CN109355240A - 一种重组克雷伯氏肺炎杆菌及其应用 - Google Patents

一种重组克雷伯氏肺炎杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组克雷伯氏菌肺炎杆菌及其应用。本发明的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌PdhR基因编码的蛋白功能失活，将该菌用于发酵甘油生产1,3‑丙二醇，能够提高厌氧或微氧条件下1，3‑丙二醇的产量和得率，有效减低发酵成本，在1，3‑丙二醇生产领域具有良好的应用前景。

Description

一种重组克雷伯氏肺炎杆菌及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和微生物发酵技术领域，具体地说，本发明涉及一种PdhR基因失活的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌及其在发酵甘油提高1,3-丙二醇产量或得率中的应用。
背景技术
1,3-丙二醇是一种重要的二元醇，主要用作单体与对苯二甲酸聚合生产新型的聚酯材料聚对苯二甲酸丙二醇脂(PTT)。1，3-丙二醇可以通过微生物发酵的方法，利用天然的微生物如克雷伯氏肺炎杆菌、丁酸梭菌等将甘油转化成1，3-丙二醇。由于克雷伯氏肺炎杆菌具有甘油代谢速率快、1，3-丙二醇产量高，能够耐受高浓度甘油和1，3-丙二醇，且发酵过程能在有氧的条件下等特点，目前已经被广泛应用于1，3-丙二醇的工业生产。
目前利用克雷伯氏肺炎杆菌生产1，3-丙二醇主要存在的问题是1，3-丙二醇对甘油的得率低，副产物多，增加了发酵过程的原料成本。因此，降低副产物的产量，提高1，3-丙二醇的得率对于降低1，3-丙二醇生产成本具有极其重要的意义。目前，文献报道的提高1，3-丙二醇产量和得率的方法都集中在敲除副产物如乙醇、乳酸的合成途径上，还没有文献报道可以通过调控转录因子提高1，3-丙二醇的产量和得率。
PdhR是调控丙酮酸脱氢酶和氧化磷酸化的转录调控因子。2013年，郑庆祥对希瓦氏菌中转录因子PdhR的功能及其调控机制进行了研究，发现PdhR缺失突变株中乙醛酸途径的代谢通量为零，阐明了由于缺乏乙醛酸途径的活性而导致PdhR缺失突变株在以乙酸为惟一碳源的条件下不能生长；进而发现PdhR对于中心碳代谢途径具有双重调控模式：抑制丙酮酸和甲酸代谢相关基因的表达，而激活乙酸代谢基因的表达机制，从而为对希瓦氏菌这类微生物的利用和开发提供理论依据。然而对于克雷伯氏肺炎杆菌中PdhR的具体作用机制，现有技术未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高1，3-丙二醇的产量和得率的方法。
本发明通过获得一种重组克雷伯氏菌肺炎杆菌发酵甘油从而提高了1，3-丙二醇的产量和得率。
本发明提供的一种PdhR基因失活的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌。
优选地，本发明提供的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌的PdhR基因敲除或PdhR基因的部分碱基缺失、替换或增加从而导致PdhR基因编码的蛋白功能失活。
进一步地，所述PdhR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.1所示核苷酸序列缺失、替换或增加一个或多个碱基而保持相同功能的DNA序列。
本发明提供了所述的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌的制备方法，包括步骤：
(1)以克雷伯氏菌肺炎杆菌基因组为模板，以SEQ ID NO.2-3所示的引物进行PCR，获得PdhR基因上游的DNA片段；
(2)以克雷伯氏菌肺炎杆菌基因组为模板，以SEQ ID NO.4-5所示的引物进行PCR，获得PdhR基因下游的DNA片段；
(3)以抗生素抗性基因的DNA片段、步骤(1)、(2)获得的DNA片段这三个DNA片段为模板，以SEQ ID NO.8-9所示的引物进行重叠PCR，纯化扩增产物；
(4)重组质粒电转入克雷伯氏肺炎杆菌中，再将步骤(3)获得的扩增产物电转到前述克雷伯氏肺炎杆菌中；
(5)在与步骤(3)抗生素抗性基因相同的抗生素筛选培养基中筛选带抗性的菌株，通过菌落PCR验证正确的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌。
在本发明的优选实施例中，步骤(3)选择的抗性基因片段为安普霉素抗性基因，是以质粒pIJ773为模板，以SEQ ID NO.6-7为引物进行PCR扩增获得的长度1.4kb的DNA片段。相应地，步骤(5)筛选培养基为含有50mg/L安普霉素的LB培养基。
上述制备方法仅为制备本发明PdhR基因失活的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌中的一种，本领域技术人员基于本发明的核心关键点，能够设计不同的方法来获得PdhR基因失活的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌，而不仅仅限于本发明提供的方法。
进一步地，PdhR表达抑制剂在发酵甘油提高1,3-丙二醇产量或得率中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明提供了所述的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌在生产1,3-丙二醇中的应用。
本发明提供了所述的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌在发酵甘油提高1,3-丙二醇产量或得率中的应用。
具体地，本发明提供了一种生产1,3-丙二醇的方法，以PdhR基因失活的微生物为发酵菌株，发酵甘油生产1,3-丙二醇。
所述PdhR基因失活的微生物是敲除了PdhR基因的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌，所述PdhR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与该序列具有90％同源性的DNA序列。
优选地，控制发酵液的pH为6.5，当发酵液中甘油浓度低于5g/L时流加甘油使其维持在10-20g/L之间。
本发明首次报道了PdhR基因缺失的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌用于发酵甘油生产1,3-丙二醇，能够提高厌氧或微氧条件下1，3-丙二醇的产量和得率，有效减低发酵成本，在1，3-丙二醇生产领域具有良好的应用前景。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1敲除克雷伯氏肺炎杆菌中调控丙酮酸脱氢酶和氧化磷酸化的转录调控因子PdhR
以克雷伯氏肺炎杆菌ACR30(该菌的保藏编号为CGMCC NO.7824，已在中国专利CN103740609A中公开)的基因组为模板，以引物PdhR_up-F(ttcgttaatgattttgccgttaccgg，SEQ ID NO.2)和PdhR_up-R(tccagcctacagcgccatttttagagcgcg，SEQ ID NO.3)为引物进行PCR，获得PdhR基因上游约1.0kb的DNA片段并进行PCR产物纯化。
