BR9714313B1

BR9714313B1 - Método para a produção de recombinantes de 1,3-propanodiol

Info

Publication number: BR9714313B1
Application number: BRPI9714313-8A
Authority: BR
Inventors: Nigel S Dunn-Coleman; Maria Diaz-Torres; Matthew W Chase; Donald Trimbur
Original assignee: Genencor Int
Priority date: 1996-11-13
Filing date: 1997-11-13
Publication date: 2014-10-21
Also published as: IL129722A; AU733534B2; CN1198935C; DE69736070D1; WO1998021341A2; BR9714313A; KR20000053213A; CN1244217A; IL129722A0; EP0942989B1; ES2336858T3; US6953684B2; US6136576A; EP0942989A1; AU5248498A; WO1998021339A1; ATE452979T1; CA2269088A1; DE69736070T2; JP4327909B2

Description

"MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE RECOMBINANTES DE 1,3-PROPANODIOL" Pedidos Relacionados O presente pedido é uma continuação-em-parte do pedido provisório US 60/030.601 depositado em 13 de novembro de 1996, incorporado aqui em sua totalidade.

Campo da Invenção A presente invenção se refere ao campo da biologia molecular e, especificamente, a processos aperfeiçoados para a produção de 1,3-propanodiol em células hospedeiras. Em particular, a presente invenção descreve componentes de agrupamentos de genes associados com a produção de 1,3- propanodiol em células hospedeiras, incluindo proteína X, e proteína 1, proteína 2 e proteína 3. Mais especificamente, a presente invenção descreve a expressão de genes clonados codificando proteína X, proteína 1, proteína 2 e proteína 3, tanto separadamente como juntas, para a produção melhorada de 1,3-propanodiol em células hospedeiras.

Antecedentes 1,3-Propanodiol é um monômero tendo utilidade potencial na produção de fibras de poliéster e na fabricação de poliuretanos e compostos cíclicos.

Conhece-se uma variedade de vias químicas para 1,3- propanodiol. Por exemplo, óxido de etileno pode ser convertido em 1,3-propanodiol sobre um catalisador na presença de fosfina, água, monóxido de carbono, hidrogênio e um ácido, pela hidratação de fase em solução catalítica de acroleína seguido por redução, ou de hidrocarbonetos como glicerol, reagido na presença de monóxido de carbono e hidrogênio sobre catalisadores tendo átomos do grupo VIII da tabela periódica.

Apesar de ser possível gerar 1,3-propanodiol por estes processos, eles são caros e geram correntes de rejeitos contendo poluentes ambientais.

Sabe-se há quase um século, o que 1,3-propanodiol pode ser produzido da fermentação de glicerol. Verificou-se que cepas bacterianas capazes de produzir 1,3-propanodiol, por exemplo, nos grupos Citrobacter, Clostridium, Enterobacter, Ilyobacter, Klebsiella, Lactobacillus e Pelobacter. Em cada caso estudado, glicerol é convertido em 1,3-propanodiol em uma sequência de reação catalisada com enzima, em duas etapas. Na primeira etapa, a desidratase catalisa a conversão de glicerol em 3-hidroxipropionaldeído (3-HP) e água (Equação 1). Na segunda etapa, 3-HP é reduzida em 1,3-propanodiol por uma oxiredutase ligada a NAD+ (Equação 2). (Equação 1) (Equação 2) O 1,3-propanodiol não é metabolizado ulteriormente e, como um resultado, acumula-se em concentração elevada no meio. A reação total consome um equivalente de redução na forma de um cofator, dinucleotídeo de adenina b-nicotinamida reduzido (NADH), que é oxidado em dinucleotídeo adenina nicotinamida (NAD+) . A produção de 1,3-propanodiol de glicerol é, geralmente, realizada em condições anaeróbicas usando glicerol como a fonte única e na ausência de outros aceptores equivalentes de redução exógenos. Nestas condições, em por exemplo, cepas de Citrobacter, Clostridium e Klebsiella, uma via paralela para glicerol opera, a qual primeiramente envolve oxidação de glicerol em di-hidroxiacetona (DHA) por uma desidrogenase ligada a NAD+ - (ou NADP+) (Equação 3) . A DHA, após fosforilação em fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) por uma quinase DHA (Equação 4), torna-se disponível para biossíntese e para suportar geração de ATP via, por exemplo, glicólise. (Equação 3) (Equação 4) Em contraste com a via de 1,3-propanodiol, esta via pode prover carbono e energia à célula e produz, em vez de consumir, NADH.

Em Klebsiella pneumoniae e Citrobacter freundii, os genes codificando as atividades ligadas funcionalmente de desidratase de glicerol (dhaB), oxiredutase de 1,3-propanodiol dha T) , desidrogenase glicerol (dha D) , e quinase de di- hidroxiacetona (dha K) são englobados pelo regulon de dha. Os regulons de dha de Citrobacter e Klebsiella são expressados em Escherichia coli e mostram converter glicerol em 1,3- propanodiol. Desidratase de glicerol (E.C. 4.2.1.30) e desidratase de diol [1,2-propanodiol] (E.C. 4.2.1.28) são enzimas relacionadas, mas distintas que são codificadas por genes distintos. Em Salmonella typhimurium e Klebsiella pneumoniae, desidratase de diol está associada com o operon pdu, ver Bobik et al., 1992, J. Bacteriol. 174: 2253-2266 e patente US 5.633.362. Tobimatsu et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 22352-22357 descrevem a proteína X de desidratase de glicerol codificando o gene de K. pneumoniae, identificada como ORF 4; Segfried et al., 1996, J. Bacteriol. 178: 5793- 5796 descreve o gene de desidratase de glicerol de C. freundii codificando proteína X identificada como ORF Z. Tobimatsu et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 7142-7148 descrevem as subunidades de desidratase de diol α, β e γ e ilustra a presença de orf 4. Luers (1997, FEMS Microbiology Letters 154: 337-345) descreve a sequência de aminoácidos da proteína 1, proteína 2 e proteína 3 de Clostridium pasteurianum.

Processos biológicos para a preparação de glicerol são conhecidos. A maioria esmagadora dos produtores de glicerol são leveduras, mas sabe-se que algumas bactérias, outros fungos e algas também produzem glicerol. Ambas bactérias e leveduras produzem glicerol convertendo glucose ou outros carboidratos através da via frutose-1,6-bisfosfaro, em glicólise ou pela via de Embden Meyerhof Parnas, no entanto, algumas algas convertem dióxido de carbono ou bicarbonato dissolvido nos cloroplastos nos intermediários de 3-carbonos do ciclo de Calvin. Em uma série de etapas, o intermediário de 3 carbonos, ácido fosfoglicérico, é convertido em 3- fosfatogliceraldeído que pode ser prontamente interconvertido em seu isômero ceto fosfato de di-hidroxiacetona e, por último, em glicerol.

Especificamente, as bactérias Bacillus licheniformis e Lactobacillus lycopersia sintetizam glicerol, e a produção de glicerol é encontrada nas algas halotolerantes Dunaliella sp. e Asteromonas gracilis para proteção contra concentrações de sais externos elevados (Ben-Amotz et al., Experientia 38, 49-52 (1982)). Similarmente, várias leveduras osmotolerantes sintetizam glicerol como uma medida de proteção. A maior parte das cepas de Saccharomyces produz algum glicerol durante fermentação alcoólica, e isto pode ser aumentado fisiologicamente pela aplicação de tensão osmótica (Albertyn et al., Mol. Cell. Biol. 14, 4135-4144, (1994)). Antes deste século a produção de glicerol comercial foi obtida pelo uso de culturas de Saccharomyces em que "reagentes de direcionamento" foram adicionados como sulfetos ou álcalis. Através da formação de um complexo ativo, os agentes de direcionamento bloqueiam ou inibem a conversão de acetaldeido em etanol; assim, excesso de equivalentes de redução (NADH) são disponíveis para ou "direcionados" para DHPA para redução, para produzir glicerol. Este processo está limitado pela inibição parcial do crescimento de levedura que é devido aos sulfetos. Esta limitação pode ser parcialmente superada pelo uso de álcalis que cria equivalentes de NADH em excesso por um mecanismo diferente. Nesta prática, o álcalis inicia desproporcionamento Cannizarro para dar etanol e ácido acético de dois equivalentes de acetaldeido. 0 gene codificando desidrogenase glicerol-3-fosfato (DAR1, GPDl) foi clonado e sequenciado de S. diastaticus (Wang et al., J. Bact. 176, 7091-7095, (1994)) . O gene DAR1 foi clonado em um vetor shuttle e usado para transformar E. coli, onde a expressão produziu enzima ativa. Wang et al. (supra) reconhecem que DAR1 é regulado pelo ambiente osmótíco celular, mas não sugerem como o gene pode ser usado para melhorar a produção de 1,3-propanodiol em um organismo recombinante.

Outras enzimas de desidrogenase de glicerol-3- fosfato foram isoladas: por exemplo, desidrogenase de sn- glicerol-3-fosfato foi clonada e sequenciada de S. cerevisiae (Larason et al., Mol. Microbiol. 10, 1101 (1993) e Albertyn et al., (Mol. Cell. Biol. 14, 4135 (1994)) ensinam a clonagem de GPDl codificando uma desidrogenase de glicerol-3-fosfato de S. cerevisiae. Como Wang et al. (supra), tanto Albertyn et al., e Larason et al. reconhecem a osmo-sensibilidade da regulação deste gene, mas não sugerem como o gene pode ser usado na produção de 1,3-propanodiol em um organismo recombinante.

Como com G3PDH, glicerol-3-fosfatase é isolado de Saccharomyces cerevisiae e a proteína identificada como sendo codificada pelos genes GPP1 e GPP2 (Norbeck et al., J. Biol.

Chem. 271, 13875 (1996)). Como os genes codificando G3PDH, parece que GPP2 é osmossensível.

Apesar de processos biológicos tanto da produção de glicerol e 1,3-propanodiol serem conhecidos, nunca foi demonstrado que o processo completo pode ser obtido por um organismo recombinante simples.

Nenhum dos processos biológicos descritos acima para a produção de 1,3-propanodiol é bem apropriado para produção em escala industrial uma vez que os processos químicos são intensos em energia e os processos biológicos requerem o material de partida caro, glicerol. Um processo requerendo entrada de energia baixa e m material de partida pouco dispendioso é necessário. Um processo mais desejável pode incorporar una microorganismo que pode ter a capacidade de converter fontes de carbono básicos como carboidratos ou açúcares no produto final 1,3-propanodiol desejado.

Apesar de uma conversão de organismo único da fonte de carbono fermentável diferente de glicerol ou di- hidroxiacetona em 1,3-propanodiol poder ser desejável, documentou-se que existem dificuldades significativas para superar este esforço. Por exemplo, Gottschalk et al. (EP 373.230) ensinam que o crescimento da maioria das cepas utilizáveis para a produção de 1,3-propanodiol, incluindo Citrobacter freundii, Clostridium autobutylicum, Clostridium butylicum, e Klebsiella pneumoniae, é perturbado pela de um doador de hidrogênio como frutose ou glucose. Cepas de Lactobacillus brevis e Lactobacillus buchner, que produzem 1,3-propanodiol em co-fermentações de glicerol e frutose ou glucose, não crescem quando glicerol é provido como a fonte de carbono única, e, apesar de ser mostrado que células em repouso podem metabolizar glucose ou frutose, elas não produzem 1,3-propanodiol. (Veiga Da Cunha et al., J.

Bacteriol. 174, 1013 (1992)). Similarmente, mostrou-se que uma cepa de llyobacter polytropus, que produz 1,3-propanodiol quando glicerol e acetato são providos, não produz 1,3- propanodiol de substratos de carbono diferentes de glicerol, incluindo frutose e glucose. (Steib et al., Arch. Microbiol. 140, 139 (1984)). Finalmente, Tong et al. (Appl. Biochem.

Biotech. 34, 149 (1992)) ensinaram que Escherichia coli recombinante transformada com a desidratase de glicerol codificando regulon dha não produz 1,3-propanodiol tanto de glucose como de xilose na ausência de glicerol exógeno.

Tentativas para melhorar o rendimento de 1,3- propanodiol de glicerol são descritas, onde co-substratos capazes de prover equivalentes de redução, tipicamente açúcares fermentáveis, são incluídos no processo.

Aperfeiçoamentos no rendimento são reivindicados para células em repouso de Citrobacter freundii e Klebsiella pneumoniae DSM 4270 co-fermentando glicerol e glucose (Gottschalk et al., supra, e Tran-Dinh et al., DE 3734 764); mas não para células em crescimento de Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 co- fermentando glicerol e glucose, que produzem nenhum 1,3- propanodiol (I-T. Tong, Ph. D. Thesis, Universidade de Wisconsin-Madison (1992)). Rendimentos aumentados são descritos para a co-fermentação de glicerol e glucose ou frutose por um Escherichia coli recombinante; no entanto, nenhum 1,3-propanodiol é produzido na ausência de glicerol (Tong et al., supra). Nestes sistemas, organismos únicos usam o carboidrato como uma fonte de geração de NADH, enquanto provendo energia e carbono para crescimento ou manutenção de células. Estas descrições sugerem que açúcares não entram na corrente de carbono que produz 1,3-propanodiol. Em nenhum caso 1,3-propanodiol é produzido na ausência de uma fonte exógena de glicerol. Assim, o peso da literatura sugere claramente que a produção de 1,3-propanodiol de uma fonte de carboidrato por um organismo único não é possível. O peso na literatura com relação ao papel da proteína X na produção de 1,3-propanodiol por uma célula hospedeira está ainda confuso Antes da disponibilidade de informação genética, McGee et al., 1982, Biochem. Biophys.

Res. Comm. 108: 547-551, descrevem desidratase de diol de K. pneumoniae ATCC 8724 a ser composta de quatro subunidades identificadas por tamanho (60K, 51K, 29K e 15K daltons) e sequência de aminoácidos N-terminais. Em contraste direto, MeGee, Tobimatsu et al., 1995, supra, descrevem a clonagem, sequenciação e expressão de desidratase de diol do mesmo organismo e não encontraram nenhum evidência ligando o polipeptideo de 51 daltons a de-hidrase. Tobimatsu et al., 1996, supra, concluem que o polipeptideo da proteína X não é uma subunidade de desidratase de glicerol, em contraste com GenBank Número de acesso U30903, onde proteína X é descrita como uma subunidade grande de desidratase de glicerol.

Seyfried et al., supra, descrevem que uma deleção de 192 bp da extremidade 3' de orfZ (proteína X) não tem nenhum efeito sobre a atividade enzimática e concluem que orfZ não codifica uma subunidade requerida para atividade de desidratase de .

Finalmente, Skraly, F.A. (1997, Tese intitulada "Metabolic Engineering of an Improved 1,3-Propanediol Fermentation") descrevem uma perda da atividade de desidratase de glicerol em uma experiência onde ORF3 recombinante (proteína X) foi rompido criando uma proteína de fusão grande, mas não em outra experiência, em que a produção de 1,3-propanodiol de glicerol foi diminuída comparada a um controle onde ORF3 estava intacto. O problema a ser resolvido pela presente invenção é a produção biológica de 1,3-propanodiol por um organismo recombinante único de substratos de um carbono pouco dispendioso como glucose ou outros açúcares em quantidades comercialmente praticável. A produção biológica de 1,3- propanodiol requer glicerol como um substrato para uma reação sequencial em duas etapas, em que uma enzima desidratase de (tipicamente uma coenzima desidratase dependente de B12) converte glicerol em um intermediário, 3- hidroxipropionaldeído, que é então reduzida a 1,3-propanodiol por uma oxirredutase dependente de NADH (ou NADPH) . A complexidade dos requisitos de cofator necessita do uso de um catalisador de célula total para um processo industrial que utiliza esta sequência de reação para a produção de 1,3- propanodiol. Além do mais, a fim de preparar o processo economicamente viável, uma carga mais cara do que glicerol ou di-hidroxiacetona é necessária e níveis de produção altos são desejáveis. Glucose e outros carboidratos são substratos apropriados, mas, como acima discutido, são sabidos interferir com a produção de 1,3-propanodiol. Como um resultado, nenhum organismo único mostrou converter glucose em 1,3-propanodiol.

Os requerentes resolveram o problema especificado e a presente invenção provê a bioconversão de uma fonte de carbono fermentável diretamente em 1,3-propanodiol usando um organismo recombinante único. Glucose é usada como um substrato modelo e a bioconversão é aplicável a qualquer microorganismo existente. Microorganismos alojando os genes codificando proteína X e proteína 1, proteína 2 e proteína 3, além de outras proteínas associadas com a produção de 1,3- propanodiol, são capazes de converter glucose e outros açúcares, através da via de degradação de glicerol, em 1,3- propanodiol com bons resultados e seletividades. Além disso, a presente invenção pode ser, em geral, aplicada para incluir qualquer substrato de carbono que é prontamente convertido em 1) glicerol, 2) di-hidroxiacetona, ou 3) compostos C3 no estado de oxidação de glicerol (por exemplo, 3-fosfato glicerol) ou 4) compostos C3 no estado de oxidação de di- hidroxiacetona (por exemplo, di-hidroxiacetona fosfato ou 3- fosfato gliceraldeído).

Sumário da Invenção A presente invenção se refere a processos aperfeiçoados para a produção de 1,3-propanodiol de um microorganismo único. A presente invenção é baseada, em parte, na descoberta inesperada de que a presença de um gene codificando proteína X em um microorganismo contendo pelo menos um gene codificando uma atividade de desidratase de e capaz de produzir 1,3-propanodiol é associada com a reativação in vivo da atividade de desidratase de e produção aumentada de 1,3-propanodiol no microorganismo. A presente invenção também é baseada, em parte, na descoberta inesperada de que a presença de um gene codificando proteína X e pelo menos um gene codificando uma proteína selecionada dentre o grupo consistindo de proteína 1, proteína 2 e proteína 3 em células hospedeiras contendo pelo menos um gene codificando uma atividade de desidratase de e capaz de produzir 1,3- propanodiol é associada com reativação in vivo da atividade de desidratase de e rendimentos aumentados de 1,3-propanodiol no microorganismo.

Consequentemente, a presente invenção provê um processo aperfeiçoado para a produção de 1,3-propanodiol de um microrganismo capaz de produzir 1,3-propanodiol, referido microorganismo compreendendo pelo menos um gene codificando uma atividade de desidratase de , o processo compreendendo as etapas de introduzir um gene codificando proteína X no organismo para criar um organismo transformado; e cultivar o organismo transformado na presença de pelo menos uma fonte de carbono capaz de ser convertida em 1,3-propanodiol em referido organismo hospedeiro e sob condições apropriadas para a produção de 1,3-propanodiol, em que a fonte de carbono é selecionada dentre o grupo consistindo de monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, e um substrato de carbono.

Em uma forma de realização preferida, o processo para a produção melhorada de 1,3-propanodiol ainda compreende introduzir pelo menos um gene codificando uma proteína selecionado dentre o grupo consistindo de proteína 1, proteína 2 e proteína 3 no organismo. 0 microorganismo pode ainda compreender pelo menos um de (a) um gene codificando a atividade de desidrogenase glicerol-3-fosfato; (b) um gene codificando uma atividade de glicerol-3-fosfatase; e (c) um gene codificando a atividade de oxirredutase 1,3-propanodiol no microorganismo. Gene(s) codificando uma atividade de desidratase de , proteína X, proteínas 1, 2 ou 3 ou outros genes necessários para a produção de 1,3-propanodiol podem ser estavelmente mantidos no genoma da célula hospedeira ou podem ser plasmídeos de replicação residindo no microorganismo hospedeiro. 0 processo compreende, opcionalmente, a etapa de recuperar o 1,3-propanodíol. Em um aspecto da presente invenção, a fonte de carbono é glucose. 0 microorganismo é selecionado dentre o grupo dos gêneros consistindo de Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces e Pseudomonas.

