CN103740609A - 一株高产1,3-丙二醇的微生物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株高产1,3-丙二醇的微生物，具体公开了分离的微生物、生产PDO的方法及系统，其中，该分离的微生物为克雷伯肺炎杆菌，于2013年7月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.7824，保藏名称为ACR30。本发明的克雷伯肺炎杆菌，荚膜较薄，利用甘油发酵生产PDO的性能好、生产强度高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一株高产1,3-丙二醇的微生物，更具体地，本发明涉及分离的微生物、生产PDO的方法及系统。
背景技术
1,3-丙二醇（PDO）作为一种典型的二醇化合物，被广泛地应用于润滑剂、染料、油墨、防冻剂、溶剂和制药工业等行业，还可合成聚氨酯等聚合物。但是因生产成本问题，其使用规模还较小。
PDO生产方法可分为化学合成法和微生物发酵法。化学法路线是化工原料经过一系列化学催化反应最终合成PDO；生物法是指微生物利用可再生的原料甘油或者葡萄糖合成PDO。相对化学法工艺路线，微生物发酵法具有原料可再生、污染小和成本低等优点，故成为现在PDO的主要生产方法。但是，自然界中能够利用甘油为底物合成PDO的微生物，其发酵性能均较差，生产强度较低。其中，克雷伯氏菌属，尤其是克雷伯肺炎杆菌（Klebsiellapneumoniae）是其中PDO发酵性较好的。通常，野生的克雷伯肺炎杆菌（Klebsiellapneumoniae）发酵甘油生产PDO性能较低，不能满足于现代工业生产的需求。
因而，目前分离筛选PDO发酵性能好、生产强度高的克雷伯肺炎杆菌，以及利用其生产PDO方面的研究，意义重大。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种本发明分离筛选获得的PDO发酵性能好、生产强度高的克雷伯肺炎杆菌。另一个目的在于提出一种利用克雷伯肺炎杆菌高效生产PDO的方法和系统。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种分离的微生物，其于2013年7月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.7824，保藏名称为ACR30。根据本发明的实施例，该分离的微生物为克雷伯肺炎杆菌。
需要说明的是，普通克雷伯肺炎杆菌具有较厚的细胞荚膜，这容易导致发酵液粘度较大，从而增加发酵液后处理的难度，同时荚膜还是导致微生物致病性的主要因素之一，较厚的细胞荚膜更易致病。而发明人惊奇地发现，本发明分离筛选获得的上述克雷伯肺炎杆菌，荚膜较薄，利用甘油发酵生产PDO的性能好、生产强度非常高。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种生产PDO的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：于37摄氏度，150rpm条件下，利用种子培养基将本发明分离的微生物进行培养12小时，以便获得种子培养液；以及于37摄氏度，150-250rpm，空气0.5vvm条件下，利用发酵培养基将所述种子培养液进行发酵培养，并使发酵液的pH保持为6.8，以便生产所述PDO，其中，1L所述种子培养基中包含：2g硫酸铵；6.9g三水磷酸氢二钾；2.5g磷酸二氢钾；0.2g硫酸镁；1g酵母粉；30g甘油；2.0mL微量元素溶液；以及1.0mL铁溶液，1L所述发酵培养基中包含：4g硫酸铵；0.69g三水磷酸氢二钾；0.25g磷酸二氢钾；0.2g硫酸镁；1.5g酵母粉；30g甘油；1.5mL微量元素溶液；以及1.5mL铁溶液，每100mL种子培养基中接入所述分离的微生物的斜面菌苔1～5环，所述种子培养液与所述发酵培养基的体积比为1:100。发明人发现，利用本发明上述分离筛选获得的克雷伯肺炎杆菌，通过本发明的方法，能够高效地生产PDO，并且该方法简单易操作、成本低、生产效率高、污染少、发酵液粘度低、后续处理难度小。
