KAN2) wurde mit SnaBI und EcoRI verdaut, und ein 1,8 kb großes Fragment mit dem ADH1-Promotor wurde isoliert. Das Plasmid pGBT9 (Clontech, Palo Alto, CA) wurde mit SnaBI und EcoRI verdaut, und das 1,5 kb große ADH1/-GAL4-Fragment wurde durch das 1,8 kb große ADH1-Promotor-Fragment ersetzt, welches aus pGAD/KAN2 durch Verdau mit SnaBI und EcoRI isoliert worden war. Der resultierende Vektor (pMCK11) ist ein replizierendes Plasmid in Hefe mit einem ADH1-Promotor und -Terminator und einem TRP1-Marker. Das Plasmid pMCK11 wurde mit EcoRI verdaut, dephosphoryliert und an das dhaB2-EcoRI-Fragment aus pMP20 ligiert. Das resultierende Plasmid (pMCK17) wies dhaB2 in der korrekten Orientierung für eine Transkription von dem ADH1-Promotor aus auf und enthielt einen TRP1-Marker.
Konstruktion des dhaB3-Expressionsplasmids pMCK30
Das Plasmid pGBT9 (Clontech) wurde mit NaeI und PvuII verdaut, und das 1 kb große TRP1-Gen wurde aus diesem Vektor entfernt. Das TRPI-Gen wurde durch das URA3-Gen ersetzt, welches als ein 1,7 kb großes AatII/NaeI-Fragment aus dem Plasmid pRS406 (Stratagene) übenommen bzw. gespendet wurde, wodurch man den intermediären Vektor pMCK32 erhielt. Der auf pMCK32 vorhandene, trunkierte ADH1-Promotor wurde auf einem 1,5 kb großen SnaBI/EcoRI-Fragment entfernt und mit einem Volllängen-ADHI-Promotor auf einem 1,8 kb großen SnaBI/EcoRI-Fragment aus dem Plasmid pGAD/KAN2 ersetzt, um den Vektor pMCK26 zu ergeben. Die einmalige EcoRI-Stelle auf pMCK26 wurde verwendet, um ein EcoRI-Fragment mit dhaB3 aus dem Plasmid pMP14 zu inserieren, um pMCK30 zu erhalten. Bei dem replizierenden Expressionsplasmid pMCK30 lag dhaB3 in der Orientierung für eine Expression von dem ADH1-Promotor aus vor, und es besaß einen URA3-Marker.
Konstruktion des dhaT-Expressionsplasmids pMCK35
Das Plasmid pGBT9 (Clontech) wurde mit NaeI und PvuII verdaut, und das 1 kb große TRP1-Gen wurde aus diesem Vektor entfernt. Das TRPI-Gen wurde ersetzt durch ein HIS3-Gen, welches als ein XmnI/NaeI-Fragment aus dem Plasmid pRS403 (Stratagene) gespendet wurde, wodurch man den intermediären Vektor pMCK33 erhielt. Der trunkierte ADH1-Promotor, der auf pMCK33 vorhanden ist, wurde auf einem 1,5 kb großen SnaBI/EcoRI-Fragment entfernt und mit einem Volllängen-ADH1-Promotor auf einem 1,8 kb großen SnaBI/EcoRI-Fragment aus dem Plasmid pGAD/KAN2 ersetzt, um den Vektor pMCK31 zu ergeben. Die einmalige EcoRI-Stelle auf pMCK31 wurde verwendet, um ein EcoRI-Fragment mit dhaT aus dem Plasmid pMP 13 zu inserieren, wodurch man pMCK35 erhielt. Das replizierende Expressionsplasmid pMCK35 enthält dhaT in der Orientierung für eine Expression von dem ADH1-Promotor aus, und es weist einen HIS3-Marker auf.
Transformation von S. cerevisiae mit dha-Expressionsplasmiden
Der S. cerevisiae-Stamm YPH500 (ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-D63 his3-D200 leu2-D1) (Sikorski, R. S., und Hieter, P., Genetics 122, 19-27 (1989)), welcher von Stratagene (La Jolla, CA) erworben wurde, wurde mit 1-2 mg Plasmid-DNA unter Einsatz eines "Frozen-EZ"-Hefe-Transformations-Kits (Katalog #T2001) (Zymo Research, Orange, CA) transformiert. Kolonien wurden auf supplementiertem Minimalmedium (SMM – 0,67 % Hefe-Stickstoff-Basis ohne Aminosäuren, 2 % Glucose) während 3-4 Tagen bei 29 °C mit einem oder mehreren der folgenden Zusätze wachsen gelassen: Adeninsulfat (20 mg/l), Uracil (20 mg/l), L-Tryptophan (20 mg/l), L-Histidin (20 mg/l), L-Leucin (30 mg/l), L-Lysin (30 mg/l). Die Kolonien wurden auf Selektionsplatten ausgestrichen und verwendet, um Flüssigmedien anzuimpfen.
Screening von S. cerevisiae-Transformanten hinsichtlich dha-Genen
Chromosomale DNA aus URA⁺,HIS⁺,TRP⁺,LEU⁺-Transformanten wurde durch PCR unter Verwendung von Primern, welche für jedes Gen spezifisch waren (SEQ ID NR.: 38-45), analysiert. Das Vorhandensein von allen vier offenen Leserastern wurde bestätigt.
Expression von dhaB- und dhaT-Aktivität in transformiertem S. cerevisiae
Das Vorhandensein von aktiver Glyceroldehydratase (dhaB) und 1,3-Propandiol-Oxidoreduktase (dhaT) wurde unter Anwendung von in vitro-Enzym-Assays demonstriert. Darüber hinaus bestätigte Western-Blot-Analyse die Proteinexpression von allen vier offenen Leserahmen aus.
Der Stamm YPH500, transformiert mit der Gruppe von Plasmiden pMCK10, pMCK17, pMCK30 und pMCK35, wurde auf supplementiertem Minimalmedium, welches 0,67 % Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren, 2 % Glucose, 20 mg/l Adeninsulfat und 30 mg/l L-Lysin enthielt, wachsen gelassen. Zellen wurden homogenisiert, und Extrakte wurden hinsichtlich dhaB- Aktivität geassayt. Eine spezifische Aktivität von 0,12 Units pro mg Protein für Glyceroldehydratase und von 0,024 Units pro mg Protein für 1,3-Propandiol-Oxidoreduktase wurde erhalten.
BEISPIEL 4
PRODUKTION VON 1,3-PROPANDIOL AUS D-GLUCOSE UNTER VERWENDUNG VON REKOMBINANTEM Saccharomyces cerevisiae
S. cerevisiae YPH500, beinhaltend die Gruppen von Plasmiden pMCK10, pMCK17, pMCK30 und pMCK35, wurde einem BiostatB-Fermenter (B Braun Biotech, Inc.) in 1,0 1 Minimalmedium wachsen gelassen, welches anfänglich 20 g/l Glucose, 6,7 g/l Hefe-Stickstoff-Basis ohne Aminosäuren, 40 mg/l Adeninsulfat und 60 mg/l L-Lysin·HCl enthielt. Während des Verlaufs des Wachstums wurde ein zusätzliches Äquivalent von Hefe-Stickstoff-Basis, Adenin und Lysin zugesetzt. Der Fermenter wurde mit Zugabe von 10 % Phosphorsäure und 2 M NaOH, auf pH 5,5, 30°C, und 40% Gelöst-Sauerstoffspannung durch Bewegungssteuerung reguliert. Nach 38 h wurden die Zellen (OD₆₀₀ = 5,8 AU) durch Zentrifugation geerntet und in Basismedium (6,7 g/l Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren, 20 mg/l Adeninsulfat, 30 mg/l L-Lysin·HCl und 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0) resuspendiert.
