CN101348774B - 一种驯化1,3-丙二醇产生菌的方法及其应用 - Google Patents

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本发明公开了一种驯化1，3-丙二醇产生菌的方法及其应用。本发明通过对现有的1，3丙二醇产生菌进行驯化，提高其对底物和产物的耐受性，使其在较高浓度的底物和多种产物存在的情况下仍然能够生长良好，且生产1，3-丙二醇的能力也得到了提高。实验证明，在相同的发酵条件下，利用本发明方法驯化的1，3-丙二醇产生菌进行发酵生产时，细胞生长受底物和多种产物协同抑制的作用明显小于未经过驯化的菌种，生物量(OD600nm)和1，3-丙二醇的产量也明显提高。本发明方法将在1，3-丙二醇产生菌的育种方面发挥重要作用，具有较好的应用前景。

Description

一种驯化1，3-丙二醇产生菌的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种驯化1，3-丙二醇产生菌的方法及其应用。
背景技术
1，3-丙二醇是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂用于制备油墨、印染、涂料、药物、润滑剂和抗冻剂等，其最主要的用途是作为聚酯、聚氨酯类以及环状化合物生产中具有潜在应用价值的单体。目前已知有多种生产1，3-丙二醇的化学方法，例如用环氧乙烷为原料，经催化加氢再酰化的方法合成1，3-丙二醇；用丙烯醛水合得到3-羟基丙醛，3-羟基丙醛经催化加氢再生成1，3-丙二醇。但这些方法需要高温、高压和复杂的贵重金属催化剂才能实现，不仅投资大、分离提纯困难，还会造成严重的环境污染。
微生物发酵法是以生物技术为特征的“绿色工业”向传统石油化工提出的强有力的挑战，具有重要的现实意义，因而越来越受到重视。目前，微生物发酵法生产1，3-丙二醇尚处于实验室研究向中试过渡的阶段，与化学合成法相比具有以下优点：1、可以利用成本较低的可再生资源；2、生产条件温和、节约能源、不需贵重金属催化剂；3、转化率高、选择性好、副产物少、易于分离纯化；4、环境污染大大减少。在微生物发酵法生产1，3-丙二醇的过程中，除产生1，3-丙二醇外，还会产生甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸和乙醇等副产物，肠道细菌还会产生2，3-丁二醇，梭菌还会产生丁酸和丁醇。1，3-丙二醇产生菌的生长会受到底物甘油和多种产物的强烈抑制作用，这大大降低了1，3-丙二醇的生产效率。为了提高1，3-丙二醇的产量和底物的转化率，必须克服底物甘油、产物1，3-丙二醇和其他副产物对1，3-丙二醇产生菌生长的抑制作用。赵红英等人(赵红英，张健，刘宏娟等.1，3-丙二醇发酵过程中底物抑制及其对策的研究.现代化工，2002，22(7)：34～38.)通过提高培养基中甘油的浓度和利用平板包埋培养的方法驯化出了对底物的耐受力和厌氧生长能力均提高的克雷伯氏菌，其1，3-丙二醇的发酵终浓度和甘油的转化率均有所提高。Abbad-Andaloussi等人(Abbad-Andaloussi S，Manginot-Durr C，Amine J，et al.Isolation and characterization of Clostridium butyricum DSM 5431 mutants withincreased resitance to 1，3-propanediol and altered production of acids.Appl EnvironMicrobiol 1995，61：4413～4417.)通过亚硝基胍诱变和质子自杀的方法，在含有高浓度1，3-丙二醇、溴化钠、溴酸钠和葡萄糖的培养基上驯化出了可耐受高浓度甘油和1，3-丙二醇且产乙酸途径发生突变的丁酸梭菌突变株，与野生型菌株相比，在补料批式培养中甘油的消耗提高44％以上，1，3-丙二醇的产量提高50％以上。
上述方法虽然可以提高1，3-丙二醇产生菌对底物和/或某种产物的耐受性，但在实际发酵过程中，细胞生长受到底物和多种产物的协同抑制作用，这些方法并不能从根本上解决多种产物积累对细胞的毒害作用和对1，3-丙二醇生产所带来的巨大负面影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种驯化1，3-丙二醇产生菌的方法及其应用。
本发明所提供的驯化1，3-丙二醇产生菌的方法，包括以下步骤：
1)培养1，3-丙二醇产生菌，得到发酵液；
2)将上述步骤1)的发酵液离心收集上清液，在上清液中加入甘油，得到1号驯化培养基；
3)将上述步骤1)的发酵液中的1，3-丙二醇产生菌接种于上述1号驯化培养基中，培养该1，3-丙二醇产生菌得到发酵液；
4)将上述步骤3)的发酵液离心收集上清液，在上清液中加入甘油，得到2号驯化培养基；
5)将上述步骤3)的发酵液中的1，3-丙二醇产生菌接种于上述2号驯化培养基中，培养该1，3-丙二醇产生菌得到发酵液；
6)将上述步骤3)的发酵液离心收集上清液，在上清液中加入甘油，得到3号驯化培养基；
7)将上述步骤5)的发酵液中的1，3-丙二醇产生菌接种于上述3号驯化培养基中，培养该1，3-丙二醇产生菌得到驯化菌。
所述方法中还包括将所述步骤n)的发酵液离心，分别收集上清液和菌体；在所述上清液中加入甘油，得到步骤n+1)用的培养基，将所述菌体在步骤n+1)用的培养基中培养得到1，3-丙二醇的过程；
