CN112280723A

CN112280723A - 联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用

Info

Publication number: CN112280723A
Application number: CN201910665004.4A
Authority: CN
Inventors: 陈振; 刘德华; 秦健淞
Original assignee: Guangdong Tsinghua Smart Biotech Co ltd; Tsinghua University
Current assignee: Guangdong Tsinghua Smart Biotech Co ltd; Tsinghua University
Priority date: 2019-07-23
Filing date: 2019-07-23
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2039-07-23
Also published as: CN112280723B

Abstract

本发明提供一种联产1,3‑丙二醇和1,3‑丁二醇的重组菌及其应用。所述重组菌是将phaA、phaB、bld和yqhD基因通过质粒导入克雷伯氏菌(Klebsiella)中或通过基因工程手段整合到克雷伯氏菌染色体上而成。利用本发明提供的克雷伯氏菌工程菌，同时实现两种高附加值的二元醇(1,3‑丙二醇和1,3‑丁二醇)的生产，且两种二元醇相对于底物甘油的得率超过0.6g/g，远远大于单独生产1,3‑丙二醇或1,3‑丁二醇过程的收率。目标产物分离过程更加简化，从而极大提高整个生产过程的经济效益。

Description

联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体地说，涉及一种联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用。

背景技术

1,3-丙二醇是一种重要的二元醇，主要用作单体与对苯二甲酸聚合生产新型的聚酯材料聚对苯二甲酸丙二醇脂(PTT)。1,3-丙二醇可以通过微生物发酵的方法，利用天然的微生物如克雷伯氏肺炎杆菌、丁酸梭菌等将甘油转化成1,3-丙二醇。由于克雷伯氏肺炎杆菌具有甘油代谢速率快、1,3-丙二醇产量高，能够耐受高浓度甘油和1,3-丙二醇，且发酵过程能在有氧条件下进行等特点，目前已被广泛应用于1,3-丙二醇的工业生产。

目前利用克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丙二醇主要存在的问题是发酵过程产生大量的副产物，如2,3-丁二醇，乳酸，丁二酸，乙醇，乙酸等，不但极大降低了1,3-丙二醇的得率同时使得后提取过程变的十分的复杂，极大增加了发酵及后提取过程的成本。因此，提高1,3-丙二醇的得率同时降低副产物的产量，对于降低1,3-丙二醇生产成本具有极其重要的意义。

1,3-丁二醇是另外一种具有重要工业应用价值的二元醇，其可以被用作化妆品的溶剂，同时可以用作单体来合成聚酯、聚氨酯及生物增塑剂。同时光学纯的1,3-丁二醇可以用作医药中间体来合成许多药物。但化学法合成的1,3-丁二醇都是外消旋体，无法直接用作医药中间体。因此，利用生物法生产光学纯1,3-丁二醇具有重要应用价值。

目前还没有任何报道能够直接利用微生物同时合成1,3-丙二醇和1,3-丁二醇。

发明内容

本发明的目的是提供一种联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用。

本发明构思如下：通过在克雷伯氏菌(如克雷伯氏肺炎杆菌)中引入1,3-丁二醇的生物合成途径，实现了在同一发酵过程同时生产两种具有重要工业价值的二元醇，使得两种二元醇相对于底物甘油的得率超过0.6g/g，远远大于单独生产1,3-丙二醇或1,3-丁二醇过程的收率。同时由于1,3-丁二醇与2,3-丁二醇竞争代谢底物且二者的分离十分困难，本发明通过阻断2,3-丁二醇的合成途径，完全消除了2,3-丁二醇的合成。本发明进一步通过敲除ldhA基因，adhE基因，mdh基因，消除了乳酸、乙醇、丁二酸的合成，使得重组克雷伯氏肺炎杆菌主要合成1,3-丙二醇和1,3-丁二醇两种产物，极大简化了后续提取的过程。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌，所述重组菌是将phaA、phaB、bld和yqhD基因通过质粒导入克雷伯氏菌(Klebsiella)中或通过基因工程手段整合到克雷伯氏菌染色体上而成。

其中，所述phaA基因为乙酰CoA酰基转移酶基因，来源于Cupriavidus necator，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

所述phaB基因为3-氧酰基-(酰基载体蛋白)还原酶基因，来源于Cupriavidusnecator，其为编码如下蛋白质(c)或(d)的基因：

(c)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d)SEQ ID NO:4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(c)衍生的蛋白质。

所述bld基因来源于Clostridium saccharoperbutylacetonicum，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。

所述yqhD基因为醇脱氢酶基因，来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，其为编码如下蛋白质(e)或(f)的基因：

(e)由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(f)SEQ ID NO:6所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(e)衍生的蛋白质。

优选地，所述克雷伯氏菌为克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)，更优选保藏号为CGMCC NO.7824的克雷伯肺炎杆菌ACR30。公众可以通过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)获得菌株ACR30。

所述重组菌可按如下方法构建得到：phaA、phaB基因经密码子优化后，与bld、yqhD基因一起构建到表达载体上，用重组载体转化克雷伯氏菌，筛选阳性转化子。

优选地，密码子优化的phaA-phaB操纵子的序列如SEQ ID NO:5所示。

更优选地，所述重组菌的构建如下：将bld-yqhD-phaAB串联基因表达盒构建到ptrc99a质粒上，用重组质粒转化克雷伯氏菌(如ACR30)，筛选阳性转化子。

其中，bld-yqhD-phaAB串联基因表达盒的序列如SEQ ID NO:9和10所示。

第二方面，本发明提供一种联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌，所述联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌是以上述重组菌作为出发菌株，利用基因工程手段对出发菌株进行改造，得到的细胞内NADPH供给增强的工程菌。

优选地，通过增强出发菌株中与NADPH生物合成途径相关的基因，来提高细胞内NADPH的供给。

更优选地，所述与NADPH生物合成途径相关的基因为pntAB基因，核苷酸序列如下：

i)SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；

ii)SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:7所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明中，所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：

1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；

2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；

3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；

4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；

5)通过导入增强子而增强；

6)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强。

第三方面，本发明提供一种联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组克雷伯氏菌，所述重组克雷伯氏菌是以上述重组菌作为出发菌株，通过弱化出发菌株中与2,3-丁二醇合成途径相关的基因，获得的基因弱化菌株。

所述与2,3-丁二醇合成途径相关的基因为budRABC基因，核苷酸序列如下：

i)SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；

ii)SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:8所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

第四方面，本发明提供一种高产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的工程菌，所述工程菌是以上述重组菌，或者上述重组克雷伯氏菌作为原始菌株，通过弱化原始菌株中ldhA、adhE、mdh基因中的至少一种基因，获得的基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低基因的表达。

ldhA、adhE、mdh基因编码蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11-13所示。

优选地，弱化原始菌株中ldhA、adhE和mdh基因。

本发明中，所述弱化包括敲除或降低相应基因的表达。

进一步地，所述弱化是指利用同源重组的方法敲除相应基因。

第五方面，本发明提供上述重组菌，或上述重组克雷伯氏菌，或上述工程菌，在发酵联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇中的应用。

第六方面，本发明提供一种联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的方法，包括在发酵培养基中对上述重组菌，或上述重组克雷伯氏菌，或上述工程菌进行培养以生产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇。

可选地，所述发酵培养基为：甘油20g/L,K₂HPO₄ 6g/L，KH₂PO₄ 3g/L，NaCl 0.5g/L，NH₄Cl 1g/L，MgSO₄ 0.5g/L,CaCl₂ 15mg/L,酵母粉2g/L,氨苄青霉素100mg/L，以水配制。

培养条件为：37℃，200rpm，控制溶氧低于10％的饱和溶氧值。

利用本发明提供的克雷伯氏菌工程菌，同时实现两种高附加值的二元醇(1,3-丙二醇和1,3-丁二醇)的生产，且两种二元醇相对于底物甘油的得率超过0.6g/g，远远大于单独生产1,3-丙二醇或1,3-丁二醇过程的收率。目标产物分离过程更加简化，从而极大提高整个生产过程的经济效益。