Reaktionsmischungen, welche Zellen (OD₆₀₀ = 20 AU) in einem Gesamtvolumen von 4 ml Basismedium enthielten, das mit 0,5 % Glucose, 5 μg/ml Coenzym B₁₂ und 0, 10, 20 oder 40 mM Chloroquin ergänzt war, wurden in Abwesenheit von Licht und Sauerstoff (Stickstoffdurchblasung) in 10 ml großen Kräuselverschluss-Serumkolben hergestellt und bei 30°C unter Schütteln inkubiert. Nach 30 h wurden Aliquots entnommen und mittels HPLC analysiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Herstellung von 1,3-Propandiol unter Verwendung von rekombinantem S. cerevisiae
BEISPIEL 5
VERWENDUNG EINER S. cerevisiae-DOPPELTRANSFORMANTE FÜR DIE HERSTELLUNG VON 1,3-PROPANDIOL AUS D-GLUCOSE, WOBEI dhaB UND dhaT IN DAS GENOM INTEGRIERT SIND
Beispiel 5 demonstriert vorausschauend die Transformation von S. cerevisiae mit dhaB1, dhaB2, dhaB3 und dhaT sowie die stabile Integration der Gene in das Hefegenom für die Herstellung von 1,3-Propandiol aus Glucose.
Konstruktion von Expressionskassetten
Vier Expressionskassetten (dhaB1, dhaB2, dhaB3 und dhaT) werden für die Glucose-induzierte und konstitutive Hoch-Niveau-Expression dieser Gene in Hefe, Saccharomyces cerevisiae, konstruiert. Diese Kassetten bestehen aus: (i) dem Phosphoglyceratkinase(PGK)-Promotor von S. cerevisiae-Stamm S288C; (ii) einem der Gene dhaB1, dhaB2, dhaB3 oder dhaT; und (iii) dem PGK-Terminator aus S. cerevisiae-Stamm S288C. Die PCR-basierende Technik des Gen-Splicing durch Überlappungsverlängerung (Honon et al., BioTechniques, 8: 528-535 (1990)) wird eingesetzt, um DNA-Sequenzen zu rekombinieren, um diese Kassetten mit saumlosen Verbindungsstellen für eine optimale Expression jedes Gens zu erzeugen. Diese Kassetten werden individuell in einen geeigneten Vektor (pLITMUS 39) kloniert, welcher Restriktionsstellen aufweist, die für eine Multi-Kassetten-Klonierung in Hefe-Expressionsplasmiden zugänglich sind.
Konstruktion von Hefe-Integrationsvektoren
Vektoren, verwendet zur Bewirkung der Integration von Expressionskassetten in das Hefegenom, werden konstruiert. Diese Vektoren enthalten die folgenden Elemente: (i) eine Polyklonierungsregion, in welche Expressionskassetten subkloniert werden; (ii) einen einmaligen Marker, der verwendet wird, um hinsichtlich stabiler Hefe-Transformanten zu selektieren; (iii) Replikationsursprung und selektierbarer Marker, welche Gen-Manipulation in E. coli vor dem Transformieren von Hefe gestatten. Ein Integrationsvektor enthält den URA3-Auxotrophie-Marker (YIp352b), und ein zweiter Integrationsvektor enthält den LYS2-Auxotrophie-Marker (pKP7).
Konstruktion von Hefe-Expressionsplasmiden
Expressionskassetten für dhaB1 und dhaB2 werden in die Polyklonierungsregion des YIp352b (Expressionsplasmid # 1) subkloniert und Expressionskassetten für dhaB3 und dhaT werden in die Polyklonierungsregion von pKP7 (Expressionsplasmid #2) subkloniert.
Transformation von Hefe mit Expressionsplasmiden
S. cerevisiae (ura3, lys2) wird mit Expressionsplasmid # 1 unter Anwendung des "Frozen-EZ"-Hefe-Transformations-Kits (Zymo Research, Orange, CA) transformiert, und Transformanten werden auf Platten, denen Uracil fehlt, selektiert. Die Integration von Expressionskassetten für dhaB1 und dhaB2 wird durch PCR-Analyse von chromosomaler DNA bestätigt. Geeignete Transformanten werden mit Expressionsplasmid #2 unter Anwendung des Frozen-EZ-Hefe-Transformations-Kits erneut transformiert, und Doppel-Transformanten werden auf Platten, denen Lysin fehlt, selektiert. Eine Integration von Expressionskassetten für dhaB3 und dhaT wird durch PCR-Analyse von chromosomaler DNA bestätigt. Die Gegenwart von allen vier Expressionskassetten (dhaB1, dhaB2, dhaB3 und dhaT) in Doppeltransformanten wird durch PCR-Analyse von chromosomaler DNA bestätigt.
Proteinherstellung aus doppel-transformierter Hefe
Die Herstellung von Proteinen, welche von dhaB1, dhaB2, dhaB3 und dhaT codiert sind, aus doppelt-transformierter Hefe wird durch Western-Blot-Analyse bestätigt.
Enzymaktivität aus doppel-transformierter Hefe
Aktive Glyceroldehydratase und aktive 1,3-Propandiol-Dehydrogenase aus doppel-transformierter Hefe wird mittels Enzym-Assay bestätigt, wie obenstehend in Allgemeine Verfahren beschrieben wurde.
Herstellung von 1,3-Propandiol aus doppel-transformierter Hefe
Die Herstellung von 1,3-Propandiol aus Glucose in doppel-transformierter Hefe wird im Wesentlichen aufgezeigt, wie beschrieben in Beispiel 4.
BEISPIEL 6
KONSTRUKTION VON PLASMIDEN, ENTHALTEND DAR1/GPP2 ODER dhaT/dhaB1-3 UND TRANSFORMATION IN KLEBSIELLA-SPEZIES
K. pneumoniae (ATCC 25955), K. pneumoniae (ECL2106) und K. oxytoca (ATCC 8724) sind natürlicherweise resistent gegenüber Ampicillin (bis zu 150 μg/ml) und Kanamycin (bis zu 50 μg/ml), jedoch empfindlich gegenüber Tetracyclin (10 μg/ml) und Chloramphenicol (25 μg/ml). Folglich sind replizierende Plasmide, welche Resistenz gegen diese letztgenannten zwei Antibiotika codieren, potenziell nützlich als Klonierungsvektoren für diese Klebsiella-Stämme. Das Wiltyp-Kpneumoniae (ATCC 25955), das Glucose-dereprimierte K. pneumonia (ECL2106) und K. oxytoca (ATCC 8724) wurden erfolgreich zur Tetracyclin-Resistenz durch Elektroporation mit dem Mäßig-Kopienzahl-Plasmid pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) transformiert. Dies wurde mittels des folgenden Vorgehens bewerkstelligt: Zehn ml einer Übernachtkultur wurden in 1 l LB (1 % (w/v) Bacto-Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5 % (w/v) Bacto-Hefe-Extrakt (Difco) und 0,5 % (w/v) NaCl (Sigma, St. Louis, MO)) inokuliert, und die Kultur wurde bei 37°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,5-0,7 inkubiert. Die Zellen wurden auf Eis gekühlt, durch Zentrifugation bei 4000 × g während 15 min geerntet und in 1 1 eiskaltem sterilen 10%igem Glycerol resuspendiert. Die Zellen wurden wiederholt durch Zentrifugation geerntet und progressiv in 500 ml, 20 ml und schließlich 2 ml eiskaltem sterilen 10%igem Glycerol resuspendiert. Für die Elektroporation wurden 40 μl Zellen mit 1-2 μl DNA in einer gekühlten 0,2-cm-Küvette gemischt und wurden bei 200 Ω, 2,5 kV während 4-5 msec. unter Anwendung eines BioRad-Gene-Pulsers (BioRad, Richmond, CA) gepulst. Ein ml SOC-Medium (2 % (w/v) Bacto-Trypton (Difco), 0,5 % (w/v) Bacto-Hefeextrakt (Difco), 10 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 2,5 mM KCl und 20 mM Glucose) wurde den Zellen zugesetzt, und, nachdem die Suspension in ein 17 × 100 mm großes steriles Polypropylen-Röhrchen überführt worden war, wurde die Kultur 1 h lang bei 37 °C, 225 U/min. inkubiert. Aliquots wurden auf Selektiv-Medium ausplattiert, wie angegeben. Analysen der Plasmid-DNA aus unabhängigen Tetracyclinresistenten Transformanten zeigten die für pBR322 typischen Restriktionsendonuklease-Verdau-Muster, was anzeigt, dass der Vektor stabil nach Übernachtkultur bei 37 °C in LB mit Tetracyclin (10 μg/ml) beibehalten wurde. Somit können dieser Vektor und Derivate, wie pBR329 (ATCC 37264), welcher Resistenz gegen Ampicillin, Tetracyclin und Chloramphenicol codiert, verwendet werden, um die DARI/GPP2- und dhaT/dhaB1-3-Expressionskassetten in K. pneumoniae und K. oxytoca einzubringen.