所述n为大于等于7的一个自然数。
例如，将上述步骤7)的发酵液离心，分别收集上清液和菌体，在上清液中加入甘油，得到4号驯化培养基；将步骤7)发酵液离心得到的菌体在4号驯化培养基中培养得到驯化菌。
上述过程至少重复一次。
当然，上述驯化1，3-丙二醇产生菌的方法也可以只包括步骤1)-7)的驯化过程。
上述方法中，所有加入甘油的步骤中，下一步骤中甘油的加入量均大于等于上一步骤中甘油的加入量。
当所述1，3-丙二醇产生菌为克雷伯氏菌时，所述步骤2)中甘油的加入量为50-70g/L培养基；所述步骤4)中甘油的加入量为70-100g/L培养基；所述步骤6)中甘油的加入量为120-150g/L培养基。
如所述1，3-丙二醇产生菌为克雷伯氏菌时，所述步骤2)中甘油的加入量为60g/L培养基；所述步骤4)中甘油的加入量为90g/L培养基；所述步骤6)中甘油的加入量为120g/L培养基。
当所述1，3-丙二醇产生菌为克雷伯氏菌时，其培养条件为36-38℃，170-190r/m，旋转半径为11-13mm振荡培养12-16小时。
上述方法中，所述1，3-丙二醇产生菌为克雷伯氏菌、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、梭菌属、乳杆菌属或泥杆菌属的菌株。
按照上述驯化方法得到的驯化菌，培养该驯化菌得到1，3-丙二醇的方法也属于本发明的保护范围。
本发明通过对现有的1，3-丙二醇产生菌进行驯化，提高其对底物和产物的耐受性，使其在较高浓度的底物和多种产物存在的情况下仍然能够生长良好，且生产1，3-丙二醇的能力也得到了提高。实验证明，在相同的发酵条件下，利用本发明方法驯化的1，3-丙二醇产生菌进行发酵生产时，细胞生长受底物和多种产物协同抑制的作用明显小于未经过驯化的菌种，生物量(OD600nm)和1，3-丙二醇的产量也明显提高。本发明方法将在1，3-丙二醇产生菌的育种方面发挥重要作用，具有较好的应用前景。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施方式
实施例1、菌种的驯化
初始发酵培养基的组成为(11)：K2HPO4 4.45g，KH2PO4 1.3g，(NH4)2SO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.02g，酵母粉1.0g，甘油20g，铁溶液1.0mL，微量元素溶液1.0mL，余量为水。pH 7.0。115℃条件下灭菌20分钟。
上述铁溶液的组成为(11)：FeSO4·7H2O 5g，37％(体积百分含量)HCl 4mL，余量为水。
上述微量元素溶液的组成为(1L)：ZnCl2 70mg，CuCl2·2H2O 20mg，MnCl2·4H2O0.1g，NiCl2·6H2O 25mg，H3BO3 60mg，Na2MO4·2H2O 35mg，CoCl2·2H2O 0.2g，37％(体积百分含量)HCl 4mL，余量为水。
1，3-丙二醇产生菌的驯化方法具体包括以下步骤：
1)将克雷伯氏菌K.oxytoca M5al(Ohta K，Beall DS，Mejia JP，et al.Metabolicengineering of Klebsiella oxytoca M5A1 for ethanol production from xylose and glucose.Appl Environ Microbiol 1991，157：2810-2815.)(清华大学)、K.pneumoniae AS1.1736(中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC)和K.pneumoniae ATCC 25955(美国菌种保藏中心ATCC)分别接种到上述初始发酵培养基中，37℃180r/m旋转半径为12mm的条件下振荡培养14小时，将发酵液离心去除菌体，收集上清液。上清液中加入甘油，使甘油在上清液中的终浓度为60g/L，然后115℃条件下灭菌20分钟，将得到的培养基作为1号驯化培养基；
2)将克雷伯氏菌K.oxytoca M5al、K.pneumoniae AS1.1736和K.pneumoniaeATCC 25955分别制成菌悬液并涂布在每升培养基中添加15g琼脂粉的上述步骤1)的1号驯化培养基制成的平板上，37℃条件下培养16小时，分别挑取在上述步骤1)的1号驯化培养基平板上生长的单菌落。其中，克雷伯氏菌K.oxytoca M5al在1号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-1A和KO-2A，克雷伯氏菌K.pneumoniae AS1.1736在1号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-1A和KV-2A，克雷伯氏菌K.pneumoniae ATCC 25955在1号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-1A和FV-2A。
3)挑取上述步骤2)得到的6个单菌落，分别接种在1号驯化培养基中，37℃、180r/m、旋转半径为12mm的条件下振荡培养14小时，将发酵液离心去除菌体，上清液中加入甘油，使甘油在上清液中的终浓度为90g/L，然后115℃条件下灭菌20分钟，将得到的培养基作为2号驯化培养基；