Em um aspecto, proteína X é derivada de um agrupamento de genes de desidratase de glicerol e, em outro aspecto, proteína X é derivada de um agrupamento de genes de desidratase de diol. 0 gene codificando a atividade de desidratase de pode ser homólogo ao microorganismo ou heterólogo ao microorganismo. Em uma forma de realização, o agrupamento de genes de desidratase de glicesol é derivado de um organismo selecionado dos gêneros consistindo de Klebsiella e Cictrobacter. Em outra forma de realização, o agrupamento de genes de desidratase de diol é derivado de um organismo selecionado dos gêneros consistindo de Klebsiella, Clostridium e Salmonella.

Em outro aspecto, a presente invenção provê um microorganismo recombinante compreendendo pelo menos um gene codificando uma atividade de desidratase de ; pelo menos um gene codificando uma glicerol-3-fosfatase; e pelo menos um gene codificando proteína X, em que referido microorganismo é capaz de produzir 1,3-propanodiol de uma fonte de carbono. A fonte de carbono pode ser selecionada dentre o grupo consistindo de monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, e um substrato de carbono. Em uma outra forma de realização, o microorganismo ainda compreende um gene codificando uma desidrogenase glicerol-3-fosfato citossólica.

Em outra forma de realização, o microorganismo recombinante ainda compreende pelo menos um gene codificando uma proteína selecionada dentre o grupo consistindo de proteína 1, proteína 2 e proteína 3. 0 microorganismo é selecionado dentre o grupo consistindo de Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces, Shizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces e Pseudomonas. Em um aspecto, proteína X é derivada de um agrupamento de genes de desidratase de glicerol. Em outro aspecto, proteína X é derivada de um agrupamento de genes de desidratase de diol. Em um aspecto, a atividade de desidratase é heteróloga para referido microorganismo e, em outro aspecto, a atividade de desidratase de é homóloga para referido microorganismo. A presente invenção também provê um processo para a reativação in vivo de uma atividade de desidratase de em um microorganismo capaz de produzir 1,3-propanodiol e contendo pelo menos um gene codificando uma atividade de desidratase de , compreendendo a etapa de introduzir um gene codificando proteína X em referido microorganismo. 0 microorganismo é selecionado dentre o grupo consistindo de Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces e Pseudomonas.

Em um aspecto, o gene codificando a atividade de desidratase de é heterólogo para referido microorganismo e, em outro aspecto, o gene codificando a atividade de desidratase de é homólogo para referido microorganismo. Em uma forma de realização, o gene codificando proteína X é derivado de um agrupamento de genes de desidratase de glicerol e, em outra forma de realização, o gene codificando proteína X é derivado de um agrupamento de genes de desidratase de diol. A presente invenção também provê vetores de expressão e células hospedeiras contendo genes codificando proteína X, proteína 1, proteína 2 e proteína 3.

Uma vantagem do processo de produção de 1,3- propanodiol de acordo com a presente invenção é a produção aumentada inesperada de 1,3-propanodiol em uma célula hospedeira capaz de produzir 1,3-propanodiol na presença de ácido nucleico codificando proteína X, como comparado à célula hospedeira em que falta ácido nucleico codificando proteína X.

Como demonstrado abaixo, uma célula hospedeira contendo ácido nucleico codificando dhaB 1, 2 e 3 e proteína X é capaz de produzir significativamente mais 1,3-propanodiol do que uma célula hospedeira contendo ácido nucleico codificando dhaB 1, 2 e 2 e faltando X.

Outra vantagem da presente invenção, como demonstrado abaixo, é que a presença de proteína X codificando ácido nucleico junto com ácido nucleico codificando pelo menos uma das proteína 1, proteína 2 e proteína 3 em uma célula hospedeira capaz de produzir 1,3-propanodiol, dá o resultado inesperado de produção aumentada de 1,3-propanodiol na célula hospedeira sobre a produção de 1,3-propanodiol na célula hospedeira em que falta ácido nucleico codificando proteína X junto com ácido nucleico codificando pelo menos uma das proteína 1, proteína 2 e proteína 3.

Ainda outra vantagem do processo de produção da presente invenção, como mostrado abaixo, é a reativação in vivo da atividade de desidratase de em um microorganismo que está associado com a presença de ácido nucleico codificando proteína X no microorganismo.

Breve Descrição dos Desenhos Figura 1 ilustra componentes do agrupamento de genes de desidratase de glicerol de Klebsiella pneumoniae no plasmídeo pHK28-26 (SEQ ID NO: 19) Neste figura, orfY codifica proteína 1, orfX codifica proteína 2 e orfW codifica proteína 3. DhaB-X se refere a proteína X.

Figuras 2A-2G ilustram a sequência de nucleotídeos e de aminoácidos da proteína X de desidratase de glicerol de Klebsiella pneumoniae (dhab4) (respectivamente SEQ ID NO:68 e SEQ ID NO:59).

Figura 3 ilustra o alinhamento de aminoácidos da proteína 1 de Klebsiella pneumoniae (SEQ ID NO: 61) e proteína 1 de Citrobacter freundii (SEQ ID NO: 60) (designada na figura 3 como orfY).

Figura 4 ilustra o alinhamento de aminoácidos da proteína 2 de Klebsiella pneumoniae (SEQ ID NO: 63) e proteína 2 de Citrobacter freundii (SEQ ID NO: 62) (designada na figura 4 como orfX).

Figura 5 ilustra o alinhamento de aminoácidos da proteína 3 de Klebsiella pneumoniae (SEQ ID NO: 64) e proteína de Citrobacter freundii (SEQ ID NO: 65) (designada na figura 5 como orfW).

Figura 6 ilustra a comparação de reativação in situ de plasmídeos pHK2 8-2 6 (que contêm subunidades 1, 2 e 3 de dhaB bem como proteína X e quadros de leitura abertos codificando proteína 1, proteína 2 e proteína 3) vs. pDT24 (que contém subunidades 1, 2 e 3 de dhaB bem como proteína X) em células DH5a de E. coli.

Figura 7 ilustra a comparação de reativação in situ de plasmídeos pM7 (contendo genes codificando subunidades 1, 2 e 3 de dhaB e proteína X) vs. plasmídeo pMll (contendo genes codificando subunidades 1, 2 e 3 de dhaB) em células DH5a de E. coli.

Figuras 8A-8E ilustra a sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 66) e de aminoácidos (SEQ ID NO: 67) do agrupamento de genes de desidratase de diol de proteína X de K. pneumonie.

Figura 9 ilustra uma fermentação em 10 litros padrão para produção de 1,3-propanodiol usando E. coli FM5/pDT24 (FM5 descreve na patente US 5.494.816 Amgen, número de acesso ATCC 53911) .

Figura 10 ilustra uma fermentação em 10 litros padrão para produção de 1,3-propanodiol usando E. coli DH5alfa/pHK28-26.

Breve descrição de depósitos biológicos e listagem das sequências W2042 de E. coli transformado (compreendendo o hospedeiro de W1485 de E. coli e plasmídeos pDT20 e pAH42) contendo os genes codificando desidrogenase de glicerol-3- fosfato (G3PDH) e glicerol-3-fosfatase (G3P fosfatase), desidratase de glicerol (dhaB) e oxiredutase 1,3-de propanodiol (dhaT) foi depositada em 26 de setembro de 1996 com o ATCC nos termos do Tratado de Budapeste junto ao International Recognition of the Deposit of Micro-organisms for the Purpose of Patent Procedure e é designado como ATCC 98188. YPH500 de S. cerevisiae alojando plasmídeos pMCKlO, pMCK17, pMCK30 e pMCK35 contendo genes codificando desidrogenase glicerol-3-fosfato (g3PDH) e glicerol-3- fosfatase (fosfatase G3P), desidratase de glicerol (dhaB) e oxiredutase 1,3-propanodiol (dhaT) foi depositada em 26 de setembro de 1996 com o ATCC nos termos do Tratado de Budapeste no International Recognition of the Deposit of Micro-organisms para o Purpose of Patent Procedure e é designado como ATCC 74392. DH5a de E. coli contendo pKPl, que tem cerca de 35 kb de um genoma de Klebsiella que contém a desidratase de glicerol, proteína X e proteínas 1, 2 e 3 foi depositada em 18 de abril de 1995 com o ATCC nos termos do Tratado de Budapeste e foi designado ATCC 697 89. DH5a de E. coli contendo pKP4 contendo uma porção do genoma de Klebsiella codificando a enzima desidratase de diol, incluindo proteína X, foi depositada em 18 de abril de 1995 com o ATCC nos termos do Tratado de Budapeste e designada ATCC 69790. "ATCC" se refere ao depositário internacional American Type Culture Collection localizado em 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA. As designações se referem ao número de acesso do material depositado.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção se refere à produção de 1,3- propanodiol em um microorganismo único e provê processos aperfeiçoados para produção de 1,3-propanodiol de uma fonte de carbono fermentável em um organismo recombinante único. O processo incorpora um microorganismo capaz de produzir 1,3- propanodiol compreendendo genes tanto homólogos como heterólogo codificando desidratase de (dhaB), pelo menos um gene codificando proteína X e, opcionalmente, pelo menos um dos genes codificando uma proteína selecionada do grupo consistindo de proteína 1, proteína 2 e proteína 3.

Opcionalmente, o microorganismo contém pelo menos um gene codificando desidrogenase glicerol-3-fosfato, glicerol-3- fosfatase e oxiredutase 1,3-propanodiol (dhaT). 0 microorganismo recombinante é contatado com um substrato de carbono e 1,3-propanodiol é isolado do meio de crescimento. O presente processo provê uma fonte ambientalmente responsável e pouco dispendiosa do monômero de 1,3-propanodiol utilizável na produção de poliésteres e outros polímeros.

As seguintes definições devem ser usadas para interpretar as reivindicações e o relatório. 0 termo "agrupamento de genes de desidratase" ou "agrupamento de genes" se refere ao conjunto de genes que estão associados com a produção de 1,3-propanodiol em uma célula hospedeira e pretende englobar agrupamentos de genes de desidratase de glicerol bem como agrupamentos de genes de desidratase de diol. O regulon dha se refere a um agrupamento de genes de desidratase de glicerol, como ilustrado na figura 1, que inclui regiões reguladoras. 0 termo "regenerar a atividade de desidratase de " ou "reativar a atividade de desidratase de " se refere ao fenômeno da conversão de desidratase de não capaz de catálise de um substrato em uma capaz de catálise de um substrato ou ao fenômeno da inibição da inativação de uma desidratase de ou o fenômeno de estender a meia-vida útil da enzima desidratase de in vivo.

Os termos "desidratase de glicerol" ou "enzima desidratase de " ou "atividade de desidratase de " se referem ao (s) polipeptideo (s) responsáveis por uma atividade enzimática que é capaz de isomerizar ou converter uma molécula de glicerol no produto 3-hidroxipropionaldeido. Para os fins da presente invenção, as enzimas desidratase de incluem uma desidratase de glicerol (GenBank U09771, U30903) e uma desidratase de diol (GenBank D45071) tendo substratos preferidos de glicerol e 1,2-propanodiol, respectivamente.

Desidratase de glicerol de K. pneumoniae ATCC 25955 é codificada pelos genes dhaBl, dhaB2 e dhaB3 identificados nas SEQ ID NOS: 1, 2 e 3, respectivamente. Os genes dhaBl, dahB2 e dhaB3 codificam as subunidades a, b e c da enzima desidratase de glicerol, respectivamente. A expressão "proteína X de um agrupamento de genes de desidratase" ou "proteína X de dhaB" ou "proteína X" se refere a uma proteína que é comparável à proteína X do agrupamento de genes de desidratase de Klebsiella pneumoniae, como mostrado na figura 2, ou alternativamente comparável a proteína X do agrupamento de genes de desidratase de diol de Klebsiella pneumoniae, como mostrado na figura 8.

Preferivelmente, proteína X é capaz de aumentar a produção de 1,3-propanodiol em um organismo hospedeiro durante a produção de 1,3-propanodiol na ausência da proteína X no organismo hospedeiro. Sendo meios comparáveis de que DNA codificando a proteína está no mesmo local estrutural como DNA codificando proteína X de Klebsiella com respeito a dhaBl, dhaB2 e dhaB3 de Klebsiella, isto é, DNA codificando proteína X é 3' em ácido nucleico codificando dhaBl-B3, ou que a proteína X tem identidade de aminoácidos totais tanto com proteína X de desidratase de glicerol como diol de Klebsiella. A presente invenção engloba moléculas de proteína X tendo pelo menos 50%; ou pelo menos 65%; ou pelo menos 80%; ou pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com a proteína X de desidratase de diol ou glicerol de K. pneumoniae ou a proteína X de C. freundii.

Incluído no termo "proteína X" é a proteína X, também referida como ORF Z, do regulon dha de Citrobacter (Segfried M. 1996, J. Bacteriol. 178: 5793:5796). A presente invenção também engloba variações de aminoácidos da proteína X de qualquer microorganismo contanto que a variante da proteína X retenha suas características funcionais essenciais de aumentar a produção de 1,3-propanodiol em um organismo hospedeiro durante a produção de 1, 3-propanodiol no organismo hospedeiro na ausência da proteína X.

Uma porção do genoma de Klebsiella codificando a atividade enzimática de desidratase de glicerol bem como proteína X foi transformada em E. coli e o E. coli transformado foi depositado em 18 de abril de 1995 com o ATCC nos termos do Tratado de Budapeste e designado como número de acesso ATCC 69789. Uma porção do genoma de Klebsiella codificando a atividade enzimática de desidratase de diol bem como proteína X foi transformada em E. coli e o E. coli transformado foi depositado em 18 de abril de 1995 com o ATCC nos termos do Tratado de Budapeste e designado como número de acesso ATCC 69790.

Proteína X de desidratase de glicerol de Klebsiella é encontrada nas bases 9749-11572 da SEQ ID NO: 19, contando a primeira base de dhaK como a posição número 1. Proteína X codificando ácido nucleico de Citrobacter freundii (número de acesso ATCC CFU09771) é encontrada entre as posições 11261 e 13072 . A presente invenção engloba genes codificando proteína X de desidratase de que são recombinantemente introduzidos e replicados em um plasmídeo no organismo hospedeiro bem como genes que são estavelmente mantidos no genoma hospedeiro. A presente invenção engloba um processo para melhorar a produção de 1,3-propanodiol, em que o gene codificando proteína X é transformado em uma célula hospedeira junto com genes codificando a atividade de desidratase de e/ou outros genes necessários para a produção de 1,3-propanodiol. 0 gene codificando proteína X, atividade de desidratase de e/ou outros genes pode estar em cassetes de expressão iguais ou diferentes. Alternativamente, o gene codificando proteína X pode ser transformado separadamente, tanto antes como após genes codificando a atividade de desidratase de e/ou outras atividades. A presente invenção engloba célula hospedeira tendo proteína X codificando ácido nucleico endógeno bem como célula hospedeira em que falta proteína X codificando ácido nucleico endógeno.

Os termos "proteína 1", "proteína 2" e "proteína 3" se referem às proteínas codificadas em um microorganismo, que são comparáveis à proteína 1 (SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 61) (também referida como orfY) , proteína 2 (SEQ ID NO: 62 ou SEQ

ID NO: 63) (também referida como orfX) e proteína 3 (SEQ ID NO: 64 ou SEQ ID NO: 65) (também referida como orfW) , respectivamente.

Preferivelmente, na presença da proteína X, pelo menos uma das proteínas 1, 2 e 3 é capaz de aumentar a produção de 1,3-propanodiol em um organismo hospedeiro durante a produção de 1,3-propanodiol na ausência da proteína X e pelo menos uma das proteínas 1, 2 e 3 no organismo hospedeiro.

Sendo meios comparáveis de que DNA codificando as respectivas proteínas, como mostrado na figura 1, ou que as respectivas proteínas têm identidade de aminoácidos totais com as SEQ ID NOS mostradas nas figuras 3, 4 e 5. A presente invenção engloba moléculas de proteína 1 tendo pelo menos 50%; ou pelo menos 65%; ou pelo menos 80%; ou pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 61. A presente invenção engloba moléculas de proteína 2 tendo pelo menos 50%; ou pelo menos 65%; ou pelo menos 80%; ou pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com SEQ ID NO: 62 ou SEQ ID NO: 63. A presente invenção engloba moléculas de proteína 3 tendo pelo menos 50%; ou pelo menos 65%; ou pelo menos 80%; ou pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com SEQ ID NO: 64 ou SEQ ID NO: 65.

Incluídos nos termos "proteína 1", "proteína 2" e "proteína 3", respectivamente, estão orfY, orfX e orfW de Clostridium pasterurianum (Luers et al. , supra) bem como moléculas tendo pelo menos 50%; ou pelo menos 65%; ou pelo menos 80%; ou pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com orfY, orfX ou orfW de C. pasterurianum. A presente invenção engloba também variações de aminoácidos da proteína 1, 2 e 3 de qualquer microorganismo, contanto que a variante da proteína, em combinação com proteína X, retenha suas características essenciais de aumentar a produção de 1,3- propanodiol em um organismo hospedeiro durante a produção de 1,3-propanodiol no organismo hospedeiro em sua ausência. A presente invenção se refere a um processo para melhorar a produção de 1,3-propanodiol, em que o(s) genes(s) codificando pelo menos uma das proteína 1, proteína 2 e proteína 3 é transformado em uma célula hospedeira junto com genes codificando proteína X, a atividade de desidratase de e/ou outros genes necessários para a produção de 1,3- propanodiol. 0( s) genes(s) codificando pelo menos uma das proteínas 1, 2 e 3, proteína 3, proteína X, atividade de desidratase de e/ou outros genes podem ser cassetes de expressão iguais ou diferentes. Alternativamente, o(s) gene(s) codificando pelo menos uma das proteínas 1, 2 e 3 podem ser transformados separadamente, tanto antes como após os genes codificarem a atividade de desidratase de e/ou outras atividades. A presente invenção se refere a célula hospedeira tendo ácido nucleico endógeno codificando proteína 1, proteína 2 ou proteína 3 bem como célula hospedeira em que falta ácido nucleico codificando as proteínas.

Os termos "oxidorredurase" ou "oxidorredutase de 1,3-propanodiol" se referem ao(s) polipeptídeo(s) responsáveis por uma atividade enzimática que é capaz de catalisar a redução de 3-hidroxipropionaldeído em 1,3-propanodiol.

Oxidorredutase de 1,3-propanodiol inclui, por exemplo, o polipeptídeo codificando pelo gene dha T (GenBank U09771, U30903) e é identificado como SEQ ID NO: 4.

Os termos "desidrogenase de glicerol-3-fosfato" ou "G3PDH" se referem ao(s) polipeptídeo(s) responsáveis por uma atividade enzimática capazes de catalisar a conversão de fosfato de desidroxiacetona (DHAP) em glicerol-3-fosfato (G3P) . G3PDH in vivo pode ser dependente de NADH, NADPH ou FAD. Exemplos desta atividade enzimática incluem os seguintes: enzimas dependentes de NADH (E.C. 1.1.1.8) são codificadas por vários genes, incluindo GPD1 (GenBank Z74071x2) ou GPD2 (GenBank Z35169xl) ou GPD3 (GenBank G984182) ou DAR1 (GenBank Z74071x2); uma enzima dependente de NADPH (E.C. 1.1.1.94) é codificada por gpsA (GenBank U32164, G466746 (cds 197911- 196892) e L45246); e enzimas dependentes de FAD (E.C.

1.1.99.5) são codificadas por GUT2 (GenBank Z47047x23) ou glpD (GenBank G147838) ou glpABC (GenBank M20938).

Os termos wglicerol-3-fosfatase" ou "sn-glicerol-3- fosfatase" ou "d,1-glicerol fosfatase" ou "fosfatase G3P" se referem ao(s) polipeptideo(s) responsáveis por uma atividade enzimática que é capaz de catalisar a conversão de glicerol-3- fosfatase em glicerol. Fosfatase G3P inclui, por exemplo, os polipeptideos codificados por GPP1 (GenBank Z47047xl25) ou GPP2 (GenBank U18813xll). 0 termo "quinase glicerol" se refere ao(s) polipeptideo(s) responsáveis por uma atividade enzimática capaz de catalisar a conversão de glicerol em glicerol-3- fosfatase ou glicerol-3-fosfato em glicerol, dependendo das condições de reação. Quinase glicerol inclui, por exemplo, o polipeptideo codificado por GUT1 (GenBank U11583xl9).