附图说明

图1为本发明所用质粒ptrc99a-bld-yqhD-phaAB的质粒图谱。

图2为本发明所用质粒ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB的质粒图谱。

图3为本发明所用质粒ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB-pntAB的质粒图谱。

具体实施方式

本发明具体的实施方式包括：(1)在克雷伯氏肺炎杆菌中引入1,3-丁二醇合成途径；(2)敲除2,3-丁二醇合成途径；(3)敲除其他副产物合成途径。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1在克雷伯氏肺炎杆菌中构建1,3-丁二醇的生物合成途径

克雷伯氏肺炎杆菌本身不能直接合成1,3-丁二醇，本发明通过在克雷伯氏肺炎杆菌中引入外源的1,3-丁二醇合成途径，实现1,3-丙二醇与1,3-丁二醇的联产。

首先构建包含来源于Cupriavidus necator的phaA、phaB基因，来源于Clostridium saccharoperbutylacetonicum的醛脱氢酶基因bld基因(编码蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO:1)，来源于大肠杆菌的yqhD基因(SEQ ID NO:4)的质粒ptrc99a-phaAB-bld-yqhD。以phaA(SEQ ID NO:3)，phaB(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列为基础，人工合成了密码子优化的phaA-phaB操纵子(SEQ ID NO:5)。将ptrc99a(从美国Addgene购买)用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson组装试剂盒将人工合成的phaA-phaB操纵子、bld基因、yqhD基因插入到ptrc99a质粒骨架上的EcoRI/XbaI酶切位点之间，获得的质粒命名为ptrc99a-phaAB-bld-yqhD(质粒图谱如图1所示)。

进一步地，本发明发现醛脱氢酶是影响1,3-丁二醇合成的关键制约因素。为此，本发明进行了大量的蛋白质工程改造，最终发现以ptrc99a-phaAB-bld-yqhD为模板，利用Biorad的基因突变试剂盒将bld基因的273位氨基酸由亮氨酸突变为苏氨酸(SEQ ID NO:2)，获得质粒ptrc99a-phaAB-bld(L273T)-yqhD(质粒图谱如图2所示)。

进一步地，本发明发现NADPH供给对于克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丁二醇的产量具有重要的影响，为此将ptrc99a-phaAB-bld(L273T)-yqhD用SbfI进行双酶切，利用Gibson组装试剂盒将大肠杆菌的pntAB基因(SEQ ID NO:7)插入到ptrc99a-phaAB-bld(L273T)-yqhD质粒骨架上，获得的质粒命名为ptrc99a-phaAB-bld(L273T)-yqhD-pntAB(质粒图谱如图3所示)。

将上述三个质粒分别转化到克雷伯氏肺炎杆菌ACR30(CN 201310688092.2)中，获得的重组菌命名为ACR30/ptrc99a-bld-yqhD-phaAB,ACR30/ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB,ACR30/ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB-pntAB。将这三株菌与对照菌ACR30在250mL的摇瓶进行培养，培养基为：甘油20g/L,K₂HPO₄ 6g/L，KH₂PO₄ 3g/L，NaCl 0.5g/L，NH₄Cl 1g/L，MgSO₄ 0.5g/L,CaCl₂ 15mg/L,酵母粉2g/L,氨苄青霉素100mg/L，培养温度为37℃，转速200rpm，待菌液OD₆₀₀＝0.6时，加入0.01mM的IPTG进行诱导，发酵48h时取样，利用高效液相色谱检测四株菌产物的分布情况。结果如表1所示，引入三个质粒后，三个重组菌株都可以同时生产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇，其中ACR30/ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB-pntAB的1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的产量分别达到7.2g/L和2.8g/L，而其他副产物的产量大大减少。而对照菌株ACR30不能合成1,3-丁二醇，其主要产物为1,3-丙二醇和2,3-丁二醇，产量分别为6.8g/L和2.4g/L，同时还生产大量有机酸。

表1引入13-丁二醇合成途径对克雷伯氏肺炎杆菌发酵的影响

实施例2敲除2,3-丁二醇合成途径提高1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的产量

上述改造实现了1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的联产，但是同时还是积累了较多的副产物，尤其是2,3-丁二醇与1,3-丁二醇沸点接近，难以分离。为此通过敲除克雷伯氏肺炎杆菌中的2,3-丁二醇合成途径budRABC基因(SEQ ID NO:8)，完全消除2,3-丁二醇的合成。

以克雷伯氏肺炎杆菌ACR30的基因组为模板以bud-up-F(atcgtatgtcttggatttaa)和bud-up-R(taataaaaaaagctctgacatggct cgaagcagctccagcctacagcgccatttt)为引物进行PCR，获得budRABC基因(SEQ ID NO:8)上游约1.0kb的DNA片段并进行PCR产物纯化。以克雷伯氏肺炎杆菌ACR30的基因组为模板以bud-down-F(gtcgacggatccccggaatattccctgtctcttgatcttcgcggcgccagcg)和bud-down-R(aaagcctcgcggtactgttt)为引物进行PCR，获得budRABC基因(SEQ ID NO:8)下游约1.0kb的DNA片段并进行PCR产物纯化。以质粒pIJ773(Journal of Industrial Microbiology 39(8):1219-26)为模板，以Apr-F(aaaatggcgctgtaggctggagctgcttcg)和Apr-R(agagacagggaatattccggggatccgtcgac)为引物进行PCR，获得安普霉素抗性基因约1.4kb的DNA片段并进行PCR产物纯化。以上面获得的三段PCR产物进行重叠PCR，获得约3.4kb的DNA片段并进行PCR产物纯化。

将包含有red重组系统的质粒pDK-red(Journal of Industrial Microbiology39(8):1219-26)电转入克雷伯氏肺炎杆菌ACR30中，获得的菌株命名为ACR30/pDK-red。将上述获得的3.4kb重叠PCR产物电转到克雷伯氏肺炎杆菌ACR30/pDK-red，在带有50mg/L安普霉素的LB平板上筛选带有抗性的菌株。进一步利用Flp酶消除安普霉素抗性，将正确的菌株命名为ACR30：ΔbudRABC。将质粒ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB-pntAB电转入ACR30：ΔbudRABC，获得的菌株命名为ACR30：ΔbudRABC/ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB-pntAB。将该菌株与对照菌株ACR30/ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB-pntAB进行发酵，发酵条件与实施例1相同，48h检测发酵产物的浓度。结果如表2所示，通过阻断2,3-丁二醇的合成途径，ACR30：ΔbudRABC/ptrc99a-phaAB-bld(L273T)-yqhD-pntAB完全不产2,3-丁二醇，同时1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的产量提高到了7.3g/L和3.2g/L。

表2敲除2,3-丁二醇合成途径对克雷伯氏肺炎杆菌发酵的影响

实施例3阻断副产物合成进一步提高1,3-丙二醇和1,3-丁二醇产量

上述改造实现了1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的联产，同时完全消除难以分离的2,3-丁二醇的合成，但仍然产生较多的副产物。为此通过敲除克雷伯氏肺炎杆菌中的乳酸合成基因ldhA、乙醇合成基因adhE，丁二酸合成基因mdh，极大降低副产物的合成，提高了1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的产量，简化了后提取工艺。