4)将克雷伯氏菌KO-1A、KO-2A、KV-1A、KV-2A、FV-1A和FV-2A分别制成菌悬液并涂布在每升培养基中添加15g琼脂粉的上述步骤3)的2号驯化培养基制成的平板上，37℃培养16小时，分别挑取在上述步骤3)的2号驯化培养基平板上生长的单菌落。其中，KO-1A在2号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-11A和KO-12A，KO-2A在2号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-21A和KO-22A，KV-1A在2号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-11A和KV-12A，KV-2A在2号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-21A和KV-22A，FV-1A在2号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-11A和FV-12A，FV-2A在2号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-21A和FV-22A。
5)挑取上述步骤4)得到的12个的单菌落，分别接种在2号驯化培养基中，37℃、180r/m、旋转半径为12mm振荡培养14小时，将发酵液离心去除菌体，上清液中加入甘油，使甘油在上清液中的终浓度为120g/L，然后115℃条件下灭菌20分钟，将得到的培养基作为3号驯化培养基；
6)将克雷伯氏菌KO-11A、KO-12A、KO-21A、KO-22A、KV-11A、KV-12A、KV-21A、KV-22A、FV-11A、FV-12A、FV-21A和FV-22A分别制成菌悬液并涂布在每升培养基中添加15g琼脂粉的上述步骤5)的3号驯化培养基制成的平板上，37℃培养16小时，分别挑取在上述步骤5)的3号驯化培养基平板上生长的单菌落，接种到3号驯化培养基中。其中，KO-11A在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-111A和KO-112A，KO-12A在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-121A和KO-122A，KO-21A在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-211A和KO-212A，KO-22A在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-221A和KO-222A；KV-11A在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-111A和KV-112A，KV-12A在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-121A和KV-122A，KV-21A在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-211A和KV-212A，KV-22A在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-221A和KV-222A；FV-11A在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-111A和FV-112A，FV-12A在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-121A和FV-122A，FV-21A在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-211A和FV-212A，FV-22A在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-221A和FV-222A。
挑取上述24个单菌落37℃、180r/m、旋转半径为12mm振荡培养14小时，即得到驯化菌。
实施例2、发酵效果对比
将克雷伯氏菌K.oxytoca M5al、K.pneumoniae AS1.1736、K.pneumoniae ATCC25955和上述实施例1驯化得到的24株驯化菌分别接种到装有5mL上述初始发酵培养基的试管中，37℃、180r/min、旋转半径为12mm的条件下培养8小时，得到种子液。
将上述种子液按照1％(体积百分含量)的接种量接入到装有100mL上述初始发酵培养基的500mL三角瓶中，37℃、180r/m、旋转半径为12mm振荡培养14小时。发酵过程中，不同时间点取样测定发酵液的OD600nm值和1，3-丙二醇的浓度。
驯化得到的菌株KO-111A、KO-112A、KO-121A、KO-122A、KO-211A、KO-212A、KO-221A、KO-222A和未经驯化的原始菌株K.oxytoca M5al的发酵液中OD600nm值和1，3-丙二醇的浓度如表1所示，驯化得到的菌株KV-111A、KV-112A、KV-121A、KV-122A、KV-211A、KV-212A、KV-221A、KV-222A和未经驯化的原始菌株K.pneumoniaeAS1.1736的发酵液中OD600nm值和1，3-丙二醇的浓度如表2所示，驯化得到的菌株FV-111A、FV-112A、FV-121A、FV-122A、FV-211A、FV-212A、FV-221A、FV-222A和未经驯化的原始菌株K.pneumoniae ATCC 25955的发酵液中OD600nm值和1，3-丙二醇的浓度如表3所示。
