CN113881614B

CN113881614B - 一种提升1,3-丙二醇生产菌株性能的工程菌及其应用

Info

Publication number: CN113881614B
Application number: CN202111064501.2A
Authority: CN
Inventors: 刘德华; 孙燕; 张圆满
Original assignee: Jiangsu Qingda Zhixing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Qingda Zhixing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-10
Filing date: 2021-09-10
Publication date: 2023-07-28
Anticipated expiration: 2041-09-10
Also published as: CN113881614A

Abstract

本发明公开了一种提升1,3‑丙二醇生产菌株性能的工程菌及其应用。所述工程菌是指通过分子生物学操作消除菌株中dhaD编码的甘油脱氢酶活性，同时提高gldA编码的甘油脱氢酶活性。本发明通过对生产菌株中编码甘油脱氢酶的基因进行调整，使得菌株总体性能发生变化。改造后的工程菌株在利用甘油生产1,3‑丙二醇的过程中，副产物产量降低、原料向1,3‑丙二醇的转化率提升。

Description

一种提升1,3-丙二醇生产菌株性能的工程菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及提升1,3-丙二醇生产菌株性能的工程菌及其应用。

背景技术

1,3-丙二醇是一种简单的二元醇，1,3-丙二醇广泛应用于化妆品原料、溶剂、高分子材料等领域。特别是作为原料合成聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)。PTT是一种性能优良的纺织材料，具有棉纶、涤纶、尼龙等材料的综合优良性能。早期工业上利用丙烯醛等石化原料生产1,3-丙二醇。自然界有多种微生物可以利用甘油生产1,3-丙二醇，随着生物法生产1,3-丙二醇技术的发展，利用丙烯醛为原料的合成法生产1,3-丙二醇被工业界淘汰。目前国际上都采用生物法生产1,3-丙二醇。目前已经发现多种细菌能利用甘油合成1,3-丙二醇，这些细菌包括：克雷伯氏菌属细菌(genus Klebsiella)、弗氏柠檬酸(Citrobacterfreundii)、丁酸梭菌(Clostridium butyricu)和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)等。

利用甘油生产1,3-丙二醇包括两条反应支路。在还原反应支路，甘油在脱水酶的催化下形成形成3-羟基丙醛，3-羟基丙醛在丙二醇还原酶的催化下形成1,3-丙二醇。在氧化支路，甘油在甘油脱氢酶的催化下形成二羟基丙酮，二羟基丙酮在激酶的催化性形成磷酸二羟基丙酮，进而进入酵解途径为细胞提供能量和材料，同时合成2,3-丁二醇、乳酸、乙醇和乙酸等代谢产物。甘油大量进入氧化途径将降低甘油到1,3-丙二醇的转化率。目前已经鉴定了dhaD和gldA两个基因都编码甘油脱氢酶。dhaD与甘油代谢的其他基因(包括甘油脱水酶编码基因，丙二醇还原酶编码基因，二羟基丙酮激酶I编码基因和二羟基丙酮激酶II编码基因)共同形成dha操纵子。dha操纵子中基因的表达受到二羟基丙酮的诱导。gldA处于一个单独的操纵子。

已经开发了多种方法来提升1,3-丙二醇生产菌株的性能。例如通过消除乳酸脱氢酶活性，使得菌株合成乳酸的能力消失，菌株合成1,3-丙二醇的性能得到明显提升。通过消除乙酸和乙醇等代谢产物的合成也可以提升1,3-丙二醇生产菌株的性能。

发明内容

本发明的目的是，提供一种提升1,3-丙二醇生产菌株性能的方法。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

