JP2001525175A - 組換え生物によるグリセロールの産生方法 - Google Patents
組換え生物によるグリセロールの産生方法Info
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Abstract
Description
成経路から誘導される化合物を産生するための組換え生物の使用に関する。より
具体的には、本発明は、グリセロールおよび炭素基質から誘導される化合物を産
生するための組換え細胞の構築について記載するもので、前記細胞は、グリセロ
ール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH)およびグリセロール−3−ホ
スファターゼ(G3Pホスファターゼ)活性を有するタンパク質をコードする外
来(foreign)遺伝子を含み、グリセロールを変換するグリセロールキナ
ーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼ活性をコードする内因性遺伝子は欠失
している。
の他の数多くの応用分野で使用される工業的に極めて重要な化合物である。グリ
セロールのエステルは、油脂工業において重要である。歴史的に見ると、グリセ
ロールは、動物脂肪および類似の原料から単離されてきたが、その方法は労力を
要し、非能率的である。グリセロールの微生物産生が好ましい。
。しかし、グリセロールの生物学的産生は、細菌、藻類、および酵母の種でいく
つか知られている。バシルス・リシェニホルミス(Bacillus lich
eniformis)およびラクトバシルス・リコペルシカ(Lactobac
illus lycopersica)といった細菌はグリセロールを合成する
。グリセロール産生は、耐塩性藻類であるダナリエラ(Dunaliella)
属およびアステロモナス・グラシリス(Asteromonas gracil
is)において、外部の高塩濃度に対する防御として見いだされる(Ben−A
motz他、Exprientia、38巻、49〜52ページ、1982年)
。同様に、種々の耐浸透圧性(osmotolerant)酵母は、防御手段と
してグリセロールを合成する。ほとんどのサッカロミセス(Saccharom
yces)株は、アルコール発酵の間にいくらかのグリセロールを産生し、浸透
圧を与えることによってこの産生を増加させることができる(Albertyn
他、Mol.Cell.Biol.、14巻、4135〜4144ページ、19
94年)。今世紀の初頭には、グリセロールは、亜硫酸塩またはアルカリなどの
ステアリング(steering)試薬を加えたサッカロミセス(Saccha
romyces)培養で商業的に製造されていた。不活性複合体の形成を介して
、ステアリング試薬は、アセトアルデヒドからエタノールへの変換を遮断または
阻害する。それによって、過剰の還元性等価体(NADH)は、グリセロールを
産生するための還元用に、ジヒドロキシアセトンリン酸エステル(DHAP)に
利用されるか、あるいはDHPAに「ステアリング」する。この方法は、亜硫酸
塩による酵母増殖の部分的阻害によって制限される。この制限は、異なる機構に
よって過剰のNADH等価体を生成するアルカリの使用により部分的に克服する
ことができる。実際、アルカリは、Cannizarro不均化反応を起こし、
2当量のアセトアルデヒドからエタノールおよび酢酸を生成する。したがって、
グリセロールの産生は、天然に存在する生物から可能であるが、培地の浸透圧ス
トレスおよび亜硫酸塩の生成を制御する必要に制約されることが多い。これらの
制限のない方法が望まれる。グリセロール生合成経路における重要なステップを
コードする外来遺伝子を含む組換え生物によるグリセロールの産生は、このよう
な方法への1つの可能な経路である。
ば、サッカロミセス・ジアスタチカス(Saccharomyces dias
taticus)からグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(DAR1、
GPD1)をコードする遺伝子がクローン化され(cloned)、配列決定さ
れた(Wang他、J.Bact.、176巻、7091〜7095ページ、1
994年)。DAR1遺伝子は、シャトルベクターにクローン化され、該遺伝子
を用いて大腸菌(E.coli)を形質転換させて発現により活性酵素を産生し
た。Wang他(同上)は、DAR1が細胞の浸透圧環境によって調節されるこ
とを明らかにしているが、遺伝子をどのように使用すれば組換え生物におけるグ
リセロール産生を促進できるかは示唆していない。
ば、S.セレビシエ(S.cerevisiae)からsn−グリセロール−3
−リン酸デヒドロゲナーゼがクローン化され、配列決定された(Larason
他、Mol.Microbiol.、10巻、1101ページ、1993年)。
Albertyn他(Mol.Cell.Biol.、14巻、4135ページ
、1994年)は、S.セレビシエ(S.cerevisiae)のグリセロー
ル−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするGPD1のクローン化について教
示している。Wang他と同様、Albertyn他およびLarason他は
いずれも、この遺伝子調節の浸透圧感受性を明らかにしているが、組換え生物に
おけるグリセロール産生にこの遺伝子をどのように使用するかは示唆していない
。
ミセス・セレビシエ(Saccharomyce cerevisiae)から
単離され、このタンパク質がGPP1およびGPP2遺伝子によってコードされ
ていることが確認された(Norbeck他、J.Biol.Chem.、27
1巻、13875ページ、1996年)。G3PDHをコードする遺伝子と同様
、GPP2は浸透圧により誘導されるようである。
当技術分野では、G3PDH/G3Pホスファターゼが一緒にあるいは別々に発
現する組換え生物からのグリセロール産生を証明する教示はない。さらに、細胞
に対してあるストレス(塩またはオスモライト(osmolyte))を加える
必要のないこれら2つの酵素活性を用いて、任意の野生型生物から効率的にグリ
セロールを産生できるという教示もない。実際、当技術分野は、G3PDH活性
がグリセロール産生に影響を与えないことを示唆している。例えば、Eusta
ce(Can.J.Microbiol.、33巻、112〜117ページ、1
987年)は、親菌株よりも多くのグリセロールを産生したハイブリダイズした
酵母を教示している。しかしながら、Eustaceは、ハイブリダイズした株
では、野生型に比べて、G3PDH活性は一定のままか、わずかに低いことも明
らかにしている。
その他の化合物も、グリセロール生合成経路から誘導することができる。例えば
、グリセロール産生生物を設計し、ポリエステル繊維の製造およびポリウレタン
および環状化合物の製造に潜在的有用性を有するモノマーである1,3−プロパ
ンジオール(米国5686276)を産生することができる。例えば、いくつか
の生物において、デヒドラターゼ酵素およびオキシドレダクターゼ酵素の作用に
より、グリセロールがそれぞれ、3−ヒドロキシプロピオンアルデヒド、次いで
1,3−プロパンジオールに変換することが知られている。1,3−プロパンジ
オールを産生することができる細菌株は、例えば、シトロバクター(Citro
bacter)、クロストリジウム(Clostridium)、エンテロバク
ター(Enterobacter)、イリオバクター(Ilyobacter)
、クレブシエラ(Klebsiella)、ラクトバシルス(Lactobac
illus)、およびペロバクター(Pelobacter)の群に見いだされ
ている。グリセロールデヒドラターゼおよびジオールデヒドラターゼ系はそれぞ
れ、Seyfried他(J.Bacteriol.、178巻、5793〜5
796ページ、1996年)およびTobimatsu他(J.Biol.Ch
em.、270巻、7142〜7148ページ、1995年)によって述べられ
ている。外因性デヒドラターゼ酵素を含む1,3−プロパンジオールを産生する
ことができる組換え生物についても述べられている(米国5686276)。こ
れらの生物は1,3−プロパンジオールを産生するが、グリセロール変換を最小
限に抑えると考えられる系から恩恵を受けることは明らかであろう。
ためのグリセロール産生生物を設計することにはいくつかの利点がある。生理学
的条件下でグリセロールを効率よく産生することができる微生物が工業的には望
ましく、特に、浸透圧ストレスによりまたはステアリング試薬の添加によって撹
乱され得るようなより複雑な異化経路または生合成経路の一部として、in v
ivoにおいて基質として、グリセロール自体を使用する場合(例えば、1,3
−プロパンジオールの産生)である。グリセロールキナーゼおよびグリセロール
デヒドロゲナーゼ変異体を作成するいくつかの試みが行われている。例えば、D
e Koning他(Appl.Microbiol Biotechnol.
、32巻、693〜698ページ、1990年)は、ジヒドロキシアセトンキナ
ーゼおよびグリセロールキナーゼが遮断されたメチロトローフ酵母ハンセヌラ・
ポリモルファ(Hansenula polymorpha)の突然変異体によ
るジヒドロキシアセトンのメタノール依存性産生を報告している。同化反応の補
助基質(co−substrate)であるキシルロース−5−リン酸を補充す
るために必要なメタノールと別の基質を用いてグリセロールを産生させているが
、ジヒドロキシアセトンレダクターゼ(グリセロールデヒドロゲナーゼ)も必要
である。同様に、ShawおよびCameron(Book of Abstr
acts、211th ACS National Meeting、New
Orleans、LA、3月、24〜28ページ、1996年、BIOT−15
4 Publisher、American Chemical Societ
y、Washington、D.C.)は、1,3−プロパンジオール産生を最
適にするために、ldhA(乳酸デヒドロゲナーゼ)、glpK(グリセロール
キナーゼ)、およびtpiA(トリオースリン酸イソメラーゼ)の欠失を検討し
ている。彼らは、グリセロールまたは1,3−プロパンジオールの産生に関して
G3PDHまたはG3Pホスファターゼに対するクローン化遺伝子の発現を示唆
しておらず、グリセロールデヒドロゲナーゼの影響についても考察していない。
トンリン酸(DHAP)からグリセロール−3−リン酸(G3P)への、次いで
グリセロールへの変換をそれぞれ触媒するG3PDHおよびG3Pホスファター
ゼ活性の付加または促進により、グリセロール産生に炭素の流れを向かわせる方
法が欠如していることである。この問題は、ある種の酵素活性、特に、グリセロ
ールおよびATPからG3Pへの変換、およびグリセロールからジヒドロキシア
セトン(またはグリセルアルデヒド)への変換をそれぞれ触媒するグリセロール
キナーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼの欠失または減少により、炭素の
流れをグリセロールからそらすように制御する必要があることからより複雑にな
る。
を(a)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を
コードする遺伝子、(b)グリセロール−3−リン酸ホスファターゼ活性を有す
るタンパク質をコードする遺伝子のいずれか1つあるいは両方を含む発現カセッ
トで形質転換することであって、(a)グリセロールキナーゼをコードする内因
性(endogenous)遺伝子、(b)グリセロールデヒドロゲナーゼをコ
ードする内因性遺伝子のいずれか一方あるいは両方の破壊(disruptio
n)を含む、この場合その破壊は活性遺伝子産物の発現を妨げる、前記宿主細胞
を形質転換することと、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、および一炭素基質からな
る群から選択される少なくとも1つの炭素源の存在下で形質転換した宿主細胞を
培養し、それによってグリセロールを産生させることと、産生するグリセロール
を回収することとを含む方法を提供する。
て、適当な宿主細胞を(a)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子、(b)グリセロール−3−リン酸ホスフ
ァターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のいずれか一方あるいは両
方を含む発現カセットで形質転換することであって、デヒドラターゼ活性を有す
るタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子を有し、さらに(a)内因性
グリセロールキナーゼをコードする遺伝子および(b)内因性グリセロールデヒ
ドロゲナーゼをコードする遺伝子のうち1つあるいは両方の破壊を有する、ここ
で(a)または(b)遺伝子における破壊は活性遺伝子産物の発現を妨げる、該
宿主細胞を形質変換することと、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、および一炭素基
質からなる群から選択される少なくとも1つの炭素源の存在下で形質転換した宿
主細胞を培養し、それによって1,3−プロパンジオールを産生させることと、
産生する1,3−プロパンジオールを回収することとを含む方法を提供する。
て、内因性遺伝子の複数コピー(multiple copies)が導入され
る方法を提供する。
宿主細胞、ならびにグリセロール経路の内因性遺伝子を含む宿主細胞が含まれる
。
な組換え細胞であって、該宿主細胞が、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ活性およびグリセロール−3−リン酸ホスファターゼ活性のいずれか一方ま
たは両方を発現する遺伝子を有し、該宿主細胞がさらに、内因性グリセロールキ
ナーゼをコードする遺伝子および内因性グリセロールデヒドロゲナーゼをコード
する遺伝子のいずれか一方または両方の破壊を有し、遺伝子中の該破壊が活性遺
伝子産物の発現を妨げる細胞を提供する。
Budapest Treaty on the International
Recognition of the Deposit of Micro
−organisms for the Purposes of Paten
t Procedure)の条項に従って以下の生物寄託を行った。
lle、MD 20852 U.S.A.に所在するアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション(American Type Culture Col
lection)国際寄託機関を指す。国際寄託機関表示は寄託材料の寄託番号
である。
entation of Nucleotide and Amino Aci
d Sequences in Patent Applications(A
nnexes IおよびII to the Decision of the
President of the EPO、Supplement No.