表1驯化菌株和原始菌株K.oxytoca M5al的发酵结果比较
Figure G2008101195321D00061
表2驯化菌株和原始菌株K.pneumoniae AS1.1736的发酵结果比较
表3驯化菌株和原始菌株K.pneumoniae ATCC 25955的发酵结果比较
Figure G2008101195321D00072
从表1、2和3的结果可知，经过驯化的菌株在发酵过程中的生物量和1，3-丙二醇的浓度均明显高于未经过驯化的原始菌种，表明本发明的方法能够方便快捷的得到对底物甘油和各种产物具有较高耐受性的优良菌种，且经过驯化的菌种生产1，3-丙二醇的能力大幅提高。
实施例3、菌种的驯化
初始发酵培养基的组成同实施例1。
1，3-丙二醇产生菌的驯化方法具体包括以下步骤：
1)将克雷伯氏菌K.oxytoca M5al(Ohta K，Beall DS，Mejia JP，et al.Metabolicengineering of Klebsiella oxytoca M5A 1for ethanol production from xylose and glucose.Appl Environ Microbiol 1991，157：2810-2815.)(清华大学)、K.pneumoniae AS1.1736(中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC)和K.pneumoniae ATCC 25955(美国菌种保藏中心ATCC)分别接种到上述初始发酵培养基中，36℃170r/m旋转半径为11mm的条件下振荡培养12小时，将发酵液离心去除菌体，收集上清液。上清液中加入甘油，使甘油在上清液中的终浓度为50g/L，然后115℃条件下灭菌20分钟，将得到的培养基作为1号驯化培养基；
2)将克雷伯氏菌K.oxytoca M5al、K.pneumoniae AS1.1736和K.pneumoniaeATCC 25955分别制成菌悬液并涂布在每升培养基中添加15g琼脂粉的上述步骤1)的1号驯化培养基制成的平板上，36℃条件下培养12小时，分别挑取在上述步骤1)的1号驯化培养基平板上生长的单菌落。其中，克雷伯氏菌K.oxytoca M5al在1号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-1B和KO-2B，克雷伯氏菌K.pneumoniae AS1.1736在1号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-1B和KV-2B，克雷伯氏菌K.pneumoniae ATCC 25955在1号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-1B和FV-2B。
3)挑取上述步骤2)得到的6个单菌落，分别接种在1号驯化培养基中，36℃、170r/m、旋转半径为11mm的条件下振荡培养12小时，将发酵液离心去除菌体，上清液中加入甘油，使甘油在上清液中的终浓度为70g/L，然后115℃条件下灭菌20分钟，将得到的培养基作为2号驯化培养基；
4)将克雷伯氏菌KO-1B、KO-2B、KV-1B、KV-2B、FY-1B和FV-2B分别制成菌悬液并涂布在每升培养基中添加15g琼脂粉的上述步骤3)的2号驯化培养基制成的平板上，36℃培养12小时，分别挑取在上述步骤3)的2号驯化培养基平板上生长的单菌落。其中，KO-1B在2号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-11B和KO-12B，KO-2B在2号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-21B和KO-22B，KV-1B在2号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-11B和KV-12B，KV-2B在2号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-21B和KV-22B，FV-1B在2号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-11B和FV-12B，FV-2B在2号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-21B和FV-22B。
5)挑取上述步骤4)得到的12个的单菌落，分别接种在2号驯化培养基中，36℃、170r/m、旋转半径为11mm振荡培养12小时，将发酵液离心去除菌体，上清液中加入甘油，使甘油在上清液中的终浓度为120g/L，然后115℃条件下灭菌20分钟，将得到的培养基作为3号驯化培养基；
