BRPI0707497A2 - oxidorredutases inÉditas e seus usos - Google Patents

Abstract

OXIDORREDUTASES INEDITAS E SEUS USOS. A presente invenção se refere a seqüências de polinucleotídeos recém-identificadas compreendendo um gene que codifica uma oxidorredutase inédita isolada de Aspergilius niger. A presente invenção apresenta a seqúência de nucleotídeos de comprimento total do gene inédito, compreendendo a seqúência de DNAc a seqúência de codificação de comprimento total da oxidorredutase inédita assim como a seqúência de aminoácidos da proteína funcional de comprimento total e seus equivalentes funcionais. A presente invenção também se refere a métodos de se usar estas enzimas nas aplicações em panificação e laticínios. Também são incluídas na presente invenção células transformadas com um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção e células em que uma oxidorredutase de acordo com a presente invenção é geneticamente modificada para aumentar ou reduzir sua atividade e/ou seu nível de expressão.

Description

OXIDORREDUTASES INÉDITAS E SEUS USOS

Campo da Invenção

A invenção se refere a seqüências depolinucleotídeos recém-identificadas compreendendo genesque codificam oxidorredutases inéditas isoladas deAspergillus niger. A invenção apresenta a seqüência denucleotídeo de comprimento total dos genes inéditos,compreendendo a seqüência de DNAc as seqüências decodificação de comprimento total das oxidorredutasesinéditas assim como a seqüência de aminoácidos da proteínafuncional de comprimento total e seus equivalentesfuncionais. A invenção também se refere a métodos de usodestas enzimas em aplicações de panificação e laticínios.Também são incluídas na invenção células transformadas comum polinucleotídeo de acordo com a invenção e células emque a oxidorredutase de acordo com a invenção égeneticamente modificada para aumentar ou reduzir suaatividade e/ou nível de expressão.

Fundamentos da Invenção

Oxidorredutases são definidas no presente invençãocomo enzimas que catalisam reações de oxidação-redução. Aclasse de enzimas conhecidas como oxidorredutases (HICl.#.#.# onde # é um número) é definida pelo NomenclatureCommittee of the International Union of Biochemistry on theNomenclature and Classification of Enzymes (EnzymeNomenclature, Academic Press, Nova York, 1992) comoconsistindo em todas as enzimas que catalisam reações deoxidação-redução. O substrato oxidado é considerado como umdoador de hidrogênio ou de elétrons. O segundo número nocódigo indica o grupo no doador de hidrogênio que sofre aoxidação. O terceiro número indica o tipo de aceptorenvolvido, um 3 indicando que o aceitador é o oxigênio. 0substrato que é oxidado é considerado um doador dehidrogênio.

Exemplos de oxidorredutases são:

o Lacase (EC 1.10.3.2) catalisa a oxidação tanto deo- como de p-quinóis, e freqüentemente atua também sobreaminofenóis e a fenileno-diamina.

o Glicose oxidase (EC 1.1.3.4 - GOX) catalisa aoxidação de glicose e de diversos outros açúcares.

o Hexose oxidase (EC 1.1.3.5) catalisa a mesmareação que GOX, mais exatamente, a oxidação de glicose e dediversos outros açúcares tais como galactose, manose,maltose, lactose e celobiose.

o Colesterol oxidase (EC 1.1.3.6) catalisa aoxidação-redução de colesterol.

o Colina desidrogenase (E.C. 1.1.99.1) catalisa aoxidação-redução de colina.

o Glicose desidrogenase (E.C. 1.1.99.10) catalisa aoxidação-redução de glicose.

o Álcool oxidase (EC 1.1.3.13) catalisa a oxidaçãode álcoois primários.

o Álcool secundário oxidase (EC 1.1.3.18) catalisaa oxidação de álcoois secundários.

o D-aspartato oxidase (EC 1.4.3.1) catalisa aoxidação-redução de aspartato e é também conhecida comooxidase aspártica.

o Putrescina oxidase (EC 1.4.3.10) catalisa aoxidação-redução de putrescina em 4-aminobutanal que secondensa em 1-pirrolina.o Amina oxidase (EC 1.4.3.4) catalisa a oxidação-redução de aminas, principalmente de aminas primárias egeralmente de algumas aminas secundárias e terciárias.

o Sarcosina oxidase (EC 1.5.3.1) catalisa aoxidação-redução de sarcosina.

o Poliamina oxidase (EC 1.5.3.11) catalisa aoxidação-redução de N'-acetilespermina.

o (i?)-6-Hidroxinicotina oxidase (EC 1.5.3.6)catalisa a oxidação-redução de (R)-6-Hidroxinicotina.

o Reticulina oxidase (EC 1.5.3.9) catalisa aoxidação-redução de (S)-Reticulina que é também conhecidacomo a enzima formadora de ponte berberina.

o Catecol oxidase (EC 1.10.3.1) catalisa aoxidação-redução de catecol e uma série de catecóissubstituídos.

o Tioredoxina reductase (EC 1.6.4.5) que catalisa aredução de tioredoxina oxidada.

o Sulfito reductase (EC 1.8.1.2) que catalisa aredução de sulfeto de hidrogênio.

o Cloreto peroxidase (EC 1.11.1.10) que produz acloração de moléculas orgânicas que formam ligações C-Clestáveis e que pode também agir sobre Br" e I".

o Catalase (EC 1.11.1.6) que produz uma oxidação-redução de diversas substâncias orgânicas, tais como, porexemplo, etanol.

o Outros exemplos de oxidorredutases são luciferasede vaga-lume (EC 1.13.12.7), ácido cinâmico 4-hidroxilase(EC 1.14.13.11), benzoato 4-monooxigenase (EC 1.14.13.12),colesterol 7a-monooxigenase (EC 1.14.13.17),pentaclorofenol monooxigenase (EC 1.14.13.50),monooxigenase (EC 1.14.14.1), esteróide Ιΐβ-monooxigenase(EC 1.14.15.4), monofenol monooxigenase (EC 1.14.18.1),prostaglandina sintase (EC 1.14.99.1) e salicilatohidroxilase (EC 1.14.13.1),

Os exemplos dados não são absolutamente restritivosou limitantes no tocante à presente invenção.

Oxidorredutases podem ser convenientementeproduzidas em microorganismos. As oxidorredutasesmicrobianas são disponíveis de uma variedade de fontes;espécies de Bacillus são uma fonte comum de enzimasbacterianas, ao passo que enzimas fúngicas sãohabitualmente produzidas em espécies de Aspergillus.

Enzimas microbianas com atividade de oxidorredutasejá foram relatadas de diversas fontes, incluindoPenicilliuml Talaromyces, Cladosporum (WO 95/29996),Trametes hirsuta (WO 97/22257). Os genes de oxidorredutasemicrobiana já foram clonados de diversas fontes incluindoFusarium (EP 1157117 Al) , Coriolus versicolor (DE 195 45780 Al) , Trametes (US6146865), Trichoderma (US 6248575) eMicrodoehium nivale (W09931990).

Oxidorredutases podem ser usadas em todas as áreasde aplicação em que são também usados agentes oxidantesquímicos. Tais agentes oxidantes químicos são geralmenteoxidantes não específicos, tais como iodatos, peróxidos,ácido ascórbico, bromato de potássio e azodicarbonamida. Noentanto, o uso de diversos dos agentes oxidantes químicosatualmente disponíveis encontrou resistência por parte dosconsumidores ou não é permitido por agências reguladoras,especialmente na área de aplicações alimentares.

0 uso de oxidorredutases foi considerado como umaalternativa a agentes oxidantes químicos.

As oxidorredutases podem ser usadas em umamultiplicidade de aplicações industriais, incluindo apreparação de alimentos e detergentes.

As aplicações industriais citadas acima da enzimaoxidorredutase são somente alguns poucos exemplos e estarelação não deve ser considerada restritiva.

Um exemplo de preparação de alimentos em que asoxidorredutases podem ser convenientemente usadas é nocampo de aplicações de panificação, para melhorar aqualidade da massa de panificação ou do produto depanificação, por exemplo.

A patente U.S. No. 2.783.150 divulga o uso de GOXna farinha para melhorar a resistência da massa depanificação, e a textura e aparência do pão assado.EP0338452 divulga a aplicação de glicose oxidase emcombinação com enzimas que degradam a hemicelulose e/ou acelulose. W002/30207 divulga o uso de GOX em artigos depanificação em combinação com dissulfeto de proteínaisomerase para melhorar a eficiência de GOX. W096/39851divulga o uso da hexose oxidase da alga vermelha Chondruscrispus em aplicações em panificação. W098/44804 divulga ouso de uma glicerol oxidase para melhorar as propriedadesreológicas da massa de panificação.

Outros preparados alimentares em que asoxidorredutases podem ser usadas incluem laticínios. WO02/39828, por exemplo, divulga o uso de hexose oxidase parareduzir as reações de Maillard no queijo de pizzas durantea preparação de pizzas, e WO 99/31990 divulga o uso decarboidrato oxidase para produzir ácido lactobiônico apartir da lactose, o açúcar mais abundante do leite.

Atualmente a glicose oxidase de Aspergillus niger éa única enzima que é usada na indústria para as aplicaçõesacima. O problema com outras oxidorredutases é que suaprodução não pode ser conduzida de um modo econômico e/ouque suas propriedades não são ótimas para o seu uso final.Portanto, continua a haver uma busca de melhoramento dasoxidorredutases para aplicações especificas, levando-se emconta, por exemplo, a sua eficácia, especificidade asubstrato e/ou afinidade, estabilidade e atividade dentrodos limites de temperatura necessários etc.

Mais especificamente, para aplicação em produtos depanificação, as oxidorredutases usadas na panificação hojeem dia (predominantemente glicose oxidase de Aspergillusniger) não têm o desempenho de bromato de potássio, porexemplo. O bromato de potássio é um agente oxidantequímico, que é considerado tecnicamente um oxidanteexcelente, especialmente para processos de panificaçãodemorados. A proibição do uso do bromato deixa os padeiroscom uma lacuna no desempenho que não foi ainda preenchida.

Um outro exemplo é o descoramento enzimático de miolo parase obter miolo de pão branco e agradável. Durante muitosanos, foi usada para tal fim farinha de soja com enzimaativa contendo lipoxigenase. A introdução de variedades desoja geneticamente modificada no mercado iniciou umaresistência mundial de consumidores contra o uso de talfarinha de soja em panificação. Como alternativa podem serusadas farinhas de outros feijões e ervilhas, no entanto,estas não são tão eficazes como a farinha de soja.Portanto, também para a aplicação de descoramento de miolocontinha a haver uma grande necessidade de uma soluçãoenzimática deste problema.

Mais especificamente para aplicações em laticínios,uma ligeira modificação ou desvio nos parâmetros deprocesso durante o tratamento térmico leva a formaçãoaumentada de cor resultante de um aumento nas reações deMaillard. Esta formação de cor é indesejável, e há anecessidade de se controlar este processo de escurecimentoque não seja por meio de um controle rígido de temperaturae processo para tornar o processo de pasteurização maisrobusto.

Também no tratamento térmico do queijo, oescurecimento do queijo, em pizza, por exemplo, éindesejável. WO 02/39828 resume diversas tentativas de sereduzir o escurecimento, que geralmente visam a obtenção ouum controle muito rígido do processo ou modificações deprocesso do processo de fabricação do queijo. A desvantagemdestas soluções é que elas são difíceis de serem manejadase/ou podem aumentar os custos ou reduzir o rendimento.

A presente invenção se volta a pelo menos um, senão a todos os problemas acima.

Objetivo da presente invenção

Um objetivo da presente invenção consiste em proporpolinucleotídeos inéditos que codificam oxidorredutases compropriedades melhoradas. Um outro objetivo consiste empropor oxidorredutases produzidas naturalmente ourecombinantemente, assim como cepas recombinantes que asproduzem. Além disso, são um objetivo da presente invençãométodos de preparação e uso dos polinucleotídeos epolipeptídeos de acordo com a presente invenção.É também um objetivo da presente invenção proporoxidorredutases inéditas que solucionem pelo menos um dosproblemas citados acima ou propor oxidorredutases inéditasque tenham uma ou mais propriedades melhoradas quandousadas em aplicações de laticínios e/ou de panificação.

As propriedades melhoradas dos produtos depanificação podem ser selecionadas do grupo de redução deescurecimento por reação de Maillard, propriedadesantimicrobianas melhoradas e reticulação melhorada deproteínas.

As propriedades melhoradas da massa de panificaçãoe/ou dos produtos de panificação podem ser selecionadas dogrupo de resistência aumentada da massa, uma elasticidadeaumentada da massa de panificação, uma estabilidadeaumentada da massa, uma pegajosidade reduzida da massa,tolerância melhorada a testes, uma extensibilidademelhorada da massa de panificação, uma melhor utilização damassa de panificação em maquinaria, um maior volume doproduto assado, uma estrutura melhorada do miolo do produtoassado, um sabor melhorado do produto assado, umacaracterística antimofo melhorada do produto assado, umamelhor cor do produto assado, uma crosta melhorada doproduto assado ou que tenha uma especificidade ampla asubstrato.

Descrição detalhada da presente invenção

Polinucleotídeos

A presente invenção propõe polinucleotídeosinéditos que codificam enzimas oxidorredutases inéditas,especialmente enzimas que têm qualquer uma das atividadesmencionadas acima, de preferência, enzimas com atividade deálcool isoamílico oxidase, de carboidrato oxidase, lacase,glicose oxidase, ou hexose oxidase.

A presente invenção propõe 6 polinucleotídeosinéditos que codificam uma oxidorredutase, denominadaprovisoriamente OXI 01, OXI 02, OXI 03, OXI 04, OXI 05, OXI06 (a que doravante se referirá como OXI 01 - OXI 06) ,tendo uma seqüência de aminoácidos respectivamente deacordo com SEQ ID NO: 013, SEQ ID NO: 014, SEQ ID NO: 015,SEQ ID NO: 016, SEQ ID NO: 017, SEQ ID NO: 018 (a quedoravante se referirá como 'SEQ ID NO: 013 - 018') ou aequivalentes funcionais de qualquer uma delas. A seqüênciado gene que codifica SEQ ID NO: 013 - 018 foi determinadapor seqüenciamento de um clone genômico obtido deAspergillus niger.

Descobriu-se com surpresa que os polipeptídeos OXI01 - OXI 06 de acordo com a presente invenção melhoram aresistência da massa de panificação para pão, quando usadosem um processo para preparar massa de panificação.

A presente invenção propõe seqüências depolinucleotídeos compreendendo o gene que codifica asoxidorredutases OXI 01 - OXI 06 (compreendendorespectivamente SEQ ID NO: 001, SEQ ID NO: 002, SEQ ID NO:003, SEQ ID NO: 004, SEQ ID NO: 005, SEQ ID NO: 006 a quedoravante se refere como vSEQ ID NO: 001 - 006') assim comosua seqüência de DNAc completa (respectivamente SEQ ID NO:007, SEQ ID NO: 008, SEQ ID NO: 009, SEQ ID NO: 010, SEQ IDNO: 011, SEQ ID NO: 012 a que se refere doravante como iSEQID NO: 007 - 012').

Conseqüentemente, a presente invenção se refere aum polinucleotídeo isolado compreendendo a seqüência denucleotídeos de acordo com SEQ ID NO: 001 - 006 ou SEQ IDNO: 007 - 012 ou a equivalentes funcionais de qualquer umadelas.

Mais especificamente, a presente invenção se referea um polinucleotídeo isolado hibridizável em condiçõesdrásticas, de preferência em condições extremamentedrásticas com um polinucleotídeo de acordo com SEQ ID NO:001 - 006 ou SEQ ID NO: 007 - 012. É vantajoso que taispolinucleotídeos possam ser obtidos de fungos filamentosos,especialmente de Aspergillus niger. Mais especificamente, apresente invenção se refere a um polinucleotídeo isoladoque tem uma seqüência de nucleotídeos de acordo com SEQ IDNO: 001 - 006 OU SEQ ID NO: 007 - 012.

A invenção também se refere a um polinucleotídeoisolado que codifica pelo menos um domínio funcional de umpolipeptídeo respectivamente de acordo com SEQ ID NO: 013 -018 ou equivalentes funcionais de qualquer um deles.

Para se evitar qualquer dúvida: OXI 01 correspondeàs seqüências de ácidos nucléicos SEQ ID NO: 001 e SEQ IDNO: 007 e seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 013 eequivalentes funcionais homólogos seus; OXI 02 correspondea SEQ ID NO: 002, SEQ ID NO: 008 e SEQ ID NO: 014 eequivalentes funcionais homólogos seus etc. e OXI 06corresponde a SEQ ID NO: 006, SEQ ID NO: 012 e SEQ ID NO:018 e equivalentes funcionais homólogos seus.

Conforme empregados no presente, os termos "gene" e"gene recombinante" se referem a moléculas de ácidonucléico que podem ser isoladas de DNA cromossômico, e queincluem uma matriz de leitura aberta que codifica umaproteína, uma oxidorredutase de A. niger, por exemplo. Umgene pode incluir seqüências de codificação, seqüências denão codificação, íntrons e seqüências reguladoras. Alémdisso, um gene se refere a uma molécula de ácido nucléicoisolado conforme definido no presente.

Uma molécula de ácido nucléico da presenteinvenção, tal como uma molécula de ácido nucléico que tem aseqüência de nucleotideos de SEQ ID NO: 001 - 006 ou SEQ IDNO: 007 - 012 ou um equivalente funcional seu, pode serisolada usando-se técnicas padrão de biologia molecular eas informações sobre seqüências providas no presentedocumento. Usando-se a totalidade ou uma porção daseqüência de ácidos nucléicos de SEQ ID NO: 001 - 006 ouSEQ ID NO: 007 - 012, por exemplo, como uma sonda dehibridização podem ser isoladas moléculas de acordo com apresente invenção usando-se técnicas de hibridização eclonagem padrão (conforme descrito em Sambrook, J., Fritsh,E. F., e Maniatis, T. Molecular Cloning: A LaboratoryManual. 2a., ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,1989, por exemplo).

Além disso, uma molécula de ácido nucléicoabrangendo a totalidade ou uma porção SEQ ID NO: 001 - 006ou SEQ ID NO: 007 - 012 pode ser isolada por reação emcadeia da polimerase (PCR) usando-se iniciadores sintéticosde oligonucleotídeos projetados à base das informaçõessobre seqüências contidas em SEQ ID NO: 001 - 006 ou SEQ IDNO: 007 - 012.

Um ácido nucléico da presente invenção pode seramplificado usando-se DNAc, RNAm ou alternativamente, DNAgenômico, como um gabarito e iniciadores adequados deoligonucleotideos de acordo com técnicas padrão deamplificação por PCR. 0 ácido nucléico deste modoamplificado pode ser clonado em um vetor adequado e sercaracterizado por análise de seqüências de DNA.

Além disso, podem ser preparados oligonucleotídeosque correspondem a seqüências de nucleotideos da presenteinvenção ou que são hibridizáveis às seqüências denucleotideos de acordo com a presente invenção, portécnicas sintéticas padrão, usando-se um sintetizador deDNA automatizado

Em uma modalidade preferida, uma molécula de ácidonucléico da presente invenção compreende a seqüência denucleotideos apresentada em SEQ ID NO: 007 - 012. Aseqüência de SEQ ID NO: 007 - 012 corresponde à região decodificação da região de DNAc de OXI 01 - OXI 06 de A.niger. Este DNAc compreende seqüências que codificam opolipeptídeo OXI 01 - OXI 06 de A. niger de acordo com SEQID NO: 013 - 018.

Em uma outra modalidade preferida, uma molécula deácido nucléico isolada da presente invenção compreende umamolécula de ácido nucléico que é um complemento daseqüência de nucleotideos apresentada em SEQ ID NO: 001 -006 OU SEQ ID NO: 007 - 012 ou um equivalente funcionaldestas seqüências de nucleotideos.

Uma molécula de ácido nucléico que é complementar auma outra seqüência de nucleotideos é uma que ésuficientemente complementar à outra seqüência denucleotideos tal que ela possa se hibridizar com a outraseqüência de nucleotideos formando assim um duplex estável.

Um aspecto da presente invenção pertence amoléculas de ácidos nucléicos isoladas que codificam umpolipeptídeo da presente invenção ou um equivalentefuncional seu tal como um fragmento biologicamente ativo oudomínio, assim como moléculas de ácidos nucléicossuficientes para serem usadas como sondas de hibridizaçãopara identificar moléculas de ácidos nucléicos quecodificam um polipeptídeo da presente invenção e fragmentosde tais moléculas de ácidos nucléicos para uso comoiniciadores de PCR para a amplificação ou mutação demoléculas de ácidos nucléicos.

Um "polinucleotídeo isolado" ou "ácido nucléicoisolado" é um DNA ou RNA que não é imediatamente contíguoàs duas das seqüências de codificação com as quais ele éimediatamente contíguo (um na extremidade 5' e um naextremidade 3') no genoma que ocorre naturalmente doorganismo do qual ele deriva. Portanto, em uma modalidade,um ácido nucléico isolado inclui parte ou a totalidade dasseqüências 5' não codificadoras (promotora, por exemplo)que são imediatamente contíguas à seqüência de codificação.O termo inclui, por exemplo, um DNA recombinante que éincorporado a um vetor, em um plasmídeo ou vírus que sereplica de modo autônomo ou no DNA genômico de umprocarionte ou eucarionte, ou que existe como uma moléculaseparada (um fragmento de DNAc ou de DNA genômico, porexemplo, produzido por PCR ou por tratamento com umaendonuclease de restrição), independentemente de outrasseqüências. Ela também inclui um DNA recombinante que éparte de um gene híbrido que codifica um polipeptídeoadicional que é substancialmente isento de materialcelular, material viral ou meio de cultura (quandoproduzido por técnicas de DNA recombinante) ou precursoresquímicos ou outras substâncias químicas (quandoquimicamente sintetizado). Além disso, um "fragmento deácido nucléico isolado" é um fragmento de ácido nucléicoque não ocorre naturalmente em forma de um fragmento e nãose encontraria no estado natural.

Conforme empregado no presente, os termos"polinucleotídeo" ou "molécula de ácido nucléico" destina-se a incluir moléculas de DNA (DNAc ou DNA genômico, porexemplo) e moléculas de RNA (RNAm, por exemplo) e análogosdo DNA ou rnam gerados usando-se análogos de nucleotídeos.A molécula de ácido nucléico pode consistir em um DNA de umúnico filamento ou de dois filamentos, mas é, depreferência, de dois filamentos. O ácido nucléico pode sersintetizado usando-se análogos de oligonucleotídeo ou seusderivados (nucleotídeos de inosina ou de fosforotioato, porexemplo). Tais oligonucleotídeos podem ser usados, porexemplo, para preparar ácidos nucléicos que têm capacidadesalteradas de pareamento de base ou uma maior resistência anucleases.

Uma outra modalidade presente invenção propõe umamolécula de ácido nucléico que é anti-sentido a umamolécula de ácido nucléico de OXI 01 - OXI 06, o filamentode codificação de uma molécula de ácido nucléico de OXI 01- OXI 06, por exemplo. Também incluídos no âmbito dapresente invenção são os filamentos complementares dasmoléculas de ácidos nucléicos descritas no presente.

Erros de seqüenciamento

As informações sobre seqüências conforme propostasno presente documento não devem ser compreendidas de modorestrito como necessitando da inclusão de baseserroneamente identificadas. As seqüências específicasdivulgadas no presente documento podem ser facilmenteusadas para isolar o gene completo a partir de fungosfilamentosos, especialmente de A. niger, que por sua vezpodem ser facilmente submetidos a análises subseqüentespara assim identificar os erros de seqüenciamento.

A não ser que seja indicado em contrário, todas asseqüências de nucleotídeos determinadas por seqüenciamentode uma molécula de DNA do presente documento foramdeterminadas usando-se um seqüenciador de DNA automatizadoe todas as seqüências de aminoácidos de polipeptídeoscodificados por moléculas de DNA determinadas no presenteforam previstas por tradução de uma seqüência de DNAdeterminada conforme acima. Portanto, conforme é doconhecimento na técnica para qualquer seqüência de DNAdeterminada por esta abordagem automatizada, qualquerseqüência de nucleotídeos determinada pode conter algunserros. As seqüências de nucleotídeos determinadas porautomatização tem tipicamente pelo menos aproximadamente 90% de identidade, mais tipicamente pelo menosaproximadamente 95% a pelo menos aproximadamente 99,9% deidentidade com a seqüência de nucleotídeos real da moléculade DNA seqüenciada. A seqüência real pode ser determinadacom uma maior precisão por outras abordagem incluindo pormétodos de seqüenciamento manuais de DNA conhecidos dosversados na técnica. Conforme é também bem conhecido natécnica, uma única inserção ou deleção em uma seqüência denucleotídeos determinada em comparação com a seqüência realcausará um deslocamento entre matrizes na tradução daseqüência de nucleotídeos tal que a seqüência deaminoácidos prevista codificada por uma determinadaseqüência de nucleotídeos será completamente diferente daseqüência de aminoácidos realmente codificada pela moléculade DNA seqüenciada, começando no ponto em que ocorreu talinserção ou deleção.

Os versados na técnica serão capazes de identificartais bases erroneamente identificadas e saberão comocorrigir tais erros.

Fragmentos de ácidos nucléicos, sondas e iniciadores

Uma molécula de ácido nucléico de acordo com apresente invenção pode compreender somente uma porção ou umfragmento da seqüência de ácidos nucléicos apresentados emSEQ ID NO: 001 - 006 ou SEQ ID NO: 007 - 012, um fragmento,por exemplo, que pode ser usado como uma sonda ou uminiciador ou um fragmento que codifica uma porção de umaproteína de OXI 01 - OXI 06. A seqüência de nucleotídeosdeterminada a partir da clonagem do gene de OXI 01 - OXI 06e de DNAc permite a geração de sondas e iniciadoresprojetados para uso na identificação e/ou clonagem deoutros membros da família OXI 01 - OXI 06, assim comohomólogos de OXI 01 - OXI 06 provenientes de outrasespécies. A sonda/iniciador tipicamente compreendeoligonucleotídeo substancialmente purificado e quetipicamente compreende uma região da seqüência denucleotídeos que se hibridiza, de preferência, em condiçõesextremamente drásticas com pelo menos aproximadamente 12 ou15, de preferência aproximadamente 18 ou 20, de preferênciaaproximadamente 22 ou 25, mais de preferênciaaproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, ou 75 oumais nucleotídeos consecutivos de uma seqüência denucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 001 - 006 ou SEQ IDNO: 007 - 012 ou de um equivalente funcional seu.

As sondas à base das seqüências de nucleotídeos OXI01- OXI 06 podem ser usadas para a detecção de seqüênciasOXI 01 - OXI 06 transcritas ou genômicas codificando asmesmas proteínas ou proteínas homólogas em outrosorganismos, por exemplo. Em modalidades preferidas, a sondacompreende ainda fixada a ela um grupo de rotulação,podendo o grupo de rotulação ser um radioisótopo, umcomposto fluorescente, uma enzima ou um cofator enzimático,por exemplo. Tais sondas podem também ser usadas como partede um kit de teste diagnóstico para a identificação decélulas que expressam uma proteína OXI 01 - OXI 06.

Identidade e homologia

Os termos "homologia" ou "porcentagem deidentidade" são usados indiferentes no presente documento.Para os fins da presente invenção, fica definido que, parase determinar a porcentagem de identidade entre duasseqüências de aminoácidos ou entre duas seqüências deácidos nucléicos, as seqüências são alinhadas para fins decomparação ótima (podem ser introduzidas falhas na primeiraseqüência de um aminoácido ou seqüência de ácidosnucléicos, por exemplo, para um alinhamento ótimo com umasegunda seqüência de aminoácidos ou de ácidos nucléicos).Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos nas posições deaminoácidos ou posições de nucleotídeos correspondentes sãoentão comparados. Quando uma posição na primeira seqüênciaé ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácidos ou nucleotídeoque a posição correspondente na segunda seqüência, então asmoléculas são idênticas naquela posição. A porcentagem deidentidade entre as duas seqüências é a função do número deposições idênticas compartilhado pelas seqüências (isto é,% de identidade = número de posições idênticas/número totalde posições (isto é, posições sobrepostas) χ 100) . Épreferível que as duas seqüências tenham o mesmocomprimento.