以克雷伯氏肺炎杆菌ACR30的基因组为模板，以引物PdhR_down-F(gatccccggaatattccctgtctctgccattagcc,SEQ ID NO.4)和PdhR_down-R(ccaccagaactggatatatttgccaac，SEQ ID NO.5)为引物进行PCR，获得PdhR基因下游约1.0kb的DNA片段并进行PCR产物纯化。
以质粒pIJ773(Journal of Industrial Microbiology 39(8):1219-26)为模板，以引物Apr-F(aaaatggcgctgtaggctggagctgcttcg,SEQ ID NO.6)和Apr-R(agagacagggaatattccggggatccgtcgac，SEQ ID NO.7)为引物进行PCR，获得安普霉素抗性基因约1.4kb的DNA片段并进行PCR产物纯化。
以上面获得的三段PCR产物为模板，以PdhR_up-F(ttcgttaatgattttgccgttaccgg,SEQ ID NO.8)和PdhR_down-R(ccaccagaactggatatatttgccaac，SEQ ID NO.9)为引物进行重叠PCR，获得约3.4kb的DNA片段并进行PCR产物纯化。
将包含λ噬菌体Red重组酶系统的质粒pDK-red(Journal of IndustrialMicrobiology 39(8):1219-26)电转入克雷伯氏肺炎杆菌ACR30中，获得的菌株命名为ACR30/pDK-red。
将上述获得的3.4kb重叠PCR产物电转到克雷伯氏肺炎杆菌ACR30/pDK-red，在带有50mg/L安普霉素的LB平板上筛选带有抗性的菌株。进一步利用PdhR_up-F(ttcgttaatgattttgccgttaccgg，SEQ ID NO.10)和PdhR_down-R(ccaccagaactggatatatttgccaac，SEQ ID NO.11)为引物对筛选的菌株进行菌落PCR验证，正确的菌株可以获得约3.4kb的PCR片段，而未突变的菌株可以获得约2.8kb的PCR片段，将正确的菌株命名为ACR30—ΔPdhR。
实施例2利用缺失PdhR基因的重组克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丙二醇
将对照菌株ACR30、ACR30/pDK-red以及实施例1制得的敲除了PdhR基因的重组菌株ACR30—ΔPdhR分别在5L发酵罐中进行流加发酵培养，培养温度为37℃，转速250rpm，转速为0.5vvm，利用NaOH控制发酵液的pH为6.5，当发酵液中甘油浓度低于5g/L时流加甘油使其维持在10-20g/L之间，发酵过程中不断取样检测1,3-丙二醇的产量。
发酵培养基的成分为(g/L)：甘油20，(NH4)2SO4 4.0,K2HPO4 0.85,MgSO4 0.2,FeSO4 0.005,酵母粉1.5，微量元素1ml。其中微量元素的组成为(mg/L):MnSO4·4H2O 100,CoCl2·6H2O 200,ZnCl2 70，NaMoO4·2H2O35,H2BO3 60,CuSO4·5H2O 29,NiCl2·6H2O 25,浓盐酸：0.9mL。
发酵进行48小时时，液相色谱检测结果显示，对照菌株ACR30/pDK-red共产生90g/L的1,3-丙二醇，1，3-丙二醇的得率为0.48g/g甘油；
对照菌ACR30共产生92g/L的1,3-丙二醇，1，3-丙二醇的得率为0.49g/g甘油。
而本发明的重组菌ACR30-ΔPdhR共产生96g/L的1，3-丙二醇，1，3-丙二醇的得率为0.56g/g甘油。
发酵进行72小时后结束，液相色谱检测结果显示，对照菌株ACR30/pDK-red共产生114g/L的1,3-丙二醇，1，3-丙二醇的得率为0.45g/g甘油；对照菌ACR30共产生116g/L的1,3-丙二醇，1，3-丙二醇的得率为0.46g/g甘油。
而本发明的重组菌ACR30-ΔPdhR共产生122g/L的1，3-丙二醇，1，3-丙二醇的得率为0.54g/g甘油。
因此，通过失活PdhR可以有效的提高1，3-丙二醇的产量和得率。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 清华大学 广东清大智兴生物技术有限公司
<120> 一种重组克雷伯氏肺炎杆菌及其应用
<130> KHP181117019.9
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 780
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcctaca gcaaaatccg ccaaccaaaa ttatccgatg tgatagagca gcagctggag 60
tttctgattc ttgaggggac cttgcgcccc ggtgaaaaac tcccgccaga acgcgaactg 120
gctaaacagt tcgacgtttc ccgcccctcg ctgcgtgagg cgattcaacg cctcgaagcc 180
aagggcttgt tgcttcgtcg tcagggaggt ggaacgtttg ttcagagccg cctgtggcag 240
agcttcagcg atccgctggt tgagctgctg tccgatcacc ctgaatccca attcgatctg 300
cttgagaccc gtcacgcgct ggaaggcatc gcggcctatt acgcggcgct gcgcagcaat 360
gatgaggatc gcgaccgtat ccgtgagctg catcaggcta ttgaacgcgc tcagcagtcg 420
ggtgatttgg acgctgagtc cggcgccgtc gtccagtatc aaatcgccgt caccgaggcg 480
gcacacaatg tggtgttgct tcatctgcta aggtgtatgg agccgatgtt ggcgcaaaac 540
gtgcgtcaga actttgaatt gctgtatgcc cggcgggaaa tgctcccgtt ggtcagcaac 600
catcgcactc gcattttcga ggcgataatg gccggggagc cggagcaggc gcgtgaagcg 660
tcgcaccgtc acctggcgtt cattgaggaa attttgctgg atcgtagtcg tgagcagagc 720
cgtcgagagc gctcactgcg tcgtttacag caacgaaagg acgagaactc cggttcttaa 780
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcgttaatg attttgccgt taccgg 26
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 4
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<212> DNA
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<212> DNA
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ccaccagaac tggatatatt tgccaac 27