6)将克雷伯氏菌KO-11B、KO-12B、KO-21B、KO-22B、KV-11B、KV-12B、KV-21B、KV-22B、FV-11B、FY-12B、FV-21B和FV-22B分别制成菌悬液并涂布在每升培养基中添加15g琼脂粉的上述步骤5)的3号驯化培养基制成的平板上，36℃培养12小时，分别挑取在上述步骤5)的3号驯化培养基平板上生长的单菌落，接种到3号驯化培养基中。其中，KO-11B在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-111B和KO-112B，KO-12B在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-121B和KO-122B，KO-21B在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-211B和KO-212B，KO-22B在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-221B和KO 222B；KV-11B在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KY-111B和KV112B，KV-12B在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-121B和KV-122B，KV-21B在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-211B和KV-212B，KV-22B在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-221B和KV-222B；FV-11B在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-111B和FV-112B，FV-12B在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-121B和FV-122B，FV-21B在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-211B和FV-212B，FV-22B在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-221B和FV-222B。
挑取上述24个单菌落36℃、170r/m、旋转半径为11mm振荡培养12小时，即得到驯化菌。
实施例4、发酵效果对比
将克雷伯氏菌K.oxytoca M5al、K.pneumoniae AS 1.1736、K.pneumoniae ATCC25955和上述实施例1驯化得到的24株驯化菌分别接种到装有5mL上述初始发酵培养基的试管中，36℃、170r/min、旋转半径为11mm的条件下培养12小时，得到种子液。
将上述种子液按照1％(体积百分含量)的接种量接入到装有100mL上述初始发酵培养基的500mL三角瓶中，36℃、170r/m、旋转半径为11mm振荡培养12小时。发酵过程中，不同时间点取样测定发酵液的OD600nm值和1，3-丙二醇的浓度。
驯化得到的菌株KO-111B、KO-112B、KO-121B、KO-122B、KO-211B、KO-212B、KO-221B、KO-222B和未经驯化的原始菌株K.oxytoca M5al的发酵液中OD600nm值和1，3-丙二醇的浓度如表4所示，驯化得到的菌株KV-111B、KV-112B、KV-121B、KV-122B、KV-211B、KV-212B、KV-221B、KV-222B和未经驯化的原始菌株K.pneumoniaeAS1.1736的发酵液中OD600nm值和1，3-丙二醇的浓度如表5所示，驯化得到的菌株FV-111B、FV-112B、FV-121B、FV-122B、FV-211B、FV-212B、FV-221B、FV-222B和未经驯化的原始菌株K.pneumoniae ATCC 25955的发酵液中OD600nm值和1，3-丙二醇的浓度如表6所示。
表4驯化菌株和原始菌株K.oxytoca M5al的发酵结果比较
Figure G2008101195321D00101
表5驯化菌株和原始菌株K.pneumoniae AS1.1736的发酵结果比较
Figure G2008101195321D00102
Figure G2008101195321D00111
表6驯化菌株和原始菌株K.pneumoniae ATCC 25955的发酵结果比较
Figure G2008101195321D00112
从表中结果可知，经过驯化的菌株在发酵过程中的生物量和1，3-丙二醇的浓度均明显高于未经过驯化的原始菌种，表明本发明的方法能够方便快捷的得到对底物甘油和各种产物具有较高耐受性的优良菌种，且经过驯化的菌种生产1，3-丙二醇的能力大幅提高。
实施例5、菌种的驯化
初始发酵培养基的组成同实施例1。
1，3-丙二醇产生菌的驯化方法具体包括以下步骤：
