CN102392019A - 新颖的氧化还原酶及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新颖的氧化还原酶及其用途。本发明涉及新鉴定的包含下述基因的多核苷酸序列，所述基因编码从Aspergillus niger分离的新颖的氧化还原酶。本发明描述了新颖基因的全长核苷酸序列、包含新颖氧化还原酶的全长编码序列的cDNA序列，以及全长功能蛋白质及其功能等同物的氨基酸序列。本发明还涉及在烘焙和乳制品应用中使用这些酶的方法。本发明还包括用根据本发明的多核苷酸转化的细胞和其中根据本发明的氧化还原酶被遗传修饰以增强或降低其活性和/或表达水平的细胞。

Description

新颖的氧化还原酶及其用途

本申请是基于申请号200780004609.4的分案申请。

技术领域

本发明涉及新近鉴定的包含下述基因的多核苷酸序列，所述基因编码从Aspergillus niger分离的新颖的氧化还原酶。本发明描述了新颖基因的全长核苷酸序列、包含新颖氧化还原酶的全长编码序列的cDNA序列，以及全长功能蛋白质及其功能等同物的氨基酸序列。本发明还涉及在烘焙和乳制品应用中使用这些酶的方法。本发明还包括用根据本发明的多核苷酸转化的细胞和其中根据本发明的氧化还原酶被遗传修饰以增强或降低其活性和/或表达水平的细胞。

背景技术

氧化还原酶在本文中被定义为催化氧化-还原反应的酶。已知是氧化还原酶(EC 1.#.#.#，其中#为数字)的酶种类由Nomenclature Committee ofthe International Union of Biochemistry on the Nomenclature and Classificationof Enzymes(Enzyme Nomenclature，Academic Press，New York，1992)定义为催化氧化还原反应的所有酶。被氧化的底物被视为氢或电子供体。号码中的第二个数字指出经受氧化的氢供体中的基团。第三个数字指出涉及的受体类型，3表示氧为受体。被氧化的底物被看做氢供体。

氧化还原酶的例子为：

·漆酶(EC 1.10.3.2)催化邻-和对-苯二酚二者的氧化，也时常作用于氨基苯酚和苯二胺。

·葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4-GOX)催化葡萄糖和若干种其它糖的氧化。

·己糖氧化酶(EC 1.1.3.5)催化与GOX相同的反应，即葡萄糖和若干种其它糖如半乳糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和纤维二糖的氧化。

·胆固醇氧化酶(EC 1.1.3.6)催化胆固醇的氧化还原。

·胆碱脱氢酶(E.C.1.1.99.1)催化胆碱的氧化还原。

·葡萄糖脱氢酶(E.C.1.1.99.10)催化葡萄糖的氧化还原。

·醇氧化酶(EC 1.1.3.13)催化伯醇的氧化。

·仲醇氧化酶(EC 1.1.3.18)催化仲醇的氧化。

·D-天冬氨酸氧化酶(EC 1.4.3.1)催化天冬酶的氧化还原，其也作为天冬氨酸氧化酶已知。

·丁二胺氧化酶(EC 1.4.3.10)催化腐胺成为4-氨基正丁醛的氧化还原，所述4-氨基正丁醛缩聚成为1-吡咯啉。

·胺氧化酶(EC 1.4.3.4)催化胺(主要是伯胺，通常是一些仲胺和叔胺)的氧化。

·肌氨酸氧化酶(EC 1.5.3.1)催化肌氨酸的氧化还原。

·多胺氧化酶(EC 1.5.3.11)催化N¹-乙酰基精胺的氧化还原。

·(R)-6-羟基烟碱氧化酶(EC 1.5.3.6)催化(R)-6-羟基烟碱的氧化还原。

·网脉番荔枝碱氧化酶(EC 1.5.3.9)催化(S)-网脉番荔枝碱的氧化还原，其也被称作小檗碱-桥-形成酶。

·儿茶酚氧化酶(EC1.10.3.1)催化儿茶酚和多种被取代的儿茶酚的氧化还原。

·硫氧还蛋白还原酶(EC 1.6.4.5)，其催化被氧化的硫氧还蛋白的还原。

·亚硫酸盐还原酶(EC 1.8.1.2)，其催化硫化氢的还原。

·氯化物过氧化物酶(EC 1.11.1.10)，其导致有机分子氯化形成稳定的C-Cl键，其也可以作用于Br^-和I^-。

·过氧化物酶(EC 1.11.1.6)，其导致若干种有机物质例如乙醇的氧化还原。

·氧化还原酶的其它例子为萤火虫荧光素酶(EC 1.13.12.7)、肉桂酸4-羟化酶(EC 1.14.13.11)、苯甲酸4-单加氧酶(EC 1.14.13.12)、胆固醇7α-单加氧酶(EC 1.14.13.17)、五氯苯酚单加氧酶(EC 1.14.13.50)、单加氧酶(EC1.14.14.1)、类固醇11β-单加氧酶(EC 1.14.15.4)、单苯酚单加氧酶(EC1.14.18.1)、前列腺素合酶(EC 1.14.99.1)和水杨酸酯水解酶(EC 1.14.13.1)。

所述例子以并非以任何方式表示限制性或限制本发明的方式给出。

氧化还原酶可便利地在微生物中生产。微生物氧化还原酶可得自多种来源；Bacillus的种是细菌酶的一个常见来源，而真菌酶通常在Aspergillus的种中生产。

已经报导了来自多种来源的具有氧化还原酶活性的微生物酶，所述来源包括Penicillium、Talaromyces、Cladosporum(WO 95/29996)、Trameteshirsuta(WO 97/22257)。已经克隆了来自若干来源的微生物氧化还原酶基因，所述来源包括Fusarium(EP 1157117A1)、Coriolus versicolor(DE 19545780A1)、Trametes(US6146865)、Trichoderma(US 6248575)和Microdochium nivale(WO9931990)。

氧化还原酶可用于还使用化学氧化剂的所有应用领域中。这类化学氧化剂通常是非特异的氧化剂，如碘酸盐、过氧化物、抗坏血酸、溴酸钾和偶氮二酰胺。然而，若干种目前可获得的化学氧化剂的使用遇到了消费者的抵制或不被管理机构允许，特别是在食物应用的领域中。

氧化还原酶的使用已经被认为是化学氧化剂的备选方案。

氧化还原酶可以被用于包括食物制剂和去污剂的多种工业应用中。

氧化还原酶的上述工业应用仅是小量例子，该列表不表示是限制性的。

其中可便利地使用氧化还原酶的食物制剂的一个例子是烘焙应用的领域，例如改善面团或烘焙制品的品质。

例如US 2,783,150公开了GOX在面粉中改善面团强度和烘焙的面包的纹理和外观的用途。EP0338452公开了葡萄糖氧化酶与半纤维素酶和/或纤维素降解酶组合的应用。WO02/30207公开了GOX在烘焙中与蛋白质二硫化物异构酶组合以改善GOX有效性的用途。WO96/39851公开了红海藻Chondrus crispus的己糖氧化酶在烘焙应用中的用途。WO98/44804公开了甘油氧化酶用于改善面团流变学(rheological)特征的用途。

其中可使用氧化还原酶的其它食物制剂包括乳制品食物。例如WO02/39828公开了己糖氧化酶在批萨制备期间减少批萨乳酪中Maillard反应的用途，WO 99/31990公开了碳水化合物氧化酶从乳糖(乳中最充裕的糖)生产乳糖酸的用途。

目前，来自Aspergillus niger的葡萄糖氧化酶是针对上述应用的工业中使用的唯一酶。其它氧化还原酶的问题是它们的生产仍然不能以成本有效的方式进行和/或它们的性能对于它们的预期用途而言不是最适的。因此，仍然有动力改善用于特定应用的氧化还原酶，例如考虑到有效性、底物特异性和/或亲和力、在所需温度范围内和pH范围内的稳定性和活性等等。

更特定地，对于烘焙应用而言，目前烘焙中使用的氧化还原酶(主要是来自Aspergillus niger的葡萄糖氧化酶)不具有例如溴酸钾的性能。溴酸钾是一种化学氧化剂，其在技术上被认为是除色的氧化剂，特别是对于长烘焙工艺而言。溴酸盐的禁用留给烘焙者时至今日仍未填补上的性能缺口。另一个例子是为了得到优良的白色面包屑的酶面包屑漂白剂(enzymatic crumb bleaching)。数年来，含有脂肪氧化酶的酶活性大豆粉一直被用于该目的。向市场中引入经遗传修饰的大豆变种引起了世界范围的消费者抵制在烘焙中使用这类大豆粉。作为选择可使用其它豆和豌豆粉，然而它们不如大豆粉有效。因此，对面包屑漂白应用而言，仍然存在对该问题的酶解决方案的巨大需要。

更特定地，对乳制品应用而言，在热处理期间对工艺参数的轻微修饰或背离导致由增加的Maillard反应引起的提高的颜色发生。该颜色发生是不想要的，并且存在除了通过严格的温度和工艺控制之外控制该变褐过程从而使得巴氏灭菌过程更有活力的需要。

还在乳酪的热处理中，例如批萨上乳酪的变褐是不想要的。WO02/39828总结了减少变褐的若干种尝试，所述尝试通常旨在获得乳酪制造工艺的非常严格的工艺控制或工艺修饰。这些解决方案的缺点在于它们难以操作和/或可能提高成本或降低产率。

本发明致力于至少一个(如果不是所有的话)上述问题。

发明目的

本发明的一个目的是提供下述新颖的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有改善的特性的新颖的氧化还原酶。另一个目的是提供天然和重组生产的氧化还原酶以及生产所述氧化还原酶的重组菌株。制造和使用根据本发明的多核苷酸和多肽的方法也是本发明的一个目的。