利用red重组系统，采用与实施例2相同的方法，以克雷伯氏肺炎杆菌ACR30的基因组为模板，分别以引物ldhA-up-F(tcacccgggcgatttcacagtc)、ldhA-up-R(aagacttttctccagtgattatacc)和ldhA-down-F(cgcctttcccttttgtgctcct)、ldhA-down-R(tggttcggcaattggcatgtgc)扩增ldhA上下游约1000bp片段，以引物adhE-up-F(aattaccaggagcgggggat)、adhE-up-R(ccaacagcgatagcatcgcg)和adhE-down-F(aatgctctcctgataatgtta)、adhE-down-R(cgatgctctcccggaccgccg)扩增adhE上下游约1000bp片段，以引物mdh-up-F(gtcatccccggcgatactgc)、mdh-up-R(cctaaactccttattatggttaatttagg)和mdh-down-F(tctcgccctaacagaagagc)、mdh-down-R(gaagcttaattttccctaatttaggc)扩增mdh上下游约1000bp片段，并分别与实施例2中的安普霉素抗性基因融合，将融合片段电转入ACR30：ΔbudRABC中用于敲除ldhA基因，adhE基因，mdh基因，获得重组菌分别命名为ACR30：ΔbudRABCΔldhA，ACR30：ΔbudRABCΔadhE，ACR30：ΔbudRABCΔmdh。进一步利用red重组系统同时敲除ACR30：ΔbudRABC中的ldhA基因，adhE基因以及mdh基因，获得的重组菌株命名为ACR30：ΔbudRABCΔldhAΔadhEΔmdh。将质粒ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB-pntAB分别电转入上述四株菌株，获得重组菌分别命名为ACR30：ΔbudRABCΔldhA/ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB-pntAB，ACR30：ΔbudRABCΔadhE/ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB-pntAB，ACR30：ΔbudRABCΔmdh/ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB-pntAB，ACR30：ΔbudRABCΔldhAΔadhEΔmdh/ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB-pntAB将上述四株菌与对照菌株ACR30：ΔbudRABC/ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB-pntAB进行发酵，发酵条件与实施例1相同，48h检测发酵产物的浓度。结果如表3所示，通过阻断副产物的合成，1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的产量都获得了提高。ACR30：ΔbudRABCΔldhAΔadhEΔmdh/ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB-pntAB的1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的产量提高到了7.5g/L和4.8g/L，两种二元醇的转化率超过0.6g/g甘油，其他副产物的产量都大大降低，极大简化了分离工艺，具有重要的经济价值。

表3阻断副产物合成途径对克雷伯氏肺炎杆菌发酵的影响

实施例4利用产酸克雷伯氏菌联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇

将实施例1中构建的质粒ptrc99a-bld-yqhD-phaAB、ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB、ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB-pntAB电转入产酸克雷伯氏菌M5al中(购自中国工业微生物菌种保藏中心)，获得的重组菌命名为M5al/ptrc99a-bld-yqhD-phaAB、M5al/ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB、M5al/ptrc99a-bld(L273T)-yqhD-phaAB-pntAB。将该菌株与对照菌M5al进行发酵，发酵条件与实施例1相同，48h检测发酵产物的浓度。结果见表4，说明在产酸克雷伯氏菌中引入本发明构建的1,3-丁二醇合成途径，同样实现了1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的联产，并降低副产物乳酸、2,3-丁二醇的合成。

表4引入1，3-丁二醇合成途径对产酸克雷伯氏菌发酵的影响

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 清华大学广东清大智兴生物技术有限公司

<120> 联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用

<130> KHP191113545.0

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 468

<212> PRT

<213> Clostridium saccharoperbutylacetonicum

<400> 1

Met Ile Lys Asp Thr Leu Val Ser Ile Thr Lys Asp Leu Lys Leu Lys

1 5 10 15

Thr Asn Val Glu Asn Ala Asn Leu Lys Asn Tyr Lys Asp Asp Ser Ser

20 25 30

Cys Phe Gly Val Phe Glu Asn Val Glu Asn Ala Ile Ser Asn Ala Val

35 40 45

His Ala Gln Lys Ile Leu Ser Leu His Tyr Thr Lys Glu Gln Arg Glu

50 55 60

Lys Ile Ile Thr Glu Ile Arg Lys Ala Ala Leu Glu Asn Lys Glu Ile

65 70 75 80

Leu Ala Thr Met Ile Leu Glu Glu Thr His Met Gly Arg Tyr Glu Asp

85 90 95

Lys Ile Leu Lys His Glu Leu Val Ala Lys Tyr Thr Pro Gly Thr Glu

100 105 110

Asp Leu Thr Thr Thr Ala Trp Ser Gly Asp Asn Gly Leu Thr Val Val

115 120 125

Glu Met Ser Pro Tyr Gly Val Ile Gly Ala Ile Thr Pro Ser Thr Asn

130 135 140

Pro Thr Glu Thr Val Ile Cys Asn Ser Ile Gly Met Ile Ala Ala Gly

145 150 155 160

Asn Thr Val Val Phe Asn Gly His Pro Gly Ala Lys Lys Cys Val Ala

165 170 175

Phe Ala Val Glu Met Ile Asn Lys Ala Ile Ile Ser Cys Gly Gly Pro

180 185 190

Glu Asn Leu Val Thr Thr Ile Lys Asn Pro Thr Met Asp Ser Leu Asp

195 200 205

Ala Ile Ile Lys His Pro Ser Ile Lys Leu Leu Cys Gly Thr Gly Gly

210 215 220

Pro Gly Met Val Lys Thr Leu Leu Asn Ser Gly Lys Lys Ala Ile Gly

225 230 235 240

Ala Gly Ala Gly Asn Pro Pro Val Ile Val Asp Asp Thr Ala Asp Ile

245 250 255

Glu Lys Ala Gly Lys Ser Ile Ile Glu Gly Cys Ser Phe Asp Asn Asn

260 265 270

Leu Pro Cys Ile Ala Glu Lys Glu Val Phe Val Phe Glu Asn Val Ala

275 280 285

Asp Asp Leu Ile Ser Asn Met Leu Lys Asn Asn Ala Val Ile Ile Asn

290 295 300

Glu Asp Gln Val Ser Lys Leu Ile Asp Leu Val Leu Gln Lys Asn Asn

305 310 315 320

Glu Thr Gln Glu Tyr Ser Ile Asn Lys Lys Trp Val Gly Lys Asp Ala

325 330 335

Lys Leu Phe Leu Asp Glu Ile Asp Val Glu Ser Pro Ser Ser Val Lys

340 345 350

Cys Ile Ile Cys Glu Val Ser Ala Arg His Pro Phe Val Met Thr Glu

355 360 365

Leu Met Met Pro Ile Leu Pro Ile Val Arg Val Lys Asp Ile Asp Glu

370 375 380

Ala Ile Glu Tyr Ala Lys Ile Ala Glu Gln Asn Arg Lys His Ser Ala

385 390 395 400

Tyr Ile Tyr Ser Lys Asn Ile Asp Asn Leu Asn Arg Phe Glu Arg Glu

405 410 415

Ile Asp Thr Thr Ile Phe Val Lys Asn Ala Lys Ser Phe Ala Gly Val

420 425 430

Gly Tyr Glu Ala Glu Gly Phe Thr Thr Phe Thr Ile Ala Gly Ser Thr

435 440 445

Gly Glu Gly Ile Thr Ser Ala Arg Asn Phe Thr Arg Gln Arg Arg Cys

450 455 460

Val Leu Ala Gly

465

<210> 2

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ile Lys Asp Thr Leu Val Ser Ile Thr Lys Asp Leu Lys Leu Lys