Claims (10)

1.一种重组克雷伯氏菌肺炎杆菌，其特征在于，该菌的PdhR基因失活。
2.如权利要求1所述的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌，其特征在于，该菌的PdhR基因敲除或PdhR基因的部分碱基缺失、替换或增加从而导致PdhR基因编码的蛋白功能失活。
3.如权利要求1或2所述的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌，所述PdhR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.1所示核苷酸序列缺失、替换或增加一个或多个碱基而保持相同功能的DNA序列。
4.权利要求1-3任一所述的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)以克雷伯氏菌肺炎杆菌基因组为模板，以SEQ ID NO.2-3所示的引物进行PCR，获得PdhR基因上游的DNA片段；
(2)以克雷伯氏菌肺炎杆菌基因组为模板，以SEQ ID NO.4-5所示的引物进行PCR，获得PdhR基因下游的DNA片段；
(3)以抗生素抗性基因的DNA片段、步骤(1)、(2)获得的DNA片段这三个DNA片段为模板，以SEQ ID NO.8-9所示的引物进行重叠PCR，纯化扩增产物；
(4)重组质粒电转入克雷伯氏肺炎杆菌中，再将步骤(3)获得的扩增产物电转到前述克雷伯氏肺炎杆菌中；
(5)在与步骤(3)抗生素抗性基因相同的抗生素筛选培养基中筛选带抗性的菌株，通过菌落PCR验证正确的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌。
5.PdhR表达抑制剂在发酵甘油提高1,3-丙二醇产量或得率中的应用。
6.权利要求1-3任一所述的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌在生产1,3-丙二醇中的应用。
7.权利要求1-3任一所述的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌在发酵甘油提高1,3-丙二醇产量或得率中的应用。
8.一种生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，以PdhR基因失活的微生物为发酵菌株，发酵甘油生产1,3-丙二醇。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PdhR基因失活的微生物是敲除了PdhR基因的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌，所述PdhR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与该序列具有90％同源性的DNA序列。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，控制发酵液的pH为6.5，当发酵液中甘油浓度低于5g/L时流加甘油使其维持在10-20g/L之间。
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