2からOJ EPO、12/1992)および37 C.F.R1.821〜1
.825およびAppendices AおよびB(Requirements
for Application Disclosures Contain
ing Nucleotides and/or Amino Acid Se
quences)に従って45個の配列を提供した。
法を提供することにより、前述の問題を解決する。この方法は、化粧品および医
薬産業で有用なグリセロールの迅速、安価で環境に責任のあるソースを提供する
。この方法は、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH)およ
び/またはグリセロール−3−ホスファターゼ(G3Pホスファターゼ)をコー
ドするクローン化された相同(homologous)または異種(heter
ologous)遺伝子を含む微生物を使用する。これらの遺伝子は、内因性の
グリセロールキナーゼおよび/またはグリセロールデヒドロゲナーゼ酵素をコー
ドする遺伝子に破壊を有する組換え宿主で発現する。この方法は、グリセロール
、およびグリセロールを中間体とする任意の最終産物の産生に有用である。組換
え微生物を炭素源と接触させて培養し、次いで、グリセロールおよびこれに由来
する任意の最終産物をならし培地から単離する。グリセロール産生のために、遺
伝子は別々にまたは一緒に宿主微生物に組み込むことができる。
の酵素をコードする遺伝子を単離することと、これに続いて内因性キナーゼおよ
びデヒドロゲナーゼ遺伝子中の破壊を有する宿主細胞で発現することを必要とし
た。出願人らの方法が、グリセロールを重要な中間体とする産生化合物、例えば
、1,3−プロパンジオールに一般的に適用できることは、当業者には理解され
るであろう。
用語は、ジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)からグリセロール−3−リン
酸(G3P)への変換を触媒する酵素活性をもたらすポリペプチドを指す。in
vivoでのG3PDHは、NADH、NADPH、またはFAD依存性であ
る。NADH依存性酵素(EC 1.1.1.8)は、例えば、GPD1(Ge
nBank Z74071x2)、またはGPD2(GenBank Z351
69x1)、またはGPD3(GenBank G984182)、またはDA
R1(GenBank Z74071x2)を含むいくつかの遺伝子によってコ
ードされる。NADPH依存性酵素(EC 1.1.1.94)は、gpsA(
GenBank U321643、(cds 197911〜196892)、
G466746およびL45246)によってコードされる。FAD依存性酵素
(EC 1.1.99.5)は、GUT2(GenBank Z47047x2
3)、またはglpD(GenBank G147838)、またはglpAB
C(GenBank M20938)によってコードされる。
ァターゼ」、または「d,l−グリセロールホスファターゼ」、および「G3P
ホスファターゼ」という用語は、グリセロール−3−リン酸および水からグリセ
ロールおよび無機リン酸への変換を触媒する酵素活性をもたらすポリペプチドを
指す。G3Pホスファターゼは、例えば、GPP1(GenBank Z470
47x125)、またはGPP2(GenBank U18813x11)によ
ってコードされる。
セロール−3−リン酸およびADPへの変換を触媒する酵素活性をもたらすポリ
ペプチドを指す。高エネルギーリン酸供与体であるATPは、生理学的置換体(
例えば、ホスホエノールピルビン酸)と換えてもよい。グリセロールキナーゼは
、例えば、GUT1(GenBank U11583x19)およびglpK(
GenBank L19201)によってコードされる。
キシアセトン(E.C. 1.1.1.6)への変換、またはグリセロールから
グリセルアルデヒド(E.C. 1.1.1.72)への変換を触媒する酵素活
性をもたらすポリペプチドを指す。グリセロールからジヒドロキシアセトンへの
変換を触媒する酵素活性をもたらすポリペプチドは、「ジヒドロキシアセトンレ
ダクターゼ」とも呼ばれる。グリセロールデヒドロゲナーゼは、NADH(E.
C. 1.1.1.6)、NADPH(E.C. 1.1.1.72)、または
その他の補因子(例えば、E.C. 1.1.99.22)に依存性である。N
ADH依存性グリセロールデヒドロゲナーゼは、例えば、gldA(GenBa
nk U00006)によってコードされる。
キシプロピオンアルデヒドへと異性化または変換する能力を有する任意の酵素を
指す。本発明の目的では、デヒドラターゼ酵素には、グリセロールデヒドラター
ゼ(E.C. 4.2.1.30)およびジオールデヒドラターゼ(E.C.
4.2.1.28)が含まれ、それぞれグリセロールおよび1,2−プロパンジ
オールという好ましい基質を有する。例えば、シトロバクター・フレウンディー
(Citrobacter freundii)では、グリセロールデヒドラタ
ーゼは、遺伝子配列がdhaB、dhaCおよびdhaE(GenBank U
09771、それぞれの塩基対は、8556〜10223、10235〜108
19、および10822〜11250)で表される3種類のポリペプチドによっ
てコードされる。例えば、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella
oxytoca)では、ジオールデヒドラターゼは、遺伝子配列がpddA、p
ddBおよびpddC(GenBank D45071、それぞれの塩基対は、
121〜1785、1796〜2470、および2485〜3006)で表され
る3種類のポリペプチドによってコードされる。
L022W」という用語は、互換的に使用され、サイトゾルのグリセロール−3
−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を指し、配列番号1に示す塩基配
列によって特徴づけられる。
ゲナーゼをコードする遺伝子を指し、配列番号2に示す塩基配列によって特徴づ
けられる。
トコンドリアのグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
を指し、配列番号3に示す塩基配列によって特徴づけられる。
的に使用され、サイトゾルのグリセロール−3−ホスファターゼをコードする遺
伝子を指し、配列番号4に示す塩基配列によって特徴づけられる。
的に使用され、サイトゾルのグリセロール−3−ホスファターゼをコードする遺
伝子を指し、配列番号5に示す塩基配列によって特徴づけられる。
遺伝子を指し、配列番号6に示す塩基配列によって特徴づけられる。「glpK
」という用語は、グリセロールキナーゼをコードする別の遺伝子を指し、Gen
eBank L19201、塩基対77347〜78855に示す塩基配列によ
って特徴づけられる。
子を指し、GeneBank U00006、塩基対3174〜4316に示す
塩基配列によって特徴づけられる。「dhaD」という用語は、グリセロールデ
ヒドロゲナーゼをコードする別の遺伝子を指し、GeneBank U0977
1、塩基対2557〜3654に示す塩基配列によって特徴づけられる。
行うのに必要なエネルギーを変化させる酵素の触媒活性を指す。このような活性
は、生成物および基質の双方の生成が適当な条件下で達成できるような平衡にあ
る反応に適用することができる。
を受ける能力を有する炭素源を指し、具体的には、単糖類、オリゴ糖類、多糖類
、および一炭素基質またはその混合物からなる群から選択される炭素源を意味す
る。
る生物または細胞の代謝プロセスを指す。
内因性遺伝子の追加のコピーとを受け入れる能力を有し、これらの遺伝子を発現
して活性遺伝子産物を産生する微生物を指す。
ール生合成経路から誘導される化合物を産生するために設計された細胞を指す。
産生細胞は組換え体であり、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子、グリセロール−3−リン酸ホスファター
ゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のいずれかまたは両方を含む。G
3PDHおよびG3Pホスファターゼ遺伝子の他に、宿主細胞は、内因性グリセ
ロールキナーゼをコードする遺伝子および内因性グリセロールデヒドロゲナーゼ
をコードする遺伝子のいずれかまたは両方において破壊を含むこととする。産生
細胞が1,3−プロパンジオールを産生するように設計する場合には、さらにデ
ヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むこととする。
すべて、異なる宿主生物内に置かれている、ある生物生来の遺伝子材料を指す。
用される「内因性」という用語は、産生細胞生来の遺伝子またはタンパク質であ
り、別の生物に由来するものではない遺伝子またはタンパク質を指す。したがっ
て、「内因性グリセロールキナーゼ」および「内因性グリセロールデヒドロゲナ
ーゼ」は、産生細胞生来の遺伝子によってコードされたポリペプチドを指す用語
である。
で形質転換された任意の生物を指す。本発明の組換え生物は、適当な炭素基質か
らグリセロールを産生するためにG3PDHおよびG3Pホスファターゼをコー
ドする外来遺伝子を発現する。さらに、「組換え生物」および「形質転換宿主」
という用語は、遺伝子のコピー数が増加するように、内因性(または相同)遺伝
子で形質転換された任意の生物を指す。
上流(5’非コード)および下流(3’非コード)の調節配列(regulat
ory sequence)も含まれる。「生来の(native)」および「
野生型」遺伝子という用語は、それ自身の調節配列を有する天然に見いだされる
遺伝子を指す。
転写および翻訳の機構を介して、ある遺伝子がアミノ酸配列を産生するようなプ
ロセスを指す。特定のアミノ酸配列をコードするプロセスには、コードされてい
るアミノ酸に変化を生じさせることがない塩基の変化を伴ってもよいDNA配列
、あるいは1つまたは数個のアミノ酸を変化させるがDNA配列によってコード
されているタンパク質の機能的特性に影響を与えない塩基変化を伴ってもよいD
NA配列が含まれることを意味する。したがって、本発明は、特定の模例の配列
以上の配列を含む。得られるタンパク質分子の機能的特性にほとんど影響を与え
ないサイレントな変化を生じる配列の欠失、挿入、または置換などの配列の改変
も企図されている。例えば、遺伝暗号の縮重を反映する遺伝子配列の変化、また
は所定の部位における化学的に等価なアミノ酸の生成をもたらす遺伝子配列の変
化が企図されている。したがって、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンに対
するコドンは、グリシンなどの疎水性の少ない別の残基、あるいはバリン、ロイ
シン、またはイソロイシンなどのより疎水性である残基をコードするコドンによ
って置き換えることができる。同様に、ある正に荷電の残基を別の残基に置き換
える変化、例えばアスパラギン酸からグルタミン酸に置き換える変化、あるいは
ある負に荷電の残基を別の残基に置き換える変化、例えばリジンからアルギニン
に置き換える変化も、生物学的に等価な生成物を生ずることが予想される。タン
パク質分子のN末端およびC末端部分の変化をもたらすヌクレオチド変化も、タ
ンパク質の活性を変化させないことが予想される。実際、いくつかの場合に、タ
ンパク質の生物学的活性に対する変化の影響を検討するために配列の変異体を作
製することが望ましい。コードされた産物において生物学的活性の保持が決定さ
れるように、上で述べたそれぞれの改変は当技術分野において通常の技術の範囲
内にある。さらに、当業者は、本発明に包含される配列は、ストリンジェントな
条件(0.1×SSC、0.1%SDS、65℃)下で本明細書中に例示した配
列とハイブリダイズする能力によっても定義されることを理解するであろう。
への転写および翻訳を指す。
語は、しばしば細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運び、通常環状の2本
鎖DNA分子の形をとる染色体外要素を指す。このような要素には、任意の供給
源から得られる、自律複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチ
ド配列、線状または環状の1本鎖または2本鎖DNAまたはRNAがあり、これ
らの中には、多くのヌクレオチド配列が、プロモーター断片および選択された遺
伝子産物に対するDNA配列を適当な3’非翻訳配列と共に細胞に導入すること
ができる特有の構築物に結合または再結合されている。「形質転換カセット」は
、外来遺伝子を含み、該外来遺伝子の他に特定の宿主細胞の形質転換を容易にす
るような要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子
を含み、該外来遺伝子の他に異種宿主で遺伝子の発現を促進させるような要素を
有する特定のベクターを指す。
の後に細胞中に新たな遺伝子が獲得されることを指す。獲得遺伝子は、染色体D
NAに組み込まれるか、染色体外複製配列として導入することができる。「形質
転換体」という用語は、形質転換によって得られる細胞を指す。
料を変化するプロセスを指す。遺伝子に適用される「破壊」および「遺伝子イン
ターラプト」という用語は、ある遺伝子に付加させるか、あるいはある遺伝子か
らその遺伝子の重要な部分を欠失させることにより、その遺伝子によってコード
されるタンパク質が発現されないように、あるいは活性型で発現されないように
生物を遺伝的に変化させる方法を指す。
って組換え生物においてグリセロールを産生できることが企図されている。通常
、グルコースなどの炭素基質はATPの存在下でヘキソキナーゼを介し、グルコ
ース−6−リン酸に変換される。グルコース−リン酸イソメラーゼは、グルコー
ス−6−リン酸からフルクトース−6−リン酸、次いで6−ホスホフルクトキナ
ーゼの作用によるフルクトース−1,6−ジリン酸への変換を触媒する。次いで
、この二リン酸は、アルドラーゼを介してジヒドロキシアセトンリン酸(DHA
P)となる。最後に、NADH依存性G3PDHが、DHAPをグリセロール−
3−リン酸に変換し、これがG3Pホスファターゼによって脱ホスホリル化され
てグリセロールとなる(Agarwal、Adv.Biochem.Engrg
.、41巻、114ページ、1990年)。
びグリセロールキナーゼをコードする遺伝子) 本発明は、宿主細胞におけるG3PDHおよびG3Pホスファターゼ活性の発
現に好適な遺伝子を提供する。
ミセス(Saccharomyces)から単離され、配列番号1に示す塩基配
列を有し、配列番号7に示すアミノ酸配列をコードする(Wang他、同上)。
同様に、配列番号8に示すアミノ酸配列をコードする、配列番号2に示す塩基配
列を有するGPD2によってコードされたサッカロミセス(Saccharom
yces)から、G3PDH活性が単離された(Eriksson他、Mol.