1 5 10 15

Thr Asn Val Glu Asn Ala Asn Leu Lys Asn Tyr Lys Asp Asp Ser Ser

20 25 30

Cys Phe Gly Val Phe Glu Asn Val Glu Asn Ala Ile Ser Asn Ala Val

35 40 45

His Ala Gln Lys Ile Leu Ser Leu His Tyr Thr Lys Glu Gln Arg Glu

50 55 60

Lys Ile Ile Thr Glu Ile Arg Lys Ala Ala Leu Glu Asn Lys Glu Ile

65 70 75 80

Leu Ala Thr Met Ile Leu Glu Glu Thr His Met Gly Arg Tyr Glu Asp

85 90 95

Lys Ile Leu Lys His Glu Leu Val Ala Lys Tyr Thr Pro Gly Thr Glu

100 105 110

Asp Leu Thr Thr Thr Ala Trp Ser Gly Asp Asn Gly Leu Thr Val Val

115 120 125

Glu Met Ser Pro Tyr Gly Val Ile Gly Ala Ile Thr Pro Ser Thr Asn

130 135 140

Pro Thr Glu Thr Val Ile Cys Asn Ser Ile Gly Met Ile Ala Ala Gly

145 150 155 160

Asn Thr Val Val Phe Asn Gly His Pro Gly Ala Lys Lys Cys Val Ala

165 170 175

Phe Ala Val Glu Met Ile Asn Lys Ala Ile Ile Ser Cys Gly Gly Pro

180 185 190

Glu Asn Leu Val Thr Thr Ile Lys Asn Pro Thr Met Asp Ser Leu Asp

195 200 205

Ala Ile Ile Lys His Pro Ser Ile Lys Leu Leu Cys Gly Thr Gly Gly

210 215 220

Pro Gly Met Val Lys Thr Leu Leu Asn Ser Gly Lys Lys Ala Ile Gly

225 230 235 240

Ala Gly Ala Gly Asn Pro Pro Val Ile Val Asp Asp Thr Ala Asp Ile

245 250 255

Glu Lys Ala Gly Lys Ser Ile Ile Glu Gly Cys Ser Phe Asp Asn Asn

260 265 270

Thr Pro Cys Ile Ala Glu Lys Glu Val Phe Val Phe Glu Asn Val Ala

275 280 285

Asp Asp Leu Ile Ser Asn Met Leu Lys Asn Asn Ala Val Ile Ile Asn

290 295 300

Glu Asp Gln Val Ser Lys Leu Ile Asp Leu Val Leu Gln Lys Asn Asn

305 310 315 320

Glu Thr Gln Glu Tyr Ser Ile Asn Lys Lys Trp Val Gly Lys Asp Ala

325 330 335

Lys Leu Phe Leu Asp Glu Ile Asp Val Glu Ser Pro Ser Ser Val Lys

340 345 350

Cys Ile Ile Cys Glu Val Ser Ala Arg His Pro Phe Val Met Thr Glu

355 360 365

Leu Met Met Pro Ile Leu Pro Ile Val Arg Val Lys Asp Ile Asp Glu

370 375 380

Ala Ile Glu Tyr Ala Lys Ile Ala Glu Gln Asn Arg Lys His Ser Ala

385 390 395 400

Tyr Ile Tyr Ser Lys Asn Ile Asp Asn Leu Asn Arg Phe Glu Arg Glu

405 410 415

Ile Asp Thr Thr Ile Phe Val Lys Asn Ala Lys Ser Phe Ala Gly Val

420 425 430

Gly Tyr Glu Ala Glu Gly Phe Thr Thr Phe Thr Ile Ala Gly Ser Thr

435 440 445

Gly Glu Gly Ile Thr Ser Ala Arg Asn Phe Thr Arg Gln Arg Arg Cys

450 455 460

Val Leu Ala Gly

465

<210> 3

<211> 393

<212> PRT

<213> Cupriavidus necator

<400> 3

Met Thr Asp Val Val Ile Val Ser Ala Ala Arg Thr Ala Val Gly Lys

1 5 10 15

Phe Gly Gly Ser Leu Ala Lys Ile Pro Ala Pro Glu Leu Gly Ala Val

20 25 30

Val Ile Lys Ala Ala Leu Glu Arg Ala Gly Val Lys Pro Glu Gln Val

35 40 45

Ser Glu Val Ile Met Gly Gln Val Leu Thr Ala Gly Ser Gly Gln Asn

50 55 60

Pro Ala Arg Gln Ala Ala Ile Lys Ala Gly Leu Pro Ala Met Val Pro

65 70 75 80

Ala Met Thr Ile Asn Lys Val Cys Gly Ser Gly Leu Lys Ala Val Met

85 90 95

Leu Ala Ala Asn Ala Ile Met Ala Gly Asp Ala Glu Ile Val Val Ala

100 105 110

Gly Gly Gln Glu Asn Met Ser Ala Ala Pro His Val Leu Pro Gly Ser

115 120 125

Arg Asp Gly Phe Arg Met Gly Asp Ala Lys Leu Val Asp Thr Met Ile

130 135 140

Val Asp Gly Leu Trp Asp Val Tyr Asn Gln Tyr His Met Gly Ile Thr

145 150 155 160

Ala Glu Asn Val Ala Lys Glu Tyr Gly Ile Thr Arg Glu Ala Gln Asp

165 170 175

Glu Phe Ala Val Gly Ser Gln Asn Lys Ala Glu Ala Ala Gln Lys Ala

180 185 190

Gly Lys Phe Asp Glu Glu Ile Val Pro Val Leu Ile Pro Gln Arg Lys

195 200 205

Gly Asp Pro Val Ala Phe Lys Thr Asp Glu Phe Val Arg Gln Gly Ala

210 215 220

Thr Leu Asp Ser Met Ser Gly Leu Lys Pro Ala Phe Asp Lys Ala Gly

225 230 235 240

Thr Val Thr Ala Ala Asn Ala Ser Gly Leu Asn Asp Gly Ala Ala Ala

245 250 255

Val Val Val Met Ser Ala Ala Lys Ala Lys Glu Leu Gly Leu Thr Pro

260 265 270

Leu Ala Thr Ile Lys Ser Tyr Ala Asn Ala Gly Val Asp Pro Lys Val

275 280 285

Met Gly Met Gly Pro Val Pro Ala Ser Lys Arg Ala Leu Ser Arg Ala

290 295 300

Glu Trp Thr Pro Gln Asp Leu Asp Leu Met Glu Ile Asn Glu Ala Phe

305 310 315 320

Ala Ala Gln Ala Leu Ala Val His Gln Gln Met Gly Trp Asp Thr Ser

325 330 335

Lys Val Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Ile Gly His Pro Ile Gly