提升1,3-丙二醇生产菌株性能的工程菌，该工程菌通过人工操作消除1,3-丙二醇生产菌株中dhaD编码的甘油脱氢酶活性，同时提升gldA编码的甘油脱氢酶活性。

作为优选实施方案，所述1,3-丙二醇生产菌株为具有1,3-丙二醇生产能力的野生菌株或经过基因改造后用于1,3-丙二醇生产的工程菌。

作为优选实施方案，1,3-丙二醇生产菌株包括：克雷伯氏菌、弗氏柠檬酸菌等具有1,3-丙二醇生产能力的野生菌株和以这些菌株为出发菌株经基因改造后的菌株。

作为优选实施方案，消除1,3-丙二醇生产菌株中dhaD编码的甘油脱氢酶活性的方法采用通过分子生物学操作将菌株染色体上的dhaD基因破坏。

作为优选实施方案，提升gldA编码的甘油脱氢酶活性的方法通过分子生物学操作将gldA基因进行高水平表达。

所述dhaD编码的甘油脱氢酶和gldA编码的甘油脱氢酶是催化甘油脱氢形成二羟基丙酮的酶。

在变栖克雷伯氏菌342(Klebsiella variicola 342)的基因组(NC_011283.1)中dhaD编码的甘油脱氢酶基因序列如SEQ ID No.1所示，gldA编码的甘油脱氢酶该基基因序列如SEQ ID No.2所示。

在弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii strain 62)的基因组(CP048382.1)dhaD编码的甘油脱氢酶基因序列如SEQ ID No.3所示，gldA编码的甘油脱氢酶该基基因序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供所述的提升1,3-丙二醇生产菌株性能的工程菌在生产1,3-丙二醇中的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明通过消除1,3-丙二醇生产菌株中dhaD编码的甘油脱氢酶的活性，同时提升gldA编码的甘油脱氢酶活性，使得菌株合成1,3-丙二醇和合成副产物相关基因的表达水平发生变化，在利用甘油生产1,3-丙二醇的过程中，降低了甘油向氧化途径的代谢，降低了副产物的合成，从而增加了甘油到1,3-丙二醇的转化率。利用本发明改造的菌株生产1,3-丙二醇，原料转化率提高。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。各种分子生物学操作为通用操作方法。

实施例1：消除克雷伯氏菌dhaD编码的甘油脱氢酶活性。

克雷伯氏菌CGMCC 1.6366菌株(该菌株也称为TUAC01，AC01)，已经在文献(WorldJournal of Microbiology Biotechnology 2008,24:1731-1740)中公开，简称为Kp。

根据变栖克雷伯氏菌342的基因组信息，设计引物构建DNA片段，将染色体上dhaD基因进行重组失活，获得Kp-ΔdhaD菌株。操作步骤如下：

1)扩增dhaD基因上下游两端长同源臂序列。以dhaD-s1：ATGCTAAAAGTTATTCAATCTC(SEQ ID No.5所示)、dhaD-a1：CCAGCCTACACCGCGGCAGCCCTGTTTTTGCAAA(SEQ ID No.6所示)和dhaD-s2：TCCCCGGAATATCACGGCGAGAAAGTGGCCTT(SEQ ID No.7所示)、dhaD-s2：TTAACGCGCCAGCCACTGCTGGC(SEQ ID No.8所示)为特异性引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366基因组为模板，经PCR扩增分别得到dhaD基因两端长同源的DNA片段1和2。以dhaD-aac-s：GGCTGCCGCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(SEQ ID No.9所示)、dhaD-aac-a：TCGCCGTGATATTCCGGGGATCCGTCGA(SEQ ID No.10所示)为引物，以PIJ773质粒(商业产品)为模板进行PCR扩增，得到Apr^r抗性的aac(3)IV基因片段3。

2)基因片段的重组连接使用的是ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒中的操作方法。将步骤1中扩增的基因片段1,2,3进行重组连接获得DNA片段4。

3)将DNA片段4电转入带有质粒pDK6-red的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366感受态细胞。涂布于带Apr^r抗性的平板上，筛选出的阳性克隆中即为染色体上dhaD基因中间部分被aac(3)IV基因替换的菌株，命名为Kp-ΔdhaD菌株。

实施例2：提升gldA编码的甘油脱氢酶活性。

将gldA基因连同启动子重复插入到克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366的基因组，获得Kp-ΔdhaD-gldA2菌株，参照具体操作如下：

