CN113322191B - 一株用于制备纳米银的黑曲霉菌hq-1及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株用于制备纳米银的黑曲霉菌HQ‑1，分类命名为黑曲霉菌（Aspergillus niger），于2021年04月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22415，保藏地址：北京市朝阳区北辰路1号院3号。所述的黑曲霉菌HQ‑1在制备纳米银中的应用；本发明黑曲霉菌HQ‑1是筛选出的新的菌株，能够实现简便、高效、低成本的合成纳米银，制备过程中不牵涉到有毒有害的化学试剂，安全环保，对制备纳米银的研究扩展提供技术支持，有显著的社会和经济效益。

Description

一株用于制备纳米银的黑曲霉菌HQ-1及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是一株用于制备纳米银的黑曲霉菌HQ-1及其应用。
背景技术
众所周知，银是一种强效的杀菌抗菌材料，特别是纳米银粒子，由于具有独特的物理化学性质，目前被广泛用于航天、电子、光学、生化、医学等众多领域，在实际生活中，已经发展出多种制备纳米银材料的方法，主要分为化学制备法、物理制备法和生物制备法，其中以化学法为主要制备方式。但化学制备法在制备过程中需要用到多种化学试剂，比如柠檬酸钠、抗坏血酸、乙二胺、丙三醇等，反应过程复杂，且容易造成环境污染；物理制备法多是利用高速破碎、激光脉冲或高压电离等方式制备得到纳米银，此法对仪器的要求比较高，并且能耗大，成本高；而生物制备法因其制备过程简单，不涉及高能精密的大型仪器，并且具有安全环保等优点，逐渐受到大众的青睐。
生物制备法除了植物提取液制备纳米银之外，还有利用微生物发酵的方式制备纳米银。利用芽孢杆菌发酵生产还原酶制备纳米银，以及利用曲霉的粗酶液合成纳米银均有相关研究，并且制备纳米银的大小在10nm左右。大量细菌和一些真菌都具有发酵制备纳米银的能力，但需要指出的是，在很大程度上，多数真菌相对于细菌的培养条件更简单，生长旺盛，菌丝体和发酵液易于分离，便于实验操作，因此，寻找一株安全环保并且能高效制备纳米银的真菌菌株是研究解决的关键技术问题。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一株用于制备纳米银的黑曲霉菌HQ-1及其应用，可有效解决不能安全环保并且高效制备纳米银的问题。
为实现上述目的，本发明解决的技术方案是，一株用于制备纳米银的黑曲霉菌HQ-1，分类命名为黑曲霉菌（Aspergillus niger），于2021年04月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22415，保藏地址：北京市朝阳区北辰路1号院3号。
所述的黑曲霉菌HQ-1在制备纳米银中的应用。
所述黑曲霉菌HQ-1制备纳米银的方法，包括以下步骤：
（1）、取黑曲霉菌HQ-1在23℃-27℃条件下，接种到PDA固体培养基上培养，培养5-10天后，黑曲霉菌丝长满平板培养基的表面，用无菌水冲洗平板培养皿，收集得到黑曲霉菌的孢子液，-80℃保藏；
所述的PDA固体培养基pH为5.5~7.0；
（2）、吸取200μL黑曲霉HQ-1的孢子液涂布到PDA固体培养基上，置于24℃-26℃恒温培养箱中静置培养，培养3-5天后，PDA固体培养基上长出黑曲霉的菌丝，用无菌牙签挑取菌丝转入100mL 改良PDB培养基中，置于23℃-27℃，150rpm的恒温摇床中保持3-5天，用滤纸过滤得到黑曲霉的菌丝体；
所述的改良PDB培养基是由马铃薯浸粉3.0 g、葡萄糖 20.0 g，溶于1L去离子水中制得，pH为6.0~7.5；
（3）、将黑曲霉的菌丝体用无菌蒸馏水清洗3-4次，去除黑曲霉菌丝生物量中的PDB培养基成分，将滤得的黑曲霉菌丝体加入到100mL无菌蒸馏水中浸泡，在25℃，150rpm的条件下培养24h，之后用滤纸过滤得到菌丝浸泡液，即黑曲霉的二次发酵液；
（4）、取100mL黑曲霉的二次发酵液，与1.0 mL的100mM 的AgNO3溶液在250 mL锥形瓶中混合，然后放入25℃的恒温培养箱，光照强度1000-5000lux条件下照射5-9d，合成纳米银。
本发明黑曲霉菌HQ-1是筛选出的新的菌株，能够实现简便、高效、低成本的合成纳米银，制备过程中不牵涉到有毒有害的化学试剂，安全环保，对制备纳米银的研究扩展提供技术支持，有显著的社会和经济效益。