根据本发明的再一方面，本发明的还提供了一种生产PDO的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：种子培养装置，所述种子培养装置用于在37摄氏度，150rpm条件下，利用种子培养基将本发明分离的微生物进行培养12小时，获得种子培养液；以及发酵培养装置，用于在37摄氏度，150-250rpm，空气0.5vvm条件下，利用发酵培养基将所述种子培养液进行发酵培养，并使发酵液的pH保持为6.8，以便生产所述PDO，其中，1L所述种子培养基中包含：2g硫酸铵；6.9g三水磷酸氢二钾；2.5g磷酸二氢钾；0.2g硫酸镁；1g酵母粉；30g甘油；2.0mL微量元素溶液；以及1.0mL铁溶液，1L所述发酵培养基中包含：4g硫酸铵；0.69g三水磷酸氢二钾；0.25g磷酸二氢钾；0.2g硫酸镁；1.5g酵母粉；20-50g甘油；1.5mL微量元素溶液；以及1.5mL铁溶液，所述种子培养液与所述发酵培养基的体积比为1:100。根据本发明的实施例，本发明的生产PDO的系统，非常适于生产实施上述本发明的生产PDO的方法。此外，发明人惊奇地发现，利用本发明分离筛选获得的克雷伯肺炎杆菌，通过本发明的系统，能够高效地生产PDO，并且该系统构造简单，生产及操作容易、生产成本低、生产效率高、污染少，且发酵液粘度低、后续易处理。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例，本发明的克雷伯肺炎杆菌的透射电子显微镜照片；
图2显示了根据本发明一个实施例，本发明的克雷伯肺炎杆菌5L发酵罐批次流加发酵实验的发酵曲线；
图3显示了根据本发明一个实施例，零下80摄氏度条件下保存12个月后的本发明的克雷伯肺炎杆菌5L发酵罐批次流加发酵实验的发酵曲线。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
微生物
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种分离的微生物，其于2013年7月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.7824，保藏名称为ACR30。根据本发明的实施例，该分离的微生物为克雷伯肺炎杆菌。
需要说明的是，普通克雷伯肺炎杆菌具有较厚的细胞荚膜，这容易导致发酵液粘度较大，从而增加发酵液后处理的难度，同时荚膜还是导致微生物致病性的主要因素之一，较厚的细胞荚膜更易致病。而发明人惊奇地发现，本发明分离筛选获得的上述克雷伯肺炎杆菌，荚膜较薄，利用甘油发酵生产PDO的性能好、生产强度非常高。
生产PDO的方法
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种生产PDO的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
首先，于37摄氏度，150rpm条件下，利用种子培养基将本发明的分离的微生物进行培养12小时，以便获得种子培养液。其中，1L所述种子培养基中包含：2g硫酸铵；6.9g三水磷酸氢二钾；2.5g磷酸二氢钾；0.2g硫酸镁；1g酵母粉；30g甘油；2.0mL微量元素溶液；以及1.0mL铁溶液，每100mL所述种子培养基中接入所述分离的微生物的斜面菌苔一到五环。根据本发明的实施例，进行所述培养12小时。由此，能够得到微生物浓度和菌活力都较好的培养物。
然后，于37摄氏度，150-250rpm，空气0.5vvm条件下，利用发酵培养基将所述种子培养液进行发酵培养，并使发酵液的pH保持为6.8，以便生产所述PDO。其中，1L所述发酵培养基中包含：4g硫酸铵；0.69g三水磷酸氢二钾；0.25g磷酸二氢钾；0.2g硫酸镁；1.5g酵母粉；30g甘油；1.5mL微量元素溶液；以及1.5mL铁溶液，所述种子培养液与所述发酵培养基的体积比为1:100。
根据本发明的一些实施例，本发明的种子培养基和发酵培养基的成分如下表1所示：
表1种子培养基和发酵培养基组成（1L）
| 组成 | 种子培养基 | 发酵培养基 |
| 硫酸铵（(NH4)2SO4） | 2g | 4g |
| 三水磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） | 6.9g | 0.69g |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | 2.5g | 0.25g |