340 345 350

Ala Ser Gly Cys Arg Ile Leu Val Thr Leu Leu His Glu Met Lys Arg

355 360 365

Arg Asp Ala Lys Lys Gly Leu Ala Ser Leu Cys Ile Gly Gly Gly Met

370 375 380

Gly Val Ala Leu Ala Val Glu Arg Lys

385 390

<210> 4

<211> 246

<212> PRT

<213> Cupriavidus necator

<400> 4

Met Thr Gln Arg Ile Ala Tyr Val Thr Gly Gly Met Gly Gly Ile Gly

1 5 10 15

Thr Ala Ile Cys Gln Arg Leu Ala Lys Asp Gly Phe Arg Val Val Ala

20 25 30

Gly Cys Gly Pro Asn Ser Pro Arg Arg Glu Lys Trp Leu Glu Gln Gln

35 40 45

Lys Ala Leu Gly Phe Asp Phe Ile Ala Ser Glu Gly Asn Val Ala Asp

50 55 60

Trp Asp Ser Thr Lys Thr Ala Phe Asp Lys Val Lys Ser Glu Val Gly

65 70 75 80

Glu Val Asp Val Leu Ile Asn Asn Ala Gly Ile Thr Arg Asp Val Val

85 90 95

Phe Arg Lys Met Thr Arg Ala Asp Trp Asp Ala Val Ile Asp Thr Asn

100 105 110

Leu Thr Ser Leu Phe Asn Val Thr Lys Gln Val Ile Asp Gly Met Ala

115 120 125

Asp Arg Gly Trp Gly Arg Ile Val Asn Ile Ser Ser Val Asn Gly Gln

130 135 140

Lys Gly Gln Phe Gly Gln Thr Asn Tyr Ser Thr Ala Lys Ala Gly Leu

145 150 155 160

His Gly Phe Thr Met Ala Leu Ala Gln Glu Val Ala Thr Lys Gly Val

165 170 175

Thr Val Asn Thr Val Ser Pro Gly Tyr Ile Ala Thr Asp Met Val Lys

180 185 190

Ala Ile Arg Gln Asp Val Leu Asp Lys Ile Val Ala Thr Ile Pro Val

195 200 205

Lys Arg Leu Gly Leu Pro Glu Glu Ile Ala Ser Ile Cys Ala Trp Leu

210 215 220

Ser Ser Glu Glu Ser Gly Phe Ser Thr Gly Ala Asp Phe Ser Leu Asn

225 230 235 240

Gly Gly Leu His Met Gly

245

<210> 5

<211> 1974

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

attgaaagga ctacacaatg actgacgttg tcatcgtatc cgccgcccgc accgcggtcg 60

gcaagtttgg cggctcgctg gccaagatcc cggcaccgga actgggtgcc gtggtcatca 120

aggccgcgct ggagcgcgcc ggcgtcaagc cggagcaggt gagcgaagtc atcatgggcc 180

aggtgctgac cgccggttcg ggccagaacc ccgcacgcca ggccgcgatc aaggccggcc 240

tgccggcgat ggtgccggcc atgaccatca acaaggtgtg cggctcgggc ctgaaggccg 300

tgatgctggc cgccaacgcg atcatggcgg gcgacgccga gatcgtggtg gccggcggcc 360

aggaaaacat gagcgccgcc ccgcacgtgc tgccgggctc gcgcgatggt ttccgcatgg 420

gcgatgccaa gctggtcgac accatgatcg tcgacggcct gtgggacgtg tacaaccagt 480

accacatggg catcaccgcc gagaacgtgg ccaaggaata cggcatcaca cgcgaggcgc 540

aggatgagtt cgccgtcggc tcgcagaaca aggccgaagc cgcgcagaag gccggcaagt 600

ttgacgaaga gatcgtcccg gtgctgatcc cgcagcgcaa gggcgacccg gtggccttca 660

agaccgacga gttcgtgcgc cagggcgcca cgctggacag catgtccggc ctcaagcccg 720

ccttcgacaa ggccggcacg gtgaccgcgg ccaacgcctc gggcctgaac gacggcgccg 780

ccgcggtggt ggtgatgtcg gcggccaagg ccaaggaact gggcctgacc ccgctggcca 840

cgatcaagag ctatgccaac gccggtgtcg atcccaaggt gatgggcatg ggcccggtgc 900

cggcctccaa gcgcgccctg tcgcgcgccg agtggacccc gcaagacctg gacctgatgg 960

agatcaacga ggcctttgcc gcgcaggcgc tggcggtgca ccagcagatg ggctgggaca 1020

cctccaaggt caatgtgaac ggcggcgcca tcgccatcgg ccacccgatc ggcgcgtcgg 1080

gctgccgtat cctggtgacg ctgctgcacg agatgaagcg ccgtgacgcg aagaagggcc 1140

tggcctcgct gtgcatcggc ggcggcatgg gcgtggcgct ggcagtcgag cgcaaataac 1200

ggcgacgata acgaagccaa tcaaggagtg gacatgactc agcgcattgc gtatgtgacc 1260

ggcggcatgg gtggtatcgg aaccgccatt tgccagcggc tggccaagga tggctttcgt 1320

gtggtggccg gttgcggccc caactcgccg cgccgcgaaa agtggctgga gcagcagaag 1380

gccctgggct tcgatttcat tgcctcggaa ggcaatgtgg ctgactggga ctcgaccaag 1440

accgcattcg acaaggtcaa gtccgaggtc ggcgaggttg atgtgctgat caacaacgcc 1500

ggtatcaccc gcgacgtggt gttccgcaag atgacccgcg ccgactggga tgcggtgatc 1560

gacaccaacc tgacctcgct gttcaacgtc accaagcagg tgatcgacgg catggccgac 1620

cgtggctggg gccgcatcgt caacatctcg tcggtgaacg ggcagaaggg ccagttcggc 1680

cagaccaact actccaccgc caaggccggc ctgcatggct tcaccatggc actggcgcag 1740

gaagtggcga ccaagggcgt gaccgtcaac acggtctctc cgggctatat cgccaccgac 1800

atggtcaagg cgatccgcca ggacgtgctc gacaagatcg tcgcgacgat cccggtcaag 1860

cgcctgggcc tgccggaaga gatcgcctcg atctgcgcct ggttgtcgtc ggaggagtcc 1920

ggtttctcga ccggcgccga cttctcgctc aacggcggcc tgcatatggg ctga 1974

<210> 6

<211> 387

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 6

Met Asn Asn Phe Asn Leu His Thr Pro Thr Arg Ile Leu Phe Gly Lys

1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Gly Leu Arg Glu Gln Ile Pro His Asp Ala Arg Val

20 25 30

Leu Ile Thr Tyr Gly Gly Gly Ser Val Lys Lys Thr Gly Val Leu Asp

35 40 45

Gln Val Leu Asp Ala Leu Lys Gly Met Asp Val Leu Glu Phe Gly Gly

50 55 60

Ile Glu Pro Asn Pro Ala Tyr Glu Thr Leu Met Asn Ala Val Lys Leu

65 70 75 80

Val Arg Glu Gln Lys Val Thr Phe Leu Leu Ala Val Gly Gly Gly Ser

85 90 95

Val Leu Asp Gly Thr Lys Phe Ile Ala Ala Ala Ala Asn Tyr Pro Glu

100 105 110

Asn Ile Asp Pro Trp His Ile Leu Gln Thr Gly Gly Lys Glu Ile Lys

115 120 125

Ser Ala Ile Pro Met Gly Cys Val Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gly Ser

130 135 140

Glu Ser Asn Ala Gly Ala Val Ile Ser Arg Lys Thr Thr Gly Asp Lys

145 150 155 160

Gln Ala Phe His Ser Ala His Val Gln Pro Val Phe Ala Val Leu Asp

165 170 175

Pro Val Tyr Thr Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Gln Val Ala Asn Gly Val

180 185 190

Val Asp Ala Phe Val His Thr Val Glu Gln Tyr Val Thr Lys Pro Val

195 200 205

Asp Ala Lys Ile Gln Asp Arg Phe Ala Glu Gly Ile Leu Leu Thr Leu

210 215 220

Ile Glu Asp Gly Pro Lys Ala Leu Lys Glu Pro Glu Asn Tyr Asp Val

225 230 235 240

Arg Ala Asn Val Met Trp Ala Ala Thr Gln Ala Leu Asn Gly Leu Ile

245 250 255

Gly Ala Gly Val Pro Gln Asp Trp Ala Thr His Met Leu Gly His Glu

260 265 270

Leu Thr Ala Met His Gly Leu Asp His Ala Gln Thr Leu Ala Ile Val

275 280 285

Leu Pro Ala Leu Trp Asn Glu Lys Arg Asp Thr Lys Arg Ala Lys Leu

290 295 300

Leu Gln Tyr Ala Glu Arg Val Trp Asn Ile Thr Glu Gly Ser Asp Asp

305 310 315 320

Glu Arg Ile Asp Ala Ala Ile Ala Ala Thr Arg Asn Phe Phe Glu Gln

325 330 335

Leu Gly Val Pro Thr His Leu Ser Asp Tyr Gly Leu Asp Gly Ser Ser

340 345 350

Ile Pro Ala Leu Leu Lys Lys Leu Glu Glu His Gly Met Thr Gln Leu

355 360 365

Gly Glu Asn His Asp Ile Thr Leu Asp Val Ser Arg Arg Ile Tyr Glu

370 375 380

Ala Ala Arg

385

<210> 7

<211> 2948

<212> DNA

<213> 克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)