附图说明
图1是本发明黑曲霉菌丝的显微镜观察图。
图2是本发明黑曲霉菌的系统进化树图。
图3是本发明纳米银溶液的紫外全波长扫描（Uv-Vis）图。
图4是本发明纳米银溶液的透射电镜（TEM）图。
图5是本发明纳米银溶液的动态光散射（DLS）粒径图。
图6是本发明纳米银溶液的Zeta电位图。
具体实施方式
以下结合附图和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明黑曲霉菌（Aspergillus niger）HQ-1是从郑州市金水区东风渠河道边的一处土壤样品中筛选得到的，其间通过不断增加培养基中硝酸银的浓度，纯化培养得到耐银的真菌菌株--黑曲霉菌HQ-1，分类命名为黑曲霉菌（Aspergillus niger），于2021年04月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22415，保藏地址：北京市朝阳区北辰路1号院3号。
该菌株在制备纳米银中的应用。
黑曲霉菌HQ-1制备纳米银的方法由以下实施例给出。
实施例1
本发明黑曲霉菌HQ-1制备纳米银的方法，包括以下步骤：
（1）、取黑曲霉菌HQ-1在23℃条件下，接种到PDA固体培养基上培养，培养10天后，黑曲霉菌丝长满平板培养基的表面，用无菌水冲洗平板培养皿，收集得到黑曲霉菌的孢子液，-80℃保藏；
所述的PDA固体培养基pH为5.5；
（2）、吸取200μL黑曲霉HQ-1的孢子液涂布到PDA固体培养基上，置于24℃恒温培养箱中静置培养，培养5天后，PDA固体培养基上长出黑曲霉的菌丝，用无菌牙签挑取菌丝转入100mL 改良PDB培养基中，置于23℃，150rpm的恒温摇床中保持5天，用滤纸过滤得到黑曲霉的菌丝体；
所述的改良PDB培养基pH为6.0；
（3）、将黑曲霉的菌丝体用无菌蒸馏水清洗3次，去除黑曲霉菌丝生物量中的PDB培养基成分，将滤得的黑曲霉菌丝体加入到100mL无菌蒸馏水中浸泡，在25℃，150rpm的条件下培养24h，之后用滤纸过滤得菌丝浸泡的黑曲霉的二次发酵液；
（4）、取100mL黑曲霉的二次发酵液，与1.0 mL的100mM 的AgNO3溶液在250 mL锥形瓶中混合，然后放入25℃的恒温培养箱，光照强度1000lux条件下照射9d，合成纳米银。
实施例2
本发明黑曲霉菌HQ-1制备纳米银的方法，包括以下步骤：
（1）、取黑曲霉菌HQ-1在25℃条件下，接种到PDA固体培养基上培养，培养7天后，黑曲霉菌丝长满平板培养基的表面，用无菌水冲洗平板培养皿，收集得到黑曲霉菌的孢子液，-80℃保藏；
所述的PDA固体培养基pH为6.5；
（2）、吸取200μL黑曲霉HQ-1的孢子液涂布到PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中静置培养，培养4天后，PDA固体培养基上长出黑曲霉的菌丝，用无菌牙签挑取菌丝转入100mL 改良PDB培养基中，置于25℃，150rpm的恒温摇床中保持4天，用滤纸过滤得到黑曲霉的菌丝体；
所述的改良PDB培养基pH为7.2；
（3）、将黑曲霉的菌丝体用无菌蒸馏水清洗4次，去除黑曲霉菌丝生物量中的PDB培养基成分，将滤得的黑曲霉菌丝体加入到100mL无菌蒸馏水中浸泡，在25℃，150rpm的条件下培养24h，之后用滤纸过滤得菌丝浸泡的黑曲霉的二次发酵液；
（4）、取100mL黑曲霉的二次发酵液，与1.0 mL的100mM 的AgNO3溶液在250 mL锥形瓶中混合，然后放入25℃的恒温培养箱，光照强度3000lux条件下照射7d，合成纳米银。
实施例3
本发明黑曲霉菌HQ-1制备纳米银的方法，包括以下步骤：
（1）、取黑曲霉菌HQ-1在27℃条件下，接种到PDA固体培养基上培养，培养5天后，黑曲霉菌丝长满平板培养基的表面，用无菌水冲洗平板培养皿，收集得到黑曲霉菌的孢子液，-80℃保藏；
所述的PDA固体培养基pH为7.0；
（2）、吸取200μL黑曲霉HQ-1的孢子液涂布到PDA固体培养基上，置于26℃恒温培养箱中静置培养，培养3天后，PDA固体培养基上长出黑曲霉的菌丝，用无菌牙签挑取菌丝转入100mL 改良PDB培养基中，置于27℃，150rpm的恒温摇床中保持3天，用滤纸过滤得到黑曲霉的菌丝体；
所述的改良PDB培养基pH为7.2；
（3）、将黑曲霉的菌丝体用无菌蒸馏水清洗3次，去除黑曲霉菌丝生物量中的PDB培养基成分，将滤得的黑曲霉菌丝体加入到100mL无菌蒸馏水中浸泡，在25℃，150rpm的条件下培养24h，之后用滤纸过滤得菌丝浸泡的黑曲霉的二次发酵液；
（4）、取100mL黑曲霉的二次发酵液，与1.0 mL的100mM 的AgNO3溶液在250 mL锥形瓶中混合，然后放入25℃的恒温培养箱，光照强度5000lux条件下照射5d，合成纳米银。
本发明能够实现简便、高效、低成本的合成纳米银，并经实验取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下：
一、菌株的筛选与鉴定
（1）、称量5.0 g取自郑州市金水区东风渠河道边的土壤，加入50 mL蒸馏水中，制成悬浮液；
（2）、将悬浮液在25℃，150 rpm的恒温摇床中放置30 min，取1mL悬浮液接种于100mL改良PDB培养基中，培养24 h，之后加入0.5 mmol/L 的AgNO3培养24h；取1mL培养液接种于100mL 改良PDB培养基中，添加1.0 mmol/L 的AgNO3培养24h，以此类推，直到添加5.0mmol/L 的AgNO3培养24h。取含有5.0 mmol/L 的AgNO3的培养液在PDA固体培养基平板上涂布培养72 h，对生长出的菌落用无菌牙签进行挑选，并且在PDA固体培养基平板上划线，重复划线挑选单菌落，重复3次，即得单一纯化的黑曲霉菌HQ-1，具有耐银的特性；
所述的改良PDB培养基是由马铃薯浸粉3.0 g、葡萄糖 20.0 g，溶于1L去离子水中制得，pH为6.0~7.5；
所述的PDA固体培养基是由马铃薯浸粉3.0 g、葡萄糖 20.0 g和琼脂15.0 g混合制成，pH为5.5~7.0。
上述筛选制备出的黑曲霉菌的菌体形态如图1所示，有节状分叉菌丝的丝状真菌，并且菌丝较长，有分生圆球形的孢子，呈黑褐色，生长前期为泛黄的白色菌落，后期变为黑色厚绒状菌丝。对筛选纯化培养的菌株进行分子生物学鉴定：将菌株送到深圳微生太科技有限公司进行测序，实验过程依次经历真菌基因组DNA提取、真菌基因组PCR扩增（所用引物为ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）、PCR产物的回收、序列测定、序列分析，然后在NCBI核酸数据库中进行数据比对，得到与测试物种（即黑曲霉菌HQ-1）序列相似性最大的物种为黑曲霉(ATCC 16888)，相似性达到99.8%，通过MEGA软件构建系统进化树，结果如图2所示，结合其生长的形态特征和培养条件，确定纯化培养的菌株为黑曲霉菌HQ-1。黑曲霉菌（Aspergillus niger）HQ-1，属于曲霉属真菌，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.22415，保藏日期为2021年04月22日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号。
二、纳米银活性实验
以实施例2为实验组，并设置对照组，对照组只有二次发酵液，不添加纳米银溶液（即以对照组为基底），与实验组同时进行，所有实验重复三次（一式三份，取三次平均结果）。
（1）、紫外全波长扫描
将实验组制备的纳米银溶液进行紫外全波长扫描（UV-Vis），得到结果如图3所示。在波长为330~600nm之间出现了很明显的紫外吸收峰，在波长为423nm处，溶液的最大吸光值为0.446，表明在溶液中有纳米银生成，并且纳米银的浓度比较高。
（2）、透射电镜（TEM）观察
将实验组制备的纳米银溶液进行透射电镜（TEM）观察，得到纳米银粒子的透射电镜图如图4所示，从图中可以看出纳米银粒子为球形，分散性较好，尺寸有所不同。并且从纳米银溶液的动态光散射（DLS）粒径分布图5中，可以看出银纳米粒子的主要粒径范围为3.0~10.0nm，占溶液中所有粒径的体积百分比达到93.4%，说明制备的纳米银溶液中大量的纳米银粒子在10nm以下，实验效果比较好。
（3）、Zeta电位测试
对实验组制备的纳米银溶液进行Zeta电位测试，得到结果如图6所示。纳米银溶液的Zeta电位值在-20mv~-50mv之间，电势的峰值为-30.5mv，绝对值高于20 mv，以此可说明纳米银粒子的胶态分散性良好，在溶液中比较稳定。
在对实施例2实验时，还对实施例1、3作了相同实验，均取得了相同或相近似的结果，这里不再一一列举，实验清楚的表明，使用本发明的黑曲霉菌HQ-1能够实现简便、高效、低成本的合成纳米银，纳米银的浓度高，主要粒径范围为3.0~10.0nm，纳米银粒子的胶态分散性良好，并且本发明制备过程中不牵涉到有毒有害的化学试剂，安全环保，对制备纳米银的研究扩展提供技术支持，有显著的社会和经济效益。
序列表
<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司；河南省科学院；河南省建筑质量监督检验中心有限公司
<120> 一株用于制备纳米银的黑曲霉菌HQ-1及其应用
<130> 2021
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 565
<212> DNA
<213> ITS4
<400> 1
atctacctga tccgaggtca cctggaaaga atggttggaa aacgtcggca ggcgccggcc 60
aatcctacag agcatgtgac aaagccccat acgctcgagg atcggacgcg gtgccgccgc 120
tgcctttcgg gcccgtcccc ccggagaggg ggacggcgac ccaacacaca agccgggctt 180
gagggcagca atgacgctcg gacaggcatg ccccccggaa taccaggggg cgcaatgtgc 240
gttcaaagac tcgatgattc actgaattct gcaattcaca ttagttatcg catttcgctg 300
cgttcttcat cgatgccgga accaagagat ccattgttga aagttttaac tgattgcatt 360
caatcaactc agactgcacg ctttcagaca gtgttcgtgt tggggtctcc ggcgggcacg 420
ggcccggggg gcagaggcgc ccccccggcg gccgacaagc ggcgggcccg ccgaagcaac 480
agggtacaat agacacggat gggaggttgg gcccaaagga cccgcactcg gtaatgatcc 540
ttccgcaggt cacccttacg gaaga 565

Claims (7)

1.一株用于制备纳米银的黑曲霉菌HQ-1，分类命名为黑曲霉菌（Aspergillus niger），于2021年04月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22415，保藏地址：北京市朝阳区北辰路1号院3号。
2.权利要求1所述的黑曲霉菌HQ-1在制备纳米银中的应用。
3.权利要求1所述的黑曲霉菌HQ-1制备纳米银的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、取黑曲霉菌HQ-1在23℃-27℃条件下，接种到PDA固体培养基上培养，培养5-10天后，黑曲霉菌丝长满平板培养基的表面，用无菌水冲洗平板培养皿，收集得到黑曲霉菌的孢子液，-80℃保藏；
所述的PDA固体培养基pH为5.5~7.0；
（2）、吸取200μL黑曲霉HQ-1的孢子液涂布到PDA固体培养基上，置于24℃-26℃恒温培养箱中静置培养，培养3-5天后，PDA固体培养基上长出黑曲霉的菌丝，用无菌牙签挑取菌丝转入100mL 改良PDB培养基中，置于23℃-27℃，150rpm的恒温摇床中保持3-5天，用滤纸过滤得到黑曲霉的菌丝体；
所述的改良PDB培养基是由马铃薯浸粉3.0 g、葡萄糖 20.0 g，溶于1L去离子水中制成，pH为6.0~7.5；
（3）、将黑曲霉的菌丝体用无菌蒸馏水清洗3-4次，去除黑曲霉菌丝生物量中的PDB培养基成分，将滤得的黑曲霉菌丝体加入到100mL无菌蒸馏水中浸泡，在25℃，150rpm的条件下培养24h，之后用滤纸过滤得菌丝浸泡的黑曲霉的二次发酵液；
（4）、取100mL黑曲霉的二次发酵液，与1.0 mL的100mM 的AgNO3溶液在250 mL锥形瓶中混合，然后放入25℃的恒温培养箱，光照强度1000-5000lux条件下照射5-9d，合成纳米银。
4.根据权利要求3所述的黑曲霉菌HQ-1制备纳米银的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、取黑曲霉菌HQ-1在23℃条件下，接种到PDA固体培养基上培养，培养10天后，黑曲霉菌丝长满平板培养基的表面，用无菌水冲洗平板培养皿，收集得到黑曲霉菌的孢子液，-80℃保藏；
所述的PDA固体培养基pH为5.5；
（2）、吸取200μL黑曲霉HQ-1的孢子液涂布到PDA固体培养基上，置于24℃恒温培养箱中静置培养，培养5天后，PDA固体培养基上长出黑曲霉的菌丝，用无菌牙签挑取菌丝转入100mL 改良PDB培养基中，置于23℃，150rpm的恒温摇床中保持5天，用滤纸过滤得到黑曲霉的菌丝体；
所述的改良PDB培养基pH为6.0；
（3）、将黑曲霉的菌丝体用无菌蒸馏水清洗3次，去除黑曲霉菌丝生物量中的PDB培养基成分，将滤得的黑曲霉菌丝体加入到100mL无菌蒸馏水中浸泡，在25℃，150rpm的条件下培养24h，之后用滤纸过滤得菌丝浸泡的黑曲霉的二次发酵液；
（4）、取100mL黑曲霉的二次发酵液，与1.0 mL的100mM 的AgNO3溶液在250 mL锥形瓶中混合，然后放入25℃的恒温培养箱，光照强度1000lux条件下照射9d，合成纳米银。
5.根据权利要求3所述的黑曲霉菌HQ-1制备纳米银的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、取黑曲霉菌HQ-1在25℃条件下，接种到PDA固体培养基上培养，培养7天后，黑曲霉菌丝长满平板培养基的表面，用无菌水冲洗平板培养皿，收集得到黑曲霉菌的孢子液，-80℃保藏；
所述的PDA固体培养基pH为6.5；
（2）、吸取200μL黑曲霉HQ-1的孢子液涂布到PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中静置培养，培养4天后，PDA固体培养基上长出黑曲霉的菌丝，用无菌牙签挑取菌丝转入100mL 改良PDB培养基中，置于25℃，150rpm的恒温摇床中保持4天，用滤纸过滤得到黑曲霉的菌丝体；
所述的改良PDB培养基pH为7.2；
（3）、将黑曲霉的菌丝体用无菌蒸馏水清洗4次，去除黑曲霉菌丝生物量中的PDB培养基成分，将滤得的黑曲霉菌丝体加入到100mL无菌蒸馏水中浸泡，在25℃，150rpm的条件下培养24h，之后用滤纸过滤得菌丝浸泡的黑曲霉的二次发酵液；
（4）、取100mL黑曲霉的二次发酵液，与1.0 mL的100mM 的AgNO3溶液在250 mL锥形瓶中混合，然后放入25℃的恒温培养箱，光照强度3000lux条件下照射7d，合成纳米银。
6.根据权利要求3所述的黑曲霉菌HQ-1制备纳米银的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、取黑曲霉菌HQ-1在27℃条件下，接种到PDA固体培养基上培养，培养5天后，黑曲霉菌丝长满平板培养基的表面，用无菌水冲洗平板培养皿，收集得到黑曲霉菌的孢子液，-80℃保藏；
所述的PDA固体培养基pH为7.0；
（2）、吸取200μL黑曲霉HQ-1的孢子液涂布到PDA固体培养基上，置于26℃恒温培养箱中静置培养，培养3天后，PDA固体培养基上长出黑曲霉的菌丝，用无菌牙签挑取菌丝转入100mL 改良PDB培养基中，置于27℃，150rpm的恒温摇床中保持3天，用滤纸过滤得到黑曲霉的菌丝体；
所述的改良PDB培养基pH为7.2；
（3）、将黑曲霉的菌丝体用无菌蒸馏水清洗3次，去除黑曲霉菌丝生物量中的PDB培养基成分，将滤得的黑曲霉菌丝体加入到100mL无菌蒸馏水中浸泡，在25℃，150rpm的条件下培养24h，之后用滤纸过滤得到菌丝浸泡液，即黑曲霉的二次发酵液；
（4）、取100mL黑曲霉的二次发酵液，与1.0 mL的100mM 的AgNO3溶液在250 mL锥形瓶中混合，然后放入25℃的恒温培养箱，光照强度5000lux条件下照射5d，合成纳米银。
7.根据权利要求4-6任一项所述的黑曲霉菌HQ-1制备纳米银的方法，其特征在于，所述方法制备的纳米银的粒径为3.0-10.0nm。
CN202110755105.8A 2021-07-05 2021-07-05 一株用于制备纳米银的黑曲霉菌hq-1及其应用 Active CN113322191B (zh)

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