Die DAR1- und GPP2-Gene können durch PCR-vermittelte Amplifikation aus dem Saccharomyces cerevisiae-Genom, basierend auf ihrer bekannten DNA-Sequenz, erhalten werden. Die Gene werden dann in K. pneumoniae oder K. oxytoca unter der Kontrolle von einem oder mehreren Promotoren, die verwendet werden können, um ihre Expression in glucosehaltigen Medien zu steuern, transformiert. Zur Bequemlichkeit wurden die Gene auf einem 2,4 kb großen DNA-Fragment erhalten, welches durch den Verdau von Plasmid pAH44 mit der Restriktionsendonuklease PvuII erhalten wurde, wodurch die Gene bereits in einer Expressionskassette unter der Kontrolle des E. coli-lac-Promotors angeordnet sind. Dieses DNA-Fragment wurde an PvuII-verdauten pBR329 ligiert, wodurch die Insertions-Inaktivierung von dessen Chloramphenicol-Resistenz-Gen hervorgerufen wurde. Die ligierte DNA wurde verwendet, um E. coli DH5α (Gibco, Gaithersberg, MD) zu transformieren. Transformanten wurden mittels ihrer Resistenz gegenüber Tetracyclin (10 μg/ml) selektiert, und wurden nach ihrer Empfindlichkeit gegenüber Chloramphenicol (25 μg/ml) gescreent. Die Analyse der Plasmid-DNA aus Tetracyclinresistenten, Chloramphenicol-empfindlichen Transformanten bestätigte das Vorhandensein der erwarteten Plasmide, bei welchen die P_lac-dar1-gpp2-Expressionkassette in beiden Orientierungen in die pBR329-PvuII-Stelle subkloniert worden war. Diese Plasmide, welche als pJSP1A (Uhrzeigersinn-Orientierung) und pJSP1B (Orientierung gegen den Uhrzeigersinn) bezeichnet werden, wurden separat durch Elektroporation in K. pneumonia (ATCC 25955), K. pneumonia (ECL2106) und K. oxytoca (ATCC 8724) transformiert, wie beschrieben. Transformanten wurden durch ihre Resistenz gegen Tetracyclin (10 μg/ml) selektiert und wurden hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit gegenüber Chloramphenicol (25 μg/ml) gescreent. Eine Restriktionsanalyse der aus unabhängigen Transformanten isolierten Plasmide zeigte nur die erwarteten Verdaumuster und bestätigte, dass sie bei 37 °C mit Antibiotikumselektion stabil beibehalten wurden. Die Expression der Gene DAR1 und GPP2 kann durch die Zugabe von IPTG (0,2-2,0 mM) zu dem Wachstumsmedium gesteigert werden.
Die vier K. pneumoniae-Gene dhaB(1-3) und dhaT können durch PCR-vermittelte Amplifikation aus dem K. pneumoniae-Genom, basierend auf ihrer bekannten DNA-Sequenz, erhalten werden. Dieses Gene werden dann in K. pneumoniae unter der Kontrolle von einem oder mehreren Promotoren, welche verwendet werden können, um ihre Expression in glucosehaltigen Medien zu steuern, transformiert. Zur Bequemlichkeit wurden die Gene auf einem ungefähr 4,0 kb großen DNA-Fragment erhalten, welches durch Verdau von Plasmid pAH24 mit den Restriktionsendonukleasen KpnI/SacI erhalten wurde, wodurch die Gene bereits in einer Expressionskassette unter der Kontrolle des E.coli-lac-Promotors angeordnet sind. Dieses DNA-Fragment wurde an gleicherweise verdauten pBC-KS+ (Stratagene, La Jolla, CA) ligiert und verwendet, um E. coli DH5α zu transformieren. Die Transformanten wurden hinsichtlich ihrer Resistenz gegen Chloramphenicol (25 μg/ml) selektiert und wurden hinsichtlich eines weißen Kolonie-Phänotyps auf LB-Agar, der X-gal enthielt, gescreent. Eine Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA aus Chloramphenicol-resistenten Transformanten, welche den weißen Kolonie-Phänotyp aufzeigten, bestätigte das Vorhandensein des erwarteten Plasmides, bezeichnet als pJSP2, in welchem die dhaT-dhaB(1-3)-Gene unter der Kontrolle des E. coli-lac-Promotors subkloniert waren.
Um die Umwandlung von Glucose zu 1,3-Propandiol zu steigern, wurde dieses Plasmid separat durch Elektroporation in K. pneumoniae (ATCC 25955) (pJSP1A), K. pneumoniae (ECL2106) (pJSP1A) und K. oxytoca (ATCC 8724) (pJSP1A), welche die P_lac-dar1-gpp2-Expressionskassette bereits enthielten, transformiert. Co-Transformanten wurden durch ihre Resistenz gegen sowohl Tetracyclin (10 μg/ml) als auch Chloramphenicol (25 μg/ml) selektiert. Eine Restriktionsanalyse der Plasmide, isoliert aus unabhängigen Cotransformanten, zeigte die Verdau-Muster, welche sowohl für pJSP1A als auch pJSP2 erwartet wurden. Die Expression der Gene DAR1, GPP2, dhaB(1-3), und dhaT kann durch die Zugabe von IPTG (0,2-2,0 mM) zu dem Medium verstärkt werden.