Os versados na técnica observarão que diversosprogramas diferentes de computador são disponíveis para adeterminação da homologia entre duas seqüências. Umacomparação entre seqüências e a determinação da porcentagemde identidade entre duas seqüências, por exemplo, podem serobtidas usando-se um algoritmo matemático. Em umamodalidade preferida, a porcentagem de identidade entreduas seqüências de aminoácidos é determinada usando-se oalgoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48) : 444-4 53 (1970)) que é incorporado ao programa GAP no pacote desoftware GCG (disponível de http://www.gcg.com), usando-seou uma matriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250, e um peso deintervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e peso decomprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Os versados na técnicaobservarão que todos estes parâmetros diferentes darãoresultados ligeiramente diferentes, mas que a porcentagemtotal de identidade entre duas seqüências não ésubstancialmente alterada quando se usam algoritmosdiferentes.

Em uma outra modalidade, a porcentagem deidentidade entre duas seqüências de nucleotídeos édeterminada usando-se o programa GAP no pacote de softwareGCG (disponível em http://www.gcg.com), usando-se umamatriz NWSgapdna.CMP e um peso de intervalo de 40, 50, 60,70, ou 8 0 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.Em uma outra modalidade, a porcentagem de identidade entredois aminoácidos ou seqüências de nucleotideos édeterminada usando-se o algoritmo de E. Meyers e W. Miller(CABIOS, 4:11-17 (1989) que foi incorporado ao programaALIGN (versão 2.0) (disponível em:http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) usando-se umatabela de resíduos de pesos PAM120, uma penalidade decomprimento de intervalo de 12 e uma penalidade deintervalo de 4.

As seqüências de ácidos nucléicos e de proteínas dapresente invenção podem ainda ser usadas como uma"seqüência de busca" para conduzir uma busca contra basesde dados públicas para identificar, por exemplo, outrosmembros da família ou seqüências relacionadas. Tais buscaspodem ser conduzidas usando-se os programas NBLAST e XBLAST(versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403—10. As buscas de nucleotideos por BLAST podem serconduzidas com o programa NBLAST program, contagem = 100,comprimento de palavra = 12 para se obter seqüências denucleotideos homólogos a moléculas de ácidos nucléicos deOXI 01 - OXI 06 da presente invenção. As buscas deproteínas por BLAST podem ser conduzidas pelo programaXBLAST, contagem = 50, comprimento de onda = 3 para seobter seqüências de aminoácidos homólogas às moléculas deproteínas de OXI 01 - OXI 06 da presente invenção. Para eobter alinhamentos com intervalos para fins de comparaçãopodem ser utilizado BLAST com intervalos conforme descritoem Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Quando e utilizam os programas BLAST e BLAST comintervalos, podem ser usados os parâmetros por revelia dosprogramas respectivos, (XBLAST e NBLAST, por exemplo) . Vejahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Hibridização

Conforme empregado no presente, o termo"hibridização" é destinado a descrever condições parahibridização e lavagem às quais as seqüências denucleotideos permanecem hibridizadas tipicamente uma aoutra com uma homologia de pelo menos aproximadamente 5 0%,pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente70%, sendo mais de preferência de pelo menosaproximadamente 80%, ainda mais de preferência de pelomenos aproximadamente 85% a 90%, sendo mais preferível comuma homologia de 95%.

Um exemplo preferido não limitante de taiscondições de hibridização são hibridização em 6X cloreto desódio/ci trato de sódio (SSC) a aproximadamente 45 °C,seguida por uma ou mais lavagens em 1 X SSC, 0,1% SDS a50°C, de preferência a 55°C, de 50°C preferência a 60°C eainda mais de preferência a 65°C.

As condições extremamente drásticas incluem, porexemplo, hibridização a 68 0C em 5x SSC/5x solução deDenhardt/1, 0% de SDS e lavagem em 0, 2x SSC/0,1% de SDS àtemperatura ambiente. Alternativamente, a lavagem pode serconduzida a 42°C.

Os versados na técnica saberão quais as condições aserem aplicadas para condições de hibridização drásticas eextremamente drásticas. Instruções adicionais referentes atais condições são disponíveis na técnica, em Sambrook etal. , 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Press, N.Y.; e Ausubel et al. (eds.), 1995,Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons,N.Y.), por exemplo.

Naturalmente um polinucleotideo que se hibridizasomente a uma seqüência poli A (tal como o trecho poli (A)de RNAms de terminal 3' ) , ou a um trecho complementar deresíduos T (ou U) resides, não seria incluído em umpolinucleotideo da presente invenção usado para sehibridizar especificamente a uma porção de um ácidonucléico da presente invenção, uma vez que talpolinucleotideo se hibridizaria com qualquer molécula deácido nucléico que contivesse um trecho poli (A) ou o seucomplemento (praticamente com qualquer clone de DNAc dedois filamentos, por exemplo).

Obtenção de DNA de comprimento total de outros organismos

Em uma abordagem típica, podem ser testadasbibliotecas de DNAc construídas a partir de outrosorganismos, de fungos filamentosos, por exemplo,especialmente da espécie Aspergillus.

Cepas de Aspergillus, por exemplo, podem sertestadas para homólogos de polinucleotídeos OXI Ol - OXI 06por análise por Northern blot. Depois da detecção detranscrições homólogas aos polinucleotídeos de acordo com apresente invenção, podem ser construídas bibliotecas deDNAc a partir de RNA isolado da cepa apropriada,utilizando-se técnicas padrão conhecidas dos versados natécnica. Alternativamente, uma biblioteca total de DNAgenômico pode ser testada usando-se uma sonda hibridizávela um polinucleotideo OXI 01 - OXI 06 de acordo com apresente invenção.

As seqüências de genes homólogas podem serisoladas, por exemplo, conduzindo-se PCR usando doisconjuntos de iniciadores de oligonucleotideos degeneradosprojetados com base nas seqüências de nucleotídeos conformeinstruído aqui.

0 gabarito para a reação pode ser DNAc obtido portranscrição reversa de RNAm preparado a partir de cepas quese sabe ou que se suspeita que expressam um polinucleotídeode acordo com a presente invenção. O produto de PCR podeser subclonado e seqüenciado para assegurar que asseqüências amplificadas representam as seqüências de umanova seqüência OXI 01 - OXI 06 de ácidos nucléicos, ou umequivalente funcional seu.

0 fragmento de PCR pode então ser usado para isolarum cIone de DNAc de comprimento total por uma variedade demétodos conhecidos. 0 fragmento amplificado, por exemplo,pode ser rotulado e usado para se testar uma biblioteca deDNAc de bacteriófago ou cosmideo. Alternativamente, ofragmento rotulado pode ser usado para se testar umabiblioteca genômica.

A tecnologia de PCR também pode ser usada para seisolar seqüências de DNAc de comprimento total a partir deoutros organismos. RNA pode ser isolado, por exemplo,seguindo-se procedimentos padrão, a partir de uma fontecelular ou tecidual adequada. Uma reação de transcriçãoreversa pode ser conduzida no RNA usando-se um iniciadoroligonucleotídeo específico para a extremidade mais a 5' dofragmento amplificado para se iniciar a primeira síntesedos filamentos.O híbrido de RNA/DNA resultante pode então serdotado de uma "cauda" (com guaninas, por exemplo) usando-seuma reação de transferase terminal padrão, o híbrido podeser digerido com RNase H, e pode se iniciar então a segundasíntese de filamentos (com um iniciador poli-C, porexemplo). Assim as seqüências de DNAc a montante dofragmento amplificado podem ser facilmente isoladas. Parauma resenha de estratégias úteis de clonagem, veja, porexemplo, Sambrook et al., supra; e Ausubel et al. , supra.

Quer o fragmento de DNA homólogo codifique ou nãouma proteína funcional OXI 01 - OXI 06, ele pode serfacilmente testado pelos métodos conhecidos na técnica.Vetores

Um outro aspecto da presente invenção diz respeitoa vetores, de preferência a vetores de expressão, contendoum ácido nucléico que codifica uma proteína 0X1 01 - 0X1 06ou um equivalente funcional seu. Conforme empregado nopresente, o termo "vetor" se refere a uma molécula de ácidonucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qualela tiver sido ligada. Um tipo de veto é um "plasmídeo",que se refere a uma alça circular de DNA de dois filamentosdentro da qual podem ser ligados segmentos de DNAadicionais. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em quesegmentos adicionais de DNA podem ser ligados ao genomaviral. Determinados vetores são capazes de replicaçãoautônoma em uma célula hospedeira na qual eles sãointroduzidos (vetores bacterianos, por exemplo, tendo umaorigem bacteriana de replicação e vetores epissômicos demamíferos). Outros vetores (vetores não epissômicos demamíferos, por exemplo) são integrados ao genoma de umacélula hospedeira depois da introdução na célula hospedeirae deste modo são replicados juntamente com o genoma dohospedeiro. Além disso, determinados vetores são capazes dedirecionar a expressão de genes aos quais eles estãooperativamente ligados. A tais vetores se refere nopresente como "vetores de expressão". Em geral, vetores deexpressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante seencontram freqüentemente na forma de plasmídeos. Os termos"plasmídeo" e "vetor" podem ser usados indiferentes nopresente documento uma vez que o plasmídeo é a forma maishabitualmente usada de vetor. No entanto, a presenteinvenção se destina a incluir outras tais formas de vetoresde expressão, tais como vetores virais (retrovírus dereplicação defeituosos, adenovírus e vírus adeno-associados, por exemplo), que servem para funçõesequivalentes.

Os vetores de expressão recombinantes da presenteinvenção compreendem um ácido nucléico da presente invençãoem uma forma adequada para a expressão do ácido nucléico meuma célula hospedeira, o que significa que o vetor deexpressão recombinante inclui uma ou mais seqüênciasreguladoras, selecionadas com base nas células hospedeirasa serem usadas para a expressão, que são operativamenteligadas à seqüência dos ácidos nucléicos a serem expressos.

Dentro de um vetor de expressão recombinante,"operativamente ligado" significa que a seqüência denucleotídeos de interesse é ligada à(s) seqüência(s)reguladora(s) de um modo que permite a expressão daseqüência de nucleotídeos (em um sistema detranscrição/tradução in vitro, por exemplo, ou em umacélula hospedeira quando o vetor é introduzido na célulahospedeira). 0 termo "seqüência reguladora" se destina aincluir promotores, intensificadores e outros elementos decontrole de expressão (sinal de poliadenilação, porexemplo). Tais seqüências reguladoras são descritas, porexemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods inEnzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).Seqüências reguladoras incluem aquelas que dirigem aexpressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeos emmuitos tipos de células hospedeiras e aquelas que dirigem aexpressão da seqüência de nucleotídeos somente em umadeterminada célula hospedeira (seqüências reguladorasespecíficas a tecido, por exemplo). Os versados na técnicaobservarão que o projeto do vetor de expressão podedepender de tais fatores como a escolha da célulahospedeira a ser transformada, do nível de expressão daproteína desejada etc. Os vetores de expressão da presenteinvenção podem ser introduzidos nas células hospedeiraspara deste modo produzir proteínas ou peptídeos,codificados por ácidos nucléicos conforme descrito nopresente documento (proteínas 0X1 01 - OXI 06, por exemplo,formas mutantes de proteínas OXI 01 - 0X1 06, fragmentos,variantes ou equivalentes funcionais de qualquer um delesetc.).

Os vetores de expressão recombinantes da presenteinvenção podem ser projetados para a expressão de proteínasOXI 01 - OXI 06 em células procarióticas ou eucarióticos.As proteínas OXI 01 - OXI 06, por exemplo, podem serexpressas em células bacterianas tais como E. coli, célulasde insetos (usando vetores de expressão de baculovírus),células de levedura ou células de mamíferos. As célulashospedeiras adequadas são discutidas com mais detalhes emGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology185, Academic Press, San Diego, CA (1990) .

Alternativamente, o vetor de expressão recombinante podeser transcrito e traduzido in vitro, usando-se seqüênciasreguladoras promotoras T7 e T7 polimerase.

Os vetores de expressão úteis na presente invençãoincluem vetores cromossômicos, epissômicos e derivados devírus, vetores derivados de plasmídeos bacterianos,bacteriófagos, epissomas de levedura, elementoscromossômicos de levedura, por exemplo, vírus tais comobaculovírus, vírus papova, vírus de vacínia, adenovírus,vírus de varíola aviária, vírus de pseudo-hidrofobia eretrovírus, e vetores derivados de suas combinações, taiscomo os derivados de elementos genéticos de plasmídeos ebacteriófagos, tais como cosmídeos e fagemídeos.

A inserção de DNA deve ser operativamente ligada aum promotor adequado tal como o promotor PL lambda de fago,os promotores Iac, trp e tac de E. coli, os promotoresprecoce e tardio de SVa4 0 do LTRs retrovirais para citaralguns. Outros promotores adequados serão conhecidos dosversados na técnica. Em uma modalidade específicas, sãopreferidos promotores que sejam capazes de dirigir um nívelalto de expressão de oxidorredutases em fungosfilamentosos. Tais promotores são conhecidos na técnica. Asconstruções de expressão podem conter sítios para ainiciação, terminação de transcrição e, na região detranscrição, um sítio de ligação a ribossomo para tradução.A porção de codificação das transcrições maduras expressaspelas construções incluirão um AUG de iniciação de traduçãono início e um códon de terminação adequadamenteposicionado no fim dos polipeptídeo a ser traduzido.

0 DNA do vetor DNA pode ser introduzido em célulasprocarióticas ou eucarióticas por meio de técnicas detransformação ou transfecção convencionais. Conformeempregado no presente, os termos "transformação" e"transfecção" são destinadas a se referir a uma variedadede técnicas reconhecidas na técnica para a introdução deácido nucléico estranho (DNA, por exemplo) em uma célulahospedeira, incluindo coprecipitação de fosfato de cálcioou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transdução, infecção, lipofecção, transfecçãomediada por lipidio catiônico e eletroporação. Os métodosadequados para a transformação ou transfecção de célulashospedeiras pode ser encontrado em Sambrook, et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed. . ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis et al. , BasicMethods in Molecular Biology (1986) e outros manuais delaboratório.

Para uma transfecção estável de células demamíferos, sabe-se que, dependendo do vetor de expressão eda técnica de transfecção usada, somente uma pequena fraçãode células pode integrar o DNA estranho no seu genoma. Afim de se identificar e selecionar estes integrantes, umgene que codifica um marcador selecionável (resistência aantibióticos, por exemplo) é geralmente introduzido nascélulas hospedeiras, juntamente com o gene de interesse. Osmarcadores selecionáveis preferidos incluem aqueles queconferem resistência a drogas, tais como G418, higromicinae metatrexato. 0 ácido nucléico que codifica um marcadorselecionável pode ser introduzido em uma célula hospedeirano mesmo vetor que aquele que codifica uma proteína OXI 01- OXI 0 6 ou pode ser introduzido em um vetor separado. Ascélulas estavelmente transfectadas com o ácido nucléicointroduzido podem ser identificadas por seleção de droga(células que têm incorporado o gene marcador selecionável,por exemplo, sobreviverão, ao passo que as demais célulasmorrerão).

A expressão de proteínas em procariontes éfreqüentemente conduzida em E. coli com vetores que contêmpromotores constitutivos ou induzíveis dirigindo aexpressão de proteínas.

Conforme indicado, os vetores de expressãoconterão, de preferência, marcadores selecionáveis. Taismarcadores incluem resistência a diidrofolato reductase oua neomicina para cultura de células eucarióticas eresistência a tetraciclina ou a ampicilina para cultura emE. coli e outras bactérias. Exemplos representativos decélulas hospedeiras incluem células bacterianas tais comoE. coli, Streptomyces e Salmonella typhimurium; célulasfúngicas, tais como de levedura; células de insetos taiscomo de Drosophila S2 e Spodoptera Sf 9; células animaistais como CHO, COS e de melanoma de Bowes; e célulasvegetais. Os meios de cultura e condições adequados para ascélulas hospedeiras descritas acima são conhecidos natécnica.

Dentre os vetores preferidos para uso em bactériase encontram pQE70, pQE60 e PQE-9, disponíveis de Qiagen;vetores pBS, vetores Phagescript, vetores Bluescript,pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH4 6A, disponíveis de Stratagene; eptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponíveisPharmacia. Dentre os vetores eucarióticos preferidos seencontram PWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pZTl e pSG disponíveis deStratagene; e pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL disponíveis dePharmacia. Outros vetores adequados ocorrerão prontamenteaos versados na técnica.

Dentre os promotores bacterianos conhecidos parauso na presente invenção se incluem os promotores IacI eIacZ de E. coli, os promotores T3 e T7, o promotor gpt, ospromotores lambda PR, PL e o promotor trp, o promotor HSVtimidina kinase, os promotores precoce e tardio de SV4 0, ospromotores de LTRs retrovirais, tais como do vírus desarcoma de Rous ("RSV"), e promotores de metalotioneína,tais como o promotor de metalotioneína-I murino.

A transcrição do DNA que codifica os polipeptídeosda presente invenção por eucariontes superiores pode seraumentada inserindo-se uma seqüência intensificadora novetor. Os intensificadores são elementos cis-atuantes deDNA, tendo geralmente de 10 a 3 00 pb que atua para aumentara atividade transcricional de um promotor em um tipo dadode célula hospedeira. Exemplos de intensificadores incluemo intensificador SV40, que está localizado no lado tardioda origem de replicação nos pb 100 a 270, o intensificadordo promotor precoce de citomegalovírus, o intensificador depolioma no lado tardio da origem de replicação eintensificadores de adenovírus.

Para a secreção da proteína traduzida no lúmen doretículo endoplasmático, no espaço periplasmático ou noambiente extracelular pode ser incorporado um sinal desecreção adequado no polipeptídeo expresso. Os sinais podemser endógenos ao polipeptídeo ou eles podem ser sinaisheterólogos.

0 polipeptídeo pode ser expresso em um formandomodificado podem incluir não somente sinais de secreção,mas também regiões funcionais heterólogas adicionais.Assim, por exemplo, uma região de aminoácidos adicionais,especialmente de aminoácidos com carga, pode seracrescentada ao terminal N do polipeptídeo para aumentar aestabilidade e a persistência na célula hospedeira, durantea purificação ou durante a manipulação e armazenagemsubseqüentes. Além disso, podem ser acrescentadas porçõespeptídicas ao polipeptídeo para facilitar a purificação.

Polipeptídeos de acordo com a presente invenção

A presente invenção propõe um polipeptídeo isoladoque tem uma seqüência de aminoácidos de acordo com SEQ IDNO: 013 - 018, uma seqüência de aminoácidos que pode serobtida por expressão do polinucleotídeo de SEQ ID NO: 001 -077 em uma hospedeira adequada, assim como uma seqüência deaminoácidos que pode ser obtida por expressão dasseqüências de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 007 - 012 emuma hospedeira adequada. Além disso, um peptídeo oupolipeptídeo que compreende um equivalente funcional dospolipeptídeos acima está contido na presente invenção. Ospolipeptídeos acima são contido coletivamente no termo"polipeptídeos de acordo com a presente invenção"

Os termos "peptídeo" e "oligopeptídeo" sãoconsiderados sinônimos (conforme é reconhecidohabitualmente) e cada termo pode ser usado indiferentementena medida em que o contexto exija a indicação de uma cadeiatendo pelo menos dois aminoácidos acoplados por ligaçõespeptidila. O termo "polipeptídeo" é usado no presentedocumento para cadeias que contêm mais de sete resíduos deaminoácidos. Todas as fórmulas ou seqüências deoligopeptídeos e peptídeos no presente documento sãoescritas da esquerda para a direita e na direção doterminal amino para o terminal carboxila. 0 código de umaletra de aminoácidos usados no presente é habitualmenteconhecido nas técnica e pode ser encontrado em Sambrook, etal. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a.,ed. ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY, 1989)

Polipeptídeo "isolado" ou proteína "isolada"significa que um polipeptídeo ou proteína foi removido doseu ambiente nativo. Polipeptídeos e proteínas produzidasrecombinantemente, por exemplo, expressas em célulashospedeiras são considerados isolados para os fins dapresente invenção, assim como polipeptídeos nativos ourecombinantes que tenham sido substancialmente purificadospor qualquer técnica adequada tal como, por exemplo, ométodo de purificação de uma única etapa usado em Smith eJohnson, Gene 67:31-40 (1988).

A oxidorredutase OXI 01 - OXI 06 de acordo com apresente invenção pode ser recuperada e purificada a partirde culturas de células recombinantes por métodos bemconhecido incluindo o de sulfato de amônio ou deprecipitação por etanol, extração com ácido, cromatografiade troca de ânions ou de cátions, cromatografia porfosfocelulose, cromatografia por interação hidrófoba,cromatografia de afinidade, cromatografia por hidroxil-apatita e cromatografia por lectina. O mais preferível é oemprego de cromatografia líquida de alto desempenho("HPLC") para a purificação.

Os polipeptídeos da presente invenção incluemprodutos naturalmente purificados, produtos deprocedimentos sintéticos químicos, e produtos produzidospor técnicas recombinantes a partir de uma hospedeiraprocariótica ou eucariótica, incluindo, célulasbacterianas, de levedura, de plantas superiores, de insetose mamíferos, por exemplo. Dependendo da hospedeiraempregada em um procedimento de produção recombinante, ospolipeptídeos da presente invenção podem ser glicosiladosou podem não ser glicosilados. Além disso, os polipeptídeosda presente invenção podem também incluir um resíduoinicial de metionina modificado, em alguns casos comoresultado de processos mediados pela hospedeira.

Fragmentos de proteína

A presente invenção também propõe fragmentosbiologicamente ativos dos polipeptídeos de acordo com apresente invenção.

Os fragmentos biologicamente ativos de umpolipeptídeo da presente invenção incluem polipeptídeos quecompreendem seqüências de aminoácidos suficientementeidênticos à seqüências de aminoácidos da proteína 0X1 01 -OXI 06 ou derivadas dela (a seqüência de aminoácidos de SEQID NO: 013 - 018, por exemplo), que incluem um número menorde aminoácidos do que a proteína de comprimento total eapresentam pelo menos uma atividade biológica da proteínade comprimento total correspondente. Tipicamente, osfragmentos biologicamente ativos compreendem um domínio oumotivo tendo pelo menos uma atividade da proteína OXI 01 -OXI 06. 0 preferido é um fragmento que tenha uma atividadede glicose oxidase (E.C. 1.1.3.4).

Um fragmento biologicamente ativo de uma proteínada presente invenção pode ser um polipeptídeo que tenha,por exemplo, 10, 25, 50, 100 ou mais aminoácidos decomprimento. Além disso, outras porções biologicamenteativas, nas demais regiões da proteína são deletadas podemser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas parauma ou mais das atividades biológicas da forma nativa de umpolipeptídeo da presente invenção.

A presente invenção também propõe fragmentos deácidos nucléicos que codificam os fragmentos biologicamenteativos acima da proteína OXI 01 - OXI 06.

Equivalentes funcionais

Os termos "equivalentes funcionais" e "variantesfuncionais" são usados indiferentemente no presentedocumento. Equivalentes funcionais de DNA de 0X1 01 - OXI06 são fragmentos de DNA isolados que codificam umpolipeptídeo que apresenta uma função específica deoxidorredutase de A. niger OXI 01 - OXI 06 conformedefinido no presente. Um equivalente funcional de umpolipeptídeo OXI 01 - 0X1 06 de acordo com a presenteinvenção é um polipeptídeo que apresenta pelo menos umafunção de uma oxidorredutase de A. niger conforme definidono presente. Equivalentes funcionais, portanto, tambémabrangem fragmentos biologicamente ativos.

Equivalentes funcionais de proteínas ou depolipeptídeos podem conter somente substituiçõesconservadoras de um ou mais aminoácidos de SEQ ID NO: 013 -018 ou substituições, inserções ou deleções de aminoácidosnão-essenciais. Conseqüentemente, um aminoácido nãoessencial é um resíduo que pode ser alterado em SEQ ID NO:013 - 018 sem alterar substancialmente a função biológica.Resíduos de aminoácidos que são conservados entre asproteínas OXI 01 - OXI 06 da presente invenção, porexemplo, são previstas como sendo especialmente apropriadaspara alteração. Além disso, os aminoácidos conservadosentre as proteínas OXI 01 - OXI 06 de acordo com a presenteinvenção e outras oxidorredutases não têm a probabilidadede serem adequadas a alteração.

0 termo "substituição conservadora" se destina asignificar que uma substituição em que o resíduo deaminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido quetem uma cadeia secundária similar. Estas famílias sãoconhecidas na técnica e incluem cadeias secundárias básicas(lisina, arginina e histidina, por exemplo), cadeiassecundárias ácidas (ácido aspártico, ácido glutâmico, porexemplo), cadeias secundárias polares sem cargas (glicina,asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina,cisteína, por exemplo), cadeias secundárias não polares(alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina,fenilalanina, metionina, triptofano, por exemplo), cadeiassecundárias de ramificação beta (treonina, valina,isoleucina, por exemplo) e cadeias secundárias aromáticas(tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina, porexemplo).

Equivalentes funcionais de ácidos nucléicos podemtipicamente conter mutações silenciosas, ou mutações quenão alteram a função biológica do polipeptídeo codificado.Conseqüentemente, a presente invenção propõe moléculas deácidos nucléicos que codificam proteínas OXI 01 - OXI 06que contêm alterações em resíduos de aminoácidos que nãosão essenciais para uma atividade biológica específica.Tais proteínas OXI 01 - OXI 06 diferem em seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO: 013 - 018, no entanto conservampelo menos uma atividade biológicas. Conseqüentemente, apresente invenção também abrange molécula isolada de ácidosnucléicos compreendendo uma seqüência de nucleotídeos quecodifica uma proteína, compreendendo a proteína umaseqüência de aminoácidos substancialmente homóloga tendopelo menos aproximadamente 63%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de homologia à seqüência deaminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 013. Em uma outramodalidade, a molécula isolada de ácido nucléico compreendeuma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína, emque a proteína compreende uma seqüência de aminoácidossubstancialmente homóloga tendo pelo menos aproximadamente40%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%ou mais de homologia à seqüência de aminoácidos apresentadaem SEQ ID NO: 014 - 018.

As instruções referentes à efetuação desubstituições de aminoácidos fenotipicamente silenciosassão dadas, por exemplo, em Bowie, J.U. et al. , Science247:1306-1310 (1990), em que os autores indicam que há duasprincipais abordagem para se estudar a tolerância de umaseqüência de aminoácidos a alteração. 0 primeiro método seapóia no processo de evolução, em que mutações ou sãoaceitas ou rejeitadas por seleção natural. A segundaabordagem usa engenharia genética para introduziralterações em aminoácidos em posições específicas de umgene clonado e seleciona ou testa para identificarseqüências que conservam a funcionalidade. Conformedeclarado pelos autores, estes estudos revelaram queproteínas são surpreendentemente tolerantes a substituiçõesde aminoácidos. Os autores indicam ainda que as alteraçõestêm a probabilidade de serem permissivas em uma posiçãodeterminada da proteína. A maioria de resíduos deaminoácidos enterrados, por exemplo, exigem cadeiassecundárias não polares, ao passo que poucascaracterísticas das cadeias secundárias de superfície sãogeralmente conservadas. Outras tais substituiçõesfenoticamente silenciosas são descritas em Bowie et al.,acima, e nas referências citadas nele.

Uma molécula de ácido nucléico isolada que codificauma proteína OXI 01 - 0X1 06 homóloga à proteína de acordocom SEQ ID NO: 013 - 018 pode ser criada por introdução deuma ou mais substituições, adições ou deleções denucleotídeos nas seqüências de codificação de nucleotídeosde acordo com SEQ ID NO: 001 - 006 ou SEQ ID NO: 007 - 012,de tal modo que uma ou mais substituições, deleções ouinserções de aminoácidos sejam introduzidas na proteínacodificada. Tais mutações podem ser introduzidas portécnicas padrão, tais como mutagênese direcionada a sítio emutagênese mediada por PCR.