提供下述新颖的氧化还原酶也是本发明的目的之一，所述氧化还原酶解决了至少一个上述问题，或当用于乳制品和/或烘焙应用中时具有一种或多种改善的特性。

乳制品的改善的特性可选自由Maillard反应引起的变褐减少、改善的抗微生物特性和改善的蛋白质交联。

面团和/或烘焙制品的改善的特性可选自提高的面团强度、提高的面团弹性、提高的面团稳定性、降低的面团粘稠度、改善的醒发耐性、改善的面团延展性、改善的面团可加工性、提高的烘焙制品体积、改善的烘焙制品碎屑结构、改善的烘焙制品柔软性、改善的烘焙制品口味、改善的烘焙制品抗腐性(anti-staling)、改善的烘焙制品色泽、改善的烘焙制品外皮或具有广泛的底物特异性。

发明详述

多核苷酸

本发明提供了编码新颖的氧化还原酶的新颖的多核苷酸，所述氧化还原酶尤其是具有任何上述活性的酶，优选地，具有异戊醇氧化酶活性、碳水化合物氧化酶、漆酶、葡萄糖氧化酶或己糖氧化酶活性的酶。

本发明提供了6种编码氧化还原酶的新颖的多核苷酸，暂时称作OXI01、OXI02、OXI03、OXI04、OXI05、OXI06(下文称作OXI01-OXI06)，其具有分别根据SEQ ID NO：013、SEQ ID NO：014、SEQ ID NO：015、SEQ ID NO：016、SEQ ID NO：017、SEQ ID NO：018(下文称作“SEQ ID NO：013-018”)的氨基酸序列或其任何的功能等同物。编码SEQ ID NO：013-018的基因的序列通过对得自Aspergillus niger的基因组克隆测序测定。

令人惊奇地，我们发现，根据本发明的OXI01-OXI06多肽被用于制备面团的工艺中时能改善面团的强度。

本发明提供了包含下述基因及其完全cDNA序列(分别为SEQ ID NO：007、SEQ ID NO：008、SEQ ID NO：009、SEQ ID NO：010、SEQ ID NO：011、SEQ ID NO：012，下文称作“SEQ ID NO：007-012”)的多核苷酸序列，所述基因编码OXI01-OXI06氧化还原酶(分别包含SEQ ID NO：001、SEQ ID NO：002、SEQ ID NO：003、SEQ ID NO：004、SEQ ID NO：005、SEQ ID NO：006，下文称作“SEQ ID NO：001-006”)。

因此，本发明涉及经分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含根据SEQID NO：001-006或SEQ ID NO：007-012的核苷酸序列或其任何的功能等同物。

更具体地，本发明涉及在严格条件下、优选在高度严格条件下能与根据SEQ ID NO：001-006或SEQ ID NO：007-012的多核苷酸杂交的经分离的多核苷酸。这类多核苷酸可有利地得自丝状真菌，尤其是来自Aspergillus niger。更特定地，本发明涉及具有根据SEQ ID NO：001-006或SEQ ID NO：007-012的核苷酸序列的经分离的多核苷酸。

本发明还涉及经分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码分别根据SEQID NO：013-018的多肽或其任何功能等同物的至少一个功能结构域。

为了避免任何疑惑：OXI01对应于核酸序列SEQ ID NO：001和SEQID NO：007和氨基酸序列SEQ ID NO：013及其同源物功能等同物；OXI02对应于SEQ ID NO：002、SEQ ID NO：008和SEQ ID NO：014及其同源物功能等同物等等，OXI06对应于SEQ ID NO：006、SEQ ID NO：012和SEQ ID NO：018及其同源物功能等同物。

本文使用的术语“基因”和“重组基因”指可从染色体DNA中分离的、包含编码蛋白质(例如A.niger氧化还原酶)的开放读码框的核酸分子。基因可包含编码序列、非编码序列、内含子和调节序列。此外，基因是指本文定义的经分离的核酸分子。

可以使用标准的分子生物学技术和本文提供的序列信息，来分离本发明的核酸分子(如具有SEQ ID NO：001-006或SEQ ID NO：007-012的核苷酸序列的核酸分子或其功能等同物)。例如，使用SEQ ID NO：001-006或SEQ ID NO：007-012的所有或部分核酸序列作为杂交探针，能够使用标准杂交和克隆技术(例如描述于Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，andManiatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中)分离根据本发明的核酸分子。

另外，可以使用合成的寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应(PCR)，来分离包含SEQ ID NO：001-006或SEQ ID NO：007-012所有或部分的核酸分子，所述引物以SEQ ID NO：001-006或SEQ ID NO：007-012中含有的序列信息为基础设计。

可以使用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，并使用适当的寡核苷酸引物根据标准的PCR扩增技术，来扩增本发明的核酸。这样扩增的核酸可以被克隆进适当的载体中并通过DNA序列分析被表征。

另外，可以通过标准的合成技术(例如使用自动化DNA合成仪)制备下述寡核苷酸，所述寡核苷酸对应于本发明的核苷酸序列或能够与本发明的核苷酸序列杂交。

在一个优选的实施方案中，本发明的经分离的核酸分子包含SEQ IDNO：007-012中所示核苷酸序列。SEQ ID NO：007-012的序列对应于A.niger OXI01-OXI06 cDNA的编码区。该cDNA包含编码根据SEQ IDNO：013-018的A.niger OXI01-OXI06多肽的序列。

在另一优选的实施方案中，本发明的经分离的核酸分子包含下述核酸分子，所述核酸分子是SEQ ID NO：001-006或SEQ ID NO：007-012中所示核苷酸序列或这些核苷酸序列功能等同物的互补体。

与另一核苷酸序列互补的核酸分子是与所述另一核苷酸序列足够互补，从而其能够与所述另一核苷酸序列杂交形成稳定双链体的核酸分子。

本发明的一个方面涉及经分离的核酸分子，所述核酸分子编码本发明的多肽或其功能等同物(如生物活性片段或结构域)，以及足够用作杂交探针(以鉴定编码本发明多肽的核酸分子)的核酸分子，和适合用作PCR引物(用于扩增或突变核酸分子)的这类核酸分子的片段。

“经分离的多核苷酸”或“经分离的核酸”是与所述DNA或RNA来源的天然存在的生物基因组中紧邻的两条编码序列(一个在5’端，一个在3’端)均不紧邻的DNA或RNA。因此，在一个实施方案中，经分离的核酸包含与编码序列紧邻的部分或所有5’非编码(例如启动子)序列。该术语因此包括例如被整合进载体、整合进自主复制的制粒或病毒、或整合进原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或作为不依赖于其它序列的独立分子(例如通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)存在的重组DNA。其还包括编码下述额外多肽的杂交基因的一部分的重组DNA，所述额外多肽基本不含细胞材料、病毒材料或培养基(通过重组DNA技术生产时)或化学前体或其它化学品(化学合成时)。另外，“经分离的核酸片段”是天然不作为片段存在并且在天然状态下不被发现的核酸片段。

本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选是双链DNA。可以使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如肌苷或硫代膦酸核苷酸)来合成核酸。这类寡核苷酸可被用于例如制备核酸，所述核酸具有改变的碱基配对能力或提高的核酸酶抗性。

本发明的另一实施方案提供了经分离的核酸分子，所述核酸分子与OXI01-OXI06核酸分子(例如OXI01-OXI06核酸分子的编码链)是反义的。还包括在本发明范围内的是本文所述核酸分子的补体链。

测序错误(sequencing errors)

本文提供的序列信息不应被狭义地解释为要求包括错误鉴定的碱基。本文公开的特定序列可以容易地被用于从丝状真菌(尤其是A.niger)分离整个基因，随后可容易地对所述基因进行进一步序列分析，从而鉴定测序错误。

除非另有说明，通过对本文的DNA分子测序确定的所有核苷酸序列均使用自动DNA测序仪测定，由本文测定的DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列是通过翻译如上测定的DNA序列来预测的。因此，如本领域所已知的，对通过该自动化途径测定的任何DNA序列而言，本文测定的任何核苷酸序列可含有一些错误。通过自动化测定的核苷酸序列与被测序的DNA分子的实际核苷酸序列典型地至少约90％同一，更典型地至少约95％到至少约99.9％同一。可以通过其它途径(包括本领域公知的手动DNA测序法)更精确地测定实际序列。又如本领域所已知的，与实际序列相比，被测定的核苷酸序列中的单个插入或删除会引起核苷酸序列翻译中的移码(frame shift)，从而由被测定的核苷酸序列编码的预测氨基酸序列会与由被测定的核苷酸序列实际编码的氨基酸序列完全不同(从该插入或删除的位点开始)。

本领域技术人员能够鉴定这类被错误鉴定的碱基，并知道如何纠正这类错误。

核苷酸片段、探针和引物

根据本发明的核酸分子可仅包含SEQ ID NO：001-006或SEQ ID NO：007-012所示核酸序列的部分或片段，例如可以用作探针或引物的片段或编码OXI01-OXI06蛋白质的部分的片段。通过克隆OXI01-OXI06基因和cDNA测定的核苷酸序列允许生产探针和引物，所述探针和引物被设计为用于鉴定和/或克隆其它OXI01-OXI06家族成员，以及来自其它物种的OXI01-OXI06同源物。探针/引物典型地包含基本上被纯化的寡核苷酸，所述寡核苷酸典型地包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列优选地在高度严格的条件下与SEQ ID NO：001-006或SEQ ID NO：007-012所示核苷酸序列或其功能等同物的至少约12或15个、优选约18或20个、优选约22或25个、更优选约30、35、40、45、50、55、60、65或75个或更多个相邻的核苷酸杂交。