BEISPIEL 7
Herstellung von 1,3-Propandiol aus Glucose durch K. pneumoniae
Klebsiella pneumoniae-Stämme ECL 2106 und 2106-47, die beide mit pJSP1A transformiert waren, und ATCC 25955, der mit pJSPA1 und pJSP2 transformiert war, wurden in einem 5 l großen Applikon-Fermenter unter verschiedenen Bedingungen (siehe Tabelle 4) für die Herstellung von 1,3-Propandiol aus Glucose wachsen gelassen. Der Stamm 2104-47 ist ein Fluoracetat-tolerantes Derivat von ECL 2106, welches erhalten wurde von einer Fluoracetat/-Lactat-Selektionsplatte, wie beschrieben in Bauer et al., Appl. Environ. Microbiol. 56, 1296 (1990). In jedem Fall enthielt das verwendete Medium 50-100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, 40 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1 % (w/v) Hefeextrakt, 10 μm CoCl₂, 6,5 μM CuCl₂, 100 μM FeCl₃, 18 μM FeSO₄, 5 μM H₃BO₃, 50 μM MnCl₂, 0,1 μM Na₂MoO₄, 25 μM ZnCl₂, 0,82 mM MgSO₄, 0,9 mM CaCl₂ und 10-20 g/l Glucose. Zusätzliche Glucose wurde zugeführt, wobei restliche Glucose im Überschuss gehalten wurde. Die Temperatur wurde bei 37 °C gesteuert, und der pH-Wert wurde mit 5N KOH oder NaOH auf 7,5 geregelt. Passende Antibiotika wurden für die Plasmid-Beibehaltung eingeschlossen; IPTG (Isopropyl-b-D-thiogalactopyranosid) wurde bei den angegebenen Konzentrationen ebenfalls zugesetzt. Für anaerobe Fermentationen wurde 0,1 vvm Stickstoff durch den Reaktor geblasen; wenn der dO-Einstellpunkt sich auf 5 % belief wurde 1 vvm Luft durch den Reaktor geblasen, und das Medium wurde mit Vitamin B12 ergänzt. Endkonzentrationen und Gesamterträge (g/g) sind in der Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Herstellung von 1,3-Propandiol aus Glucose durch K. pneumoniae
BEISPIEL 8
Umwandlung von Kohlenstoffsubstraten zu 1,3-Propandiol durch rekombinanten K. pneumoniae welcher dar1, gpp2, dhaB und dhaT enthält
A. Umwandlung von D-Fructose zu 1,3-Propandiol durch verschiedene rekombinante K. pneumoniae-Stämme:
Einzelkolonien von K. pneumoniae (ATCC 25955 pJSP1A), K. pneumoniae (ATCC 25955 pJSPA1/pJSP2), K. pneumoniae (ATCC 2106 pJSP1A) und K. pneumoniae (ATCC 2106 pJSP1A/pJSP2) wurden von Agarplatten überführt und wurden in getrennten Kulturröhrchen über Nacht in Luria-Bertani(LB)-Nährmedium subkultiviert, welches die passenden Antibiotika-Agenz(ien) enthielt. Eine 50 ml große Flasche enthielt 45 ml eines sterilfiltrierten Minimalmediums, definiert als LLMM/F, welches je Liter Folgendes enthält: 10 g Fructose; 1 g Hefeextrakt; 50 mmol Kaliumphosphat, pH 7,5; 40 mmol (NH₄)₂SO₄; 0,09 mmol Calciumchlorid; 2,38 mg CoCl₂·6H₂O; 0,88 mg CuCl₂·2H₂O; 27 mg FeCl₃·6H₂O; 5 mg FeSO₄·7H₂O; 0,31 mg H₃BO₃; 10 mg MnCl₂·4H₂O; 0,023 mg Na₂MoO₄·2H₂O; 3,4 mg ZnCl₂; 0,2 g MgSO₄·7H₂O.
Tetracyclin bei 10 μg/ml wurde dem Medium für Reaktionen unter Verwendung von einer der beiden der Einzel-Plasmidrekombinanten zugesetzt; 10 μg/ml Tetracyclin und 25 μg/ml Chloramphenicol wurden für Reaktionen unter Verwendung von einer der beiden Doppel-Plasmidrekombinanten zugesetzt. Das Medium wurde gründlich mit Stickstoff durchblasen, vor Inokulierung mit 2 ml der Teilkultur. IPTG (I) bei einer Endkonzentration von 0,5 mM wurde zu einigen Flaschen zugegeben. Die Flaschen wurden verschlossen, und dann bei 37 °C, 100 U/min. in einem New Brunswick Series 25-Inkubator/Schüttler inkubiert. Die Reaktionen wurden mindestens 24 Stunden lang oder bis der Großteil des Kohlenstoffsubstrates zu Produkten umgewandelt war, ausgeführt. Die Proben wurden durch HPLC analysiert. Die Tabelle 5 beschreibt die Ausbeuten an 1,3-Propandiol (3G), welches aus Fructose durch die verschiedenen Klebsiella-Rekombinanten hergestellt wurde. Tabelle 5 Herstellung von 1,3-Propandiol aus D-Fructose unter Verwendung von rekombinantem Klebsiella
B. Umwandlung von verschiedenen Kohlenstoffsubstraten zu 1,3-Propandiol durch K. pneumoniae (ATCC 25955 pJSP1A/pJSP2):
Ein Aliquot (0,1 ml) von gefrorenen Stammkulturen von K. pneumoniae (ATCC 25955 pJSP1A/pJSP2) wurde in 50 ml Animpfmedium in einem 250 ml großen Schikanen-Kolben überführt. Das Animpfmedium enthielt pro Liter: 0,1 molar NaK/PO₄-Puffer, pH 7,0; 3 g (NH₄)₂SO₄; 5 g Glucose, 0,15 g MgSO₄·7H₂O, 10 ml 100X Spurenelement-Lösung, 25 mg Chloramphenicol, 10 mg Tetracyclin und 1 g Hefeextrakt. Die 100X-Spurenelemente enthielten je Liter: 10 g Zitronensäure, 1,5 g CaCl₂·2H₂O, 2,8 g FeSO₄·7H₂O, 0,39 g ZnSO₄·7H₂O, 0,38 g CuSO₄·5H₂O, 0,2 g CoCl₂·6H₂O und 0,3 g MnCl₂·4H₂O. Die resultierende Lösung wurde entweder mit KOH oder H₂SO₄ bis zu pH 7,0 titriert. Die Glucose, Spurenelemente, Antibiotika und Hefeextrakte wurden separat sterilisiert. Das Animpf-Inokulum wurde über Nacht bei 35 °C und 250 U/min wachsen gelassen.
Die Reaktionsauslegung war semi-aerob. Das System enthielt 130 ml Reaktionsmedium in verschlossenen 125 ml großen Kolben, welche, mit einem Aluminiumfolien-Streifen, teilweise offen gelassen wurden. Das Reaktionsmedium enthielt pro Liter: 3 g (NH₄)₂SO₄; 20 g Kohlenstoffsubstrat, 0,15 molar NaK/PO₄-Puffer, pH 7,5; 1 g Hefeextrakt; 0,15 g MgSO₄·7H₂O; 0,5 mmol IPTG; 10 ml 100X Spurenelement-Lösung; 25 mg Chloremphenicol; und 10 mg Tetracyclin. Die resultierende Lösung wurde mit KOH oder H₂SO₄ auf pH 7,5 titriert. Die Kohlenstoffquellen waren: D-Glucose (Glc); D-Fructose (Frc); D-Lactose (Lac); D-Saccharose (Suc); D-Maltose (Mal); und D-Mannitol (Man). Einige wenige Glaskügelchen wurden in das Medium eingeschlossen, um das Vermischen zu verbessern. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von Animpf-Inokulum initiiert, so dass die optische Dichte der Zellsuspension bei 0,1 AU startete, wie gemessen bei I₆₀₀ nm. Die Kolben wurden bei 35 °C und 250 U/min. inkubiert. Die 3G-Herstellung wurde mittels HPLC nach 24 Stunden gemessen. Die Tabelle 6 beschreibt die Ausbeuten an 1,3-Propandiol, welches aus den verschiedenen Kohlenstoffsubstraten hergestellt wurde. Tabelle 6 Herstellung von 1,3-Propandiol aus verschiedenen Kohlenstoffsubstraten unter Verwendung von rekombinantem Klebsiella 25955 pJSP1A/pJSP2
BEISPIEL 9
VERBESSERUNG DER 1,3-PROPANDIOL-HERSTELLUNG UNTER VERWENDUNG DES dhaBX-GENS
Das Beispiel 9 zeigt die verbessern Herstellung von 1,3-Propandiol in E. coli, wenn ein Gen, welches ein Protein X codiert, eingeführt wird.