0 termo "equivalentes funcionais" também abrangeortólogos da proteína OXI 01 - OXI 06 de A. niger.Ortólogos da proteína OXI 01 - OXI 06 de A. niger sãoproteínas que podem ser isoladas de outras cepas ouespécies e possuir uma atividade biológica similar ouidêntica. Tais ortólogos podem ser facilmente identificadoscomo compreendendo uma seqüência de aminoácidos que ésubstancialmente homóloga a SEQ ID NO: 013 - 018.

Conforme definido no presente, o termo"substancialmente homólogo" se refere a uma primeiraseqüência de aminoácidos ou nucleotídeos que contém umnúmero suficiente ou mínimo de aminoácidos ou nucleotídeosidênticos ou equivalentes (com cadeia secundária similar,por exemplo) a uma segunda seqüência de aminoácidos ounucleotídeos, de modo tal que a primeira e a segundaseqüências de aminoácidos ou nucleotídeos tenham um domíniocomum. A título de exemplo, seqüências de aminoácidos ou denucleotídeos que contêm um domínio comum tendoaproximadamente 40%, de preferência 65%, more depreferência 70%, ainda mais de preferência 75%, 80%, 85%,90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou mais sãodefinidos no presente documento como sendo suficientementeidênticas.

Além disso, os ácidos nucléicos que codificamoutros membros da família OXI 01 - OXI 06, que têm,portanto, uma seqüência de nucleotídeos que difere de SEQID NO: 001 - 006 ou SEQ ID NO: 007 - 012, incidem no âmbitoda presente invenção. Além disso, ácidos nucléicos quecodificam proteínas OXI 01 - OXI 06 de diferentes espéciesque têm, portanto, uma seqüência de nucleotídeos que diferede SEQ ID NO: 001 - 006 ou SEQ ID NO: 007 - 012 incidem noâmbito da presente invenção.

A molécula de ácido nucléicos que corresponde avariantes (variantes alélicas naturais, por exemplo) ehomólogos de DNA de OXI 01 - OXI 06 da presente invençãopodem ser isolados com base na sua homologia aos ácidosnucléicos de OXI 01 - OXI 06 descritos no presentedocumento ou um fragmento adequado dele, como uma sonda dehibridização de acordo com técnicas padrão de hibridização,de preferência em condições de hibridização extremamentedrásticas.

Além de variantes alélicas da seqüência 0X1 01 -OXI 06 que ocorrem naturalmente, os versados na técnicaobservarão que podem ser introduzidas alterações pormutação nas seqüências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 001 -006 ou SEQ ID NO: 007 - 012, levando, assim, a alteraçõesna seqüência de aminoácidos da proteína OXI 01 - OXI 06 semse alterar substancialmente a função da proteína OXI 01 -OXI 06.

Em um outro aspecto da presente invenção, sãopropostas proteínas OXI 01 - OXI 06 melhoradas. Asproteínas OXI 01 - OXI 06 melhoradas são proteínas em quepelo menos uma atividade biológica é melhorada. Taisproteínas podem ser obtidas por introdução aleatória demutações ao longo de toda a seqüência de codificação de OXI01 - OXI 06 ou de parte dela, tal como por mutagênese desaturação, e os mutantes resultantes podem ser expressosrecombinantemente e testados para atividade biológica. Atécnica propõe ensaios padrão para a medição de atividadeenzimática de oxidorredutases, por exemplo, e, portanto,podem ser facilmente selecionadas proteínas melhoradas.

Em uma modalidade preferida a proteína 0X1 01 - OXI06 tem uma seqüência de aminoácidos de acordo com SEQ IDNO: 013 - 018. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo OXIOl - ΟΧΙ 06 é substancialmente homólogo à seqüência deaminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 013 - 018 e conservapelo menos uma atividade biológica de um polipeptídeo deacordo com SEQ ID NO: 013 - 018, no entanto diferem emseqüência de aminoácidos devido à variação natural ou àmutagênese, conforme foi descrito acima.

Em uma outra modalidade preferida a proteína OXI 01- OXI 06 tem uma seqüência de aminoácidos codificada por umfragmento de ácido nucléico capaz de se hibridizar com umácido nucléico de acordo com SEQ ID NO: 001 - 006 ou SEQ IDNO: 007 - 012, de preferência em condições de hibridizaçãoextremamente drásticas.

Para a proteína que compreende a seqüência deaminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 013, o homólogo maispróximo a uma enzima funcional é álcool isoamílico oxidasede Aspergillus fumigatus, que apresenta uma identidade de62% a SEQ ID 013. Em uma modalidade, a molécula isolada doácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeos quecodifica uma proteína, compreendendo a proteína umaseqüência de aminoácidos que tem substancialmente umahomologia de pelo menos aproximadamente 63%, 65%, 70%, 75%,80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais à seqüênciade aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 013, e sendo umequivalente funcional da proteína que compreende aseqüência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 013.

Para a proteína que compreende a seqüência deaminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 014, o homólogo maispróximo a uma enzima funcional é a 6-hidróxi-D-nicotinaoxidase de Anthrobacter oxidans, que apresenta xx% deidentidade a SEQ ID 014. Em uma modalidade, as moléculaisolada de ácido nucléico compreende uma seqüência denucleotídeos que codifica uma proteína, compreendendo aproteína uma seqüência de aminoácidos que temsubstancialmente uma homologia de pelo menosaproximadamente 40%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% ou mais à seqüência de aminoácidosapresentada em SEQ ID NO: 014, e sendo um equivalentefuncional da proteína que compreende a seqüência deaminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 014.

Para a proteína que compreende a seqüência deaminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 015, o homólogo maispróximo a uma enzima funcional é a versicolorina B sintasede Aspergillus parasiticus que apresenta uma identidade de31% ã SEQ ID 015. Em uma modalidade, a molécula isolada deácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeos quecodifica uma proteína, compreendendo a proteína umaseqüência de aminoácidos substancialmente uma homologia depelo menos aproximadamente 40%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais à seqüência deaminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 015, e sendo umequivalente funcional da proteína que compreende aseqüência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 015.

A proteína que compreende a seqüência deaminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 016 não apresentanenhuma homologia a qualquer enzima funcional. Em umamodalidade, a molécula de ácido nucléico isolada compreendeuma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína,proteína esta que compreende uma seqüência de aminoácidossubstancialmente com uma homologia de pelo menosaproximadamente 40%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% ou mais à seqüência de aminoácidosapresentada em SEQ ID NO: 016, e sendo um equivalentefuncional da proteína que compreende a seqüência deaminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 016.

Para a proteína que compreende a seqüência deaminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 017 o homólogo maispróximo a uma enzima funcional é 6-hidróxi-D-nicotinaoxidase de Arthrobacter oxidans que apresenta umaidentidade <25% à SEQ ID 017. Em uma modalidade, a moléculade ácido nucléico isolada compreende uma seqüência denucleotídeos que codifica uma proteína, compreendendo aproteína uma seqüência de aminoácidos que temsubstancialmente uma homologia de pelo menosaproximadamente 40%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% ou mais à seqüência de aminoácidosapresentada em SEQ ID NO: 017, e sendo um equivalentefuncional da proteína que compreende a seqüência deaminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 017.

A proteína que compreende a seqüência deaminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 018 não apresentanenhuma homologia à enzima funcional. Em uma modalidade amolécula de ácido nucléico isolada de acordo com a presenteinvenção compreende a seqüência de nucleotídeos quecodifica uma proteína, compreendendo a proteína umaseqüência de aminoácidos tendo substancialmente umahomologia de pelo menos aproximadamente 40%, 65%, 70%, 75%,80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais à seqüênciade aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 018, e sendo umequivalente funcional da proteína que compreende aseqüência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 018.Conseqüentemente, a proteína OXI 01 é uma proteínaque compreende uma seqüência de aminoácidos tendo umahomologia de pelo menos aproximadamente 63%, 65%, 70%, 75%,80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais à seqüênciade aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 013 e conservapelo menos uma atividade funcional do polipeptídeo deacordo com SEQ ID NO: 013

De modo análogo, as proteínas OXI 02 - OXI 06 sãoproteínas que compreendem uma seqüência de aminoácidos quetem uma homologia de pelo menos aproximadamente 40%, 65%,70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais àseqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 014 -018 respectivamente, e conservam pelo menos uma atividadefuncional do polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO: 014 -018.

Equivalentes funcionais de uma proteína de acordocom a presente invenção podem também ser identificados porexame de bibliotecas combinatórias de mutantes, porexemplo, de mutantes truncando-se, por exemplo, a proteínada presente invenção para atividade de oxidorredutase. Emuma modalidade, uma biblioteca variegada de variantes égerada por mutagênese combinatória a nível de ácidosnucléicos. Uma biblioteca variegada de variantes pode serproduzida por ligação enzimática de uma mistura deoligonucleotídeos sintéticos, por exemplo, em seqüências degenes, de modo tal que um conjunto degenerado de seqüênciasde proteínas potenciais possa ser expresso como depolipeptídeos individuais. Existe uma variedade de métodosque podem ser usados para produzir bibliotecas de variantespotenciais dos polipeptídeos da presente invenção a partirde uma seqüência de oligonucleotídeos degenerados. Osmétodos para a síntese de oligonucleotídeos degenerados sãoconhecidos na técnica (veja, por exemplo, Narang (1983)Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem.53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al.(1983) Nucleic Acid Res. 11:477).

Além disso, podem ser usadas bibliotecas defragmentos da seqüência de codificação de um polipeptídeoda presente invenção para gerar uma população variegada depolipeptídeos para se testar uma subseqüente seleção devariantes. Uma biblioteca de fragmentos de seqüência decodificação, por exemplo, pode ser gerada tratando-se umfragmento de dois filamentos da seqüência de codificação deinteresse obtido por PCR com uma nuclease em condições emque se apara somente aproximadamente uma vez por molécula,desnaturando-se o DNA de dois filamentos, renaturando-se oDNA para formar o DNA de dois filamentos que pode incluirpares sentido/anti-sentido a partir de produtos diferentesaparados, removendo-se as porções de um único filamento dosduplexes reformados tratando-se com Sl nuclease, e ligando-se a biblioteca de fragmentos resultante em um vetor deexpressão. Por este método, pode ser derivada umabiblioteca de expressão que codifica os fragmentos determinal N e internos de diversos tamanhos da proteína deinteresse.

Diversas técnicas são conhecidas na técnica para setestar produtos genéticos de bibliotecas combinatóriasgeradas por mutações em pontos de truncação e para seselecionar bibliotecas de DNAc para produtos genéticos quetenham uma propriedade selecionada. As técnicas maisamplamente usadas e que são adequadas para uma análise degrande rendimento, para a seleção de grandes bibliotecasgenéticas tipicamente incluem a clonagem da bibliotecagenética em vetores de expressão replicáveis, atransformação de células apropriadas com a biblioteca devetores resultante e a expressão dos genes combinatórias emcondições em que a detecção de uma atividade desejadafacilita o isolamento do vetor que codifica o gene cujoproduto foi detectado. A mutagênese de conjunto recorrente(REM), uma técnica que aumenta a freqüência de mutantesfuncionais nas bibliotecas, pode ser usada em combinaçãocom os ensaios de teste para se identificar variante de umaproteína da presente invenção (Arkin e Yourvan (1992) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993)Protein Engineering 6 (3):327-331) .

Além da seqüência genética OXI 01 - OXI 06apresentada em SEQ ID NO: 1, será evidente aos versados natécnica que os polimorfismos da seqüência de DNA que podelevar a alterações na seqüência de aminoácidos da proteína0X1 01 - 0X1 06 pode existir dentro de uma população dada.Tais polimorfismos genéticos podem existir em célulasprovenientes de diferentes populações ou dentro de umapopulação devido à variação alélica natural. Os variantesalélicos podem também incluir equivalentes funcionais.

Os fragmentos de um polinucleotídeo de acordo com apresente invenção podem também compreender polinucleotídeosque não codificam polipeptídeos funcionais. Taispolinucleotídeos podem funcionar como sondas ou comoiniciadores para uma reação de PCR.

Os ácidos nucléicos de acordo com a presenteinvenção independentemente de eles codificarempolipeptídeos funcionais ou não funcionais, podem serusados como sondas de hibridização ou como iniciadores dereação em cadeia da polimerase (PCR). Os usos das moléculasde ácido nucléico da presente invenção que não codificam umpolipeptídeo que tem uma atividade de OXI 01 - OXI 06incluem, dentre outros, (1) o isolamento do gene quecodifica a proteína OXI 01 - OXI 06, ou variantes alélicosseus de uma biblioteca de DNAc, provenientes de outrosorganismos que não sejam A. niger, por exemplo; (2)hibridização in situ (FISH, por exemplo) dispersões demetáfases cromossômicas para proporcionar a localizaçãocromossômica precisa do gene de OXI 01 - OXI 06, conformedescrito em Verma et al. , Human Chromosomes: a Manual ofBasic Techniques, Pergamon Press, Nova York (1988); (3)Análise por northern blot para a detecção de RNAm de 0X1 01- 0X1 06 RNAm em tecidos e/ou células específicos e (4)sondas e iniciadores que podem ser usados como umaferramenta diagnostica para a análise da presença de umácido nucléico hibridizável à sonda de 0X1 01 - OXI 06 emuma amostra biológica dada (em um tecido, por exemplo).

A presente invenção também abrange um método parase obter um equivalente funcional de um gene ou DNAc de 0X101 - OXI 06. Tal método abrange a obtenção de uma sondarotulada que inclui um ácido nucléico isolado que codificatoda a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 0-13-018 ouporção dela ou uma variante sua; o teste de uma bibliotecade fragmentos de ácidos nucléicos com a sonda rotulada emcondições que permitem a hibridização da sonda aosfragmentos de ácidos nucléicos na biblioteca, formandoassim duplexes de ácidos nucléicos, e preparando umaseqüência genética de comprimento total a partir dosfragmentos de ácidos nucléicos em qualquer duplex rotuladopara a obtenção de um gene relacionado com o gene de OXI 01- OXI 06.

Células hospedeiras

Em uma outra modalidade, a presente invenção propõecélulas, tais como células hospedeiras transformadas oucélulas hospedeiras recombinantes que contêm um ácidonucléico abrangido pela presente invenção. Uma "célulatransformada" ou "célula recombinante" é uma célula em que(ou em uma ancestral daquela) foi introduzido, por meio detécnicas de DNA recombinante, um ácido nucléico de acordocom a invenção. Tanto células procarióticas comoeucarióticas são incluídas, tais como células bacterianas,fúngicas, de levedura e semelhantes, sendo especialmentepreferidas células de fungos filamentosos, especialmente deAspergillus niger.

Pode ser escolhida uma célula hospedeira que modulaa expressão das seqüências inseridas, ou que modifica eprocessa o produto gênico de um modo específico desejado,tais modificações (glicosilação, por exemplo) eprocessamento (clivagem, por exemplo) dos produtosprotéicos pode facilitar o funcionamento ótimo da proteína.

Diversas células hospedeiras têm mecanismoscaracterísticos e específicos para o processamento póstraducional e modificação de proteínas e de produtosgênicos. Podem ser escolhidas linhagens de célulasapropriadas ou sistemas de hospedeiras familiares aosversados na técnica da biologia molecular e/oumicrobiologia para se assegurar a modificação eprocessamento desejados e corretos da proteína estranhaexpressa. Para tal fim, podem ser usadas célulashospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celularpara o processamento adequado da transcrição primária,glicosilação e fosforilação do produto gênico. Tais célulashospedeiras são conhecidas na cn.

As células hospedeiras também incluem, semlimitação, linhagens de células de mamíferos tais como CHO,VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, e linhagens decélulas de plexo coróide.

Se for desejado, os polipeptídeos de acordo com apresente invenção podem ser produzidos por uma linhagem decélulas transfectadas de modo estável. Uma série de vetoresadequados para a transfecção estável de células demamíferos são disponíveis ao público, sendo os métodos paraa construção de tais linhagens de células também conhecidasdo publico, veja, por exemplo, em Ausubel et ai. (acima).

Uso de oxidorredutases em processos industriais

A invenção também se refere ao uso daoxidorredutase de acordo com a presente invenção em umasérie selecionada de processos industriais. Apesar daexperiência a longo prazo obtida com estes processos, aoxidorredutase de acordo com a presente invenção ofereceuma série de vantagens significativas em relação às enzimasatualmente usadas. Dependendo da aplicação específica,estas vantagens podem incluir aspectos tais como um melhordesempenho, custos de produção mais baixos, uma maiorespecificidade em relação ao substrato, sendo menosantigênicos, apresentam um número menor de atividadessecundárias indesejáveis, rendimentos mais altos quandoproduzidos em um microorganismo adequado, limites maisadequados de pH e temperatura, um melhor paladar do produtofinal, assim como aspectos de categoria e kosher doalimento.

A oxidorredutase da presente invenção pode serusada em qualquer aplicação em que se deseja oxidar umsubstrato ou se obter produtos de reação específica dele. Aaplicação da oxidorredutase de acordo com a presenteinvenção, por exemplo, pode render peróxido de hidrogêniojuntamente com aldeídos, álcoois, ácido carboxílico etc.

Um dos processos industriais para os quais podemser usada a oxidorredutase inédita de acordo com a presenteinvenção é para fins de produtos de panificação. A presenteinvenção também se refere a um método de se produzir massasde farinha para panificação tendo propriedades reológicasmelhoradas e a produtos acabados assados ou secadosproduzidos a partir de tais massas de panificação que têmuma qualidade de textura e de paladar melhorada ecaracterísticas dimensionais melhoradas. A invenção tambémse refere a uma pré-mistura de panificação que compreendefarinha, um preparado de enzimas e um veículo adequado. Ainvenção resulta em massas mais resistentes, compropriedades reológicas melhoradas assim como a um produtoassado final com qualidades melhoradas.

A resistência da massa é um aspecto importante dapanificação tanto para aplicações em pequena escala como emgrande escala. A massa resistente tem uma tolerância maiorde tempo de mistura, tempo de prova e vibrações mecânicasdurante o transporte da massa, ao passo que a massa fraca émenos tolerante a estes tratamentos. Uma massa resistentecom propriedades reológicas e de manuseio superioresresulta de farinha que contém uma rede de glúten forte. Afarinha com um baixo teor de proteína ou uma qualidade deglúten precária resulta em uma massa fraca.

Os condicionadores de massa são bem conhecidos naindústria de panificação. A adição de condicionadores àmassa de pão resultou em uma melhor capacidade da massa sertrabalhada por máquina e em uma textura, volume, sabor efrescor (antimofo) melhoradas do pão. Oxidantes nãoespecíficos tais como iodatos, peróxidos, ácido ascórbico,bromato de potássio e azodicarbonamida são usados paramelhorar o desempenho de cozimento da farinha para se obteruma massa com propriedades reológicas melhoradas e paraobter massa com uma resistência e estabilidade desejáveis.

Foi sugerido que estes condicionadores induzem aformação de ligações interprotéicas que reforçam o glúten,e conseqüentemente a massa. No entanto o uso de diversosagentes químicos oxidantes disponíveis atualmente foirecebido com resistência pelo consumidor ou não sãopermitidos pelas agências reguladoras.

0 uso de enzimas como condicionadores da massa foiconsiderado uma alternativa a condicionadores químicos. Umasérie de enzimas foi usada recentemente como agentesmelhoradores da massa e/ou do pão, especialmente enzimasque atuam sobre os componentes presentes em grandesquantidades na massa. Exemplos de tais enzimas sãoamilases, proteases, glicose oxidases, hexose oxidases,xilanases e (hemi)celulases, incluindo pentosanases elipases, fosfolipases e galactolipases.Os produtos de panificação são preparados a partirde uma massa que e geralmente constituída por ingredientesbásicos farinha, água e opcionalmente sal. Dependendo dosprodutos de panificação, outros ingredientes opcionais sãoaçúcares, aromatizantes etc. Para produtos levedados, usa-se principalmente fermento biológico juntamente comsistemas de fermentação química, tais como uma combinaçãode um ácido (composto gerador) e bicarbonato. Para semelhorar as propriedades de manuseio da massa e/ou aspropriedades finais dos produtos de panificação há umesforço contínuo de se desenvolver auxiliares deprocessamento com propriedades melhoradas. As propriedadesda massa que devem ser melhoradas são a capacidade de sertrabalhada por máquina, capacidade de retenção de gasesetc. As propriedades dos produtos assados que podem sermelhoradas compreendem o volume do pão, a casca crocante, atextura do miolo e a maciez, sabor e aroma e tempo dearmazenagem. Os adjuvantes de processamento que existematualmente podem ser divididos em dois grupos: aditivosquímicos e enzimas.

Os aditivos químicos com propriedades demelhoramento compreendem agentes químicos oxidantes taiscomo ácido ascórbico, bromato e azodicarbonato, agentesredutores tais como L-cisteína e glutatione, emulsificantesque atuam como condicionadores de massa tais como ésteresdiacetil tartáricos de mono/diglicerídeos (DATEM),estearoil lactilato de sódio (SSL) ou estearoil lactilatode cálcio (CSL) ou que atuam como amaciantes do miolo taiscomo o monoestearato de glicerila (GMS) etc, materiais30 graxos tais como triglicerídeos (gordura) ou lecitina eoutros.

Atualmente existe uma tendência de se substituir osaditivos químicos por enzimas. Estas últimas sãoconsideradas como sendo compostos mais naturais e são,portanto, mais aceitas pelo consumidos. Enzimas adequadaspodem ser selecionadas de enzimas oxidantes, consistindo ogrupo de enzimas que degradam o amido, enzimas que degradamarabinoxilanocelulose e outras hemiceluloses, enzimas quedegradam celulose, enzimas que fazem a clivagem de materialgraxo e enzimas que degradam a proteína.

A presente invenção também se refere a métodos paraa preparação de uma massa de panificação ou um produto depanificação compreendendo a incorporação à massa de umaquantidade efetiva de uma oxidorredutase da presenteinvenção que melhora uma ou mais propriedades da massa oudo produto de panificação obtido da massa, em comparaçãocom uma massa ou um produto de panificação ao qual opolipeptídeo não é incorporado.

A expressão "incorporação à massa" é definida nopresente documento como a adição de oxidorredutase deacordo com a invenção à massa, qualquer ingrediente apartir do qual a massa será feita e/ou qualquer mistura deingredientes de massa da qual a massa será preparada. Emoutras palavras, a oxidorredutase de acordo com a invençãopode ser acrescentada em qualquer etapa da preparação damassa e pode ser acrescentada em uma, duas ou mais etapas.A oxidorredutase de acordo com a presente invenção éacrescentada aos ingredientes da massa que é sovada eassada para produzir o produto de panificação usando-semétodos bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo,patente U.S. No. 4.567.046, EP-A-426,211, JP-A-60-78529,JP-A-62-111629 , e JP-A-63-258528.

O termo "quantidade efetiva" é definido no presentedocumento como uma quantidade de oxidorredutase de acordocom a presente invenção que é suficiente para produzir umefeito mensurável sobre pelo menos uma propriedade deinteresse da massa e/ou do produto assado.

0 termo "propriedade melhorada" é definido nopresente documento como qualquer propriedade de uma massae/ou de um produto obtido a partir da massa, especialmentede um produto assado, que é melhorado pela ação daoxidorredutase de acordo com a invenção em comparação comuma massa ou produto ao qual a oxidorredutase de acordo coma invenção não tenha sido incorporada. A propriedademelhorada pode incluir, sem limitação, uma maiorresistência da massa, uma maior elasticidade da massa, umamaior estabilidade da massa, uma menor pegajosidade damassa, uma melhor extensibilidade da massa, um melhor sabordo produto assado, um efeito antimofo melhorado do produtoassado e uma maior brancura do miolo.

A propriedade melhorada pode ser determinada porcomparação de uma massa e/ou de um produto assado preparadocom e sem a adição de um polipeptídeo da presente invençãode acordo com os métodos da presente invenção são descritosabaixo nos Exemplos. As qualidades organolépticas podem seravaliadas usando-se procedimentos bem estabelecidos naindústria de panificação e podem incluir, por exemplo, ouso de um quadro de testadores de sabor treinados.

O termo "uma maior resistência da massa" é definidono presente documento como a propriedade de uma massa quetem geralmente propriedades mais elásticas e/ou que exigemais trabalho para ser moldada e receber um formato.

0 termo "uma maior elasticidade da massa" édefinido no presente documento como a propriedade de umamassa que tem uma maior tendência de voltar ao seu formatooriginal depois de ter sido submetida a um determinadoesforço físico.

0 termo "uma maior estabilidade da massa" édefinido no presente documento como a propriedade que umamassa tem de ser menos suscetível a abuso mecânico,mantendo, assim, melhor o seu formato e volume.

0 termo "uma menor pegajosidade da massa" édefinido no presente documento como a propriedade que amassa tem que ter uma menor tendência de aderir asuperfícies, tal como na maquinaria de produção de massa,por exemplo, e é avaliada empiricamente pelo padeiro deteste perito ou medida pelo uso de um analisador de textura(por TAXT2, por exemplo) conforme é conhecido na técnica.

0 termo "uma maior extensibilidade da massa" édefinido no presente documento como a propriedade que umamassa tem de poder ser submetida a uma tensão ouestiramento maior sem se romper.

O termo "uma melhor capacidade de a massa sertrabalhada por máquina" é definido no presente documentocomo a propriedade que a massa tem de ser geralmente menospegajosa e/ou mais firme e/ou mais elástica.

O termo "uma maior resistência durante a prova deuma massa" é definido no presente documento como acapacidade que uma massa tem resistir a tempos prolongadosde proa.O termo "maior volume do produto assado" é medidocomo o volume específico de um pão dado (volume/peso)determinado tipicamente pelo método tradicional dedeslocamento de semente de canola.

0 termo "uma melhor estrutura do miolo no produtoassado" é definido no presente documento como a propriedadeque um produto assado tem de apresentar paredes celularesmenores e/ou mais delgadas no miolo e/ou uma distribuiçãomais uniforme/homogênea das células no miolo e é geralmenteavaliada pelo padeiro de teste perito.

O termo "uma maior maciez do produto assado" é ooposto de "firmeza" e é definido no presente documento comoa propriedade que um produto assado tem de ser maisfacilmente comprimido e é avaliada ou empiricamente pelopadeiro perito de teste ou medida com o uso de umanalisador de textura (TAXT2, por exemplo) conhecido natécnica.

O termo "um melhor sabor do produto assado" éavaliado por um quadro de teste treinado.

O termo "um melhor efeito antimofo do produtoassado" é definido no presente documento como a preparaçãoque um produto assado tem de ter uma taxa reduzida dedeterioração de parâmetros de qualidade, tais como macieze/ou elasticidade, por exemplo, durante armazenagem.

0 termo "massa" é definido no presente documentocomo uma mistura de farinha e outros ingredientes que sejasuficientemente firme para ser sovada ou esticada. A massapode ser fresca, congelada, pré-desnudado ou pré-assada. Apreparação de massa congelada é descrita por Kulp e Lorenzem Frozen and refrigerated Doughs and Batters.O termo "produto assado" é definido no presentedocumento como qualquer produto preparado a partir de umamassa de padaria, que fosse ou de um caráter macio ou umcrocante. Exemplos de produtos assados, quer do tipobranco, leve ou do tipo escuro, que podem ser produzidoscom vantagem pela presente invenção são pão (especialmenteo pão branco, o integral ou o de centeio) tipicamente naforma de bisnagas ou broas, pão do tipo baguette francesa,massas, pão sírio, tortillas, tacos, bolos, panquecas,biscoitos, cookies, crosta de torta, pão no vapor e pãocrocante e semelhantes.