以OXI01-OXI06核苷酸序列为基础的探针可以被用于检测转录本或基因组OXI01-OXI06序列，所述转录本或基因组OXI01-OXI06序列编码例如其它生物中的相同或同源蛋白质。在优选的实施方案中，探针还包含与之结合的标签基团，例如所述标签基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶，或酶辅因子。这类探针也可以被用作诊断测试试剂盒的部分，所述试剂盒用于鉴定表达OXI01-OXI06蛋白质的细胞。

同一性&同源性

术语“同源性”或“同一性百分比”在本文可互换使用。就本发明的目的而言，其在本文被定义来测定两条氨基酸序列或两条核酸序列的同一性百分比，所述序列就最适比较的目的被排列(例如为了与第二氨基酸或核酸序列最适比对，可以向第一氨基酸或核酸序列的序列中引入缺口)。然后比较相应的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一条序列中的一个位置被与第二序列中相应位置上相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置上是同一的。两条序列之间的同一性百分比是所述序列共享的同一位置数的函数(即％同一性＝同一位置数/位置总数(即重叠位置)x100)。优选两条序列是相同的长度。

技术人员应当明白下述事实：可获得若干种不同的计算机程序以测定两条序列之间的同源性。例如，可以使用数学算法完成两个序列之间的序列比较和同一性百分比测定。在一个优选的实施方案中，使用Needlemanand Wunsch(J.MoI.Biol.(48)：444-453(1970))算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵和16、14、12、10、8、6或4的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重测定两条氨基酸序列之间的同一性百分比，所述算法已经被整合进GCG软件包内的GAP程序中(可得自http://www.gcg.com)。技术人员应当知道：这些不同的参数会产生轻微差异的结果，但是使用不同的算法时两条序列的整体同一性百分比不会被显著改变。

还在另一实施方案中，使用GCG软件包(可得自http://www.gcg.com)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重测定两条核苷酸序列之间的同一性百分比。在另一实施方案中，使用E.Meyers andW.Miller算法(CABIOS，4：11-17(1989))，使用PAM120权重残表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分测定两条氨基酸或核苷酸序列的同一性百分比，所述算法已被整合进ALIGN程序(2.0版)中(可得自http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi)。

本发明的核酸和蛋白质序列还可以被用作“查询序列”，针对公开数据库进行搜索，以例如鉴定其它家族成员或相关序列。这类搜索可以使用Altschul，et al.(1990)J.MoI.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。可以使用NBLAST程序(计分＝100，字长＝20)进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的OXI01-OXI06核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序(计分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的OXI01-OXI06蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得加缺口的比对用于比较的目的，可以如Altschul et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述使用Gapped BLAST。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。

杂交

本文使用术语“杂交”旨在描述用于下述杂交和洗涤的条件，典型地，在所述条件下彼此至少约50％、至少约40％、至少约70％、更优选地至少约80％、进一步更优选地至少约85％到90％、更优选地至少95％同源的核苷酸序列保持彼此杂交。

这类杂交条件的一个优选的非限制性例子是：于约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后于50℃、优选55℃、优选60℃和进一步更优选65℃下，在1X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。

高度严格条件包括例如于68℃下在5x SSC/5x Denhardt′s溶液/1.0％SDS中杂交并于室温下在0.2x SSC/0.1％SDS中洗涤。或者，洗涤可以在42℃进行。

技术人员应当知道对于严格和高度严格的杂交条件而言应用何种条件。涉及这类条件的其它指示在该领域能够容易地获得，例如在Sambrooket al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress，N.Y.；和Ausubel et al.(eds.)，1995，Current Protocols in MolecularBiology，(John Wiley & Sons，N.Y.)中。

当然，仅与多聚A序列(例如mRNA的3’末端多聚(A))或互补的T(或U)残基段杂交的多核苷酸不应被包括于与本发明的核酸部分特异杂交的本发明多核苷酸中，因为这类多核苷酸会与含有多聚(A)段或其补体的任何核酸分子(例如尤其是任何双链cDNA克隆)杂交。

从其它生物获得全长DNA

可以以一种典型的途径，来筛选从其它生物(例如丝状真菌，尤其是来自Aspergillus的种)构建的cDNA文库。

例如，可以通过Northern印迹针对同源的OXI 01-OXI 06多核苷酸筛选Aspergillus菌株。检测到与根据本发明的多核苷酸同源的转录物后，可以利用本领域技术人员公知的标准技术从分离自适当菌株的RNA构建cDNA文库。或者，可以使用能够与根据本发明的OXI01-OXI06多核苷酸杂交的探针来筛选总基因组DNA文库。

可以例如通过进行PCR分离同源的基因序列，所述PCR使用以本文所述核苷酸序列为基础设计的两个简并寡核苷酸引物池。

用于反应的模板可以是通过反转录mRNA获得的cDNA，所述mRNA从已知或怀疑表达本发明多核苷酸的菌株中制备。可以对PCR产物进行亚克隆和测序，以确保被扩增的序列代表了新OXI01-OXI06核酸序列的序列或其功能等同物。

然后可以通过多种已知方法，使用PCR片段来分离全长cDNA克隆。例如，被扩增的片段可以被标记，并用于筛选噬菌体或粘粒cDNA文库。或者，被标记的片段可以被用于筛选基因组文库。

也可以用PCR技术来从其它生物中分离全长cDNA序列。例如，可以根据标准步骤从合适的细胞或组织来源中分离RNA。可以使用特异于被扩增片段最5’端的寡核苷酸引物，引导第一链合成，针对RNA进行反转录反应。

然后可以使用标准的末端转移酶反应将得到的RNA/DNA杂交体“加尾”(例如用鸟嘌呤)，可以用RNase H消化所述杂交体，然后(例如用多聚-C引物)引物起始第二链合成。因此，被扩增片段上游的cDNA序列可以容易地被分离。有用的克隆策略的综述，参阅例如上文Sambrook etal.；和上文的Ausubel et al.。

无论同源的DNA片段是否编码功能OXI01-OXI06蛋白质，其均可通过本领域已知的方法容易地被测试。

载体

本发明的另一方面涉及含有下述核酸的载体，优选表达载体，所述核酸编码OXI01-OXI06蛋白质或其功能等同物。本文使用的术语“载体”指能够转运与之连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，质粒是指其中可以连接其它DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中其它DNA区段可以被连接进病毒基因组中。某些载体在它们被引入的宿主细胞中能够自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加体哺乳动物载体)在引入宿主细胞时被整合进宿主细胞的基因组中，从而随宿主细胞的基因组一起被复制。另外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。这类载体在本文中被称作“表达载体”。一般而言，重组DNA技术中使用的表达载体通常是以质粒的形式存在的。术语“质粒”和“载体”在本文中可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括这类表达载体的起等同作用的其它形式，如病毒载体(例如复制缺陷反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。

本发明的重组表达载体以适合核酸在宿主细胞中表达的形式包含本发明的核酸，这意味着重组表达载体含有一个或多个与待表达的核酸序列可操作地连接的调节序列，以要用于表达的宿主细胞为基础选择所述调节序列。在重组表达载体中，“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达(例如在体外转录/翻译体系中或当载体被引入宿主细胞中时在宿主细胞中)的方式连接。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这类调节序列描述于例如Goeddel；Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的那些和仅在某种宿主细胞中指导核苷酸序列表达的那些(例如组织特异调节序列)。本领域技术人员应当知道：对表达载体的设计可以以下述因素为基础，如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等。本发明的表达载体可以被引入宿主细胞中，从而生产由本文所述的核酸编码的蛋白质或肽(例如OXI01-OXI06蛋白质，OXI01-OXI06蛋白质的突变体形式，其任何的片段、变体或功能等同物等)。

本发明的重组表达载体可以被设计，以用于OXI01-OXI06蛋白质在原核细胞或真核细胞中的表达。例如OXI01-OXI06蛋白质可以在细菌细胞如E.coli、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中进一步讨论。或者，可以例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶体外转录和翻译重组表达载体。

可用于本发明的表达载体包括来自染色体、附加体和病毒的载体，例如来自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒(如杆状病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和反转录病毒)的载体和来自其组合的病毒，如来自质粒和噬菌体遗传元件的病毒(如粘粒和噬菌粒)。

DNA插入物应与合适的启动子可操作地连接，所述启动子如噬菌体λPL启动子，E.coli lac、trp和tac启动子，SV40早期和晚期启动子和反转录病毒LTR的启动子，但不限于这些。其它合适的启动子是技术人员应当知道的。在一个特定的实施方案中，能够在丝状真菌中指导氧化还原酶高水平表达的启动子是优选的。这类启动子是本领域已知的。表达构建体可含有转录起始位点、终止位点和(在被转录的区域中)用于翻译的核糖体结合位点。构建体表达的成熟转录本的编码部分应包含位于起点的翻译起始AUG和适当地位于待翻译多肽末端的终止密码子。

可以通过常规的转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。本文使用的术语“转化”和“转染”旨在表示用于向宿主细胞中引入外源核酸(例如DNA)的多种本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、转导、感染、脂质转染、阳离子脂质介导的转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook，et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd，ed.ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)，Davis et al.，Basic Methods in Molecular Biology(1986)和其它实验室手册中。