1)表达质粒的线性化。以pDK6-s：AAGCTTGGCTGTTTTGGCG(SEQ ID No.11所示)和pDK6-a：GAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTG(SEQ ID No.12所示)为特异性引物，以pDK6质粒(商业产品)为模板，得到线性化的pDK6载体。

2)扩增过表达的目的基因。以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366的基因组为模板，以gldA-s：TCACACAGGAAACAGAATTCATGGATCGCATTATTCAATCAC(SEQ ID No.13所示)和gldA-a：CCGCCAAAACAGCCAAGCTTTTATTCCCATTCCTGCAGGAAGC(SEQ ID No.14所示)为特异性引物进行PCR扩增，得到目的基因片段gldA。

3)目的基因与线性化载体连接。根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒中(商业产品)的操作步骤，将扩增出的目的基因片段gldA与线性pDK6载体连接成环，得到质粒pdk-gldA。将质粒pdk-gldA转入DH5α感受态细胞中，通过Kan^r抗性的平板进行筛选阳性克隆。

4)按照质粒抽提试剂盒的方法将pdk-gldA质粒从DH5α中提取并转入克雷伯氏肺炎杆菌Kp-ΔdhaD感受态细胞中，得到Kp-ΔdhaD-gldA菌株。将pdk-gldA质粒转入克雷伯氏肺炎杆菌Kp感受态细胞中，得到Kp-gldA菌株。

实施例3：将这些菌株进行1,3丙二醇发酵实验。

将Kp、Kp-ΔdhaD、Kp-ΔdhaD-gldA和Kp-gldA菌株分别接种到250mL锥形瓶中，其中装有50mL的LB培养基，摇瓶柜转速150转每分钟，恒温37℃进行种子培养。

种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基。保持发酵过程通风量2L/分钟，搅拌转速200转/分钟，发酵温度37℃，利用氢氧化钠溶液使发酵液的pH值稳定在7.0，发酵12小时结束。

发酵培养基配方为：甘油30g/L；硫酸铵4g/L；磷酸氢二钾0.69g/L；磷酸二氢钾0.25g/L；硫酸镁0.2g/L；酵母粉1.5g/L；甘油30g/L；微量元素1.0ml/L；铁溶液1.0ml/L。

微量元素为：硫酸锰100mg/L；氯化锌70mg/L；钼酸钠35mg/L；硼酸60mg/L；氯化钴200mg/L；硫酸铜29.28mg/L；氯化镍25mg/L；浓盐酸(37％)0.9ml/L。

铁溶液为：1升水中加入硫酸亚铁5.0g，37％的浓盐酸4ml。

发酵液中组分的测定采用液相色谱法测定。液相色谱法测定，利用HPX-87H色谱柱，利用视差和紫外检测器检测，流动相0.025mol/L硫酸水溶液，流速0.8ml/min，柱温箱65℃。菌株发酵结果如表1所示。

表1，克雷伯氏菌属发酵罐发酵结果

菌株	甘油消耗(g/L)	1,3-丙二醇(g/L)	转化率(g/g)
				Kp	30	10.5	0.35
Kp-ΔdhaD	10	3	0.3
				Kp-gldA	30	9	0.3
Kp-ΔdhaD-gldA	30	12.6	0.42

从表1的数据结果可以看出：野生克雷伯氏菌在12小时发酵过程中消耗了培养基中30g/L的甘油，产生了10.5g/L的1,3-丙二醇，甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为0.35g/g。Kp-ΔdhaD菌株消耗甘油速度降低，发酵12小时仅消耗10g/L的甘油，合成3g/L的1,3-丙二醇，甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为0.3g/g。Kp-gldA菌株将培养基中甘油消耗完，发酵12小时合成9g/L的1,3-丙二醇，甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为0.3g/g。Kp-ΔdhaD-gldA菌株将培养基中甘油消耗完，发酵12小时合成12.6g/L的1,3-丙二醇，甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为0.42g/g。消除菌株dhaD编码的甘油脱氢酶，同时高水平表达gldA编码的甘油脱氢酶，菌株性能得到明显提升。