As oxidorredutases da presente invenção e/ouenzimas adicionais a serem usadas nos métodos da presenteinvenção pode se encontrar em qualquer foram adequada parao uso em questão, em forma de um pó seco, pó aglomerado ougranulado, por exemplo, especialmente um granulado nãocontendo pó, líquido, especialmente um líquidoestabilizado, ou enzima protegida, tal como a descrita emWO 01/11974 e WO 02/26044. Os granulados e os pósaglomerados podem ser preparados por métodos convencionais,por pulverização com oxidorredutase de acordo com ainvenção sobre um veículo em um granulador de leito fluido.0 veículo pode consistir em núcleos em partículas tendo umtamanho de partícula adequado. 0 veículo pode ser solúvelou insolúvel, um sal, por exemplo, (tal como NaCl ousulfato de sódio), açúcar (tal como sacarose ou lactose)álcool de açúcar (tal como sorbitol), amido, arroz, farinhaentrefina de milho ou soja. A oxidorredutase de acordo coma invenção e/ou enzimas adicionais podem estar contidas emformulações de liberação lenta. Os métodos para apreparação de formulação de liberação lenta são bemconhecidos na técnica. Acrescentando-se estabilizantesaceitáveis do ponto de vista nutricional tais como açúcar,álcool de açúcar ou um outro poliol e/ou ácido lático ou umoutro ácido orgânico de acordo com métodos estabelecidospode estabilizar preparações de enzimas líquidas, porexemplo.

As oxidorredutases de acordo com a invenção podemtambém ser incorporadas em composições que compreendemlevedura tais como as descritas em EP-A-0619947, EP-A-0659344 e WO 02/49441.

Para a inclusão de pré-misturas de farinha évantajoso que o polipeptídeo de acordo com a presenteinvenção se encontre na forma de um produto seco, umgranulado sem pó, por exemplo, ao passo que para a inclusãojuntamente com um líquido é vantajoso que se encontre naforma líquida.

Uma ou mais enzimas adicionais podem também serincorporadas à massa. A enzima adicional pode ser dequalquer origem, incluindo-se de mamífero e vegetal, esendo, de preferência, de origem microbiana (bacteriana, delevedura ou fúngica) e pode ser obtida por técnicasconvencionalmente usadas na técnica.

Em uma modalidade preferida, a enzima adicionalpode ser uma amilase, tal como uma alfa-amilase (útil paraprover açúcares fermentáveis por levedura e retardadores demofo) ou beta-amilase, ciclodextrina glicano transferase,peptidase, especialmente uma exopeptidase (útil naintensificação de sabor), transglutaminase,lipase/fosfolipase/galactolipase (útil para a modificaçãode compostos lipolíticos presentes na massa ou nosconstituintes da massa), oxidorredutase, celulase,hemicelulase, especialmente uma pentosanase, tal comoxilanase (útil para a hidrólise parcial de pentosanos queaumenta a extensibilidade da massa), protease (útil para oenfraquecimento do glúten, especialmente quando se usa umafarinha de trigo dura), dissulfeto isomerase de proteínas,tal como uma dissulfeto isomerase de proteínas conformedescrito em WO 95/00636, glicosil transferase, peroxidase(útil para melhorar a consistência da massa), lacase,catecol oxidase e outras oxidases, uma glicose oxidase, porexemplo, hexose oxidase, aldose oxidase, piranose oxidase,lipoxigenase ou L-aminoácido oxidase (útil para melhorar aconsistência da massa).

Quando uma ou mais atividades da enzima adicionaldevem ser acrescentadas de acordo com os métodos dapresente invenção, estas atividades podem ser acrescentadasseparadamente ou em conjunto com o polipeptídeo de acordocom a presente invenção, opcionalmente como constituinte(s)da composição melhoradora de pão e/ou melhoradora de massa.

As outras atividades da enzima podem ser qualquer uma dasenzimas descritas acima e podem ser dosadas de acordo compráticas de padaria estabelecidas.

A presente invenção também se refere a métodos paraa preparação de um produto assado compreendendo o cozimentode uma massa obtida por um método da presente invenção paraproduzir um produto assado. 0 cozimento da massa paraproduzir um produto assado pode ser conduzido usando-semétodos bem conhecidos na técnica.

A presente invenção também se refere a massas e aprodutos assados, produzidos respectivamente, pelos métodosda presente invenção.

A presente invenção também se refere a uma pré-mistura, na forma de uma composição de farinha, porexemplo, para massa e/ou produtos assados feitos da massaem que a pré-mistura compreende um polipeptídeo da presenteinvenção. 0 termo "pré-mistura" é definido no presentedocumento para ser compreendido no seu significadoconvencional, isto é, como uma mistura de agente decozimento, geralmente incluindo farinha, que pode ser usadanão somente em agentes industriais de cozimento de pão,incluindo em geral farinha, que pode ser usada não somentenas instalações industriais/fábricas de produção de pão,mas também em padarias de vendas no varejo. A pré-misturapode ser preparada misturando-se o polipeptídeo ou umacomposição melhoradora de pão e/ou melhoradora de massa dainvenção que compreende o polipeptídeo com um veículoadequado tal como farinha, amido, um açúcar ou um sal. Apré-mistura pode conter outros aditivos melhoradores demassa e/ou melhoradores de pão, tal como qualquer um dosaditivos, por exemplo, incluindo enzimas, mencionadosacima.

A presente invenção se refere ainda a aditivos decozimento na forma de um granulado ou pó aglomerado quecompreendem um polipeptídeo da presente invenção. O aditivode cozimento tem, de preferência, uma distribuição detamanhos de partículas estreita com mais de 95 % (em peso)das partículas se encontrando na faixa de 25 a 500 pm.

Na preparação de massa e pão a presente invençãopode ser usada em combinação com os auxiliares deprocessamento definidos acima tais como os auxiliares eprocessamento químicos como oxidantes (ácido ascórbico, porexemplo), agentes redutores (L-cisteína, por exemplo),fosfolipases e/ou outras enzimas tais com enzimasmodificadoras de polissacarídeos (alfa-amilase,hemicelulase, enzimas ramificadas, por exemplo, etc.) e/ouenzimas modificadores de proteína (endoprotease,exoprotease, enzimas ramificadas etc.).

Foi também descoberto que a proteína OXI 01 podeproduzir peróxido de hidrogênio na massa. Foi constatadocom surpresa que ela usa pelo menos o ácido 9,12,13-triidróxi-10-octadecenóico como substrato produzindo assimum ácido ceto-diidróxi-10-octadecenóico. Este substratoestá presente na farinha, por exemplo, e torna, portanto, aproteína OXI 01 especialmente adequada para o cozimento.

0 uso de tal enzima na panificação não eraconhecido até agora. Portanto, a presente invenção tambéminclui o uso de uma enzima que catalisa a oxidação de umácido graxo hidroxilado, tal como um ácido graxo mono-hidroxilado ou um ácido graxo tri-hidroxilado, tal como oácido 9,12,13-triidróxi-10-octadecenóico, produzindo assimperóxido de hidrogênio, durante o cozimento. Um exemplo deum tipo adequado de enzima é uma oxidase de álcool, umaoxidase de álcool secundário, por exemplo, ou uma álcoolisoamílico oxidase.

Em uma modalidade preferida, a enzima capaz deoxidar um ácido graxo hidroxilado é combinada com umalipoxigenase e/ou uma peroxidase.

A presente invenção também se refere a umacomposição adequada para uso em cozimento, compreendendouma enzima capaz de oxidar um ácido graxo hidroxilado e umalipoxigenase e/ou uma peroxidase. É preferível que a enzimacapaz de oxidar um ácido graxo hidroxilado seja capaz deoxidar o ácido 9,12,13-triidróxi-10-octadecenóico. Maispreferível é que a enzima capaz de oxidar um ácido graxohidroxilado seja uma proteína OXI 01 sendo ainda preferívelque a proteína compreenda a seqüência de aminoácidos deacordo com a SEQ ID NO: 013.

Um outro uso de oxidorredutase de acordo comapresente invenção se encontra no campo de aplicações delaticínios.

0 tratamento térmico do leite é sempre acompanhadoaté um certo ponto por reações de Maillard que levam aodesenvolvimento de uma cor ligeiramente marrom do leitetratado, embora em alguns casos possa ser desejável (talcomo nas balas ou caramelos amanteigados, por exemplo), acoloração marrom é geralmente indesejável. A reação deMaillard é o resultado da reação de açúcares redutorespresentes no leite, especialmente da lactose, glicose elactose com grupos amino livres que estão presentes nasproteínas do leite tal como nas caseínas ou nas proteínasdo soro.

A oxidorredutase OXI 01-06 de acordo com a invençãopode ser usada para reduzir a reação de Maillard em leite,em produtos derivados suaves ou alimentos contendo produtos(laticínios) suaves derivados a temperaturas aumentadas.

Um exemplo de tal tratamento é a pasteurização doleite para aumentar a sua estabilidade durante o tempo dearmazenamento. Na pasteurização de longa-duração a baixatemperatura (LTLP), também denominada pasteurização emcuba, o leite é tipicamente mantido a 62,8°C durante umperíodo não inferior a 3 0 minutos. Em processos contínuos,é usada a pasteurização de curta duração a alta temperatura(HTST) em que o leite é mantido a uma temperatura nãoinferior a 71,7°c durante um mínimo de 15 segundos (ou emcondições equivalente a uma temperatura mais elevadadurante um período de tempo mais curto). Mais recentementefoi desenvolvida uma pasteurização por Tratamento-Ultra-Térmico (UHT) em que o leite é aquecido a pelo menos 1350Cdurante um mínimo de 1 segundo. 0 tratamento UHTespecialmente, mas até um ponto menor também os tratamentosLTLP e HTST exigem um controle muito rígido de temperaturae de processo.

Um outro exemplo de uma aplicação adequado para seusar a oxidorredutase de acordo com a invenção é o queijoespalhado sobre uma pizza, me muitos casos, um queijo dotipo mussarela que é usado na cobertura de pizzas. Natécnica, refere-se a pasta fileta como mussarela. Muitosfabricantes de pizza assam a pizza a temperatura >260°C. Aestas altas temperaturas a propensão que o queijo tem deescurecer excessivamente se transformou em uma preocupaçãoespecífica à indústria de mussarela, pois os fabricantes demussarela devem entregar um queijo que não formará bolhasnegras e áreas marrons quando assado a estas altastemperaturas. 0 efeito de coloração marrom é tipicamenteproduzido por quantidades residuais de lactose eespecialmente de galactose. Sabe-se na técnica que há umforte coeficiente de correlação entre a galactose e níveisde cor do queijo assado e muitas tentativas de se reduzir onível de galactose e de lactose em mussarela sãomencionadas na literatura. Estas práticas sãoprincipalmente de difícil manipulação e/ou podem aumentaros custos ou reduzir a produção.

O uso da oxidorredutase de acordo com a presenteinvenção antes do tratamento térmico reduz as reações deMaillard7 proporcionando uma via eficiente para o controleda coloração marrom do leite durante o tratamento atemperaturas elevadas. A oxidorredutase de acordo com apresente invenção é acrescentada, de preferência, em umafase precoce do tratamento do leite para dar a enzima tenhaum tempo máximo para oxidar os açúcares redutores. Como aenzima depende da disponibilidade de oxigênio, a adiçãoprecoce é preferida paras permitir a entrada de oxigêniodurante o processamento do leite e permitir assim umaredução mais alta possível dos níveis de concentração dosaçúcares redutores. A oxidorredutase de acordo com ainvenção tem uma ampla especificidade de substrato,permitindo a oxidação de uma série ampla de açúcaresredutores. Para aplicação a laticínios para produtos oupara produtos alimentícios contendo laticínios. Aoxidorredutase de acordo com a presente invenção é capaz deoxidar eficientemente lactose, glicose e galactose.

A enzima pode ser colocada em contato com produtosalimentícios mais sólidos, queijo, por exemplo, de diversosmodos. Pode-se colocar o queijo em contato com a enzimadurante o processo de fabricação do queijo, acrescentando-se a enzima a algum estágio do processo de fabricação(adição ao leite do queijo, por exemplo) resultando naincorporação da enzima à matriz do queijo. A enzima setornará ativa quando o oxigênio estiver presente, estepodendo até um certo ponto já se encontrar no queijopropriamente dito, mas será o mais predominante durantee/ou depois do processamento do queijo, tal como quando forfatiado ou ralado, o que leva a um aumento significativo emsuperfície do queijo exposto ao ar e exposição a oxigênio.Alternativamente, a enzima pode ser pulverizada sobre oproduto alimentício contendo o queijo antes do aquecimento,impedindo deste modo as reações de Maillard na superfícieque é o local onde as reações de Maillard predominantementetêm lugar. Neste caso, a enzima pode ser fornecida em umasolução ou uma dispersão e ser pulverizada sobre o produtoalimentício. A solução/dispersão pode compreender a enzimaem quantidade de 1-50 unidades de OXI 01 -OXI 06/mL.Alternativamente a enzima pode ser acrescentada em umaforma seca, tal como um pó.

A enzima, ou em forma seca ou líquida, pode seracrescentada sozinha ou em combinação com outros aditivos.

Foi descoberto com surpresa que o uso daoxidorredutase da presente invenção pode também reduzir ocrescimento de microorganismos aeróbicos no leite,contribuindo, assim, para a conservação do leite fresco. Emtais casos, a oxidorredutase pode ser usada como um agenteantimicrobiano em aplicações a laticínios, em leite, porexemplo, em produtos derivados de leite ou em produtosalimentícios contendo tais produtos.

Uma vantagem adicional do uso de uma oxidorredutasede acordo com a presente invenção é que são formadosperóxidos. É conhecido o fato de que tais peróxidos podemreagir com proteínas, levando à reticulação de proteínas(veja, por exemplo, J.A. Gerrard, Trends in Food Science &Technology (2002), 13, 391-399). NO entanto, a extensão dareticulação depende da quantidade de peróxido de hidrogênioque é gerada. Causou surpresa o fato de que aoxidorredutase de acordo com a presente invenção é capaz desubstancialmente reticular proteínas no leite. 0 grau dereticulação é também dependente do pré-tratamento dosubstrato, da quantidade de oxigênio disponível para a óxi-redução etc. A reticulação de proteínas tem a vantagem deque os produtos que compreendem proteínas reticuladasalteraram as suas propriedades texturais, a capacidade queos géis formados a partir de tais proteínas reticuladas têmde reter água.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Testes reológicos

0 farinógrafo e o extensógrafo são usados porpadeiros em todo o mundo para avaliar as propriedadesreológicas e tecnológicas da massa.

0 efeito da oxidorredutase sobre as propriedadesreológicas da massa podem ser medidas por métodos padrão deacordo com a International Association of Cereal Chemistry(ICC) e a American Association of Cereal Chemistry (AACC)incluindo o analisador Rapid Visco Analyser, o métodofarinográfico (AACC 54-2, ICC 115) e o extensográfico (AACC54-10, ICC 114).

Na verdade, o método do extensógrafo mede aresistência relativa da massa. Uma massa resistenteapresenta uma curva extensográfica mais alta e em algunscasos mais longa do que uma massa fraca. 0 método AACC 54-10 define o extensógrafo do seguinte modo: "o extensógraforegistra uma curva de carga-extensão para um fragmento deteste de massa até ele se quebrar. As características dascurvas carga-extensão ou extensogramas são usadas para seavaliar a qualidade geral da farinha e as suas respostas aagentes melhoradores".

0 método farinográfico determina a absorção de águade uma farinha específica e a tolerância a mistura da massaresultante. Farinhas para padaria melhores e melhoresmassa, apresentarão valores farinográficos mais elevados.Se uma farinha específica apresentar uma absorçãorelativamente alta de água, e a tolerância a mistura damassa resultante for boa, a curva farinográfica apresentauma retenção da maior parte, se não toda, a altura inicialcom o decorrer do tempo. A capacidade de a massa sertrabalhada por máquina e a qualidade de cozimento de talmassa têm a probabilidade de serem excelentes. 0 MétodoAACC 54-12 define o farinógrafo do seguinte modo: "ofarinógrafo mede e registra a resistência de uma massa amistura. Ele é usado para se avaliar a absorção de farinhase para determinar a estabilidade e outras característicasdas massas durante a mistura".

Exemplo 2

Medição do teor de grupos tiol livres da massa

O efeito de uma enzima redox sobre a formação dareticulação do grupo tiol pode ser estudado medindo-se oteor de grupos tiol livres em uma massa. O método édescrito em Cereal Chemistry, 1983, 70, 22-26. Este métodoé baseado no princípio de que o 5,5'-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) reage com os grupos tiol na massapara formar um ânion extremamente colorido de ácido 2-nitro-5-mercapto-benzóico que é medidoespectrofotometricamente a 412 nm.

Exemplo 3

Teste de cozimento de mini-bâtard

0 teste de cozimento de mini-bâtard foi usado parao reforço em glúten. Para se detectar o efeito de enzimassobre o reforço de glúten, foi omitida a adição de agentesoxidantes químicos. Todos os testes são conduzidos emduplicata.

Receita

Ingredientes Farinha Kolibi (Meneba) 180 gFarinha Ibis (Meneba) 20 gLevedo fresco (Koningsgist) 4,6 gÁgua 59% 118 gSal 2% 4 gAmilase fúngica Bakezyme P500 3 g/m3Xilanase Bakezyme HSP6000 5 g/m3

Processo

Etapa de processo Mistura Misturador de rolo 6 min 15 segEscala 2 χ 150 gPrimeira prova 25 min, temperatura ambienteMoldagem Ajuste do moldador de bastão Bertrand 16Prova final 90 min, 32°C, 85% de umidade ambienteCozimento 20 min a 240/235°C, 0,21 de vapord'água

A relação altura/largura é uma medida para aestabilidade da massa. Quando se assa pão em forno aberto,e quando não está presente nenhum agente oxidante, a massanão é estável e fica chata e larga. As mesmascaracterísticas são encontradas no pão final. A adição deenzimas que melhoram a estabilidade da massa resulta em umarelação altura/largura mais elevada.

Durante o processamento a qualidade da massa éavaliada pelo padeiro. As relações altura/largura sãomedidas com uma régua. Os resultados são avaliadosestatisticamente com ANOVA, Statgraphics plus 5.1.

Exemplo 3.1

As oxidorredutases tendo seqüências de aminoácidosde acordo com SEQ ID NO: 013, 014, 015, 016, 017 e 018foram testadas em mini-bâtards. Todos so testes foramconduzidos em duplicata. Todas as enzimas foram dosadascomo concentrados de ultrafiltração e testadas a 5 mg deproteína total por kg de farinha. O controle negativoconsistia em massa sem a adição de oxidorredutase. O ácidoascórbico (68 mm) foi levado como referência.

Resultados:

<table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table>

*Resultados afetados com uma letra diferente sãodiferenças estatisticamente significativas a um nível deconfiabilidade de 90,0%. 0 método usado para se discriminarentre as médias é o procedimento de diferença significativamínima (LSD) de Fisher.

É claramente visível que os pães contendo asoxidorredutases de acordo com a presente invençãoapresentam uma relação altura/largura melhor do que os pãesque não contêm estas enzimas.

Exemplo 3.2

O efeito da resposta a dosagem da enzima contendoaminoácido de acordo com SEQ ID NO: 013 sobre a relaçãoaltura/largura foi testada como mini-bâtards. Três dosagensforam testadas: 1, 2 e 3 mg de proteína total/kg defarinha. O controle negativo consistia em massa sem aadição de oxidorredutase. 0 ácido ascórbico (68 mm) étomado como referência. Os testes foram conduzidos emduplicata.

Resultados:

<table>table see original document page 69</column></row><table>

* Resultados afetados com uma letra diferente sãodiferenças estatisticamente significativas a um nível deconfiabilidade de 90,0%. O método usado para se discriminarentre as médias é o procedimento de diferença significativamínima (LSD) de Fisher.

Foi constatado que a oxidorredutase de acordo com apresente invenção apresenta uma boa resposta a dosagem narelação altura-largura de mini-bâtards assados. Emcomparação com os resultados do Exemplo 3.1, os valoresabsolutos das relações altura/largura são mais elevadosneste teste. Isto é relacionado com o fato de que o testedo exemplo 3.1 foi conduzido com uma farinha proveniente dacolheita de 2005 e o exemplo 3.2 com uma farinha dacolheita de 2006.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

Seqüência 1

4877

DNA

Aspergillus niger<400> OOl

cacgacgggc agagatccgc gacgatggtg gtcatccttt gacagaacag atgcgactac 60

tcaagtatat ttattttatc gtggaactaa cttacttccc acaagaattc ggcaccaggg 120

gaattatact ttcagagtcg ccttagcccg tatggctgcc gactgggcag attcgtgcat 180

ggctggaata ttggatccat ggcgcagata acataatatt agggagattg ggtgccttcg 240

tccatccaat tcctgggtgc tccggctacc cgacggacaa atctcgcaaa agatagtgga 300

gactgttgtc ccagttggcc agggcaattg gacaaagctt tccccaatag gcagacgtcg 360

ccggggaaca gagtcccagg gtatgaataa ttcaacccta ctactggaat cctggtggcg 420

cttagcgtgc agcagtggat gcactcgcca cgaggggaac aggggtcggc tCcatcctta 480

atcatttcta gaatgcgacc aggatcctca cctgccggta ctccaattat tggaatttct 540

gcagccggca ctgaagataa tcaaatgacc gttatggtct tcccacttga tgcagatcta 600

cccatgccct acgggggatg gtagagagat gatcccttgc tctaagctca ccatgcccag 660

cgaccggtac gggaccctca cgtctgtttg aattgatggt gggtcattgt caaactttga 720

gagaaaaaat tcctcggcca acttcaagcc acattccaga gttgagagac gtcgcagccg 780

acacactcag gaacaaacct ttggtgttct ggtcggagag agttacgtac accagcaggg 840

gggagggaag gcagatttga attaaaaata gcggcactag agacacgaga aatgtcagcg 900

acaagtcttt ctatctcaga ccatagagga ctcgctagca tgcaccgaag caaaccgaag 960

gagtcagtcg gcagcgtgtg atggatttgg caccgtctgt tcgtcgaatc cccggaacat 1020

ccgccgcggt actcattttt agacggacca tcggccacct gccaataaaa cggttagcac 1080

agctccactt cgtccggttc cagtgctcgc cgaaagccta aatcctgccc tctggaggtt 1140

gcatggtgcc attctgatcc aataccacgc ctcatagcca ctctagcgag cggggcccga 1200

aattacctgg aggaagtgcc actgtgccat cgcccaactg gaagtcgttc tccgatcgtg 1260

tgtgcctgga cgataacccg gcccctgtgt cggccagata attccctaaa tccatccaca 1320

ccatctgcct cggcgactcg gccagttcct ggccatcgct ctagtatctc tgccacaccc 1380

agcgtccggc taatccgcgg tggtagaatt atccaccgct tgctccgcga ctttacgcac 1440

ttggggaaca tgtccgatga tggctcaata gcttcctcct gatcgtgaga tacggctgct 1500

gtatcaattt gcatataaag tacttgtccc tccgcaggga tcgtcacttt attcactcaa 1560

tccagtcact tcctttcttt ccatcccctc cgtcctccct tagctttaca ggatgaaggc 1620

ttcctggtct tttgcagcat ctgtcgctgc tctcgcctcc aaggccgtcg cttctagcga 1680

ctgccactgc ctgcccggcg atagctgctg gccctcgacc tccagctggg actccctcaa 1740

caacactgtg ggcggtcgct tggttgcgac tgttcccatt ggCactcctt gccatgaccc 1800

taactacaat ggcgccgagt gcacgaacct gcaggatgac tggtactacc cgcagactca 1860

gtaaggcacc ccctcctcca cttcccaaat ttaaaccatg ctgacgtcag tcaatctcag 1920

cttggtctct tcttcatctg ttatgcaacc gtactttgcc aaccagagct gtgatccttt 1980

ccagcccgag tcccggccct gcctgcttgg caactacgtg agctacgccg tcaacgtctc 2040

cacgaccgat gatgttgttg ctgcggtcaa gttcgcccag gagaacaaca tccgtctcgt 2100

gatcaggaac accggtcatg agtaagtttc attttttccc ccctctgaat catgtagatt 2160

aggatgctaa tccatctctc agctaccttg gccgttccac cggtgctggt gccctggcca 2220

tctggactca ctacctgaac gacgtcgaaa tcacagagtg gtcggattcc acctacgcgg 2280LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

Seqüência 1

4877

DNA

Aspergillus niger<400> OOl

cacgacgggc agagatccgc gacgatggtg gtcatccttt gacagaacag atgcgactac 60

tcaagtatat ttattttatc gtggaactaa cttacttccc acaagaattc ggcaccaggg 120

gaattatact ttcagagtcg ccttagcccg tatggctgcc gactgggcag attcgtgcat 180

ggctggaata ttggatccat ggcgcagata acataatatt agggagattg ggtgccttcg 240

tccatccaat tcctgggtgc tccggctacc cgacggacaa atctcgcaaa agatagtgga 300

gactgttgtc ccagttggcc agggcaattg gacaaagctt tccccaatag gcagacgtcg 360

ccggggaaca gagtcccagg gtatgaataa ttcaacccta ctactggaat cctggtggcg 420

cttagcgtgc agcagtggat gcactcgcca cgaggggaac aggggtcggc ttcatcctta 480

atcatttcta gaatgcgacc aggatcctca cctgccggta ctccaattat tggaatttct 540

gcagccggca ctgaagataa tcaaatgacc gttatggtct tcccacttga tgcagatcta 600

cccatgccct acgggggatg gtagagagat gatcccttgc tctaagctca ccatgcccag 660

cgaccggtac gggaccctca cgtctgtttg aattgatggt gggtcattgt caaactttga 720

gagaaaaaat tcctcggcca acttcaagcc acattccaga gttgagagac gtcgcagccg 780

acacactcag gaacaaacct ttggtgttct ggtcggagag agttacgtac accagcaggg 840

gggagggaag gcagatttga attaaaaata gcggcactag agacacgaga aatgtcagcg 900

acaagtcttt ctatctcaga ccatagagga ctcgctagca tgcaccgaag caaaccgaag 960

gagtcagtcg gcagcgtgtg atggatttgg caccgtctgt tcgtcgaatc cccggaacat 1020

ccgccgcggt actcattttt agacggacca tcggccacct gccaataaaa cggttagcac 1080

agctccactt cgtccggttc cagtgctcgc cgaaagccta aatcctgccc tctggaggtt 1140

gcatggtgcc attctgatcc aataccacgc ctcatagcca ctctagcgag cggggcccga 1200

aattacctgg aggaagtgcc actgtgccat cgcccaactg gaagtcgttc tccgatcgtg 1260

tgtgcctgga cgataacccg gcccctgtgt cggccagata attccctaaa tccatccaca 1320

ccatctgcct cggcgactcg gccagttcct ggccatcgct ctagtatctc tgccacaccc 1380

agcgtccggc taatccgcgg tggtagaatt atccaccgct tgctccgcga ctttacgcac 1440

ttggggaaca tgtccgatga tggctcaata gcttcctcct gatcgtgaga tacggctgct 1500

gtatcaattt gcatataaag tacttgtccc tccgcaggga tcgtcacttt attcactcaa 1560

tccagtcact tcctttcttt ccatcccctc cgtcctccct tagctttaca ggatgaaggc 1620

ttcctggtct tttgcagcat ctgtcgctgc tctcgcctcc aaggccgtcg cttctagcga 1680

ctgccactgc ctgcccggcg atagctgctg gccctcgacc tccagctggg actccctcaa 1740

caacactgtg ggcggtcgct tggttgcgac tgttcccatt ggtactcctt gccatgaccc 1800

taactacaat ggcgccgagt gcacgaacct gcaggatgac tggtactacc cgcagactca 1860

gtaaggcacc ccctcctcca cttcccaaat ttaaaccatg ctgacgtcag tcaatctcag 1920

cttggtctct tcttcatctg ttatgcaacc gtactttgcc aaccagagct gtgatccttt 1980

ccagcccgag tcccggccct gcctgcttgg caactacgtg agctacgccg tcaacgtctc 2040

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ccatggttga tgccggcacc accgtcatct atgagatgac

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tctctgctct gaccgacctg ggcatcgagt acaccgtcgc