对于哺乳动物细胞的稳定转染而言，已知取决于使用的表达载体和转染技术，只有非常小的细胞级分可以将外源DNA整合进它们的基因组中。为了鉴定并选择这些整合体，通常将编码可选择标记(例如抗性或抗生素)的基因与感兴趣的基因一起引入宿主细胞中。优选的可选择标记包括赋予药物(例如G418、潮霉素和甲氨喋呤)抗性的基因。编码可选择标记的核酸可以被引入宿主细胞中与编码OXI01-OXI06蛋白质的核酸相同的载体上，或可以被引入独立的载体上。可以通过药物选择来鉴定用被引入的核酸稳定转染的细胞(例如，已经整合了可选择标记基因的细胞能够存活，而其它细胞死亡)。

蛋白质在原核生物中的表达常在E.coli中用下述载体完成，所述载体含有指导蛋白质表达的组成型或诱导型启动子。

如所指出的，表达载体优选地含有可选择标记。这类标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，和用于在E.coli和其它细菌中培养的四环素或氨苄西林抗性。合适的宿主细胞的代表性例子包括细菌细胞，如E.coli、Streptomyces和Salmonella typhimurium；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如Drosophila S2和Spodoptera Sf9；动物细胞如CHO，COS和Bowes melanoma；和植物细胞。用于上述宿主细胞的适当培养基和条件是本领域已知的。

载体中优选用于细菌的是可得自Qiagen的pQE70、pQE60和PQE-9；可得自Stratagene的pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A和可得自Pharmacia的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。优选的真核载体为可得自Stratagene的PWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pZT1和pSG；和可得自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其它合适的载体是技术人员显而易见的。

用于本发明的已知的细菌启动子包括E.coli lacl和lacZ启动子，T3和T7启动子，gpt启动子，λPR、PL启动子和trp启动子，HSV胸苷激酶启动子，早期和晚期SV40启动子，反转录LTR的启动子如Rous肉瘤病毒(″RSV″)的启动子和金属硫蛋白启动子如小鼠金属硫蛋白-I启动子。

可以通过向载体中插入增强子序列，来提高高等真核生物对编码本发明多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10到300bp，其作用于提高启动子在给定的宿主细胞类型中的转录活性。增强子的例子包括SV40增强子(其位于复制起点下游的bp 100到270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点下游的多瘤增强子和腺病毒增强子。

为了将翻译的蛋白质分泌进入内质网腔中、进入壁膜间隙中或进入细胞外环境中，可以向被表达的多肽中整合进适当的分泌信号。所述信号对多肽可以是同源的或它们可以是异源信号。

多肽可以以经修饰的方式被表达，并可不仅含有分泌信号而且含有额外的异源功能区。因此，例如额外氨基酸区(尤其是带电荷的氨基酸)可被添加至多肽的N端，以促进纯化期间或随后的操作和储存期间在宿主细胞中的稳定性和持久性。还可向多肽添加肽基元，以便于纯化。

根据本发明的多肽

本发明提供了经分离的多肽，所述多肽具有根据SEQ ID NO：013-018的氨基酸序列、可通过在适当的宿主中表达SEQ ID NO：001-077的多核苷酸获得的氨基酸序列，以及可以通过在合适的宿主中表达SEQ IDNO：007-012的多核苷酸序列获得的氨基酸序列。包含上述多肽的功能等同物的肽或多肽也包含在本发明中。上述多肽集体包含在术语“本发明的多肽”中。

术语“肽”和“寡肽”被认为是同义的(如其通常被认为的那样)，且当上下文需要表示通过肽键偶合的至少两个氨基酸链时，每个术语可以互换使用。词语“多肽”在本文中使用表示含有多于七个氨基酸残基的链。所有的寡肽和多肽式或序列在本文中从左到右和从氨基端到羧基端的方向书写。本文使用的单字母氨基酸代码是本领域普遍已知的，并可见于Sambrook，et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd，ed.ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)。

“分离的”多肽或蛋白质表示被从其天然环境中取出的多肽或蛋白质。例如，就本发明的目的而言，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的，与通过任何合适的技术已基本纯化的天然或重组多肽一样，所述合适的技术例如Smith and Johnson，Gene 67：31-40(1988)中公开的单步骤纯化方法。

可以通过公知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化根据本发明的OXI01-OXI06氧化还原酶，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。最优选地，使用高效液相色谱(“HPLC”)用于纯化。

本发明的多肽包括天然纯化的产物、化学合成步骤的产物，和通过重组技术从原核或真核宿主生产的产物，所述宿主包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。取决于重组生产步骤中使用的宿主，可以将本发明的多肽糖基化或不糖基化。另外，本发明的多肽也可以包含最初被修饰的残基(在一些情况下由宿主介导的过程产生)。

蛋白质片段

本发明还包括根据本发明的多肽的生物活性片段。

本发明的多肽的生物活性片段包括包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与OXI01-OXI06蛋白质的氨基酸序列(其包含比全长蛋白质更少的氨基酸，并限制相应的全长蛋白质的至少一种生物活性)足够同一或来自后者(例如SEQ ID NO：013-018的氨基酸序列)。典型地，生物活性片段包含具有OXI01-OXI06蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。优选的是具有葡萄糖氧化酶活性(E.C.1.1.3.4)的片段。

本发明的蛋白质的生物活性片段可以是多肽，所述多肽长度为例如10、25、50、100或更多个氨基酸。另外，其它生物活性部分(其中蛋白质的其它区域被删除)可以通过重组技术被制备，并针对本发明多肽的天然形式的一种或多种生物活性做出评价。

本发明还包括编码OXI01-OXI06蛋白质的上述生物活性片段的核酸片段。

功能等同物

术语“功能等同物”和“功能变体”在本文可互换使用。OXI01-OXI06 DNA的功能等同物是编码下述多肽的经分离的DNA片段，所述多肽显示本文公开的OXI01-OXI06 DNA A.niger氧化还原酶的具体功能。根据本发明的OXI01-OXI06多肽的功能等同物是显示本文定义的A.niger氧化还原酶的至少一种功能的多肽。因此，功能等同物包括生物活性片段。

功能蛋白质或多肽等同物可含有SEQ ID NO：013-018的仅一个或多个氨基酸的保守取代或非必需氨基酸的取代、插入或删除。因此，非必需氨基酸是SEQ ID NO：013-018中能够被改变而基本不改变生物功能的残基。例如，在本发明的OXI01-OXI06蛋白质间保守的氨基酸残基被预测为尤其不应进行改变。另外，在根据本发明的OXI01-OXI06蛋白质和其它氧化还原酶间保守的氨基酸可能不适合被改变。

术语“保守取代”旨在表示下述取代：其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。这些家族是本领域已知的，并包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。

典型地，功能核酸等同物可含有沉默突变或不改变所编码的多肽生物功能的突变。因此，本发明提供了编码下述OXI01-OXI06蛋白质的核酸分子，所述蛋白质含有对于具体生物活性并非必需的氨基酸残基改变。这类OXI01-OXI06蛋白质在氨基酸序列上与SEQ ID NO：013-018差异，但仍保留至少一种生物活性。因此，本发明还包括包含编码蛋白质的核苷酸序列的经分离的核酸分子，其中所述蛋白质含有与SEQ ID NO：013所示氨基酸序列至少约63％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更同源的基本同源的氨基酸序列。在另一实施方案中，经分离的核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质含有与SEQ ID NO：014-018所示氨基酸序列至少约40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更同源的基本同源的氨基酸序列。

例如，涉及如何制造表型沉默的氨基酸取代的指导在Bowie，J.U.etal.，Science 247：1306-1310(1990)中提供，其中作者指出，存在两种途径，用于研究氨基酸序列对改变的耐受。第一种途径依赖于进化过程，其中突变由自然选择接受或拒绝。第二种途径使用基因工程在被克隆的基因的特定位点引入氨基酸改变并选择或筛选，以鉴定保留功能性的序列。如作者所述，这些研究已揭示了蛋白质令人惊奇地对氨基酸取代耐受。作者还指出蛋白质某位置上的何种改变很可能被允许。例如，最深埋(buried)的氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链的很少特征是普遍保守的。其它这类表型沉默取代在上文Bowie et al及其中所引用的参考文献中描述。

可以如下文所述来制造编码与根据SEQ ID NO：013-018的蛋白质同源的OXI 01-OXI 06蛋白质的经分离的核酸分子：向根据SEQ ID NO：001-006或SEQ ID NO：007-012的编码核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或删除，使得一个或多个氨基酸取代、删除或插入被引入所编码的蛋白质中。这类突变可以通过标准技术引入，如定点诱变和PCR-介导的诱变。

术语“功能等同物”还包括A.niger OXI01-OXI06蛋白质的直向同源物。A.niger OXI01-OXI06蛋白质的直向同源物是能够从其它菌株或物种中分离并具有相似或相同生物活性的蛋白质。这类直向同源物可容易地被鉴定，因为含有与SEQ ID NO：013-018基本同源的氨基酸序列。

本文定义术语“基本同源”是指含有与第二氨基酸或核苷酸序列足够或最少的同一或等同(例如具有相似侧链)的氨基酸或核苷酸的第一氨基酸或核苷酸序列，使得所述第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构域。例如，含有下述共有结构域的氨基酸或核苷酸序列在本文中被定义为足够同一，所述共有结构域具有约40％、优选65％、更优选70％、进一步更优选75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性或更多。

此外，编码其它OXI01-OXI06家族成员的核酸(其因而具有与SEQ ID NO：001-006或SEQ ID NO：007-012不同的核苷酸序列)也在本发明的范围内。另外，编码来自不同物种的OXI01-OXI06蛋白质的核酸(其因此具有与SEQ ID NO：001-006或SEQ ID NO：007-012不同的核苷酸序列)在本发明的范围内。

