CN107384975A - 生物安全变栖克雷伯氏菌及其在1,3‑丙二醇生产中的应用 - Google Patents

生物安全变栖克雷伯氏菌及其在1,3‑丙二醇生产中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了生物安全变栖克雷伯氏菌及其在1,3‑丙二醇生产中的应用。通过基因工程方法构建出强化tqsA基因表达的变栖克雷伯氏菌TqsA，并通过发酵工艺优化提供一种采用变栖克雷伯氏菌F2R9T及变栖克雷伯氏菌TqsA发酵甘油生产1,3‑丙二醇的方法。本发明首次提供采用克雷伯氏菌F2R9T发酵甘油生产1,3‑丙二醇，并通过基因工程手段构建出强化tqsA基因表达的变栖克雷伯氏菌TqsA从而强化1,3‑丙二醇的生产；采用本发明优化的发酵工艺能够使克雷伯氏菌F2R9T生产1,3‑丙二醇的产率达到72g/L，且变栖克雷伯氏菌TqsA发酵甘油生产1,3‑丙二醇的产率达到85g/L，为1,3‑丙二醇的微生物发酵生产提供了生物安全的菌种及其高效生产1,3‑丙二醇的工艺。

Description

生物安全变栖克雷伯氏菌及其在1,3-丙二醇生产中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种生物安全变栖克雷伯氏菌及其在1,3-丙二醇生产中的应用。
背景技术
1,3-丙二醇用途广泛，是非常重要的化工产品及平台化合物，可用作粘合剂、保护剂、润滑剂、抗冻剂及溶剂，在高分子材料、医药、化工、食品及化妆品领域都具有广泛应用。其最重要的用途为生产聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)。PTT的良好特性，包括水洗性、延展性及回复性都使得其市场需求日益扩大。由此拉动了1,3-丙二醇的市场需求(Liu H.et al.,Biotechnol J.2010,5(11):1137–1148)。
鉴于1,3-丙二醇的重要作用，化学法合成的种种弊端，利用微生物发酵甘油生产1,3-丙二醇的研究备受关注。目前报道的合成1,3-丙二醇的菌株主要有克雷伯氏菌属(Klebsiella)、梭菌属、肠杆菌属以及乳酸菌属。其中，克雷伯氏菌属的菌株属于兼性厌氧菌，在工业应用中容易培养，且该类菌株具有良好的底物甘油耐受性及产物1,3-丙二醇耐受性，1,3-丙二醇的生产强度和转化率较高。因此，克雷伯氏菌属是研究较多的优良的1,3-丙二醇生产菌株。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)是目前研究较多，且1,3-丙二醇生产性能较好的菌株。
CN103740609B公开了一株高产1,3-丙二醇克雷伯肺炎杆菌(即：肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae)，其于2013年7月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNO.7824，保藏名称为ACR30；该肺炎克雷伯氏菌ACR30在5L发酵罐批次流加发酵实验中，发酵72小时1,3-丙二醇浓度达到116g/L。
另有一篇文章报道过一株乳酸生产途径缺陷的产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)，以及该菌株在微好氧条件下发酵生产1,3-丙二醇的应用。作者通过对产酸克雷伯氏菌M5al的乳酸脱氢酶基因进行了插入失活，获得了突变菌株产酸克雷伯氏菌LDH3。在7.5L发酵罐中，微好氧条件下，产酸克雷伯氏菌LDH3发酵甘油和糖的混合碳源(80％甘油、10％糖和10％水)，可生产83.56g/L的1,3-丙二醇，1,3-丙二醇的转化率为0.62mol/mol，1,3-丙二醇生产强度为1.61g/L h(Yang,G.,Tian,J.,&Li,J.(2007).Fermentation of 1,3-propanediol by a lactate deficient mutant of Klebsiella oxytoca undermicroaerobic conditions.Applied Microbiology and Biotechnology,73(5),1017-1024.)。
然而，上述两类菌株均为条件致病菌，即生物安全2类菌。条件致病菌在工业应用中存在着较多限制及安全隐患，该类菌株生产的产品的应用范围受到严重限制(CelińskaE.Crit Rev Biotechnol.2012,32(3):274–288)。
克雷伯氏菌属中，变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola，又名栖异地克雷伯氏菌)F2R9T是目前唯一一株被美国公共卫生服务指南——微生物和生物医学实验室的生物安全(U.S.Public Health Service Guidelines,Biosafety in Microbiological andBiomedical Laboratories)认定为非致病菌(既生物安全1类菌)的克雷伯氏菌。变栖克雷伯氏菌F2R9T分离自香蕉根部，在美国模式培养物集存库(American type culturecollection，ATCC)的保藏编号为ATCC BAA-830(Mónica Rosenblueth et al.,System.Appl.Microbiol.2004,27:27–35)。目前，还没有使用变栖克雷伯氏菌F2R9T发酵特性的研究，也没有使用变栖克雷伯氏菌F2R9T或者其衍生菌株生产1,3-丙二醇的报道。
tqsA基因编码一个转运蛋白。研究表明，大肠杆菌的tqsA基因是群体感应信号自诱导物AI-2的转运蛋白，与生物膜形成有关，对多个基因具有调控功能(Herzberg,M.,Kaye,I.K.,Peti,W.,&Wood,T.K.(2006).YdgG(TqsA)controls biofilm formation inEscherichia coli K-12through autoinducer 2transport.Journal of bacteriology,188(2),587-598)。变栖克雷伯氏菌F2R9T的基因组注释结果表明，该菌株具有tqsA基因，但是，目前还没有对克雷伯氏菌tqsA基因的相关功能研究，也没有强化表达tqsA基因以增强微生物发酵生产1,3-丙二醇的报导。
发明内容
基于现有肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌在生产1,3-丙二醇上的缺陷和不足，本发明的一个目的在于提供一种生物安全变栖克雷伯氏菌F2R9T及其衍生菌株在生产1,3-丙二醇上的应用。
一方面，本发明提供了变栖克雷伯氏菌F2R9T及其衍生菌株在生产1,3-丙二醇中的应用。
本发明的变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)F2R9T是从美国模式培养物寄存库(American type culture collection，ATCC)购买获得，其编号为ATCC BAA-830。本发明中所用到的变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)F2R9T基因组序列可由NCBI查询获得(NCBI数据库的保藏号为NZ_CP010523.2)。
根据本发明的具体实施方案，本发明的变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株，其为一种变栖克雷伯氏菌F2R9T的tqsA基因表达增强的菌株。
根据本发明的具体实施方案，本发明的变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株，是通过将变栖克雷伯氏菌F2R9T的tqsA基因的启动子替换为表达强度高的启动子而得到的。
在本发明的一些具体实施方案中，所述表达强度高的启动子为dhaD基因的启动子。本发明的变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株，是通过将变栖克雷伯氏菌F2R9T的tqsA基因的启动子替换为dhaD基因的启动子而得到的。
另一方面，本发明还提供了一种变栖克雷伯氏菌F2R9T衍生菌株，该菌株的tqsA基因表达增强。在本发明的一些具体实施方案中，该菌株是通过将变栖克雷伯氏菌F2R9T的tqsA基因的启动子替换为表达强度高的启动子(例如dhaD基因的启动子)而得到的。
另一方面，本发明还提供一种变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株的构建方法。可采用所属领域中已知的任何可行方法使得变栖克雷伯氏菌F2R9T的tqsA基因表达增强而构建所述的衍生菌株。在本发明的一些实施方案中，本发明的变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株的构建方法包括以下步骤：
步骤一，PCR扩增变栖克雷伯氏菌F2R9T的基因组序列中tqsA基因启动子的上游和下游核苷酸片段，分别命名为片段A和片段B；
步骤二，PCR扩增变栖克雷伯氏菌F2R9T的基因组序列中表达强度高的dhaD基因启动子的核苷酸片段，命名为片段C；
步骤三，利用重组PCR将片段A、片段B和片段C按照A-C-B的顺序重组成一条新的核苷酸片段，命名为片段ACB；
步骤四，将片段ACB连接至克雷伯氏菌的自杀质粒pRE118(KmR)的HindIII和XmaI的酶切位点中，获得质粒pRE118(KmR)-tqsA；
步骤五，将质粒pRE118(KmR)-tqsA转化入变栖克雷伯氏菌F2R9T中得到感受态细胞，将转化后的感受态细胞于含有卡那霉素的固体培养基中培养获得质粒与基因组发生的第一次交换的单交换菌株；
步骤六，将上述单交换菌株于不含有卡那霉素的液体培养基中培养，并将其培养液于含有蔗糖的固体培养基中培养获得质粒与基因组发生第二次交换的双交换菌株；
步骤七，利用PCR对双交换菌株进行验证，获得能够扩增得到844bp片段的菌株；对该菌株采用抗生素敏感实验进行验证，获得不具有卡那霉素抗性的菌株，即为tqsA基因表达强度提高的变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株。
上述变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株的构建方法中，优选地，步骤一中片段A为PCR扩增变栖克雷伯氏菌F2R9T的基因组序列中tqsA基因启动子的上游500bp的核苷酸片段，其扩增的引物为：
A-F：CCGCAAGCTTGACAAGGTGCCGGTAATTTC(如SEQ ID NO：1所示)
A-R：AGGTCCCGACCTCAATCTTC(如SEQ ID NO：2所示)。
注：“A-F”：指扩增片段A的正向引物；“A-R”指扩增片段A的反向引物；下述依次类推，不再赘述。
上述变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株的构建方法中，优选地，步骤一中片段B为PCR扩增变栖克雷伯氏菌F2R9T的基因组序列中tqsA基因启动子的下游500bp的核苷酸片段，其扩增的引物为：
B-F：ATGGCTAAACCCATTATTAC(如SEQ ID NO：3所示)
B-R：CACGCCCGGGTGGGGGACCTCCAGCAGCAT(如SEQ ID NO：4所示)。
上述变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株的构建方法中，优选地，步骤二中片段C为PCR扩增变栖克雷伯氏菌F2R9T的基因组序列中表达强度高的dhaD基因启动子的344bp的核苷酸片段，其扩增的引物为：
C-F：GAAGATTGAGGTCGGGACCTGATGGCTGGCGAAGCGGGTG(如SEQ ID NO：5所示)
C-R：GTAATAATGGGTTTAGCCATTCCTTTCACCCTCAAATAAG(如SEQ ID NO：6所示)。
上述变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株的构建方法中，优选地，重组PCR扩增的引物为：
A-F：CCGCAAGCTTGACAAGGTGCCGGTAATTTC(如SEQ ID NO：1所示)
B-R：CACGCCCGGGTGGGGGACCTCCAGCAGCAT(如SEQ ID NO：4所示)。
上述变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株的构建方法中，优选地，将质粒pRE118(KmR)-tqsA转化入变栖克雷伯氏菌F2R9T中得到感受态细胞，将转化后的感受态细胞于含有50μg/mL的卡那霉素的固体LB培养基中37℃静置培养24h，获得质粒与基因组发生的第一次交换的单交换菌株。
上述变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株的构建方法中，优选地，将单交换菌株于不含有卡那霉素的LB液体培养基中培养12h，将培养液稀释100倍，并将培养液于含有100g/L的蔗糖的固体LB培养基中37℃静置培养24h，获得质粒与基因组发生第二次交换的双交换菌株。
上述变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株的构建方法中，优选地，利用PCR对双交换菌株进行验证所采用的引物为：
C-F：GAAGATTGAGGTCGGGACCTGATGGCTGGCGAAGCGGGTG(如SEQ ID NO：5所示)
B-R：CACGCCCGGGTGGGGGACCTCCAGCAGCAT(如SEQ ID NO：4所示)。
上述变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株的构建方法中，LB液体培养基为常规配方，即：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、pH为7.0；LB固体培养基为LB液体培养基中加入琼脂粉15g/L。
本发明中，将上述变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株的构建方法构建得到的变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株，命名为变栖克雷伯氏菌TqsA。
另一方面，本发明还提供了一种生产1,3-丙二醇的方法，该方法包括：
步骤(1)，将变栖克雷伯氏菌F2R9T或本发明所述的其衍生菌株接种于含有甘油的种子培养基中，摇瓶培养获得种子培养液；
步骤(2)，将种子培养液接种于含有甘油的发酵培养基中，培养得到1,3-丙二醇。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生产1,3-丙二醇的方法中，所述种子培养基的组成包括：以1L种子培养基计，包括20g的甘油、3.2g的K2HPO4·3H2O、1.2g的KH2PO4、2.85g的NH4Cl和2g的酵母膏。种子发酵培养过程中，优选地，摇瓶培养的条件为32℃、转速为100rpm、种子培养基的pH为7.0，培养12h。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生产1,3-丙二醇的方法中，所述发酵培养基的组成包括：以1L发酵培养基计，包括20g的甘油、3.2g的K2HPO4·3H2O、1.2g的KH2PO4、2.85g的NH4Cl、0.28g的Na2SO4、0.1g的MgSO4·7H2O、0.42g的柠檬酸、2g的酵母膏和0.3mL的微量元素溶液。其中，更具体地，以1L微量元素溶液计，该微量元素溶液包括7.56g的ZnCl2、15.65g的FeCl3·6H2O、6.28g的MnCl2·4H2O、1.32g的CuCl2·2H2O、6.42g的CoCl2·6H2O、0.48g的H3BO3和3.22g的Na2MoO4·2H2O。优选地，发酵培养的条件为32-35℃、转速为100-200rpm、通气量为0.5-0.8vvm、发酵培养基pH值为6.5-6.8，发酵12-36h。发酵过程中，发酵培养基的pH值可通过碱溶液进行调节。更优选地，发酵第4-32小时，每升发酵液中，每小时补加10-40g的甘油。
本发明首次提供采用克雷伯氏菌F2R9T发酵甘油生产1,3-丙二醇，并通过基因工程手段构建出强化tqsA基因表达的变栖克雷伯氏菌TqsA从而强化1,3-丙二醇的生产；同时，采用本发明优化的发酵工艺能够使克雷伯氏菌F2R9T生产1,3-丙二醇的产率达到72g/L，且变栖克雷伯氏菌TqsA发酵甘油生产1,3-丙二醇的产率达到85g/L，为1,3-丙二醇的微生物发酵生产提供了生物安全的菌种及其高效生产1,3-丙二醇的工艺。
附图说明
图1为实施例1中PCR验证基因工程菌株图(M，DNA分子量标准；1，基因工程菌株PCR获得的DNA片段；2，变栖克雷伯氏菌F2R9T对照菌株PCR获得的DNA片段)；
图2为实施例1中荧光定量PCR检测tqsA基因的相对转录水平图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例中PCR使用的试剂均为常规的商业产品，使用方法参照产品说明书的常规方法。
实施例中检测发酵液中1,3-丙二醇含量是通过气相色谱仪进行检测。其中，气相色谱仪型号为GC-2014C，购自日本岛津公司，色谱柱采用毛细管柱AT.SE-54(30m×0.53mm×1.0μm)，FID检测器，N2作为载气，柱温为120℃，检测器与进样器温度为250℃。
实施例1
本实施例提供一种变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株的构建方法，其包括以下步骤：
步骤一，PCR扩增变栖克雷伯氏菌F2R9T的基因组序列中tqsA基因启动子的上游和下游核苷酸片段，分别命名为片段A和片段B，其中：
片段A为PCR扩增变栖克雷伯氏菌F2R9T的基因组序列中tqsA基因启动子的上游500bp的核苷酸片段，其扩增的引物为：
A-F：CCGCAAGCTTGACAAGGTGCCGGTAATTTC(如SEQ ID NO：1所示)
A-R：AGGTCCCGACCTCAATCTTC(如SEQ ID NO：2所示)；