Konstruktion des Expressionsvektors pTacIQ
Der E. coli-Expressionsvektor pTacIQ, der das lacIq-Gen (Farabaugh, P. J. 1978, Nature 274 (5673) 765-769) und den tac-Promotor (Amann et al., 1983, Gene 25, 167-178) enthielt, wurde in die Restriktionsendonuklease-Stelle EcoRI von pBR322 (Sutcliffe, 1979, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 43, 77-90) inseriert. Eine Mehrfachklonierungsstelle und Terminatorsequenz (SEQ ID NR.: 50) ersetzt die pBR322-Sequenz von EcoRI bis SphI.
Subklonierung der Glyceroldehydratase-Gene (dhaB1, 2, 3, X)
Die Region, welche die gesamte codierende Region für Klebsiella-dhaB1, -dhaB2, -dhaB3 und dhaBX des dhaB-Operons aus pHK28-26 enthielt, wurde in pBluescriptIIKS+ (Stratagene) unter Verwendung der Restriktionsenzyme KpnI und EcoRI kloniert, um das Plasmid pM7 zu erzeugen.
Der offene Leserahmen für das dhaB3-Gen wurde aus pHK 28-26 mittels PCR unter Verwendung von Primern (SEQ ID NR.: 51 und SEQ ID NR.: 52) amplifiziert, beinhaltend eine EcoRI-Stelle am 5'-Ende und eine XbaI-Stelle am 3'-Ende. Das Produkt wurde in pLitmus29 (NEB) subkloniert, um das Plasmid pDHAB3, welches dhaB3 enthielt, zu erzeugen.
Das dhaBX-Gen wurde entfernt durch Verdauen von Plasmid pM7 mit ApaI und XbaI, Reinigen des 5,9 kb großen Fragmentes und Ligieren desselben mit dem 325 by großen ApaI-XbaI-Fragment aus dem Plasmid pDHAB3, um pM11 zu erzeugen, welches dhaB, dhaB2 und dhaB3 enthielt.
Der offene Leserahmen für das dhaB1-Gen wurde aus pHK28-26 durch PCR unter Verwendung von Primern (SEQ ID NR.: 53 und SEQ ID NR.: 54) amplifiziert, beinhaltend eine HindIII-Stelle und eine Konsensus-Ribosomenbindungsstelle am 5'-Ende sowie eine XbaI-Stelle am 3'-Ende. Das Produkt wurde in pLitmus 28 (NEB) subkloniert, um die Plasmide pDT1 zu erzeugen, enthaltend dhaB1.
Ein NotI-XbaI-Fragment aus pM11, welches einen Teil des dhaB1-Gens, das dhaB2-Gen und das dhaB3-Gen enthielt, wurde in pDT1 inseriert, um das dhaB-Expressionsplasmid pDT2 zu erzeugen. Das HindIII-XbaI-Fragment, welches die dhaB(1,2,3)-Gene aus pDT2 enthielt, wurde in pTacIQ inseriert, um pDT3 zu erzeugen.
Subklonierung des TMG-Dehydrogenase-Gens (dhaT)
Das KpnI-SacI-Fragment von pHK28-26, welche das TMG-Dehydrogenase(dhaT)-Gen enthielt, wurde in pBluescriptII KS+ subkloniert, wodurch das Plasmid pAH1 erzeugt wurde. Das dhaT-Gen wurde durch PCR aus pAH1 als Matrizen-DNA und synthetische Primer (SEQ ID NR.: 55 mit SEQ ID NR.: 56) kloniert, beinhaltend eine XbaI-Stelle am 5'-Ende und eine BamHI-Stelle am 3'-Ende. Das Produkt wurde in pCR-Script (Strategene) an der SrfI-Stelle subkloniert, um die Plasmide pAH4 und pAH5 zu erzeugen, enthaltend dhaT. Das pAH4 enthält das dhaT-Gen in der richtigen Orientierung für eine Expression von dem lac-Promotor in pCR-Script aus, und pAH5 enthält das dhaT-Gen in der entgegengesetzten Orientierung. Das XbaI-BamHI-Fragment aus pHA4, welches das dhaT-Gen enthielt, wurde in pTacIQ inseriert, um das Plasmid pAH8 zu erzeugen. Das HindII-BamHI-Fragment aus pAH8, enthaltend die RBS und das dhaT-Gen, wurde in pBluescriptIIKS+ inseriert, um pAH11 zu erzeugen.
Konstruktion einer Expressionskassette für dhaT und dhaB(1,2,3)
Eine Expressionskassette für dhaT und dhaB(1,2,3) wurde aus den vorstehend beschriebenen, individuellen dhaB(1,2,3)- und dhaT-Subklonen unter Anwendung von standardmäßigen Molekularbiologie-Methoden zusammengefügt. Ein SpeI-SacI-Fragment, das die dhaB(1,2,3)-Gene aus pDT3 enthielt, wurde in pAH11 an den SpeI-SacI-Stellen inseriert, um pAH24 zu erzeugen. Ein SalI-XbaI-Linker (SEQ ID NR.: 57 und SEQ ID NR.: 58) wurde in pAH5 inseriert, welches mit den Restriktionsenzymen SalI-XbaI verdaut wurde, um pDT16 zu erzeugen. Der Linker zerstört die XbaI-Stelle. Das 1 kb große SalI-MluI-Fragment aus pDT16 wurde dann in pAH24 inseriert, wodurch das existierende SalI-MluI-Fragment ersetzt wurde, um pDT18 zu erzeugen.
Plasmid für die Überexpression von dhaT und dhaB(1,2,3,X) in E. coli
Das 4,4 kb große NotI-XbaI-Fragment, das einen Teil des dhaB1-Gens, dhaB2, dhaB3 und dhaBX aus Plasmid pM7 enthielt, wurde gereinigt und mit dem 4,1 kb großen NotI-XbaI-Fragment aus dem Plasmid pDT18 ligiert (unter Wiederherstellung von dhaB1), um pM33 zu erzeugen, welches das dhaB1, dhaB2, dhaB3 und dhaBX enthält.
E. coli-Stamm
E. coli DH5a wurde von BRL (Difco) erhalten. Dieser Stamm wurde mit den Plasmiden pM7, pM11, pM33 oder pDt18 transformiert und auf LA-Platten, die 100 μg/ml Carbenicillin enthielten, selektiert.
Herstellung von 1,3-Propandiol
E. coli DH5a, welcher Plasmid pM7, pM11, pM33 oder pDT18 enthielt, wurde auf LA-Platten mit 100 μg/ml Carbenicillin über Nacht bei 37 °C wachsen gelassen. Eine Kolonie von jedem wurde verwendet, um 25 ml Medium (0,2 M KH₂PO₄, Zitronensäure 2,0 g/l, MgSO₄·7H₂O 2,0 g/l, H₂SO₄ (98 %) 1,2 ml/l, Eisen(III)-ammoniumcitrat 0,3 g/l, CaCl₂·2H₂O 0,2 g, Hefeextrakt 5 g/l, Glucose 10 g/l, Glycerol 30 g/l) plus Vitamin B12 bei 0,005 g/l, 0,2 mM IPTG, 200 μg/ml Carbenicillin und 5 ml modifizierte Balch's Spurenelementlösung (deren Zusammensetzung gefunden werden kann in "Methods for General and Molecular Bacteriology" (Hrsg.: P. Gerhardt et al., S. 158, American Society for Microbiology, Washington, DC 1994) End-pH 6,8 (NH₄OH), zu inokulieren, wonach in 250-ml-Erlenmeyerkolben steril filtriert wurde. Die Schüttelkolben wurden bei 37 °C unter Schütteln (300 U/min.) mehrere Tage lang inkubiert, wobei aus ihnen währenddessen für HPLC-Analyse mittels Standardverfahrensweisen Proben entnommen wurden. Die Endausbeuten sind in der Tabelle 4 gezeigt.