| 硫酸镁（MgSO4） | 0.2g | 0.2g |
| 酵母粉（Yeast extract） | 1g | 1.5g |
| 甘油（glycerol） | 30g | 30g |
| 微量元素（Trace element solution） | 2.0mL | 1.5mL |
| 铁溶液（Fe2+solution） | 1.0mL | 1.5mL |
根据本发明的实施例，于摇瓶或发酵罐中进行所述发酵培养。根据本发明的一些具体示例，将所述摇瓶置于150rpm的摇床中进行所述发酵培养。根据本发明的另一些实施例，于所述发酵罐中进行所述发酵培养时，维持250rpm的搅拌转度。由此，能够高效地生产PDO。
根据本发明的实施例，向所述发酵液中添加浓度为40%的NaOH，以便使所述发酵液的pH保持为6.8。由此，能够得到更好的发酵结果。
根据本发明的实施例，所述微量元素的成分不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，1L所述微量元素溶液中包含：100mg四水硫酸锰；80mg氯化锌；40mg二水钼酸钠；60mg硼酸；300mg六水氯化钴；30mg五水硫酸铜；25mg六水氯化镍；以及0.9mL浓度为37%的浓盐酸。具体地，其成分如下表2所示：
表2微量元素溶液的组成（1L）
| 组分 | 含量 |
| 四水硫酸锰（MnSO4·4H2O） | 100mg |
| 氯化锌（ZnCl2） | 80mg |
| 二水钼酸钠（Na2MoO4·2H2O） | 40mg |
| 硼酸（H3BO3） | 60mg |
| 六水氯化钴（CoCl2·6H2O） | 300mg |
| 五水硫酸铜（CuSO4·5H2O） | 30mg |
| 六水氯化镍（NiCl2·6H2O） | 25mg |
| 浓盐酸（37%HCl） | 0.9mL |
根据本发明的实施例，所述铁溶液的成分不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，1L所述铁溶液中包含：5.0g FeSO4·H2O；以及4mL浓度为37%的浓盐酸。
根据本发明的实施例，本发明的生产PDO的方法，进一步包括：对所述PDO进行定量定性分析，优选采用高效液相色谱仪进行所述定量定性分析。由此，能够对PDO浓度进行准确地定量分析，同时对发酵液中其它物质也能准确地定量分析，有助于发酵数据的综合分析。
发明人发现，利用本发明上述分离筛选获得的克雷伯肺炎杆菌，通过本发明的方法，能够高效地生产PDO，并且该方法简单易操作、成本低、生产效率高、污染少、发酵液粘度低、后续处理难度小。
生产PDO的系统
根据本发明的再一方面，本发明的还提供了一种生产PDO的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：种子培养装置和发酵培养装置。
其中，所述种子培养装置用于在37摄氏度，150rpm条件下，利用种子培养基将本发明的分离的微生物进行培养12小时，获得种子培养液。其中，1L所述种子培养基中包含：2g硫酸铵；6.9g三水磷酸氢二钾；2.5g磷酸二氢钾；0.2g硫酸镁；1g酵母粉；30g甘油；2.0mL微量元素溶液；以及1.0mL铁溶液，每100mL种子培养基中接入所述分离的微生物的斜面菌苔一到五环。根据本发明的实施例，进行所述培养12小时。由此，能够得到微生物浓度和菌活力都较好的培养物。
所述发酵培养装置与所述种子培养装置相连，用于在37摄氏度，150-250rpm，空气0.5vvm条件下，利用发酵培养基将所述种子培养液进行发酵培养，并使发酵液的pH保持为6.8，以便生产所述PDO。其中，1L所述发酵培养基中包含：4g硫酸铵；0.69g三水磷酸氢二钾；0.25g磷酸二氢钾；0.2g硫酸镁；1.5g酵母粉；20-50g甘油；1.5mL微量元素溶液；以及1.5mL铁溶液，所述种子培养液与所述发酵培养基的体积比为1:100。
根据本发明的一些实施例，上述的种子培养基和发酵培养基的成分如前述的表1所示。
根据本发明的实施例，所述发酵培养装置为摇瓶或发酵罐。根据本发明的一些具体示例，当采用摇瓶作为发酵培养装置时，使所述摇瓶保持150rpm的转速。根据本发明的另一些实施例，当采用发酵罐作为发酵培养装置时，使所述发酵罐中的搅拌转度保持为250rpm。由此，能够使PDO发酵达到最好的发酵强度和发酵终浓度。