Os termos "GPD1", "DAR1", "OSG1", "D2830" e "YDL022W" serão usados intercambiavelmente e se referem a um gene que codifica uma desidrogenase glicerol-3-fosfato citossólica e caracterizado pela sequência base dada como SEQ ID NO: 5. 0 termo "GPD2" se refere a um gene que codifica uma desidrogenase glicerol-3-fosfato citossólica e caracterizado pela sequência base SEQ ID NO: 6.

Os termos "GUT2" e "YIL155C" são usados intercambiavelmente e se referem a um gene que codifica uma desidrogenase glicerol-3-fosfato mitocondrial e caracterizado pela sequência base dada em SEQ ID NO: 7.

Os temos "GPP1", "RHR2" e "YIL053W" são usados intercambiavelmente e se referem a um gene que codifica uma glicerol-3-fosfatase citossólica e caracterizado pela sequência base dada como SEQ ID NO: 8.

Os termos "GPP2", "H0R2" e ''YER0 62C" são usados intercambiavelmente e se referem a um gene que codifica uma glicerol-3-fosfatase citossólica e caracterizado pela sequência base dada como SEQ ID NO: 9. 0 termo "GUT1" se refere a um gene que codifica uma quinase glicerol citossólica e caracterizado pela sequência base dada como SEQ ID NO: 10.

Os termos "função" ou "função enzimática" se referem à atividade enzimática alterando a energia requerida para realizar uma reação química específica. Entende-se que esta atividade pode se aplicar a uma reação em equilíbrio em que a produção tanto do produto como do substrato pode ser realizada em condições apropriadas.

Os termos "polipeptídeo" e "proteína" dão usados intercambiavelmente.

Os termos "substrato de carbono" e "fonte de carbono" se referem a uma fonte de carbono capaz de ser metabolizada pelos organismos hospedeiros da presente invenção e, particularmente, fontes de carbono selecionada dentre o grupo consistindo de monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarideos, e os substratos de carbono ou misturas dos mesmos.

Os termos "célula hospedeira" ou "organismo hospedeiro" se referem a um microorganismo capaz de receber genes estranhos ou heterólogos e de expressar estes genes para produzir um produto genético ativo.

Os termos "gene estranho", " DNA estranho", "gene heterólogo" e "DNA heterólogo" se referem a material genético nativo em um organismo que é colocado em um organismo hospedeiro por vários meios. 0 gene de interesse pode ser um gene de ocorrência natural, um gene mudado ou um gene sintético.

Os termos "organismo recombinante" e "hospedeiro transformado" se referem a qualquer organismo tendo sido transformado com genes estranhos ou heterólogos ou cópias extras de genes homólogos. Os organismos recombinantes da presente invenção expressam genes estranhos codificando desidrogenase glicerol-3-fosfatase (G3PDH) e glicerol-3- fosfatase (fosfatase G3P), desidratase de glicerol (dhaB) e oxidorredutase 1,3-propanodiol (dhaT) para a produção de 1,3- propanodiol de substratos de carbono apropriados. "Gene" se refere a um fragmento de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, incluindo sequências regulatórias precedendo (não codificação 5') e após (não codificação 3') a região de codificação. Os termos "nativo" e "tipo selvagem" se referem a um gene como encontrado in natura com suas sequências regulatórias próprias.

Os termos "encodificação" e "codificação" se referem ao processo pelo qual um gene, através de mecanismos de transcrição e translação, produz uma sequência de aminoácidos.

Entende-se que o processo de encodificação de uma sequência de aminoácidos especifica inclui sequências de DNA que podem envolver alterações de base que não causam uma alteração no aminoácido codificado, ou que envolve alterações de base que podem alterar um ou mais aminoácidos, mas não afetam as propriedades funcionais da proteína codificada pela sequência de DNA. Entende-se, consequentemente, que a invenção engloba mais do que sequências exemplares específicas. Modificações na sequência, como deleções, inserções ou substituições na sequência que produzem alterações silenciosas que não afetam substancialmente as propriedades funcionais da molécula da proteína resultante são também contempladas. Por exemplo, alteração na sequência genética que reflete a degeneração do código genético, ou que resultam na produção de um aminoácido quimicamente equivalente em um dado sítio, é contemplada.

Assim, um códon para o aminoácido alanina, um ácido hidrófobo, pode ser substituído por um códon codificando outro resíduo menos hidrófobo, como glicina, ou um resíduo mais hidrófobo, como valina, leucina ou isoleucina. Similarmente, espera-se que alterações que resultam em substituição de um resíduo carregado negativamente para outro, como ácido aspártico para ácido glutâmico, ou um re-sódio carregado positivamente para outro, como lisina para arginina, podem também produzir um produto biologicamente equivalente. Espera-se também que alterações de nucleotídeos que resultam em alteração das porções N-terminal e C-terminal da molécula de proteína podem também altera a atividade de proteína. Em alguns casos, pode de fato se desejável preparar mutantes da sequência a fim de estudar o efeito da alteração na atividade biológica da proteína. Cada uma das modificações propostas está dentro da rotina dos versados na arte, como está a determinação de retenção da atividade biológica nos produtos codificados. Além do mais, os versados na arte reconhecerão que sequências englobadas por esta invenção são também definidas por sua capacidade de hibridizar, em condições estringentes (0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C) , com as sequências aqui exemplificadas. O termo "expressão" se refere à transcrição e translação do produto genético de um gene codificando a sequência do produto genético.

Os termos "plasmídeo", "vetor" e "cassete" se referem a um elemento cromossômico extra frequentemente conduzindo genes que não fazem parte do metabolismo central da célula e, geralmente, na forma de moléculas de DNA de filamento duplo circulares. Estes elementos podem ser sequência de replicação autônoma, sequências integrando genoma, sequências de fago ou nucleotídeo, RNA ou DNA de filamento duplo ou único, linear ou circular, derivado de qualquer fonte, em que um número de sequências de nucleotídeo são unidas ou recombinadas em uma construção única que é capaz de introduzir um fragmento de promotor e sequência de DNA para um produto genético selecionado, junto com sequência não traduzida 3' apropriada em uma célula. "Cassete de transformação" se refere a um vetor contendo um gene estranho e tendo elementos além do gene estranho que facilitam a transformação de uma célula hospedeira particular. "Cassete de expressão" se refere a um vetor específico contendo um gene estranho e tendo elementos além do gene estranho que permitem expressão melhorada do gene em um hospedeiro estranho.

Os termos "transformação" e "transfecção" se referem à aquisição de genes novos em uma célula após a incorporação do ácido nucleico. Os genes adquiridos podem ser integrados no DNA cromossômico ou introduzido como sequências de replicação extracromossômicas. 0 termo "transformante" se refere ao produto de uma transformação. 0 gene "alterado geneticamente" se refere ao processo de alterar material hereditário por transformação ou mutação. 0 termo "isolado" se refere a uma proteína ou sequência de DNA que é removida de pelo menos um componente com o qual ela está associada naturalmente. 0 termo "homólogo" se refere a uma proteína ou polipeptídeo nativo ou de ocorrência natural em uma célula hospedeira gram-positiva. A invenção inclui microorganismos produzindo a proteína homóloga via tecnologia de DNA recombinante.

CONSTRUÇÃO DE ORGANISMOS RECOMBINANTES

Organismos recombinantes contendo os genes necessários que codificarão a via enzimática para a conversão de um substrato de carbono em 1,3-propanodiol podem ser construídos usando técnicas bem conhecida na arte. Como discutido no exemplo 9, genes codificando dhaBl, dhaB2, dhaB3 e proteína X de Klebsiella foram usados para transformar DH5a E. coli e, no exemplo 10, genes codificando pelo menos uma das proteínas 1, 2 e 3 de Klebsiella bem como pelo menos um gene codificando proteína X foi usado para transformar E. coli.

Genes codificando desidrogenase glicerol-3-fosfaro (G3PDH), glicerol-3-fosfatase (fosfatase G3P) , desidratase de glicerol (dhaB) e oxidorredutase de 1,3-propanodiol (dha T) foram isolados de um hospedeiro nativo como Klebsiella ou Saccahromyces e usados para transformar cepas hospedeiras como DH5a, ECL707, ΑΆ200 ou W1485 E. coli; a cepa YPH500 de Saccharomyces cerevisiae; ou as cepas ATCC 29955 ou ECL 2106 de Klebsiella pneumoniae.

Isolamento de genes Processos para obter genes desejados de um genoma bacteriano são comuns e bem conhecidos na arte da biologia molecular. Por exemplo, se a sequência do gene é conhecida, bibliotecas genômicas apropriadas podem ser criadas por digestão de endonuclease de restrição e podem ser tríadas com sondas complementares para a sequência genética desejada. Uma vez que a sequência é isolada, o DNA pode ser ampliado usando processos de ampliação dirigidos a iniciadores padrões como reação de cadeia polimerase (PCR) (US 4.683.202) para obter quantidades de DNA apropriadas para transformação usando vetores apropriados.

Alternativamente, bibliotecas de cosmídeos podem ser criadas, em que grandes segmentos de DNA genômico (35-45 kb) podem ser embalados em vetores e usados para transformar hospedeiros apropriados. Vetores de cosmídeos são únicos sendo capazes de acomodar grandes quantidades de DNA. Em geral, vetores de cosmídeos têm pelo menos uma cópia da sequência de DNA cos que é necessária para embalagem e circularização subsequente do DNA estranho. Além da sequência cos, estes vetores conterão, também, uma origem de replicação como marcadores ColEl e de resistência a drogas como um gene resistente à amplicilina ou neomicina. Processos para usar vetores de cosmideos para a transformação de hospedeiros bacterianos apropriados são bem descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbon, NY (1989) .

Tipicamente para clonar cosmideos, DNA estranho é isolado e ligado, usando as endonucleases de restrição apropriadas, adjacentes à região cos do vetor de cosmideos.

Vetores de cosmideos contendo o DNA estranho linearizado são então reagidos com o veículo de embalagem de DNA como bacteriófafo I. Durante o processo de embalagem os sítios cos são clivados e o DNA estranho é embalado na porção superior da partícula viram bacteriana. Estas partículas são então usadas para transfectar células hospedeiras apropriadas como E. coli.

Uma vez injetado na célula, o DNA estranho circulariza sob a influência das extremidades pegajosas de cos. Deste modo, grandes segmentos do DNA estranho podem ser introduzidos e expressados em células hospedeiras recombinantes.

Isolamento e clonagem de genes codificando desidratase de glicerol (dhaB) e oxidorredutase de 1, 3-propanodiol (dhaT) Vetores de cosmideos e processos de transformação de cosmideos foram usados dentro do contexto da presente invenção para clonar grandes segmentos do DNA genômíco de gêneros bacterianos conhecidos possuir genes capazes de processar glicerol em 1,3-propanodiol. Especificamente, DNA genômico de ATCC 25955 K. pneumoniae foi isolado por processos bem conhecidos na arte e digerido com a enzima de restrição Sau3A para inserção em um vetor de cosmídeo Supercos 1 e embalado usando extratos de embalagem Gigapackll. Após a construção do vetor, células XLl-Blue MR de E. coli foram transformadas com o DNA do cosmídeo. Os transformantes foram triados para a capacidade de converter glicerol em 1,3-propanodiol fazendo crescer as células na presença de glicerol e analisando o meio para a formação de 1,3-propanodiol.

Dois dos transformantes positivos de 1,3-propanodiol foram analisados e os cosmídeos denominados pKPl e pKP2. A sequenciação de DNA revelou homologia extensa no gene de desidratase de glicerol (dha B) de C. freundii, demonstrando que estes transformantes continham DNA codificando o gene de desidratase de glicerol. Outros transformantes positivos de 1,3-propanodiol foram analisados e os cosmídeos denominados pKP4 e pKP5. Sequenciação de DNA revelou que os cosmídeos carregavam DNA codificado um gene de desidratase de diol.

Isolamento de genes codificando proteína X, proteína 1, proteína 2 e proteína 3 Apesar da presente invenção utilizar os genes isolados de dentro de um cosmídeo de Klebsiella, fontes alternativas de genes de desidratase de e proteína X, proteína I, proteína 2 e proteína 3 incluem, mas não estão limitadas a, Citrobacter, Clostridia e Salmonella. Tobimatsu et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 22352-22357 descrevem o operon de desidratase de glicerol de K. pneumoniae em que proteína X é identificada como ORF 4; Segfried et al., 1996, J. Bacteriol. 178: 5793-5796 descrevem o operon de desidratase de glicerol de C. freundii em que proteína X é identificada como ORF Z. A figura 8 descreve proteína X de desidratase de diol de Klebsiella e figuras 3, 4 e 5 descrevem sequências de aminoácidos das proteínas 1, 2 e 3 de Klebsiella e Citrobacter.

Genes codificando fosfatase G3PDH e G3P A presente invenção provê genes apropriados para a expressão de atividades de G3PDH e G3P em uma célula hospedeira.

Genes codificando G3PDH são conhecidos. Por exemplo, GPD1 é isolado de Saccahromyces e tem a sequência base dada por SEQ ID NO: 5, codificando a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 11 (Wang et al., supra) . Similarmente, a atividade de G3PDH é também isolada de Saccharomyces codificado por GPD2 tendo a sequência base dada em SEQ ID NO: 6, codificando a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 12 (Eriksson et al., Mol. Microbiol. 17, 95 (1995).

Contempla-se que qualquer gene codificando um polipeptídeo responsável pela atividade de G3PDH é apropriado para os fins da presente invenção, em que a atividade é capaz de catalisar a conversão de fosfato di-hidroxiacetona (DHAP) em glicerol-3-fosfato (G3P). Além disso, contempla-se que qualquer gene codificando a sequência de aminoácidos de G3PDH, como dado por qualquer uma das SEQ ID NOS: 11, 12, 13, 14, 15 e 16 correspondentes aos genes GPD1, GPD2, GUT2, gpsA, glpD, e a subunidade de glpABC, respectivamente, será funcional na presente invenção, em que a sequência de aminoácidos engloba substituições, deleções ou adições de aminoácidos, que não alteram a função da enzima. Será apreciado pelos versados na arte que genes codificando GePDH isolado de outras fontes são também apropriados para uso na presente invenção. Por exemplo, genes isolados de procariotos incluem GenBank accessos M34393, M20938, L06231, U12567, L45246, L45323, L45324, L45435, U32164 e U39682; genes isolados de fungos incluem acessos GenBank U30625, U30876 e X56162; genes isolados de insetos incluem acessos GenBank X61223 e X14179; e genes isolados de fontes de mamíferos incluem acessos GenBank U12424m M25558 e X78593.

Genes codificando fosfatase G3P são conhecidos. Por exemplo, GPP2 é isolado de Saccharomyces cerevisiae e tem a sequência base dada por SEQ ID NO: 9 que codifica a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 17 (Norbeck et al., J. Biol.

Chem. 271, P. 13875, 1996).

Contempla-se que qualquer gene codificando uma atividade de fosfatase G3P é apropriado para os fins da presente invenção, em que a atividade é capaz de catalisar a conversão de glicerol-3-fosfato em glicerol. Além disso, contempla-se que qualquer gene codificando a sequência de aminoácidos de fosfatase G3P como dada por SEQ ID NOs: 33 e 17 será funcional na presente invenção, em que a sequência de aminoácidos engloba substituições, deleções ou adições de aminoácidos que não alteram a função da enzima. Será apreciado pelos versados na arte que genes codificando fosfatase G3P isolada de outras fontes são também apropriados para uso na presente invenção. Por exemplo, a desfosforilação de glicerol- 3-fosfato para dar glicerol pode ser obtida com uma ou mais das seguintes fosfatases: fosfatase alcalina (E.C. 3.1.3.1) [GenBank M19159, M29663, U02550 ou M33965]; fosfatase ácida (E.C. 3.1.3.2) [GenBank U51210, U19789, U28658 ou L20566]; glícerol-3-fosfatase (E.C. 3.1.3.-) [GenBank Z38060 ou U18813xll]; glucose-l-fosfatase [E.C. 3.1.3.10) [GenBank M33807]; glucose-6-fosfatase (E.C. 3.1.3.9) [GenBank U00445]; frutose-1,6-bisfosfatase (E.C. 3.1.3.11) [GenBank X12545 ou J03207] ou fosfotidil glicerol fosfato fosfatase (E.C. 3.1.3.27) [GenBank M23546 e M23628].

Genes codificando quinase glicerol são conhecidos.

Por exemplo, GUT1 codificando a quinase glicerol de Saccharomyces foi isolado e sequenciado (Pavlik et al., Curr- Genet. 24, 21, (1993)) e a sequência base é dada por SEQ ID

NO: 10 que codifica a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 18. Será apreciado pelos versados na arte que apesar de quinase glicerol catalisar a degradação de glicerol in natura, a mesma enzima será capaz de funcionar na síntese de glicerol para converter glicerol-3-fosfato em glicerol nas condições de energia de reação apropriadas. Existe evidência para produção de glicerol através de uma quinase glicerol. Em condições anaeróbicas ou inibidas por respiração, Tripanosoma brucei dá surgimento a glicerol na presença de Glicerol-3-Ρ e ADP. A reação ocorre no compartimento do glicossoma (D. Hammond, J.

Biol. Chem. 260, 15646-15654, (1985)). Células hospedeiras Células hospedeiras apropriadas para a produção recombinante de ppm podem ser tanto procarióticas como eucarióticas e serão limitadas somente pela capacidade de células hospedeiras expressarem enzimas ativas. Hospedeiros preferidos serão os tipicamente utilizáveis para produção de glicerol ou 1,3-propanodiol como Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Blebsiella, Aerobacter, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces, Schisosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Eschericchia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces e Pseudomonas. Mais preferidos na presente invenção são espécies E. coli, Klebsiella e espécies Saccharomyces.

Adenosil-cobalamina (coenzima Bi2) é um cofator essencial para atividade de desidratase de glicerol. A coenzima é o produto natural não polimérico mais complexo conhecido, e sua síntese in vivo é dirigida usando os produtos de cerca de 30 genes. Síntese da coenzima Bi2 é encontrada em procariotos, alguns dos quais são capazes de sintetizar o composto de novo, enquanto outros podem realizar reações parciais. E. coli, por exemplo, não pode fabricar a estrutura em anel corrin, mas é capaz de catalisar a conversão de cobinamida em corrinóide e pode introduzir o grupo 5'- deoxiadenosil.

Eucariotos são incapazes de sintetizar a coenzima Bi2 de novo e, ao contrário, transportam vitamina Bi2 do meio extracelular com conversão subsequente do composto em sua forma funcional do composto por enzimas celulares. Três atividades enzimáticas são descritas para esta série de reações. 1) reductase aquacobalamina (E.C. 1.6.99.8) reduz Co (III) em Co (II); 2) reductase cob(II)alamina (E.C. 1.6.99.9) reduz Co (II) em Co (I); e 3) adenosiltransf ersase cob (I) alamina (E.C. 2.5.1.17) transfere uma porção de 5'- deoxiadenosina de ATP para o corrinóde reduzido. Esta última atividade enzimática é a melhor caracterizada das três, e é codificada por cobA em S. typhimurium, btuR em E. coli e cobO em P. identificans. Estes três genes de adenosiltransferase cob(I)alamina foram clonados e sequenciados. Atividade de adenosiltransferase cob(I)alamina foi detectada em fibroblastos humanos e em mitocondrias isoladas de rato (Fenton et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 98, 283-9 (1981)). As duas enzimas envolvidas na redução de cobalto são fracamente caracterizadas e sequências genéticas não estão disponíveis. Existem duas descrições de uma reductase de aquacobalamina de Eugenia gracilis (Watanabe et al., Arch.

Biochem. Biophys. 305, 421-7 (1993)) e uma reductase de cob(III)alamina microssômica está presente nas frações de membranas internas microssômicas e mitocondriais de fibroblastos de rato (Pezacka, Biochim. Biophys. Acta, 1157, 167-77, (1993)) .