可以根据它们与本文公开的OXI01-OXI06核酸的同源性，使用本文公开的cDNA或其合适的片段作为杂交探针，根据标准的杂交技术，优选地在高度严格的杂交条件下，来分离对应于本发明的OXI01-OXI06DNA的变体(例如天然等位基因变体)或同源物的核酸分子。

除了OXI01-OXI06序列的天然存在的等位基因变体外，技术人员知道，可以通过突变向SEQ ID NO：001-006或SEQ ID NO：007-012的核苷酸序列中引入改变，从而导致OXI01-OXI06蛋白质的氨基酸序列中的改变，而不显著改变OXI01-OXI06蛋白质的功能。

在本发明的另一方面，提供了经改进的OXI01-OXI06蛋白质。经改进的OXI01-OXI06蛋白质是其中至少一种生物活性被改进的蛋白质。这类蛋白质可以如下获得：沿全部或部分OXI01-OXI06编码序列随机地引入突变，重组表达得到的突变体并针对生物活性进行筛选。例如，本领域提供了用于测量氧化还原酶酶活性的标准实验，因而经改进的蛋白质可以容易地被选择。

在一个优选的实施方案中，OXI01-OXI06蛋白质具有根据SEQ IDNO：013-018的氨基酸序列。在另一实施方案中，OXI01-OXI06多肽与根据SEQ ID NO：013-018的氨基酸序列基本同源，并保留根据SEQ IDNO：013-018的多肽的至少一种生物活性，但是由于如上所述的天然变异或诱变而在氨基酸序列上有差异。

在又一个优选的实施方案中，OXI01-OXI06蛋白质具有由下述经分离的核酸片段编码的氨基酸序列，所述经分离的核酸片段能够与根据SEQID NO：001-006或SEQ ID NO：007-012的核酸优选地在高度严格的杂交条件下杂交。

对于包含根据SEQ ID NO：013的氨基酸序列的蛋白质而言，与功能酶最接近的同系物是来自Aspergillus fumigatus的异戊醇氧化酶，该异戊醇氧化酶显示与SEQ ID 013 62％的同一性。在一个实施方案中，经分离的核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质包含与SEQ ID NO：013所示氨基酸序列至少约63％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源的基本同源的氨基酸序列，并且是包含根据SEQ ID NO：013的氨基酸序列的蛋白质的功能等同物。

对于包含根SEQ ID NO：014的氨基酸序列的蛋白质而言，与功能酶最接近的同源物是来自Anthrobacter oxidans的6-羟基烟碱氧化酶，该酶显示与SEQ ID 014xx％的同一性。在一个实施方案中，经分离的核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质包含与SEQ ID NO：014所示氨基酸序列至少约40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源的基本同源的氨基酸序列，并且是包含根据SEQ ID NO：014的氨基酸序列的蛋白质的功能等同物。

对于包含根SEQ ID NO：015的氨基酸序列的蛋白质而言，与功能酶最接近的同源物是来自Aspergillus parasiticus的杂色曲霉素B合酶，该酶显示与SEQ ID 015 31％的同一性。在一个实施方案中，经分离的核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质包含与SEQ ID NO：015所示氨基酸序列至少约40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源的基本同源的氨基酸序列，并且是包含根据SEQ ID NO：015的氨基酸序列的蛋白质的功能等同物。

包含根SEQ ID NO：016的氨基酸序列的蛋白质显示与任何功能酶无同源性。在一个实施方案中，经分离的核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质包含与SEQ ID NO：016所示氨基酸序列至少约40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源的基本同源的氨基酸序列，并且是包含根据SEQ ID NO：016的氨基酸序列的蛋白质的功能等同物。

对于包含根SEQ ID NO：017的氨基酸序列的蛋白质而言，与功能酶最接近的同源物是来自Arthrobacter oxidans的6-羟基-D-烟碱氧化酶，该酶显示与SEQ ID 017＜25％的同一性。在一个实施方案中，经分离的核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质包含与SEQ ID NO：017所示氨基酸序列至少约40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源的基本同源的氨基酸序列，并且是包含根据SEQ ID NO：017的氨基酸序列的蛋白质的功能等同物。

包含根SEQ ID NO：018的氨基酸序列的蛋白质显示与任何功能酶无同源性。在一个实施方案中，经分离的核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质包含与SEQ ID NO：018所示氨基酸序列至少约40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源的基本同源的氨基酸序列，并且是包含根据SEQ ID NO：018的氨基酸序列的蛋白质的功能等同物。

因此，OXI01蛋白质是包含下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：013所示氨基酸序列至少约63％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源，并保留根据SEQ ID NO：013的多肽的至少一种功能活性。

类似地，OXI2-OXI06蛋白质是包含下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列分别与SEQ ID NO：014-018所示氨基酸序列至少约40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源，并保留根据SEQ ID NO：014-018的多肽的至少一种功能活性。

也可以如下文所述来鉴定根据本发明的蛋白质的功能等同物：例如，针对氧化还原酶活性，筛选本发明蛋白质的突变体(例如截短突变体)的组合文库。在一个实施方案中，通过核酸水平上的组合诱变产生有斑文库(variegated library)。可以通过例如将合成的寡核苷酸混合物酶连接为基因序列来产生变体的有斑文库，从而可能的蛋白质序列的简并集合(degenerate set)可作为个体多肽表达。存在可用于从简并寡核苷酸生产本发明多肽的可能变体文库的多种方法。用于合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(见例如Narang(1983)Tetrahedron 39：3；ltakura et al.(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；ltakura et al.(1984)Science 198：1056；Ike et al.(1983)Nucleic Acid Res.11：477)。

另外，本发明多肽的编码序列的片段文库可以被用于产生有斑的多肽群，用于筛选随后的变体选择。例如，可以如下产生编码序列片段的文库：在每个分子仅发生约一次切割的条件下用核酸酶处理感兴趣的编码序列的双链PCR片段，变性双链DNA，将DNA复性形成双链DNA(其可包含来自被不同切割的产物的有义/反义对)，通过用S1核酸酶处理从再形成的双链体上去除单链部分，并将得到的片段文库连接进表达载体中。通过该方法，可以得到下述表达文库，所述表达文库编码感兴趣的蛋白质的不同大小的N-末端和内部片段。

本领域已知有若干种技术可用于筛选组合文库(其通过截短的点突变制造)的基因产物，和用于筛选cDNA文库以获得具有选定特性的基因产物。用于筛选大基因文库的、适用于高通量分析的、最广泛使用的技术典型地包括：将基因文库克隆进可复制的表达载体中，用得到的载体文库转化合适的细胞，和在下述条件下表达组合基因，所述条件下想要的活性的检测简化编码基因(其产物被检测)的载体的分离。循环总体诱变(Recursive ensemble mutagenesis，REM)，一种增强文库中功能突变体频率的技术，可以与筛选实验组合使用以鉴定本发明蛋白质的变体(Arkinand Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815；Delgrave et al.(1993)Protein Engineering 6(3)：327-331)。

除了SEQ ID NO：1中所示的OXI01-OXI06基因序列外，本领域技术人员应当知道给定的种群中可存在DNA序列多态，所述多态导致OXI01-OXI06蛋白质氨基酸序列中的改变。这类遗传多态性可存在于来自不同种群的细胞中或由于天然等位基因变异而存在于一个种群中。等位基因变体也可包括功能等同物。

根据本发明的多核苷酸的片段也可包括不编码功能多肽的多核苷酸。这类多核苷酸可作为PCR反应的探针或引物作用。

根据本发明的核酸无论是编码功能多肽还是无功能的多肽，均可被用作杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)引物。不编码具有OXI01-OXI06活性的多肽的本发明核酸分子的用途尤其包括：(1)从cDNA文库分离编码OXI01-OXI06蛋白质的基因或其等位基因变体，所述cDNA文库例如来自除A.niger之外的其它生物；(2)与中期染色体涂片原位杂交(例如FISH)以提供OXI01-OXI06基因的精确染色体定位，如Verma et al.，Human Chromosomes：a Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，NewYork(1988)所述；(3)Northern印迹分析，用于检测OXI01-OXI06 mRNA在特定组织中的表达；和4)能够被用作诊断工具来分析给定的生物(例如组织)样品中核酸存在的探针和引物，所述核酸能与OXI01-OXI06探针杂交。

本发明还包括获得OXI01-OXI06基因或cDNA功能等同物的方法。这类方法需要获得被标记的含有被分离的核酸的探针，所述被分离的核酸编码根据SEQ ID NO：013-018的序列或其变体的全部或部分；在允许探针与文库中的核酸片段杂交从而形成核酸双链体的条件下，用被标记的探针筛选核酸片段文库，和从任何被标记的双链体中的核酸片段制备全长的基因序列，以获得与OXI01-OXI06基因相关的基因。

宿主细胞

在另一实施方案中，本发明包括细胞，例如含有本发明所包括的核酸的经转化的宿主细胞或重组的宿主细胞。“经转化的细胞”或“重组细胞”是其中(或其祖先中)已经借助于重组DNA技术引入了本发明核酸的细胞。原核和真核细胞均包括在内，例如细菌、真菌、酵母等等，特别优选的是来自丝状真菌(尤其是Aspergillus niger)的细胞。

可选用调控插入序列表达并以特异的、期望的方式加工基因产物的宿主细胞。蛋白质产物的这类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)可促进蛋白质发挥最佳功能。

多种宿主细胞具有用于翻译前加工和修饰蛋白质和基因产物的特性和特异机制。可选用分子生物学和/或微生物学领域技术人员熟悉的适当细胞系或宿主系统，以确保对所表达的外源蛋白质的想要的和正确的修饰与加工。为此，可以使用具有下述细胞机制的真核宿主细胞，所述细胞机制用于适当地加工原始转录本、糖基化和磷酸化基因产物。这类宿主细胞是本领域公知的。