根据本发明的实施例，向所述发酵液中添加浓度为40%的NaOH，以便使所述发酵液的pH保持为6.8。由此，能够得到更好的发酵结果。
根据本发明的实施例，所述微量元素的成分不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，1L所述微量元素溶液中包含：100mg四水硫酸锰；80mg氯化锌；40mg二水钼酸钠；60mg硼酸；300mg六水氯化钴；30mg五水硫酸铜；25mg六水氯化镍；以及0.9mL浓度为37%的浓盐酸。具体地，其成分如上表2所示。
根据本发明的实施例，所述铁溶液的成分不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，1L所述铁溶液中包含：5.0g FeSO4·H2O；及4mL浓度为37%的浓盐酸。
根据本发明的实施例，本发明的生产PDO的系统，进一步包括：检测分析装置。根据本发明的实施例，所述检测分析装置与所述发酵培养装置相连，用于对所述的底物甘油和产物PDO进行定量定性分析。由此，能够有助于发酵参数的调控，进而得到更好的发酵结果。根据本发明的一些具体示例，所述检测分析装置为高效液相色谱仪。由此，能够对PDO浓度进行准确地定量分析，同时对发酵液中其它物质也能准确地定量分析，有助于发酵数据的综合分析。
根据本发明的实施例，本发明的生产PDO的系统，非常适于生产实施上述本发明的生产PDO的方法。此外，发明人惊奇地发现，利用本发明分离筛选获得的克雷伯肺炎杆菌，通过本发明的系统，能够高效地生产PDO，并且该系统构造简单，生产及操作容易、生产成本低、生产效率高、污染少，且发酵液粘度低、后续易处理。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
一般方法：
根据本发明的实施例，利用本发明的克雷伯肺炎杆菌生产PDO的一般方法如下：
（一）发酵
种子培养：将装有100mL种子培养基的250mL三角瓶用6层纱布或者商业封口膜封口，于120摄氏度下灭菌20分钟，冷却后接入克雷伯肺炎杆菌斜面菌苔1～5环，于37摄氏度，150rpm摇床中培养（约12小时），以便获得种子培养液。
摇瓶发酵培养：将1mL培养12小时的种子培养液接种入含有100mL发酵培养基的250mL揺瓶中，37摄氏度，150rpm摇床中培养24小时后进行高效液相色谱分析。
5L发酵罐培养：将种子培养液按照体积比1％接种到含有4L发酵培养基的发酵罐中，于37摄氏度，空气0.5vvm，搅拌转度250rpm，流加40%NaOH维持发酵液pH为6.8条件下进行发酵培养。
（二）PDO及其他发酵产品的分析方法
采用高效液相色谱分析定性和定量分析发酵液中的各种有机酸、糖类和醇类等代谢产物。
发酵液样品预处理：将发酵液利用小型离心机15000rpm离心5分钟，上清液用高纯水进行50或100倍稀释，即为液相色谱样。
仪器参数：液相色谱柱为A minex HPX-87H柱，柱温65摄氏度，流动相为0.005mol/LH2SO4，流速为0.8mL/min；检测器为CTO-10vp型折光示差检测器，进样量为20μL。
发酵液各组分含量通过标准曲线计算得到。
实施例1：克雷伯肺炎杆菌的分离筛选
1.材料：在北京随机采集土壤和河边污泥样品30份。
2.培养基：
（1）富集培养基（g·L-1）：
蛋白胨5.0，牛肉膏2.0，酵母粉3.0，NaCl3.0，K2HPO42.0，甘油60.0，乳酸钙15.0，0.4％溴甲酚紫2mL，pH7.0；
（2）分离培养基（g·L-1）：
蛋白胨5.0，牛肉膏2.0，酵母粉3.0，K2HPO42.0，甘油60.0，乳酸钙15.0，1％溴甲酚紫2mL，琼脂粉18，pH7.5；
（3）种子培养基及发酵培养基：配置方法见表1；
（4）斜面培养基（g·L-1）：酵母浸粉5，蛋白胨10，NaCl5，琼脂15，pH7.0。
3.分离方法
将1g土壤样品装入装有50mL富集培养基的250mL三角瓶中，瓶口用六层纱布封口。37摄氏度，150rpm摇床培养48小时，获得一级培养物；然后将0.1mL一级培养物接种到另一个含有富集培养基三角瓶中，同样条件培养48小时；同样条件下第三次富集。