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agtacaacta cggcggccgc ctcctccccc gtgacaccct

tcgtctccgt cctccgcaac atcacctccg acggtctcat

acgtcaccaa ctccaacgác accgccaacg ctgtcttcca

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Seqüência 2

2852

DNA

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gatctcgccg catggactga ggttgctgtc gactccgccc cctgccagaa gatgggtatg 2040

gccaaccccc gttacccgat ctacctcgaa acgtacaacg tcactgccca gcagaaggca 2100

tgggacgtct acgcgaatgc tacccgtggc ttttcggcgt tcaacaactc catcttcatg 2160

ttcgagggat actcagttgg cggcgtgcac gatgttgata gccggtcgag cgcttttgcc 2220

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tttgaaaatc atgaacagta gtattacaca tcaatcacgg cccagtcgat acctcctagt 2760

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Seqüência 3

4745

DNA

Aspergillus niger<400> 003

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cactgccaaa aacaaagaag cttgctactg acttgtcagc caagtgggtg gacaatgggc 360ctagtagggc tgaacccctt gataggtccc ctgagtttcg ttgattttcg ggtcggccag 420gcatggatcg gagtccggcc aggcagaaag atcctatcaa gaagctaaag atgctttttc 480

ctggctaagc ctctctgggt ccaccgattt agtggagctt aaccaatggt ttaatcttca 540

ttcgtcgact cgcagggctc tttttgggtt tcgattactc acgtgtttgg ctccccttac 600

catcttctcg tatgctggag gagatttctg ctgatggtta ctcagacaga tccagcgttc 660

cggaattcta tgcgactaag cggtccatta atatagcgat ttccgaccat ttccgaagaa 720

tatgagttca gataaggggg ccttagagac atattctgtg tctaggcttt cgtcagagtg 780

aaagcaaact ctgcaaaccc ggtcgggatg ctggctaaaa gggacaagaa ggtttgtcaa 840

agcacccccg caccagttgg caactgtgaa gaacagtaga tagtcagtaa gccccagact 900

acacgaaaat ttctgggcat tatgctattt atggcaccgg cttatcacac cattccacta 960

ttacgagggt caataatctc tgccacagtg gcttggcaga tacgctggga ttatcatgct 1020

cgggtacagt tggacagtgc gcacgagaat ggcgcagtca ctcagcaacc tgaaacacca 1080

tagcataagt gtcttggatg tccatgatta gtaataggtg caatgcacca ccctttatgc 1140

gtgcaggggt aacttcatag cagttaatta agcttgtggc agccagtgca atataaacta 1200

atgtgatata taatcactgt atactttcct acaataacaa gattacactg tagaattata 1260

tagattcgat gcttatacaa tgagattgcc tggcactgaa gttctgtgag gtttctagaa 1320

attcaggcgc tatagggcgg attacattgg gccggatgag gttgcagtgc cagagaaatg 1380

ttaagtctgg ttccagtatc agtgagtccg cataattgtc agacagcttc actcaatttc 1440

ttctctacct gagcggtgtt ccatgggtca gttcatgtca tatcgtctag tggcacgtca 1500

tgacttcact aatggctggc tccgcgggca tatattccac ctcaatggaa aagagacttt 1560

ccattcggct acacgataga aattttacgt gacttcatac cacaacatag cagtctatga 1620

tgctctagat gccgtcactg gtgaagtcac agtgcatatt ccaatcgtcc atattaaccc 1680

ttaaacaaga ccagttgatc taaacttgtg gactagccgt agatctcacg tcctagccaa 1740

ctcccccgac ccgatagtat cgacaatgct ctcaactata acatctttcc tcatccttct 1800

gttctttgtt accacagtct ccgcctatcc cttcgaggag aactcctttc ctcgtctcca 1860

ggatacttta gccactggca ccaaacccgg tgaccccccc aaattcggtg gtgggtatga 1920

ccacgtcgta gtgggcggtg gcacaaccgg gctcctagta gccagtcggc tagcaaaggc 1980

aggaaactca gtcgccgtta tcgaaaacgg cacataccct actgggaatt tgactacagt 2040

gccagggtac aatgagcagt ggtttagcag ggtgttgccg tcgaattgga cggatatggt 2100

gaatgtgtgg cctactgtgc agcaggtggt atgttgccca gctctactcg ggggtgaata 2160

cttacgggcg ctaatcctgg ctttattgca gggaggggga gagcagcagc atatgatggg 2220

gagaatggta ggtagcttat tcctctactt tatcctgtag cctttgttat ggttatgtct 2280

gatagaattg cagatcggag ggagccaggg ctttaccttt gtcgattact tccgcactac 2340

taagggggct atgaaaagat gggctgacga aactggcgat gattcctgga cttgggagaa 2400

tgtccagcaa tactataaaa agtcattcaa attcacacca ccgaacaata ccgcaagacc 2460

atcgaatgcc acaccggact atgagtcaag tcaaatcgtt ggttctacgc ctgggccact 2520

agaactcacc ttccccaaat atgcccaggc atttggtagc tgggttaaac ttggtctcaa 2580

cgaattaaaa gctggtatca atcgagtctt tgtcgagggc gatatcaaag gtgccagttg 2640

gatcttaaat atgatcgatt cgcaaacggg caatcgcgcc acaacatata cagctttctt 2700

ggaaccaaca cagaaagatg acacgtcgaa gattgacgtg tatgtggaga cgctggccga 2760

gagaactttg tcaaacactc cccctggcag cgaccccgta accatcggag tcttagtgaa 2820

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catacttact cctcaatttc tcatggtgtc tggtatcggt cctcaggatc acctgcagga 2940

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ccagactaaa tcaggtaatt tgtggccttg tgtctctcgt ggttccgttg tgcctaataa 3240

tatgattcta gatctctccc aattcccctc tgactggcca gatatcggta tcgtatcttc 3300

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tcgaacgttg aatcaccaat ctgcatcgtg ccgaatggga aagcgagacg atcctatggc 3660

cgtggtggat agtaagggca aggtaatcgg agttgataga tgtgagtcct acctacttcg 3720

actctggact tgacgtttgg ttgctcctcc gtgttgtacg tacggaactg attgagaaac 3780

agtgagaatt gctgacccgt ccgcctggcc tttcttgcca gcgggatttc cgttaggcac 3840tgcctgtgag taatacccta ccattcccac agtcagtttt ggaatgatcg gtctaaccta 3900

ctcaaactgt agatatgttt gcggagaaga tagccgataa catcctcagt gatcatggaa 3960

gtgacaagga tgaggatgag gatgagctgc gagtggaact ctagagagag ggccctacgt 4020

ttctcaacgg aatgatgaag agtactcatt cgaacatgaa aaggcaacga cctactgtaa 4080

ttgcaacaga agtttttaat actgtctcag ataatgttaa tctactagat cgcactacag 4140

gaaaaatgac tgcaattggc ttgagcgaca atgatccgtt tctgaaggac tcccaatggc 4200

actctcgaac gggccattaa tcccaacgaa gggagcaaga agaaggtcag agcgaaggct 4260

actgagatct gaatatggaa ataacatata aattgattaa aagtataatt ctaatgtaga 4320

tgttccgttg ttgattattt tggcatcgag catattcccg ccaggggtaa tttagtatca 4380

gccacgctat ctaatcggta cacgccagtg acatcaaagt acttgccggc gaccgggcat 4440

acacaaatcg aatcaaagcc tatactagta ctctgcagcc ggcatctact atttccgata 4500

aaatcaacga atctgtttgc cagattccag gtaagcaatg attggcatca ctttatctgc 4560

tcccacacac tcccgccaca tgtctggcct gaagagaaga tcattgtcga aatcgtctct 4620

cggaggctaa atatcgaatt gccccacctt cccctcatct ggtgcagaaa gcgaacgtcg 4680

ttcatgatgg ttttcacatc aatcctctta aatcaaatca ggaatcattt ttcctcccat 4740

ggaaa 4745

Seqüência 4

4145

DNA

Aspergillus niger

<400> 004

cctagagtac acgatagtaa ttgaggaaga aatttatgcg taagttgtaa gagacaattg 60

aacctcgtga agttggaaga atgcgggttt cagttcgctg acaaccaaaa taattaatac 120

atgtcagcca agatagaatg actaaggaat aagcgcttgt atgttttgag actagtgatc 180

cagcattgag gcctgagggg aacagtcctg ttatcgacca ttcaatctca actcagcgac 240

tcttgggaat tgtcagttgc atattataca atccaggtag aatatctagt ttaacaatca 300

tgtgactcta tacccagttt atcagtaccc cacctggcaa tatactttat cgcaacgtaa 360

gaataggcat ttgctgggac tggacgcaga catagaggat accattgtta tgggaatctt 420

cacactgatt gataagagaa aatgcgaat-g gagcgcggcg atctttataa ctgtgggagc 480

tgatcatcac ggatatggtt aagtttgtcc ccgctcccca acactggcgg cgacccaaat 540

gatgattcgt ctttccgcac acctcagacc cgaatgagtc agactctctc gtggtaaatg 600

cttgatatca aattcctgac tcttggaccc tgactaggtc atttccagca agtggaaaag 660

ggcatagtcc cacagggctt cttctctaac tcagaagtat ctaactgctt taaatgagcc 720

atctttcgtt gatgctatct tcctttaaac tgatcgctat caattatata ggactaactg 780

gcattcggtc attatctgca atgtacctgt cgacttttct tactatctgc ttaggccctc 840

aggccgtagc agagatggca tcggcgacca tacaatcttg agcttgatat gcgacaccga 900

cgcaggcgca aaattcagga gagcaagagt tggcgggcca ggtcaaagaa taaagctgaa 960

cataatatgg atgagtcgtg gttttgctag ttctagtact attacgaggt gacatcgtgg 1020

ttaccatgtt tcggcttcct ctgtcagcac tgctgacgaa gaatgtatat catgtatcct 1080

taagccgtgc cctgtaggtt tgctgagtag gtcgtccctt gctccagtac catctgacat 1140

aagaataagc atctttgtct tttcttcttc ttcttctttt tatttttttt ttttctttat 1200

ttgctctttt cccctcgcag aaatagatgt gattgtcgag atacactgcg ctgtcacagt 1260

ttatggaata cattgtactg cctaggatag gagagatctt tacctttgaa tgcagccatg 1320

attcaactga taaagaaata caacattaca attcaaacaa ggctatgaga ggttggcaga 1380

tgctcattaa catgccgaga agcatagtat ctcatcggtc caatgatccg gtatgagctg 1440

atgtattctc agcagcagat ttgaattgca gctgacagca ttaaatatac tgtaagcgta 1500

cccatggcat cggtaatctc ccacgggctt ctaaaacacc tgagtaatgc tgaagaaaac 1560

ccactgaacc attagaaaca tgaagcaggg gggaaacacg tgcatcctcg gtcaatccca 1620

aagttgagac ttcgtttcga ggttccttgc agatccccct ccgcttagat gaaatgactg 1680

tctctgaaga gcgtccccca tccgaccgtt catttaacag tctgttttag ctcaaacgtg 1740

cgtgtcgatc ttaaatcgaa tacgcaaata cgcaaatact acacggaatg ttgcccgttt 1800

ttgaggatcg atcacaaccg attatacaaa atccattcag catggacccc ctgagcctgg 1860

catttaaggt aattaggatg ccttatttca ccacccacta cacggagcaa agcttttcgt 1920

atccaagatg atagctgctg ctcttcttct ggctgcagtg gcccctgtcc tggcagcccc 1980

aaacaccgac gcagtgtctg tttgccagca cctacacacg gtttaccccc agtacaccgt 2040ctgggacccc acaggcacct acgcaactga aacattctgg aatcagtctt actacaacaa 2100

tgcagtcaag gaatactgga acggcgtgaa tgctgacaac cgtccggcct gcgccttttt 2160

ccctgcaaac gcgcaacatg tctccgtcgc aattcagcag ctgaacaaat atcccactgc 2220

accctttgca ttgaaaggag gcggtcacaa tttcaatgtg ggactctcaa gtaccaacgg 2280

gggggtcctt atctcgttca atgagaacct gtcctcaacc acgcgtaact cagacggcca 2340

gactttcgac gtcggccctg gagcccgatg gggcgatgtc tacgctgtca cggagaagac 2400

gaaccaggtc gtcgtaggcg gccgattggc taatatcggc gtggcaggat tcacgattgg 2460

agggggattg tcatactact cagctcaata tgtactacct tgccctatcc ctcctccgcc 2520

ccctttcctc tacgtccagc actaacccaa ctcagggctt atcctgcgac aacgtggtca 2580

agttcgaagt agtcctagca aacggcacca tcgtcaacgc gaacagcacc tctaatccag 2640

acctctggtg ggccttgcgc ggcggcggca accgctatgg catcgttacc aagttcacat 2700

accagggtca cccactcggc gacaacgggc aagtctgggg cggcattcgc ttttacagcg 2760

ccgacaaacg ccagcaaatc tttgaagctc tctccaactt cacaagtgaa tacccggacg 2820

ccaaagccgc cgtcatccca accttcgact ttggcttgcc tggagcgata gtctccaacc 2880

cagccgtttt cttcttctac gatggagcga agcccagcac taacgccttc gtcggactcg 2940

acaacatcga agcccttatc gactctacta agaccaccac ctacaccgat ctaacgaacg 3000

aagcaggcgg agccaagatc tacggcatca acgctgccat tcgtgtcaac acattcccca 3060

acatgccgtc ccagcagatg acccaactgc ttgaaaacca ctggactacc taccagtcca 3120

tgatcaagaa cgattcctcc aagaacttgg acatccagat cggcacattt accccgcaac 3180

cgctatcagt gcgcattgct cgtgcttcca acaaggccgg cggtaatgct ctcggcctgg 3240

accctgcgaa cggtgatcgt gtctggattg agaatgactt gatctgggtt aatccggttt 3300

gcaatgatgc ttgtccggag tatctgcgcc aggtgggtga tactgtgaag gaggcattta 3360

ataacacgct gttgggaact aagccgacga attatcaatc gggtgatgtg gattggatct 3420

cgtacgtgtc ctccttccct tcatttctct cttcgtccag tgcagcacgc taacaattat 3480

gatagctcta atcctctctt catgaacgat gccgccgact accaagacgt atatggcagt 3540

tatgggccaa cgaataaggc gcgactggcg agcattgcta aggcgtatga tccgacgggt 3600

ttcatgttcc gtcagggcgg atggtccttt tgaacttgac tgtgcctgaa atggagcgca 3660

aagcatctac aatttgtttg ttgattattt atcgcgtatg atggtctatt cagggtgcaa 3720

ataccccaga tacctttagc tggataatgg aataagataa tgttaggatt acacattggt 3780

cttcagccta tccacctgat cttattgttc agtgatagct ccattgaagc ttgagctata 3840

tatcccccac gaggataggc tcgttttaca gctagtcaga tatcagacta caaactacaa 3900

gctcaaaata taccagtagt agtaacatac gatacaatac aataaaatct aaccgataac 3960

gctagaagag tataaccgac aaaacaaaaa gctcccctcc cctaagatat cctgctccat 4020

cctccccgat agaaaccact acaccccaca atccacacct agaagaacaa atcaaaaacg 4080

aaactgacaa ccgatatcca tacccagtat gaatcccagc ataattcttt tcaaagacat 4140

acacc 4145

Listagem 5

4641

DNA

Aspergillus niger<400> 005

gatcgaagaa taaaaaggcc aagaggcaac cgcaccacag gcatgggatt agggaagatg 60

acgaaatcat tccccttctc tctcgcgcgc ccgtataatc aggagagcat tgcggcaccg 120

gcgacaggta caaggccggg gcgtctgcag ttgactgatc aactttcgca gttgaaattg 180

gaaagttttc tgataagatg cggtgtttgc actgtttgtt tccccaccgt ctgccgctcg 240

gattgattcc gcgacggagc agctcaacac cgtatgaaca ccgtttacaa cactggaaat 300

atcccgatta agtctttaaa aagaggcttc gagaggatta cagataatta cagatgcccc 360

catattgaaa aaattttcag tcactttagt cttactgtca gctgaagctt tgcggcggta 420

acaacgacgg cgttgccagc aggacggtct gtatgtgcga ctaccatgag gagtataccg 480

gtttagcgcc gggaatccaa accaaggaca cagacaccta gaaaatcata cccgctacag 540

gtgctggggt ggcttgcaag ctcggataaa acgaagaatg gccgataagg ctgaattcaa 600

ccaggtctct ttctaggatt ggttggacga ttaccggcac aaaaaggtgt tgatgacaag 660

agtttcaatc tgcctcatcg aaggcagatc ccaacttttg cattggaatc tctgtacagg 720

tacgatgcca tatagacttc atccatgtta tgaattctaa tctcagccac tacgcctagt 780

ctatctcaag gaaaagtaca agtatattac tcaacaagct gggtaacacc atcgaaaaca 840ggatggacct gggaagggaa gggagtgatt cacctccata atcttttact acatcaagtt 900

gctactaaac caatcgatat gctcgactgc gcttgactgc taccgtcacg gatttacatc 960

tgcaatatgt cgccgaggta tctccggctt cgtgtctaat aggtggtaat ctattagcag 1020

ccttgctatc agcatccagc cacagaacac acggaaattt gccaaataag gccaattcgg 1080

gatagacagg ctagaacggt gattaattcc gagtccaaac accagattgg attaccaagt 1140

ggagaatcgt agaatgaagc ggttgggagc aaacagaaat gacggacctg atgagagggc 1200

gtgagctggc tgaacttcgg aggtgcgacg gtgatggtgg aacccgtgga ggggtatgaa 1260

tgcaggacga gacgaagcgc aagccaacac cttctttctg agtaaattgc catgaccctg 1320

tcaattccgt gattaggcaa gtgctttgcg ccttcattgg cccttatccc tgcatccgcg 1380

ggcattggta gggaacatct tcagttttgg gctctgtgtt taacctgcgt gcacacctta 1440

ctgtgccttg aagctactca ataagatttt ctcattttcg actcttttat gtcacagata 1500

ctggcaaggc ggctgtctag ttctccgggt tggtttcccg tccgctcgat tgacaacgct 1560

aaaatctagt acgctgccaa ctagctttcc cactatataa gggagctcca ctgcgaataa 1620

agtgtgcctg tcatcaagag acccactaac cgggccaccc aaccgtcaaa tcaagcctcg 1680

gtttgttatt agacaatctg gaccaccggt gcaatcgcca gtttgggctt gcagcatgtc 1740

ttactacgca gacggcaatt gatcgacacg ctcgtatagg gattcgcaca cgaacgcctt 1800

cgcttcatac tatctgctcc acagaataac tttaccctct ccgtctctgg ctaccccaat 1860

tcaatcgtgc catacgggtt gacttgcccc gtgtagccat gtacttacta cttacttcgt 1920

tgcgactcgg gaccactccg gctgtcaaag cacaggcaag gagtatccgc tatgaaaagg 1980

cgctaatcgt ggaagtcttc ccgcagcccg cttgatctag gggcttcggc atatattatg 2040

aagtgtagcc atctccaggg actctgctaa cggagaaatt ctatcagcgt tggactcgaa 2100

atgaaggtct ccagtgcggc agtccctgtt ctcagcattc tgcccgaggc cagcctcggg 2160

cttggctcta cgcaactttg tgtatgtggt tcatgttcag tacttagtcg gtgtactaat 2220

agccttgtca cctagtgcgc cgctctgcaa gcgacctccc tgcgtaatca agtcctttac 2280

cctaccagcg ctgcatacaa tgagtccgtg gcatcttact ttgcggtcaa tgttcagctc 2340

gaccctacgt gtattgtaca gccacactct acagaggatg tctcgctcat tgtctcgact 2400

ctgacccaaa ccggcgaaac acaatgccca tttgccgtgc gcagtggtgg tcataccacc 2460

tggcctggtg cagcggatat cggacagggt gttaccattg atttgtccat gatgaacagc 2520

accacatacc acaaggacaa aggcgttgca tctatccagc cgggtgcgcg ctggcaggcg 2580

gtctacaagg ctcttgatcc gtacggagtc acagtacctg gcggacgcgg cggaccagtt 2640

ggcgtgggtg ggttcttgat cggaggtaag attcagcgac agttcaaaca aaagtggttg 2700

catgtctaat gccctgatag gtggaaacac cttctacacc gctcgtgtag gcttcgcatg 2760

tgataatatc gagaactttg aagtcgttct tgccagtgga tcgatcgtca atgccaaccg 2820

gactagccat cctgatctgt acaaggcgct gaagggtggc tcgatcaact ttggagttgt 2880

tacaaagtat gacctcaaga cgttgcctca tgatatgctt tggggtggac tggtcgtcta 2940

tgataattca accaccgccc ggcagctctc ggccgctgtg aactttacca acaacatcca 3000

caatgaccca tacgcatcct ggattgggat gtgggaatac agctcgacaa cgggacagaa 3060

catcattgcc gatgccttgg aatacaccaa gcctgttgcc tttgctcctg cattccatga 3120

atttacgagt attccaaaca ccaccgacac gatgcgtttt gctacgattt acaacctgac 3180

acaagagctg gttcaggcgg cgggctaccg gtaagtctcc aatagatagc catcttcggt 3240

cctctttctt cttggaaggc agtcgatggt ggtgtttaag tctggttctc gttgttcggg 3300

gcgctaacaa ctcagtgatg ttttcaccac cggcacgtac aagaacgacg tcaaagtcct 3360

tcgcaaggcg atcgaccttc acaacaacaa cattgaaaag gccaaggctc atgtcaagag 3420

tgactactgg gccatggata ccatcatcca gccctggccc aagcttttcg ctcagcacag 3480

cgtggagaag ggtggcaacg ttctgggttt ggaacggttt gacgagaacc tgatccgtat 3540

gtaacccgac cttgtttcta gcgcagcact aatccgttta cagaaatact attcgactac 3600

tcctgggatg atgcaaggga cgacgatctc ttcatcggcc ttggccagtc gatcctggag 3660

gaggttggtg aatacgccaa atcgattggg gcgcacaatg agtacatcta tctcaattat 3720

gccgacaagt cgcagaaccc tctcaagggc tatggcgagg agaatgttga gttcatctcc 3780

cgcgtggcca agcagtacga tccagatgga gtgtttcagg tacaggttcc aggtggcttc 3840

aagatcagcc aggtttaagc accatcgagt ccaaaattta cgactagtcg aagtaatttt 3900

gtacagtaga ctacgaaaaa gaacagaata gattagacaa cacaagctcc accccctcat 3960

tttgccttgc taggctgcgc catttttgac acggaattag tgccttttta aatttgcggc 4020

gcagtcaacc cgcatcgcgg tggagccgat aatgaagcca gcacgagccg tttcaacgcg 4080

atccgaacta gcacggtcta atcgttcgcc tcttggggct ctaccaccga tcctttccac 4140

tcctcccgcc gtctctcggg cctctggacg gccaggcttt ggcccggacg acggctagac 4200

gcgatggcat attggacgct ccacaaggat gacactatcc atgcaccggg aaaattctta 4260agcttggttg gattgttatt gttaatcaca gtaatatacg gaatgtggta caatttgcca 4320

cggctaacaa aggatgcgca tatccttgtc atcttgggag agcgtgcata agctttcgat 4380

agcaccttcc gtgttggaat ccatcgaggg taatcaatac gcttttccat gaagagaaaa 4440

agcaagaaaa aaacaaaaaa tgaacaaatg caaattcttt ctccccatca tgtctgtgcc 4500

atcgactagg ccttcccatg cctcaggggc cacctcagag tataagctcc cttctggaac 4560

ccttctatgc tttatgacag cgtgaggctt cagtgagagg ctgttggcct tcgatgccac 4620

ttgaatatgg ccattactac a 4641

Listagem 6

3837

DNA

Aspergillus niger

<400> 006

aagacaatac ggagtacatt gacctttatt attacttgat actatcgaag gaagagaata 60

aatactactc cttctgaatg tgcatagggt tatgtatatg ctaaaagaca ggttatcact 120

agcgtgcatc gaatctgact gatcagttgc agttcctggt tgaacacgca catatttcct 180

tctaattgat tggatctatt cagcttcttc tatgcgaagg cggtccaaga ttgattggtc 240

tcggccactg ggtaagctaa ggctgtcact tcaggcaggg gtaggcctga gactgcagga 300

tggtggccag agccaatttc tgaaaccctg tagatccgca acatctccca aataaagcca 360

ttgtaatcac atggctcaat cttagaagga atacagtact acgaatggcg gttgattgca 420

agcttcattc tacctgctgc ggtgaacaac accccacaac aaccatctCg acaaataata 480

cgtcgtcatc aaaaaggaga agctaccaaa tcaggtcatc ttcggcgtat gagaatctga 540

caatgtcctc ttcagctgaa tgtcggccga ttgggttggg gggtgtggga ggcggatccc 600

aatacgagtc ccacccgtgc gtctaccaaa atggttcgct gatcctcgct cgctccatcg 660

tcagcgatgt gcttgtggac tatgtaatgc ccgacgaacg atgcaatggg taatttcagc 720

tccgccgcgt attttggata gacgatcaat ccaggtattg attaaatgtt cgcccgagcc 780

ccgatttaaa gcttcaaatg actcccaacc acaagcttgc gacaaccgga tgacttactg 840

aacttatcag ccagtattca atctgacggt caggatggtc aatcttgcct atattctggg 900

tgccgttgcg gttttttcaa catcgggaac cgctgcagac gtttctctat cttcctctgt 960

tgctgcttcc acgaccccat cagctgccgg ttctctttcc tcgctgggcc tttctctccc 1020

agccggcaat gtgctcgtcg ggaatgtggg gtacacctgc aatctgctga gtcgtacatt 1080

tccaaagaat gagaccttta ccgccagctc accctactat gaggctctaa ttgatgagac 1140

ctggtcaggg aacagccgcc tgaacgcgtc ctgcattgtg acgcccagat ctgctcagga 1200

ggtttcgctt gtcatccaaa tccttagtat tctggagacc aaattctcca ttcgctcggg 1260

tgggcacagt tccaatccag ggttcagttc gattggtagc aacggagtgc tagttgcgct 1320

tggaaggttg aacacactct cgatcagcgc ggaccggaag accctcactg ttggaccgçg 1380

caatcgctgg gaagccgtgt accaatatct ggagcagtac aatctgaccg tactcggggg 1440

gcgagagccc gttgtgggag ttggtggctt cgtcctgggg ggtaagccaa tgcttcctct 1500

atcatattct gggaaaataa acatgatact aattacaata ggtggtctta gtctcttcta 1560

taacaccaat ggtctggcca ttgacacggt cacccgattc caggtggtaa cccccaatgg 1620

gaccatcgtc aacgctaccc aaaccgagca tgccgatcta tacaaggggc tgaaaggagg 1680

tctgaacaac tttggtaggc ctaatactca cctcggtgac ctcttttatg tgactaatcg 1740

aacccaggca tcgtggtgga atacgacctc accaccaata ccggcatcga tgtctggttc 1800

gaggtcaaga actataccct cgctgagact cccgcactgc ttgctgccta cgcagcatat 1860

ctccaaaatg ccgatatccg cagcaatgtc gagattcaga cgaatccagc atatacacta 1920

gtcttctacg gatatctcga ccatgtgtca gcgccatccg cctttaatgc tttctcccaa 1980

gtcccgtcgg tctcgactgt ttatcctcct accaatgcct ccctaaatca agtcctcctc 2040

gacattggca atgccggtgt ggttggctca ttatatacct atagcatttc ttttgccttc 2100

aaggttacca gccccagctt tctccaggaa agcttcaagg cctaccttaa aactgccgca 2160

tcgctcctgc ctttgggcgt aatactcgag tacgtgcctc agggcatcat cccaaaccta 2220

gttaccaaaa gccagaccca gaatggtggt aatttgtttg gcctggaggc cacacctcaa 2280

gtttgtatgt atcccttgtg cccgatcaat tcccaatcta tctgaggaac gcagtactaa 2340

ctgaatactt ggacaggggg ggagatcttt gcccaattcc ccgccacggt tagtcagtca 2400

acggtagcca acgccgtgga atctcttcta gccaacctta cctcgagcgc ccagtctcag 2460

agtgttcatc ttccttacat tttcgccaat gatgctggcc ctaatcagca ggtcctgcga 2520

ggatatggtg aagacaatgt caagtatatt gccgccgttg ctgagaggta tgatccaagg 2580ggcgtgatgc agaagttgca gaatgatgcc tatttcgtgt cgaaagagtt gtaacgggtt 2640