Meios de cultura suplementados com vitamina B12 podem satisfazer a necessidade de produzir coenzima B12 para atividade de desidratase de glicerol em muitos microorganismos, mas, em alguns casos, atividades catalíticas adicionais podem ter que ser adicionadas ou aumentadas in vivo. Síntese melhorada da coenzima B12 em eucariotos pode ser particularmente desejável. Dadas as sequências publicadas para genes codificando adenosiltransferase de con(I)alamina, a clonagem e expressão destes genes podem ser realizadas por um versado na arte. Por exemplo, contempla-se que leveduras, como Saccharomyces, podem ser construídas de modo a conterem genes codificando adenosiltransfersase de cob(I)alamina além dos genes necessários para efetuar conversão de um substrato de carbono como glucose em 1,3-propanodiol. Clonagem e expressão de genes para redução de cobalto requer uma abordagem diferente. Esta pode ser baseada em uma seleção em E. coli para crescimento em etanolamina como fonte de N2 única. Na presença da coenzima Βχ2, lise de amônia etanolamina capacita o crescimento de células na ausência de outras fontes de N2.

Se células de E. coli contêm um gene clonado para adenosiltransferase de cob(I)alamina e DNA clonado aleatório de outro organismo, crescimento em etanolamina na presença de aquacobalamina deve ser melhorada e selecionada se o DNA clonado aleatório codifica propriedades de redução de cobalto para facilitar adenosilação da aquacobalamina.

Desidratase de glicerol é uma enzima de multi- subunidades consistindo de três componentes de proteína que são dispostos em uma configuração a2b2g2 (M. Seyfried et al. , J. Bacteriol., 5793-5796 (1996)). Esta configuração é uma apo- enzima inativa que liga uma molécula da coenzima Bi2 para tornar a holo-enzima cataliticamente ativa. Durante catálise, a holo-enzima suporta inativação de primeira ordem, rápida, para tornar um complexo inativo em que a coenzima B22 é convertida em hidroxicobalamina (Z. Schneider e J.

Pawelkoewícz, ACTA Biochim. Pol., 311-328 (1996)). Análise estequiométrica da reação de desidratase de glicerol com glicerol como substrato revelou que cada molécula da enzima catalisa 100.000 reações antes da inativação (Z. Schneider e J. Pawelkiewcs, ACTA Biochim. Pol., 311-328 (1966)). In vitro, este complexo inativo pode somente ser reativado por remoção da hidroxicobalamina, por tratamento químico forte com magnésio e sulfeto, e substituição com coenzima Bi2 adicional (Z. Schneider et al., J. Biol. Chem., 3388-3396 (1970)).

Desidratase de glicerol inativada em Klebsiella pneumoniae do tipo selvagem pode ser reativada in situ (células toluenizadas) na presença da coenzima Bi2, adenosina 5'- trifosfato (ATP) e manganês (S. Honda et al., J. Bacteriol. 1458-1465 (1980)). Esta reativação mostrou ser devido à substituição dependente de ATP da cobalamina inativada com coenzima Βχ2 (K. Ushio et al., J. Nutr. Sei. Vitaminol. 225- 236 (1982)). Extratos de células de células toluenizadas que catalisam in situ a ATP, manganês e coenzima Bi2 dependentes de reativação são inativos com relação a esta reativação.

Assim, sem tratamento redutivo químico forte ou substituição mediada por células do cofator inativado, desidratase de glicerol pode somente catalisar 100.000 reações por molécula. A presente invenção demonstra que a presença da proteína X é importante para reativação in vivo da desidratase de e a produção de 1,3-propanodiol é aumentada em uma célula hospedeira capaz de produzir 1,3-propanodiol na presença da proteína X. A presente invenção descreve também que a presença da proteína 1, proteína 2 e proteína 3, em combinação com proteína X, também aumentou a produção de ppm em uma célula hospedeira capaz de produzir 1,3-propanodiol.

Além de E. coli e Saccharomyces, Klebsiella é um hospedeira particularmente preferido. Sabe-se que cepas de Klebsiella pneumoniae produz 1,3-propanodiol quando crescendo em glicerol como o carbono único. Contempla-se que Klebsiella pode ser alterada geneticamente para produzir 1,3-propanodiol de monossacarídeos, oligossacarideos, polissacarídeos, ou substratos de um carbono. A fim de engenheirar estas cepas, será vantajoso prover um hospedeiro Klebsiella com os genes facilitando a conversão de fosfato de di-hidroxiacetona em glicerol e conversão de glicerol em 1,3-propanodiol tanto separadamente como juntos, con o controle transcripcional de um ou mais promotores indutiveis ou constitutivos. A introdução dos genes DAR1 e GPP2 codificando desidrogenase glicerol-3-fosfato e glicerol-3-fosfatase, respectivamente, proverá Klebsiella com maquinário genérico para produzir 1,3-propanodiol de um substrato de carbono apropriado.

Os genes codificando proteína X, proteína 1, proteína 2 e proteína 3 ou outras enzimas associadas com a produção de 1,3-propanodiol (por exemplo, fosfatase G3PDH, G3P, dhaB e/ou dhaT) podem ser introduzidos em qualquer vetor de plasmídeo capaz de replicação em K. pneumoniae ou podem ser integrados no genoma de K. pneumoniae. Por exemplo, sabe-se que ATCC 25955 K. pneumoniae e ECL 2106 K. pneumoniae são sensíveis a tetraciclina ou cloranfenicol; assim, vetores de plasmídeo que são ambos capazes de replicar em K. pneumoniae e codificar resistência a qualquer um ou ambos antibióticos podem ser usados para introduzir estes genes em K.pneumoniae.

Processos para transformar Klebsiella com genes de interesse são comuns e bem conhecidos na arte e protocolos apropriados, incluindo vetores apropriados e técnicas de expressão podem ser encontrados em Sambrook, supra.

Vetores e cassetes de expressão A presente invenção provê uma variedade de vetores e cassetes de transformação e expressão apropriados para a clonagem, transformação e expressão da proteína X, proteína 1, proteína 2 e proteína 3, bem como outras proteínas associadas com a produção de 1,3-propanodiol, por exemplo fosfatase G3PDH e G3P em uma célula hospedeira apropriada. Vetores apropriados serão os que são compatíveis com a bactéria empregada. Vetores apropriados podem ser derivados de, por exemplo, uma bactéria, um vírus (como bacteriófago T7 ou um fago derivado de M13), um cosmideo, uma levedura ou uma planta. Protocolos para obter e usar estes vetores são conhecidos dos versados na arte. (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual - volumes 1, 2, 3 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989)).

Tipicamente, o vetor ou cassete contém sequências dirigindo transcrição e translação do gene relevante, um marcador selecionável, e sequências permitindo replicação autônoma ou integração cromossômica. Vetores apropriados compreendem uma região 5' do gene que aloja controles de iniciação transcripcionais e uma região 3' do fragmento de DNA que controla terminação transcripcional. Prefere-se mais quando ambas as regiões de controle são derivadas de genes homólogos na célula hospedeira transformada, apesar de ser compreendido que estas regiões de controle necessitam ser derivadas de genes nativos nas espécies especificas escolhidas como um hospedeiro de produção.

Promotores ou regiões de controle de iniciação, que são utilizáveis para conduzir expressão da proteína x e proteína 1, proteína 2 ou proteína 3 na célula hospedeira desejada, são numerosos e familiares aos versados na arte.

Virtualmente qualquer promotor capaz de conduzir estes genes é apropriado para a presente invenção, incluindo mas não limitados a CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (utilizáveis para expressão em Saccharomyces); 0X1 (utilizável para expressão em Pichia); e lac, trp, IPL, IPR, T7, tac e trc (utilizáveis para expressão em E. coli).

Regiões de controle de terminação podem ser também derivadas de vários genes nativos nos hospedeiros preferidos.

Opcionalmente, um sítio de terminação pode ser desnecessário, no entanto, é mais preferido se incluído.

Para expressão eficaz das presentes enzimas, DNA codificando as enzimas são ligados operavelmente através de códons de iniciação a regiões de controle de expressão selecionadas de modo que a expressão resulta na formação do RNA mensageiro apropriado.

Transformação de hospedeiros apropriados e expressão de genes para a produção de 1,3-propanodiol Uma vez construídos cassetes apropriados, eles são usados para transformar células hospedeiras apropriadas. A

introdução do cassete contendo atividade dhaB, proteína X dhaB e pelo menos uma das proteína 1, proteína 2 e proteína 3 e, opcionalmente, oxidoredutase 1,3-propanodiol (dhaT), tanto separadamente como juntas na célula hospedeira, pode ser realizada por procedimentos conhecidos como por transformação (por exemplo, usando células permeabilizadas com cálcio, eletroporaçâo) ou por transfecção usando um virus de fago recombinante (Sambrook et al., supra). Na presente invenção, DH5a E. coli foi transformado com subunidades dhaB 1, 2 e 3 e proteína X dha.

Adicionalmente, foi criado W2042 E. coli (ATCC 98188) contendo os genes codificando desidrogenase glicerol-3- fosfato (G3PDH) e glicerol-3-fosfatase (fosfatase G3P) , desidratase de glicerol (dhaB), e oxidoredutase 1,3- propanodiol (dha T) . Adicionalmente, foi construído YPH500 S. cerevisiae (ATCC 74392) alojando plasmídeos pMCKlO, pMCK17, pMCK30 e pMCK35 contendo genes codificando desidrogenase glicerol-3-fosfatase (G3PDH) e glicerol-3-fosfatase (fosfatase G3P) , desidratase de glicerol (dhaB) e oxidoredutase 1,3- propanodiol (dhaT). Ambos E. coli e Saccharomyces transformados, acima mencionados, representam formas de realização preferidas da invenção.

Meio e substratos de carbono: Meio de fermentação na presente invenção deve conter substratos de carbono apropriados. Substratos apropriados podem incluir, mas não estão limitados a, monossacarídeos como glucose e frutose, oligossacarídeos como lactose ou sacarose, polissacarídeos como amido ou celulose, ou misturas dos mesmos, e misturas não purificadas de cargas renováveis como permeato de soro de queijo, licor embebido em milho, melaços de beterraba e malte de cevada. Adicionalmente, o substrato de carbono pode também ser substratos de um carbono como dióxido de carbono, ou metanol para o qual conversão metabólica nos intermediários bioquímicos chave é demonstrada. Produção de glicerol de fontes de carbono únicas (por exemplo, metanol, formaldeído ou formato) foi descrita em leveduras metilotróficas (Yamada et al., Agric. Biol. Chem., 53(2) 541- 543, (1989)) e em bactérias (Hunter et al., Biochemistry, 24, 4148-4155 (1985)). Estes organismos podem assimilar compostos de carbono únicos, na faixa do estado de oxidação de metano em formato, e produzir glicerol. A via de assimilação de carbono pode ser através de monofosfato de ribulose, através de serina, ou através de xilulose-monofosfato (Gottschalk, Bacterial Metabolism, segunda edição, Springer-Verlag: New York (1986)). A via monofosfato de ribulose envolve a condensação de formato com ribulose-5-fosfato para formar um açúcar de 6 carbonos que torna-se frutose e, eventualmente, o produto de três carbonos gliceraldeído-3-fosfato. Do mesmo modo, a via serina assimila o composto de um carbono na via glicolítica via metilenotetraidrofolato.

Além da utilização de substratos de um e dois carbonos, sabe-se também que organismos metilotróficos utilizam um número de outros compostos contendo carbono como metilamina, glucosamina e uma variedade de aminoácidos para atividade metabólica. Por exemplo, sabe-se que leveduras metilotróficas utilizam o carbono de metilamina para formar tre-halose ou glicerol (Belliol et al·., Microb. Growth Cl Compd., [Int. Symp.], 7- (1993), 415-32. Editor (es): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, Reino Unido). Similarmente, várias espécies de Candida metabolizarão alanina ou ácido oleico (Sulter et al., Arch. Microbiol. 153(5), 485-9 (1990)). Consequentemente, a fonte de carbono utilizada na presente invenção pode englobar uma variedade de substratos contendo carbono e somente serão limitados pelos requisitos do organismo hospedeiro.

Apesar de ser contemplado que todos os substratos de carbono mencionados acima e misturas dos mesmos são apropriados na presente invenção, substratos de carbono preferidos são monossacarideos, oligossacarideos, polissacarídeos e substratos de um carbono. Mais preferidos são açúcares como glucose, frutose, sacarose e substratos de carbono únicos como metanol e dióxido de carbono. Mais preferido é glucose.

Além de uma fonte de carbono apropriada, meio de fermentação deve conter minerais, sais, cofatores, tampões e outros componentes apropriados, conhecidos dos versados na arte, apropriados para o crescimento de culturas e promoção da via enzimática necessária para produção de glicerol. Atenção particular é dada a sais de Co (II) e/ou vitamina B12 ou precursores dos mesmos.

Condições de cultura Tipicamente, células crescem a 30°C em meio apropriado. Meio de crescimento preferido na presente invenção são meios preparados comercialmente comuns como caldo de Luria Bertani (LB), caldo de Sabouraud Dextrose (SD) ou caldo de extrato de malte de levedura (YM). Outros meios de crescimento definidos ou sintéticos podem ser também usados e o meio apropriado para crescimento de microorganismo particular serão conhecidos por alguns dos versados na arte da ciência da microbiólogia ou fermentação. 0 uso de agentes conhecidos modular repressão catabólica diretamente ou indiretamente, por exemplo, 2’ :3'-monofosfato de adenosina cíclico ou 2':5'- monofosfato de adenosina cíclico, podem também ser incorporados no meio de reação. Similarmente, o uso de agentes conhecidos modular atividades enzimáticas (por exemplo, sulfitos, bissulfitos e álcalis), que levam ao melhoramento da produção de glicerol pode ser aplicado em conjunto com ou como uma alternativa para manipulações genéticas.

Faixas de pH apropriadas para a fermentação estão entre pH 5,0 a pH 9,0, em que pH 6,0 a pH 8,0 é preferido como faixa para a condição inicial.

Reações podem ser realizadas em condições aeróbicas ou anaeróbicas, em que condições anaeróbicas ou microaeróbicas são preferidas.

Fermentações em batelada e contínuas O presente processo usa um processo em batelada de fermentação. Uma fermentação em batelada clássica é um sistema fechado, onde a composição do meio é colocada no início da fermentação e não submetida a alterações artificiais durante a fermentação. Assim, no início da fermentação, o meio é inoculado com o organismo ou organismos desejados e fermentação é permitida ocorrer adicionando nada ao sistema.

Tipicamente, no entanto, uma fermentação em batelada é formada em "batelada" com respeito à adição da fonte de carbono e tentativas são frequentemente feitas em fatores de controle como pH e concentração de oxigênio. As composições de metabólito e biomassa do sistema de batelada altera-se constantemente até o tempo de fermentação ser interrompido. Em culturas em batelada, células moderam através de uma fase lag estática em uma fase log de crescimento elevado e, finalmente, em uma fase estacionária onde a taxa de crescimento é diminuída ou parada. Se não tratadas, células na fase estacionária eventualmente morrerão. Células na fase log são, geralmente, responsáveis pelo volume da produção do produto final ou intermediário.

Uma variação no sistema de batelada padrão é o sistema de fermentação batelada-alimento que é também apropriado na presente invenção. Nesta variação de um sistema de batelada típico, o substrato é adicionado em incrementos como os progressos da fermentação. Sistemas batelada-alimento são utilizáveis quando repressão de catabólito está apta a inibir o metabolismo de células e onde é desejável ter quantidades limitadas do substrato no meio. Medição da concentração de substrato atual nos sistemas batelada-alimento é difícil e é, consequentemente, estimada na base das alterações de fatores mensuráveis como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases de rejeito como C02. Fermentações em batelada e alimento-batelada são comuns e bem conhecidas na arte e exemplos podem ser encontrados em Brock, supra.

Contempla-se, também, que o processo pode ser adaptável a processos de fermentação contínua. Fermentação contínua é um sistema aberto onde um meio de fermentação definido é adicionado continuamente a um bio-reator e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para processamento. Fermentação continua mantém, geralmente, as culturas em uma densidade alta constante, onde as células estão primeiramente no crescimento da fase log.

Fermentação continua permite a modulação de um fator ou qualquer número de fatores que afetam o crescimento celular ou a concentração do produto final. Por exemplo, um processo manterá um nutriente de limitação como a fonte de carbono ou nível de nitrogênio em uma taxa fixa e permitirá moderar todos os outros parâmetros. Em outros sistemas, um número de fatores afetando o crescimento pode ser alterado continuamente enquanto a concentração de células, medida por turvação média, é mantida constante. Sistemas contínuos empenham-se em manter condições de crescimento no estado estável e, assim, a perda de células devido ao meio sendo retirado pode ser equilibrada contra a taxa de crescimento de células na fermentação. Métodos de nutrientes de modulação e fatores de crescimento para processos de fermentação contínua bem como técnicas para maximizar a taxa de formação do produto são bem conhecida na arte da microbiologia industrial e uma variedade de processos é detalhada por Brock, supra. A presente invenção pode ser praticada usando tanto processos contínuos ou de batelada-alimento, como de batelada.

Adicionalmente, contempla-se que células podem ser imobilizadas em um substrato como catalisadores de células totais e submetidas a condições de fermentação para produção de 1,3-propanodiol.

Alterações na via de produção de 1,3-propanodiol: Via de enzima representativa: A produção de 1,3- propanodiol de glucose pode ser realizada pela seguinte série de etapas. Esta série é representativa de um número de vias conhecidas dos versados na arte. Glucose é convertida em uma série de etapas por enzimas da via glicolitica em fosfato di- hidroxiacetona (DHAP) e 3-fosfogliceraldeido (3-PG). Glicerol é então formado tanto por hidrólise de DHAP em di- hidroxiacetona (DHA) seguida por redução, ou redução de DHAP em glicerol-3-fosfato (G3P) seguida por hidrólise. A etapa de hidrólise pode ser catalisada por qualquer número de fosfatases celulares que sabe-se serem especificas ou não especificas com respeito a seus substratos ou a atividade pode ser introduzida no hospedeiro por recombinação. A etapa de redução pode ser catalisada por uma enzima hospedeira ligada a NAD+ ou (NADP+) ou a atividade pode ser introduzida no hospedeiro por recombinação. É notável que o regulon dha contém uma desidrogenase glicerol (E.C. 1.1.1.6) que catalisa a reação reversível da Equação 3. (Equação 1) (Equação 2) (Equação 3) Glicerol é convertido em 1,3-propanodiol via o intermediário 3-hidroxipropionaldeído (3-HP), como descrito em detalhe abaixo. 0 intermediário 3-HP é produzido de glicerol (Equação 1) por uma enzima desidratase de que pode ser codificada pelo hospedeiro ou pode ser introduzida no hospedeiro por recombinação. Esta desidratase de pode ser desidratase de glicerol (E.C. 4.2.1.30), desidratase de diol (E.C. 4.2.1.28), ou qualquer outra enzima capaz de catalisar esta transformação. Desidratase de glicerol, mas não desidratase de diol, é codificada pelo regulon dha. 1,3- Propanodiol é produzido de enzima hospedeira ligada a 3-HP (Equação 2) por um NAD+- (ou NADP+) ou a atividade pode ser introduzida no hospedeiro por recombinação. Esta reação final na produção de 1,3-propanodiol pode ser catalisada por desidrogenase 1,3-propanodiol (E.C. 1.1.1.202) ou outras desidrogenases de álcool.

Mutações e transformações que afetam canalização de carbono.

Uma variedade de organismos mutantes compreendendo variações na via de produção de 1,3-propanodiol será utilizável na presente invenção. A introdução de uma mutação isomerase triosefosfato (tpi-) no microorganismo é um exemplo do uso de uma mutação para melhorar o desempenho canalizando-se carbono.