在富集培养过程中培养基浑浊且由紫变黄，通过比色留取颜色变黄明显的富集培养液10份，用无菌水稀释，取0.5mL稀释液涂布于分离培养基平板上，37摄氏度恒温培养48小时，然后挑选出长势良好、菌落周围黄色明显、透明圈大的菌落80株微生物。
4.筛选实验采用摇瓶发酵实验对上述分离获得的80株克雷伯肺炎杆菌进行筛选，具体方法如下：
将菌种转接至斜面培养基，37摄氏度下培养12小时；然后接入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，瓶口用六层纱布封口，37摄氏度，150rpm摇床中进行液体种子培养12小时，然后将种子培养液接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，同样条件进行发酵培养48小时。并用高效液相色谱分析检测发酵液中PDO浓度，从中选出产量较高的菌株15株。
将上述选出的PDO产量较高的菌株种子液按1%接种量接入装有4L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵维持37摄氏度，pH值6.8，发酵开始6小时后流加纯甘油补充碳源，过程中用液谱检测甘油及PDO浓度，发酵6～20小时，甘油浓度维持在10g/L以下，其后维持在20g/L左右。其中，发酵过程中通入空气，通气量0.5vvm，发酵罐搅拌转速250rpm。发酵72小时结束。结果，用液谱检测得到3株高产PDO的菌株，其中最高一株菌的发酵液中含有PDO浓度为116g/L，2,3-丁二醇浓度为32g/L，随后用气谱检测再次确定了产物为PDO，将此株高产菌株命名为ACR30。
5.菌株检测
对上述分离得到的克雷伯肺炎杆菌菌株ACR30进行染色镜检，其为杆状细菌，革兰氏阴性菌。接着，对该菌株进行16S rRNA测序和微生物生理生化鉴定，结果表明上述分离筛选获得的菌株ACR30为克雷伯肺炎杆菌。该菌株于2013年7月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.7824，保藏名称为ACR30。
实施例2：透射电子显微镜实验
将实施例1中分离筛选获得的克雷伯肺炎杆菌ACR30接种至LB固体培养基，37摄氏度条件下培养24小时，然后将培养获得的菌落置于透射电子显微镜（日本日立公司，H-7650B）下进行观察。其中，该透射电子显微镜的参数如下：分辨率：0.2nm（晶格像），加速电压：40kV～120kV，连续放大模式：x200～x600,000，低倍模式：x50～x1,000。结果见图1。
图1显示了本发明的克雷伯肺炎杆菌的透射电子显微镜照片。由图1可以看出，本发明的克雷伯肺炎杆菌荚膜较薄，具有更透亮的菌落，进而，证明本发明的菌株ACR30利用甘油发酵生产PDO的性能好、生产强度非常高。
实施例3：发酵液粘度实验
按照以下步骤，对实施例1中获得的本发明的克雷伯肺炎杆菌ACR30和对照菌AC521的发酵液粘度进行比较：
将实施例1中获得的克雷伯肺炎杆菌ACR30与对照菌AC521培养物用去离子水配置为OD600nm为10的样品液。采用内径为1.2mm的乌氏粘度计，在水温为30摄氏度的水浴锅中测量两组样品液的粘度和过滤速度。
实验结果如下表3所示。
表3本发明的菌种ACR30与对照菌AC521的粘度和过滤速度
| 对照菌AC521 | 本发明的菌种ACR30 | |
| 粘度（mPa.S） | 1.72 | 1.43 |
| 过滤速度L.h-1.m-2) | 171 | 298 |
由表3的结果可以看出，本发明的菌种ACR30的粘度明显低于对照菌AC521，过滤速度明显高于对照菌AC521。由此，进一步证明了利用本发明的生产PDO的方法生产PDO时，发酵液粘度低，后续处理难度小。此外，本发明的菌种ACR30具有更低的粘度和更快的过滤速度，进一步表明其具有更薄的细胞荚膜。
实施例4：5L发酵罐批次流加发酵实验
将实施例1中获得的本发明的克雷伯肺炎杆菌ACR30菌种液涂布于LB固体斜面培养基上，37摄氏度条件下静置培养12小时，获得LB固体斜面菌苔。在每100mL所述种子培养基中接入所述LB固体斜面菌苔一到五环，于37摄氏度，150rpm条件下培养约12小时以便获得种子培养液。然后把种子培养液按照1%体积比接种到装有4L发酵培养基的5L发酵罐（赛多利斯公司）中，发酵培养基提前经蒸汽灭菌后冷却到37摄氏度。接着于37摄氏度，250rpm，空气0.5vvm，维持pH为6.8条件下进行发酵培养。发酵过程中，每隔1-2小时取发酵液进行高效液相色谱分析，控制底物甘油浓度在2-25g/L范围内。