atcactgtat caatatctcg tctattttcg ggatcgtctg tacctacagc atactctgta 2700

ataattttaa taaggggtga tccttctget tccataccac cggtcgtcac ttcttgggcg 2760

caaatgacga gggagacggg aggtttgacc tcagtctggg agtcagcaaa tactacaagt 2820

agtcatgcgt taatgtctca attatcgagc ctccatgttg ggttttaggt gacggtgaaa 2880

gctgatacac tgcaagacgc tgaaaggaca tgatgttaca atgatgctat gaaggtgggt 2940

gtgagtggtg gtactggatt acgcaaaaat atatattcag actatgaggc tcagggtcat 3000

tggcaggttt cacccatcga catatatttc tacgcccatc tatttgatgg cagagtctgc 3060

tgtaaacaaa agtttctttt gccttaagaa ggttcaatca gaaatttcca ggagttttat 3120

atattaagca gagcgaaatc aaatgtggaa aaaaaaagac aatcaaaaag gaatggggca 3180

agccgggctt gaaccggcca cctccagatc ttcagtctga cgcgctccca gatgcgccat 3240

tgccccggtg attacgtcat atgctacaca tagctatata aatattaaag ctactgatta 3300

atattttgct tgcttaacgc tctaaaggca gcatgaaacc taatattaac taactcgata 3360

ttatatacca ataattcatg aacctcaaaa atgtgcacta tgctatttac gctcaatgat 3420

tcaatgctat cacctctcct gctcaagccg cctgctgaac tccatggatg atattcatga 3480

actcgctgcc atatattgct cacccgatcc cgttgatttc gcgtgaacca caagtgtatg 3540

ctttcatgtc tgccttttaa taaatcaccc catactacct tcatgtaaaa gccgctccta 3600

tattttccat tgggtgaaat gatcgcacct cttcgtatag ttatggcccg cgggtctcct 3660

actcgactcg atgatctaac tccatattca tactacatag gctaccacat catcgctcac 3720

agctggaatt gacttgacaa atatccccat ctcggcagct ggccgtatag gactggcgat 3780

tatgtactta aattgagaaa gtaaatacaa ctagagagca cgctcactct aatccca 3837

Listagem 7

1713

DNA

Aspergillus niger<400> 007

atg aag gct tcc tgg tct ttt gea gea tct gtc gct gct CtC gcc tcc 48Met Lys Ala Ser Trp Ser Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Ala Ser 1 5 10 15 aag gcc gtc gct tct age gac tgc cac tgc ctg CCC ggc gat age tgc 96Lys Ala Val Ala Ser Ser Asp Cys His Cys Leu Pro Gly Asp Ser Cys 20 25 30 tgg CCC tcg acc tcc age tgg gac tcc CtC aac aac act gtg ggc ggt 144Trp Pro Ser Thr Ser Ser Trp Asp Ser Leu Asn Asn Thr Val Gly Gly 35 40 45 cgc ttg gtt gcg act gtt CCC att ggt act cct tgc cat gac cct aac 192Arg Leu Val Ala Thr Val Pro Ile Gly Thr Pro Cys His Asp Pro Asn 50 55 60 tac aat ggc gcc gag tgc acg aac ctg cag gat gac tgg tac tac ccg 240Tyr Asn Gly Ala Glu Cys Thr Asn Leu Gln Asp Asp Trp Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 cag act cac ttg gtc tct tct tca tct gtt atg caa ccg tac ttt gcc 288Gln Thr His Leu Val Ser Ser Ser Ser Val Met Gln Pro Tyr Phe Ala 85 90 95 aac cag age tgt gat cct ttc cag CCC gag tcc cgg CCC tgc ctg Ctt 336Asn Gln Ser Cys Asp Pro Phe Gln Pro Glu Ser Arg Pro Cys Leu Leu 100 105 110 ggc aac tac gtg age tac gcc gtc aac gtc tcc acg acc gat gat gtt 384Gly Asn Tyr Val Ser Tyr Ala Val Asn Val Ser Thr Thr Asp Asp Val 115 120 125 gtt gct gcg gtc aag ttc gcc cag gag aac aac ate cgt CtC gtg ate 432Val Ala Ala Val Lys Phe Ala Gln Glu Asn Asn Ile Arg Leu Val Ile

130 135 140

agg aac acc ggt cat gac tac ctt ggc cgt tcc acc ggt gct ggt gcc 480

Arg Asn Thr Gly His Asp Tyr Leu Gly Arg Ser Thr Gly Ala Gly Ala145 150 155 160

ctg gcc ate tgg act cac tac ctg aac gac gtc gaa ate aca gag tgg 528

Leu Ala Ile Trp Thr His Tyr Leu Asn Asp Val Glu Ile Thr Glu Trp

165 170 175

tcg gat tcc acc tac gcg ggt tcg gct gtc aag ctg ggc agt ggt gtc 576

Ser Asp Ser Thr Tyr Ala Gly Ser Ala Val Lys Leu Gly Ser Gly Val

180 185 190

acg ggc tac aat gtg ctc gat gct act cac gga aag gga att gtt gtc 624

Thr Gly Tyr Asn Val Leu Asp Ala Thr His Gly Lys Gly Ile Val Val

195 200 205

gtc ggc ggc gaa tgc cct act gtc ggc ctc gct ggt gga tac acc atg 672

Val Gly Gly Glu Cys Pro Thr Val Gly Leu Ala Gly Gly Tyr Thr Met

210 215 220

ggc ggc ggt cac tcc gcc ctg age act gcc ttc ggt ctg ggt gct gac 720

Gly Gly Gly His Ser Ala Leu Ser Thr Ala Phe Gly Leu Gly Ala Asp225 230 235 240

cag acc ctg tcc ttc gag gtt gtc acc gct tcg ggc gag gtc ate acg 768

Gln Thr Leu Ser Phe Glu Val Val Thr Ala Ser Gly Glu Val Ile Thr

245 250 255

gcc tcc cgg acc aac aac acc gat ctg tac tgg gcc ctc agt ggt ggt 816

Ala Ser Arg Thr Asn Asn Thr Asp Leu Tyr Trp Ala Leu Ser Gly Gly

260 265 270

ggt gcc ggt aac ttc ggt gtt gtc acc tet ctc acc gtc aag gcc cat 864

Gly Ala Gly Asn Phe Gly Val Val Thr Ser Leu Thr Val Lys Ala His

275 280 285

ccc gat gcc acc ate tcc ggt gct gcg ctc gaa ttc acc ate gcc aac 912

Pro Asp Ala Thr Ile Ser Gly Ala Ala Leu Glu Phe Thr Ile Ala Asn

290 295 300

ate acc tcc gat ctc ttc tac gag gct gtg gag cgc ttc cac acc ttg 960

Ile Thr Ser Asp Leu Phe Tyr Glu Ala Val Glu Arg Phe His Thr Leu305 310 315 320

ctg ccc gcc atg gtt gat gcc ggc acc acc gtc ate tat gag atg acc 1008

Leu Pro Ala Met Val Asp Ala Gly Thr Thr Val Ile Tyr Glu Met Thr

325 330 335

aac cag gtc ttc ctc ate aac ccc ttg acc gcc tac aac aag acc acc 1056

Asn Gln Val Phe Leu Ile Asn Pro Leu Thr Ala Tyr Asn Lys Thr Thr

340 345 350

gct gag gtc aag acc ate ttg tet ccc ttc ctc tet gct ctg acc gac 1104

Ala Glu Val Lys Thr Ile Leu Ser Pro Phe Leu Ser Ala Leu Thr Asp

355 360 365

ctg ggc ate gag tac acc gtc gct tac acc cag tac tcc tet tac tac 1152

Leu Gly Ile Glu Tyr Thr Val Ala Tyr Thr Gln Tyr Ser Ser Tyr Tyr

370 375 380

gac cac tac gag aag tac atg gga ccc ctc ccc tac ggc aac ctc gag 1200

Asp His Tyr Glu Lys Tyr Met Gly Pro Leu Pro Tyr Gly Asn Leu Glu385 390 395 400

gtc ggc cag tac aac tac ggc ggc cgc ctc ctc ccc cgt gac acc ctt 1248

Val Gly Gln Tyr Asn Tyr Gly Gly Arg Leu Leu Pro Arg Asp Thr Leu

405 410 415

acc tcg aac gcc gcc gat ctc gtc tcc gtc ctc cgc aac ate acc tcc 1296

Thr Ser Asn Ala Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Arg Asn Ile Thr Ser

420 425 430

gac ggt ctc ate gcc gtc ggc gtc ggc ctg aac gtc acc aac tcc aac 1344Asp Gly Leu 435 Ile Ala Val Gly Val 440 Gly Leu Asn Val Thr 445 Asn Ser Asn gac acc gcc aac gct gtc ttc cag ccc tgg cgt aac gcc gcc gtg acc 1392Asp Thr 450 Ala Asn Ala Val Phe 455 Gln Pro Trp Arg Asn 460 Ala Ala Val Thr atg cag ttc ggt tcc acc tgg aac gag act gcc cct tgg tcc gag atg 1440Met Gln Phe Gly Ser Thr Trp Asn Glu Thr Ala Pro Trp Ser Glu Met 465 470 475 480 gtc gcc gac cag ctg cgc att gcc cac gac tac att ccc cag ttc gag 1488Val Ala Asp Gln Leu 485 Arg Ile Ala His Asp 490 Tyr Ile Pro Gln Phe 495 Glu gcc gtg acc cct ggc tcg ggc gcc tac gag aac gag ggc age ttc cgt 1536Ala Val Thr Pro 500 Gly Ser Gly Ala Tyr 505 Glu Asn Glu Gly Ser 510 Phe Arg cag cag aac tgg cag aag gaa ttc ttc ggc gat aac tac gcc cag ctc 1584Gln Gln Asn Trp Gln Lys Glu Phe Phe Gly Asp Asn Tyr Ala Gln Leu 515 520 525 tgc gag gtc aag gag aag tat gat ccc gac cat gtc ttc tac gtc acc 1632Cys Glu 530 Val Lys Glu Lys Tyr 535 Asp Pro Asp His Val 540 Phe Tyr Val Thr aag ggt gcc ggt age gag tac tgg tet gtg gcc gag tcg ggt cgc atg 1680Lys Gly Ala Gly Ser Glu Tyr Trp Ser Val Ala Glu Ser Gly Arg Met 545 550 555 560 tgc aag acc cag cag gcg tgc gct gct gtt tga 1713Cys Lys Thr Gln Gln 565 Ala Cys Ala Ala Val 570

Seqüência 8

1503

DNA

Aspergillus niger

<221> CDS<222> (1) .. (1503)

<400> OOB

atg ttt cga ctc aag atgMet Phe Arg Leu Lys Met1 5

ttc gcc acg gtc tcg cagPhe Ala Thr Val Ser Gln20

gac ctc cag acc ctc tcgAsp Leu Gln Thr Leu Ser35

tat ccg ggc tcc agt ggaTyr Pro Gly Ser Ser Gly50

ctg gat gag cct gag gttLeu Asp Glu Pro Glu Val65 70

gat gtc gcc gaa att gtgAsp Val Ala Glu Ile Val85

cta acc tac aat ggt gtgLeu Thr Tyr Asn Gly Val

gag gtg ctc acg gcc ateGlu Val Leu Thr Ala Ile10

caa ate cct cgc tcc tccGln Ile Pro Arg Ser Ser25

ggt agg ctt tcc aat accGly Arg Leu Ser Asn Thr40

ttc aca aat gcc acc acgPhe Thr Asn Ala Thr Thr55 60

aat gtt gtc gtg gtc cctAsn Val Val Val Val Pro75

aaa ttt gcc aat cag aagLys Phe Ala Asn Gln Lys90

cac ggt gcc ctc ate tetHis Gly Ala Leu Ile Ser

gcg gcc tgg gea 48

Ala Ala Trp Ala15

age tgg gaa agt 96

Ser Trp Glu Ser30

tcc cag ate tat 144

Ser Gln Ile Tyr45

cgg tgg tcc gtc 192

Arg Trp Ser Val

ggc acc gaa aat 240

Gly Thr Glu Asn80

gat gtc ccc ttc 288

Asp Val Pro Phe95

ctg gga gaa atg 336

Leu Gly Glu Met100 105 110

acc cat ggt att gct ate tac atg ggc cag ttg agt agt gtc gag gtc 384

Thr His Gly Ile Ala Ile Tyr Met Gly Gln Leu Ser Ser Val Glu Val

115 120 125

gea gct gac ggc aag act gcc acg ate gga ggt gga acc atg tcc aag 432

Ala Ala Asp Gly Lys Thr Ala Thr Ile Gly Gly Gly Thr Met Ser Lys

130 135 140

gag gtc acc gac cag ctt tgg gcc gea gga aag cag acc gtg act gga 480

Glu Val Thr Asp Gln Leu Trp Ala Ala Gly Lys Gln Thr Val Thr Gly145 150 155 160

acc tgt gaa tgt gtc agt ctt gtc ggt cct gcg ctt ggt ggt ggc cat 528

Thr Cys Glu Cys Val Ser Leu Val Gly Pro Ala Leu Gly Gly Gly His

165 170 175

ggt tgg etc cag ggc cac cac ggc ctt gtt ctt gat cag ttt gtc tcg 576

Gly Trp Leu Gln Gly His His Gly Leu Val Leu Asp Gln Phe Val Ser

180 185 190

atg aac ate gtg ctg gcg aac ggc act ctg acc cac ate gac gcc aac 624

Met Asn Ile Val Leu Ala Asn Gly Thr Leu Thr His Ile Asp Ala Asn

195 200 205

tcg gac cte tgg tgg gcc gtc aag ggt gcc ggc cac aac ttt ggc ate 672

Ser Asp Leu Trp Trp Ala Val Lys Gly Ala Gly His Asn Phe Gly Ile

210 215 220

gtc act tcc ctc acc atg aag ate tat gac ate gag tac age gat tgg 720

Val Thr Ser Leu Thr Met Lys Ile Tyr Asp Ile Glu Tyr Ser Asp Trp225 230 235 240

gcc ate gag acg ctg acc ttc agt ggc gac aag gtt gcc gag gtc tac 768

Ala Ile Glu Thr Leu Thr Phe Ser Gly Asp Lys Val Ala Glu Val Tyr

245 250 255

cag gct gcc aat gac tac ctg gtc aag aac ggc acc cag gct gcc ggc 816

Gln Ala Ala Asn Asp Tyr Leu Val Lys Asn Gly Thr Gln Ala Ala Gly

260 265 270

gtg ate aac tgg tcg tac tgg atg aac aat gcg gat gcc gac ccc aac 864

Val Ile Asn Trp Ser Tyr Trp Met Asn Asn Ala Asp Ala Asp Pro Asn

275 280 285

aac ccg gtc ate ate ttc tac ate ate cag gag gga gtg aag acc gtc 912

Asn Pro Val Ile Ile Phe Tyr Ile Ile Gln Glu Gly Val Lys Thr Val

290 295 300

gat tcc gtc tac acc gcg cct ttc cgc aag ate ggt ccc att tet gtg 960

Asp Ser Val Tyr Thr Ala Pro Phe Arg Lys Ile Gly Pro Ile Ser Val305 310 315 320

tcc ccc aac aac ggc aca tac aag gat ctc gcc gea tgg act gag gtt 1008

Ser Pro Asn Asn Gly Thr Tyr Lys Asp Leu Ala Ala Trp Thr Glu Val

325 330 335

gct gtc gac tcc gcc ccc tgc cag aag atg ggt atg gcc aac ccc cgt 1056

Ala Val Asp Ser Ala Pro Cys Gln Lys Met Gly Met Ala Asn Pro Arg

340 345 350

tac ccg ate tac ctc gaa acg tac aac gtc act gcc cag cag aag gea 1104

Tyr Pro Ile Tyr Leu Glu Thr Tyr Asn Val Thr Ala Gln Gln Lys Ala

355 360 365

tgg gac gtc tac gcg aat gct acc cgt ggc ttt tcg gcg ttc aac aac 1152

Trp Asp Val Tyr Ala Asn Ala Thr Arg Gly Phe Ser Ala Phe Asn Asn

370 375 380

tcc ate ttc atg ttc gag gga tac tca gtt ggc ggc gtg cac gat gtt 1200

Ser Ile Phe Met Phe Glu Gly Tyr Ser Val Gly Gly Val His Asp Val385 390 395 400

gat age cgg tcg age gct ttt gcc ttc cgt aat gaa aac gtg ctg gct 1248

Asp Ser Arg Ser Ser Ala Phe Ala Phe Arg Asn Glu Asn Val Leu Ala405

gct ccc atg ate aacAla Pro Met Ile Asn420

ggg gct aac ttg ggtGly Ala Asn Leu Gly435

gac cac gag gat ateAsp His Glu Asp Ile450

act ccc cag cag ttgThr Pro Gln Gln Leu4 65

cgg tcc ctg aag gccArg Ser Leu Lys Ala485

gea cct att cct tgaAla Pro Ile Pro500

tac tac cct gatTyr Tyr Pro Asp425

cag gag ctg cgcGln Glu Leu Arg440

cgc gcg tat gtcArg Ala Tyr Val455

tat ggt age gagTyr Gly Ser Glu470

aag tat gac cctLys Tyr Asp Pro

410

ggc gcc gaa ctt gatGly Ala Glu Leu Asp430

aac att etc ttt gctAsn Ile Leu Phe Ala445

aac tat gcc cat ggtAsn Tyr Ala His Gly4 60

ggg tgg cgt cag cagGly Trp Arg Gln Gln475

acg ggc aag ttc ageThr Gly Lys Phe Ser490

415

cgc cgc 1296

Arg Arg

ggt act 1344

Gly Thr

gat gag 1392

Asp Glu

cgt ctg 1440

Arg Leu480

tac tac 1488

Tyr Tyr

495

1503

Sequêcia 9

1995

DNA

Aspergillus niger<221> CDS<222> (1)..(1995)

<400> 009

atg etc tca act ataMet Leu Ser Thr Ile1 5

aca gtc tcc gcc tatThr Val Ser Ala Tyr20

gat act tta gcc actAsp Thr Leu Ala Thr35

ggt ggg tat gac tacGly Gly Tyr Asp Tyr50

gta gcc agt cgg ctaVal Ala Ser Arg Leu65

aac ggc aca tac cctAsn Gly Thr Tyr Pro85

gag cag tgg ttt ageGlu Gln Trp Phe Ser100

aat gtg tgg cct actAsn Val Trp Pro Thr115

atg atg ggg aga atgMet Met Gly Arg Met130

aca tet ttc etcThr Ser Phe Leu

ccc ttc gag gagPro Phe Glu Glu25

ggc acc aaa cccGly Thr Lys Pro40

gtc gta gtg ggcVal Val Val Gly55

gea aag gea ggaAla Lys Ala Gly70

act ggg aat ttgThr Gly Asn Leu

agg gtg ttg ccgArg Val Leu Pro105

gtg cag cag gtgVal Gln Gln Val120

cct ttg tta tggPro Leu Leu Trp135

ate ctt ctg ttc tttIle Leu Leu Phe Phe10

aac tcc ttt cct cgtAsn Ser Phe Pro Arg30

ggt gac ccc ccc aaaGly Asp Pro Pro Lys45

ggt ggc aca acc gggGly Gly Thr Thr Gly60

aac tca gtc gcc gttAsn Ser Val Ala Val75

act aca gtg cca gggThr Thr Val Pro Gly90

tcg aat tgg acg gatSer Asn Trp Thr Asp110

gga ggg gga gag cagGly Gly Gly Glu Gln125

tta tgt ctg ata gaaLeu Cys Leu Ile Glu140

gtt acc 48

Val Thr15

ctc cag 96

Leu Gln

ttc ggt 144

Phe Gly

ctc cta 192

Leu Leu

ate gaa 240

Ile Glu80

tac aat 288

Tyr Asn95

atg gtg 336

Met Val

cag cat 384

Gln His

ttg cag 432

Leu Glnate gga ggg age cag ggc ttt acc ttt gtc gat tac ttc cgc act act 480

Ile Gly Gly Ser Gln Gly Phe Thr Phe Val Asp Tyr Phe Arg Thr Thr

145 150 155 160

aag ggg gct atg aaa aga tgg gct gac gaa act ggc gat gat tcc tgg 528

Lys Gly Ala Met Lys Arg Trp Ala Asp Glu Thr Gly Asp Asp Ser Trp

165 170 175

act tgg gag aat gtc cag caa tac tat aaa aag tca ttc aaa ttc aca 576

Thr Trp Glu Asn Val Gln Gln Tyr Tyr Lys Lys Ser Phe Lys Phe Thr

180 185 190

cca ccg aac aat acc gea aga cca tcg aat gcc aca ccg gac tat gag 624

Pro Pro Asn Asn Thr Ala Arg Pro Ser Asn Ala Thr Pro Asp Tyr Glu

195 200 205

tca agt caa ate gtt ggt tet acg cct ggg cca cta gaa ctc acc ttc 672

Ser Ser Gln Ile Val Gly Ser Thr Pro Gly Pro Leu Glu Leu Thr Phe

210 215 220

ccc aaa tat gcc cag gea ttt ggt age tgg gtt aaa ctt ggt ctc aac 720

Pro Lys Tyr Ala Gln Ala Phe Gly Ser Trp Val Lys Leu Gly Leu Asn225 230 235 240

gaa tta aaa gct ggt ate aat cga gtc ttt gtc gag ggc gat ate aaa 768

Glu Leu Lys Ala Gly Ile Asn Arg Val Phe Val Glu Gly Asp Ile Lys

245 250 255

ggt gcc agt tgg ate tta aat atg ate gat tcg caa acg ggc aat cgc 816

Gly Ala Ser Trp Ile Leu Asn Met Ile Asp Ser Gln Thr Gly Asn Arg

260 265 270

gcc aca aca tat aca gct ttc ttg gaa cca aca cag aaa gat gac acg 864

Ala Thr Thr Tyr Thr Ala Phe Leu Glu Pro Thr Gln Lys Asp Asp Thr

275 280 285

tcg aag att gac gtg tat gtg gag acg ctg gcc gag aga act ttg tca 912

Ser Lys Ile Asp Val Tyr Val Glu Thr Leu Ala Glu Arg Thr Leu Ser

290 295 300

aac act ccc cct ggc age gac ccc gta acc ate gga gtc tta gtg aaa 960

Asn Thr Pro Pro Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile Gly Val Leu Val Lys305 310 315 320

cgg tgg ggc atg aga ttt ccg ata ttc gea ggg aaa gaa gta ate cta 1003

Arg Trp Gly Met Arg Phe Pro Ile Phe Ala Gly Lys Glu Val Ile Leu

325 330 335

gct gga gga ccc ata ctt act cct caa ttt ctc atg gtg tet ggt ate 1056

Ala Gly Gly Pro Ile Leu Thr Pro Gln Phe Leu Met Val Ser Gly Ile

340 345 350

ggt cct cag gat cac ctg cag gag atg aac att aca gtc cta gct aat 1104

Gly Pro Gln Asp His Leu Gln Glu Met Asn Ile Thr Val Leu Ala Asn

355 360 365

aga ccg gga gtc ggc cag aac tac aac gat cat att ctc ttc ggc gtc 1152

Arg Pro Gly Val Gly Gln Asn Tyr Asn Asp His Ile Leu Phe Gly Val

370 375 380

aag cac gea gta caa gtg gag aca aca tcg gtg ctc ctc aac gat acc 1200

Lys His Ala Val Gln Val Glu Thr Thr Ser Val Leu Leu Asn Asp Thr385 390 395 400

agg aag tgg caa gag tgc gaa aga ttc aaa gct cac gea aat ggc atg 1248

Arg Lys Trp Gln Glu Cys Glu Arg Phe Lys Ala His Ala Asn Gly Met

405 410 415

ctg gcc gat ccg ggc ccg gat ttc gcc gcc ttt gtc gat tac ccg gaa 1296

Leu Ala Asp Pro Gly Pro Asp Phe Ala Ala Phe Val Asp Tyr Pro Glu

420 425 430

gat att cgc caa aac ctg tet gcc cag act aaa tca ggt aat ttg tgg 1344

Asp Ile Arg Gln Asn Leu Ser Ala Gln Thr Lys Ser Gly Asn Leu Trp435 440 445cct tgt gtc tct cgt ggt tcc gtt gtg cct aat aat atg att cta gat 1392

Pro Cys Val Ser Arg Gly Ser Val Val Pro Asn Asn Met Ile Leu Asp

450 455 460

ctc tcc caa ttc ccc tct gac tgg cca gat ate ggt ate gta tct tct 1440

Leu Ser Gln Phe Pro Ser Asp Trp Pro Asp Ile Gly Ile Val Ser Ser465 470 475 480

cca ctc ggc gtc aat ggc gac ggc aat cac aac tat gea gac ctc gtc 1488

Pro Leu Gly Val Asn Gly Asp Gly Asn His Asn Tyr Ala Asp Leu Val

485 490 495

tgc ate cct atg aag ccc ata tcc aag gga act att aaa ctc aga tct 1536

Cys Ile Pro Met Lys Pro Ile Ser Lys Gly Thr Ile Lys Leu Arg Ser

500 505 510

aag tcc atg gat gat aag cct gtg ctg gat ccg caa tgg ctt aaa tct 1584

Lys Ser Met Asp Asp Lys Pro Val Leu Asp Pro Gln Trp Leu Lys Ser

515 520 525

ccg aca gac atg gat act gcc gtc gcc ggt ctg cag tac ctt ctg cgc 1632

Pro Thr Asp Met Asp Thr Ala Val Ala Gly Leu Gln Tyr Leu Leu Arg

530 535 540

ctc tat gga acg aac age atg aag ccc ate tta aat gcc tcg ggt aaa 1680

Leu Tyr Gly Thr Asn Ser Met Lys Pro Ile Leu Asn Ala Ser Gly Lys545 550 555 560

cct ate gat cta gaa agt tct aac aag gac gac ctc att aag tat gtg 1728

Pro Ile Asp Leu Glu Ser Ser Asn Lys Asp Asp Leu Ile Lys Tyr Val

565 570 575

aaa aac aac tat cga acg ttg aat cac caa tct gea tcg tgc cga atg 1776

Lys Asn Asn Tyr Arg Thr Leu Asn His Gln Ser Ala Ser Cys Arg Met

580 585 590

gga aag cga gac gat cct atg gcc gtg gtg gat agt aag ggc aag gta 1824

Gly Lys Arg Asp Asp Pro Met Ala Val Val Asp Ser Lys Gly Lys Val

595 600 605

ate gga gtt gat aga ttg aga att gct gac ccg tcc gcc tgg cct ttc 1872

Ile Gly Val Asp Arg Leu Arg Ile Ala Asp Pro Ser Ala Trp Pro Phe

610 615 620

ttg cca gcg gga ttt ccg tta ggc act gcc tat atg ttt gcg gag aag 1920

Leu Pro Ala Gly Phe Pro Leu Gly Thr Ala Tyr Met Phe Ala Glu Lys625 630 635 640

ata gcc gat aac ate ctc agt gat cat gga agt gac aag gat gag gat 196B

Ile Ala Asp Asn Ile Leu Ser Asp His Gly Ser Asp Lys Asp Glu Asp

645 650 655

gag gat gag ctg cga gtg gaa ctc tag 1995

Glu Asp Glu Leu Arg Val Glu Leu660

Seqüência 10

1578

DNA

Aspergillus niger<221> CDS<222> (1) . . (1578)

<400> 010

atg ata gct gct gct ctt ctt ctg gct gea gtg gcc cct gtc ctg gea 48

Met Ile Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Val Ala Pro Val Leu Ala15 10 15

gcc cca aac acc gac gea gtg tct gtt tgc cag cac cta cac acg gtt 96Ala Pro Asn Thr Asp Ala Val Ser Val Cys Gln His Leu His Thr Val