Alternativamente, mutações que diminuem a produção de etanol (adh) ou lactato (ldh) aumentarão a disponibilidade de NADH para a produção de 1,3-propanodiol. Mutações adicionais nas etapas de glicólise após gliceraldeído-3-fosfato como mutase fosfoglicerato (pgm) pode ser utilizável para aumentar o fluxo de carbono na via de produção de 1,3-propanodiol. Mutações que afetam o transporte de glucose , como PTS que pode prevenir a perda de PEP, provaram também ser úteis. Mutações que bloqueiam vias alternativas para intermediários da via de produção de 1,3-propanodiol como via catabólica de glicerol (glp) podem também ser utilizáveis na presente invenção. A mutação pode ser dirigida para um gene estrutural de modo a prejudicar ou melhorar a atividade de uma atividade enzimática ou pode ser dirigida para um gene regulatório de modo a modular o nível de expressão de uma atividade enzimática.

Alternativamente, transformações e mutações podem ser combinadas de modo a controlar atividades enzimáticas particulares para a melhoria da produção de 1,3-propanodiol.

Assim, está dentro do escopo da presente invenção antecipar modificações de um catalisador de células total que leva a uma produção aumentada de 1,3-propanodiol.

Identificação e purificação de 1,3-propanodiol: Processos para a purificação de 1,3-propanodiol do meio de fermentação são conhecidos na arte. Por exemplo, propanodióis podem ser obtidos de meio de células submetendo a mistura de reação a extração com um solvente orgânico, cromatografia de destilação e de coluna (US 5.536.812). Um solvente orgânico particularmente bom para este processo é ciclo-hexano (US 5.008.473). 1,3-Propanodiol pode ser diretamente identificado submetendo o meio a análise de cromatografia líquida de pressão alta (HPLC). Preferido na presente invenção é um processo onde o meio de fermentação é analisado ou uma coluna de troca de íons analítica usando uma fase móvel de ácido sulfúrico 0,1 N em um modo isocrático.

Identificação e purificação de fosfatase G3PDH e G3P: Os níveis de expressão das proteínas de fosfatases G3PDH e G3P são medidos por testes enzimáticos, teste de atividade de G3PDH recai nas propriedades espectrais do co- substrato, NADH, na conversão de DHAP em G-3-P. NADH tem absorção UV/vis intrínseca e seu consumo pode ser monitorado espectrofotometricamente a 340 nm. Atividade de fosfatase G3P pode ser medida por qualquer processo de medição em fosfato inorgânico liberado na reação. O processo de detecção mais comumente usou a determinação espectroscópica visível de um complexo de fosfomolibdato de amônio de cor azul.

EXEMPLOS

PROCESSOS GERAIS

Procedimentos para fosforilações, ligações e transformações são bem conhecidos na arte. Técnicas apropriadas para uso nos seguintes exemplos podem ser encontradas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A

Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Materiais e processos apropriados para a manutenção e crescimento de culturas bacterianas são bem conhecidos na arte. Técnicas apropriadas para uso nos seguintes exemplos podem ser encontradas como descrito em Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R.G.E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg e G. Briggs Phillips, eds. ) , American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994)) ou por Thomas D. Brock em Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edição, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989)).

Todos os reagentes e materiais usados para o crescimento e manutenção de células bacterianas foram obtidos de Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD), ou Sigma Chemical Company (St.

Louis, MO), a menos que de outro modo especificado. 0 significado das abreviaturas é como a seguir: "h" significa hora(s), "min" significa minuto(s), "sec" significa segundo(s), "d" significa dia(s), "mL" significa mililitros, "L" significa litros.

TESTES ENZIMÁTICOS

Atividade de desidratase de glicerol em extratos isentos de célula foi determinada usando 1,2-propanodiol como substrato. 0 teste, baseado na reação de aldeidos com metilbenzo-2-tiazolona hidrazona, foi descrito por Forage e Foster (Biochim. Biophys. Acta, 569, 249 (1979)). A atividade de oxidoredutase de 1,3-propanodiol, algumas vezes referida como desidrogenase 1,3-propanodiol, foi determinada em solução ou em géis em lâmina usando 1,3-propanodiol + NAD+ como substratos e foi também descrita. Johnson e Lin, J.

Bacteriol., 169, 2050 (1987). Atividade de desidrogenase glicerol-3-fosfato (G3PDH) dependente de NADH ou NADPH foi determinada espectrofotometricamente, após o desaparecimento de NADH ou NADPH, como descrito. (R.M. Bell e J.E. Cronan, Jr., J. Biol. Chem. 250: 7153-8 (1975)).

Honda et al. (1980, In Situ Reactivation of Glycerol-Inactivated Coenzyme B12-Dependent Enzymes, Glycerol Dehydratase and Diol Dehydratase. Journal of Bacteriology 143: 1458-1465) descrevem um teste que mede a reativação de desidratase de s.

Teste para glicerol-3-fosfatase, GPP 0 teste para atividade enzimátíca foi realizando incubando o extrato com um substrato de fosfato orgânico em bis-Tris ou MES e tampão de magnésio, pH 6,5. 0 substrato usado foi fosfato I-a-glicerol; fosfato d,I-a-glicerol. As concentrações finais dos reagentes no teste são: tampão (20 mM, bis-Tris ou MES 50 mM) ; MgCl2 (10 mM) ; e substrato (20 mM). Se a proteína total nas amostras era baixa e precipitação visível não ocorre com um resfriamento brusco de ácido, a amostra foi convenientemente testada na pequena cuba. Este processo envolveu incubar uma amostra de enzima em uma pequena cuba que continha substrato de 20 mM (50 mL, 20 mM) , 50 mM MES, 10 mM MgCl2, tampão de pH 6,5. 0 volume de teste de fosfatase final era de 0,5 mL. A amostra contendo enzima foi adicionada para a mistura de reação; os conteúdos da pequena cuba foram misturados e então a pequena cuba foi colocada em um banho de água de circulação a T = 37° C durante 5 para 120 min — dependendo, se a atividade de fosfatase na amostra de enzima variou de 2 para 0,02 U/mL. A reação enzimátíca foi resfriada bruscamente pela adição do reagente de molibdato de ácido (0,4 mL) . Após o reagente Fiske SubbaRow (0,1 mL) e água destilada (1,5 mL) serem adicionados, a solução foi misturada e deixada desenvolver. Após 10 min, a absorvância das amostras foi lida a 660 nm usando um espectrofotômetro Cary 219 UV/Vis. A quantidade do fosfato inorgânico realizado foi comparada a uma curva padrão que foi preparada usando uma solução de carga de fosfato inorgânico (0,65 mM) e preparando 6 padrões com concentrações de fosfato inorgânico finais variando de 0,026 a 0,130 itimol/mL.

Isolamento e identificação de 1,3-propanodiol A conversão de glicerol para 1,3-propanodiol foi monitorada por HPLC. As análises foram realizadas usando técnicas padrões e materiais disponíveis para um versado na arte da cromatografia. Um processo apropriado utilizou um sistema HPLC Waters Maxima 820 usando UV (210 nm) e detecção RI. As amostras foram injetadas sobre uma coluna de Shodex SH- 1011 (8 mm x 300 mm, adquirida por Waters, Milford, MA) equipado com uma pré-coluna de Shodex SH-1011P (6 mm x 50 mm), a temperatura controlada a 50° C, usando 0,01 N H2SO4 como fase móvel a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. Quando a análise quantitativa foi desejada, as amostras foram preparadas com uma quantidade conhecida de ácido trimetilacético como padrão externo. Tipicamente, os períodos de retenção de glicerol (detecção RI), 1,3-propanodiol (detecção RI), e o ácido trimetilacético (detecção UV e RI) foram de 20,67 min, 26,08 min, e 35,03 min, respectivamente. A produção de 1,3-propanodiol foi confirmada por GC/MS. As análises foram realizadas usando técnicas padrões e materiais disponíveis para um versado na arte de GC/MS. Um processo apropriado utilizou uma cromatografia de gás de Hewlett Packard 5890 Série II acoplado a um detector seletivo de massa de Série 5971 de Hewlett Packard (EI) e uma coluna HP- INNOWax (30 m de comprimento, 0,25 mm i.d., 0,25 de densidade de filme de mícron) . 0 tempo de retenção e o espectro de massa de 1,3-propanodiol gerados foram comparados ao de 1,3- propanodiol autêntico (m/e: 57, 58).

Um processo alternativo para GC/MS envolveu a derivatização da amostra. Para 1,0 mL de amostra (por exemplo, o sobrenadante de cultura) foi adicionado a 30 uL de ácido perclórico concentrado (70% v/v). Após misturar, a amostra foi congelada e liofilizada. Uma mistura de 1:1 de bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida:piridina (300 uL) foi adicionada para o material liofilizado, misturado vigorosamente e colocado a 65° C durante uma hora. A amostra foi clarificada de material insolúvel por centrifugação. O liquido resultante dividido em duas fases, cuja superior foi usada para análise. A amostra foi cromatografada em uma coluna de DB-5 (48 m, 0,25 mm I.D., 0,25 de densidade de filme; de J&W Scientific) e o tempo de retenção e o espectro de massa do derivado 1,3-propanodiol obtido dos sobrenadantes de cultura foram comparados aos obtidos de padrões autênticos. O espectro de massa de 1,3- propanodiol derivado de TMS continha os ions característicos de 205, 177, 130 e 115 AMU. EXEMPLO 1 CLONAGEM E TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS DE E. COLI COM

DNA DE cosmídeo PARA A EXPRESSÃO DE 1,3-PROPANODIOL

Meios O meio S12 sintético foi usado na triagem de transformantes bacterianos para a capacidade em fazer 1,3- propanodiol. 0 meio S12 continha: 10 mM sulfato de amônia, 50 mM tampão de fosfato de potássio, pH 7,0, 2 mM MgCl2, 0,7 mM

CaCl2, 50 uM MnCl2, 1 uM FeCl3, 1 uM ZnCl, 1,7 uM CuS04, 2,5 uM

CoCl2, 2,4 uM Na2Mo04, e 2 uM hidrocloreto de tiamina. O meio A usado para o crescimento e fermentação consiste de: 10 mM sulfato de amônia; 50 mM MOPS/KOH tampão, pH 7,5; 5 mM tampão de fosfato de potássio, pH 7,5; 2 mM MgCl2; 0,7 mM CaCl2; 50 uM MnCl2; 1 uM FeCl3; 1 uM ZnCl; 1,72 uM CuS04; 2,53 uM CoCl2; 2,42 uM Na2Mo04; 2 uM hidrocloreto de tiamina;

0,01% extrato de levedura; 0,01% ácidos casamino; 0,8 ug/mL vitamina B12; e 50 ug/mL amp. 0 meio A foi suplementado com 0,2% de glicerol ou 0,2% de glicerol mais 0,2% de D-glucose como requerido. Células: Klebsiella pneumoniae ECL2106 (Ruch et. al., J.

Bacteriol., 124, 348 (1975), também conhecido na literatura como K. aerogenes ou Aerobacter, foi obtido de E. C. C. Lin (Harvard Medicai School, Cambridge, MA) e foi similarmente transformado com DNA de cosmídeo de Klebsiella pneumoniae.

Estes transformantes foram identificados como ECL707-pKPl e ECL-707-pKP2, contendo o gene desidratase de glicerol e ECL707-pKP4 contendo o gene desidratase de diol. E. coli AA2 00 contendo uma mutação no gene tpi (Anderson et. al., J. Gen Microbiol., 62, 329 (1970)) foi adquirido do E. coli Genetic Stock Center, Yale University (New Haven, CT) e foi transformado com DNA de cosmídeo de Klebsiella para dar os organismos recombinantes AA200-pKPl e AA200-pKP2, contendo o gene desidratase de glicerol, e AA200- pKP2, contendo o gene desidratase de glicerol, e AA200-pKP4, contendo o gene desidratase de diol. DH5a: Seis placas de transformações contendo, aproximadamente, 1.000 colônias de E. coli XLl-Blue MR

transfectadas com DNA de K. pneumoniae foram lavadas com 5 mL de meio LB e centrifugadas. As bactérias foram pelotizadas e colocadas em suspensão em 5 mL meio LB + glicerol. Uma alíquota (50 uL) foi inoculada em um tubo de 15 mL contendo o meio sintético S12 com 0,2% de glicerol + 400 ng por mL de vitamina B12 + 0,001% de extrato de levedura + 50 amp. 0 tubo foi enchido com o meio para o topo e enrolado com parafilme e incubado a 30° C. Uma turvação leve foi observada após 48 h.

As alíquotas, analisadas para distribuição de produto como descrito acima a 78 h e 132 h, eram positivas para 1,3- propanodiol, o mais recente tempo contendo as quantidades aumentadas de 1,3-propanodiol.

As bactérias, testando positivo para produção de 1,3-propanodiol, foram diluídas em série e colocadas em placas sobre placas de LB-50 amp a fim de isolar as colônias únicas.

As quarenta e oito colônias únicas foram isoladas e checadas outra vez para a produção de 1,3-propanodiol. O DNA de cosmídeo foi isolado de 6 clones independentes e transformados em cepa de E. coli DH5a. Os transformantes foram outra vez checados para a produção de 1,3-propanodiol. Os dois transformantes foram caracterizados mais adiante e designados como DH5a-pKPl e DH5a-pKP2.

Um fragmento de 12,1 kb EcoRI-Sall de pKPl, subclonado em plB131 (IBI Biosystem, New Haven, CT) , foi sequenciado e terminado pHK28-26 (SEQ ID NO:19). A sequenciação divulgou os locais das matrizes de leitura aberta relevante do dha operon codificando desidratase de glicerol e genes necessários para a regulagem. Se referindo para SEQ ID

NO:19, um fragmento do matriz de leitura aberta para dhaK codificando di-hidroxiacetona de quinase é verificado nas bases 1-399; a matriz de leitura aberta dhaD codificando desidrogenase de glicerol é encontrado nas bases 983-2107; a matriz de leitura aberta dhaR codificando o repressor é encontrada nas bases 2209-4134; a matriz de leitura aberta dhaT codificando oxidoreductase de 1,3 propanodiol é encontrada nas bases 5017-6180; a matriz de leitura aberta dhaBl codificando subunidade alfa desidratase de glicerol é encontrada nas bases 7044-8711; a matriz de leitura aberta dhaB2 codificando subunidade beta desidratase de glicerol é encontrada nas bases 8724-9308; a matriz de leitura aberta dhaB3 codificando a subunidade gama de desidratase de glicerol é encontrada nas bases 9311-9736; e a matriz de leitura aberta dhaBX, codificando uma proteína de função desconhecida é encontrada nas bases 9749-11572.

As únicas colônias de E. coli XLl-Blue MR transfectadas com DNA de cósmídeo comprimido de K. pneumoniae foram inoculados em reservatórios de microtitulação contendo 200 uL de meio S15 (sulfato de amônia, 10 mM; tampão de fosfato de potássio, pH 7,0, 1 mM; tampão MOPS/KOH, pH 7,0, 50 mM; MgCl2, 2 mM; CaCl2, 0, 7 mM; MnCl2, 50 uM; FeCl3, 1 uM; ZnCl, uM; CuS04, 1,72 uM; CoCl2, 2,53 uM; Na2Mo04, 2,42 uM; e hidrocloreto de tianina, 2 uM) + 0,2% de glicerol + 400 ng/mL de vitamina B42 + 0,001% de extrato de levedura + 50 ug/mL de ampicilina. Além disso, para os reservatórios de microtitulação, uma placa principal contendo LB-50 amp foi também inoculado. Após 96 h, 100 uL foi retirado e centrifugado em um tubo de microcentrífuga Rainin contendo um filtro de membrana de náilon de 0,2 mícron. As bactérias foram retidas e o filtrado foi processado para análise de HPLC. Os clones positivos demonstrando a produção de 1,3-propanodiol foram identificados após a triagem, aproximadamente, 240 colônias. Os três clones positivos foram identificados, em dois de que tinha crescido em LB-50 amp e um de que não tinha. Uma colônia única, isolada de um dos dois clones positivos crescido em LB-50 amp e verificado para a produção de 1,3-propanodiol, foi designado como pKP4. O DNA de cosmideo foi isolado de cepas de E. coli contendo pKP4 e cepa de E. coli. DH5a foi transformada. Um transformante independente, designado como DH5a-pKP4, foi verificado para a produção de 1,3-propanodiol. ECL707: A cepa de E. coli ECL707 foi transformada com DNA de K. pneumoniae cosmideo correspondendo para um de pKPl, pKP2, pKP4 ou só o vetor Supercos e chamado de ECL707-pKPl, ECL707- pKP2, ECL707-pKP4, e ECL707-sc, respectivamente. ECL707 é defectivo em glpK, gld, e pstD que codifica a quinase de glicerol dependente de ATP, desidrogenase de glicerol ligada a NAD+-e a enzima II para di-hidroxiacetona do sistema de fosfotransferase dependente de piruvato de fosfoenol, respectivamente.

Vinte colônias únicas de cada transformação de cosmideo e cinco só da transformação de vetor Supercos (controle negativo), isoladas de placas LB-50 amp, foram transferidas para uma placa LB-50 amp principal. Estes isolados foram também para capacidade dos mesmos para converter glicerol para 1,3-propanodiol a fim de determinar se os mesmos contendo a atividade desidratase. Os transformantes foram transferidos com um palito estéril para placas de microtitulação contendo 200 uL de Meio A suplementado com ou 0,2% de glicerol ou 0,2% de glicerol mais 0,2% de D-glucose. Após a incubação durante 48 horas a 30° C, os teores dos reservatórios de placa de microtitulação foram filtrados por um filtro de náilon de 0,45 mícron e cromatografados por HPLC. Os resultados destes testes são dados na Tabela 1.

Tabela 1 Conversão de glicerol em 1,3-propanodiol por ECL707 transformado *(Número de isolamentos positivos/número de isolamentos testados) AA200: A cepa de E. coli foi transformada com DNA de K. pneumoniae cosmídeo correspondendo para um de pKPl, pKP2, pKP4 e só o vetor Supercos e nomeado de AA200-pKPl, AA200-pKP2, AA200-pKP4, e AA200-SC, respectivamente, A cepa AA200 é defectivo em isomerase de triosefosfato (tpi') .

Vinte colônias únicas de cada transformação de cosmídeo e cinco da transformação de vetor vazio foram isoladas e testadas para capacidade dos mesmos para converter glicerol em 1,3-propanodiol como descrito para cepa de E. coli ECL707.

Os resultados destes testes são dados na Tabela 2.

Tabela 2 Conversão de glicerol em 1,3-propanodiol por AA200 transformado *(Número de isolamentos positivos/número de isolamentos testados) EXEMPLO 2 CONVERSÃO DE D-GLUCOSE PARA 1,3-PROPANODIOL POR RECOMBINANTE E.

coli USANDO PARI, GPP2, dhaB, e dhaT

Construção de plasmídeos de expressão de fim geral para uso na transformação de Escherichia coli 0 vetor de expressão pTaclQ 0 vetor de expressão de E. coli, pTaclQ, contém o gene laclq (Farabaugh, Nature 274, 5673 (1978)) e o promotor tac (Amann et. al., Gene 25, 167 (1983)) inserido no EcoRI de pBR322 (Sutcliffe et. al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 43, 77 (1979)). Um sítio de clonagem múltipla e a sequência de terminador (SEQ ID NO:20) substitui a sequência pBR322 de EcoRI para Sphl.

Subclonagem de genes desidratase de glicerol (dhaBl, 2, 3) A matriz de leitura aberta para o gene dhaB3 (incorporando um sitio de EcoRI à terminação 5' e um sitio Xbal à terminação 3') foi amplificada de pHK28-26 por PCR usando iniciadores (SEQ ID NOS:21 e 22). O produto foi subclonado em pLitmus29 (New England Biolab, Inc., Beverly, MA) para gerar o plasmídeo pDHAB3 contendo dhaB3. A região contendo o inteiro codificando a região para os quatro genes de dhaB operon de pHK28-26 foi clonada em pBluescriptll KS+ (Stratagene, La Jolla, CA) usando as enzimas de restrição Kpnl e EcoRI para criar o plasmideo pM7. O gene dhaBX foi removido digerindo o plasmideo pM7, que contém dhaB (1,2,3,4), com Apal e Xbal (apagando parte de dhaB3 e todos de dhaBX). O fragmento resultante de 5,9 kb foi purificado e ligado com o fragmento 325-bp Apal-Xbal de plasmideo pDHAB3 (restaurando o gene dhaB3) para criar pMll, que contém dhaB(1,2,3). A matriz de leitura aberta para o gene dhaBl (incorporando um sitio de HindIII e um sitio de ligação de ribossomo RBS de consenso à terminação 5' e um sitio Xbal à terminação 3') foi amplificado de pHK28-26 por PCR usando iniciadores (SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24) . 0 produto foi subclonado no pLitmus28 (New England Biolab, Inc.) para gerar o plasmideo pDTl contendo dhaBl.