Insgesamt, wie gezeigt in der Tabelle 7, deuten die Ergebnisse an, dass die Expression von dhaBX in Plasmiden, welche dhaB(1,2,3) oder dhaT-dhaB(1,2,3) exprimieren, in großem Maße die Herstellung von 1,3-Propandiol steigert. TABELLE 7 Effekt von dhaBX-Expression auf die Herstellung von 1,3-Propandiol durch E. coli

*Ausgedrückt als ein Mittelwert aus mehreren Experimenten.

Primer:

SEQ ID NR.: 50 – MCS-TERMINATOR: 5 AGCTTAGGAGTCTAGAATATTGAGCTCGAATTCCCGGGCATGCGGTACCGGATCCAGAAAA AAGCCCGCACCTGACAGTGCGGGCTTTTTTTTT 3'
SEQ ID NR.: 51 – dhaB3-5'-Ende. EcoRI GGAATTCAGATCTCAGCAATGAGCGAGAAAACCATGC
SEQ ID NR.: 52: dhaB3-3'-Ende XbaI GCTCTAGATTAGCTTCCTTTACGCAGC
SEQ ID NR.: 53: dhaB1 5'-Ende-HindIII-SD 5' GGCCAAGCTTAAGGAGGTTAATTAAATGAAAAG 3'
SEQ ID NR.: 54: dhaB1 3'-Ende-XbaI 5' GCTCTAGATTATTCAATGGTGTCGGG 3'
SEQ ID NR.: 55: dhaT 5'-Ende-XbaI 5' GCGCCGTCTAGAATTATGAGCTATCGTATGTTTGATTATCTG 3'
SEQ ID NR.: 56: dhaT 3'-Ende-BamHI 5' TCTGATACGGGATCCTCAGAATGCCTGGCGGAAAAT 3'
SEQ ID NR.: 57: pUSH Linker1: 5' TCGACGAATTCAGGAGGA 3'
SEQ ID NR.: 58: pUSH Linker2: 5' CTAGTCCTCCTGAATTCG 3'

BEISPIEL 10
Reaktivation der Glyceroldehydratase-Aktivität
Das Beispiel 10 demonstriert die in vivo-Reaktivierung der Glyceroldehydratase-Aktivität in Mikroorganismen, welche wenigstens ein Gen enthalten, das Protein X codiert.
Die Plasmide pM7 und pM11 wurden wie in Beispiel 9 beschrieben konstruiert und in E.coli-DH5α-Zellen transformiert. Die transformierten Zellen wurden kultiviert und hinsichtlich der Herstellung von 1,3-Propandiol gemäß des Verfahrens von Honda et al. (1980, In Situ Reactivation of Glycerol-Inactivated Coenzyme B₁₂-Dependent Enzymes, Glycerol Dehydratase and Diol Dehydratasae. Journal of Bacteriology 143: 1458-1465) geassayt.
Materialien und Methoden
Toluolisierung von Zellen
Die Zellen wurden bis zur mittleren logarithmischen Phase wachsen gelassen und wurden durch Zentrifugation bei Raumtemperatur früh im Wachstum, d.h. 0,2 > OD₆₀₀ < 0,8, geerntet. Die geernteten Zellen wurden 2 × in 50 mM KPO₄, pH 8,0, bei Raumtemperatur gewaschen. Die Zellen wurden zu OD₆₀₀ 20-30 in 50 mM KPO₄, pH 8,0, resuspendiert. Die absolute OD ist nicht kritisch. Eine geringere Zellmasse wird in einem geringeren Volumen resuspendiert. Wenn Coenzym B12 an diesem Punkt zugegeben wird, wird der Rest der Schritte im Dunklen durchgeführt. Toluol wird zu einem Endvolumen von 1 % der Zellsuspension zugesetzt, und die Suspension wird 5 Minuten lang bei Raumtemperatur heftig geschüttelt. Die Suspension wird zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Die Zellen werden 2 × in 50 mM KPO₄, pH 8,0, bei Raumtemperatur (jeweils 25 ml) gewaschen. Das Zellpellet wird in dem gleichen Volumen resuspendiert, wie vor der Toluolzugabe verwendet, und in frische Röhrchen überführt. Die OD₆₀₀ für die toluolisierten Zellen wurde gemessen und aufgezeichnet, und sie wurden bei 4 °C aufbewahrt.
Ganzzell-Glyceroldehydratase-Assay
Die Toluol-behandelten Zellen wurden bei 37 °C hinsichtlich des Vorhandenseins von Dehydratase-Aktivität geassayt. Es wurden drei Gruppen von Reaktionen durchgeführt, wie nachstehend gezeigt: kein ATP, Zugeben von ATP bei Zeit 0, und Zugeben von ATP bei 10 Minuten.
Kontrollen wurden für jede der oben stehenden Bedingungen durch Zusetzen von 100 μl Puffer anstatt von CoB₁₂ hergestellt. Die Röhrchen wurden gemischt. 50 μl MBTH (3-Methyl-2-Beno-Thiazolinon-Hydrazon) (6 mg/ml in 375 mM Glycin/HCl, pH 2,7) wurden in jedes dieser Röhrchen zugegeben, und die Inkubation wurde in Eiswasser fortgesetzt. Die Reaktionsröhrchen wurden in ein Wasserbad bei 37 °C während einiger Minuten eingebracht, um eine Äquilibrierung auf 37 °C vorzunehmen. Ein Röhrchen, welches genug toluolisierte Zellen für alle Assay-Röhrchen enthielt, wurde in das 37°C-Wasserbad während einiger Minuten eingebracht, um eine Äquilibrierung auf 37 °C vorzunehmen. Ein Röhrchen, welches 2,5-fach (in Assay-Puffer) verdünntes 30 mM ATP/30 mM MnCl₂ (jeweils 12 mM) enthielt, wurde einige Minuten lang in das 37°C-Wasserbad eingebracht, um eine Äquilibrierung auf 37°C vorzunehmen. 100 μl Zellsuspension wurde zu allen Röhrchen zugegeben, und Proben wurden nach 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 und 30 Minuten entnommen. Bei jedem Zeitpunkt wurden 100 μl Reaktion entnommen und unverzüglich zu 50 μl eiskaltem MBTH zugegeben, per Vortex vermischt und in ein Eis-Wasser-Bad eingebracht. Bei T = 10 Minuten wurde eine Probe entnommen und zu MBTH zugesetzt, dann wurden 100 μl des 2,5-fach verdünnten ATP/Mn so schnell wie möglich zugegeben. Als alle Proben gesammelt worden waren, wurde das Probenröhrchengestell in ein siedendes Wasserbad gegeben und drei Minuten lang gekocht. Die Röhrchen wurden 30 Minuten lang in einem Eis-Wasser-Bad gekühlt, 500 μl frisch vorbereitetes 3,3 mg/ml FeCl₃·6H₂O wurde den Röhrchen zugegeben und die Röhrchen wurden per Vortex gemischt. Die Röhrchen wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, 10 × in H₂O verdünnt und dann zentrifugiert, um die Zellen und Partikulate abzusammeln. Die Absorption wurde bei 670 nM gemessen und die Zellen wurden verdünnt, um die OD unter 1,0 zu halten.
Beispiel der Berechnung der Aktivität
Die beobachtete OD670 wurde mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert, um die Absorption zu bestimmen. Die Leerproben-Absorption wurde für diese Reaktionsserie subtrahiert, und die T0-A670nM wurde subtrahiert. Die absolute A670nM wurde durch 53,4 (mM-Extinktionskoeffizient für 3OH-Propionaldehyd) dividier, und die mM-Konzentration wurde mit jedweder Verdünnung der Reaktion während des Zeitverlaufs multipliziert. Weil 1 ml Reaktion eingesetzt wurde, wurde die Konzentration (μmol/ml) von 3OH-Propionaldehyd durch die im Assay verwendeten mg's Trockengewicht (berechnet über OD₆₀₀, und 1OD 600 = 0,436 mg Trockengewicht) dividiert, um μmol-Aldehyd pro mg Trockengewicht an Zellen zu erhalten.