20 25 30

tac ccc cag tac acc gtc tgg gac ccc aca ggc acc tac gca act gaa 144

Tyr Pro Gln Tyr Thr Val Trp Asp Pro Thr Gly Thr Tyr Ala Thr Glu

35 40 45

aca ttc tgg aat cag tct tac tac aac aat gca gtc aag gaa tac tgg 192

Thr Phe Trp Asn Gln Ser Tyr Tyr Asn Asn Ala Val Lys Glu Tyr Trp

50 55 60

aac ggc gtg aat gct gac aac cgt ccg gcc tgc gcc ttt ttc cct gca 240

Asn Gly Val Asn Ala Asp Asn Arg Pro Ala Cys Ala Phe Phe Pro Ala

65 70 75 80

aac gcg caa cat gtc tcc gtc gca att cag cag ctg aac aaa tat ccc 288

Asn Ala Gln His Val Ser Val Ala Ile Gln Gln Leu Asn Lys Tyr Pro

85 90 95

act gca ccc ttt gca ttg aaa gga ggc ggt cac aat ttc aat gtg gga 336

Thr Ala Pro Phe Ala Leu Lys Gly Gly Gly His Asn Phe Asn Val Gly

100 105 110

ctc tca agt acc aac ggg ggg gtc ctt ate tcg ttc aat gag aac ctg 384

Leu Ser Ser Thr Asn Gly Gly Val Leu Ile Ser Phe Asn Glu Asn Leu

115 120 125

tcc tca acc acg cgt aac tca gac ggc cag act ttc gac gtc ggc cct 432

Ser Ser Thr Thr Arg Asn Ser Asp Gly Gln Thr Phe Asp Val Gly Pro

130 135 140

gga gcc cga tgg ggc gat gtc tac gct gtc acg gag aag acg aac cag 480

Gly Ala Arg Trp Gly Asp Val Tyr Ala Val Thr Glu Lys Thr Asn Gln

145 150 155 160

gtc gtc gta ggc ggc cga ttg gct aat ate ggc gtg gca gga ttc acg 528

Val Val Val Gly Gly Arg Leu Ala Asn Ile Gly Val Ala Gly Phe Thr

165 170 175

att gga ggg gga ttg tca tac tac tca gct caa tat ggc tta tcc tgc 576

Ile Gly Gly Gly Leu Ser Tyr Tyr Ser Ala Gln Tyr Gly Leu Ser Cys

180 185 190

gac aac gtg gtc aag ttc gaa gta gtc cta gca aac ggc acc ate gtc 624

Asp Asn Val Val Lys Phe Glu Val Val Leu Ala Asn Gly Thr Ile Val

195 200 205

aac gcg aac age acc tct aat cca gac ctc tgg tgg gcc ttg cgc ggc 672

Asn Ala Asn Ser Thr Ser Asn Pro Asp Leu Trp Trp Ala Leu Arg Gly

210 215 220

ggc ggc aac cgc tat ggc ate gtt acc aag ttc aca tac cag ggt cac 720

Gly Gly Asn Arg Tyr Gly Ile Val Thr Lys Phe Thr Tyr Gln Gly His

225 230 235 240

cca ctc ggc gac aac ggg caa gtc tgg ggc ggc att cgc ttt tac age 768

Pro Leu Gly Asp Asn Gly Gln Val Trp Gly Gly Ile Arg Phe Tyr Ser

245 250 255

gcc gac aaa cgc cag caa ate ttt gaa gct ctc tcc aac ttc aca agt 816

Ala Asp Lys Arg Gln Gln Ile Phe Glu Ala Leu Ser Asn Phe Thr Ser

260 265 270

gaa tac ccg gac gcc aaa gcc gcc gtc ate cca acc ttc gac ttt ggc 864

Glu Tyr Pro Asp Ala Lys Ala Ala Val Ile Pro Thr Phe Asp Phe Gly

275 280 285

ttg cct gga gcg ata gtc tcc aac cca gcc gtt ttc ttc ttc tac gat 912

Leu Pro Gly Ala Ile Val Ser Asn Pro Ala Val Phe Phe Phe Tyr Asp

290 295 300

gga gcg aag ccc age act aac gcc ttc gtc gga ctc gac aac ate gaa 960

Gly Ala Lys Pro Ser Thr Asn Ala Phe Val Gly Leu Asp Asn Ile Glu

305 310 315 320

gcc ctt ate gac tct act aag acc acc acc tac acc gat cta acg aac 1008Ala Leu Ile Asp Ser Thr Lys Thr Thr Thr Tyr Thr Asp Leu Thr Asn

325 330 335

gaa gca ggc gga gcc aag ate tac ggc ate aac gct gcc att cgt gtc 1056

Glu Ala Gly Gly Ala Lys Ile Tyr Gly Ile Asn Ala Ala Ile Arg Val

340 345 350

aac aca ttc ccc aac atg ccg tcc cag cag atg acc caa ctg ctt gaa 1104

Asn Thr Phe Pro Asn Met Pro Ser Gln Gln Met Thr Gln Leu Leu Glu

355 360 365

aac cac tgg act acc tac cag tcc atg ate aag aac gat tcc tcc aag 1152

Asn His Trp Thr Thr Tyr Gln Ser Met Ile Lys Asn Asp Ser Ser Lys

370 375 380

aac ttg gac ate cag ate ggc aca ttt acc ccg caa ccg cta tca gtg 1200

Asn Leu Asp Ile Gln Ile Gly Thr Phe Thr Pro Gln Pro Leu Ser Val385 390 395 400

cgc att gct cgt gct tcc aac aag gcc ggc ggt aat gct etc ggc ctg 1248

Arg Ile Ala Arg Ala Ser Asn Lys Ala Gly Gly Asn Ala Leu Gly Leu

405 410 415

gac cct gcg aac ggt gat cgt gtc tgg att gag aat gac ttg ate tgg 1296

Asp Pro Ala Asn Gly Asp Arg Val Trp Ile Glu Asn Asp Leu Ile Trp

420 425 430

gtt aat ccg gtt tgc aat gat gct tgt ccg gag tat ctg cgc cag gtg 134Ί

Val Asn Pro Val Cys Asn Asp Ala Cys Pro Glu Tyr Leu Arg Gln Val

4 35 440 445

ggt gat act gtg aag gag gca ttt aat aac acg ctg ttg gga act aag 1392

Gly Asp Thr Val Lys Glu Ala Phe Asn Asn Thr Leu Leu Gly Thr Lys

450 455 460

ccg acg aat tat caa tcg ggt gat gtg gat tgg ate tcc tet aat cct 1440

Pro Thr Asn Tyr Gln Ser Gly Asp Val Asp Trp Ile Ser Ser Asn Pro465 470 475 480

ctc ttc atg aac gat gcc gcc gac tac caa gac gta tat ggc agt tat 1488

Leu Phe Met Asn Asp Ala Ala Asp Tyr Gln Asp Val Tyr Gly Ser Tyr

485 490 495

ggg cca acg aat aag gcg cga ctg gcg age att gct aag gcg tat gat 1536

Gly Pro Thr Asn Lys Ala Arg Leu Ala Ser Ile Ala Lys Ala Tyr Asp

500 505 510

ccg acg ggt ttc atg ttc cgt cag ggc gga tgg tcc ttt tga 1578

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Seqüência 11

1656

DNA

Aspergillus niger

<221> CDS<222> (1) . .(1656)

<400> 011

atg aag gtc tcc agt gcg gca gtc cct gtt ctc age att ctg ccc gag 48

Met Lys Val Ser Ser Ala Ala Val Pro Val Leu Ser Ile Leu Pro Glu15 10 15

gcc age ctc ggg ctt ggc tet acg caa ett tgt tgc gcc gct ctg caa 96

Ala Ser Leu Gly Leu Gly Ser Thr Gln Leu Cys Cys Ala Ala Leu Gln

20 25 30

gcg acc tcc ctg cgt aat caa gtc ctt tac cct acc age gct gca tac 144

Ala Thr Ser Leu Arg Asn Gln Val Leu Tyr Pro Thr Ser Ala Ala Tyr35 40 45

aat gag tcc gtg gca tct tac ttt gcg gtc aat gtt cag ctc gac cct 192

Asn Glu Ser Val Ala Ser Tyr Phe Ala Val Asn Val Gln Leu Asp Pro

50 55 60

acg tgt att gta cag cca cac tct aca gag gat gtc tcg ctc att gtc 240

Thr Cys Ile Val Gln Pro His Ser Thr Glu Asp Val Ser Leu Ile Val65 70 75 80

tcg act ctg acc caa acc ggc gaa aca caa tgc cca ttt gcc gtg cgc 288

Ser Thr Leu Thr Gln Thr Gly Glu Thr Gln Cys Pro Phe Ala Val Arg

85 90 95

agt ggt ggt cat acc acc tgg cct ggt gca gcg gat ate gga cag ggt 336

Ser Gly Gly His Thr Thr Trp Pro Gly Ala Ala Asp Ile Gly Gln Gly

100 105 110

gtt acc att gat ttg tcc atg atg aac age acc aca tac cac aag gac 384

Val Thr Ile Asp Leu Ser Met Met Asn Ser Thr Thr Tyr His Lys Asp

115 120 125

aaa ggc gtt gca tct ate cag ccg ggt gcg cgc tgg cag gcg gtc tac 432

Lys Gly Val Ala Ser Ile Gln Pro Gly Ala Arg Trp Gln Ala Val Tyr

130 135 140

aag gct ctt gat ccg tac gga gtc aca gta cct ggc gga cgc ggc gga 480

Lys Ala Leu Asp Pro Tyr Gly Val Thr Val Pro Gly Gly Arg Gly Gly145 150 155 160

cca gtt ggc gtg ggt ggg ttc ttg ate gga ggt gga aac acc ttc tac 528

Pro Val Gly Val Gly Gly Phe Leu Ile Gly Gly Gly Asn Thr Phe Tyr

165 170 175

acc gct cgt gta ggc ttc gca tgt gat aat ate gag aac ttt gaa gtc 576

Thr Ala Arg Val Gly Phe Ala Cys Asp Asn Ile Glu Asn Phe Glu Val

180 185 190

gtt ctt gcc agt gga tcg ate gtc aat gcc aac cgg act age cat cct 624

Val Leu Ala Ser Gly Ser Ile Val Asn Ala Asn Arg Thr Ser His Pro

195 200 205

gat ctg tac aag gcg ctg aag ggt ggc tcg ate aac ttt gga gtt gtt 672

Asp Leu Tyr Lys Ala Leu Lys Gly Gly Ser Ile Asn Phe Gly Val Val

210 215 220

aca aag tat gac ctc aag acg ttg cct cat gat atg ctt tgg ggt gga 720

Thr Lys Tyr Asp Leu Lys Thr Leu Pro His Asp Met Leu Trp Gly Gly225 230 235 240

ctg gtc gtc tat gat aat tca acc acc gcc cgg cag ctc tcg gcc gct 768

Leu Val Val Tyr Asp Asn Ser Thr Thr Ala Arg Gln Leu Ser Ala Ala

245 250 255

gtg aac ttt acc aac aac ate cac aat gac cca tac gca tcc tgg att 816

Val Asn Phe Thr Asn Asn Ile His Asn Asp Pro Tyr Ala Ser Trp Ile

260 265 270

ggg atg tgg gaa tac age tcg aca acg gga cag aac ate att gcc gat 864

Gly Met Trp Glu Tyr Ser Ser Thr Thr Gly Gln Asn Ile Ile Ala Asp

275 280 285

gcc ttg gaa tac acc aag cct gtt gcc ttt gct cct gca ttc cat gaa 912

Ala Leu Glu Tyr Thr Lys Pro Val Ala Phe Ala Pro Ala Phe His Glu

290 295 300

ttt acg agt att cca aac acc acc gac acg atg cgt ttt gct acg att 960

Phe Thr Ser Ile Pro Asn Thr Thr Asp Thr Met Arg Phe Ala Thr Ile305 310 315 320

tac aac ctg aca caa gag ctg gtt cag gcg gcg ggc tac cgt gat gtt 1008

Tyr Asn Leu Thr Gln Glu Leu Val Gln Ala Ala Gly Tyr Arg Asp Val

325 330 335

ttc acc acc ggc acg tac aag aac gac gtc aaa gtc ctt cgc aag gcg 1056

Phe Thr Thr Gly Thr Tyr Lys Asn Asp Val Lys Val Leu Arg Lys Ala340

ate gac ctt cac aacIle Asp Leu His Asn355

agt gac tac tgg gccSer Asp Tyr Trp Ala370

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cgg ttt gac gag aacArg Phe Asp Glu Asn405

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ate tat etc aat tatIle Tyr Leu Asn Tyr450

ggc gag gag aat gttGly Glu Glu Asn Val465

cca gat gga gtg tttPro Asp Gly Val Phe485

cgc ate gcg gtg gagArg Ile Ala Val Glu500

cga tcc gaa cta geaArg Ser Glu Leu Ala515

ccg ate ctt tcc actPro Ile Leu Ser Thr530

ggc ttt ggc ccg gacGly Phe Gly Pro Asp545

345

aac aac att gaaAsn Asn Ile Glu360

atg gat acc ateMet Asp Thr Ile375

gtg gag aag ggtVal Glu Lys Gly390

ctg ate caa ataLeu Ile Gln Ile

gat etc ttc ateAsp Leu Phe Ile425

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gcc gac aag tcgAla Asp Lys Ser455

gag ttc ate tccGlu Phe Ile Ser470

cag tgc ctt tttGln Cys Leu Phe

ccg ata atg aagPro Ile Met Lys505

cgg tet aat cgtArg Ser Asn Arg520

cct ccc gcc gtcPro Pro Ala Val

535gac ggc tagAsp Gly550

350

aag gcc aag gct catLys Ala Lys Ala His 365 ate cag ccc tgg cccIle Gln Pro Trp Pro 380 ggc aac gtt ctg ggtGly Asn Val Leu Gly 395 cta ttc gac tac tccLeu Phe Asp Tyr Ser410 ggc ctt ggc cag tcgGly Leu Gly Gln Ser 430att ggg gcg cac aatIle Gly Ala His Asn 445 cag aac cct CtC aagGln Asn Pro Leu Lys 4 60 cgc gtg gcc aag cagArg Val Ala Lys Gln 475 aaa ttt gcg gcg cagLys Phe Ala Ala Gln490 cca gea cga gcc gttPro Ala Arg Ala Val 510tcg cct ctt ggg gctSer Pro Leu Gly Ala 525 tet cgg gcc tet ggaSer Arg Ala Ser Gly 540

gtc aag 1104

Val Lys

aag ctt 1152

Lys Leu

ttg gaa 1200

Leu Glu400

tgg gat 1248

Trp Asp

415

ate ctg 1296

Ile Leu

gag tac 1344

Glu Tyr

ggc tat 1392

Gly Tyr

tac gat 1440

Tyr Asp480

tca acc 1488

Ser Thr

495

tca acg 1536

Ser Thr

cta cca 1584

Leu Pro

cgg cca 1632

Arg Pro

1656

Seqüência 121662DNA

Aspergillus niger<221> CDS<222> (1)..(1662)

<400> 012

atg gtc aat ctt gcc tat att ctg ggt gcc gtt gcg gtt ttt tca aca 48

Met Val Asn Leu Ala Tyr Ile Leu Gly Ala Val Ala Val Phe Ser Thr

1 5 10 15

tcg gga acc gct gea gac gtt tet cta tet tcc tet gtt gct gct tcc 96

Ser Gly Thr Ala Ala Asp Val Ser Leu Ser Ser Ser Val Ala Ala Ser20 25 30acg acc cca tca gct gcc ggt tct ctt tcc tcg ctg ggc ctt tct ctc 144

Thr Thr Pro Ser Ala Ala Gly Ser Leu Ser Ser Leu Gly Leu Ser Leu

35 40 45

cca gcc ggc aat gtg ctc gtc ggg aat gtg ggg tac acc tgc aat ctg 192

Pro Ala Gly Asn Val Leu Val Gly Asn Val Gly Tyr Thr Cys Asn Leu

50 55 60

ctg agt cgt aca ttt cca aag aat gag acc ttt acc gcc age tca cccLeu Ser Arg Thr Phe Pro Lys Asn Glu Thr Phe Thr Ala Ser Ser Pro65 70 75 80

tac tat gag gct cta att gat gag acc tgg tca ggg aac age cgc ctg 288

Tyr Tyr Glu Ala Leu Ile Asp Glu Thr Trp Ser Gly Asn Ser Arg Leu

85 90 95

aac gcg tcc tgc att gtg acg ccc aga tct gct cag gag gtt tcg ctt 336

Asn Ala Ser Cys Ile Val Thr Pro Arg Ser Ala Gln Glu Val Ser Leu

100 105 110

gtc ate caa ate ctt agt att ctg gag acc aaa ttc tcc att cgc tcg 384

Val Ile Gln Ile Leu Ser Ile Leu Glu Thr Lys Phe Ser Ile Arg Ser

115 120 125

ggt ggg cac agt tcc aat cca ggg ttc agt tcg att ggt age aac gga 432

Gly Gly His Ser Ser Asn Pro Gly Phe Ser Ser Ile Gly Ser Asn Gly

130 135 140

gtg cta gtt gcg ctt gga agg ttg aac aca ctc tcg ate age gcg gac 480

Val Leu Val Ala Leu Gly Arg Leu Asn Thr Leu Ser Ile Ser Ala Asp145 150 155 160

cgg aag acc ctc act gtt gga ccg ggc aat cgc tgg gaa gcc gtg tac 528

Arg Lys Thr Leu Thr Val Gly Pro Gly Asn Arg Trp Glu Ala Val Tyr

165 170 175

caa tat ctg gag cag tac aat ctg acc gta ctc ggg ggg cga gag ccc 576

Gln Tyr Leu Glu Gln Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Gly Arg Glu Pro

180 185 190

gtt gtg gga gtt ggt ggc ttc gtc ctg ggg ggt ggt ctt agt ctc ttc 624

Val Val Gly Val Gly Gly Phe Val Leu Gly Gly Gly Leu Ser Leu Phe

195 200 205

tat aac acc aat ggt ctg gcc att gac acg gtc acc cga ttc cag gtg 672

Tyr Asn Thr Asn Gly Leu Ala Ile Asp Thr Val Thr Arg Phe Gln Val

210 215 220

gta acc ccc aat ggg acc ate gtc aac gct acc caa acc gag cat gcc 720

Val Thr Pro Asn Gly Thr Ile Val Asn Ala Thr Gln Thr Glu His Ala225 230 235 240

gat cta tac aag ggg ctg aaa gga ggt ctg aac aac ttt ggc ate gtg 768

Asp Leu Tyr Lys Gly Leu Lys Gly Gly Leu Asn Asn Phe Gly Ile Val

245 250 255

gtg gaa tac gac ctc acc acc aat acc ggc ate gat gtc tgg ttc gag 816

Val Glu Tyr Asp Leu Thr Thr Asn Thr Gly Ile Asp Val Trp Phe Glu

260 265 270

gtc aag aac tat acc ctc gct gag act ccc gea ctg ctt gct gcc tac 864

Val Lys Asn Tyr Thr Leu Ala Glu Thr Pro Ala Leu Leu Ala Ala Tyr

275 280 285

gea gea tat ctc caa aat gcc gat ate cgc age aat gtc gag att cag 912

Ala Ala Tyr Leu Gln Asn Ala Asp Ile Arg Ser Asn Val Glu Ile Gln

290 295 300

acg aat cca gea tat aca cta gtc ttc tac gga tat ctc gac cat gtg 960

Thr Asn Pro Ala Tyr Thr Leu Val Phe Tyr Gly Tyr Leu Asp His Val305 310 315 320

tca gcg cca tcc gcc ttt aat gct ttc tcc caa gtc ccg tcg gtc tcg 1008

Ser Ala Pro Ser Ala Phe Asn Ala Phe Ser Gln Val Pro Ser Val Ser325 330 335act gtt tat cct cct acc aat gcc tcc cta aat caa gtc ctc ctc gac 1056

Thr Val Tyr Pro Pro Thr Asn Ala Ser Leu Asn Gln Val Leu Leu Asp

340 345 350

att ggc aat gcc ggt gtg gtt ggc tca tta tat acc tat age att tet 1104

Ile Gly Asn Ala Gly Val Val Gly Ser Leu Tyr Thr Tyr Ser Ile Ser

355 360 365

ttt gcc ttc aag gtt acc age ccc age ttt ctc cag gaa age ttc aag 1152

Phe Ala Phe Lys Val Thr Ser Pro Ser Phe Leu Gln Glu Ser Phe Lys

370 375 380

gcc tac ctt aaa act gcc gea tcg ctc ctg cct ttg ggc gta ata ctc 1200

Ala Tyr Leu Lys Thr Ala Ala Ser Leu Leu Pro Leu Gly Val Ile Leu

385 390 395 400

gag tac gtg cct cag ggc ate ate cca aac cta gtt acc aaa age cag 1248

Glu Tyr Val Pro Gln Gly Ile Ile Pro Asn Leu Val Thr Lys Ser Gln

405 410 415

acc cag aat ggt ggt aat ttg ttt ggc ctg gag gcc aca cct caa gtt 1296

Thr Gln Asn Gly Gly Asn Leu Phe Gly Leu Glu Ala Thr Pro Gln Val

420 425 430

tgg ggg gag ate ttt gcc caa ttc ccc gcc acg gtt agt cag tca acg 1344

Trp Gly Glu Ile Phe Ala Gln Phe Pro Ala Thr Val Ser Gln Ser Thr

435 440 445

gta gcc aac gcc gtg gaa tet ctt cta gcc aac ctt acc tcg age gcc 1392

Val Ala Asn Ala Val Glu Ser Leu Leu Ala Asn Leu Thr Ser Ser Ala

450 455 460

cag tet cag agt gtt cat ctt cct tac att ttc gcc aat gat gct ggc 1440

Gln Ser Gln Ser Val His Leu Pro Tyr Ile Phe Ala Asn Asp Ala Gly

465 470 475 480

cct aat cag cag gtc ctg cga gga tat ggt gaa gac aat gtc aag tat 1488

Pro Asn Gln Gln Val Leu Arg Gly Tyr Gly Glu Asp Asn Val Lys Tyr

485 490 495

att gcc gcc gtt gct gag agg ggt gat cct tet gct tcc ata cca ccg 1536

Ile Ala Ala Val Ala Glu Arg Gly Asp Pro Ser Ala Ser Ile Pro Pro

500 505 510

gtc gtc act tet tgg gcg caa atg acg agg gag acg gga ggt ttg acc 1584

Val Val Thr Ser Trp Ala Gln Met Thr Arg Glu Thr Gly Gly Leu Thr

515 520 525

tca gtc tgg gag tca gea aat act aca agt agt cat gcg tta atg tet 1632

Ser Val Trp Glu Ser Ala Asn Thr Thr Ser Ser His Ala Leu Met Ser

530 535 540

caa tta tcg age ctc cat gtt ggg ttt tag 1662

Gln Leu Ser Ser Leu His Val Gly Phe545 550

Seqüência 13

570

DNA

Aspergillus niger<400> 013

Met Lys Ala Ser Trp Ser Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Ala Ser15 10 15

Lys Ala Val Ala Ser Ser Asp Cys His Cys Leu Pro Gly Asp Ser Cys

20 25 30

Trp Pro Ser Thr Ser Ser Trp Asp Ser Leu Asn Asn Thr Val Gly Gly

35 40 45

Arg Leu Val Ala Thr Val Pro Ile Gly Thr Pro Cys His Asp Pro Asn50 55 60Tyr Asn Gly Ala Glu Cys Thr Asn Leu Gln Asp Asp Trp Tyr Tyr Pro65 70 75 80Gln Thr His Leu Val Ser Ser Ser Ser Val Met Gln Pro Tyr Phe Ala 85 90 95 Asn Gln Ser Cys Asp Pro Phe Gln Pro Glu Ser Arg Pro Cys Leu Leu 100 105 110 Gly Asn Tyr Val Ser Tyr Ala Val Asn Val Ser Thr Thr Asp Asp Val 115 120 125 Val Ala Ala Val Lys Phe Ala Gln Glu Asn Asn Ile Arg Leu Val Ile 130 135 140 Arg Asn Thr Gly His Asp Tyr Leu Gly Arg Ser Thr Gly Ala Gly Ala14 5 150 155 160Leu Ala Ile Trp Thr His Tyr Leu Asn Asp Val Glu Ile Thr Glu Trp 165 170 175 Ser Asp Ser Thr Tyr Ala Gly Ser Ala Val Lys Leu Gly Ser Gly Val 180 185 190 Thr Gly Tyr Asn Val Leu Asp Ala Thr His Gly Lys Gly Ile Val Val 195 200 205 Val Gly Gly Glu Cys Pro Thr Val Gly Leu Ala Gly Gly Tyr Thr Met 210 215 220 Gly Gly Gly His Ser Ala Leu Ser Thr Ala Phe Gly Leu Gly Ala Asp225 230 235 240Gln Thr Leu Ser Phe Glu Val Val Thr Ala Ser Gly Glu Val Ile Thr 245 250 255 Ala Ser Arg Thr Asn Asn Thr Asp Leu Tyr Trp Ala Leu Ser Gly Gly 260 265 270 Gly Ala Gly Asn Phe Gly Val Val Thr Ser Leu Thr Val Lys Ala His 275 280 285 Pro Asp Ala Thr Ile Ser Gly Ala Ala Leu Glu Phe Thr Ile Ala Asn 290 295 300 Ile Thr Ser Asp Leu Phe Tyr Glu Ala Val Glu Arg Phe His Thr Leu305 310 315 320Leu Pro Ala Met Val Asp Ala Gly Thr Thr Val Ile Tyr Glu Met Thr 325 330 335 Asn Gln Val Phe Leu Ile Asn Pro Leu Thr Ala Tyr Asn Lys Thr Thr 340 345 350 Ala Glu Val Lys Thr Ile Leu Ser Pro Phe Leu Ser Ala Leu Thr Asp 355 360 365 Leu Gly Ile Glu Tyr Thr Val Ala Tyr Thr Gln Tyr Ser Ser Tyr Tyr 370 375 380 Asp His Tyr Glu Lys Tyr Met Gly Pro Leu Pro Tyr Gly Asn Leu Glu385 390 395 400Val Gly Gln Tyr Asn Tyr Gly Gly Arg Leu Leu Pro Arg Asp Thr Leu 405 410 415 Thr Ser Asn Ala Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Arg Asn Ile Thr Ser 420 425 430 Asp Gly Leu Ile Ala Val Gly Val Gly Leu Asn Val Thr Asn Ser Asn 435 440 445 Asp Thr Ala Asn Ala Val Phe Gln Pro Trp Arg Asn Ala Ala Val Thr 450 455 460 Met Gln Phe Gly Ser Thr Trp Asn Glu Thr Ala Pro Trp Ser Glu Met465 470 475 480Val Ala Asp Gln Leu Arg Ile Ala His Asp Tyr Ile Pro Gln Phe Glu 485 490 495 Ala Val Thr Pro Gly Ser Gly Ala Tyr Glu Asn Glu Gly Ser Phe Arg 500 505 510 Gln Gln Asn Trp Gln Lys Glu Phe Phe Gly Asp Asn Tyr Ala Gln Leu515 520 525