Um fragmento de NotI-Xbal de pMll contendo parte do gene dhaBl, o gene dhaB2 e o gene dhaB3 foi inserido em pDT para criar o plasmídeo de expressão de dhaB, pDT2. O fragmento HindIII-Xbal contendo os genes dhaB(1,2,3) de pDT2 foi inserido em pTaclQ para criar pDT3.

Subclonagem do gene desidrogenase de 1, 3-propanodiol (dhaT) 0 fragmento de Kpnl de pHK2 8-2 6, contendo o gene desidrogenase de 1,3-propanodiol completo (dhaT), foi subclonado em pBluescriptII KS+ criando o plasmídeo pAHl. 0 gene dhaT (incorporando um sítio Xbal à terminação 5' e um sítio BamHI à terminação 3') foi amplificado por PCR de pAHl como gabarito DNA usando os iniciadores sintéticos (SEQ ID NO: 25 com SEQ ID NO: 26) . 0 produto foi subclonado em pCR-Script (Stratagene) ao sítio Srfl para gerar os plasmídeos pAH4 e pAH5 contendo dhaT. 0 plasmídeo pAH4 contém o gene dhaT na orientação correta para expressão do promotor Iac em PCR-Script e pAH5 contém o gene dhaT na orientação oposta. 0 fragmento Xbal-BamHI de pAH4 contendo o gene dhaT foi inserido no pTaclQ para gerar o plasmídeo pAH8. O fragmento HindIII-BamHI de pAH8 contendo o RBS e o gene dhaT foi inserido em pBluescriptII KS+ para criar pAHll. 0 fragmento HindIII-SalI de pAH8 contendo o RBS, o gene dhaT e terminador foi inserido em pBluescriptII KS+ para criar pAH12.

Construção de um cassete de expressão para dhaB(1,2,3)e dhaT

Um cassete de expressão para dhaB(1,2,3)e dhaT foi montado de dhaB(1,2,3) e subclones dhaT descrito acima usando processos de biologia moleculares padrão. O fragmento Spel- Kpnl de pAH8 contendo o RBS, o gene dhaT e o terminador foi inserido nos sítios Xbal-Kpnl de pDT3 para criar pAH23. 0 fragmento Smal-EcoRI entre o dhaB3 e o gene dhaT foi removido para criar o pAH26. 0 fragmento Spel-Notl contendo um sitio EcoRI de pDT2 foi usado para substituir o fragmento Spel-Notl de pAH26 para gerar o pAH27.

Construção de um cassete de expressão para dhaT e dhaB(l,2,3) Um cassete de expressão para dhaT e dhaB(l,2,3) foi montado de dhaB(l,2,3) individual e subclones dhaT descritos, previamente, usando processos de biologia molecular padrão. Um fragmento Spel-SacI contendo os genes dhaB(l,2,3) de pDT3 foi inserido em pAHll aos sítios Spel-SacI para criar pAH2 4.

Clonagem e expressão de 3-fosfatase de glicerol para produção de glicerol aumentada em E. coli, 0 cromossomo V lamda clone 6592 deSaccharomyces cerevisiae (Gene Bank, no. de acesso U18813xll) foi obtido de ATCC. 0 gene de fosfato fosfatase de glicerol 3-(GPP2) (incorporando um sítio BamHI-RBS-Xbal à terminação 5T e um sítio Smal à terminação 3') foi clonado por PCR clonando o clone lamda como DNA de marcação usando iniciadores sintéticos (SEQ ID NO:27) com SEQ ID NO:28). 0 produto foi subclonado em PCR-Script ao sítio Srfl para gerar os plasmídeos pAH15 contendo GPP2. 0 plasmídeo pAH15 contém o gene GPP2 na orientação inativa para expressão do promotor lac em PCR- Script SK+. 0 fragmento BamHI-Smal de pAH15 contendo o gene GPP2 foi inserido em pBlueScriptII SK+ para gerar o plasmídeo pAH19. 0 pHH19 contém o gene GPP2 na orientação correta para expressão do promotor lac. 0 fragmento Xbal-PstI de pAH19 contendo o gene GPP2 foi inserido em pPH0X2 para criar o plasmídeo pAH21.

Plasmídeos para a expressão de genes dhaT, dhaB(l,2,3) e GPP2 Um ligador de SalI-EcoRI-Xbal (SEQ ID NOS: 29 e 30) foi inserido em pAH5 que foi digerido com as enzimas de restrição, Sall-Xbal para criar pDT16. O ligador destroi o sitio Xbal. 0 fragmento SalI-MIuI de 1 kb de pDT16 foi então inserido em pAH24 colocando o fragmento Sall-Mulul existente para criar pDTl8. O fragmento de Eco-RI-Xbal de 4,1 kb contendo o cassete de expressão para dhaT e dhaB(l,2,3) de pDT18 e o fragmento Xabl-Sall de 1,0 kb contendo o gene GPP2 de pAH21 foi inserido no vetor pMMB66EH (Füste et. al., GENE, 48, 119 (1986)) digerido com as enzimas de restrição EcoRI e Sall para criar pDT20.

Plasmídeos para a sobre-expressão de PARI em E. coli DAR1 foi isolado por PCR clonando de DNA S. cerevisiae genômico usando os iniciadores sintéticos (SEQ ID NO:46 com SEQ ID NO:47). Bem sucedida, a clonagem de PCR coloca um sítio Ncol à terminação 5’ de DAR1 onde o ATG dentro de Ncol é o iniciador DAR1 metionina. À terminação 3’ de DARl um sítio BamHI é introduzida seguindo o terminador de translação. Os fragmentos PCR foram digeridos com Ncol + BamHI e clonados nos mesmos sítios dentro do plasmídeo de expressão pTrc99A (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) para dar pDARlA. A fim de criar um melhor sítio de ligação de ribossomo na terminação 5’ de DARl, um ligador Spel-RBS-Ncol obtido recombinando iniciadores sintéticos (SEQ ID NO:48 com SEQ ID NO:49) foi inserido no sitio Ncol de pDARlA para criar pAH4 0. 0 plasmídeo pAH4 0 contém o RBS novo e o gene DAR1 na orientação correta para expressão do promotor trc de Trc99A (Pharmacia). 0 fragmento NcoI-BamHI de pDARlA e um segundo conjunto Spel-RBS-Ncol obtido recombinando os iniciadores sintéticos (SEQ ID NO: 31 com SEQ ID NO: 32) foi inserido no sitio Spel-BamHI de pBluescript II-SK+ (Stratagene) para criar pAH41. A construção pAH41 contém um gene de resistência a ampicilina. 0 fragmento NcoI-BamHI de pDARlA e um segundo conjunto de ligador Spel-RBS-Ncol obtido recombinando iniciadores sintéticos (SEQ ID NO:31 com SEQ ID NO:32) foram inseridos no sitio Spel-BamHI de pBC-SK+ (Stratagene) para criar pAH42. A construção pAH42 contém um gene de resistência a cloranfenicol.

Construção de um cassete de expressão para PARI e GPP2 Um cassete de expressão para DAR1 e GPP2 foi montado do DAR1 individual e subclones GPP2 descritos acima usando processos de biologia molecular padrão. 0 fragmento BamHI-PstI de pAH19 contendo o RBS e o gene GPP2 foi inserido em pAH4 0 para criar pAH43. 0 fragmento BamHI-PstI de pAH19 contendo o RBS e o gene GPP2 foi inserido em pAH41 para criar pAH44. 0 mesmo fragmento BamHI-PstI de pAH19 contendo o RBS e o gene GPP2 foi também inserido em pAH42 para criar pAH45. 0 sitio de ligação de ribossomo na terminação 5' de GPP2 foi modificado como a seguir. Um ligador BamHI-RBS-Spel, obtido recombinando os iniciadores sintéticos GATCCAGGAAACAGA com CTAGTCTGTTTCCTG para o fragmento Xbal-PstI de pAH19 contendo o gene GPP2, foi inserido no sitio Bam-HI-PstI de pAH40 para criar pAH48. O plasmídeo pAH48 contém o gene DAR1, o RBS modificado, e o gene GPP2 na orientação correta para expressão do promotor trc de pTrc99A (Pharmacia, Piscataway, N. J. ) .

Construção de cepa de E. coli W1485 de E. coli é uma cepa K-12 de tipo selvagem (ATCC 12435) . Esta cepa foi transformada com os plasmideos pDT20 e pAH42 e selecionada em placas de LA (Luria Agar, Difco) suplementada com 50 mg/mL carbencilina e 10 mg/mL cloranfenicol.

Produção de 1,3-propanodiol a partir de glucose W1485/pDT20/pAH42 de E. coli foi transferido de uma placa a 50 mL de um meio contendo por litro: 22,5 g de glucose, 6,85 g de K2HP04, 6,3 g de (NH4)2S04, 0,5 g de NaHC03, 2,5 g de NaCl, 8 g de extrato de levedura, 8 g de triptona, 2,5 mg de vitamina B12, 2,5 mL de solução de elemento de traço de Balch modificado, 50 mg de carbencilina e 10 mg de cloranfenicol, pH final de 6,8 (HC1), então esterilizados em filtro. A composição de solução de elemento de traço de Balch modificada pode ser encontrada em Methods for General and Molecular Bacteriology (P. Gerhardt et. al., eds, p. 158, American Society for Microbiology, Washington, DC (1994)). Após incubar a 37° C, 300 rpm durante 6 h, 0,5 g de glucose e IPTG (concentração final = O, 2 mM) foram adicionados e a agitação foi reduzida a 100 rpm.

As amostras foram analisados por GC/MS. Após 24 h, W1485/pDT20/pAH42 produziu 1,1 g/L de glicerol e 195 mg/L 1,3- propanodiol. EXEMPLO 3 CLONAGEM E EXPRESSÃO DE dhaB e dhaT EM Saccharomyces cerevisiae Os plasmídeos de expressão que podem existir como elementos epissomais replicantes foram construídos para cada um dos quatro genes dha. Para todos os plasmídeos de expressão um promotor de ADH1 levedura estava presente e separado de um termínador de transcrição de ADH1 levedura por fragmentos de DNA contendo sítios de reconhecimento para uma ou mais endonucleases de restrição. Cada plasmídeo de expressão também contém o gene para b-lactamase para seleção em E. coli em meios contendo ampicilina, uma origem de replicação para conservação de plasmídeo em E. coli, e uma origem de replicação de 2 microns para manutenção em S. cerevisiae. Os marcadores nutricionais selecionáveis usados para levedura e presentes nos plasmídeos de expressão eram um dos seguintes: 0 gene HIS3 codificando desidratase de imidazolglicerolfosfato, o gene URA3 codificando orotidina 5’-fosfato descarboxilase, o gene TRP1 codificando N-(5'-fosforibosil)-antranilato isomerase, e o gene LEU2 codificando b-isopropilmalato hidrogenase.

As matrizes de leitura aberta para dhaT, dhaB3, dhaB2 e dhaBl foram amplificadas de pHK28-26 (SEQ ID NO:19) por PCR usando iniciadores (SEQ ID NO:38 com SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 com SEQ ID NO:41), SEQ ID NO:42 com SEQ ID NO:43, e SEQ ID NO:44 com SEQ ID NO:45 para dhaT, dhaB3, dhaB2 e dhaBl, respectivamente) incorporando os sítios EcoRl a terminações 5' (10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0, 0001% de gelatina, 200 mM dATP, 200 mM dCTP, 200 mM dGTP, 200 mM dTTP, 1 mM cada iniciador, 1-10 ng marcação DNA, 25 unidades/mL

Amplitaq DNA polimerase (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk CT)). Os parâmetros de PCR eram de 1 min a 94° C, 1 min a 55° C, 1 min a 72° C, 35 ciclos. Os produtos foram subclonados no sitio EcoRl de pHIL-D4 (Phillips Petroleum, Bartlesville, OK) para gerar os plasmídeos pMP13, pMP14, pMP20 e pMP15 contendo dhaT, dhaB3, dhaB2 e dhaBl, respectivamente.

Construção de dhaBl plasmídeo de expressão pMCKlO 7,8 kb reproduzindo o plasmídeo pGADGH (Clontech, Paio Alto, CA) foi digerido com HindIII, desfosforilado, e ligado para o fragmento dhaBl HindIII de pMP15. O plasmídeo resultante (pMCKlO) tinha dhaBl corretamente orientado para transcrição do promotor ADH1 e contendo um marcador de LEU2.

Construção de dhaB2 plasmídeo de expressão pMCK17 O plasmídeo pGADGH (Clontech, Paio Alto, CA) foi digerido com HindIII e as terminações de filamento único convertidas para as terminações EcoRl por ligação com adaptadores HindIII-Xmnl e Eco-RI-Xmnl (New England Biolabs, Beverly, MA) . A seleção para plasmídeo com terminações EcoRl foi alcançada por ligação para um gene de resistência a canamicina em um fragmento de EcoRl de plasmídeo pUC4K (Pharmacia Biotech, Uppsala), a transformação em cepa de E. coli DH5a e a seleção em placas de LB contendo 25 mg/mL de canamicina. O plasmídeo resultante (pGAD/KAN2) foi digerido com SnaBI e EcoRl e um fragmento de 1,8 kb com o promotor ADH1 foi isolado. 0 plasmídeo pGBT9 (Clontech, Paio Alto, CA) foi digerido com SanBI e EcoRl, e o fragmento ADH1/GA14 substituído pelo promotor ADH1 de 1,8 kb isolado de pGAD/KAN2 pela digestão com SnaBI e EcoRI. 0 vetor resultante (pMCKll) é um plasmideo reproduzindo em levedura com um promotor ADH1 e terminador e um marcador TRP1. O plasmideo pMCKll foi digerido com EcoRI, desfosforilado, e ligado para o fragmento dhaB2 EcoRI de pMP20. 0 plasmideo resultante (pMCK17) tinha dhaB2 corretamente orientado para transcrição do promotor ADH1 e contendo um marcador TRP1.

Construção de dhaB3 plasmideo de expressão pMCK30 0 plasmideo pGBT9 (Clontech) foi digerido com Nael e PvuII e o gene TRPl de 1 kb removido deste vetor. 0 gene TRPI foi substituído por um gene URA3 dado como um fragmento de Aatll/Nael de 1,7 kb de plasmideo pRS406 (Stratagene) para dar o vetor intermediário pMCK32. 0 promotor ADH1 truncado presente em pMCK32 foi removido em um fragmento de SnaBI/EcoRI de 1,5 kb, e substituído com um promotor ADH1 de comprimento completo em um fragmento de SnaBI/EcoRI de 1,8 kb do plasmideo pGAD/KAN2 para dar o vetor pMCK26. 0 único sítio EcoRI em pMCK26 foi usado para inserir um fragmento EcoRI com dhaB3 de plasmideo pMP14 para dar pMCK30. 0 pMCK30 reproduzindo o plasmideo de expressão tinha dhaB3 orientado para expressão do promotor ADH1, e tinha um marcador de URA3.

Construção de dhaT plasmideo de expressão pMCK35 0 plasmideo pGBT9 (Clontech) foi digerido com Nael e PvuII e o gene TRPl de 1 kb removido deste vetor. 0 gene TRPI foi substituído por um gene HIS3 dado como um fragmento de Xmnl/Nael de plasmideo pRS403 (Stratagene) para dar o vetor intermediário pMCK33. 0 promotor ADH1 truncado presente em pMCK33 foi removido em um fragmento de SnaBI/EcoRI de 1,5 kb, e substituído com um promotor ADH1 de comprimento completo em um fragmento de SnaBI/EcoRI de 1,8 kb do plasmídeo pGAD/KAN2 para dar o vetor pMCK31. 0 único sítio EcoRI em pMCK31 foi usado para inserir um fragmento EcoRI com dhaT de plasmídeo pMP13 para dar pMCK35. 0 pMCK35 reproduzindo o plasmídeo de expressão tinha dhaT orientado para expressão do promotor ADH1, e tinha um marcador de HIS3.

Transformação de S. cerevisiae com plasmídeos de expressão dha A cepa de YPH500 de S. cerevisiae (ura3-52 lys2-801 ade-2-101 trpl-D63 hís3-D200 Ieu2-Dl) (Sikorski R. S. e Hieter P., Genetics 122, 19-27, (1989)) adquirido de Stratagene (La Jolla, CA) foi transformada com 1-2 mg de plasmídeo DNA usando um kit de transformação de levedura Frozen-EZ (Catalogo #T2001) (Zymo Research, Orange, CA). As colônias foram cultivadas em meio mínimo suplementado (SMM - 0,67% de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 2% de glucose) durante 3-4 h a 29° C com um ou mais das seguintes adições: sulfato de adenina (20 mg/L), uracil (20 mg/L), L-triptofano (20 mg/L), L-histidina (20 mg/L), L-leucina (30 mg/L), L-lisina (30 mg/L).

As colônias foram riscadas em placas seletivas e usadas para inocular os meios líquidos.

Triagem de transformantes de 5. cerevisiae para genes de dha O DNA cromossômico de transformantes URA+, HIS+, TRP+, LEU+ foi analisado por PCR usando iniciadores específicos para cada gene (SEQ ID NOS:38-45). A presença de todos os quatro quadros de leitura aberta foi confirmada.

Expressão da atividade de dhaB e dhaT em S. cerevisiae transformado A presença de desidratase de glicerol ativo (dhaB) e reductase de óxido de 1,3-propanodiol (dhaT) foi demonstrada usando testes de enzima in vitro. Adicionalmente, a análise de blot western confirmou a expressão de proteína de todos as quatro matrizes de leitura aberta. A cepa YPH500, transformada com o grupo de plasmídeos pMCKlO, pMCKl7, pMCK30 e pMCK35, foi cultivada em Meio mínimo suplementado contendo 0, 67% de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 2% de glucose, 20 mg de sulfato de adenina e 30 mg/L L-lisina. As células foram homogenizadas e os extratos testados para atividade dhaB. Uma atividade específica de 0,12 unidades por proteína mg foi obtida para desidratase de glicerol, e 0,024 unidades por proteína mg para reductase de 1,3-propanodiol óxido. EXEMPLO 4 PRODUÇÃO DE 1,3-PROPANODIOL D-GLUCOSE USAUDO Saccharomyces cerevisiae RECOMBINANTE S. cerevisiae YPH500, abrigando os grupos de plasmídeos pMCKlO, pMCK17, pMCK30 e pMCK35, foi cultivada em um fermentador BiostatB (B Braun Biotech, Inc.) em 1,0 L de meio mínimo inicialmente contendo 20 g/L de glucose, 6,7 g/L de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 40 mg/L de sulfato de adenina e 60 mg/L de L-lisina HC1. Durante o curso de crescimento, um adicional equivalente de base de nitrogênio de levedura, a adenina e lisina foram adicionadas. O fermentador foi controlado ao pH 5,5 com adição de 10% de ácido fosfórico e 2 M NaOH, 30° C, e 40% de tensão de oxigênio dissolvido por controle de agitação. Após 38 h, as células (OD50o = 5,8 AU) foram coletadas por centrifugação e colocadas em suspensão em meio de base (6,7 g/L de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 20 mg/L de sulfato de adenina, 30 mg/L de L-lisina HCl, e 50 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 7,0).