发酵结果如图2所示。由图2可知，本发明的菌种ACR30的正常发酵罐实验，发酵72小时PDO浓度达到116g/L，是现在野生菌发酵甘油生产PDO的最高报道记录，表明利用本发明的菌种ACR30，通过本发明的生产PDO的方法和本发明的生产PDO的系统，能够高效地生产PDO。
实施例5低温保存12个月后的5L发酵罐批次流加发酵实验
将于零下80摄氏度保存12个月的实施例1中获得的本发明的克雷伯肺炎杆菌ACR30，涂LB固体培养基平板，30摄氏度下静置培养12小时。然后，按照实施例4所述的发酵罐操作方法进行发酵试验。发酵结果如图3所示。
由图3可知，低温保存12个月后，本发明的菌种ACR30在5L发酵罐批次流加发酵实验中，发酵72小时PDO浓度仍超过100g/L，说明本发明的菌种ACR30发酵性能具有良好的稳定性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种分离的微生物，其于2013年7月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.7824，保藏名称为ACR30。
2.根据权利要求1所述的分离的微生物，所述微生物为克雷伯肺炎杆菌。
3.一种生产PDO的方法，其特征在于，包括：
于37摄氏度，150rpm条件下，利用种子培养基将权利要求1或2所述的分离的微生物进行培养，以便获得种子培养液；以及
于37摄氏度，150-250rpm，空气0.5vvm条件下，利用发酵培养基将所述种子培养液进行发酵罐培养，并使发酵液的pH保持为6.8，以便生产所述PDO，
其中，
1L所述种子培养基中包含：
2g硫酸铵；
6.9g三水磷酸氢二钾；
2.5g磷酸二氢钾；
0.2g硫酸镁；
1g酵母粉；
30g甘油；
2.0mL微量元素溶液；以及
1.0mL铁溶液，
1L所述发酵培养基中包含：
4g硫酸铵；
0.69g三水磷酸氢二钾；
0.25g磷酸二氢钾；
0.2g硫酸镁；
1.5g酵母粉；
30g甘油；
1.5mL微量元素溶液；以及
1.5mL铁溶液，
每100mL所述种子培养基中接入所述分离的微生物的斜面菌苔1～5环，
所述种子培养液与所述发酵培养基的体积比为1:100。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，进行所述培养12小时。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，于摇瓶或发酵罐中进行所述发酵培养，
任选地，将所述摇瓶置于150rpm的摇床中进行所述发酵培养，
任选地，于所述发酵罐中进行所述发酵培养时，维持250rpm的搅拌转度，
任选地，向所述发酵液中流加浓度为40%的NaOH，以便使所述发酵液的pH保持为6.8。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，1L所述微量元素溶液中包含：
100mg四水硫酸锰；
80mg氯化锌；
40mg二水钼酸钠；
60mg硼酸；
300mg六水氯化钴；
30mg五水硫酸铜；
25mg六水氯化镍；以及
0.9mL浓度为37%的浓盐酸，
任选地，1L所述铁溶液中包含：
5.0g FeSO4·H2O；以及
4mL浓度为37%的浓盐酸。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，进一步包括：
对所述PDO进行定量定性分析，优选采用高效液相色谱仪进行所述定量定性分析。
8.一种生产PDO的系统，其特征在于，包括：
种子培养装置，所述种子培养装置用于在37摄氏度，150rpm条件下，利用种子培养基将权利要求1或2所述的分离的微生物进行培养12小时，获得种子培养液；以及
发酵培养装置，所述发酵培养装置与所述种子培养装置相连，用于在37摄氏度，150-250rpm，空气0.5vvm条件下，利用发酵培养基将所述种子培养液进行发酵培养，并使发酵液的pH保持为6.8，以便生产所述PDO，
其中，
1L所述种子培养基中包含：
2g硫酸铵；
6.9g三水磷酸氢二钾；
2.5g磷酸二氢钾；
0.2g硫酸镁；
1g酵母粉；
30g甘油；
2.0mL微量元素溶液；以及