Ergebnisse
Wie in der 6 gezeigt, wurden ganze E.coli-Zellen hinsichtlich Reaktivierung von Glyceroldehydratase in Abwesenheit und Gegenwart von zugesetztem ATP und Mn++ geassayt. Die Ergebnisse zeigen, dass Zellen, welche ein Plasmid enthalten, welches dhaB1, 2 und 3 sowie Protein X trägt, die Fähigkeit aufweisen, katalytisch inaktivierte Glyceroldehydrogenase zu reaktivieren. Zellen, welche Protein 1, Protein 2 und Protein 3 enthalten, besitzen eine erhöhte Fähigkeit, die katalytisch inaktivierte Glyceroldehydratase zu reaktivieren.
Wie in der 7 gezeigt, wurden ganze E.coli-Zellen hinsichtlich Reaktivierung von Glycerolinaktivierter Glyceroldehydratase in Abwesenheit und in Gegenwart von zugesetztem ATP und Mn++ geassayt. Die Ergebnisse zeigen, dass Zellen, welche die dhaB-Untereinheiten 1, 2 und 3 und X enthalten, die Fähigkeit besitzen, katalytisch inaktivierte Glyceroldehydratase zu reaktivieren. Zellen, denen das Protein X-Gen fehlt, besitzen nicht die Fähigkeit, die katalytisch inaktivierte Glyceroldehydratase zu reaktivieren.
Die 9 und 10 veranschaulichen, dass Wirtszellen, welche das Plasmid pHK 28-26 (1) enthalten, bei Kultivierung unter für die Herstellung von 1,3-Propandiol geeigneten Bedingungen, mehr 1,3-Propandiol herstellten als Wirtszellen, welche mit pDT24 transformiert und unter Bedingungen, die für die Herstellung von 1,3-Propandiol geeignet sind, kultiviert wurden. Das Plasmid pDT24 ist ein Derivat von pDT18 (beschrieben in Beispiel 9) und enthält dhaT, dhaB 1, 2, 3 und Protein X, aber ihm fehlen die Proteine 1, 2 und 3. SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verfahren zur Herstellung von 1,3-Propandiol aus einem Mikroorganismus, umfassend die folgenden Schritte: Erhalten eines rekombinanten Mikroorganismus, der fähig ist zum Herstellen von 1,3-Propandiol, wobei der Mikroorganismus folgendes umfasst: mindestens eine Nukleinsäure, die eine Glycerol- oder Dioldehyratase-Aktivität, fähig zum Umwandeln von Glycerol zu 3-Hydroxypropionaldehyd, codiert; eine Nukleinsäure, die ein Protein X codiert, das mit einer in vivo-Reaktivierung der Dehyratase assoziiert ist, wobei Protein X mindestens 90% Aminosäure-Sequenzähnlichkeit zu der SEQ ID Nr.: 59, SEQ ID Nr.: 67 oder C. freundii-Aminosäuresequenz unter der GenBank-Zugangsnummer U09771 aufweist; wobei die Protein X codierende Nukleinsäure auf einer verschiedenen Expressionskassette zu der Nukleinsäure vorliegt, welche die Glycerol- oder Dioldehyratase-Aktivität codiert; und Kultivieren des rekombinanten Mikroorganismus in Gegenwart von mindestens einer Kohlenstoffquelle, die in der Lage ist, in dem transformierten Mikroorganismus zu 1,3-Propandiol umgewandelt zu werden, und unter Bedingungen, die geeignet sind für die Herstellung von 1,3-Propandiol, wobei die Kohlenstoffquelle aus der Gruppe gewählt wird, bestehend aus Monosacchariden, Oligosacchariden, Polysacchariden und einem Ein-Kohlenstoff-Substrat; und Gewinnen des 1,3-Propandiols.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus mindestens eine Nukleinsäure umfasst, codierend ein Protein, welches aus der Gruppe gewählt wird, die aus Protein 1, Protein 2 und Protein 3 besteht, wobei Protein 1 mindestens 90% Aminosäure-Sequenzähnlichkeit zu SEQ ID Nr.: 60 oder SEQ ID Nr.: 61 aufweist; Protein 2 mindestens 90% Aminosäure-Sequenzähnlichkeit zu SEQ ID Nr.: 62 oder SEQ ID Nr.: 63 aufweist; und Protein 3 mindestens 90% Aminosäure-Sequenzähnlichkeit zu SEQ ID Nr.: 64 oder SEQ ID Nr.: 65 aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei Protein 1 die Sequenz aufweist, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 60 oder SEQ ID Nr.: 61.
Verfahren nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei Protein 2 die Sequenz aufweist, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 62 oder SEQ ID Nr.: 63.
Verfahren nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei Protein 3 die Sequenz aufweist, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 64 oder SEQ ID Nr.: 65.
Verfahren nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei die Protein X codierende Nukleinsäure aus einem Glyceroldehydratase-Gencluster isoliert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei der Glyceroldehydratase-Gencluster aus einem Organismus ist, der gewählt wird aus den Gattungen, bestehend aus Klebsiella und Citrobactor.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Protein X codierende Nukleinsäure die Sequenz aufweist, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 59.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Protein X codierende Nukleinsäure aus einem Dioldehydratase-Gencluster isoliert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei Protein X die Aminosäuresequenz aufweist, die von den Basen 11261 bis 13072 unter der GenBank-Zugangsnummer U09771 codiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei der Dioldehydratase-Gencluster aus einem Organismus ist, der gewählt wird aus den Gattungen, die aus Klebsiella, Clostridium und Salmonella bestehen.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei Protein X die Aminosäuresequenz aufweist, welche in SEQ ID Nr.: 67 gezeigt ist.
Verfahren nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei die eine Dehydratase-Aktivität codierende Nukleinsäure bezüglich des Organismus heterolog ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12, wobei die eine Dehydratase-Aktivität codierende Nukleinsäure bezüglich des Organismus homolog ist.
Verfahren nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei der rekombinante Mikroorganismus gewählt wird aus der Gruppe von Gattungen, bestehend aus Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacer, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hanseaula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces und Pseudomonas.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der rekombinante Mikroorganismus gewählt wird aus der Gruppe von Gattungen, bestehend aus Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacer, Lactobacillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces und Pseudomonas.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei der Mikroorganismus gewählt wird aus der Gruppe, welche aus E. coli und Klebsiella spp. besteht.
Verfahren nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei die Protein X codierende Nukleinsäure stabil in dem Wirtsgenom beibehalten wird.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 18, worin mindestens eine Nukleinsäure, codierend ein Protein, gewählt aus Protein 1, Protein 2 und Protein 3, stabil in dem Wirtsgenom beibehalten wird.
Verfahren nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei die Kohlenstoffquelle Glukose ist.