宿主细胞还包括但不限于：哺乳动物细胞系如CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38和脉络丛细胞系。

如果想要的话，可以由稳定转染的细胞系来生产根据本发明的多肽。公众可获得多种适用于稳定转染哺乳动物细胞的载体，用于构建这类细胞系的方法也是公众已知的，例如Ausubel et al.(上文)中。

氧化还原酶在工业过程中的用途

本发明还涉及根据本发明的氧化还原酶在选定数量的工业过程中的用途。尽管用这些过程获得了长期的经验，但是根据本发明的氧化还原酶具有超出目前所用酶的大量显著优点。根据特定的应用，这些优点可包括下述方面，如更好的性能、更低的生产成本、更高的底物特异性、更低的抗原性、更少的不想要的副活性、在合适的微生物中生产时更高的产率、更合适的pH和温度范围、更好的最终产物味道以及食物级别和犹太教规方面(kosher aspect)。

本发明的氧化还原酶可被用于下述任何应用中，所述应用中期望氧化底物或获得其特定反应产物。例如，根据本发明的氧化还原酶的应用能够与醛、醇、羧酸等一起产生过氧化氢。

可以使用根据本发明的新颖氧化还原酶的工业过程之一是烘焙应用。本发明还涉及提供面粉面团的方法(其具有经改进的流变学特性)，并涉及从这类面团制造的完成烘焙的或干燥的制品(其具有经改进的结构、食用品质和尺寸特性)。本发明还涉及烘焙预混合物，所述预混合物包含面粉、酶制剂和合适的运载体。本发明导致产生更强的面团，其具有经改进的流变学特性以及具有经改进的品质的最终烘焙制品。

对小规模和大规模应用而言，面团的强度均是烘焙的重要方面。结实的面团在面团转运期间具有更大的混合时间、醒发时间和机械振动耐性，而软弱的面团对这些处理更不耐受。具有更好的流变学和操作特性的结实面团来自含有强谷蛋白网状系统的面粉。具有低蛋白质含量或差的谷蛋白品质的面粉导致软弱的面团。

面团调节剂(conditioner)是烘焙工业公知的。向面包面团中添加调节剂导致产生经改进的面团可加工性和经改进的面包结构、体积、口味和新鲜度(抗腐性)。非特异性的氧化剂(如碘酸盐、过氧化物、抗坏血酸、溴酸钾和偶氮二酰胺)被用于促进面粉的烘焙性能、获得具有经改进的流变学特性的面团以及获得具有想要的强度和稳定性的面团。

已经提出这些调节剂诱导蛋白质之间键的形成，所述键强化谷蛋白从而强化面团。然而，若干种目前可获得的化学氧化剂的使用遇到了消费者的抵制，或不被管理机构允许。

酶作为面团调节剂的用途已经被认为是化学调节剂的备选方案。目前大量的酶已经被用作面团和/或面包改进剂，尤其是作用于面团中大量存在的成分的酶。这类酶的例子是淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、木聚糖酶和(半)纤维素酶，包括聚戊糖酶(pentosanase)和脂酶、磷脂酶和半乳糖脂酶。

烘焙制品从下述面团制备，所述面团通常由碱性成分面粉、水和任选的盐制成。取决于烘焙制品，其它任选的成分为糖、调味剂等。对发酵剂制品而言，在化学发酵系统之后主要使用面包酵母(baker′s yeast)，所述化学发酵系统如酸(产酸化合物)和碳酸氢盐的组合。为了改进面团的操作特性和/或烘焙制品的最终特性，存在开发加工助剂(aids)的持续努力，所述加工助剂具有改进的特性。待改进的面团特性包括可加工性、气体保留能力等。可以被改进的烘焙制品的特性包括面包体积、面包屑易碎性(crustcrispiness)、粉碎结构和柔软性、口味和香味和保质期。目前存在的加工助剂可以被分为两组：化学添加剂和酶。

具有改进特性的化学添加剂包括化学氧化剂如抗坏血酸、溴酸盐和偶氮碳酸氢盐(azodicarbonate)，还原剂如L-半胱氨酸和谷胱甘肽，作为面团调节剂(如二乙酰酒石酸酯)发挥作用的乳化剂如单/双甘油酯(DATEM)、硬脂酰乳酸钠(sodium stearoyl lactylate，SSL)或硬脂酰乳酸钙(CSL)，或作为面包防硬剂发挥作用的如单硬脂酸甘油酯(GMS)等，脂肪材料如甘油三酯(脂肪)或卵磷脂等等。

最近，存在用酶代替化学添加剂的趋势。酶被认为是更天然的化合物并因此更被消费者接受。合适的酶可选自氧化酶，由淀粉降解酶、阿拉伯木聚糖和其它半纤维素降解酶、纤维素降解酶、脂肪材料裂解酶和蛋白质降解酶组成的组。

本发明还涉及用于制备面团或烘焙制品的方法，所述方法包括向面团中掺入有效量的本发明的氧化还原酶，这相对于其中未掺入多肽的面团或烘焙制品而言促进面团或得自面团的烘焙制品的一种或多种特性。

短语“掺入面团中”在本文中定义为向面团中、要用于制造面团的任何成分中、和/或要制造面团的面团成分的混合物中添加根据本发明的氧化还原酶。换言之，根据本发明的氧化还原酶可以在面团制备的任何步骤中被添加，并可以在一个、两个或更多步骤中被添加。根据本发明的氧化还原酶被添加进面团的成分中，所述成分使用本领域公知的方法被揉捏和烘焙以制造烘焙制品。参阅例如U.S.专利No.4,567,046、EP-A-426,211、JP-A-60-78529、JP-A-62-111629和JP-A-63-258528。

术语“有效量”在本文中定义为根据本发明的氧化还原酶的下述量，所述量足够对面团和/或烘焙制品的至少一个感兴趣的特性提供可测量的作用。

术语“经改进的特性”在本文中定义为面团和/或得自面团的制品(尤其是烘焙制品)的任何特性，所述特性相对于其中未掺入本发明氧化还原酶的面团或产物而言被本发明的氧化还原酶的作用改进。经改进的特性可包括但不限于：提高的面团强度、提高的面团弹性、提高的面团稳定性、经改进的烘焙制品香味、经改进的烘焙制品抗腐性和经改进的面包屑白度。

可以根据以下实施例中所述的本发明的方法，通过将添加和不添加本发明多肽而制备的面团和/或烘焙制品进行比较，来测定经改进的特性。感觉品质可以使用烘焙工业中明确的流程来评价，并可包括例如使用一组受过训练的口味测试人员(a panel of trained taste-testers)。

术语“提高的面团强度”在本文中定义为面团的下述特性，所述面团一般具有更具弹性的特性和/或需要更多的劳动输入来用模具成形和造型。

术语“提高的面团弹性”在本文中定义为面团的下述特性，所述面团具有在经受过某些物理张力之后恢复其原始形状的更高趋势。

术语“提高的面团稳定性”在本文中定义为面团的下述特性，所述面团对机械损伤更不敏感，因此更好地维持其形状和体积。

术语“降低的面团粘稠度”在本文中定义为面团的下述特性，所述面团具有更小的与表面(例如在面团生产机器中)粘附的趋势，并如本领域所已知的，由熟练的测试烘焙者根据经验评价或通过使用纹理分析仪(例如TAXT2)测量。

术语“经改进的面团延展性”在本文中定义为面团的下述特性，所述面团可以接受提高的张力或拉伸而不破裂。

术语“经改进的面团可加工性”在本文中定义为面团的下述特性，所述面团一般更不粘和/或更坚硬和/或更有弹性。

术语“提高的面团醒发抗性”被定义为面团经受延长的醒发时间的能力。

术语“提高的烘焙制品的体积”被测量为给定的面包的比体积(specific volume，体积/重量)，这典型地通过传统的油菜籽替换方法测定。

术语“经改进的烘焙制品面包屑结构”在本文中定义为烘焙制品的特性，所述烘焙制品的面包屑中具有更精细和/或更薄的细胞壁和/或细胞在面包屑中更均一/同质的分布，并通常由熟练的测试烘焙者根据经验评价。

术语“经改进的烘焙制品柔软性”是“硬度”的反义词，并在本文中定义为烘焙制品的特性，所述烘焙制品更容易被压缩，并且如本领域已知由熟练的测试烘焙者根据经验评价或通过使用纹理分析仪(例如TAXT2)测量。

术语“经改进的烘焙制品香味”由受过训练的测试组评价。

术语“经改进的烘焙制品抗腐性”在本文中被定义为烘焙制品的特性，所述烘焙制品储存期间具有降低的品质参数(例如柔软度和/或弹性)衰退速率。

术语“面团”在本文中定义为面粉和其它成分的混合物，所述混合物足够坚硬到被揉捏或滚动。面团可以是新鲜的、冷冻的、预先暴露的(pre-bared)或预先烘焙的。冷冻面团的制备由KuIp and Lorenz在Frozen andRefrigerated Doughs and Batters中描述。

术语“烘焙制品”在本文中定义为从面团制备的、具有软或脆特征的任何制品。可有利地由本发明生产的烘焙制品(无论是白色、浅色或深色类型)的例子为面包(尤其是白面包、全麦面包或裸麦面包)，典型地以棍或卷(loaves or rolls)的形式，法棍面包，意大利面，皮塔(pita)面包，玉米饼(tortillas)，墨西哥玉米卷，蛋糕，煎饼，饼干，曲奇，馅饼皮(piecrust)，馒头和脆面包(crisp bread)等等。