实施例4：提高弗氏柠檬酸菌生产1,3-丙二醇性能。

弗氏柠檬酸菌为公司保藏野生菌株，简称为Cf，根据弗氏柠檬酸菌(Citrobacterfreundii strain 62)的基因组信息，设计引物，按照实施例1方法使用以下引物构架Cf-ΔdhaD，Cf-ΔdhaD中dhaD编码的甘油脱氢酶通过基因重组被失活。

1)C设计引物FdhaD-s1：ATGCTAAAAGTTATTCAATCTC(SEQ ID No.15所示)、CFdhaD-a1：CCAGCCTACAGCCGCGACAGCCGTGCTGTTTC(SEQ ID No.16所示)和dhaD-s2：TCCCCGGAAATTTGTACCACGGTGAAAAAGT(SEQ ID No.17所示)、dhaD-s2：TTAACGCGCCAGCCACTGCTGC(SEQ ID No.18所示)为特异性引物，以弗氏柠檬酸菌Cf基因组为模板，经PCR扩增分别得到dhaD基因两端长同源的DNA片段Cf1和Cf2。以CfdhaD-aac-s：CTGTCGCGGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(SEQ ID No.19所示)、CfdhaD-aac-a：GTGGTACAAATTTCCGGGGATCCGTCGA(SEQ ID No.20所示)为引物，以PIJ773质粒(商业产品)为模板进行PCR扩增，得到Apr^r抗性的aac(3)IV基因片段Cf3。

2)将扩增的基因片段Cf1,Cf2,Cf3进行重组连接获得DNA片段Cf4。

3)将DNA片段Cf4电转入带有质粒pDK6-red的弗氏柠檬酸菌Cf感受态细胞。涂布于带Apr^r抗性的平板上，筛选出的阳性克隆中即为染色体上dhaD基因中间部分被aac(3)IV基因替换的菌株，命名为Cf-ΔdhaD菌株。

按照实施例2的方法，根据根据弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii strain62)的基因组信息，设计引物克隆Cf的gldA基因，连接于pDK6，得到质粒pdk-CfgldA，将pdk-CfgldA转入Cf-ΔdhaD获得Cf-ΔdhaD-gldA菌株，将pdk-CfgldA转入Cf获得Cf-gldA菌株。

4)扩增弗氏柠檬酸菌Cf的gldA基因。以弗氏柠檬酸菌Cf的基因组为模板，以CfgldA-s：TCACACAGGAAACAGAATTCATGGATCGCATTATTCAATCAC(SEQ ID No.21所示)和CfgldA-a：CCGCCAAAACAGCCAAGCTTTTATTCCCACTCTTGCAGGTAACG(SEQ ID No.22所示)为特异性引物进行PCR扩增，得到目的基因片段CfgldA。

5)将扩增出的目的基因片段CfgldA与实施例2中获得的线性pDK6载体连接成环，得到质粒pdk-CfgldA。将质粒pdk-CfgldA转入DH5α感受态细胞中，通过Kan^r抗性的平板进行筛选阳性克隆。

4)按照质粒抽提试剂盒的方法将pdk-CfgldA质粒从DH5α中提取并转入Cf-ΔdhaD感受态细胞中，得到Cf-ΔdhaD-gldA菌株。将pdk-CfgldA转入Cf获得Cf-gldA菌株。

按照实施例3的方法，将Cf、Cf-ΔdhaD、Cf-gldA和Cf-ΔdhaD-gldA进行发酵实验，发酵培养24小时结束。菌株发酵结果如表2所示。

表2，弗氏柠檬酸菌发酵罐发酵结果

菌株	甘油消耗(g/L)	1,3-丙二醇(g/L)	转化率(g/g)
				Cf	30	7.5	0.25
Cf-ΔdhaD	15	3	0.2
				Cf-gldA	30	6	0.2
Cf-ΔdhaD-gldA	30	10.5	0.35