1)将克雷伯氏菌K.oxytoca M5al(Ohta K，Beall DS，Mejia JP，et al.Metabolicengineering of Klebsiella oxytoca M5A1 for ethanol production from xylose and glucose.Appl Environ Microbiol 1991，157：2810-2815.)(清华大学)、K.pneumoniae AS1.1736(中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC)和K.pneumoniae ATCC 25955(美国菌种保藏中心ATCC)分别接种到上述初始发酵培养基中，38℃190r/m旋转半径为13mm的条件下振荡培养16小时，将发酵液离心去除菌体，收集上清液。上清液中加入甘油，使甘油在上清液中的终浓度为70g/L，然后115℃条件下灭菌20分钟，将得到的培养基作为1号驯化培养基；
2)将克雷伯氏菌K.oxytoca M5al、K.pneumoniae AS1.1736和K.pneumoniaeATCC 25955分别制成菌悬液并涂布在每升培养基中添加15g琼脂粉的上述步骤1)的1号驯化培养基制成的平板上，38℃条件下培养16小时，分别挑取在上述步骤1)的1号驯化培养基平板上生长的单菌落。其中，克雷伯氏菌K.oxytoca M5al在1号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-1C和KO-2C，克雷伯氏菌K.pneumoniae AS1.1736在1号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-1C和KV-2C，克雷伯氏菌K.pneumoniae ATCC 25955在1号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-1C和FV-2C。
3)挑取上述步骤2)得到的6个单菌落，分别接种在1号驯化培养基中，38℃、190r/m、旋转半径为13mm的条件下振荡培养16小时，将发酵液离心去除菌体，上清液中加入甘油，使甘油在上清液中的终浓度为100g/L，然后115℃条件下灭菌20分钟，将得到的培养基作为2号驯化培养基；
4)将克雷伯氏菌KO-1C、KO-2C、KV-1C、KV-2C、FV-1C和FV-2C分别制成菌悬液并涂布在每升培养基中添加15g琼脂粉的上述步骤3)的2号驯化培养基制成的平板上，38℃培养16小时，分别挑取在上述步骤3)的2号驯化培养基平板上生长的单菌落。其中，KO-1C在2号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-11C和KO-12C，KO-2C在2号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-21C和KO-22C，KV-1C在2号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-11C和KV-12C，KV-2C在2号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-21C和KV-22C，FV-1C在2号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-11C和FV-12C，FV-2C在2号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-21C和FV-22C。
5)挑取上述步骤4)得到的12个的单菌落，分别接种在2号驯化培养基中，38℃、190r/m、旋转半径为13mm振荡培养16小时，将发酵液离心去除菌体，上清液中加入甘油，使甘油在上清液中的终浓度为150g/L，然后115℃条件下灭菌20分钟，将得到的培养基作为3号驯化培养基；
6)将克雷伯氏菌KO-11C、KO-12C、KO-21C、KO-22C、KV-11C、KV-12C、KV-21C、KV-22C、FV-11C、FV-12C、FV-21C和FV-22C分别制成菌悬液并涂布在每升培养基中添加15g琼脂粉的上述步骤5)的3号驯化培养基制成的平板上，38℃培养16小时，分别挑取在上述步骤5)的3号驯化培养基平板上生长的单菌落，接种到3号驯化培养基中。其中，KO-11C在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-111C和KO-112C，KO-12C在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-121C和KO-122C，KO-21C在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-211C和KO-212C，KO-22C在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KO-221C和KO-222C；KV-11C在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-111C和KV-112C，KV-12C在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-121C和KV-122C，KV-21C在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-211C和KV-212C，KV-22C在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为KV-221C和KV-222C；FV-11C在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-111C和FV-112C，FV-12C在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-121C和FV-122C，FV-21C在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-211C和FV-212C，FV-22C在3号驯化培养基平板上生长的单菌落挑取2个，分别命名为FV-221C和FV-222C。