Cys Glu Val Lys Glu Lys Tyr Asp Pro Asp His Val Phe Tyr Val Thr

530 535 540

Lys Gly Ala Gly Ser Glu Tyr Trp Ser Val Ala Glu Ser Gly Arg Met545 550 555 560

Cys Lys Thr Gln Gln Ala Cys Ala Ala Val

565 570

Seqüencia 14

500

DNA

Asperaillus nicrer<400> 014

Met Phe Arg Leu Lys Met Glu Val Leu Thr Ala Ile Ala Ala Trp Ala1 5 10 15 Phe Ala Thr Val Ser Gln Gln Ile Pro Arg Ser Ser Ser Trp Glu Ser 20 25 30 Asp Leu Gln Thr Leu Ser Gly Arg Leu Ser Asn Thr Ser Gln Ile Tyr 35 40 45 Tyr Pro Gly Ser Ser Gly Phe Thr Asn Ala Thr Thr Arg Trp Ser Val 50 55 60 Leu Asp Glu Pro Glu Val Asn Val Val Val Val Pro Gly Thr Glu Asn65 70 75 80Asp Val Ala Glu Ile Val Lys Phe Ala Asn Gln Lys Asp Val Pro Phe 85 90 95 Leu Thr Tyr Asn Gly Val His Gly Ala Leu Ile Ser Leu Gly Glu Met 100 105 110 Thr His Gly Ile Ala Ile Tyr Met Gly Gln Leu Ser Ser Val Glu Val 115 120 125 Ala Ala Asp Gly Lys Thr Ala Thr Ile Gly Gly Gly Thr Met Ser Lys 130 135 140 Glu Val Thr Asp Gln Leu Trp Ala Ala Gly Lys Gln Thr Val Thr Gly145 150 155 160Thr Cys Glu Cys Val Ser Leu Val Gly Pro Ala Leu Gly Gly Gly His 165 170 175 Gly Trp Leu Gln Gly His His Gly Leu Val Leu Asp Gln Phe Val Ser 180 185 190 Met Asn Ile Val Leu Ala Asn Gly Thr Leu Thr His Ile Asp Ala Asn 195 200 205 Ser Asp Leu Trp Trp Ala Val Lys Gly Ala Gly His Asn Phe Gly Ile 210 215 220 Val Thr Ser Leu Thr Met Lys Ile Tyr Asp Ile Glu Tyr Ser Asp Trp22b 230 235 240Ala Ile Glu Thr Leu Thr Phe Ser Gly Asp Lys Val Ala Glu Val Tyr 245 250 255 Gln Ala Ala Asn Asp Tyr Leu Val Lys Asn Gly Thr Gln Ala Ala Gly 260 265 270 Val Ile Asn Trp Ser Tyr Trp Met Asn Asn Ala Asp Ala Asp Pro Asn 275 280 285 Asn Pro Val Ile Ile Phe Tyr Ile Ile Gln Glu Gly Val Lys Thr Val 290 295 300 Asp Ser Val Tyr Thr Ala Pro Phe Arg Lys Ile Gly Pro Ile Ser Val305 310 315 320Ser Pro Asn Asn Gly Thr Tyr Lys Asp Leu Ala Ala Trp Thr Glu Val 325 330 335 Ala Val Asp Ser Ala Pro Cys Gln Lys Met Gly Met Ala Asn Pro Arg340 345 350 Tyr Pro Ile Tyr Leu Glu Thr Tyr Asn Val Thr Ala Gln Gln Lys Ala 355 360 365 Trp Asp 370 Val Tyr Ala Asn Ala 375 Thr Arg Gly Phe Ser 380 Ala Phe Asn AsnSer Ile Phe Met Phe Glu Gly Tyr Ser Val Gly Gly Val His Asp Val385 390 395 400Asp Ser Arg Ser Ser Ala Phe Ala Phe Arg Asn Glu Asn Val Leu Ala 405 410 415 Ala Pro Met Ile 420 Asn Tyr Tyr Pro Asp 425 Gly Ala Glu Leu Asp 430 Arg ArgGly Ala Asn 435 Leu Gly Gln Glu Leu 440 Arg Asn Ile Leu Phe 445 Ala Gly ThrAsp His 450 Glu Asp Ile Arg Ala 455 Tyr Val Asn Tyr Ala 460 His Gly Asp GluThr Pro Gln Gln Leu Tyr Gly Ser Glu Gly Trp Arg Gln Gln Arg Leu465 470 475 480Arg Ser Leu Lys Ala 485 Lys Tyr Asp Pro Thr 490 Gly Lys Phe Ser Tyr 495 Tyr

Ala Pro Ile Pro500

Seqüência 15

664

DNA

Aspergillus niger

<400> 015 Met Leu Ser Thr Ile Thr Ser Phe Leu Ile Leu Leu Phe Phe Val Thr1 5 10 15 Thr Val Ser Ala 20 Tyr Pro Phe Glu Glu 25 Asn Ser Phe Pro Arg 30 Leu GlnAsp Thr Leu 35 Ala Thr Gly Thr Lys 40 Pro Gly Asp Pro Pro 45 Lys Phe GlyGly Gly 50 Tyr Asp Tyr Val Val 55 Val Gly Gly Gly Thr 60 Thr Gly Leu LeuVal Ala Ser Arg Leu Ala Lys Ala Gly Asn Ser Val Ala Val Ile Glu65 70 75 80Asn Gly Thr Tyr Pro 85 Thr Gly Asn Leu Thr 90 Thr Val Pro Gly Tyr 95 AsnGlu Gln Trp Phe 100 Ser Arg Val Leu Pro 105 Ser Asn Trp Thr Asp 110 Met ValAsn Val Trp 115 Pro Thr Val Gln Gln 120 Val Gly Gly Gly Glu 125 Gln Gln HisMet Met 130 Gly Arg Met Pro Leu 135 Leu Trp Leu Cys Leu 140 Ile Glu Leu GlnIle Gly Gly Ser Gln Gly Phe Thr Phe Val Asp Tyr Phe Arg Thr Thr145 150 155 160Lys Gly Ala Met Lys 165 Arg Trp Ala Asp Glu 170 Thr Gly Asp Asp Ser 175 TrpThr Trp Glu Asn 180 Val Gln Gln Tyr Tyr 185 Lys Lys Ser Phe Lys 190 Phe ThrPro Pro Asn 195 Asn Thr Ala Arg Pro 200 Ser Asn Ala Thr Pro 205 Asp Tyr GluSer Ser Gln Ile Val Gly Ser Thr Pro Gly Pro Leu Glu Leu Thr Phe

210 215 220

Pro Lys Tyr Ala Gln Ala Phe Gly Ser Trp Val Lys Leu Gly Leu Asn225 230 235 240Glu Leu Lys Ala Gly Ile Asn Arg Val Phe Val Glu Gly Asp Ile Lys 245 250 255 Gly Ala Ser Trp Ile Leu Asn Met Ile Asp Ser Gln Thr Gly Asn Arg 260 265 270 Ala Thr Thr Tyr Thr Ala Phe Leu Glu Pro Thr Gln Lys Asp Asp Thr 275 280 285 Ser Lys Ile Asp Val Tyr Val Glu Thr Leu Ala Glu Arg Thr Leu Ser 290 295 300 Asn Thr Pro Pro Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile Gly Val Leu Val Lys305 310 315 320Arg Trp Gly Met Arg Phe Pro Ile Phe Ala Gly Lys Glu Val Ile Leu 325 330 335 Ala Gly Gly Pro Ile Leu Thr Pro Gln Phe Leu Met Val Ser Gly Ile 340 345 350 Gly Pro Gln Asp His Leu Gln Glu Met Asn Ile Thr Val Leu Ala Asn 355 360 365 Arg Pro Gly Val Gly Gln Asn Tyr Asn Asp His Ile Leu Phe Gly Val 370 375 380 Lys His Ala Val Gln Val Glu Thr Thr Ser Val Leu Leu Asn Asp Thr385 390 395 400Arg Lys Trp Gln Glu Cys Glu Arg Phe Lys Ala His Ala Asn Gly Met 405 410 415 Leu Ala Asp Pro Gly Pro Asp Phe Ala Ala Phe Val Asp Tyr Pro Glu 420 425 430 Asp Ile Arg Gln Asn Leu Ser Ala Gln Thr Lys Ser Gly Asn Leu Trp 435 440 445 Pro Cys Val Ser Arg Gly Ser Val Val Pro Asn Asn Met Ile Leu Asp 450 455 4 60 Leu Ser Gln Phe Pro Ser Asp Trp Pro Asp Ile Gly Ile Val Ser Ser4 65 470 475 480Pro Leu Gly Val Asn Gly Asp Gly Asn His Asn Tyr Ala Asp Leu Val 485 490 495 Cys Ile Pro Met Lys Pro Ile Ser Lys Gly Thr Ile Lys Leu Arg Ser 500 505 510 Lys Ser Met Asp Asp Lys Pro Val Leu Asp Pro Gln Trp Leu Lys Ser 515 520 525 Pro Thr Asp Met Asp Thr Ala Val Ala Gly Leu Gln Tyr Leu Leu Arg 530 535 540 Leu Tyr Gly Thr Asn Ser Met Lys Pro Ile Leu Asn Ala Ser Gly Lys545 550 555 560Pro Ile Asp Leu Glu Ser Ser Asn Lys Asp Asp Leu Ile Lys Tyr Val 565 570 575 Lys Asn Asn Tyr Arg Thr Leu Asn His Gln Ser Ala Ser Cys Arg Met 580 585 590 Gly Lys Arg Asp Asp Pro Met Ala Val Val Asp Ser Lys Gly Lys Val 595 600 605 Ile Gly Val Asp Arg Leu Arg Ile Ala Asp Pro Ser Ala Trp Pro Phe 610 615 620 Leu Pro Ala Gly Phe Pro Leu Gly Thr Ala Tyr Met Phe Ala Glu Lys625 630 635 640Ile Ala Asp Asn Ile Leu Ser Asp His Gly Ser Asp Lys Asp Glu Asp 645 650 655 Glu Asp Glu Leu Arg Val Glu Leu 660Seqüência 16

525

DNA

Aspergillus niger<400> 016

Met Ile Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Val Ala Pro Val Leu Ala15 10 15

Ala Pro Asn Thr Asp Ala Val Ser Val Cys Gln His Leu His Thr Val

20 25 30

Tyr Pro Gln Tyr Thr Val Trp Asp Pro Thr Gly Thr Tyr Ala Thr Glu

35 40 45

Thr Phe Trp Asn Gln Ser Tyr Tyr Asn Asn Ala Val Lys Glu Tyr Trp

50 55 60

Asn Gly Val Asn Ala Asp Asn Arg Pro Ala Cys Ala Phe Phe Pro Ala65 70 75 80

Asn Ala Gln His Val Ser Val Ala Ile Gln Gln Leu Asn Lys Tyr Pro

85 90 95

Thr Ala Pro Phe Ala Leu Lys Gly Gly Gly His Asn Phe Asn Val Gly

100 105 110

Leu Ser Ser Thr Asn Gly Gly Val Leu Ile Ser Phe Asn Glu Asn Leu

115 120 125

Ser Ser Thr Thr Arg Asn Ser Asp Gly Gln Thr Phe Asp Val Gly Pro

130 135 140

Gly Ala Arg Trp Gly Asp Val Tyr Ala Val Thr Glu Lys Thr Asn Gln145 150 155 160

Val Val Val Gly Gly Arg Leu Ala Asn Ile Gly Val Ala Gly Phe Thr

165 170 175

Ile Gly Gly Gly Leu Ser Tyr Tyr Ser Ala Gln Tyr Gly Leu Ser Cys

180 185 190

Asp Asn Val Val Lys Phe Glu Val Val Leu Ala Asn Gly Thr Ile Val

195 200 205

Asn Ala Asn Ser Thr Ser Asn Pro Asp Leu Trp Trp Ala Leu Arg Gly

210 215 220

Gly Gly Asn Arg Tyr Gly Ile Val Thr Lys Phe Thr Tyr Gln Gly His225 230 235 240

Pro Leu Gly Asp Asn Gly Gln Val Trp Gly Gly Ile Arg Phe Tyr Ser

245 250 255

Ala Asp Lys Arg Gln Gln Ile Phe Glu Ala Leu Ser Asn Phe Thr Ser

260 265 270

Glu Tyr Pro Asp Ala Lys Ala Ala Val Ile Pro Thr Phe Asp Phe Gly

275 280 285

Leu Pro Gly Ala Ile Val Ser Asn Pro Ala Val Phe Phe Phe Tyr Asp

290 295 300

Gly Ala Lys Pro Ser Thr Asn Ala Phe Val Gly Leu Asp Asn Ile Glu305 310 315 320

Ala Leu Ile Asp Ser Thr Lys Thr Thr Thr Tyr Thr Asp Leu Thr Asn

325 330 335

Glu Ala Gly Gly Ala Lys Ile Tyr Gly Ile Asn Ala Ala Ile Arg Val

340 345 350

Asn Thr Phe Pro Asn Met Pro Ser Gln Gln Met Thr Gln Leu Leu Glu

355 360 365

Asn His Trp Thr Thr Tyr Gln Ser Met Ile Lys Asn Asp Ser Ser Lys

370 375 380

Asn Leu Asp Ile Gln Ile Gly Thr Phe Thr Pro Gln Pro Leu Ser Val385 390 395 400

Arg Ile Ala Arg Ala Ser Asn Lys Ala Gly Gly Asn Ala Leu Gly Leu405 410 415Asp Pro Ala Asn Gly Asp Arg Val Trp Ile Glu Asn Asp Leu Ile Trp

420 425 430

Val Asn Pro Val Cys Asn Asp Ala Cys Pro Glu Tyr Leu Arg Gln Val

435 440 445

Gly Asp Thr Val Lys Glu Ala Phe Asn Asn Thr Leu Leu Gly Thr Lys

450 455 460

Pro Thr Asn Tyr Gln Ser Gly Asp Val Asp Trp Ile Ser Ser Asn Pro465 470 475 480

Leu Phe Met Asn Asp Ala Ala Asp Tyr Gln Asp Val Tyr Gly Ser Tyr

485 490 495

Gly Pro Thr Asn Lys Ala Arg Leu Ala Ser Ile Ala Lys Ala Tyr Asp

500 505 510

Pro Thr Gly Phe Met Phe Arg Gln Gly Gly Trp Ser Phe515 520 525

Seqüência 17

551

DNA

Aspergillus niger<400> 017

Met Lys Val Ser Ser Ala Ala Val Pro Val Leu Ser Ile Leu Pro Glu1 5 10 15

Ala Ser Leu Gly Leu Gly Ser Thr Gln Leu Cys Cys Ala Ala Leu Gln

20 25 30

Ala Thr Ser Leu Arg Asn Gln Val Leu Tyr Pro Thr Ser Ala Ala Tyr

35 40 45

Asn Glu Ser Val Ala Ser Tyr Phe Ala Val Asn Val Gln Leu Asp Pro

50 55 60

Thr Cys Ile Val Gln Pro His Ser Thr Glu Asp Val Ser Leu Ile Val65 70 75 80

Ser Thr Leu Thr Gln Thr Gly Glu Thr Gln Cys Pro Phe Ala Val Arg

85 90 95

Ser Gly Gly His Thr Thr Trp Pro Gly Ala Ala Asp Ile Gly Glri Gly

100 105 HO

Val Thr Ile Asp Leu Ser Met Met Asn Ser Thr Thr Tyr His Lys Asp

115 120 125

Lys Gly Val Ala Ser Ile Gln Pro Gly Ala Arg Trp Gln Ala Val Tyr.

130 135 140

Lys Ala Leu Asp Pro Tyr Gly Val Thr Val Pro Gly Gly Arg Gly Gly145 150 155 160

Pro Val Gly Val Gly Gly Phe Leu Ile Gly Gly Gly Asn Thr Phe Tyr

165 170 175

Thr Ala Arg Val Gly Phe Ala Cys Asp Asn Ile Glu Asn Phe Glu Val

180 185 190

Val Leu Ala Ser Gly Ser Ile Val Asn Ala Asn Arg Thr Ser His Pro

195 200 205

Asp Leu Tyr Lys Ala Leu Lys Gly Gly Ser Ile Asn Phe Gly Val Val

210 215 220

Thr Lys Tyr Asp Leu Lys Thr Leu Pro His Asp Met Leu Trp Gly Gly225 230 235 240

Leu Val Val Tyr Asp Asn Ser Thr Thr Ala Arg Gln Leu Ser Ala Ala

245 250 255

Val Asn Phe Thr Asn Asn Ile His Asn Asp Pro Tyr Ala Ser Trp Ile

260 265 270

Gly Met Trp Glu Tyr Ser Ser Thr Thr Gly Gln Asn Ile Ile Ala Asp275 280 285Ala Leu Glu Tyr Thr Lys Pro Val Ala Phe Ala Pro Ala Phe His Glu 290 295 300 Phe Thr Ser Ile Pro Asn Thr Thr Asp Thr Met Arg Phe Ala Thr Ile305 310 315 320Tyr Asn Leu Thr Gln Glu Leu Val Gln Ala Ala Gly Tyr Arg Asp Val 325 330 335 Phe Thr Thr Gly Thr Tyr Lys Asn Asp Val Lys Val Leu Arg Lys Ala 340 345 350 Ile Asp Leu His Asn Asn Asn Ile Glu Lys Ala Lys Ala His Val Lys 355 360 365 Ser Asp Tyr Trp Ala Met Asp Thr Ile Ile Gln Pro Trp Pro Lys Leu 370 375 380 Phe Ala Gln His Ser Val Glu Lys Gly Gly Asn Val Leu Gly Leu Glu385 390 395 400Arg Phe Asp Glu Asn Leu Ile Gln Ile Leu Phe Asp Tyr Ser Trp Asp 405 410 415 Asp Ala Arg Asp Asp Asp Leu Phe Ile Gly Leu Gly Gln Ser Ile Leu 420 425 430 Glu Glu Val Gly Glu Tyr Ala Lys Ser Ile Gly Ala His Asn Glu Tyr 435 440 445 Ile Tyr Leu Asn Tyr Ala Asp Lys Ser Gln Asn Pro Leu Lys Gly Tyr 450 455 460 Gly Glu Glu Asn Val Glu Phe Ile Ser Arg Val Ala Lys Gln Tyr Asp4 65 470 475 480Pro Asp Gly Val Phe Gln Cys Leu Phe Lys Phe Ala Ala Gln Ser Thr 485 490 495 Arg Ile Ala Val Glu Pro Ile Met Lys Pro Ala Arg Ala Val Ser Thr 500 505 510 Arg Ser Glu Leu Ala Arg Ser Asn Arg Ser Pro Leu Gly Ala Leu Pro 515 520 525 Pro Ile Leu Ser Thr Pro Pro Ala Val Ser Arg Ala Ser Gly Arg Pro 530 535 540 Gly Phe Gly Pro Asp Asp Gly 545 550

Seqüência 18

553

DNA

Aspergillus niger<4 00> 018

Met Val Asn Leu Ala Tyr Ile Leu Gly Ala Val Ala Val Phe Ser Thr15 10 15

Ser Gly Thr Ala Ala Asp Val Ser Leu Ser Ser Ser Val Ala Ala Ser

20 25 30

Thr Thr Pro Ser Ala Ala Gly Ser Leu Ser Ser Leu Gly Leu Ser Leu

35 40 45

Pro Ala Gly Asn Val Leu Val Gly Asn Val Gly Tyr Thr Cys Asn Leu

50 55 60

Leu Ser Arg Thr Phe Pro Lys Asn Glu Thr Phe Thr Ala Ser Ser Pro65 70 75 80

Tyr Tyr Glu Ala Leu Ile Asp Glu Thr Trp Ser Gly Asn Ser Arg Leu

85 90 95

Asn Ala Ser Cys Ile Val Thr Pro Arg Ser Ala Gln Glu Val Ser Leu

100 105 110

Val Ile Gln Ile Leu Ser Ile Leu Glu Thr Lys Phe Ser Ile Arg Ser115 120 125Gly Gly His Ser130

Val Leu Val Ala145

Arg Lys Thr Leu

Gln Tyr Leu Glu180

Val Val Gly Val195

Tyr Asn Thr Asn210

Val Thr Pro Asn225

Asp Leu Tyr Lys

Val Glu Tyr Asp260

Val Lys Asn Tyr275

Ala Ala Tyr Leu290

Thr Asn Pro Ala305

Ser Ala Pro Ser

Thr Val Tyr Pro340

Ile Gly Asn Ala355

Phe Ala Phe Lys370

Ala Tyr Leu Lys385

Glu Tyr Val Pro

Thr Gln Asn Gly420

Trp Gly Glu Ile435

Val Ala Asn Ala450

Gln Ser Gln Ser465

Pro Asn Gln Gln

Ile Ala Ala Val500

Val Val Thr Ser515

Ser Val Trp Glu530

Gln Leu Ser Ser545

Ser Asn Pro Gly135

Leu Gly Arg Leu150

Thr Val Gly Pro165

Gln Tyr Asn Leu

Gly Gly Phe Val200

Gly Leu Ala Ile215

Gly Thr Ile Val230

Gly Leu Lys Gly245

Leu Thr Thr Asn

Thr Leu Ala Glu280

Gln Asn Ala Asp295

Tyr Thr Leu Val310

Ala Phe Asn Ala325

Pro Thr Asn Ala

Gly Val Val Gly360

Val Thr Ser Pro375

Thr Ala Ala Ser390

Gln Gly Ile Ile405

Gly Asn Leu Phe

Phe Ala Gln Phe440

Val Glu Ser Leu455

Val His Leu Pro470

Val Leu Arg Gly485

Ala Glu Arg Gly

Trp Ala Gln Met520

Ser Ala Asn Thr535

Leu His Val Gly550

Phe Ser Ser Ile140

Asn Thr Leu Ser155

Gly Asn Arg Trp170

Thr Val Leu Gly185

Leu Gly Gly Gly

Asp Thr Val Thr220

Asn Ala Thr Gln235

Gly Leu Asn Asn250

Thr Gly Ile Asp265

Thr Pro Ala Leu

Ile Arg Ser Asn300

Phe Tyr Gly Tyr315

Phe Ser Gln Val330

Ser Leu Asn Gln345

Ser Leu Tyr Thr

Ser Phe Leu Gln380

Leu Leu Pro Leu395

Pro Asn Leu Val410

Gly Leu Glu Ala425

Pro Ala Thr Val

Leu Ala Asn Leu460

Tyr Ile Phe Ala475

Tyr Gly Glu Asp490

Asp Pro Ser Ala505

Thr Arg Glu Thr

Thr Ser Ser His540

Phe

Gly Ser Asn Gly

Ile Ser Ala Asp160

Glu Ala Val Tyr175

Gly Arg Glu Pro190

Leu Ser Leu Phe205

Arg Phe Gln Val

Thr Glu His Ala240

Phe Gly Ile Val255

Val Trp Phe Glu270

Leu Ala Ala Tyr285

Val Glu Ile Gln

Leu Asp His Val320

Pro Ser Val Ser335

Val Leu Leu Asp350

Tyr Ser Ile Ser365

Glu Ser Phe Lys

Gly Val Ile Leu400

Thr Lys Ser Gln415

Thr Pro Gln Val430

Ser Gln Ser Thr445

Thr Ser Ser Ala

Asn Asp Ala Gly480

Asn Val Lys Tyr495

Ser Ile Pro Pro510

Gly Gly Leu Thr525

Ala Leu Met Ser

Claims (30)

1. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato deser capaz de hibridizar a um polinucleotídeo de qualqueruma do N0 de identidade de seqüência: 001 - 006 ou N0 deidentidade de seqüência: 007 - 012.

2. Polinucleotídeo isolado, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser capaz dehibridizar sob condições de alta severidade a umpolinucleotídeo de algum do N0 de identidade de seqüência:-001 - 006 ou N0 de identidade de seqüência: 007 - 012.

3. Polinucleotídeo isolado, de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de obteníveisde um fungo filamentoso.

4. Polinucleotídeo isolado, de acordo com areivindicação 3, caracterizado pelo fato de obtenível doAspergillus niger.

5. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato deque codifica uma oxidorredutase que compreende algum do N0de identidade de seqüência das seqüências de aminoácido:-013 - 018 ou equivalentes funcionais de alguns deles.

6. Codificação do polinucleotídeo isolado de pelomenos um domínio funcional de uma oxidorredutasecaracterizado pelo fato de que compreende algum do N0 deidentidade de seqüência das seqüências de aminoácido: 013 --018 ou equivalentes funcionais de alguns deles.

7. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato deque compreende algum do N0 de identidade de seqüência dasseqüências de nucleotídeo: 001 - 006 ou N0 de identidade deseqüência: 007 - 012 ou equivalentes funcionais de algunsdeles.

8. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato deque consiste em algum do N0 de identidade de seqüência: 001- 006 ou N0 de identidade de seqüência: 007 - 012.

9. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende umaseqüência do polinucleotídeo de acordo com asreivindicações 1 8.

10. Vetor, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de a seqüência dita dopolinucleotídeo das reivindicações 1 a 8 é ligada operativacom as seqüências reguladoras apropriadas para a expressãoda seqüência dita do polinucleotídeo em uma célula dehospedeiro apropriado.

11. Vetor, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de a célula de hospedeiroapropriada dita é um fungo filamentoso.

12. Método para manufaturar um polinucleotídeo, deacordo com reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ou umvetor de acordo com as reivindicações 9, 10 ou 11,caracterizado pelo fato de que compreende as etapas decultivar uma célula de hospedeiro transformada compolinucleotídeo dito ou vetor dito e de isolar opolinucleotídeo dito ou o vetor dito da célula dehospedeiro dita.

13. Oxidorredutase isolada caracterizado pelo fato deter um N° de identidade de seqüência da seqüência deaminoácido: 013 - 018 ou equivalentes funcionais de algunsdeles.

14. Oxidorredutase isolada, de acordo com areivindicação 13, caracterizada pelo fato de obtenível doAspergillus niger.

15. Oxidorredutase isolada caracterizada pelo fato deser obtenível expressando um polinucleotídeo de acordo comreivindicações 1 a 8 ou um vetor de acordo com asreivindicações 9 a 11 em uma célula de hospedeiroapropriada, por exemplo Aspergillus niger.

16. Oxidorredutase recombinante caracterizada pelofato de que compreende um domínio funcional de alguma daoxidorredutase de acordo com as reivindicações 13 15.

17. Método para manufaturar uma oxidorredutase, deacordo com qualquer uma das reivindicações 13, 14, 15 ou-16, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas detransformar uma célula de hospedeiro apropriada com umpolinucleotídeo isolado de acordo com reivindicações 1 a 8ou um vetor de acordo com as reivindicações 9 a 11,cultivando a célula dita sob circunstâncias permitindo aexpres.são do polinucleotídeo dito e opcionalmentepurificação o polipeptídeo codificado do meio dito dacélula ou de cultura.

18. Célula de hospedeiro recombinante caracterizadapelo fato de que compreende um polinucleotídeo de acordocom reivindicações 1 a 8 ou um vetor de acordo com asreivindicações 9 a 11.

19. Célula de hospedeiro recombinante caracterizadapelo fato de que expressa um polipeptídeo de acordo com asreivindicações 13 a 16.

20. Anticorpos reativos purificados caracterizadospelo fato de ter uma oxidorredutase de acordo com asreivindicações 13 a 16.

21. Processo para a produção de massa de pãocaracterizado pelo fato de que compreende a adição de umaoxidorredutase de acordo com qualquer uma dasreivindicações 13 a 16.

22. Processo para a produção de um produto assado deuma massa de pão caracterizado pelo fato de ser preparadopelo processo da reivindicação 21.

23. Uso de uma oxidorredutase, de acordo com asreivindicações 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato deser para preparação de uma massa de pão e/ou do produtoassado disso.

24. Uso de uma enzima capaz de hidrolisar um ácidograxo hidróxi caracterizado pelo fato de ser para apreparação de uma massa de pão e/ou do produto assadodisso.

25. Uso de uma oxidorredutase, de acordo com qualqueruma das reivindicações 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelofato de ser para a preparação dos produtos lácteos.

26. Uso de uma oxidorredutase, de acordo com qualqueruma das reivindicações 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelofato de ser para a redução de reações do Maillard nosprodutos lácteos.

27. Uso de uma oxidorredutase, de acordo com qualqueruma das reivindicações 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelofato de ser para a prevenção de reações do Maillard nosprodutos lácteos.

28. Uso de uma oxidorredutase, de acordo com qualqueruma das reivindicações 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelofato de ser um agente antimicrobial nos produtos lácteos.

29. Uso de uma oxidorredutase, de acordo com areivindicação 28, caracterizado pelo fato de o agenteantimicrobiano ser usado para o sistema do lactoperoxidase-tiocianato no leite.

30. Uso de uma oxidorredutase, de acordo com qualqueruma das reivindicações 25, 26, 27 ou 28, caracterizado pelofato de os produtos lácteos ser leite ou queijo.