1.0mL铁溶液，
1L所述发酵培养基中包含：
4g硫酸铵；
0.69g三水磷酸氢二钾；
0.25g磷酸二氢钾；
0.2g硫酸镁；
1.5g酵母粉；
20-50g甘油；
1.5mL微量元素溶液；以及
1.5mL铁溶液，
所述种子培养液与所述发酵培养基的体积比为1:100。
9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于，进行所述培养12小时，
任选地，所述发酵培养装置为摇瓶或发酵罐，
任选地，当采用摇瓶作为发酵培养装置时，使所述摇瓶保持150rpm的转速，
任选地，当采用发酵罐作为发酵培养装置时，使所述发酵罐中的搅拌转度保持为250rpm，
任选地，向所述发酵液中流加浓度为40%的NaOH，以便使所述发酵液的pH保持为6.8。
10.根据权利要求8所述的系统，其特征在于，1L所述微量元素溶液中包含：
100mg四水硫酸锰；
80mg氯化锌；
40mg二水钼酸钠；
60mg硼酸；
300mg六水氯化钴；
30mg五水硫酸铜；
25mg六水氯化镍；以及
0.9mL浓度为37%的浓盐酸，
任选地，1L所述铁溶液中包含：
5.0g FeSO4·H2O；以及
4mL浓度为37%的浓盐酸，
任选地，进一步包括：
检测分析装置，所述检测分析装置与所述发酵培养装置相连，用于对所述PDO进行定量定性分析，
任选地，所述检测分析装置为高效液相色谱仪。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104388476A (zh) * | 2014-12-01 | 2015-03-04 | 华东理工大学 | 一种高效率、高转化率生产1,3-丙二醇的方法 |
| CN104762239A (zh) * | 2015-04-24 | 2015-07-08 | 张家港美景荣化学工业有限公司 | 一种克雷伯氏肺炎杆菌及其应用和一种生产1,3-丙二醇的方法 |
| CN105400831A (zh) * | 2015-12-07 | 2016-03-16 | 清华大学 | 利用重组谷氨酸棒杆菌联产1，3-丙二醇和谷氨酸的方法 |
| CN107384975A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-11-24 | 张家港美景荣化学工业有限公司 | 生物安全变栖克雷伯氏菌及其在1,3‑丙二醇生产中的应用 |
| CN109251869A (zh) * | 2018-06-21 | 2019-01-22 | 湖南省林业科学院 | 一株高效利用粗甘油生产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌 |
| CN109355240A (zh) * | 2018-10-30 | 2019-02-19 | 清华大学 | 一种重组克雷伯氏肺炎杆菌及其应用 |
| CN112280723A (zh) * | 2019-07-23 | 2021-01-29 | 清华大学 | 联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1189854A (zh) * | 1995-05-12 | 1998-08-05 | 纳幕尔杜邦公司 | 利用单一微生物将可发酵碳源生物转化为1,3－丙二醇 |
| CN1763210A (zh) * | 2005-10-20 | 2006-04-26 | 清华大学 | 微生物好氧发酵生产1,3－丙二醇的方法 |
| WO2010079500A2 (en) * | 2008-02-28 | 2010-07-15 | Reliance Life Sciences Pvt. Ltd | Aerobic production of 1,3-propanediol from crude glycerol from biodiesel process. |
-
2013
- 2013-12-16 CN CN201310688092.2A patent/CN103740609B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1189854A (zh) * | 1995-05-12 | 1998-08-05 | 纳幕尔杜邦公司 | 利用单一微生物将可发酵碳源生物转化为1,3－丙二醇 |