挑取上述24个单菌落38℃、190r/m、旋转半径为13mm振荡培养16小时，即得到驯化菌。
实施例6、发酵效果对比
将克雷伯氏菌K.oxytoca M5al、K.pneumoniae AS1.1736、K.pneumoniae ATCC25955和上述实施例1驯化得到的24株驯化菌分别接种到装有5mL上述初始发酵培养基的试管中，38℃、190r/min、旋转半径为13mm的条件下培养16小时，得到种子液。
将上述种子液按照1％(体积百分含量)的接种量接入到装有100mL上述初始发酵培养基的500mL三角瓶中，38℃、190r/m、旋转半径为13mm振荡培养16小时。发酵过程中，不同时间点取样测定发酵液的OD600nm值和1，3-丙二醇的浓度。
驯化得到的菌株KO-111C、KO-112C、KO-121C、KO-122C、KO-211C、KO-212C、KO-221C、KO-222C和未经驯化的原始菌株K.oxytoca M5al的发酵液中OD600nm值和1，3-丙二醇的浓度如表7所示，驯化得到的菌株KV-111C、KV-112C、KV-121C、KV-122C、KV-211C、KV-212C、KV-221C、KV-222C和未经驯化的原始菌株K.pneumoniaeAS1.1736的发酵液中OD600nm值和1，3-丙二醇的浓度如表8所示，驯化得到的菌株FV-111C、FV-112C、FV-121C、FV-122C、FV-211C、FV-212C、FV-221C、FV-222C和未经驯化的原始菌株K.pneumoniae ATCC 25955的发酵液中OD600nm值和1，3-丙二醇的浓度如表9所示。
表7驯化菌株和原始菌株K.oxytoca M5al的发酵结果比较
Figure G2008101195321D00141
表8驯化菌株和原始菌株K.pneumoniae AS1.1736的发酵结果比较
Figure G2008101195321D00142
Figure G2008101195321D00151
表9驯化菌株和原始菌株K.pneumoniae ATCC 25955的发酵结果比较
从表中结果可知，经过驯化的菌株在发酵过程中的生物量和1，3-丙二醇的浓度均明显高于未经过驯化的原始菌种，表明本发明的方法能够方便快捷的得到对底物甘油和各种产物具有较高耐受性的优良菌种，且经过驯化的菌种生产1，3-丙二醇的能力大幅提高。

Claims (7)

1.一种驯化1，3-丙二醇产生菌的方法，包括以下步骤：
1)培养1，3-丙二醇产生菌，得到发酵液；
2)将上述步骤1)的发酵液离心收集上清液，在上清液中加入甘油，得到1号驯化培养基；
3)将上述步骤1)的发酵液中的1，3-丙二醇产生菌接种于上述1号驯化培养基中，培养该1，3-丙二醇产生菌得到发酵液；
4)将上述步骤3)的发酵液离心收集上清液，在上清液中加入甘油，得到2号驯化培养基；
5)将上述步骤3)的发酵液中的1，3-丙二醇产生菌接种于上述2号驯化培养基中，培养该1，3-丙二醇产生菌得到发酵液；
6)将上述步骤5)的发酵液离心收集上清液，在上清液中加入甘油，得到3号驯化培养基；
7)将上述步骤5)的发酵液中的1，3-丙二醇产生菌接种于上述3号驯化培养基中，培养该1，3-丙二醇产生菌，得到驯化菌；
所述1，3-丙二醇产生菌为克雷伯氏菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将步骤n)的发酵液离心，分别收集上清液和菌体；在所述上清液中加入甘油，得到步骤n+1)用的培养基，将所述菌体在步骤n+1)用的培养基中培养得到1，3-丙二醇的过程；
所述n等于7。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述权利要求2的过程至少重复一次。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，所有加入甘油的步骤中，下一步骤中甘油的加入量均大于等于上一步骤中甘油的加入量。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中甘油的加入量为每升培养基50-70g；所述步骤4)中甘油的加入量为每升培养基70-100g；所述步骤6)中甘油的加入量为每升培养基120-150g。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法中，所有步骤中1，3-丙二醇产生菌的培养条件为36-38℃，170-190r/m，旋转半径为11-13mm振荡培养12-16小时。
7.一种生产1，3-丙二醇的方法，是培养按照权利要求1-4中任一所述的方法得到的驯化菌，得到1，3-丙二醇。
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