Microbiol.、17巻、95ページ、1995年)。
任意の遺伝子は、ジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)からグリセロール−
3−リン酸(G3P)への変換を触媒する能力を有する場合に適当であることが
企図されている。さらに、遺伝子GPD1、GPD2、GUT2、gpsA、g
lpD、およびglpABCのαサブユニットそれぞれに対応する配列番号7、
8、9、10、11および12に示されるG3PDHのアミノ酸配列をコードす
る任意の遺伝子が、そのアミノ酸配列が酵素の機能を変化させないアミノ酸の置
換、欠失または付加を含む場合には本発明で機能することが企図されている。当
業者は、他の供給源から単離されたG3PDHをコードする遺伝子も本発明で使
用するのに適当であることを理解するであろう。例えば、原核生物から単離され
た遺伝子には、GenBank寄託番号M34393、M20938、L062
31、U12567、L45246、L45323、L45324、L4532
5、U32164、U32689、およびU39682が含まれる。真菌から単
離された遺伝子には、GenBank寄託番号U30625、U30876およ
びX56162が含まれる。昆虫から単離された遺伝子には、GenBank寄
託番号X61223およびX14179が含まれ、哺乳動物から単離された遺伝
子には、GenBank寄託番号U12424、M25558、およびX785
93が含まれる。
はサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyce cerevisi
ae)から単離され、配列番号5に示す塩基配列を有し、配列番号13に示すア
ミノ酸配列をコードする(Norbeck他、J.Biol.Chem.、27
1巻、13875ページ、1996年)。
は、その活性がグリセロール−3−リン酸および水からグリセロールおよび無機
リン酸への変換を触媒する能力を有する場合に本発明の方法で使用するのに適当
である。さらに、遺伝子GPP2およびGPP1それぞれに対応する配列番号1
3および配列番号14に示されるG3Pホスファターゼのアミノ酸配列をコード
する任意の遺伝子が、G3Pホスファターゼの機能を変化させないアミノ酸の置
換、欠失または付加を含む任意のアミノ酸配列を含めて本発明で機能する。当業
者は、他の供給源から単離されたG3Pホスファターゼをコードする遺伝子も本
発明で使用するのに適当であることを理解するであろう。例えば、グリセロール
を得るためのグリセロール−3−リン酸の脱ホスホリル化は、次の一般的なまた
は特定のホスファターゼの1つまたは複数によって行うことができる:アルカリ
ホスファターゼ(EC 3.1.3.1)[GenBank M19159、M
29663、U02550またはM33965]、酸ホスファターゼ(EC 3
.1.3.2)[GenBank U51210、U19789、U28658
またはL20566]、グリセロール−3−ホスファターゼ(EC 3.1.3
.−)[GenBank Z38060またはU18813x11]、グルコー
ス−1−ホスファターゼ(EC 3.1.3.10)[GenBank M33
807]、グルコース−6−ホスファターゼ(EC 3.1.3.9)[Gen
Bank U00445]、フルクトース−1,6−ビスホスファターゼ(EC
3.1.3.11)[GenBank X12545またはJ03207]、
またはホスファチジルグリセロリン酸ホスファターゼ(EC 3.1.3.27
)[GenBank M23546およびM23628]。
ールキナーゼをコードするGUT1はサッカロミセス(Saccharomyc
es)から単離され、配列が決定され(Pavlik他、Curr.Genet
.、24巻、21ページ、1993年)、その塩基配列は配列番号6で示され、
配列番号15に示すアミノ酸配列をコードする。あるいは、glpKは大腸菌(
E.coli)のグリセロールキナーゼをコードし、GeneBank L19
201、塩基対77347〜78855に示す塩基配列によって特徴づけられる
。
gldAは大腸菌(E.coli)のグリセロールデヒドロゲナーゼをコードし
、GeneBank U00006、塩基対3174〜4316に示す塩基配列
によって特徴づけられる。あるいは、dhaDは、シトロバクター・フレウンデ
ィー(Citrobacter freundii)のグリセロールデヒドロゲ
ナーゼをコードする別の遺伝子を指し、GeneBank U09771、塩基
対2557〜3654に示す塩基配列によって特徴づけられる。
生に適当な宿主細胞は、原核生物でも真核生物でもよく、活性酵素を発現する能
力によってのみ限定されるべきである。好ましい宿主細胞は、グリセロール産生
に通常有用である、シトロバクター(Citrobacter)、エンテロバク
ター(Enterobacter)、クロストリジウム(Clostridiu
m)、クレブシエラ(Klebsiella)、エロバクター(Aerobac
ter)、ラクトバシルス(Lactobacillus)、アスペルギルス(
Aspergillus)、サッカロミセス(Saccharomyces)、
スヒゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ジゴサッ
カロミセス(Zygosaccharomyces)、ピヒア(Pichia)
、クリベロミセス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida
)、ハンゼヌラ(Hansenula)、デバリオミセス(Debaryomy
ces)、ムコール(Mucor)、トルロプシス(Torulopsis)、
メチロバクター(Methylobacter)、エシェリヒア(Escher
ichia)、サルモネラ(Salmonella)、バシルス(Bacill
us)、ストレプトミセス(Streptomyces)およびシュードモナス
(Pseudomonas)などの細菌、酵母、および糸状菌である。本発明で
は、大腸菌(E.coli)およびサッカロミセス(Saccharomyce
s)が好ましい。
は、宿主細胞は、デヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする内因性遺
伝子を有するか、形質転換によってこのような遺伝子を獲得しなければならない
。具体的に1,3−プロパンジオールの産生に適している宿主細胞は、シトロバ
クター(Citrobacter)、エンテロバクター(Enterobact
er)、クロストリジウム(Clostridium)、クレブシエラ(Kle
bsiella)、エロバクター(Aerobacter)、ラクトバシルス(
Lactobacillus)、およびサルモネラ(Salmonella)で
あり、これらはデヒドラターゼ酵素をコードする内因性遺伝子を有している。さ
らに、このような内因性遺伝子を欠く宿主細胞には大腸菌(E.coli)が含
まれる。
ーン化、形質転換、および発現に適する種々のベクター、形質転換カセット、お
よび発現カセットを提供する。適当なベクターは、使用する細菌に適合するもの
でなくてはならない。適当なベクターは、例えば、細菌、ウイルス(バクテリオ
ファージT7またはM−13由来のファージ)、コスミド、酵母または植物に由
来するものあってよい。このようなベクターを取得し使用するためのプロトコル
は当業者に知られている(Sambrook他、Molecular Clon
ing:A Laboratory Manual−1、2,3巻(Cold
Spring Harbor Laboratory:Cold Spring
Harbor、NY、1989年))。
、選択可能なマーカー、および自律複製または染色体組込みを可能にする配列を
含む。適当なベクターは、5’領域の転写開始制御を有する遺伝子および3’領
域の転写終結を制御するDNA断片を含む。両方の制御領域は、形質転換された
宿主細胞に対して相同な遺伝子に由来することが最も好ましい。このような制御
領域は、産生宿主として選択された特定の種に由来する遺伝子から得られる必要
はない。
およびG3Pホスファターゼ遺伝子の発現を作動するために有用であり、当業者
に数多く知られている。これらの遺伝子を作動する能力を有するほとんどすべて
のプロモーターが本発明に適しており、これらには、CYC1、HIS3、GA
L1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TR
P1、URA3、LEU2、ENO、およびTPI(サッカロミセス(Sacc
haromyces)における発現に有用)、AOX1(ピヒア(Pichia
)における発現に有用)、およびlac、trp、λPL、λPR、tac、およ
びtrc(大腸菌(E.coli)における発現に有用)が含まれるが、これら
に限定されるものではない。
意選択で、終結部位は不必要なこともあるが、含まれていれば最も好ましい。
メッセンジャーRNAの生成をもたらすように、選択された発現制御領域に、開
始コドンによる動作可能的に、結合される。
びG3Pホスファターゼの発現) 適当なカセットを構築したら、それらを用いて適当な宿主細胞を形質転換させ
る。G3PDHおよび/またはG3Pホスファターゼをコードする遺伝子を含む
カセットの宿主細胞への導入は、例えば、カルシウム透過化処理細胞または電気
穿孔法などを用いた形質転換、または組換ファージウイルスを用いたトランスフ
ェクションなどにより、知られている手順で行うことができる(Sambroo
k他、同上)。
よび実施例で十分に説明するが、大腸菌(E.coli)DH5αおよびFM5
を形質転換させる。
む適当な宿主細胞は、関連遺伝子がグリセロール産生のためにアップレギュレー
トされるように操作することができることが企図されている。
る。例えば、所望の遺伝子をアップレギュレートするために、構造遺伝子を通常
、受容体微生物によって認識されるDNA上のプロモーター領域の下流に置く。
プロモーターの他に、異種遺伝子からの発現を増加または制御する他の制御配列
を含めることができる。さらに、同じ目的で任意の知られた遺伝的操作によって
内因性遺伝子の制御配列を変化させることができる。微生物が、所望の代謝経路
を完結するために必要な遺伝子を協調的に発現するように、インデューサーまた
はリプレッサーによって発現を制御することができる。
ドする内因性遺伝子を含む宿主細胞を、調節プロモーター(例えば、lacまた
はosmy)または構成(constitutive)プロモーターの制御下に
置くことができるであろう。例えば、ターゲティングを可能にするのに十分な長
さでありかつ生来の遺伝子に相同であるDNAの側面に位置する特異的な誘導プ
ロモーターまたは構成プロモーターを含むカセットを構築することができる。適
当な生育条件下でのカセットの導入は、カセットと遺伝子の標的部分との間の相
同性組換えと、関連のある生来のプロモーターから調節可能なプロモーターへの
置換をもたらす。このような方法を使用し、グリセロール産生のためのG3PD
Hおよび/またはG3Pホスファターゼ活性をコードする内因性遺伝子のアップ
レギュレーションを行うことができる。
れている。グリセロールは、ATP依存性グリセロールキナーゼによってグリセ
ロール−3−リン酸(G3P)に変換される。次いで、G3Pは、G3PDHに
よってDHAPに酸化される。第2の経路では、グリセロールは、グリセロール
デヒドロゲナーゼによってジヒドロキシアセトン(DHA)に酸化され、次いで
、DHAは、ATP依存性DHAキナーゼによってDHAPに変換される。第3
の経路では、グリセロールは、グリセロールデヒドロゲナーゼによってグリセル
アルデヒドに酸化され、グリセルアルデヒドは、ATP依存性キナーゼによって
グリセルアルデヒド−3−リン酸にホスホリル化される。DHAPおよびグリセ
ルアルデヒド−3−リン酸は、トリオースリン酸イソメラーゼの作用によって互
いに変換し、中心代謝経路を経由してさらに代謝される。副生成物がはいりこむ
ことから、これらの経路は、グリセロール産生に対しては有害である。
ナーゼのグルセロール変換活性を欠失させた、グリセロール産生のための産生生
物を提供する能力である。欠失突然変異体を作成する方法は一般的なもので、当
技術分野で良く知られている。例えば、野生型細胞を放射線または変異誘発化学
物質などの種々の試剤に暴露し、次いで所望の表現型を選別することができる。
放射線によって変異を起こすときには、紫外(UV)またはイオン化放射を使用
することができる。遺伝子突然変異に好適な短波UV波長は、200nmから3
00nmの範囲内にあるが、254nmが好ましい。この波長のUV放射はグア
ニジンおよびシトシンからアデニンおよびチミジンまでの核酸配列内の変化を主
に引き起こす。全ての細胞が、大部分のUV誘発突然変異を修復すると考えられ
るDNA修復機構を有しているので、カフェインなどの試剤および他の阻害剤を
加え、修復プロセスを妨害し、有効な突然変異数を最大限にすることができる。
300nmから400nmの範囲の光を使用する長波UV突然変異もまた可能で
あるが、DNAと相互作用するソラレン染料などの種々の活性化物質を併せて使
用しない限り、短波UV光ほど有効ではない。
通常使用される物質には、HNO2およびNH2OHなどの非複製DNAに影響を
与える薬品、ならびにアクリジン染料などの複製DNAに影響を与えフレームシ
フト突然変異を引き起こすことが顕著である薬品が含まれる。放射線または化学
薬品を使用して突然変異体を作成する具体的方法は、当技術分野において十分に
調べられている。例えば、Thomas D.Brock、「Biotechn
ology」:A Textbook of Industrial Micr
obiology、第2版、1989年、Sinauer Associate
s、Inc.、Sunderland、MA.、またはDeshpande、M
ukund V.、Appl.Biochem.Biotechnol.、36
巻、227ページ、1992年を参照されたい。これらの内容を参照により本明
細書に取り入れる。
って選択することができる。ランダムスクリーニングが最も一般的で、変異誘発
された細胞を所望の生成物または中間体を産生する能力によって選択する。ある
いは、突然変異体の選択的単離は、耐性コロニーのみが成長できるような選択培
地で、変異誘発された一団を増殖させることにより行うことができる。変異体の
選択方法は極めて発展しており、工業微生物学の技術分野では良く知られている
。Brock、同上、DeMancilha他、Food Chem.、14巻
、313ページ、1984年を参照されたい。
知られている。例えば、De BruijnおよびRossbach、「Met
hods for General and Molecular Bacte
riology」(1994年)、American Society for
Microbiology、Washington、D.C.を参照されたい
。あるいは、遺伝子配列が知られているという条件で、特定の欠失または置換に
よる染色体遺伝子破壊が、適当なプラスミドによる相同組換えによって行われて
いる。例えば、Hamilton他、J.Bacteriol.、171巻、4
617〜4622ページ、1989年、Balbas他、Gene、136巻、
211〜213ページ、1993年、Gueldener他、Nucleic
Acids Res.、24巻、2519〜2524ページ、1996年、およ
びSmith他、Methods Mol.Cell.Biol.、5巻、27
0〜277ページ、1996年を参照されたい。
ゲナーゼ活性の欠失または不活性化のために、前述の任意の方法を使用すること
が企図されている。
質には、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、ラクトースまたはスクロ
ースなどのオリゴ糖類、デンプンなどの多糖類、セルロース、またはその混合物
、およびチーズホエー浸透液(cheese whey permeate)、
コーンスティープ(cornsteep)液、甜菜糖液、および大麦麦芽などの
再生可能な原料の未精製混合物が含まれるが、これらに限定されるものではない
。さらに、炭素基質は、二酸化炭素、メタノールなどの、重要な生化学的中間体
への代謝変換が証明されている一炭素基質であってもよい。
のグリセロール産生はメチロトローフの酵母(Yamada他、Agric.B
iol.Chem.、53巻(2号)、541〜543ページ、1989年)お
よび細菌(Hunter他、Biochemistry、24巻、4148〜4
155ページ、1985年)で報告されている。これらの生物は、メタンからホ
ルメートまでの酸化状態にわたって一炭素化合物を同化(assimilati
on)し、グリセロールを産生することができる。炭素同化の経路は、リブロー
スモノリン酸、セリン、またはキシルロース−モノリン酸を介する(Gotts
chalk、「Bacterial Metabolism」、第2版、Spr
inger−Verlag、New York、1986年)。リブロースモノ
リン酸経路は、ホルメートとリブロース−5−リン酸の縮合で6炭糖を形成し、
これがフルクトースとなり最終的に3炭素生成物であるグリセルアルデヒド−3
−リン酸になるものである。同様に、セリン経路は、メチレンテトラヒドロ葉酸
を経由して一炭素化合物を解糖系に同化する。
グルコサミンおよび代謝活性な種々のアミノ酸など、他のいくつかの炭素含有化
合物を利用することも知られている。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルア
ミンの炭素を利用し、トレハロースまたはグリセロールを作ることが知られてい
る(Bellion他(1993年)、Microb.Growth C1 C
ompd.、[Int.Symp.]、第7回、415〜32ページ、著者、M
urrell、J.Collin、Kelly、Don P.出版社、Inte
rcept、Andover、UK)。同様に、種々のカンジダ(Candid
a)種は、アラニンまたはオレイン酸を代謝する(Sulter他、Arch.
Microbiol.、153巻(5号)、485〜9ページ、1990年)。
したがって、本発明で利用する炭素源は、多種の炭素含有基質を包含し、生物の
選択によってのみ限定されるものである。
炭素基質は、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、一炭素基質またはその混合物である
。グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトースなどの糖類
、およびメタノールや二酸化炭素などの一炭素基質がより好ましい。炭素基質と
しては、グルコースが最も好ましい。
要な酵素経路の促進に適した、当業者に知られている適当な無機化合物、塩、補
助因子、緩衝液および他の成分を含まなければならない。
uria Bertani(LB)broth、Sabouraud Dext
rose(SD)broth、Yeast medium(YM)brothな
ど、一般に市販向けに調製された培地である。他の規定の増殖培地または合成増
殖培地を使用してもよいし、特定の微生物が増殖するのに適切な培地が、微生物
学または発酵学の分野の技術者に知られている。異化代謝産物の抑制を直接的ま
たは間接的に調節することが知られている、例えばサイクリックアデノシン3’
,5’−一リン酸などの試薬の使用を、反応培地に取り入れてもよい。同様に、
グリセロールの生成を増大させるように作用する酵素活性を、調節することが知
られている試薬(例えば亜硫酸塩、亜硫酸水素塩およびアルカリ)の使用を、遺
伝子操作と一緒に、または遺伝子操作の代わりに利用してもよい。
.0からpH8.0の範囲が初期条件には好ましい。
気性条件が好ましい。
びグリセロールキナーゼ活性の同定) タンパク質G3PDH、G3Pホスファターゼグリセロールデヒドロゲナーゼ
、およびグリセロールキナーゼの発現レベルは、酵素検定で測定する。一般に、
G3PDH活性およびグリセロールデヒドロゲナーゼ活性の検定は、DHAPが
G−3−Pに、DHAがグリセロールにそれぞれ変換するときの、補助基質NA
DHが分光学的性質に基づく。NADHは固有のUV/vis吸収を有し、その
消費量を分光光度的に340nmにてモニターすることができる。G3Pホスフ
ァターゼの活性は、反応中の遊離する無機リン酸塩を測定するいかなる方法でも
測定することができる。最も一般的に使用される検出法は、青色のリンモリブデ
ン酸アンモニウム錯体の可視分光測定を利用する。グリセロールキナーゼの活性
は、グリセロールおよびATPからのG3Pの検出を、例えばNMRによって、
測定することができる。検定は、必要ならば、例えば代替の補因子を使用するこ
とによって、個々の酵素のより特定の特徴に照準を合わせることができる。
定および回収) グリセロールおよび他の生成物(例えば1,3−プロパンジオール)は、セル
フリーの抽出物を、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)、およびガスクロマ
トグラフィ/質量分析(GC/MS)によって、同定および定量化してもよい。
好ましいのはHPLC法であり、ここで発酵培地は、移動相に0.01Nの硫酸
を使用してイソクラティク溶離して分析用のイオン交換カラム上で解析する。
えば、グリセロールは細胞培地から、反応混合物を以下の一連の手順に供するこ
とによって得ることができ、これらは濾過;水分の除去;有機溶媒の抽出;およ
び分留(米国特許第2,986,495号)である。
る方法を述べる。本発明に特に適するのは、グリセロール三リン酸デヒドロゲナ
ーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、グリセロール三リン酸活性
を有するタンパク質をコードする遺伝子の一方または両方を有する発現カセット
で形質転換された細菌の宿主細胞である。G3PDHおよびG3Pホスファター
ゼ遺伝子に加えて、宿主細胞は、内因性のグリセロールキナーゼおよびグリセロ
ールデヒドロゲナーゼ酵素をコードしている遺伝子のどちらか一方または両方に
破壊を含んでいる。外来G3PDHおよびG3Pホスファターゼ遺伝子(炭素源
からグリセロールへの経路を提供する)を、遺伝子破壊(グリセロールの転換を
阻害する)と一緒にする結果、効率的で確実なグリセロールを産生することがで
きる微生物を生じる。
んでいるが、このような破壊を欠いた状態で、外来G3PDHおよびG3Pホス
ファターゼ遺伝子のどちらか一方または両方を含有する宿主細胞によって、グリ
セロールの生産は可能である。例えば、DAR1遺伝子を有する組換え大腸菌株
AA200(実施例1)は、発酵パラメーターに依存して、0.38g/Lから
0.48g/Lのグリセロールを生産することができた。同様に、GPP2遺伝
子を有し、発現することができる大腸菌DH5α(実施例2)は、0.2g/L
のグリセロールを生産することができた。両方の遺伝子が存在する場合(実施例
3および4)では、グリセロールの生産は約40g/Lに達した。両遺伝子が、
内因性グリセロールキナーゼ活性を除去して存在する場合は、グリセロールの変
換に減少が見られた(実施例8)。さらに、グリセロールデヒドロゲナーゼの存
在は、グルコースが限定された条件下で、グリセロールの変換と関連しており、
したがってグリセロールデヒドロゲナーゼ活性を除去すると、グリセロールの変
換が減少することとなる(実施例8)。
し、内因性のグリセロールキナーゼおよび/またはグリセロールデヒドロゲナー
ゼの活性中に破壊を含有する組換え微生物を利用することによって、1,3−プ
ロパンジオールを生成するのに適応させることもできる。あるいは、本発明は、
内因性遺伝子の複数コピーが導入された組換え微生物から、1,3−プロパンジ
オールを生成する工程を提供する。こうした遺伝子改変に加え、生成細胞には、
活性のあるデヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子の存在が必要である。デヒド
ラターゼの酵素活性は、グリセロールデヒドラターゼまたはジオールデヒドラタ
ーゼである。デヒドラターゼの酵素活性は、内因性遺伝子の発現、または宿主微
生物にトランスフェクトした外来遺伝子の発現に起因するであろう。適切なデヒ
ドラターゼ酵素をコードする遺伝子の単離および発現は、当技術分野において十
分に知られており、本出願人によって1996年11月5日に出願されたPCT
/US96/06705、およびU.S.5686276、U.S.56333
62によって教示され、この内容を参照によって本明細書中に取り入れる。グリ
セロールは1,3−プロパンジオールを生成するのに重要な中間体であるので、
宿主細胞が、発現される外来G3PDHおよび/またはG3Pホスファターゼ遺
伝子と共にデヒドラターゼ活性を有し、さらにグリセロール変換グリセロールキ
ナーゼまたはグリセロールデヒドロゲナーゼ活性を欠いている場合、その細胞は
特に1,3−プロパンジオールの生成に好都合なことが分かるであろう。
しい実施形態を示しているが、例示したものにすぎないことを理解されたい。上
述およびこれらの実施例から、当分野の技術者は、本発明の基本的な特徴を把握
することができ、その意図および範囲から逸脱せずに、本発明の種々の変更およ
び修正を行い、さまざまな用法および条件に適応させることができる。
で十分に知られている。以下の実施例の使用に適している技法は、Sambro
okらのMolecular Cloning:A Laboratory M
anual、第2版、Cold Spring Harbor Laborat
ory Press(1989)に見出すことができるであろう。
知られている。以下の実施例での使用に適している技法は、Manual of
Methods for General Bacteriology(Ph
illipp Gerhardt、R.G.E.Murray、Ralph N
.Costilow、Eugene W.Nester、Willis A.W
ood、Noel R.KriegおよびG.Briggs Phillps、
eds)、American Society for Microbiolo
gy、Washington、DC(1994)または、Biotechnol
ogy:A Textbook of Industrial Microbi
ology(Thomas D.Brock、Second Edition(
1989)Sinauer Associates、Inc.、Sunderl
and、MA)に見ることができるであろう。細菌細胞の増殖および維持に使用
する、すべての試薬および材料は、特に指定の無い限り、Aldrich Ch
emicals(Milwaukee、WI)、DIFCO Laborato
ries(Detroit、MI)、GIBCO/BRL(Gaithersb
urg、MD)、またはSigma Chemical Company(St
.Louis、MO)から入手した。
分(複数分)、「sec」は秒(複数秒)、「d」は日(複数日)、「mL」は
ミリリットル(複数ミリリットル)、「L」はリットル(複数リットル)を意味
する。
び発現に使用した。株は大腸菌(E.coli) Genetic Stock
Center、ATCC、またはLife Technologies(Ga
ithersburg、MD)より入手した。
reLA1 pit−10 spoTI tpi−1 phoM510 mc
rB1)(Andersonら、(1970)、J.Gen.Microbio
l.、62:329) BB20(tonA22 ΔphoA8 fadL701 relA1 gl
pR2 glpD3 pit−10 gpsA20 spoTI T2R)(C
ronanら、J.Bact.、118:598) DH5α(deoR endA1 gyrA96 hsdR17 recA1
reIA1 supE44 thi−I Δ(lacZYA−argFV16
9)phi80lacZΔM15F-)(Woodcockら、(1989)、 Nucl.Acids Res.、17:3469) FM5大腸菌(ATCC53911)
モニターした。解析は、クロマトグラフィの分野の技術に利用可能な、標準的な
技法および材料を使って行った。適切な方法の1つは、UV(210nm)およ
びRI検出を使用する、Waters Maxima 820 HPLCシステ
ムを利用した。試料は、Shodex SH−1011Pプレカラム(6mm×
50mm)を装備する、Shodex SH−1011カラム(8mm×300
mm、Waters、Milford、MA)に注入し、50℃に温度調節を行
い、移動相として0.01N H2SO4を0.69mL/分の流速にて使用した
。定量分析が要求された時は、外標準物質として、既知量のトリメチル酢酸と共
に試料を調製した。通常、1,3−プロパンジオール(RI検出)、グリセロー
ル(RI検出)およびグルコース(RI検出)の保持時間は、それぞれ21.3
9分、17.03分および12.66分であった。
よび定量のためのガスクロマトグラフィ/質量分析による検出は、DB−WAX
カラム(30m、0.32mmI.D.、0.25umのフィルム厚、J&W
Scientific、Folsom、CA)を使用して、以下の条件で行った
:インジェクター:単離、1:15;試料容積:1μL;温度分布:初期温度1
50℃を30秒保持、40℃/分から180℃、20℃/分から240℃を2.
5分保持。検出:EIマススペクトロメトリー(Hewlett Pckard
5971、San Fernando、CA)、定量的SIM、グリセロール
およびグリセロール−d8の標的イオンとして、イオン61m/zおよび64m
/zを、グリセロールのクォリファイア(qualifier)イオンとしてイ
オン43m/zを使用。グリセロール−d8を、内標準物質として使用した。
H6.5中で、抽出物を有機リン酸塩の基質と共にインキュベートして行った。
使用した基質は、l−α−グリセロールリン酸、またはd,l−α−グリセロー
ルリン酸であった。検定に使用する試薬の最終濃度は:緩衝液(20mMのビス
−トリスまたは50mMのMES);MgCl2(10mM);および基質(2 0mM)である。試料中の総タンパク質が少なく、酸によるクエンチングで可視
の沈殿が起こらない場合、試料はキュベット中で都合よく検定された。この方法
は、20mMの基質(50μL、200mM)、50mMのMES、10mMの
MgCl2、pH6.5の緩衝液を含有するキュベット中で、酵素試料をインキ ュベートすることを含んでいた。最終的なホスファターゼ検定体積は0.5mL
であった。酵素を含んだ試料を反応混合物に加え、キュベットの内容物を混合し
、次にキュベットを、還流している水浴中に温度37℃で5〜120分間置いた
が、この時間の長さは、酵素試料中のホスファターゼ活性が、2〜0.02U/
mLの範囲にあるかどうかに左右された。酵素反応は、酸性のモリブデン酸塩試
薬(0.4mL)を添加することによって停止させた。Fiske Subba
Row試薬(0.1mL)および蒸留水(1.5mL)を加えた後、溶液を混合
し顕色させた。十分に発色させるため、10分後に、Cary219UV/Vi
s分光光度計を使用して試料の吸光度を660nmで読み取った。放出された無
機リン酸塩の量を、標準曲線と比較したが、この標準曲線は無機リン酸のストッ
ク溶液(0.65mM)を使用し、0.026〜0.130μmol/mLの範
囲内に最終無機リン酸濃度を持つ、6本の標準品を調製して作成した。
法による検定) 以下の手順は、Bellら(1975)、J.Biol.Chem.、250
:7153〜8によって掲載された方法から、次に示すように変更したものとし
て使用された。この方法は、0.2mMのNADH;2.0mMのジヒドロキシ
アセトンリン酸(DHAP)、および5mMのDTTを添加した0.1Mのトリ
ス/HCl、pH7.5緩衝液中の酵素を含んだキュベット中の酵素試料を、総
容積1.0mLで30℃でインキュベートすることを含むものとした。340n
mの定波長にて吸光度の変化をモニターするために、分光光度計を設定した。機
器は、緩衝液のみを含有するキュベットでブランクにした。酵素をキュベットに
添加後、吸光度を読んだ。第一の基質NADH(50μL 4mMのNADH;
吸光度は約1.25AU増加する)を、バックグラウンドレートを測定する為に
加えた。バックグラウンドレートは、少なくとも3分間追跡すべきである。第二
の基質DHAP(50μL 40mMのDHAP)を次に加え、時間経過ととも
に吸光度の変化を少なくとも3分間モニターし、グロスレートを測定した。G3
PDHの活性は、グロスレートからバックグラウンドレートを引いて特定した。
MgSO4、一律に13Cで標識した21mMのグリセロール(99%、Camb ridge Isotope Laboratories)、および0.1Mの
トリス−HCl、pH9を含有する反応混合物に、25℃で75分間加えた。グ
リセロールのグリセロール三リン酸への変換は、13C−NMR(125MHz)
で検出した:グリセロール(63.11ppm、d、J=41Hzおよび72.
66ppm、t、J=41Hz);グリセロール三リン酸(62.93ppm、
d、J=41Hz;65.31ppm、br d、J=43Hz;および72.
66ppm、dt、J=6、41Hz)
活性は、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、タンパク質を単離後
に測定した。グリセロールおよびNAD+からジヒドロキシアセトンおよびNA DHへの変換は、フェナジンメトスルフェイト(PMS)を媒介物として使用し
て、3−[4,5−ジメチルチアゾール−2−イル]−2,5−ジフェニルテト
ラゾリウムブロマイド(MTT)から濃く着色したホルマザンへの変換とカップ
リングした(Tangら.(1997)J.Bacteriol.140:18
2)。
帯のゲル、Novex、San Diego、CA)を使用して2回行った。残
留のグリセロールは、50mMのトリスまたは炭酸カリウム緩衝液、pH9で3
回、10分間洗浄して、ゲルから除去した。2枚のゲルを、グリセロールの入っ
た、または入っていない(約0.16Mの最終濃度)、50mMのトリスまたは
炭酸カリウム、pH9、60mgの硫酸アンモニウム、75mgのNAD+、1 .5mgのMTTおよび0.5mgのPMSを含有する検定溶液15mL中で展
開した。
ゼ活性の有無もまた、ポリアクリルアミドゲル電気泳動後に、精製したK.ニュ
ーモニエ(K.pheumoniae)グリセロールデヒドロゲナーゼ(dha
D)に対するポリクロナール抗体と反応させることにより測定した。
めの、グリセロース三リン酸のクローニングおよび発現) サッカロミセス・セレビシエ(Saccharonyce cerevisi
ae)第5染色体ラムダクローン6592(Gene Bank、寄託番号U1
8813x11)は、ATCCから入手した。グリセロール三リン酸ホスファタ
ーゼ(GPP2)遺伝子は、5’末端にBamHI−RBS−XbaI部位を、
3’末端にSmaI部位を取り込んだ合成プライマー(配列番号16および配列
番号17)を使用して、標的DNAとしてラムダクローンからクローニングによ
ってクローン化した。生成物を、pCR−Script(Stratagene
、Madison、WI)のSrfI部位に入れ、サブクローン化し、GPP2
を含有するプラスミドpAH15を生成した。プラスミドpAH15は、GPP
2遺伝子を、pCR−Script SK+中のlacプロモーターからの発現
に対して、不活性な向き(orientation)で含有する。GPP2遺伝
子を含有するpAH15由来のBamHI−SmaI断片を、pBlueScr
iptII SK+に挿入し、プラスミドpAH19を生成した。pAH19は
、GPP2遺伝子を、lacプロモーターからの発現に対して、正しい方向で含
有する。GPP2遺伝子を含有するpAH19由来のXbaI−PstI断片を
、pPHOX2に挿入してプラスミドpAH21を生成した。pAH21/DH
5αは、発現プラスミドである。
、合成プライマー(配列番号18および配列番号19)を使用して、PCRクロ
ーニングによって単離した。成功したPCRクローニングは、DAR1の5’末
端にNcoI部位を配列するが、ここでNcoI中のATGは、DAR1のイニ
シエーターのメチオニンである。DAR1の3’末端に、翻訳ターミネーターに
続いて、BamHI部位を挿入する。PCR断片は、NcoI+BamHIで消
化し、発現プラスミドpTrc99A(Pharmacia、Piscataw
ay、NJ)中の同一部位にクローン化し、pDAR1Aを生成した。
成プライマー(配列番号20および配列番号21)をアニーリングして得たSp
eI−RBS−NcoIリンカーを、pDAR1AのNcoI部位に挿入してp
AH40を生成した。プラスミドpAH40は、新しいRBSおよびDAR1遺
伝子を、pTrc99A(Pharmacia、Piscataway、NJ)
のtrcプロモーターからの発現に対して、正しい方向で含有する。pDAR1
からのNcoI−BamHI断片、および合成プライマー(配列番号22および
配列番号23)をアニーリングして得たSpeI−RBS−NcoIリンカーの
別の一組を、pBC−SK+(Stratagene、Madison、WI)
のSpeI−BamHI部位に挿入して、プラスミドpAH42を生成した。プ
ラスミドpAH42は、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含有する。
GPP2サブクローンから、標準的な分子生物学の方法を使って構築した。リボ
ソーム結合部位(RBS)、およびGPP2遺伝子を含有するpAH19由来の
BamHI−PstI断片を、pAH40に挿入してpAH43を生成した。R
BSおよびGPP2遺伝子を含有する、pAH19由来のBamHI−PstI
断片を、pAH42に挿入してpAH45を生成した。
ライマーGATCCAGGAAACAGA(配列番号24)およびCTAGTC
TGTTTCCTG(配列番号25)を、GPP2遺伝子を含有するpAH19
由来のXbaI−PstI断片とアニーリングして得た、BamHI−RBS−
SpeIリンカーを、pAH40のBamHI−PstI部位に挿入してpAH
48を生成した。プラスミドpAH48は、DAR1遺伝子、変更されたRBS
、およびGPP2遺伝子を、pTrc99A(Pharmacia、Pisca
taway、NJ)のtrcプロモーターからの発現に対して、正しい方向で含
有する。
菌DH5αまたはFM5中に形質転換した。形質転換細胞は、DNA RFLP
のパターンによって検証した。
セロールの生成に、合成培地を使用した。培地は、1リットル当たり6.0gの
Na2HPO4、3.0gのKH2PO4、1.0gのNH4Cl、0.5gのNa Cl、1mLの20%MgSO4・7H2O、8.0gのグルコース、40mgの
カザミノ酸、0.5mlの1%塩酸チアミン、100mgのアンピシリンを含有
した。
で250mLフラスコ中で、250rpmで振盪しながら、50mLの培地中で
好気性条件下で増殖させた。吸光度600で、0.2〜0.3のイソプロピルチ
オ−β−ガラクトシドを1mMの最終濃度まで加え、インキュベーションを48
時間継続した。嫌気性の増殖については、、誘導細胞の試料を用いてFalco
n#2057管を充填し、これにキャップをし、37℃で48時間回転させて穏
やかに混合した。グリセロールの生成は、培養上清をHPLCで解析して測定し
た。pDAR1A/AA200株は、嫌気性条件下で48時間後に、0.38g
/Lのグリセロールを、好気性条件下で0.48g/Lを生成した。
、グリセロールの生成) (培地) 大腸菌中のGPP2発現によって、グリセロールが増加することを実証するた
めに、合成phoAを振盪フラスコに入れ使用した。phoA培地は、1リット
ル当たり以下を含有した:Amisoy12g、硫酸アンモニウム0.62g;
MOPS10.5g;クエン酸Na1.2g;NaOH(1M)、10mL;1
M MgSO4 12mL;100X微量元素12mL;50%グルコース10 mL;1%チアミン10mL;100mg/mL L−プロリン10mL;2.
5mM FeCl3、5mL;混合リン酸緩衝液2mL(0.2M NaH2PO 4 5mL+0.2M K2HPO4 9mL)pH7.0。1L当たりのpho A培地中、100倍希釈の微量元素は以下を含有した:ZnSO4・7H2O、0
.58g;MnSO4・H2O、0.34g;CuSO4・5H2O、0.49g;
CoCl2・6H2O、0.47g;H3BO3、0.12g、NaMoO4・2H2 O、0.48g。
H5α株(対照)を、37℃で250mLの振盪フラスコに入れた45mLの培
地中(phoA培地、50μg/mLのカルベニシリンおよび1μg/mLのビ
タミンB12)で増殖させた。培養物は好気性条件下で(250rpmの振盪)2
4時間増殖させた。グリセロールの生成は、培養上清をHPLC解析して測定し
た。pAH21/DH5αは、24時間後、0.2g/Lのグリセロールを生成
した。
グルコースからのグリセロールの生成) pAH43を含有する大腸菌DH5αによって、グリセロールの生成が増加す
ることを実証するための増殖は、振盪フラスコ培地中(erlenmeyerフ
ラスコ、全容の1/5の液体容積)で37℃で好気的に続ける。
る選別を備えるLB/1%グルコースを一晩培養したものを、接種することによ
って開始する。最小培地は、濾過−滅菌された合成培地、最終pH6.8(HC
l)であり、1リットル当たり以下のものを含有していた:12.6gの(NH 4 )2SO4、13.7gのK2HPO4、0.2gの酵母抽出物(Difco)、 1gのNaHCO3、5mgのビタミンB12、5mLのBalchの微量元素溶 液(この組成は、Methods for General and Mole
cular Bacteriology(P.Gerhardtら、eds、p
158、American Society for Microbiolog
y、Washington、DC(1994)の中で見ることができる)。振盪
フラスコを37℃で一晩激しく振盪しながらインキュベートし、次に、その上清
をGC解析の試料に供する。pAH43/DH5αは、24時間後、3.8g/
Lのグリセロールを生成した。
グルコースからのグリセロールの生成) 実施例4は、GPP2およびDAR1遺伝子の両方を含有する、組換え大腸菌
DH5α/pAH48からのグルコースの生成を例示する。
の成分およびプロトコールを以下に示す。
を、2LのErlenmcyerフラスコに入れた600mLの培地に接種して
得た接種培地から開始した。培養物は、30℃で250rpmの振盪機中で、約
12時間増殖させ、次にこれを使って発酵槽に播いた。
したストック溶液から無菌的に加えた。グルコースは、60%供給から最終濃度
10g/Lまで加えた。カルベニシリンは、100mg/L加えた。接種後の容
積は6Lであった。
圧は0.5バールに調節した。攪拌機は350rpmに設定した。アンモニア水
は、pHを6.7に調整するために使用した。グルコースの供給(60%グルコ
ース一水和物)速度は、過剰のグルコースを維持するように調節した。
ルキナーゼ変異体の設計) (大腸菌FM5中でグリセロールキナーゼ遺伝子を置換するための組込みプ
ラスミドの構築) 大腸菌FM5のゲノムDNAは、Puregene DNA Isolati
on Kit(Gentra Systems、Minneapolis MN
)を使って調製した。部分的なglpFおよびグリセロールキナーゼ(glpK
)遺伝子を含有する、1.0kbのDNA断片を、PCR(Mullis an
d Faloona、Methods Enzymol.、155:335〜3
50、1987)によって、FM5ゲノムDNAから、プライマー配列番号26
および配列番号27を使って増幅した。部分的なglpKおよびglpX遺伝子
を含有する1.1kbのDNA断片は、PCRによって、FM5ゲノムDNAか
ら、プライマー配列番号28および配列番号29を使って増幅した。MunI部
位をプライマー配列番号28に挿入した。プライマー配列番号28の5’末端は
、次の重複伸長(overlap extension)PCRを可能にするた
めのプライマー配列番号27のリバース・コムプレメントである。重複伸長の技
法(Hortonら、BioTechniques、8:528〜535、19
90)による遺伝子のスプライシングを用いて、鋳型としての上記2つのPCR
断片、およびプライマー配列番号26と配列番号29を使って、PCRにより2
.1kbの断片を生成した。この断片は、1.5kbのglpK遺伝子の中心領
域から0.8kbが欠損していることを示した。全体として、この断片は、Mu
nIクローニング部位(部分的なglpK内)の両側に1.0kbおよび1.1
kbのフランキング領域を有しており、相同組換えによる染色体の遺伝子置換を
可能とした。
ーゼを使用して)、Zero Blunt PCR Cloning Kit(
Invitrogen、San Diego、CA)を使用して、pCR−Bl
untベクターにクローン化し、カナマイシンおよびZeocin耐性遺伝子を
含有する5.6kbのプラスミドpRN100を生成した。pLoxCat1(
未公開産物)に由来し、バクテリオファージP1 loxP部位(Snaith
ら、Gene、166:173〜174、1995)に隣接するクロラムフェニ
コール耐性遺伝子を含有する、1.2kbHincII断片を用いて、プラスミ
ドpRN100中のglpK断片をMunIで消化された(および平滑末端の)
プラスミドpRN100に連結することによってこの断片をインターラプトし、
6.9kbのプラスミドpRN101−1を生成した。R6K起点を含有する3
76bpの断片を、ベクターpGP704(MillerとMekalanos
、J.Becteriol.、170:2575〜2583、1988)からプ
ライマー配列番号30および配列番号31を使用してPCRによって増幅し、平
滑末端化し、pRN101−1由来の5.3kbのAsp718−AatII断
片(平滑末端化された)に連結し、カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐
性遺伝子を含有する5.7kbのプラスミドpRN102−1を生成した。pR
N101−1中のColE1起点領域をR6K起点と置換して生成したpRN1
02−1はまた、大部分のZeocin耐性遺伝子を欠損している。pRN10
2−1を複製するための宿主は、大腸菌SY327(MillerとMekal
anos、J.Bacteriol.、170:2575〜2583、1988
)であったが、これはR6K起点が機能するのに必要なpir遺伝子を含有する
。
RJF10mの設計) 大腸菌FM5は、非複製組込みプラスミドpRN102−1で電気的に形質転
換(electrotransformed)し、クロラムフェニコール耐性(
12.5μg/mL)およびカナマイシン感受性(30μg/mL)の形質転換
細胞を、1mMのグリセロールを含有するM9最小培地上でグリセロール非利用
によってさらに選別した。RJF10mのような変異体に由来するゲノムDNA
のEcoRIによる消化物は、サザン解析(Southern、J.Mol.B
iol.、98:503〜517、1975)によってインタクトなglpKで
プローブすると、二重−交差組込み(glpK遺伝子の置換)であったことを示
した。これは、クロラムフェニコール耐性遺伝子内に追加のEcoRI部位が存
在することにより、2つの予想された7.9kbおよび2.0kbのバンドが観
察されたためである。野生型の対照は、単一の予想された9.4kbのバンドを
生成した。変異体RJF10mの13CNMRによる解析により、13Cで標識され
たグリセロールおよびATPが、グリセロール三リン酸に変換するのは不可能で
あることが確認された。このglpK変異体を、予想された2.3kb、2.4
kb、および4.0kbのPCR断片をそれぞれ生成するプライマーの組み合わ
せである配列番号32および配列番号33、配列番号34および配列番号35、
ならびに配列番号32および配列番号35を使用し、ゲノムPCRによってさら
に解析した。野生型の対照は、プライマー配列番号32および配列番号35を用
いて、予想された3.5kbのバンドを生成した。glpK変異体RJF10m
を、プラスミドpAH48で電気的に形質転換して、グルコールからグリセロー
ルを生成することが可能になった。glpK変異体大腸菌RJF10mは、19
97年11月24日のブタペスト条約の条項のもとに、ATCCに寄託されてい
る。
キナーゼ変異体RJF10の設計) YENB培地(0.75%の酵母抽出物、0.8%の栄養ブイヨン)上で、3
7℃で一晩増殖した後、水懸濁液中の大腸菌RJF10mをプラスミドpJW1
68(未公開の産物)で電気的に形質転換したが、該プラスミドは、IPTGに
よる誘導が可能なlacUV5プロモーターの制御下でのバクテリオファージP
1 Creレコンビナーゼ遺伝子、温度感受性pSC101レプリコン、および
アンピシリン耐性遺伝子を含有した。30℃のSOC培地中で十分に増殖した時
、カルベニシリン(50μg/mL)およびIPTG(1mM)を添加したLB
寒天培地上で、形質転換細胞を30℃で選択した。染色体クロラムフェニコール
耐性遺伝子の切り出しをCreレコンビナーゼ(HoessとAbremski
、J.Mol.Biol.181:351〜362、1985)で媒介されたl
oxP部位で組換えにより行わせるために、プールしたコロニーの転移を、二晩
、30℃で、カルベニシリンおよびIPTGが添加された新鮮LB寒天培地上で
行った。生じたコロニーは、レプリカプレート法により、カルベニシリンおよび
IPTGを添加したLB寒天培地およびクロラムフェニコール(12.5μg/
mL)を添加したLB寒天に植え、マーカー遺伝子の除去を示す、カルベニシリ
ン耐性およびクロラムフェニコール感受性のコロニーを同定した。このようなコ
ロニーを一晩30℃で培養したものを、10mLのLB寒天培地に接種した。3
0℃で吸光度が0.6(600nm)を示すまで増殖したら、培養物を37℃で
一晩インキュベートした。希釈液を数回、予め温めておいたLB寒天培地に分注
し、このプレートを一晩、42℃(pJW168の複製には、非許容温度)にて
インキュベートした。生じたコロニーをレプリカプレート法により、LB寒天培
地、およびカルベニシリン(75μg/mL)を添加したLB寒天培地に植え、
プラスミドpJW168を失ったことを示す、カルベニシリン感受性のコロニー
を同定した。このようなglpK変異体であるRJF10を、プライマー配列番
号32および配列番号35を使ってゲノムPCRによってさらに解析し、マーカ
ー遺伝子の切り出しを立証する予想された3.0kbのバンドを生成した。変異
体RJF10がグリセロールを利用しないことは、1mMのグリセロールを含有
するM9最小培地上で増殖が無いことから確認された。glpK変異体RJF1
0は、プラスミドpAH48で電気的に形質転換し、グルコースからグリセロー
ルを生成することが可能になった。
プライマー配列番号36および配列番号37を使用して、PCR(K.B.Mu
llisとF.A.Faloona(1987)Meth.Enzymol.1
55:335〜350)によって、大腸菌から単離し、pUC18のSphIお
よびXbaI部位の間でクローン化(T.Maniatis1982Molec
ular Cloning.A Laboratory Manual.Col
d Spring Harbor、Cold Spring Harbor、N
Y)し、pKP8を生成した。pKP8をgldA内で唯一のSalIおよびN
coI部位で切断し、末端をKlenowで平滑化し連結したが、これによりg
ldAの中ほどに109bpの欠損と、唯一のSalI部位の再生とをもたらし
、このようにしてpKP9を生成した。カナマイシン耐性(kan)を与える遺
伝子を含有し、翻訳開始コドンのDNA上流約400bpsおよび翻訳停止コド
ンのDNA下流約100bpsを含む1.4kbのDNA断片は、末端のSal
I部位を取り込んだプライマー配列番号38および配列番号39を使用して、P
CRによってpET−28a(+)(Novagen、Madison、Wis
)から単離し、pKP9の唯一のSalI部位に入れサブクローン化して、pK
P13を生成した。gldA翻訳開始コドンの下流204bpsで始まり、gl
dA翻訳停止コドンの上流178bpsで終わり、kan(カナマイシン耐性)
挿入を含有する2.1kbのDNA断片は、末端のSphIおよびXbaI部位
をそれぞれ取り込んだプライマー配列番号40および配列番号41を使用して、
PCRによってpKP13から単離し、pMAK705(Genencor I
nternational、Palo Alto、Calif.)のSphIお
よびXbaI部位の間でサブクローン化し、pMP33を生成した。大腸菌FM
5は、pMP33で形質転換し、pMAK705の複製に対する許容温度である
30℃で、20μg/mLでkanを選別した。あるコロニーを一晩30℃で、
20μg/mLのkanを添加した液体培地中で増殖させた。約32,000細
胞を20μg/mLのkan上に播き、pMAK705の複製にとって抑制的な
温度である44℃で、16時間インキュベートした。44℃で増殖する形質転換
細胞は、染色体に組み込まれたプラスミドを保持し、これは約0.0001の頻
度(frequency)で発生する。PCRおよびサザンブロット(E.M.
Southern1975 J.Mol.Biol.98:503〜517)解
析を使用して、形質転換細胞中の染色体組込みの性質を確認した。ウェスタンブ
ロット解析(H.Towbinら、(1979)Proc.Natl.Acad
.Sci.76:4350)を使用して、gldAの産物であるグリセロールデ
ヒドロゲナーゼタンパクが形質転換細胞中で生成されているかどうかを確認した
。活性の検定を使用して、グリセロールデヒドロゲナーゼ活性が形質細胞中に残
っているかどうかを確認した。未変性ゲル上のグリセロールデヒドロゲナーゼバ
ンド中の活性は、グリセロール+NAD(+)からジヒドロキシアセトン+NA
DHへの変換を、テトラゾリウム染料、MTT[3−(4,5−ジメチルチアゾ
ール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド]から濃く着
色したホルマザンへの変換と、フェナジンメトサルフェートを媒介物としてカッ
プリングして測定した。グリセロールデヒドロゲナーゼはさらに、30mMの硫
酸アンモニウムおよび100mMのトリス、pH9の存在を要求する(C.T.
Tangら、(1997)J.Bacteriol.140:182)。解析し
た8例の形質転換細胞のうち、6例がgldAをノックアウトしていることが確
認された。大腸菌MSP33.6は、1997年11月24日のブタペスト条約
の条項のもとに、ATCCに寄託されている。
訳停止コドンのDNA下流220bpsを含む、1.6kbのDNA断片は、末
端のSphIおよびXbaI部位をそれぞれ取り込んだプライマー配列番号42
および配列番号43を使用してPCRによって大腸菌から単離し、pUC18の
SphIおよびXbaI部位の間でクローン化し、pQN2を生成した。pQN
2は、gldA内の唯一のSalIおよびNcoI部位で切断し、末端をKle
nowで平滑化し連結し、これによりgldAの中ほどに109bpsの欠損と
、唯一のSalI部位の再生をもたらしたが、このようにしてpQN4を生成し
た。カナマイシン耐性(kan)を与える遺伝子を含有し、loxP部位に隣接
する1.2kbのDNA断片は、pLoxKan2(Genencor Int
ernational、Palo Alto、Calif.)からStuI/X
hoI断片として単離し、Klenowで末端を平滑化し、さらにKlenow
で平滑にした後pQN4のSalI部位に入れサブクローン化し、pQN8を生
成した。R6Kの複製起点を含有する0.4kbのDNA断片は、pGP704
(MillerとMekalanos、J.Bacteriol.、170:2
575〜2583、1988)から、末端のSphIおよびXbaI部位をそれ
ぞれ取り込んだ、プライマー配列番号44および配列番号45を使用して、PC
Rによって単離し、pQN8由来のgldA::kanカセットを含有する2.
8kbのSphI/XbaI DNA断片と連結し、pKP22を生成した。ク
ロラムフェニコール耐性(cam)を与える遺伝子を含有し、loxP部位に隣
接した1.0kbのDNA断片は、pLoxCat2(Genencor In
ternational、Palo Alto、Calif.)から、XbaI
断片として単離し、pKP22のXbaI部位に入れサブクローン化し、pKP
23を生成した。大腸菌株RJF10(実施例5を参照)は、glpK−である
が、pKP23で形質転換し、kanRcamSの表現型を有する形質転換細胞
を単離したが、これは二重交差組込みを示すことがサザンブロット解析によって
確認された。グリセロールデヒドロゲナーゼのゲルの活性検定(実施例6で述べ
られたように)により、活性グリセロールデヒドロゲナーゼが、これらの形質転
換細胞には存在しないことが証明された。kanマーカーを、実施例5で述べら
れたように、Cre−産生プラスミドpJW168を使って、染色体から除去し
、KLP23株を生成した。表現型kanSを有する数個の単離体は、グリセロ
ールデヒドロゲナーゼ活性が無いことを証明し、またサザンブロット解析により
kanマーカーを失ったことが確認された。
K)活性を有するまたは有しない組換え大腸菌によって、D−グルコースから生
産されたグリセロールの構築) 実施例8は、組換え大腸菌FM5/pAH48およびRJF10/pAH48
による、グリセロールの消費量を例示する。FM5/pAH48およびRJF1
0/pAH48株は、上述したように一般的な手法で構築した。
に、発酵に使用したのと同一の培地、または1%グルコースを添加したLB中で
前培養した。カルベニシリンかアンピシリンのどちらかを、プラスミドを維持す
るために使用(100mg/L)した。発酵用の培地は、実施例4で述べたとお
りである。
中に、凍結ストック(凍結保護物質として15%グリセロール)を入れて開始し
、30℃で250rpmの振盪機中で約12時間増殖させ、発酵槽に植えるに使
用した。
られたように調製した。カルベニシリンまたはアンピシリンを、プラスミドを維
持するために使用(100mg/L)した。
背圧は0.5バールに調整した。溶存酸素引張は、攪拌によって10%に調整し
た。アンモニア水をpH6.7に調節するために使用した。グルコースの供給(
60%グルコース)速度は、グリセロールが少なくとも25g/Lに蓄積するま
で、過量のグルコースを維持するように調節した。グルコースを次に無くし、グ
リセロールの正味代謝をもたらした。表2に生じたグリセロール変換を示す。
ロールキナーゼ活性が除去されると、4〜5倍減少する。
背圧は0.5バールに調整した。溶存酸素引張は、攪拌によって10%に調整し
た。アンモニア水をpH6.7に調節するために使用した。最初の発酵では、発
酵の間グルコースを過量に維持した。2番目の発酵では、最初の25時間の後、
残余のグルコースが無い状態で行った。GlpKおよびGldA活性を測定する
ために、2つの発酵物から時間の経過とともに試料を採取した。表3に、Gld
Aがグリセロールの選択率に及ぼす効果を示す、RJF10/pAH48の発酵
を要約する。
活性の存在は、グルコースが限定された条件下でグリセロールの変換に関連して
いる;したがって、グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を除去すると、グリセロ
ールの変換が減少することが予想される。
いたD−グルコースからのグリセロールの生成) 実施例9は、GPP2およびDAR1遺伝子の両方を含有する組換えE.ブラ
ッテ(E.blattae)によるD−グルコースからのグリセロール生成を例
示する。
blattae)は、30℃で、培養が600nmで約0.6AUの吸光度に到
達するまで増殖させた。次にエレクトロポレーションを使って、培養物を、GP
P2およびDAR1遺伝子を構成するプラスミドpAH48で形質転換した。形
質転換細胞は、DNA RFLPパターンおよび抗生物質耐性(200μg/m
Lのカルベニシリン)によって確認した。
的に増殖させた。培養物は、抗生物質による選別を備える2%グルコースを加え
た合成培地中で増殖させ、抗生物質による選別を備える1%グルコースを加えた
LB中で一晩増殖させたものを接種して開始した。合成培地は1リットル当たり
以下のものを含有した:27.2gのKH2PO4、2gのクエン酸、2gのMg
SO4・7H2O、1.2mlの98%H2SO4、0.3gのクエン酸鉄アンモニ
ウム、0.2gのCaCl2・2H2O、10gの酵母抽出物(Difco)、5
mLのBalchの微量元素溶液(この組成はMethods for Gen
eral and Molecular Bacteriology(P.Ge
rhardtら、eds、p158、American Society fo
r Microbiology、Washington、DC、(994)の中
で見ることができる)。合成培地は、濾過滅菌し、NH4OHで最終pHを6. 8に調整した。振盪フラスコは、35℃で一晩、激しく振盪しながらインキュベ
ートした。上清を次に、グリセロールの存在を確認するためにHPLC解析に供
した。一晩インキュベーションした後、pAH48を含有するE.blatta
eは、グリセロール7.63g/Lを生成した。対照は、同一条件下で増殖させ
た野生型E.ブラッテ(E.blattae)(ATCC33439)であった
が、これはグリセロール0.2g/Lを生成した。
AR1の両方を含有する、組換え大腸菌を使用したD−グルコースからのグリセ
ロールの生成) この実施例は、gldAおよびglpK遺伝子がノックアウトされ、宿主細胞
の染色体に組み込まれたGPP2、およびDAR1をコードする遺伝子を含有す
る、組換え大腸菌由来のDグルコースから、グリセロールを生成するのを例示す
る。
ナーゼ(glpK産物)およびグリセロールデヒドロゲナーゼ(gldA産物)
活性が欠損している。DAR1、GPP2、およびampC領域で染色体に組み
込まれた、loxP隣接クロラムフェニコール耐性遺伝子を含有するKLP23
を調製したが、これをAH76RIcmと呼ぶ。