从表2的数据结果可以看出：野生弗氏柠檬酸菌在24小时发酵过程中消耗了培养基中30g/L的甘油，产生了170.5g/L的1,3-丙二醇，甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为0.25g/g。Cf-ΔdhaD菌株消耗甘油速度降低，发酵24小时消耗15g/L的甘油，合成3g/L的1,3-丙二醇，甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为0.2g/g。Cf-gldA菌株将培养基中甘油消耗完，发酵24小时合成6g/L的1,3-丙二醇，甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为0.2g/g。Cf-ΔdhaD-gldA菌株将培养基中甘油消耗完，发酵24小时合成10.5g/L的1,3-丙二醇，甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为0.35g/g。消除菌株dhaD编码的甘油脱氢酶，同时高水平表达gldA编码的甘油脱氢酶，菌株性能得到明显提升。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 江苏清大智兴生物技术有限公司

<120> 一种提升1,3-丙二醇生产菌株性能的工程菌及其应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1098

<212> DNA

<213> 变栖克雷伯氏菌342(Klebsiella variicola 342)

<400> 1

atgctaaaag ttattcaatc tccagccaaa tatcttcagg gtcctgatgc tgctgtcctg 60

ttcggtcaat atgccaaaaa cctggcggag agcttcttcg tcatcgccga cgatttcgtg 120

atgaagctgg cgggagagaa agtggtgaat ggtctgcaga gtcacgatat tcgctgccat 180

gcggaacggt ttaacggtga atgcagccat gcggaaatta accgtctgat ggcgattttg 240

caaaaacagg gctgccgcgg cgtggttggc atcggcggcg gtaaaaccct cgataccgcg 300

aaggcgatcg gttactacca gaagctgccg gtggtggtga tcccgaccat cgcctcgacc 360

gatgcgccga ccagcgcgct gtcggtgatc tacaccgaag cgggcgagtt tgaagagtat 420

ctgatctatc cgaaaaaccc ggatatggtg gtgatggaca cggcgattat cgccaaagcg 480

ccggtacgcc tgctggtctc cggcatgggc gatgcgctct ccacctggtt cgaggccaag 540

gcctgctacg atgcgcgcgc caccagcatg gccggggggc agtccaccga ggcggcgctg 600

agcctcgccc gcctgtgcta tgatacgctg ctggcggagg gcgaaaaggc ccgtctggcg 660

gcgcaggccg gggtggtgac cgaagcgctg gagcgcatca tcgaggcgaa cacctacctc 720

agcggcattg gctttgaaag cagcggcctg gccgccgccc acgcgatcca caacggtttc 780

accattctgg aagagtgcca ccacctgtat cacggcgaga aagtggcctt cggtaccctg 840

gcgcagctgg tgctgcagaa cagcccgatg gacgagattg aaacggtgct gggcttctgc 900

cagcgcgtcg gcctgccggt gaccctcgcg cagatgggcg tcaaagaggg gatcgacgcg 960

aaaatcgccg cggtggcgaa agccacctgc gcggaagggg aaaccatcca caatatgccg 1020

ttcgcggtga ccccggagag tgtgcacgcc gctatcctca ccgccgatct gttaggccag 1080

cagtggctgg cgcgttaa 1098

<210> 2

<211> 1104

<212> DNA

<213> 变栖克雷伯氏菌342(Klebsiella variicola 342)

<400> 2

atggatcgca ttattcaatc accaggcaaa tacattcagg gcgcaggcgc catcaagcgc 60

ctcggcgact atctgaagcc tctggccgaa cgctggctgg tagtcggcga taagttcgta 120

ctggggtttg cggaagagat gctgcataaa agcctggccg acgctggcct ggcggccgaa 180

attgcgccgt ttggcggtga gtgttcgcat aatgaaatca atcgcctgcg cgatatcgcc 240

ggcagcgcga agtgcaccgc cgtgctgggg atcggcggtg gtaaaacgct ggataccgcg 300

aaagcgctgg cccattttat gaaggtgccg gtggcgatcg cccccaccat cgcctccacc 360

gatgcgccgt gtagcgcgct gtcggtgatt tacaccgacg aaggggagtt cgacagctac 420

ctgatgctgc cgcacaaccc caacatggtc attgtcgata cgcagattgt tgccggtgcg 480

ccagctcgcc tgctggccgc cgggattggc gatgcgctgg ccacctggtt cgaagcccgc 540

gcctgctccc gtagcggcgc caccaccatg gcgggtggga aatgcactca ggcggcgctg 600

gcgctggccg agctgtgcta caacacctta cttgaagagg gtgaaaaagc gatgctggcc 660

gccgaacagc acgtggtcac cccggcgctg gagcgagtgg tggaagccaa cacctacctg 720

agcggcgtcg gctttgaaag cggcggcctg gcggcggcgc acgcgattca caacggcatg 780

acggccatcc ctgacgccca ccactattat cacggggaaa aagtggcgtt cggtaccctg 840

acgcagctgg tgctggaaaa tgcgccggtg gacgaaatag agaccgtcgc cgcgctgtgc 900

cacagcgttg ggctgccgat caccctggcg cagctggaca tcaaaggtga tatcccgacc 960

aaaatgcgcc tggtggcgga agccgcctgc gctgaaggcg aaaccattca caatatgccg 1020

ggcggcgtcg actcagacca ggtctacgcc gcgctgttgg tggccgacca atacggtcag 1080

cgcttcctgc aggaatggga ataa 1104

<210> 3

<211> 1098

<212> DNA

<213> 弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii strain 62)

<400> 3

atgctaaaag ttattcaatc tccagccaaa tatctccagg gtcctgacgc ttccaccttg 60

tttggtcaat acgctaaaaa tctggcggac agcttttttg tgattgcgga tgacttcgtg 120

atgaagctgg cgggagagaa agtactcaac ggcctgcaca gccacgacat tagctgccat 180

gcggaacgct ttaacggtga atgtagccat gttgaaatta atcgactgat tgccattctg 240

aaacagcacg gctgtcgcgg cgtggttggg attggcggcg ggaaaacgct ggataccgcc 300

aaagcgattg gttactacca gaagctgccg gtggtggtga tcccgactat cgcgtctacc 360

gatgcgccaa ccagcgcgct gtccgttatc tataccgaag ccggtgagtt tgaagagtat 420

ctgatctacc cgaaaaaccc ggatatggtg gtgatggaca ctgcgatcat tgccaaagcg 480

ccggtacgtc tgctggtggc cgggatgggc gatgcgctct cgacctggtt tgaagcgaaa 540

gcctgttatg acgccagagc gaccagcatg gcgggcggac agtccaccgt ggcggcgctg 600

agcctggcgc gcttgtgcta tgataccctg ctggcggaag gcgagaaggc acgctttgct 660

gcgcaggctg gcgtggtgac cgatgcgctg gagcgtattg tcgaagctaa cacttacctc 720

agcggcatcg gctttgaaag cagcggtctt gcaggggcgc atgcgatcca caacggcttt 780

acgattctgg aagagtgcca ccatttgtac cacggtgaaa aagtcgcctt tggtacgctg 840

gcgcaactgg tgctgcaaaa cagcccgatg gaagagatcg aaaccgtgct gaatttctgt 900

cagaaagtag gcctgccggt aacgttagcg gaaatgggcg tgaaagaaga cgttgacggc 960

aagatcatgg ccgtggcgaa agcgacctgc gcagaaggtg aaaccatcca caatatgccg 1020

ttcccggtaa cgcctgaaag cgtacatgcc gctatcttga cggcagatct gctggggcag 1080

cagtggctgg cgcgttaa 1098

<210> 4

<211> 1104

<212> DNA

<213> 弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii strain 62)