As misturas de reação contendo as células (ODSOo = 2 0 AU) em um volume total de 4 mL de meios de base suplementado com 0,5% de glucose, 5 ug/mL de coenzima Bí2 e 0, 10, 20, ou 40 mM de cloroquina foram preparados, na ausência de luz e oxigênio (nitrogênio moderado) , em 10 mL em garrafas lacradas de soro e incubadas a 30° C com agitação. Após 3 0 h, as alíquotas foram retiradas e analisadas por HPLC. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3 Produção de 1,3-propanodiol usando S. cerevisiae recombinante EXEMPLO 5 USO DE UM TRANSFORMANTE DUPLO DE S. cerevisiae PARA PRODUÇÃO

DE 1,3-PROPANODIQL A PARTIR DE D-GLUCOSE ONDE

dhaB e dhaT SÃO INTEGRADOS NO GENOMA O Exemplo 5 profeticamente demonstra a transformação de S. cerevisiae com dhaBl, dhaB2, dhaB3, e dhaT e a integração estável dos genes no genoma de levedura para a produção de 1,3-propanodiol a partir de glucose.

Construção de cassetes de expressão Quatro cassetes de expressão (dhaBl, dhaB2, dhaB3, e dhaT) são construídos para expressão induzida por glucose e expressão constitutiva de nível elevado destes genes em levedura, Saccharomyces cerevisiae. Estes cassetes consistem de: (i) quinase de fosfoglicerato (PGK) de cepa S288C de S. cerevisiae; (ii) um dos genes dhaBl, dhaB2, dhaB3, ou dhaT; e (iii) o terminador PGK de cepa S288C de S. cerevisiae. A técnica baseada em PCR de gene unindo por extensão sobreposta (Horton et. al., Bio Techniques, 8:528-535, (1990)) é usada para recombinar as sequências de DNA para gerar estes cassetes unidos sem costura para expressão ótima de cada gene. Estes cassetes são clonados individualmente em um vetor apropriado (pLITMUS 39) com sítios de restrições tratáveis para clonagem de multi-cassete em plasmídeos de expressão de levedura.

Construção de vetores de integração de levedura Os vetores para efetuar a integração de cassetes de expressão no genoma de levedura são construídos. Estes vetores contém os seguintes elementos: (i) uma região de policlonagem em que os cassetes de expressão são subclonados; (ii) um marcador único usado para selecionar os transformantes de levedura estável; (iii) a origem de replicação e marcador selecionável permitindo a manipulação de gene em E. coli antes de transformar a levedura. Um vetor de integração contém o marcador auxotrófico URA3 (YIp352b), e um segundo vetor de integração contém o marcador auxotrófico LYS2 (pKP7).

Construção de plasmideos de expressão de levedura Os cassetes de expressão para dhaBl e dhaB2 são subclonados na região de policlonagem do Yl352b (plasmídeo de expressão #1), uns cassetes de expressão para dhaB3 e dhaT são subclonados na região de policlonagem de pKP7 (plasmídeo de expressão #2).

Transformação de levedura com os plasmideos de expressão S. cerevisiae (ura3, lys2) é transformado com o plasmídeo de expressão #1 usando kit de transformação de levedura Frozen-EZ (Zymo Research, Orange, CA) , e transformantes selecionados em placas faltando uracila. A integração de cassetes de expressão para dhaBl e dhaB2 é confirmada por análise PCR de DNA cromossômico. Os transformantes selecionados são re-transformados com o plasmídeo de expressão #2 usando kit de transformação de levedura Frozen-EZ, e transformantes duplos selecionados em placas faltando lisina. A integração de cassetes de expressão para dhaB3 e dhaT é confirmada por análise PCR de DNA cromossômico. A presença de todos os quatro cassetes de expressão (dhaBl, dhaB2, dhaB3, dhaT) em transformantes duplos é confirmada por análise PCR de DNA cromossômico.

Produção de proteína de levedura transformada dupla A produção de proteínas codificadas por dhaBl, dhaB2, dhaB3, e dhaT de levedura transformada dupla é confirmada por análise blot de Western.

Atividade de enzima de levedura transformada dupla Uma desidratase de glicerol ativo e hidrogenase de 1,3-propanodiol ativo de levedura transformada dupla é confirmada por teste de enzima como descrito em Processos Gerais acima.

Produção de 1,3-propanodiol de levedura transformada dupla A produção de 1,3-propanodiol de glucose em levedura transformada dupla é demonstrada, essencialmente, como descrito no Exemplo 4. EXEMPLO 6 CONSTRUÇÃO DE PLASMÍDEOS CONTENDO DAR1/GPP2 OU dhaT/dhaBl-3 E A TRANSFORMAÇÃO EM ESPÉCIES DE KLEBSIELLA K. pneumoniae (ATCC 25955), K. pneumoniae (ECL2106), e K. oxytoca (ATCC 8724) são naturalmente resistentes a ampicilina (até 150 ug/mL) e canamicina (até 50 ug/mL), mas sensível a tetraciclina (10 ug/mL) e cloranfenicol (25 ug/mL).

Consequentemente, reproduzindo plasmídeos que codifica a resistência para estes antibióticos posteriores são potencialmente úteis como vetores de clonagem para estas cepas Klebsiella. K. pneumoniae de tipo selvagem (ATCC 25955), a K.

pneumonia depressiva por glucose (ECL2106), e K. oxytoca (ATCC 8724) foram sucessivamente transformadas para resistência a tetraciclina por eletroporação com o plasmídeo de número de cópia moderada pBR322 (New England Biolabs, Bervely, MA) . Isto foi realizado pelo seguinte procedimento: Dez mL de uma cultura durante a noite foram inoculados em 1 L LB (1% p/v) Bacto- triptona (Difco, Detroit, MI), 0,5% (p/v) extrato de levedura Bacto (Difco) e 0,5% (p/v) NaCl (Sigma, St. Louis, MO) e a cultura foi incubada a 37° C para um OD6oo de 0,5-0,7. As células foram esfriadas em gelo, coletadas por centrifugação a 4000 x g durante 15 min, e colocadas em suspensão em 1 L de 10% de glicerol de gelo-frio estéril. As células foram repetidamente coletadas por centrifugação e progressivamente colocadas em suspensão em 500 mL, 20 mL e, finalmente, 2 mL de 10% de glicerol de gelo-frio estéril. Para eletroporação, 40 uL de células foram misturadas com 1-2 uL DNA em uma pequena cuba de 0,2 cm gelada e foram pulsadas a 200 Ω, 2,5 kV durante 4-5 mseg usando um BioRad Gene Pulser (BioRad, Richmond, CA). Um mL de meio SOC (2% p/v) Bacto-triptona (Difco), 0,5% (p/v) extrato de levedura de Bacto (Difco) , 10 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM

MgS04, 2,5 mM KC1 e 20 mM glucose) foram adicionados para as células e, após a suspensão foi transferida para um tubo de polipropileno estéril de 17 x 100 mm, a cultura foi incubada durante lha 37° C, 225 rpm. As alíquotas foram colocadas em placas em meio seletivo, como indicado. As análises do plasmídeo DNA de transformantes de resistência a tetraciclina independente mostraram a digestão de endonuclease de restrição de padrões típicos de pBR322, indicando que o vetor estava estável mantido após, durante a noite, a cultura a 37° C em LB contendo tetraciclina (10 ug/mL). Assim, este vetor, e os derivados, tal como, pBR329 (ATCC 37264) que codificam a resistência para ampicilina, tetraciclina e cloranfenicol, podem ser usados para introduzir os cassetes de expressão DAR1/PGG2 e dhaT/dhaBl-3 em K. pneumoniae e K. oxytoca.

Os genes DAR1 e GPP2 podem ser obtidos por amplificação mediada por PCR do genoma de Saccharomyces cerevisiae, baseado nas sequências de DNA conhecida dos mesmos.

Os genes são, então, transformados em K. pneumoniae e K. oxytoca sob o controle de um ou mais promotores que podem ser usados para dirigir a expressão dos mesmos em meios contendo glucose. Para conveniência, os genes foram obtidos em um fragmento DNA de 2,4 kb obtido de plasmideo pAH44 com PvuII restrição endonuclease, em que os genes já estão organizados em um cassete de expressão sob o controle do promotor de E. coli.

Este fragmento de DNA foi ligado para pBR329 digerido de PvuII, produzindo inativação por inserção de seu gene de resistência a cloranfenicol. 0 DNA ligado foi usado para transformar E. coli DH5a (Gibco, Gaithersberg, MD) . Os transformantes foram selecionados pela resistência do mesmo para tetraciclina (10 ug/mL) e foram triados para a sensibilidade dos mesmos para cloranfenicol (25 ug/mL). A análise do plasmideo DNA de resistência a tetraciclina, os transformantes sensíveis a cloranfenicol confirmaram a presença dos plasmídeos esperados, em que cassete de expressão de Piac-darl-ggp2 foi subclonado em cada orientação no sitio pBR329. Estes plasmídeos, designados pJSPlA (orientação sentido horário) e pJSPlB ( orientação anti- sentido horário), foram separadamente transformados por eletroporação em K. pneumonia (ATCC 25955) , K. pneumonia (ECL2106) e K. oxytoca (ATCC 8724) como descrito.

Os transformantes foram selecionados pela resistência dos mesmos a tetraciclina (10 ug/mL) e foram triados para a sensibilidade dos mesmos para cloranfenicol (25 ug/mL). A análise de restrição dos plasmideos isolados dos transformantes independentes mostrou somente os padrões de digestão esperados, e confirmou que os mesmos eram estáveis mantendo a 37° C com seleção antibiótica. A expressão de genes DAR1 e GPP2 pode ser melhorada pela adição de IPTG (0,2-2,0 mM) para o meio de crescimento.

Os quatro genes de K. pneumoniae dhaB(103) e dhaT podem ser obtidos por amplificação mediada por PCR do genoma K. pneumoniae, baseado na sequência DNA conhecida dos mesmos.

Estes genes são então transformados em K. pneumoniae sob o controle de um ou mais promotores que podem ser usados para dirigir a expressão dos mesmos em meios contendo glucose. Para conveniência, os genes foram obtidos em, aproximadamente, um fragmento DNA de 4,0 kb obtido pela digestão de plasmideo pAH24 com a endonuclease de restrição Kpnl/SacI, em que os genes já são organizados em um cassete de expressão sob o controle do promotor lac de E. coli. Este fragmento de DNA foi ligado para pBC-KS+ (Stratagene, LaJolla, CA) , similarmente, digerido e usado para transformar E. coli DH5a.

Os transformantes foram selecionados pela resistência dos mesmos para cloranfenicol (25 ug/mL) e foram triados para um fenotipo de colônia branca em agar LB contendo X-gal. A análise de restrição do plasmideo DNA de transformantes de resistência a cloranfenicol demonstrou o fenótipo de colônia branca confirmou a presença do plasmideo esperado, designou pJSP2, em que os genes dhaT-dhaB(1-3) foram subclonados sob o controle do promotor lac de E. coli.

Para melhorar a conversão de glucose em 1,3- propanodiol, este plasmídeo foi separadamente transformado por eletroporação em K. pneumoniae (ATCC 25955) (pJSPlA) , K. pneumoniae (ECL2106) (pJSPlA) e K. oxytoca (ATCC 8724) (pJSPlA) já contendo o cassete de expressão Piac-darl-ggp2.

Cotransformantes foram selecionados pela resistência dos mesmos para tanto tetraciclina (10 ug/mL) como cloranfenicol (25 ug/mL). A análise de restrição dos plasmideos isolados de cotransformantes independentes mostraram os padrões de digestão esperados para ambos pJSPlA e pJSP2. A expressão dos genes DARl e GPP2, dhaB(l-3) e dhaT pode ser melhorada pela adição de IPTG (0,2-2,0 mM) ao meio. EXEMPLO 7 Produção de 1,3-propanodiol a partir de glucose por K. pneunoniae As cepas de Klebsiella pneumoniae ECL2106 e 2106-47, transformadas com pJSPlA, e ATCC 25955, transformadas com pJSPlA e pJSP2, foram cultivadas em um fermentador de 5 L

Applikon sob várias condições (ver Tabela 4) para a produção de 1,3-propanodiol a partir de glucose. A cepa 2104-47 é um derivado tolerante de fluoroacetato de ECL2106 que foi obtido de uma placa de seleção fluoroacetato/lactato como descrito em Bauer et. al., Appl. Environ. Microbiol. 56, 1296 (1990). Em cada caso, o meio usado continha 50-100 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 7,5, 40 mM (NH4)S04, 0,1% (p/v) de extrato de levedura, 10 μΜ CoCl2, 6,5 μΜ CuCl2, 100 μΜ FeCl3, 18 μΜ FeS04, 5 μΜ H3B03, 50 μΜ MnCl2, 0,1 μΜ Na2Mo04, 25 μΜ ZnCl2, 0,82 mM MgS04, 0,9 rtiM CaCl 2, e 10-20 g/L de glucose. A glucose adicional foi alimentada, com glucose residual mantida em excesso. A temperatura foi controlada a 31° Ceo pH controlado a 7,5 com 5N KOH ou NaOH. Os antibióticos apropriados foram incluídos para a manutenção de plasmídeo; IPTG (isopropil-b-D-tiogalactopiranosídeo) foi adicionado a concentrações indicadas como o reservatório.

Para fermentações anaeróbicas, 0,1 ppm de nitrogênio foi pulverizado pelo reator; quando o ponto de ajuste dO era de 5%, 1 vvm de ar foi aspergido pelo reator e o meio foi suplementado com vitamina B12. As concentrações finais e globais dadas (g/g) são mostradas na Tabela 4.

Tabela 4 Produção de 1,3-propanodiol a partir de glucose por K. pneumoniae EXEMPLO 8 Conversão de substratos de carbono em 1,3-propanodiol por K.

pneumoniae recombinante contendo darl, gpp2, dhaB, e dhaT A. Conversão de D-fructose em 1,3-propanodiol por várias cepas recombinantes de K. pneumoniae: Colônias únicas de K. pneumoniae (ATCC 25955 pJSPlA), K. pneumoniae (ATCC 25955 pJSPlA/pJSP2), K. pneumoniae (ATCC 2106 pJSPlA), e K. pneumoniae (ATCC 2106 pJSPlA/pJSP2) foram transferidas de placas agar e em tubos de cultura separados foram subcultivados durante a noite em caldo Luria-Bertani (LB) contendo o agente (s) antibiótico apropriado. Um frasco de 50 mL contendo 45 mL de um meio mínimo filtrado estéril definido como LLMM/F que continha por litro: 10 g de fructose; 1 g de extrato de levedura; 50 mmoles de fosfato de potássio, pH 7,5; 40 mmoles de (NH4)2S04; 0,09 mmoles de cloreto de cálcio; 2,38 mg de CoC12»6H20; 0,88 mg de CuCl2»2H20; 27 mg de FeCl3*6H20; 5 mg de FeSO4»7H20; 0,31 mg de H3B03; 10 mg de MnCl2«4 H20; 0,023 mg de Na2Mo04*2 H20; 3,4 mg de ZnCl2; 0,2 MgSO4*7H20. A tetraciclina a 10 ug/mL foi adicionada para meio para reações usando cada dos recombinantes plasmídeos únicos; 10 ug/mL de tetraciclina e 25 ug/mL de cloranfenicol para reações usando cada um dos recombinantes de plasmídeo duplo. 0 meio foi completamente pulverizado com nitrogênio antes da inoculação com 2 mL da subcultura. o IPTG (I) a concentração final de 0,5 mM foi adicionado para alguns frascos. Os frascos foram tampados, então, incubados a 37° C, 100 rpm em uma incubadora/agitador de New Brunswick Series 25. As reações foram cicladas durante, pelo menos, 24 horas ou até mais do substrato de carbono ser convertido nos produtos. As amostras foram analisadas por HPLC. A Tabela 5 descreve os rendimentos de 1,3-propanodiol (3G) produzido de fructose por vários recombinantes Klebsiella.

Tabela 5 Produção de 1,3-propanodiol a partir de D-fructose usando Klebsiella recombinante B. Conversão de vários substratos de carbono em 1,3-propanodiol por K. pneumoniae (ATCC 25955 pJSPlA/pJSP2): Uma alíquota (0,1 mL) de culturas congeladas de carga de K. pneumoniae (ATCC 25955 pJSPlA/pJSP2) foi transferida para 50 mL de meio de semente em um frasco com anteparos. O meio de semente continha por litro: 0,1 molar de tampão NaK/P04, pH

7,0; 3 g de (NH4)2S04; 5 g de glucose, 0,15 g MgSO4*7H20, 10 mL 100X de solução de elemento de traço, 25 mg de cloranfenicol, 10 mg de tetraciclina, e 1 g de extrato de levedura. O elemento de traço 100X continha por litro: 10 g de ácido cítrico, 1,5 g de CaCl2*2H20, 2,8 g FeS04*7H20, 0, 39 g de ZnSO4*7H20, 0, 38 g de CuSO4*5H20, 0,2 g de CoCl2«6H20, e 0,3 g MnCl2*4H20. A solução resultante foi titulada para pH 7,0 com ou KOH ou H2S04. A glucose, elementos de traço, antibióticos e extratos de levedura foram esterilizados separadamente. O inóculo de semente foi cultivado durante a noite a 35° C e 250 rpm. O projeto de reação foi semi-aeróbico. O sistema consiste de 130 mL de meio de reação em frascos selados de 125 mL foram deixados parcialmente abertos com uma tira de chapa de alumínio. O meio de reação continha por litro 3 g de (NH4)2S04;

20 g de substrato de carbono; 0,15 molar de tampão NaK/P04, pH 7,5; 1 g de extrato de levedura; 0,15 g MgSO4*7H20, 0,5 mmoles de IPTG; 10 mL 100X de solução de elemento de traço; 25 mg cloranfenicol; e 10 mg de tetraciclina. A solução resultante foi titulada para pH 7,5 com ou KOH ou H2S04. As fontes de carbono eram: D-glucose (GIc); D-fructose (Frc); D-lactose (Lac); D-sacarose (Suc); D-maltose (Mal); e D-manitol (Man).

Algumas contas de vidro eram incluídos no meio para melhorar a mistura. As reações foram iniciadas pela adição de inóculo de semente assim que a densidade óptica da suspensão de célula começou a 0,1 AU como medido a ISoo nm. Os frascos foram incubados a 35° C: 250 rpm. A produção de 3G foi medida por HPLC após 24 horas. A Tabela 6 descreve os rendimentos de 1,3- propanodiol produzido dos vários substratos de carbono.

Tabela 6 EXEMPLO 9 MELHORA DE PRODUÇÃO DE 1,3-PROPANODIOL USANDO 0 GENE dhaBX O Exemplo 9 demonstra a produção melhorada de 1,3- propanodiol em E. coli quando um gene codificando uma proteína X é introduzida.

Construção de vetor de expressão pTacIQ O vetor de expressão de E. coli, pTacIQ contendo o gene laclq (Farabaugh, P.J. 1978, Nature 274 (5673) 765-769) e o promotor tac (Amann et al, 1983, Gene 25, 167-178) foi inserido no sítio endonuclease de restrição EcoRI de pBR322 (Sutcliffe, 1979, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 43, 77- 90). Um sítio de clonagem múltipla e a sequência de terminador (SEQ ID NO:50) substitui a sequência pBR322 de EcoRI para Sphl.

Subclonagem dos genes desidratase de glicerol (dhaBl,2, 3,X) A região contendo a região de codificação inteira para Klebsiella dhaBl, dhaB2, dhaB3 e dhaBX do dhaB operon de pHK28-26 era clonagem em pBluescriptIIKS+ (Stratagene) usando as enzimas de restrição Kpnl e EcoRI para criar o plasmídeo pM7. A matriz de leitura aberta para o gene dhaB3 foi amplificado de pHK 28-26 por PCR usando iniciadores (SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52) incorporando um sitio EcoRI à terminação 5' e um sitio Xbal à terminação 3'. O produto foi subclonado em pLitmus29(NEB) para gerar o plasmídeo pDHAB3 contendo dhaB3. O gene dhaBX foi removido por digerindo o plasmídeo pM7 com Apal e Xbal, purificando o fragmento de 5,9 kb e ligando o mesmo com o fragmento 325-bp Apal-Xbal do plasmídeo pDHAB3 para criar pMll contendo dhaBl, dhaB2 e dhaB3. A matriz de leitura aberta para o gene dhaBl foi amplificada de pHK28-26 por PCR usando iniciadores (SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 54) incorporando um sítio de HindIII e um sítio de ligação de ribossomo de consenso à terminação 5’ e um sítio Xbal à terminação 3'. 0 produto foi subclonado em pLitmus28(NEB) para gerar os plasmídeos pDTl contendo dhaBl.