<400> 7

gatggaaggg aatatcatgc gaattggcat accaagagaa cggttaacca atgaaacccg 60

tgttgcagca acgccaaaaa cagtggaaca gctgctgaaa ctgggtttta ccgtcgcggt 120

agagagcggc gcgggtcaac tggcaagttt tgacgataaa gcgtttgtgc aagcgggcgc 180

tgaaattgta gaagggaata gcgtctggca gtcagagatc attctgaagg tcaatgcgcc 240

gttagatgat gaaattgcgt tactgaatcc tgggacaacg ctggtgagtt ttatctggcc 300

tgcgcagaat ccggaattaa tgcaaaaact tgcggaacgt aacgtgaccg tgatggcgat 360

ggactctgtg ccgcgtatct cacgcgcaca atcgctggac gcactaagct cgatggcgaa 420

catcgccggt tatcgcgcca ttgttgaagc ggcacatgaa tttgggcgct tctttaccgg 480

gcaaattact gcggccggga aagtgccacc ggcaaaagtg atggtgattg gtgcgggtgt 540

tgcaggtctg gccgccattg gcgcagcaaa cagtctcggc gcgattgtgc gtgcattcga 600

cacccgcccg gaagtgaaag aacaagttca aagtatgggc gcggaattcc tcgagctgga 660

ttttaaagag gaagctggca gcggcgatgg ctatgccaaa gtgatgtcgg acgcgttcat 720

caaagcggaa atggaactct ttgccgccca ggcaaaagag gtcgatatca ttgtcaccac 780

cgcgcttatt ccaggcaaac cagcgccgaa gctaattacc cgtgaaatgg ttgactccat 840

gaaggcgggc agtgtgattg tcgacctggc agcccaaaac ggcggcaact gtgaatacac 900

cgtgccgggt gaaatcttca ctacggaaaa tggtgtcaaa gtgattggtt ataccgatct 960

tccgggccgt ctgccgacgc aatcctcaca gctttacggc acaaacctcg ttaatctgct 1020

gaaactgttg tgcaaagaga aagacggcaa tatcactgtt gattttgatg atgtggtgat 1080

tcgcggcgtg accgtgatcc gtgcgggcga aattacctgg ccggcaccgc cgattcaggt 1140

atcagctcag ccgcaggcgg cacaaaaagc ggcaccggaa gtgaaaactg aggaaaaatg 1200

tacctgctca ccgtggcgta aatacgcgtt gatggcgctg gcaatcattc tttttggctg 1260

gatggcaagc gttgcgccga aagaattcct tgggcacttc accgttttcg cgctggcctg 1320

cgttgtcggt tattacgtgg tgtggaatgt atcgcacgcg ctgcatacac cgttgatgtc 1380

ggtcaccaac gcgatttcag ggattattgt tgtcggagca ctgttgcaga ttggccaggg 1440

cggctgggtt agcttcctta gttttatcgc ggtgcttata gccagcatta atattttcgg 1500

tggcttcacc gtgactcagc gcatgctgaa aatgttccgc aaaaattaag gggtaacata 1560

tgtctggagg attagttaca gctgcataca ttgttgccgc gatcctgttt atcttcagtc 1620

tggccggtct ttcgaaacat gaaacgtctc gccagggtaa caacttcggt atcgccggga 1680

tggcgattgc gttaatcgca accatttttg gaccggatac gggtaatgtt ggctggatct 1740

tgctggcgat ggtcattggt ggggcaattg gtatccgtct ggcgaagaaa gttgaaatga 1800

ccgaaatgcc agaactggtg gcgatcctgc atagcttcgt gggtctggcg gcagtgctgg 1860

ttggctttaa cagctatctg catcatgacg cgggaatggc accgattctg gtcaatattc 1920

acctgacgga agtgttcctc ggtatcttca tcggggcggt aacgttcacg ggttcggtgg 1980

tggcgttcgg caaactgtgt ggcaagattt cgtctaaacc attgatgctg ccaaaccgtc 2040

acaaaatgaa cctggcggct ctggtcgttt ccttcctgct gctgattgta tttgttcgca 2100

cggacagcgt cggcctgcaa gtgctggcat tgctgataat gaccgcaatt gcgctggtat 2160

tcggctggca tttagtcgcc tccatcggtg gtgcagatat gccagtggtg gtgtcgatgc 2220

tgaactcgta ctccggctgg gcggctgcgg ctgcgggctt tatgctcagc aacgacctgc 2280

tgattgtgac cggtgcgctg gtcggttctt cgggggctat cctttcttac attatgtgta 2340

aggcgatgaa ccgttccttt atcagcgtta ttgcgggtgg tttcggcacc gacggctctt 2400

ctactggcga tgatcaggaa gtgggtgagc accgcgaaat caccgcagaa gagacagcgg 2460

aactgctgaa aaactcccat tcagtgatca ttactccggg gtacggcatg gcagtcgcgc 2520

aggcgcaata tcctgtcgct gaaattactg agaaattgcg cgctcgtggt attaatgtgc 2580

gtttcggtat ccacccggtc gcggggcgtt tgcctggaca tatgaacgta ttgctggctg 2640

aagcaaaagt accgtatgac atcgtgctgg aaatggacga gatcaatgat gactttgctg 2700

ataccgatac cgtactggtg attggtgcta acgatacggt taacccggcg gcgcaggatg 2760

atccgaagag tccgattgct ggtatgcctg tgctggaagt gtggaaagcg cagaacgtga 2820

ttgtctttaa acgttcgatg aacactggct atgctggtgt gcaaaacccg ctgttcttca 2880

aggaaaacac ccacatgctg tttggtgacg ccaaagccag cgtggatgca atcctgaaag 2940

ctctgtaa 2948

<210> 8

<211> 4242

<212> DNA

<213> 克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)