本发明的氧化还原酶和/或本发明方法中要使用的其它酶可以是适用于所述用途的任何形式，例如干粉、凝聚的粉末、颗粒(尤其是无尘颗粒)、液体(尤其是经稳定的液体)或受保护的酶(如WO01/11974和WO02/26044中所述)的形式。可以通过常规方法制备颗粒和凝聚的粉末，例如通过将根据本发明的氧化还原酶喷雾在流动床颗粒剂上的运载体上。运载体可由颗粒核心组成，所述颗粒核心具有合适的颗粒大小。运载体可以是可溶的或不溶的，例如盐(例如NaCl或硫酸钠)、糖(例如蔗糖或乳糖)、糖醇(例如山梨糖醇)、淀粉、稻、玉米粒或大豆。根据本发明的氧化还原酶和/或其它酶可以含在缓释的配方中。用于制备缓释配方的方法是本领域公知的。添加营养学可接受的稳定剂(如糖、糖醇或其它多元醇和/或乳酸或根据已知方法的其它有机酸)可例如对液体酶制剂加以稳定。

根据本发明的氧化还原酶也可以被掺入包含酵母的组合物中，如EP-A-0619947、EP-A-0659344和WO02/49441中公开的组合物。

对于包含在面粉的预先混合物中而言，根据本发明的多肽是干燥制品(例如无尘颗粒)是有利的，而对于与液体一起被包含而言，液体形式是有利的。

也可以向面团中掺入一种或多种其它酶。所述其它酶可以是任何来源，包括哺乳动物和植物来源，优选地为微生物(细菌、酵母或真菌)来源，并可通过本领域常用技术获得。

在一个优选的实施方案中，其它酶可以是淀粉酶如α-淀粉酶(适用于提供可被酵母发酵的糖并延缓腐败)或β-淀粉酶，环糊精葡萄糖转位酶，肽酶尤其是外肽酶(适用于增强香味)、转谷氨酰胺酶，脂酶/磷脂酶/半乳糖脂酶(适用于修饰面团或面团组分中存在的脂解化合物)，氧化还原酶，纤维素酶，半纤维素酶，尤其是戊聚糖酶如木聚糖酶(适用于戊聚糖的部分水解，这提高面团的延展性)，蛋白酶(适用于削弱谷蛋白，尤其是使用硬小麦粉时)，蛋白质二硫化物异构酶，例如WO 95/00636中公开的蛋白质二硫化物异构酶，糖基转移酶，过氧化物酶(适用于改进面团的稠度)，漆酶，儿茶酚氧化酶或其它氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、醛糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂肪氧化酶或L-氨基酸氧化酶(适用于改进面团的稠度)。

当根据本发明的方法要添加一种或多种其它酶添加剂时，这些添加剂可以单独地或与根据本发明的多肽一起，任选地作为面包改进和/或面团改进组合物的组分被添加。其它酶活性可以是上述的任何酶，并可以根据已确立的烘焙实践确定剂量。

本发明还涉及用于制备烘焙制品的方法，包括烘焙通过本发明方法获得的面团，以生产烘焙制品。烘培面团以生产烘培制品可以通过本领域公知的方法进行。

本发明还涉及分别通过本发明的方法生产的面团和烘焙制品。

本发明还涉及用于面团和/或由面团制成的烘焙制品的预混合物(例如为面粉组合物形式)，其中所述预混合物包含本发明的多肽。术语“预混合物”在本文定义为以其常规含义理解，即作为烘焙剂的混合物，一般包含不仅可用于工业面包烘焙剂中的面粉，一般包含不仅可用于工业面包烘焙工厂/设施、而且也可用于零售面包房的面粉。可以通过将本发明的多肽或包含多肽的本发明的面包改进和/或面团改进组合物与合适的运载体(如面粉、淀粉、糖或盐)混合来制备预混合物。预混合物可含有其它面团改进和/或面包改进添加剂，例如包括上述酶的任何添加剂。

本发明还涉及颗粒或凝聚粉末形式的烘焙添加剂，所述添加剂包含本发明的多肽。烘焙添加剂优选地具有狭窄的颗粒大小分布，多于95％(按重量计)的颗粒在25到500μm的范围内。

在面团和面包制造中，本发明可与前文定义的加工助剂组合使用，所述加工助剂如化学加工助剂，如氧化剂(例如抗坏血酸)、还原剂(例如L-半胱氨酸)、磷脂酶和/或其它酶，如多糖修饰酶(例如α-淀粉酶、半纤维素酶、分支酶等)和/或蛋白质修饰酶(内切蛋白酶、外切蛋白酶、分支酶等)。

还发现OXI01蛋白质能够在面团中产生过氧化氢。其令人惊奇地使用至少9，12，13-三羟基-10-十八碳烯酸作为底物，从而生产氧代-二羟基-10-十八碳烯酸。该底物存在于例如面粉中，并因此使得OXI01蛋白质特别适用于烘焙。

这类酶在烘焙中的用途之前是未知的。因此，本发明还包括下述酶在烘焙中的用途，所述酶催化羟基脂肪酸(例如单羟基脂肪酸或二羟基脂肪酸或三羟基脂肪酸如9，12，13-三羟基-10-十八碳烯酸)的氧化从而产生过氧化氢。合适的酶类型的一个例子是醇氧化酶，例如仲醇氧化酶或异戊醇氧化酶。

在一个优选的实施方案中，能够氧化羟基脂肪酸的酶与脂肪氧合酶和/或过氧化物酶组合。

本发明还涉及适用于烘焙的组合物，包括能够氧化羟基脂肪酸的酶和脂氧合酶和/或过氧化物酶。优选地，能够氧化羟基脂肪酸的该酶能够氧化9，12，13-三羟基-10-十八碳烯酸。更优选地，能够氧化羟基脂肪酸的该酶为OXI01蛋白质，进一步更优选为包含根据SEQ ID NO：013的氨基酸序列的蛋白质。

根据本发明的氧化还原酶的另一用途是乳制品应用领域内的。

对乳的热处理总是伴随着一些程度的麦拉德反应(Maillard reaction)，导致被处理的乳发生轻微的褐色。尽管在一些情况下这可以是想要的(例如在牛油糖(butterscotch confection)或焦糖中)，但是变褐通常是不想要的。麦拉德反应是还原乳中存在的糖(特别是乳糖、葡萄糖和乳糖)与乳蛋白质(如酪蛋白或乳清蛋白)中存在的游离氨基反应的结果。

根据本发明的氧化还原酶OXI01-06可用于在提高的温度下降低乳、乳衍生制品或含有这类乳衍生(乳)制品的食物中的麦拉德反应。

这类处理的一个例子是巴氏消毒乳，以提高其保质期稳定性。在低温长时间(LTLP)巴氏消毒(也称作大桶(vat)巴氏消毒)中，典型地将乳在62.80℃保持不少于30分钟。在连续的过程中，使用高温短时间(HTST)巴氏消毒，其中乳在不低于71.70℃的温度下保持最少15秒(或在更高温度下更短时间段的等同条件)。更最近开发的是超高温处理(UHT)巴氏消毒，其中乳被加热至至少135℃保持最少1秒。UHT处理特别需要、LTLP和HTST处理也以较小的程度需要非常严格的温度和过程控制。

使用根据本发明的氧化还原酶的合适的应用的一个例子是涂在批萨上面的乳酪。在许多情况下，在批萨馅料中使用莫扎里拉(Mozzarella)型乳酪。在该领域中，凝乳(pasta fileta)是指莫扎里拉。许多批萨制造者在＞260C的温度下烘焙批萨。在这些高温下，乳酪成为褐色的倾向极度成为摩苏里拉工业的具体担心，因为摩苏里拉制造者必须使用在这些高温下烘烤时不会产生黑色水泡和棕色区域的乳酪。变褐色的效应典型地由乳糖和特别是半乳糖的残余量产生。本领域已知半乳糖和被烘焙的乳酪的颜色水平之间存在强的相关系数，并且文献中提到了降低莫扎里拉中半乳糖和乳糖水平的许多尝试。这些是最难以操作的和/或可提高成本或降低产率。

在热处理之前使用根据本发明的氧化还原酶减少麦拉德反应，提供了在提高的温度下处理时控制乳变为褐色的有效途径。根据本发明的氧化还原酶优选在乳处理的早期被添加，从而允许酶有最大的时间来氧化还原糖。因为该酶依赖于氧的可用性，所以早期添加是优选的，从而允许在乳加工期间进入氧，并因此使得还原糖浓度水平尽可能高的减少。根据本发明的氧化还原酶具有广泛的底物特异性，允许大范围还原糖的氧化。对于在乳制品或含乳食物中的乳制品应用而言，根据本发明的氧化还原酶能够有效地氧化乳糖、葡萄糖和半乳糖。

酶可以与更多的固体食物(例如乳酪)以若干种方式接触。可以通过在制造工艺中的一些阶段添加酶(例如添加至乳酪乳中)而将乳酪与酶在乳酪制造工艺中接触，导致酶被掺入乳酪基质中。存在氧时酶会开始有活性；这在一些程度上可以在乳酪自身中进行，但是在乳酪加工如切割或磨碎(这导致暴露于空气的乳酪表面和氧暴露的显著增加)期间和/或之后最为有效。或者，可以在加热之前将酶喷雾在含乳酪食品上，以这种方式防止麦拉德反应最有效发生的表面上的麦拉德反应。在该情况下酶可以在溶液中或分散系中被提供，并被喷雾在食物表面上。溶液/分散系可以包含用量为1-50单位OXI01-OXI06/ml的酶。或者，可以添加干燥形式(如粉末)的酶。