Um fragmento de NotI-Xbal de pMll contendo parte do gene dhaBl, o gene dhaB2 e o gene dhaB3 com inserido em pDTl para criar o plasmídeo de expressão dhaB, pDT2. O fragmento HindIII-Xbal contendo os genes dhaB(1,2,3) de pDT2 foi inserido em pTaclQ para criar pDT3.

Subclonagem do gene desidrogenase TMG (dhaT) 0 fragmento Kpnl-Sacl de pHK28-26, contendo o gene desidrogenase de TMG (dhaT), foi subclonado em pBluescriptIIKS+ criando o plasmídeo pAHl. 0 gene dhaT foi clonado por PCR de pAHl como gabarito DNA e iniciadores sintéticos (SEQ ID NO:55 com SEQ ID NO:56) incorporando um sitio Xbal à terminação 5' e um sitio BamHI à terminação 3'. 0 produto foi subclonado em PCR-Script (Stratagene) ao sítio Srfl para gerar os plasmídeos pAH4 e pAH5 contendo dhaT. 0 pAH4 contém o gene dhaT na orientação correta para expressão do promotor lac em pCR-Script e pAH5 contém o gene dhaT na orientação oposta. 0 fragmento Xbal-BamHI de pHA4 contendo o gene dhaT foi inserido em pTaclQ para gerar o plasmídeo, pAH8. 0 fragmento HindIII-BamHI de pAH8 contendo o gene RBS e o gene dhaT foi inserido em pBluescriptIIKS+ para criar pAHll.

Construção de um cassete de expressão para dhaT e dhaB(l, 2, 3) Um cassete de expressão para dhaT e dhaB(l, 2, 3) foi montado do dhaB(l, 2, 3) e subclones dhaT descrito previamente usando processos de biologia molecular padrão. Um fragmento Spel-SacI contendo os genes dhaB(l, 2, 3) de pDT3 foi inserido em pAHll aos sítios Spel-SacI para criar pAH24.

Um ligador Sall-Xbal (SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 58) foi inserido em pAH5 que foi digerido com as enzimas de restrições Sall-Xbal para criar pDT16. 0 ligador destrói o sítio Xbal. 0 fragmento Sall-Mlul de 1 kb de pDT16 foi então inserido em pAH24 substituindo o fragmento Sall-Mlul existente para criar pDT18.

Plasmídeo para super-expressão de dhaT e dhaB (1, 2, 3, X) em E. coli 0 fragmento Notl-Xbal de 4,4 kb contendo parte do gene dhaBl, dhaB2, dhaB3 e dhaBX do plasmídeo pM7 foi purificado e ligado com o fragmento Notl-Xbal de 4,1 kb de plasmídeo pDT18 (restaurando dhaBl) para criar pM33 contendo dhaBl, dhaB2, dhaB3 e dhaBX.

Cepa de E. coli 0 DH5 de E. coli foi obtido de BRL (Difco) . Esta cepa foi transformada com os plasmídeos pM7, pMll, ou pDtl8 e selecionado em placas de LA contendo 100 ug/ml de carbenicilina.

Produção de 1,3-propanodiol 0 DH5 de E. coli, contendo o plasmídeo pM7, pMll, pM33 ou pDT18 foi cultivado em placas de LA mais 100 ug/ml de carbenicilina durante a noite a 37° C. Uma colônia de cada era usada para inocular 25 ml de meio (0,2 M KH2P04, 2,0 g/L de ácido cítrico, 2,0 g/L de MgS04*7H20, 1,2 ml/L de H2S04 (98%), 0,3 g/L de citrato de amônia férrica, 0,2 gramas de CaC12*2H20, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de glucose, 30 g/L de glicerol) mais 0,005 g/L de vitamina B12, 0,2 mM IPTG, 200 ug/ml de carbenicilina e 5 ml de solução de elemento de traço de Balch modificada (cuja composição pode ser encontrada em Methods for General and Molecular Bacteriology (P. Gerhardt et. al., eds, p 158, American Socíety for Microbiology, Washington, DC 1994), pH final de 6,8 (NH40), então o filtro esterilizado em 250 ml de frascos erlenmeiers. Os frascos de agitação foram incubados a 37° C com agitação (300 rpm) durante vários dias, durante que os mesmos foram mostrados para análise de HPLC por procedimentos padrões. Os rendimentos finais são mostrados na Tabela 4.

No todo, como mostrado na Tabela 7, os resultados indicam que a expressão de dhaBX em plasmídeos expressando dhaB(l,2,3) ou dhaT-dhaB(1,2,3) grandemente melhora a produção de 1,3-propanodiol. T ABE IA 7 Efeito de expressão de dhaBX na produção de 1,3-propanodiol por E. coli. * Expressado como uma média de várias experiências.

Iniciadores: SEQ ID NO: 50- MCS-TERMINADOR

5 AGCTTAGGAGTCTAGAATATTGAGCTCGAATTCCCGGGCATGCGGTACCGGATCCAGAAA AAGCCCGCACCTGACAGTGCGGGCTTTTTTTTT 3' SEQ ID NO: 51 terminação -dhaB3-5'. EcoRI

GGAAT T CAGATVT CAGCAAT GAGC GAGAAAAC CAT G C SEQ ID NO: 52 terminação dhaB3-3' Xbal GCTCTAGATTAGCTTCCTTTACGCAGC

SEQ ID NO 53: dhaBl 5'end-HindIII-SD 5' GGCCAAGCTTAAGGAGGTTAATTAAATGAAAAG 3' SEQ ID NO 54: dhaBl 3' terminação- Xbal 5' GCTCTAGATTATTCAATGGTGTCGGG 3' SEQ ID NO 55: dhaT 5' terminação -Xbal 5' GCGCCGTCTAGAATTATGAGCTATCGTATGTTTGATTATCTG 3' SEQ ID NO 56: dhaT 3' terminação -BamHI 5’ TCTGATACGGGATCCTCAGAATGCCTGGCGGAAAAT 3’ SEQ ID NO 57: pUSH Ligadorl: 5’ TCGACGAATTCAGGAGGA 3’ SEQ ID NO 58: pUSH Ligador2: 5' CTAGTCCTCCTGAATTCG 3' EXEMPLO 10 Reativação da atividade de desidratase de glicerol O Exemplo 10 demonstra a reativação in vivo da atividade desidratase glicerol nos microorganismos contendo, pelo menos, um gene codificando a proteína X.

Os plasmídeos pM7 e pMll foram construídos como descrito no Exemplo 9 e transformados em células DH5a de E. coli. As células transformadas foram cultivadas e testadas para a produção de 1,3-propanodiol de acordo com o processo de Honda et. al. (1980, In Situ Reactivation of Glycerol- Inactivated Coenzyme Bi2-Dependent Enzymes, Glycerl Desidratase and Diol Desidratase, Journal of Bacteriology 143:1458-1465) .

Materiais e processos Toluenização de células As células foram cultivadas para fase mid-log e foram coletadas por centrifugação a temperatura ambiente, no início do crescimento, isto é, 0,2 > OD60o < 0,8. As células coletadas foram lavadas 2x em 50 mM KP04 pH 8,0 a temperatura ambiente. As células foram colocadas em suspensão para OD6oo 20-30 em 50 mM KP04 pH 8,0. O OD absoluto não é crítico. Uma massa de célula inferior é colocada em suspensão em menos volume. Se a coenzima B12 é adicionada a este ponto, o restante das etapas é realizado no escuro. 0 tolueno é adicionado para 1% de volume final de suspensão de célula e a suspensão é sacudida vigorosamente durante 5 minutos a temperatura ambiente. A suspensão é centrifugada para pelotizar as células. As células são lavadas 2x em 50 mM KP04 pH 8,0 a temperatura ambiente (25 ml cada). A pelota de célula é colocada em suspensão no mesmo volume como foi usada antes da adição de tolueno e transferido para tubos novos. O OD60o para células toluenizadas foi medido e registrado e armazenado a 4 graus C..

Teste de desidratase de glicerol de célula inteira As células tratadas com tolueno foram testadas a 37 graus C para a presença de atividade de desidratase. Os três conjuntos de reações foram realizados como mostrado abaixo: sem ATP, o ATP adicionado a 0 tempo, e ATP adicionado a 10 minutos.

NooATP: 100 ul 2M glicerol 10 0 ul 15 0 uM CoB12 700 ul tampão (0,03 M KPO4/0,5M KC1, pH 8,0) Τ = 0 minutos ΑΤΡ 100 ul 2Μ glicerol 100 ul 150 uM C0B12 600 ul tampão (0,03 M KPO4/0,5M KC1, pH 8,0) 100 ul 30 mM ATP/30 mM MnCl2 T = 10 minutos ATP 100 ul 2M glicerol 100 ul 150 uM CoB12 70 0 ul tampão (0,03 M KPO4/0,5M KC1, pH 8,0) Os controles foram preparados para cada das condições acima adicionando tampões de 100 ul em vez de C0B12.

Os tubos foram misturados. 50 ul MBTH (3-metil-2-benzo- tiazolinona hidrazona) (6 mg/ml em 375 mM glicina / HC1 pH 2,7) foi adicionado para cada destes tubos e a incubação continua em água de gelo. Os tubos de reação foram colocados em um banho de água de 37 graus C durante alguns minutos para equilibrar para 37 graus C. Um tubo contendo células bastante toluenizadas para todos os tubos de testes foi colocado em um banho de água de 37 graus C durante alguns minutos para equilibrar a 37 graus C. Um tubo contendo 2,5 vezes diluída (no tampão de teste) 30 mM ATP/30 mM MnCl2 (12 mM cada) foi colocado em banho de água a 37 graus C durante alguns minutos para equilibrar 37 graus C. Uma suspensão de célula de 100 ul foi adicionado para todos os tubos e as amostras foram feitas a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 e 30 minutos. Em cada ponto de tempo , 100 ul de reação foram retirados e imediatamente adicionados para MBTH resfriado de gelo de 50 ul, submetidos a vórtice, e colocados em um banho de gelo. A T = 10 minutos, uma amostra foi retirada e adicionada para MBTH, em seguida, 100 ul do ATP/Mn diluído 2,5 vezes foi adicionado tão rápido quanto é possível. Quando todas as amostras foram coletadas, uma estante de tubo de amostra foi adicionada para um banho de água fervente e foi fervida durante três minutos. Os tubos foram esfriados em um banho de água de gelo durante 30 segundos.500 ul de FeC13.6H20 de 3,3 mg/ml recentemente preparado, foram adicionados para os tubos e os tubos submetidos a vórtice. Os tubos foram incubados a temperatura ambiente durante 30 minutos, diluída lOx em H20, e então centrifugado para coletar as células e partículas. A absorvância foi medida a 670 nM e as células foram diluídas para manter OD sob 1,0.

Exemplo de cálculo de atividade O OD670 observado foi multiplicado pelo fator de diluição para determinar a absorvância. A absorvância em branco foi subtraída para que a série de reação e ο T0 A670nM

foi subtraída. 0 A670nM absoluto foi dividido por 53,4 (mM coeficiente de extinção para 30H-propioaldeído) e a concentração mM foi multiplicada por alguma diluição de reação durante o curso de tempo. Porque 1 ml de reação foi usada, a concentração (umoles/ml) de 3-OH-propionaldeído foi dividida por mg de peso seco usado no teste (via calculada OD600 e 10D 600 = 0,436 mg peso seco) para ter umoles aldeído por células de peso seco de mg.

Resultados Como mostrado na Figura 6, as células de E. coli total foram testadas para reativação de desidratase de glicerol na ausência e presença de ATP e Mn++ adicionado. Os resultados indicam que as células contendo um plasmídeo carregando dhaB 1, 2 e 3, assim como, proteina X tem a capacidade para reativar cataliticamente desidrogenase de glicerol inativada. As células contendo a proteina 1, a proteina 2 e a proteina 3 tem capacidade aumentada para reativar desidratase de glicerol cataliticamente inativada.

Como mostrado na Figura 7, as células de E. coli total foram testadas para reativação de desidratase de glicerol inativada por glicerol na ausência e na presença de ATP e Mn++ adicionado. Os resultados mostram que as células contendo subunidade dhaB 1, 2 e 3 e X tem a capacidade para reativar desidratese de glicerol cataliticamente inativada. A célula em que falta o gene de proteina X não tem a capacidade de reativar desidratase de glicerol cataliticamente inativada.

As Figuras 9 e 10 ilustram que as células hospedeiras contendo plasmídeo pHK 28-26 (Figura 1) , quando cultivadas sob condições apropriadas para a produção de 1,3- propanodiol, produziram mais 1,3-propanodiol do que as células hospedeiras transformadas com pDT24 e cultivadas sob condições apropriadas para a produção de 1,3-propanodiol. O plasmídeo pDT24 é derivado de pDT18 (descrito no Exemplo 9) e contém dhaT, dhaB 1, 2, 3 e a proteína X, mas falta as proteínas 1, 2 e 3.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÕES GERAIS: (i) REQUERENTE: MARIA DIAZ-TORRES ET AL.

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: METHOD FOR THE RECOMBINANT

PRODUCTION OF 1,3 PROPANEDIOL (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 68 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Genencor International, Inc. (B) RUA: 4 Cambridge Place 1870 South Winton road (C) CIDADE: Rochester (D) ESTADO: NY

(E) PAÍS: U.S.A (F) CEP: 14618 (v) FORMA LEGÍVEL DO COMPUTADOR: (A) TIPO MÉDIO: Diskette (B) COMPUTADOR: IBM Compatible (C) SISTEMA DE OPERAÇÃO: Windows (D) SOFTWARE: FastSEQ for Windows Version 2.0b (vi) DADOS DO PEDIDO ATUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/969,683 (B) DATA DO DEPÓSITO: 13-NOV-1997 (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 60/030,601 (B) DATA DO DEPÓSITO: 13-NOV-1996 (viii) INFORMAÇÕES AGENTE/PROCURADOR: (A) NOME: Glaister, Debra (B) NÚMERO DO REGISTRO: 33,888 (C) NÚMERO Ξ REFERÊNCIA DO DOCUMENTO: GC 369-2 (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: 650-864-7620 (B) TELEFAX: 650-845-6504 (C) TELEX: (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1668 pares base (B) TIPO: ácido nucléico (C) TIPO DO FILAMENTO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (iii) HIPOTÉTICO: NÂO

Claims

1. Processo para a produção de 1,3-propanodiol a partir de um microorganismo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas de: obtenção de um microorganismo transgênico capaz de produzir 1,3-propanodiol, o referido microorganismo compreendendo: pelo menos um ácido nucléico codificando uma atividade de desidratase de diol ou glicerol capaz de converter o glicerol em 3-hidroxipropionaldeído; um ácido nucléico codificando uma proteína X associada à reativação in vivo da desidratase; onde o ácido nucléico codificando a proteína X apresenta a sequência conforme apresentada na SEQ ID No: 68, SEQ ID No: 66; onde o ácido nucléico que codifica a proteína X está em um cassete de expressão diferente do ácido nucléico que codifica a atividade de desidratase de diol ou glicerol; e cultivo do microorganismo transgênico na presença de pelo menos uma fonte de carbono capaz de ser convertida em 1,3-propanodiol no referido microorganismo transformado e sob condições apropriadas para a produção de 1,3- propanodiol em que a fonte de carbono é selecionada dentre o grupo consistindo em monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos e um substrato de um carbono e recuperação do 1,3-propanodiol; onde ambos os genes que codificam atividade de desidratase e proteína X são introduzidos no referido microorganismo transgênico através de cassetes de expressão diferentes.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucléico codificando a proteína X é isolado de um agrupamento de gene desidratase de glicerol.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucléico codificando a proteína X é isolado de um agrupamento de gene desidratase de diol.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o agrupamento de gene de desidratase de glicerol é a partir de um organismo selecionado dos gêneros consistindo de Klebsíella e Citrobactor.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o agrupamento de gene desidratase de diol é de um organismo selecionado dos gêneros consistindo em Klebsíella, Clostridium e Salmonella.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que ácido nucléico codificando uma atividade desidratase é heterólogo ao organismo.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que ácido nucléico codificando uma atividade desidratase é homólogo ao organismo.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o microorganismo transgênico é selecionado a partir do grupo de gêneros consistindo em Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsilella, Aerobacter, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candída, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces e Pseudomonas.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o microorganismo é selecionado de E. coli e Klebsilella spp.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucléico codificando a proteína X é estavelmente mantido no genoma hospedeiro.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a fonte de carbono é glicose.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucléico codificando a proteína X possui a sequência como descrita na SEQ ID NO: 68 ou SEQ ID NO:66.

13. Microorganismo transgênico capaz de produzir 1,3-propanodiol a partir de uma fonte de carbono, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) pelo menos um ácido nucléico codificando uma atividade de desidratase de diol ou glicerol capaz de converter glicerol em 3-hidroxipropionaldeído; b) pelo menos um ácido nucléico codificando uma glicerol-3-fosfatase; c) pelo menos um ácido nucléico codificando uma proteína X associada à reativação in vivo da desidratase; onde o ácido nucléico que codifica a proteína X apresenta a sequência conforme apresentada na SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:66; e onde o microorganismo transgênico é selecionado a partir do grupo de gêneros consistindo em Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsilella, Aerobacter, Lactobacillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces e PseudomonasPseudomonas; e onde o ácido nucléico codificando a proteína X está em um cassete de expressão diferente do ácido nucléico codificando a atividade desidratase de glicerol e diol.

14. Microorganismo transgênico, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de gue codifica a proteína X é isolado de um agrupamento de gene desidratase de glicerol.

15. Microorganismo transgênico, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de gue codifica a proteína X é isolado de um agrupamento de gene desidratase de diol.

16. Microorganismo transgênico, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de gue o agrupamento de gene desidratase de glicerol é a partir de um organismo selecionado dos gêneros consistindo em Klebsiella e Citrobactor.

17. Microorganismo transgênico, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de gue o agrupamento de gene desidratase de diol é de um organismo selecionado dos gêneros consistindo em Klebsiella, Clostridium e Salmonella.

18. Microorganismo transgênico, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida atividade de desidratase é heteróloga ao referido microorganismo.

19. Microorganismo transgênico, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucléico codificando a proteína X possui a sequência como descrita na SEQ ID NO:68 ou SEQ ID NO:66.

20. Processo para prolongar a meia-vida da atividade de desidratase de diol ou glicerol capaz de converter glicerol em 3-hidroxipropionaldeído em um microorganismo transformado capaz de produzir 1,3- propanodiol, o microorganismo contendo pelo menos um ácido nucléico codificando uma referida atividade de desidratase de diol ou glicerol, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: introduzir um ácido nucléico codificando proteína X no referido microorganismo; onde o ácido nucléico codificando a proteína X possui a sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 66; e onde a proteina X é associada à reativação in vivo da desidratase; e cultivar sob condições apropriadas para a produção de 1,3-propanodiol.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucléico codificando a atividade de desidratase é heterólogo ao referido microorganismo.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucléico codificando a proteina X é isolado de um agrupamento de gene desidratase de glicerol.

23. Processo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucléico codificando a proteina X é isolado de um agrupamento de gene desidratase de diol.

24. Processo, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o agrupamento de gene desidratase de glicerol é de um organismo selecionado dos gêneros consistindo em Klebsiella e Citrobactor.

25. Processo, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o agrupamento de gene desidratase de diol é de um organismo selecionado dentre os gêneros consistindo de Klebsilella, Clostridium e Salmonella.

26. Processo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o microorganismo é selecionado do grupo consistindo de Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsilella, Aerobacter, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces e Pseudomonas.

27. Processo, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o microorganismo é selecionado do grupo consistindo em E. coli e Klebsiella ssp.