Rekombinanter Mikroorganismus, der zum Herstellen von 1,3-Propandiol aus einer Kohlenstoffquelle in der Lage ist, wobei der rekombinante Mikroorganismus folgendes umfasst: a) mindestens eine Nukleinsäure, codierend eine Glycerol- oder Dioldehydratase-Aktivität, fähig zum Umwandeln von Glycerol zu 3-Hydroxypropionaldehyd; b) mindestens eine Nukleinsäure, welche eine Glycerol-3-phosphatase codiert; c) mindestens eine Nukleinsäure, codierend ein Protein X, assoziiert mit einer in vivo-Reaktivierung der Dehydratase; wobei die Protein X codierende Nukleinsäure auf einer verschiedenen Expressionskassette zu der die Glycerol- oder Dioldehydratase-Aktivität codierenden Nukleinsäure vorliegt; wobei das Protein X mindestens 90% Aminosäure-Sequenzähnlichkeit zu der SEQ ID Nr.: 59, SEQ ID Nr.: 67 oder C. freundii-Aminosäuresequenz unter der GenBank-Zugangsnummer U09771 aufweist; und wobei der rekombinante Mikroorganismus aus der Gruppe von Gattungen gewählt wird, bestehend aus Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter, Lactobacillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces und Pseudomonas.
Mikroorganismus gemäß Anspruch 21, wobei der Mikroorganismus mindestens eine Nukleinsäure umfasst, die ein Protein codiert, das gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Protein 1, Protein 2 und Protein 3; wobei Protein 1 mindestens 90% Aminosäure-Sequenzähnlichkeit zu SEQ ID Nr.: 60 oder SEQ ID Nr.: 61 aufweist; Protein 2 mindestens 90% Aminosäure-Sequenzähnlichkeit zu SEQ ID Nr.: 62 oder SEQ ID Nr.: 63 aufweist; und Protein 3 mindestens 90% Aminosäure-Sequenzähnlichkeit zu SEQ ID Nr.: 64 oder SEQ ID Nr.: 65 aufweist.
Mikroorganismus gemäß Anspruch 22, wobei Protein 1 die Sequenz aufweist, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 60 oder SEQ ID Nr.: 61.
Mikroorganismus gemäß Anspruch 22 oder Anspruch 23, wobei Protein 2 die Sequenz aufweist, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 62 oder SEQ ID Nr.: 63.
Mikroorganismus nach einem beliebigen der Ansprüche 22 bis 24, wobei Protein 3 die Sequenz aufweist, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 64 oder SEQ ID Nr.: 65.
Mikroorganismus nach einem beliebigen der Ansprüche 21 bis 25, wobei die Protein X codierende Nukleinsäure aus einem Glyceroldehydratase-Gencluster isoliert ist.
Mikroorganismus gemäß Anspruch 26, wobei der Glyceroldehydratase-Gencluster aus einem Organismus ist, der gewählt wird aus den Gattungen, die aus Klebsiella und Citrobactor bestehen.
Mikroorganismus gemäß Anspruch 27, wobei die Protein X codierende Nukleinsäure die Sequenz aufweist, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 59.
Mikroorganismus nach einem beliebigen der Ansprüche 21 bis 25, wobei die Protein X codierende Nukleinsäure aus einem Dioldehydratase-Gencluster isoliert ist.
Mikroorganismus gemäß Anspruch 29, wobei Protein X die Aminosäuresequenz aufweist, die von den Basen 11261 bis 13072 unter der GenBank-Zugangsnummer U09771 codiert wird.
Mikroorganismus gemäß Anspruch 29, wobei der Dioldehydratase-Gencluster aus einem Organismus ist, der gewählt wird aus den Gattungen, die aus Klebsiella, Clostridium und Salmonella bestehen.
Mikroorganismus gemäß Anspruch 31, wobei Protein X die Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr.: 67 gezeigt ist.
Mikroorganismus nach einem beliebigen der Ansprüche 21 bis 32, wobei die Dehydratase-Aktivität codierende Nukleinsäure bezüglich des Mikrorganismus heterolog ist.
Mikroorganismus nach einem beliebigen der Ansprüche 21 bis 32, wobei die Dehydratase-Aktivität bezüglich des Mikroorganismus homolog ist.
Mikroorganismus nach einem beliebigen der Ansprüche 21 bis 34, wobei der Mikroorganismus gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus E. coli und Klebsiella spp.
Verfahren zur Verlängerung der Halbwertszeit von Glycerol- oder Dioldehydratase-Aktivität, die fähig ist zum Umwandeln von Glycerol zu 3-Hydroxypropionaldehyd in einem transformierten Mikroorganismus, der zum Herstellen von 1,3-Propandiol in der Lage ist, wobei der Mikroorganismus mindestens eine Nukleinsäure enthält, codierend eine besagte Glycerol- oder Dioldehydratase-Aktivität, umfassend die folgenden Schritte: Einbringen einer Protein X codierenden Nukleinsäure in den Mikroorganismus; wobei Protein X mindestens 90% Aminosäure-Sequenzähnlichkeit zu SEQ ID Nr.: 59, SEQ ID Nr.: 67 oder C. freundii-Aminosäuresequenz unter GenBank-Zugangsnummer U09771 aufweist; und wobei Protein X assoziiert ist mit einer in vivo-Reaktivierung der Dehyratase; und Kultivieren unter Bedingungen, die für die Herstellung von 1,3-Propandiol geeignet sind.
Verfahren gemäß Anspruch 36, wobei die für die Dehydratase-Aktivität codierende Nukleinsäure bezüglich des Mikroorganismus heterolog ist.
Verfahren gemäß Anspruch 36, wobei die für die Dehydratase-Aktivität codierende Nukleinsäure bezüglich des Mikroorganismus homolog ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 36 bis 38, wobei die Protein X codierende Nukleinsäure aus einem Glyceroldehydratase-Gencluster isoliert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei der Glyceroldehydratase-Gencluster aus einem Organismus ist, der gewählt wird aus den Gattungen, die aus Klebsiella und Citrobactor bestehen.
Verfahren gemäß Anspruch 40, wobei die Protein X codierende Nukleinsäure die Sequenz aufweist, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 59.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 36 bis 38, wobei die Protein X codierende Nukleinsäure aus einem Dioldehydratase-Gencluster isoliert ist
Verfahren gemäß Anspruch 42, wobei Protein X die Aminosäuresequenz aufweist, die von den Basen 11261 bis 13072 unter der GenBank-Zugangsnummer U09771 codiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 42, wobei der Dioldehydratase-Gencluster aus einem Organismus kommt, der aus den Gattungen gewählt wird, die aus Klebsiella, Clostridium und Salmonella bestehen.
Verfahren gemäß Anspruch 44, wobei Protein X die Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr.: 67 gezeigt ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 36 bis 45, wobei der Mikroorganismus aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hanseaula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces und Pseudomonas besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 46, wobei der Mikroorganismus gewählt wird aus der Gruppe, welche aus Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter, Lactobacillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces und Pseudomonas besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 47, wobei der Mikroorganismus aus der Gruppe gewählt wird, welche aus E. coli und Klebsiella spp. besteht.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 36 bis 48, ferner umfassend den Schritt des Einbringens von mindestens einer Nukleinsäure, welche Protein 1, Protein 2 oder Protein 3 codiert, in den Mikroorganismus; wobei Protein 1 mindestens 90% Aminosäure-Sequenzähnlichkeit zu SEQ ID Nr.: 60 oder SEQ ID Nr.: 61 aufweist; Protein 2 mindestens 90% Aminosäure-Sequenzähnlichkeit zu SEQ ID Nr.: 62 oder SEQ ID Nr.: 63 aufweist; und Protein 3 mindestens 90% Aminosäure-Sequenzähnlichkeit zu SEQ ID Nr.: 64 oder SEQ ID Nr.: 65 aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 49, wobei Protein 1 die Sequenz aufweist, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 60 oder SEQ ID Nr.: 61.
Verfahren gemäß Anspruch 49 oder Anspruch 50, wobei Protein 2 die Sequenz aufweist, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 62 oder SEQ ID Nr.: 63.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 49 bis 52, wobei Protein 3 die Sequenz aufweist, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 64 oder SEQ ID Nr.: 65.