<400> 4

atggatcgca ttattcaatc acctggtaag tacatccagg gtgccgatgt tattacccgt 60

cttggcagct acctcaaacc attggcagaa cgctggctga tcgttgggga caagtttgtc 120

ttaggctttg cccagggtgc actggaaaaa agcttccagg atgccggact ggcgctggaa 180

attgcaccgt ttggcggcga atgttcacaa aacgaaatcg accgtctgcg cgtcgtagcg 240

gaaaaagcac agtgcgccgc agtacttggt attggcggcg gtaaaacgct ggataccgcc 300

aaagcgctgg cgcactttat gggcgtgcct gtcgccattg cgccaaccat cgcctctacc 360

gatgcgccgt gcagcgcgct gtccgtcatt tacaccgatg ccggtgaatt cgatcgctat 420

ctgctgctgc ccaataaccc ggacagggtc attgttgata ccaaaattgt cgcgggcgca 480

ccggcgcgtc tgttagctgc gggtattggc gatgcgctgg cgacctggtt cgaagcgcgt 540

gcctgttcac gcagcggcgc aaccaccatg gcgggcggtc agtgtactca ggcggcgctg 600

gcgctggcag agctgtgctt taatacgctg atcgaagaag gtgaaaaagc gatgctggct 660

gcagagcagc acgtggttac accagcactg gagcgcgtta ttgaagccaa cacctatctg 720

agtggcgtcg gttttgaaag cggtggtctg gcagcggctc acgccattca taacggtctg 780

accgcaatcc cggatgcaca tcattattac cacggcgaga aagtggcttt cggtacgttg 840

acgcagttgg tgctggaaaa cgcacccgtc gatgaaattg aaaccgttgc cgcgctgtgc 900

cattccgttg gcttgccgat taccctggcg caactggaca tcaaacagga tattcaggcg 960

aaaatgcgca ttgtggctga ggcagcctgt gccgaaggcg aaaccatcca caacatgcct 1020

ggcggcgcaa cgccggacca ggtgtatgcc gccctgcttg tggctgacca gtacggtcaa 1080

cgttacctgc aagagtggga ataa 1104

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 5

atgctaaaag ttattcaatc tc 22

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 6

ccagcctaca ccgcggcagc cctgtttttg caaa 34

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 7

tccccggaat atcacggcga gaaagtggcc tt 32

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 8

ttaacgcgcc agccactgct ggc 23

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 9

ggctgccgcg gtgtaggctg gagctgcttc g 31

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 10

tcgccgtgat attccgggga tccgtcga 28

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 11

aagcttggct gttttggcg 19

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 12

gaattctgtt tcctgtgtga aattg 25

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 13

tcacacagga aacagaattc atggatcgca ttattcaatc ac 42

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 14

ccgccaaaac agccaagctt ttattcccat tcctgcagga agc 43

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 15

atgctaaaag ttattcaatc tc 22

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 16

ccagcctaca gccgcgacag ccgtgctgtt tc 32

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 17

tccccggaaa tttgtaccac ggtgaaaaag t 31

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 18

ttaacgcgcc agccactgct gc 22

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 19

ctgtcgcggc tgtaggctgg agctgcttcg 30

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 20

gtggtacaaa tttccgggga tccgtcga 28

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 21

tcacacagga aacagaattc atggatcgca ttattcaatc ac 42

<210> 22

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 22

ccgccaaaac agccaagctt ttattcccac tcttgcaggt aacg 44

Claims

1.提升1,3-丙二醇生产菌株性能的工程菌，其特征在于：该工程菌通过人工操作消除1,3-丙二醇生产菌株中dhaD编码的甘油脱氢酶活性，同时提升gldA编码的甘油脱氢酶活性，所述的1,3-丙二醇生产菌株选自克雷伯氏菌、弗氏柠檬酸菌。

2.如权利要求1所述的提升1,3-丙二醇生产菌株性能的工程菌，其特征在于：所述消除1,3-丙二醇生产菌株中dhaD编码的甘油脱氢酶活性的方法采用通过分子生物学操作将菌株染色体上的dhaD基因破坏。

3.如权利要求1所述的提升1,3-丙二醇生产菌株性能的工程菌，其特征在于：所述消除同时提升gldA编码的甘油脱氢酶活性的方法采用分子生物学操作将gldA基因进行高水平表达。

4.如权利要求1-3任一项所述的提升1,3-丙二醇生产菌株性能的工程菌在生产1,3-丙二醇中的应用。