<400> 8

tcagaacatc gccagaaagc gtttcaccgt acgcgagcgc tcgaagcgcc gccaggcgat 60

ggcgatatcg gtcttcagcg gcgccccgct aagcgggtga tagctgacgt tcggctgctg 120

gatgcaggtc atcgactgcg gaaccagcgc gaagccgaag cctgcattga ccatgctcag 180

cgacgatgaa atttgcgacg actgccaggc gcgcgccata tcgatcccgg cgcgcaggca 240

actgttatac accagctcat acagcccggg ggccacctcc cgcgggaaga ggatcggcgc 300

cacgtcgcgc agctgctcca gggccagggt cggctgcgtc gccagcgggt tatcgcgcgg 360

cagcgcgata accatcggct cctcatcgat aatccgcaga ttaaaggctt tactgctctc 420

gcacggcagg cggacgaagg cgatatccag ctcggcctcg ctcagggcgg tcatcagatt 480

ggccatattg tcttccatct ggtgcagggt caccccgggg tggtcgagct gaaaacggtg 540

cagcagcgtg aagatttgcg gatggaaagc atcagaactg gtaatgccta gcgacaggct 600

gccgttcatc ccgcgcgcaa tgcccttggc cttctccagc gccgcatcgc tcatggcgag 660

gatctggcgg gcatcctcat agaaagactc tcccgcttcc gtcagctcca ccccgcgggt 720

taaacgccgg aacagcgggg ttcccacttc gcgctcaagc cgctgaattt gctgacttaa 780

cggaggctgt gaaataccca gctccttggc ggcctgggtg aagtgccgcg tcctggcgac 840

ggcgacaaaa tagcgaagat aacgaagttc catatcgaaa acgtctcaaa ccagcatggt 900

ttctatattg gaactgtgag ctgaatcggg tcaacattta tttaaccttt cttatatttg 960

ttgaacgagg aagtggtata tgaatcattc tgctgaatgc acctgcgaag agagtctatg 1020

cgaaaccctg cgggcgtttt ccgcgcagca tcccgagagc gtgctctatc agacatcgct 1080

catgagcgcc ctgctgagcg gggtttacga aggcagcacc accatcgcgg acctgctgaa 1140

acacggcgat ttcggcctcg gcacctttaa tgagctggac ggggagctga tcgccttcag 1200

cagtcaggtc tatcagctgc gcgccgacgg cagcgcgcgc aaagcccagc cggagcagaa 1260

aacgccgttc gcggtgatga cctggttcca gccgcagtac cggaaaacct ttgaccatcc 1320

ggtgagccgc cagcaactgc acgaggtgat tgaccagcaa atcccctctg acaacctgtt 1380

ctgcgccctg cgcatcgacg gccatttccg ccatgcccat acccgcaccg tgccgcgcca 1440

gacaccgccg taccgggcga tgaccgacgt cctcgacgat cagccggtgt tccgctttaa 1500

ccagcgcgaa ggggtgctgg tcggcttccg gaccccgcag catatgcagg ggatcaacgt 1560

cgccgggtat cacgagcatt ttattaccga tgaccgcaaa ggcggcggtc acctgctgga 1620

ttaccagctc gaccacgggg tgctgacctt cggcgaaatt cacaagctga tgatcgacct 1680

gcccgccgac agcgcgttcc tgcaggctaa tctgcatccc gataatctcg atgccgccat 1740

ccgttccgta gaaagttaag ggggtcacat ggacaaacag tatccggtac gccagtgggc 1800

gcacggcgcc gatctcgtcg tcagtcagct ggaagctcag ggggtacgcc aggtgttcgg 1860

catccccggc gctaaaatcg acaaggtctt cgattcactg ctggattcct ccattcgcat 1920

tattccggta cgccacgaag ccaacgccgc atttatggcc gccgccgtcg gacgtattac 1980

cggcaaagcg ggcgtggcgc tggtcacctc cggtccgggt tgttctaacc tgatcaccgg 2040

catggccacc gcgaacagcg aaggcgaccc ggtggtggcc ctgggcggcg cggtaaaacg 2100

cgccgataaa gccaaacagg tccatcagag tatggatacg gtggcgatgt tcagcccggt 2160

aaccaaatac gccgtcgagg tgacggcgcc ggatgcgctg gcggaagtgg tctccaacgc 2220

cttccgcgcc gccgagcagg gccggccggg cagcgcgttc gttagcctgc cgcaggatgt 2280

ggtcgatggc ccggtcagcg gcaaagtgct gccggccagc ggggccccgc agatgggcgc 2340

cgcgccggat gatgccatcg accaggtggc gaagcttatc gcccaggcga agaacccgat 2400

cttcctgctc ggcctgatgg ccagccagcc ggaaaacagc aaggcgctgc gccgtttgct 2460

ggagaccagc catattccag tcaccagcac ctatcaggcc gccggagcgg tgaatcagga 2520

taacttctct cgcttcgccg gccgggttgg gctgtttaac aaccaggccg gggaccgtct 2580

gctgcagctc gccgacctgg tgatctgcat cggctacagc ccggtggaat acgaaccggc 2640

gatgtggaac agcggcaacg cgacgctggt gcacatcgac gtgctgcccg cctatgaaga 2700

gcgcaactat accccggatg tcgagctggt gggcgatatc gccggcactc tcaacaagct 2760

ggcgcaaaat atcgatcatc ggctggtgct ctccccgcag gcggcggaga tcctccgcga 2820

ccgccagcac cagcgcgagc tgctggaccg ccgcggcgcg cagctcaacc agtttgccct 2880

gcatcccctg cgcatcgttc gcgccatgca ggacatcgtc aacagcgacg tcacgctgac 2940

cgtggacatg ggcagcttcc atatctggat tgcccgctac ctgtacagct tccgcgcccg 3000

ccaggtgatg atctccaacg gccagcagac catgggcgtc gccctgccct gggccatcgg 3060

cgcctggctg gtcaatcctg agcgcaaagt ggtctccgtc tccggcgacg gcggcttcct 3120

gcagtcgagc atggagctgg agaccgccgt ccgcctgaaa gccaacgtgc tgcacctgat 3180

ctgggtcgat aacggctaca acatggtcgc tatccaggaa gagaaaaaat atcagcgcct 3240

gtccggcgtc gagttcgggc cgatggattt taaagcctat gccgaatcct tcggcgcgaa 3300

agggtttgcc gtggaaagcg ccgaggcgct tgagccgacc ctgcgcgcgg cgatggacgt 3360

cgacggcccg gcggtagtgg ccatcccggt ggattatcgc gataacccgc tgctgatggg 3420

ccagctgcat ctgagtcaga ttctgtaagt catcacaata aggaaaggaa aatgaaaaaa 3480

gtcgcacttg ttaccggcgc cggccagggg attggtaaag ctatcgccct tcgtctggtg 3540

aaggatggat ttgccgtggc cattgccgat tataacgacg ccaccgccaa agcggtcgcc 3600

tccgaaatca accaggccgg cggccgcgcc atggcggtga aagtggatgt ctccgaccgc 3660

gaccaggtat ttgccgccgt cgaacaggcg cgcaaaacgc tgggcggctt cgacgtcatc 3720

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gacaaagtct acaatatcaa cgtcaaaggg gtgatctggg gcatccaggc ggcggttgag 3840

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<210> 9

<211> 4627

<212> DNA

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<400> 9

atgaacaaag atactttaat cccgacgacc aaagatttaa aacttaaaac gaatgtcgaa 60

aatatcaatt tgaaaaatta taaagataat tcctcttgct ttggggtctt cgaaaatgtg 120

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tacatctaca gtaaaaacat tgacaacctt aaccgttttg agcgcgaaat tgatacgacg 1260

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<210> 10

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gagactcaag agtatagcat taataaaaaa tgggttggga aggacgcaaa attgtttctt 1020

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gatatcgacg aagctattga atatgcgaaa atcgccgagc agaaccgtaa gcactcagcg 1200

tatatttatt ccaaaaatat cgataactta aatcgttttg agcgcgaaat cgatacaact 1260

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caacgtcgct gcgtgttagc cggttaaaac tttaagaagg agatatacat gaacaacttt 1440

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caaattcctc acgatgctcg cgtattgatt acctacggcg gcggcagcgt gaaaaaaacc 1560

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attgagccaa acccggctta tgaaacgctg atgaacgccg tgaaactggt tcgcgaacag 1680

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gcaacgcata tgctgggcca cgaactgact gcgatgcacg gtctggatca cgcgcaaaca 2280

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ctgcaatatg ctgaacgcgt ctggaacatc actgaaggtt ccgatgatga gcgtattgac 2400

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<210> 11

<211> 329

<212> PRT

<213> 克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)

<400> 11

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Gln His Val Asn Asp Ala Tyr Gly Phe Glu Leu Glu Phe Phe Asp Phe

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Leu Leu Thr Ala Lys Thr Ala Lys Thr Ala Asn Gly Cys Glu Ala Val

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Cys Ile Phe Val Asn Asp Asp Gly Ser Arg Pro Val Leu Glu Glu Leu

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Lys Ala His Gly Val Lys Tyr Ile Ala Leu Arg Cys Ala Gly Phe Asn

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Asn Val Asp Leu Glu Ala Ala Lys Glu Leu Gly Leu Arg Val Val Arg

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Val Pro Ala Tyr Ser Pro Glu Ala Val Ala Glu His Ala Ile Gly Met

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Met Met Ser Leu Asn Arg Arg Ile His Arg Ala Tyr Gln Arg Thr Arg

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Arg Ile Leu Lys Gly Phe Gly Met Arg Leu Leu Ala Phe Asp Pro Tyr

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Pro Ser Ala Ala Ala Leu Glu Leu Gly Val Glu Tyr Val Asp Leu Ala