片段B为PCR扩增变栖克雷伯氏菌F2R9T的基因组序列中tqsA基因启动子的下游500bp的核苷酸片段，其扩增的引物为：
B-F：ATGGCTAAACCCATTATTAC(如SEQ ID NO：3所示)
B-R：CACGCCCGGGTGGGGGACCTCCAGCAGCAT(如SEQ ID NO：4所示)。
步骤二，PCR扩增变栖克雷伯氏菌F2R9T的基因组序列中表达强度高的dhaD基因启动子的核苷酸片段，命名为片段C，其中：
片段C为PCR扩增变栖克雷伯氏菌F2R9T的基因组序列中表达强度高的dhaD基因启动子的344bp的核苷酸片段，其扩增的引物为：
C-F：GAAGATTGAGGTCGGGACCTGATGGCTGGCGAAGCGGGTG(如SEQ ID NO：5所示)
C-R：GTAATAATGGGTTTAGCCATTCCTTTCACCCTCAAATAAG(如SEQ ID NO：6所示)。
步骤三，利用重组PCR将片段A、片段B和片段C按照A-C-B的顺序重组成一条新的核苷酸片段，命名为片段ACB，重组PCR扩增的引物为：
A-F：CCGCAAGCTTGACAAGGTGCCGGTAATTTC(如SEQ ID NO：1所示)
B-R：CACGCCCGGGTGGGGGACCTCCAGCAGCAT(如SEQ ID NO：4所示)。
步骤四，将片段ACB连接至克雷伯氏菌的自杀质粒pRE118(KmR)的HindIII和XmaI的酶切位点中，获得质粒pRE118(KmR)-tqsA。
步骤五，将质粒pRE118(KmR)-tqsA转化入变栖克雷伯氏菌F2R9T中得到感受态细胞，将转化后的感受态细胞涂布于含有50μg/mL的卡那霉素的固体LB培养基平板上，于37℃静置培养24h，获得质粒与基因组发生的第一次交换的单交换菌株。
步骤六，将单交换菌株于不含有卡那霉素的LB液体培养基中培养12h，将培养液稀释100倍，并将培养液涂布于含有100g/L的蔗糖的固体LB培养基平板上，于37℃静置培养24h，获得质粒与基因组发生第二次交换的双交换菌株。
其中，LB液体培养基为常规配方，即：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、pH为7.0；LB固体培养基为LB液体培养基中加入琼脂粉15g/L。
步骤七，利用PCR对双交换菌株进行验证，获得能够扩增得到844bp片段的菌株，所采用的引物为：
C-F：GAAGATTGAGGTCGGGACCTGATGGCTGGCGAAGCGGGTG(如SEQ ID NO：5所示)
B-R：CACGCCCGGGTGGGGGACCTCCAGCAGCAT(如SEQ ID NO：4所示)；
PCR的验证结果如图1所示，正确的基因工程菌株，使用引物C-F和B-R可以扩增得到844bp片段，图1的1通道所示DNA片段位于750bp和1000bp之间，为正确的基因工程菌株。图1的2通道所示没有扩增出DNA片段的菌株，为变栖克雷伯氏菌F2R9T对照实验。
然后对该菌株采用抗生素敏感实验进行验证，获得不具有卡那霉素抗性的菌株，即为tqsA基因表达强度提高的变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株，命名为变栖克雷伯氏菌TqsA。
采用荧光定量PCR的方法，对变栖克雷伯氏菌F2R9T和变栖克雷伯氏菌TqsA的tqsA基因转录表达水平进行检测。荧光定量PCR采用常规技术方法，主要包括以下实验流程：培养细菌至对数中期，收集菌体，提取总RNA，反转录合成cDNA，以及荧光定量PCR。荧光定量PCR所使用引物为：
tqsA-F：GCTTTGCGGCGGACATTATTG(如SEQ ID NO：7所示)
tqsA-R：GCAGCGGACCAGCAGTTG(如SEQ ID NO：8所示)
如图2所示，相较于变栖克雷伯氏菌F2R9T，变栖克雷伯氏菌TqsA的tqsA基因转录表达水平提高了约3倍。
实施例2
本实施例提供变栖克雷伯氏菌F2R9T及上述实施例1构建的变栖克雷伯氏菌TqsA在发酵甘油生产1,3-丙二醇上的应用。
本实施例利用上述两种菌种通过小规模摇瓶发酵生产1,3-丙二醇的方法，包括以下步骤：
(1)将上述变栖克雷伯氏菌F2R9T或变栖克雷伯氏菌TqsA接种于含有50mL LB液体培养基的250mL摇瓶中，37℃，220rpm培养12小时，获得种子液；
(2)将上述种子液，以10％的比例接种于含有50mL LB甘油液体培养基的250mL摇瓶中，37℃，220rpm培养12小时，获得发酵液；