基づいて設計および構築した。組込みプラスミドを生成するために、pLoxC
atIのHindIII−SmaIを、HindIIIおよびSmaI線形pA
H48に挿入して、pAH48cm2を生成した。pAH48プラスミドは、t
rcプロモーターの制御下に発現する、DAR1およびGPP2遺伝子を含有す
る。pAH48cm2の3.5kbのApaL I断片を、T4 DNA Po
lymerase(Boehringer Mannheim Biochem
ical)およびdNTPsで平滑末端にし、大腸菌SY327(Miller
ら、J.Bacteriol.170:2575〜2583、1998)を宿主
として使用して、NruI linearized pInt−ampC(Ge
nencor International、CA)に挿入し、pAH76およ
びpAH76Rを生成した。「R」は、組込みカセットの逆向きを意味する。両
プラスミド、pAH76およびpAH76Rは、R6K複製起点を含有し、KL
P23中で複製することができない。プラスミドpAH76およびpAH76R
を使用して、大腸菌の染色体のampC領域に組み込むようにKLP23を形質
転換した。形質転換細胞は、10μg/mlのクロラムフェニコールで選別し、
これはカナマイシン感受性であったが、二重交差組込みを生成した。これらの大
腸菌形質転換細胞を、AH76IcmおよびAH76RIcmと命名した。
スを添加した振盪フラスコ中に、一晩培養した、1%グルコースおよび抗生物質
による選別を備えたLB培地接種して開始し、増殖させた。振盪フラスコ(Er
lenmeyerフラスコ、全容の1/5の液体容量)を、37℃で激しく振盪
しながら一晩インキュベートし、その上清を、Monarch2000 ins
trument(Instrumentation Laboratory C
o.、Lexington、MA)で、色調測定酵素検定法(colormet
ric enzyme assay)(Sigma、Procedure No
.337)を使用して、グリセロールを測定するための試料に供した。AH77
RIcmは、25時間後に、6.7g/Lのグリセロールを生成したことを示し
た。
コール遺伝子を有する。クロラムフェニコール遺伝子は、Cre−生成プラスミ
ドpJW168を使用して、実施例5に述べられたように染色体から除去した。
30℃で1mMのIPTGの誘導下に、カルベニシリン耐性およびクロラムフェ
ニコール感受性の形質転換細胞を選別した。クロラムフェニコール遺伝子を除去
した後、AH76RIを、pJW168を治療する抗生物質を含まないLB培地
上で増殖させた。AH76RIの最終型は、クロラムフェニコールまたはカルベ
ニシリンの選択では、増殖できない。
中に、一晩培養したLB/1%グルコースを接種して開始し、増殖させた。振盪
フラスコを、35℃で激しく振盪しながら一晩インキュベートし、その上清を、
Monarch2000 instrument(Instrumentati
on Laboratory Co.、Lexington、MA)で、色調測
定検定法(colormetric assay)(Sigma、Proced
ure No.337)を使用して、グリセロールを測定する試料に供した。A
H77RIは、24時間後に、グリセロール4.6g/Lを生成したことを示し
た。
使って、大腸菌KLP23に形質転換した。形質転換細胞は、DNA RFLP
パターン、抗生物質耐性、PCR増幅またはG3Pリン酸塩検定によって確認し
た。
Claims (20)
- 【請求項1】 組換え生物からのグリセロール産生方法であって、 (i)適当な宿主細胞を、(a)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ
活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および(b)グリセロール−3−リ
ン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のいずれか一方
または両方を含む発現カセットで形質転換することであって、 (a)グリセロールキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性遺
伝子および(b)グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードする内因性遺伝子のいずれか一方または両方に破壊を有する、ここで該破壊
は活性遺伝子産物の発現を妨げる、該適当な宿主細胞を形質転換することと、 (ii)単糖類、オリゴ糖、多糖類、および一炭素基質からなる群から選択さ
れる少なくとも1つの炭素源の存在下で(i)の形質転換された宿主細胞を培養
し、それによってグリセロールを産生することと、 (iii)任意選択で、(ii)で産生したグリセロールを回収することと を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項2】 前記発現カセットがグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ酵素をコードする遺伝子を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記発現カセットがグリセロール−3−リン酸ホスファター
ゼ酵素をコードする遺伝子を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 前記発現カセットがグリセロール−3−リン酸ホスファター
ゼ酵素およびグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝
子を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 【請求項5】 前記宿主細胞が内因性グリセロールキナーゼ酵素をコードす
る遺伝子に破壊を含み、該破壊が活性遺伝子産物の発現を妨げることを特徴とす
る、請求項1に記載の方法。 - 【請求項6】 前記宿主細胞が内因性グリセロールデヒドロゲナーゼ酵素を
コードする遺伝子に破壊を含み、該破壊が活性遺伝子産物の発現を妨げることを
特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】 前記宿主細胞がa)内因性グリセロールキナーゼ酵素をコー
ドする遺伝子における破壊と、b)内因性グリセロールデヒドロゲナーゼ酵素を
コードする遺伝子における破壊とを含み、それぞれの遺伝子における該破壊がど
ちらか一方の遺伝子からの活性遺伝子産物の発現を妨げることを特徴とする、請
求項1に記載の方法。 - 【請求項8】 前記適当な宿主細胞が細菌、酵母、および糸状菌からなる群
から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 【請求項9】 前記適当な宿主細胞が、シトロバクター(Citrobac
ter)、エンテロバクター(Enterobacter)、クロストリジウム
(Clostridium)、クレブシエラ(Klebsiella)、エロバ
クター(Aerobacter)、ラクトバシルス(Lactobacillu
s)、アスペルギルス(Aspergillus)、サッカロミセス(Sacc
haromyces)、スヒゾサッカロミセス(Schizosaccharo
myces)、ジゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)、
ピヒア(Pichia)、クリベロミセス(Kluyveromyces)、カ
ンジダ(Candida)、ハンゼヌラ(Hansenula)、デバリオミセ
ス(Debaryomyces)、ムコール(Mucor)、トルロプシス(T
orulopsis)、メチロバクター(Methylobacter)、エシ
ェリヒア(Escherichia)、サルモネラ(Salmonella)、
バシルス(Bacillus)、ストレプトミセス(Streptomyces
)およびシュードモナス(Pseudomonas)からなる群から選択される
ことを特徴とする、請求項8に記載の方法。 - 【請求項10】 前記適当な宿主細胞が大腸菌(E.coli)またはサッ
カロミセス種(Saccharomyces sp.)であることを特徴とする
、請求項9に記載の方法。 - 【請求項11】 前記炭素源がグルコースであることを特徴とする、請求項
1に記載の方法。 - 【請求項12】 グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する
タンパク質が、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号
11、および配列番号12からなる群から選択されるアミノ酸配列であって酵素
の機能特性を変えるものではないアミノ酸の置換、欠失または挿入を含んでいて
もよい該アミノ酸配列に対応することを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 【請求項13】 グリセロール−3−ホスファターゼ活性を有するタンパク
質が、配列番号13および配列番号14からなる群から選択されるアミノ酸配列
であって酵素の機能特性を変えるものではないアミノ酸の置換、欠失または挿入
を含んでいてもよい該アミノ酸配列に対応することを特徴とする、請求項1に記
載の方法。 - 【請求項14】 (a)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子と、(b)グリセロール−3−リン酸ホス
ファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、(c)内因性グリセ
ロールキナーゼをコードする遺伝子における破壊と、(d)内因性グリセロール
デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における破壊と、を含む形質転換された宿
主細胞であって、(c)および(d)の遺伝子における該破壊が活性遺伝子産物
の発現を妨げ、該宿主細胞が単糖類、オリゴ糖類、多糖類、および一炭素基質か
ら選択される少なくとも1つの炭素源をグリセロールに変換することを特徴とす
る、形質転換された宿主細胞。 - 【請求項15】 (a)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子と、(b)グリセロール−3−リン酸ホス
ファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、(c)内因性グリセ
ロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における破壊と、を含む形質転換さ
れた宿主細胞であって、(c)の遺伝子における該破壊が活性遺伝子産物の発現
を妨げ、該宿主細胞が単糖類、オリゴ糖類、多糖類、および一炭素基質から選択
される少なくとも1つの炭素源をグリセロールに変換することを特徴とする、形
質転換された宿主細胞。 - 【請求項16】 (a)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子と、(b)グリセロール−3−リン酸ホス
ファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、(c)内因性グリセ
ロールキナーゼをコードする遺伝子における破壊と、を含む形質転換された宿主
細胞であって、(c)の遺伝子における該破壊が活性遺伝子産物の発現を妨げ、
該宿主細胞が単糖類、オリゴ糖類、多糖類、および一炭素基質から選択される少
なくとも1つの炭素源をグリセロールに変換することを特徴とする、形質転換さ
れた宿主細胞。 - 【請求項17】 組換え生物からの1,3−プロパンジオール産生方法であ
って、 (i)適当な宿主細胞を、(a)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ
活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および(b)グリセロール−3−リ
ン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のいずれか1つ
あるいは両方を含む発現カセットで形質転換することであって、 デヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子
を有し、さらに(a)グリセロールキナーゼ活性を有するポリペプチドをコード
する内因性遺伝子および(b)グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードする内因性遺伝子のいずれか一方あるいは両方に破壊を有する
、ここで(a)および(b)の遺伝子における該破壊は活性遺伝子産物の発現を
妨げる、該適当な宿主細胞を形質転換することと、 (ii)単糖類、オリゴ糖、多糖類、および一炭素基質からなる群から選択さ
れる少なくとも1つの炭素源の存在下で(i)の形質転換した宿主細胞を培養し
、それによって1,3−プロパンジオールを産生することと、 (iii)(ii)で産生した1,3−プロパンジオールを回収することと、
を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項18】 デヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質がグリセロー
ルデヒドラターゼ酵素およびジオールデヒドラターゼ酵素からなる群から選択さ
れることを特徴とする、請求項17に記載の方法。 - 【請求項19】 前記グリセロールデヒドラターゼ酵素が、クレブシエラ(
Klebsiella)、ラクトバシルス(Lactobacillus)、エ
ンテロバクター(Enterobacter)、シトロバクター(Citrob
acter)、ペロバクター(Pelobacter)、イリオバクター(Il
yobacter)、およびクロストリジウム(Clostridium)から
なる群から選択された微生物から単離された遺伝子によってコードされているこ
とを特徴とする、請求項18に記載の方法。 - 【請求項20】 前記ジオールデヒドラターゼ酵素が、クレブシエラ(Kl
ebsiella)およびサルモネラ(Salmonella)からなる群から
選択された微生物から単離された遺伝子によってコードされていることを特徴と
する、請求項18に記載の方法。
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