干燥形式或液体形式的酶可以单独或与其它添加剂组合添加。

令人惊奇地，已经发现，使用本发明的氧化还原酶也能够降低乳中的需氧微生物的生长，从而有助于新鲜乳的保存。在这类情况下，氧化还原酶可以被用作乳制品应用中(例如在乳、乳衍生制品和含这类制品的食物中)的抗微生物剂。

使用根据本发明的氧化还原酶的一个额外优点是过氧化物的形成。已知这类过氧化物能与蛋白质反应，导致蛋白质交联(参阅例如J.A.Gerrard，Trens in Food Science & technology(2002)，13，391-399)。然而，交联的程度取决于产生的过氧化氢的量。令人惊奇地，根据本发明的氧化还原酶能够大量交联乳中的蛋白质。交联的程度还取决于底物的预处理、氧化还原能得到的氧量等等。蛋白质的交联具有下述优点：包含交联的蛋白质的制品具有被改变的构造特性，例如从这类交联蛋白质形成的凝胶的存水能力。

实施例

实施例1

流变学测试

粉质图(farinograph)和伸展图(extensograph)被全世界的烘焙者用来评价面团的流变学和技术特性。

可以通过根据International Association of Cereal Chemistry(ICC)和theAmerican Association of Cereal Chemistry(AACC)的标准方法，来测量氧化还原酶对面团的流变学特性的影响，所述标准方法包括快速黏度分析仪(Rapid Visco Analyser)、粉质仪方法(AACC 54-2，ICC 115)和拉伸仪(AACC 54-10，ICC 114)。

事实上，用伸展图方法来测量面团的相对强度。结实的面团显示比软弱的面团更高的和(在一些情况下)更长的伸展图曲线。AACC方法54-10以以下的方式定义了伸展图：“伸展图记录测试的一块面团的负荷-伸展曲线，直至其断裂。负荷-伸展曲线或伸展图的特征被用于评价面粉的一般品质机器对促进剂(improving agent)的反应”。

粉质图方法测定具体面粉的水摄入和得到的面团的混合耐性。更好的烘焙面粉和面团会显示更高的粉质图值。如果具体的面粉显示相对高的水摄入，并且得到的面团的混合耐性良好，则粉质图曲线在全部时间显示保留大部分(如果不是所有的话)初始高度。这类面团的可加工性和烘焙品质可能是极好的。AACC方法54-12定义粉质图如下：“粉质图测量并记录面团对混合的抗性。其被用于评价面粉的吸收和测定面团在混合时的稳定性和其它特征”。

实施例2

测量面团的游离硫醇含量

可以通过测量面团中游离巯基的含量来研究氧化还原酶对硫醇交联形成的作用。所述方法描述于Cereal Chemistry，1983，70，22-26中。该方法以下述原则为基础：5，5′-二硫代-二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)与面团中的硫醇反应形成高度有色的2-硝基-5-巯基-苯甲酸阴离子，在412nm处用分光光度计对其加以测量。

实施例3

迷你巴塔德(Mini-batard)烘焙测试

针对谷蛋白强化使用迷你巴塔德烘焙测试。为了检测酶对谷蛋白强化的作用，省略化学氧化剂的添加。所有的测试一式两份进行。

配方

工艺

针对面团的稳定性测量高度/宽度比。烘焙炉膛面包时，当不存在氧化剂时面团是不稳定的并变成又扁又宽。相同的特征也出现在最终的面包中。促进面团稳定性的酶的添加导致更高的高度/宽度比。

在加工期间，由烘焙者评价面团品质。用尺子测量高度/宽度比。结果用ANOVA，Statgraphics plus 5.1进行统计学评价。

实施例3.1

在迷你巴塔德中测试具有根据SEQ ID NO：013、014、015、016、017和018的氨基酸序列的氧化还原酶。所有的测试一式两份进行。所有的酶作为超滤浓缩物被递送被在每kg面粉5mg总蛋白质下测试。阴性对照是不添加氧化还原酶的面团。使用抗坏血酸(68mm)作为参考。

结果：

添加	高度/宽度比
		无氧化还原酶	0.55a*
SEQ ID NO：013	0.65c
		SEQ ID NO：014	0.59b
SEQ ID NO：015	0.59b
		SEQ ID NO：016	0.59b
SEQ ID NO：017	0.60b
		SEQ ID NO：018	0.61b
抗坏血酸	0.66c

^*带有不同字母的结果是在90.0％置信水平上统计学显著差异的。用于在均值间鉴别的方法是Fisher′s最小显著差数(LSD)程序。

清楚地看到含有根据本发明的氧化还原酶的面包显示与不含这些酶的面包相比更好的高度/宽度比。

实施例3.2

在迷你巴塔德中测试包含根据SEQ ID NO：013的氨基酸序列的酶对高度/宽度比的剂量应答。测试了三种剂量：1、2和3mg总蛋白质/kg面粉。阴性对照是不添加氧化还原酶的面团。使用抗坏血酸(68mm)作为参考。测试一式两份进行。

结果：

^*带有不同字母的结果是在90.0％置信水平上统计学显著差异的。用于在均值间鉴别的方法是Fisher′s最小显著差数(LSD)程序。

发现根据本发明的氧化还原酶在烘焙的迷你巴塔德的高度/宽度比中显示良好的剂量应答。与实施例3.1的结果相比，该测试中高度/宽度比的绝对值更高。这与下述事实相关：实施例3.1的测试用来自2005年收获的面粉完成，而实施例3.2用来自2006年收获的面粉完成。

Claims (30)

1.经分离的多核苷酸，其能够与SEQ ID NO：001-006或SEQ ID NO：007-012中任一多核苷酸杂交。

2.根据权利要求1的经分离的多核苷酸，所述多核苷酸能够在高严格度条件下与SEQ ID NO：001-006或SEQ ID NO：007-012中任一多核苷酸杂交。

3.根据权利要求1或2的经分离的多核苷酸，其能从丝状真菌获得。

4.根据权利要求3的经分离的多核苷酸，其能从Aspergillus niger获得。

5.编码下述氧化还原酶的经分离的多核苷酸，所述氧化还原酶包含氨基酸序列SEQ ID NO：013-018之任一或其任何的功能等同物。

6.编码下述氧化还原酶的至少一个功能结构域的经分离的多核苷酸，所述氧化还原酶包含氨基酸序列SEQ ID NO：013-018之任一或包含其中任何的功能等同物。

7.经分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：001-077或SEQ ID NO：007-012之任一或其任何的功能等同物。

8.由SEQ ID NO：001-006或SEQ ID NO：007-012之任一组成的经分离的多核苷酸。

9.包含根据权利要求1到8中任一项的多核苷酸序列的载体。

10.根据权利要求9的载体，其中根据权利要求1到8中任一项的所述多核苷酸序列与下述调节序列可操作地连接，所述调节序列适用于所述多核苷酸序列在合适的宿主细胞中表达。

11.根据权利要求10的载体，其中所述合适的宿主细胞是丝状真菌。

12.制造根据权利要求1-8中任一项的多核苷酸或根据权利要求9到11中任一项的载体的方法，所述方法包括下述步骤：培养用所述多核苷酸或所述载体转化的宿主细胞，并从所述宿主细胞中分离所述多核苷酸或所述载体。

13.具有氨基酸序列SEQ ID NO：013-018之任一或其任何的功能等同物的经分离的氧化还原酶。

14.根据权利要求13的经分离的氧化还原酶，其能从Aspergillus niger获得。

15.通过在适当的宿主细胞例如Aspergillus niger中表达根据权利要求1到8中任一项的多核苷酸或根据权利要求9到11中任一项的载体能够获得的经分离的氧化还原酶。

16.包含根据权利要求13到15中任一项的任何氧化还原酶功能结构域的重组氧化还原酶。

17.制造根据权利要求13到16中任一项的氧化还原酶的方法，所述方法包括下述步骤：用根据权利要求1到8中任一项的经分离的多核苷酸或根据权利要求9到11中任一项的载体转化合适的宿主细胞，在允许所述多核苷酸表达的条件下培养所述细胞，和任选地，从所述细胞或培养基中纯化被编码的多肽。

18.重组宿主细胞，其包含根据权利要求1到8中任一项的多核苷酸或根据权利要求9到11中任一项的载体。

19.重组宿主细胞，其表达根据权利要求13到16中任一项的多肽。

20.经纯化的抗体，其与根据权利要求13到16中任一项的氧化还原酶具有反应性。

21.用于制造面团的工艺，所述工艺包括添加根据权利要求13-16中任一项的氧化还原酶。

22.用于从通过权利要求21的工艺制备的面团生产烘焙制品的工艺。

23.根据权利要求13-16中任一项的氧化还原酶用于制备面团和/或其烘焙制品的用途。

24.能够水解羟基脂肪酸的酶用于制备面团和/或其烘焙制品的用途。

25.根据权利要求13-16中任一项的氧化还原酶用于制备乳制品的用途。

26.根据权利要求13-16中任一项的氧化还原酶用于在乳制品中降低Maillard反应的用途。

27.根据权利要求13-16中任一项的氧化还原酶用于在乳制品中防止Maillard反应的用途。

28.根据权利要求13-16中任一项的氧化还原酶作为乳制品中抗微生物剂的用途。

29.根据权利要求28的氧化还原酶的用途，其特征在于所述抗微生物剂被用于乳中的乳过氧化物酶-硫氰酸体系。

30.根据权利要求25-28中任一项的氧化还原酶的用途，其特征在于所述乳制品为乳或乳酪。