(3)使用气相色谱检测发酵液中1,3-丙二醇的浓度，变栖克雷伯氏菌F2R9T生产了浓度为6.5g/L的1,3-丙二醇，1,3-丙二醇转化率为0.39mol/mol；变栖克雷伯氏菌TqsA生产了浓度为8.3g/L的1,3-丙二醇，1,3-丙二醇转化率为0.50mol/mol。
上述LB液体培养基配方为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，pH为7.0。上述LB甘油液体培养基为LB液体培养基中加入甘油20g/L。
实施例3
本实施例提供变栖克雷伯氏菌F2R9T及上述实施例1构建的变栖克雷伯氏菌TqsA在发酵甘油生产1,3-丙二醇上的应用。
本实施例利用上述两种菌种通过发酵罐发酵生产1,3-丙二醇的方法，包括以下步骤：
(1)将上述变栖克雷伯氏菌F2R9T或变栖克雷伯氏菌TqsA接种于以甘油为碳源的种子培养基中，于温度为35℃，培养基pH为7.0，转速为200rpm的条件下，培养12小时，以便获得种子培养液。其中，1L所述以甘油为碳源的种子培养基中包含：甘油20g，K2HPO4·3H2O3.20g，KH2PO4 1.20g，NH4Cl 2.85g，酵母膏2.00g。
(2)将上述种子液接种于装有以甘油为碳源的发酵培养基的发酵罐中，于温度为35℃，培养基pH为6.5，转速为200rpm，通气量为0.5vvm的条件下，发酵24小时。在发酵培养时，发酵液的pH通过加入氢氧化钠溶液调节。在发酵培养的第4-24小时，相对于每1升的发酵液，补加120g的甘油。其中，1L所述以甘油为碳源的发酵培养基中包含：甘油20g，K2HPO4·3H2O 3.20g，KH2PO4 1.20g，NH4Cl 2.85g，Na2SO4 0.28g，MgSO4·7H2O 0.10g，柠檬酸0.42g，酵母膏2.00g和微量元素溶液0.3mL，其中，1L微量元素溶液包含：ZnCl2 7.56g，FeCl3·6H2O15.65g，MnCl2·4H2O 6.28g，CuCl2·2H2O 1.32g，CoCl2·6H2O 6.42g，H3BO3 0.48g和Na2MoO4·2H2O 3.22g。
(3)使用气相色谱检测发酵液中1,3-丙二醇的浓度，变栖克雷伯氏菌F2R9T生产了浓度为62g/L的1,3-丙二醇，1,3-丙二醇转化率为0.54mol/mol，生产强度为2.58g/L·h；变栖克雷伯氏菌TqsA生产了浓度为71g/L的1,3-丙二醇，1,3-丙二醇转化率为0.61mol/mol，生产强度为2.96g/L·h。
实施例4
本实施例提供变栖克雷伯氏菌F2R9T及上述实施例1构建的变栖克雷伯氏菌TqsA在发酵甘油生产1,3-丙二醇上的应用。
本实施例利用上述两种菌种通过发酵罐发酵生产1,3-丙二醇的方法，包括以下步骤：
(1)将上述变栖克雷伯氏菌F2R9T或变栖克雷伯氏菌TqsA接种于以甘油为碳源的种子培养基中，于温度为32℃，培养基pH为7.0，转速为200rpm的条件下，培养12小时，以便获得种子培养液。其中，1L所述以甘油为碳源的种子培养基中包含：甘油20g，K2HPO4·3H2O3.20g，KH2PO4 1.20g，NH4Cl 2.85g，酵母膏2.00g。
(2)将上述种子液接种于装有以甘油为碳源的发酵培养基的发酵罐中，于温度为32℃，培养基pH为6.8，转速为100rpm，通气量为0.75vvm的条件下，发酵30小时。在发酵培养时，发酵液的pH通过加入氢氧化钠溶液调节。在发酵培养的第4-30小时，相对于每1升的发酵液，补加138g的甘油。其中，1L所述以甘油为碳源的发酵培养基中包含：甘油20g，K2HPO4·3H2O 3.20g，KH2PO4 1.20g，NH4Cl 2.85g，Na2SO4 0.28g，MgSO4·7H2O 0.10g，柠檬酸0.42g，酵母膏2.00g和微量元素溶液0.3mL，其中，1L微量元素溶液包含：ZnCl2 7.56g，FeCl3·6H2O15.65g，MnCl2·4H2O 6.28g，CuCl2·2H2O 1.32g，CoCl2·6H2O 6.42g，H3BO3 0.48g和Na2MoO4·2H2O 3.22g。
(3)使用气相色谱检测发酵液中1,3-丙二醇的浓度，变栖克雷伯氏菌F2R9T生产了浓度为72g/L的1,3-丙二醇，1,3-丙二醇转化率为0.55mol/mol，生产强度为2.4g/L·h；变栖克雷伯氏菌TqsA生产了浓度为85g/L的1,3-丙二醇，1,3-丙二醇转化率为0.65mol/mol，生产强度为2.83g/L·h。
综上所述，本发明首次提供采用克雷伯氏菌F2R9T发酵甘油生产1,3-丙二醇，并通过基因工程手段构建出强化tqsA基因表达的变栖克雷伯氏菌TqsA从而强化1,3-丙二醇的生产；同时，采用本发明优化的发酵工艺能够使克雷伯氏菌F2R9T生产1,3-丙二醇的产率达到72g/L，且变栖克雷伯氏菌TqsA发酵甘油生产1,3-丙二醇的产率达到85g/L，为1,3-丙二醇的微生物发酵生产提供了生物安全的菌种及其高效生产1,3-丙二醇的工艺。
序列表
<110> 张家港美景荣化学工业有限公司
<120> 生物安全变栖克雷伯氏菌及其在1,3-丙二醇生产中的应用
<130> GAI17CN2267
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
ccgcaagctt gacaaggtgc cggtaatttc 30
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
aggtcccgac ctcaatcttc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
atggctaaac ccattattac 20
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
cacgcccggg tgggggacct ccagcagcat 30
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
gaagattgag gtcgggacct gatggctggc gaagcgggtg 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
gtaataatgg gtttagccat tcctttcacc ctcaaataag 40
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
gctttgcggc ggacattatt g 21
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
gcagcggacc agcagttg 18

Claims (10)

1.变栖克雷伯氏菌F2R9T或其衍生菌株在生产1,3-丙二醇中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株为其tqsA基因表达增强的菌株。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株是通过将变栖克雷伯氏菌F2R9T的tqsA基因的启动子替换为表达强度高的启动子而得到的。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述表达强度高的启动子为dhaD基因的启动子。
5.一种变栖克雷伯氏菌F2R9T衍生菌株，该菌株的tqsA基因表达增强。
6.根据权利要求5所述的变栖克雷伯氏菌F2R9T衍生菌株，该菌株是通过将变栖克雷伯氏菌F2R9T的tqsA基因的启动子替换为表达强度高的启动子而得到的。
7.一种生产1,3-丙二醇的方法，该方法包括：
步骤(1)，将变栖克雷伯氏菌F2R9T或其衍生菌株接种于含有甘油的种子培养基中，摇瓶培养获得种子培养液；
步骤(2)，将种子培养液接种于含有甘油的发酵培养基中，培养得到1,3-丙二醇。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株为权利要求5或6所述的菌株。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述种子培养基的组成包括：以1L种子培养基计，包括20g的甘油、3.2g的K2HPO4·3H2O、1.2g的KH2PO4、2.85g的NH4Cl和2g的酵母膏；
优选地，摇瓶培养的条件为32℃、转速为100rpm、种子培养基的pH为7.0，培养12h。
10.根据权利要求7或9所述的方法，其中，所述发酵培养基的组成包括：以1L发酵培养基计，包括20g的甘油、3.2g的K2HPO4·3H2O、1.2g的KH2PO4、2.85g的NH4Cl、0.28g的Na2SO4、0.1g的MgSO4·7H2O、0.42g的柠檬酸、2g的酵母膏和0.3mL的微量元素溶液；
优选地，发酵培养的条件为32-35℃、转速为100-200rpm、通气量为0.5-0.8vvm、发酵培养基pH值为6.5-6.8，发酵12-36h；
优选地，发酵培养基的pH值通过碱溶液进行调节；
更优选地，发酵第4-32小时，每升发酵液中，每小时补加10-40g的甘油。
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