| CN1763210A (zh) * | 2005-10-20 | 2006-04-26 | 清华大学 | 微生物好氧发酵生产1,3－丙二醇的方法 |
| WO2010079500A2 (en) * | 2008-02-28 | 2010-07-15 | Reliance Life Sciences Pvt. Ltd | Aerobic production of 1,3-propanediol from crude glycerol from biodiesel process. |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FATMA GIZEM AVCI等: "The effects of cell recycling on the production of 1,3-propanediol", 《BIOPROCESS BIOSYST ENG》, 28 July 2013 (2013-07-28), pages 514 * |
| MINE GUNGORMUSLER等: "Effect of cell immobilization on the production of 1,3-propanediol", 《NEW BIOTECHOLOGY》, vol. 30, no. 6, 30 September 2013 (2013-09-30), pages 623 - 628 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104388476A (zh) * | 2014-12-01 | 2015-03-04 | 华东理工大学 | 一种高效率、高转化率生产1,3-丙二醇的方法 |
| CN104388476B (zh) * | 2014-12-01 | 2017-09-15 | 华东理工大学 | 一种高效率、高转化率生产1,3‑丙二醇的方法 |
| CN104762239A (zh) * | 2015-04-24 | 2015-07-08 | 张家港美景荣化学工业有限公司 | 一种克雷伯氏肺炎杆菌及其应用和一种生产1,3-丙二醇的方法 |
| CN104762239B (zh) * | 2015-04-24 | 2017-12-15 | 张家港美景荣化学工业有限公司 | 一种克雷伯氏肺炎杆菌及其应用和一种生产1,3‑丙二醇的方法 |
| CN105400831A (zh) * | 2015-12-07 | 2016-03-16 | 清华大学 | 利用重组谷氨酸棒杆菌联产1，3-丙二醇和谷氨酸的方法 |
| CN107384975A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-11-24 | 张家港美景荣化学工业有限公司 | 生物安全变栖克雷伯氏菌及其在1,3‑丙二醇生产中的应用 |
| CN107384975B (zh) * | 2017-08-10 | 2019-09-24 | 张家港美景荣化学工业有限公司 | 生物安全变栖克雷伯氏菌及其在1,3-丙二醇生产中的应用 |
| CN109251869A (zh) * | 2018-06-21 | 2019-01-22 | 湖南省林业科学院 | 一株高效利用粗甘油生产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌 |
| CN109355240A (zh) * | 2018-10-30 | 2019-02-19 | 清华大学 | 一种重组克雷伯氏肺炎杆菌及其应用 |
| CN112280723A (zh) * | 2019-07-23 | 2021-01-29 | 清华大学 | 联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用 |
| CN112280723B (zh) * | 2019-07-23 | 2022-08-19 | 清华大学 | 联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用 |
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