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Asp Gly Val Met Val Ile Asn Thr Ser Arg Gly Ala Leu Ile Asp Ser

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Gln Ala Ala Ile Asp Ala Leu Lys His Gln Lys Ile Gly Ala Leu Gly

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Asp Asn Gly Val Ile Cys Ala Ser Glu Gln Ser Val Val Val Val Asp

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Val Gly Pro Lys His Leu Ile Asn Lys Lys Thr Val Ala Lys Arg Ala

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675 680 685

Ser Tyr His Glu Gly Ser Lys Asn Pro Val Ala Arg Glu Arg Val His

690 695 700

Ser Ala Ala Thr Ile Ala Gly Ile Ala Phe Ala Asn Ala Phe Leu Gly

705 710 715 720

Val Cys His Ser Met Ala His Lys Leu Gly Ser Gln Phe His Ile Pro

725 730 735

His Gly Leu Ala Asn Ala Leu Leu Ile Cys Asn Val Ile Arg Tyr Asn

740 745 750

Ala Asn Asp Asn Pro Thr Lys Gln Thr Ala Phe Ser Gln Tyr Asp Arg

755 760 765

Pro Gln Ala Arg Arg Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Asp His Leu Gly Leu

770 775 780

Ser Ala Pro Gly Asp Arg Thr Ala Ala Lys Ile Glu Lys Leu Leu Ala

785 790 795 800

Trp Leu Glu Ser Ile Lys Ala Glu Leu Gly Ile Pro Lys Ser Ile Arg

805 810 815

Glu Ala Gly Val Gln Glu Ala Asp Phe Leu Ala His Val Asp Lys Leu

820 825 830

Ser Glu Asp Ala Phe Asp Asp Gln Cys Thr Gly Ala Asn Pro Arg Tyr

835 840 845

Pro Leu Ile Ser Glu Leu Lys Gln Ile Leu Leu Asp Thr Tyr Tyr Gly

850 855 860

Arg Glu Phe Val Glu Gly Glu Ala Gly Ala Lys Ala Glu Val Ala Pro

865 870 875 880

Val Lys Ala Glu Lys Lys Ala Lys Lys Ser Ala

885 890

<210> 13

<211> 312

<212> PRT

<213> 克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)

<400> 13

Met Lys Val Ala Val Leu Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Gln Ala Leu

1 5 10 15

Ala Leu Leu Leu Lys Thr Gln Leu Pro Ser Gly Ser Glu Leu Ser Leu

20 25 30

Tyr Asp Ile Ala Pro Val Thr Pro Gly Val Ala Val Asp Leu Ser His

35 40 45

Ile Pro Thr Asp Val Lys Ile Lys Gly Phe Ser Gly Glu Asp Ala Thr

50 55 60

Pro Ala Leu Glu Gly Ala Asp Val Val Leu Ile Ser Ala Gly Val Ala

65 70 75 80

Arg Lys Pro Gly Met Asp Arg Ser Asp Leu Phe Asn Val Asn Ala Gly

85 90 95

Ile Val Lys Asn Leu Val Gln Gln Ile Ala Lys Thr Cys Pro Gln Ala

100 105 110

Cys Ile Gly Ile Ile Thr Asn Pro Val Asn Thr Thr Val Ala Ile Ala

115 120 125

Ala Glu Val Leu Lys Lys Ala Gly Val Tyr Asp Lys Asn Lys Leu Phe

130 135 140

Gly Val Thr Thr Leu Asp Ile Ile Arg Ser Asn Thr Phe Val Ala Glu

145 150 155 160

Leu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Val Glu Val Pro Val Ile Gly Gly

165 170 175

His Ser Gly Val Thr Ile Leu Pro Leu Leu Ser Gln Ile Pro Gly Val

180 185 190

Ser Phe Ser Asp Gln Glu Ile Ala Asp Leu Thr Lys Arg Ile Gln Asn

195 200 205

Ala Gly Thr Glu Val Val Glu Ala Lys Ala Gly Gly Gly Ser Ala Thr

210 215 220

Leu Ser Met Gly Gln Ala Ala Ala Arg Phe Gly Leu Ser Leu Val Arg

225 230 235 240

Ala Met Gln Gly Glu Lys Gly Val Val Glu Cys Ala Tyr Val Glu Gly

245 250 255

Asp Gly His Tyr Ala Arg Phe Phe Ser Gln Pro Leu Leu Leu Gly Lys

260 265 270

Asn Gly Val Glu Glu Arg Gln Ser Ile Gly Lys Leu Ser Ala Phe Glu

275 280 285

Gln Gln Ala Leu Glu Gly Met Leu Asp Thr Leu Lys Lys Asp Ile Ala

290 295 300

Leu Gly Glu Asp Phe Val Asn Lys

305 310

Claims

1.联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将phaA、phaB、bld和yqhD基因通过质粒导入克雷伯氏菌(Klebsiella)中或通过基因工程手段整合到克雷伯氏菌染色体上而成；

其中，所述phaA基因来源于Cupriavidus necator，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质；

所述phaB基因来源于Cupriavidus necator，其为编码如下蛋白质(c)或(d)的基因：

(c)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d)SEQ ID NO:4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(c)衍生的蛋白质；

所述bld基因来源于Clostridium saccharoperbutylacetonicum，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示；

所述yqhD基因来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，其为编码如下蛋白质(e)或(f)的基因：

(e)由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(f)SEQ ID NO:6所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(e)衍生的蛋白质；

优选地，所述克雷伯氏菌为克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)，更优选保藏号为CGMCC NO.7824的克雷伯肺炎杆菌ACR30。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建如下：phaA、phaB基因经密码子优化后，与bld、yqhD基因一起构建到表达载体上，用重组载体转化克雷伯氏菌，筛选阳性转化子；

3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建如下：将bld-yqhD-phaAB串联基因表达盒构建到ptrc99a质粒上，用重组质粒转化克雷伯氏菌，筛选阳性转化子；

4.联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌，其特征在于，所述联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌是以权利要求2或3所述的重组菌作为出发菌株，利用基因工程手段对出发菌株进行改造，得到的细胞内NADPH供给增强的工程菌；

优选地，通过增强出发菌株中与NADPH生物合成途径相关的基因，来提高细胞内NADPH的供给；

i)SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；

5.联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组克雷伯氏菌，其特征在于，所述重组克雷伯氏菌是以权利要求2-4任一项所述的重组菌作为出发菌株，通过弱化出发菌株中与2,3-丁二醇合成途径相关的基因，获得的基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低基因的表达。

6.根据权利要求5所述的重组克雷伯氏菌，其特征在于，所述与2,3-丁二醇合成途径相关的基因为budRABC基因，核苷酸序列如下：

i)SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；

7.高产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的工程菌，其特征在于，所述工程菌是以权利要求2-4任一项所述的重组菌，或者权利要求5或6所述的重组克雷伯氏菌作为原始菌株，通过弱化原始菌株中ldhA、adhE、mdh基因中的至少一种基因，获得的基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低基因的表达；

ldhA、adhE、mdh基因编码蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11-13所示；

优选地，弱化原始菌株中ldhA、adhE和mdh基因。

8.根据权利要求5或6所述的重组克雷伯氏菌，或者权利要求7或8所述的工程菌，其特征在于，所述弱化是指利用同源重组的方法敲除相应基因。

9.权利要求1-4任一项所述的重组菌，或权利要求5或6所述的重组克雷伯氏菌，或权利要求7所述的工程菌，或者权利要求8所述的重组克雷伯氏菌或工程菌在发酵联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇中的应用。

10.联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的方法，其特征在于，包括在发酵培养基中对权利要求1-4任一项所述的重组菌，或权利要求5或6所述的重组克雷伯氏菌，或权利要求7所述的工程菌，或者权利要求8所述的重组克雷伯氏菌或工程菌进行培养以生产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇。