CN115322975A - 路德维希肠杆菌氧化还原酶的突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了路德维希肠杆菌氧化还原酶突变体及其在催化5‑羟甲基糠醛选择性还原合成2,5‑二羟甲基呋喃中的应用。本发明公开的氧化还原酶为路德维希肠杆菌（Enterobacter ludwigii）YYP3产生的氧化还原酶ElSDR‑SSP1627，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明公开了该氧化还原酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明公开了该氧化还原酶的4种突变体及其编码基因。利用该新型氧化还原酶及其突变体的重组菌株分别转化5‑羟甲基糠醛为2,5‑二羟甲基呋喃，具有反应时间短，条件温和，对环境无污染，产物选择性高的特点，其中以突变体的重组菌株更加高效。

Description

路德维希肠杆菌氧化还原酶的突变体及其应用
技术领域
本发明涉及路德维希肠杆菌氧化还原酶的突变体及其应用，属于生物化学技术领域。
背景技术
随着倡导以绿色能源替代石油资源以及在化学工业中寻求环保替代品的可持续发展理念 的深入，人们对利用木质纤维素生物质生产高价值化学品和燃料越来越感兴趣，因为它是地 球上最丰富的可再生碳资源。5-羟甲基糠醛(HMF)作为最具价值的生物基平台化学品之一， 可以通过酸催化C6糖脱水得到，C6糖是木质纤维素的主要部分。HMF具有三个高活性基团： 芳香呋喃环、羟基和醛，使其能够通过氧化反应、加氢反应、醚化反应、酯化反应、缩合反 应等典型反应灵活地转化为多种增值化学物质。在这些衍生物中，通过选择性还原HMF甲 酰基制备的2，5-二羟甲基呋喃(BHMF)作为一种高附加值的二醇，在医药、高分子等领域具有 重要的应用价值。BHMF也因其能量密度高，沸点高，挥发性较低，空气中较稳定且不易吸 水，成为近年来兴起的一种新型燃油添加剂。
近年来，构建以过表达HMF相关酶作为全细胞生物催化剂的重组菌株已被证明是在高 HMF浓度下提高催化性能的有效策略。在工程菌株中过表达HMF相关酶比野生型有很大的 优势：(1)通过更快速有效地转化HMF来提高细胞的耐受性；(2)可以通过合理重新设计靶酶来提高催化特性。然而，据我们所知，目前只有三种酶被应用于BHMF生物合成：(1)在大肠杆菌CCZU-K14中过表达木兰念珠菌的NADH依赖性还原酶(CmCR)，72h内能将 200mMHMF转化为BHMF，产率为90.6％，时空产率2.5mM/h；(2)在E.coli BL21(DE3) 中过表达的还原性胺化酶AspRedAm变体N93A。18h内能将25mM HMF转化为BHMF，产 率为98％，选择性为99％，时空产率1.4mM/h；(3)在酿酒酵母中异源表达来自季也蒙迈耶 氏酵母SC1103的醇脱氢酶MgAAD1669，24h内能将250mM HMF转化为BHMF，产率为 94％，选择性为99％，时空产率9.8mM/h。可以看出，这三种已知的酶表达的重组菌在催化 HMF转化为BHMF时，时空产率在1.4-9.8mM/h，催化效率还有待进一步提高。此外，大多 数已报道的野生型菌株中，负责HMF减少的重要靶酶仍不清楚。综上所述，鉴定微生物中 负责HMF还原的重要靶酶，以及将鉴定得到的靶酶进行设计改造以提高其催化效率，对于 以HMF为原料合成BHMF生物催化路径的建立尤为重要。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了路德维希肠 杆菌氧化还原酶突变体、编码其突变体的核酸或基因、重组载体、细胞、重组菌株及其催化HMF选择性还原合成BHMF中的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了路德维希肠杆菌氧化还原酶突变体， 所述突变体是在野生型路德维希肠杆菌氧化还原酶上发生如下任意一种或几种突变：
A1)第38位的丙氨酸突变为丝氨酸；
A2)第94位的亮氨酸突变为色氨酸；
A3)第145位的丙氨酸突变为酪氨酸；
A4)第192位的谷氨酸突变为甲硫氨酸。
其中，所述突变体包括但不仅限于：
B1)如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示的氨 基酸序列包括如下任意一种或几种；
B2)在B1)中的氨基酸序列经过取代、修饰、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有氧化 还原酶活性；
B3)所述氨基酸序列与B1)中的氨基酸至少有90％以上的同源性。
本发明内容还包括编码所述的路德维希肠杆菌氧化还原酶突变体的核酸或基因，所述核 酸或基因包括如下任意一种或几种：
C1)如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示的核 苷酸序列；
C2)在C1)中的核苷酸序列经过取代、修饰、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有氧化 还原酶活性；
C3)与C1)中的核苷酸序列至少有90％的同源性。
本发明内容还包括表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌，其包含编码路德维希肠杆菌 氧化还原酶的基因或其包含所述的核酸或基因。
本发明内容还包括所述的路德维希肠杆菌氧化还原酶突变体、所述的核酸或基因、所述 的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌在生产5-羟甲基糠醛中的应用。
本发明内容还包括一种合成2，5-二羟甲基呋喃的方法，包括以下步骤：将编码路德维希 肠杆菌氧化还原酶的基因或权利要求3所述的核酸或基因插入表达载体，然后导入大肠杆菌， 得到重组菌；采用所述重组菌在磷酸缓冲液中转化5-羟甲基糠醛为2，5-二羟甲基呋喃。
其中，所述重组菌的接种量为15-25mg/mL。
其中，所述的合成2，5-二羟甲基呋喃的方法，其特征在于，所述所述磷酸缓冲液中5-羟 甲基糠醛的浓度为25-150mM，所述磷酸缓冲液中还含有葡萄糖，所述葡萄糖与5-羟甲基糠 醛的摩尔比为0-1∶1，转化在20-45℃的温度及pH 5.5-8.0下进行。
本发明的氧化还原酶为路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)YYP3产生的氧化还原酶 ElSDR-SSP1627，其野生型氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
作为本发明的实施例之一，将所述氧化还原酶的编码基因插入表达载体，然后导入E.coli BL21(DE3)，得到重组菌BL21-ElSDR-SSP1627；采用所述重组菌在磷酸缓冲液中转化5-羟 甲基糠醛为2，5-二羟甲基呋喃。其中所述菌株的接种量为20mg/mL，所述磷酸缓冲液中5- 羟甲基糠醛的含量为100mM，所述磷酸缓冲液中还含有葡萄糖，所述葡萄糖与5-羟甲基糠醛 的摩尔比为0.75∶1，转化在30℃的温度及pH 7.0下进行。
作为本发明的实施例之一，本发明提供的4种路德维希肠杆菌氧化还原酶突变体，分别 是：(1)氧化还原酶ElSDR-SSP1627的第38位的丙氨酸(A)突变为丝氨酸(S)后所得，其氨 基酸序列如SEQ ID NO：4所示；(2)氧化还原酶ElSDR-SSP1627的第94位的亮氨酸(L) 突变为色氨酸(W)后所得，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；(3)氧化还原酶 ElSDR-SSP1627的第145位的丙氨酸(A)突变为酪氨酸(Y)后所得，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；(4)氧化还原酶ElSDR-SSP1627的第192位的谷氨酸(E)突变为甲硫氨酸(M) 后所得，其氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
作为本发明的实施例之一，本发明将所述突变体的编码基因插入表达载体，然后导入 E.coli BL21(DE3)，得到重组菌；采用所述重组菌在磷酸缓冲液中转化5-羟甲基糠醛为2，5- 二羟甲基呋喃。其中所述菌株的接种量为20mg/mL，所述磷酸缓冲液中5-羟甲基糠醛的含量 为100mM，所述磷酸缓冲液中还含有葡萄糖，所述葡萄糖与5-羟甲基糠醛的摩尔比为0.75∶1， 转化在30℃的温度及pH 7.0下进行。
有益效果：与现有的技术相比，本发明具备以下优点：
1)本发明利用路德维希肠杆菌氧化还原酶的重组菌BL21-ElSDR-SSP1627作为催化剂， 能高效、高选择性地催化HMF转化为目标产物BHMF，克服了其他重组菌催化效率低的缺 点。
2)本发明利用的4种路德维希肠杆菌氧化还原酶突变体的重组菌对HMF的催化效率 高，能够在3h内催化高浓度底物(100mM)选择性还原合成目标产物，转化率在79.3％-98％， 选择性在98.5％-99％，时空产率在26.4-32.7mM/h。其中催化效率最高的重组菌为BL21-ElSDR-SSP1627-A38S，其时空产率可达32.7mM/h，远高于其他已报道的重组菌生物催化剂。
3)本发明提供的转化方法具有操作简单，无需添加培养基，易控、条件温和等特点，有 利于简化后续目标产物的分离纯化工艺。
附图说明
图1为不同情况下的液相色谱图。图1A显示了重组菌BL21-ElSDR-SSP1627-A38S生物 合成BHMF反应0h的液相色谱图(HMF的保留时间为6.538min)。图1B显示了重组菌 BL21-ElSDR-SSP1627-A38S生物合成BHMF反应1h的液相色谱图(BHMF及HMF的保留时 间分别为6.073及6.561min)。图1C显示了重组菌BL21-ElSDR-SSP1627-A38S生物合成BHMF 反应3h的液相色谱图(BHMF的保留时间为6.041min)。图1D显示了HMF对照品的液相色 谱图(HMF的保留时间为6.554min)。图1E显示了BHMF对照品的液相色谱图(BHMF的保留 时间为6.068min)。
图2为10种可能的酶表达的重组大肠杆菌BL21(DE3)细胞生物合成BHMF的转化率及 选择性，横坐标为基因名称，纵坐标为转化率/选择性。
图3为重组菌BL21-ElSDR-SSP1627及4种突变体重组菌生物合成BHMF反应3h的转化率及选择性，横坐标为基因名称，纵坐标为转化率/选择性。
图4为重组菌BL21-ElSDR-SSP1627及4种突变体重组菌生物合成BHMF的转化率，横坐标为转化时间，纵坐标为转化率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围并不受具体实施方式 的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材 料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、术语定义
宿主细胞
本文所用的术语“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即能够产生 本发明氧化还原酶的宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要本发明的氧化 还原酶能在该宿主细胞中表达。
湿重
本文所用的术语“湿重”是指菌液经离心、洗涤后所得湿菌体的质量。具体方法如下： 将菌液在6000rpm、4℃下离心5min，弃上清液；加入蒸馏水洗涤，在6000rpm、4℃下离心5min，弃上清；重复加蒸馏水、洗涤、离心、弃上清，将所得湿菌体称重。
2、材料
LB固体培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L。
LB液体培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L。
本发明所用的DNA聚合酶为TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.1(Code No.6022)。
E.coli BL21(DE3)感受态细胞通过常规CaCl2法制备。
3、仪器
高效液相条件：LC-20AT色谱系统，Symmetry Shield RP18色谱柱，SPD-M20A二极管 阵列检测器(DAD)，检测波长为240nm，柱温为25℃，流动相为0.1％乙酸水溶液(流动相A)和甲醇(流动相B)，流动相以92％(流动相A)：8％(流动相B)、0.8mL/min的流速等度洗脱。
实施例1
本实施例说明携带氧化还原酶基因的重组菌BL21-ElSDR-SSP1627在合成BHMF中的应 用。
(1)路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)YYP3保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2020607，保藏日期为2020年10月19日，保藏地 址为中国武汉武汉大学，邮编：430072。通过路德维希肠杆菌YYP3基因组功能注释可知， 该菌内有多种氧化还原酶可能参与将HMF还原为BHMF，根据转录本的表达水平，通过 FPKM值定量，发现德维希肠杆菌YYP3内有10个氧化还原酶的编码基因(FabI，hcp，ykvO， yqhD，queG，nrdG，Molybdopterin，SSP1627，ahpC，yliI)的表达水平较高，推测这10种 酶可能是还原HMF的候选酶。其中氧化还原酶ElSDR-SSP1627的基因序列如SEQ ID NO：1 所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
(2)在生工生物工程(上海)股份有限公司分别合成步骤(1)中的10个氧化还原酶编码 基因，并插入pUC57质粒得到10个重组质粒。将10个重组质粒、pET-28a载体分别经XhoI 和NcoI双酶切，用T4 DNA连接酶将酶切的基因片段与酶切的pET-28a连接得到质粒，并导入 E.coli BL21(DE3)中异源表达。将携带10个氧化还原酶的编码基因的E.coli BL21(DE3)接种 于5mL含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养12h，获得种子 液。然后将种子液按照接种量为2％接种于含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在 37℃、180rpm下培养，当600nm(OD600)处的光密度达到0.6-0.8时，加入终浓度为100μM的 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在25℃下诱导目的蛋白表达12h(如图2所示)。
(3)将步骤(2)中诱导表达后菌株的发酵液，离心，收集细胞，洗涤，最后分散在磷酸盐缓冲液中进行转化。其中，磷酸盐缓冲液(100mM)体积为4mL，含有100mM的HMF 和37.5mM的葡萄糖，pH为7.0。转化在转速为200rpm的摇床中进行，细胞用量为20mg/mL (湿重)，转化温度为30℃。“细胞用量为20mg/mL(湿重)”的含义是每毫升磷酸盐缓冲 液中细胞的用量为20mg(湿重)，下同。
(4)通过高效液相测定该菌转化HMF为BHMF的能力。当转化时间为7h时，取样进 行检测。结果如图2所示，只有重组菌BL21-ElSDR-ykvO(导入了携带ElSDR-ykvO基因的 重组质粒)和BL21-ElSDR-SSP1627(导入了携带ElSDR-SSP1627基因的重组质粒)能够有 效的转化HMF为BHMF。其中重组菌BL21-ElSDR-SSP1627的HMF转化率(HMF消耗浓 度/初始HMF浓度*100％)为97％，对还原产物BHMF的选择性(BHMF生成浓度/初始HMF 浓度*100％)为96.5％，时空产率(HMF转化率/反应时间)为13.9mM/h。因此，氧化还原 酶ElSDR-SSP1627在路德维希肠杆菌YYP3还原HMF反应中起到重要作用，为此基因的改 造及其在HMF还原中的进一步应用提供了优良的基因材料。
此外，我们还对比了已报道的三种酶(CmCR、MgAAD1669、AspRedAm)以及我们研究的ElSDR-SSP1627的氨基酸序列以及对HMF的催化效率。如表1所示，我们发现 ElSDR-SSP1627的催化效率更高，且与其他蛋白之间的同源性(8.6-22.9％)较低，说明 ElSDR-SSP1627是一个全新的、高效的催化HMF的酶。
表1氧化还原酶ElSDR-SSP1627与已报道的三种酶的对比
Figure BDA0003697172630000061
实施例2路德维希肠杆菌氧化还原酶突变体菌株的构建
以实施例1中得到的质粒pET-ElSDR-SSP1627为模板，通过全质粒PCR向SSP1627基因引入定点突变，所用引物见表2。突变体的名称表示为：原始氨基酸/突变位点/突变后氨基 酸，例如A38S表示氧化还原酶氧化还原酶ElSDR-SSP1627第38位的氨基酸A被突变为S后所得突变体。其他类推。PCR扩增结束后，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。回收产物用Dpn I消化，去除模板。消化后产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，在含有100μg/mL卡那霉素的LB抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑选单克隆，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将测序结果正确的质粒进行表达，获得重组菌株BL21-ElSDR-SSP1627-A38S、BL21-ElSDR-SSP1627-L94W、 BL21-ElSDR-SSP1627-A145Y、BL21-ElSDR-SSP1627-E192M。
PCR扩增体系：模板0.8μL，上下游引物各0.8μL，DNA聚合酶10μL，灭菌的双蒸水7.6μL， 总体积20μL。
PCR反应条件为：94℃8min，30个循环(94℃30s，62℃30s，72℃8min)，72℃10min，冷却至4℃。
表2菌株构建所用引物序列
Figure BDA0003697172630000071
实施例3携4种带氧化还原酶突变体基因的重组菌在合成BHMF中的应用。
(1)将实施例1中的重组菌BL21-ElSDR-SSP1627与实施例2中4种突变体的重组菌分 别接种于5mL含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养12h，获得种子液。然后将种子液按照接种量为2％接种于含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中， 在37℃、180rpm下培养，当600nm(OD600)处的光密度达到0.6-0.8时，加入终浓度为100μM 的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在25℃下诱导目的蛋白表达12h。
(2)将步骤(1)中诱导表达后菌株的发酵液，离心，收集细胞，洗涤，最后分散在磷酸盐缓冲液中进行转化。其中，磷酸盐缓冲液(100mM)体积为4mL，含有100mM的HMF 和37.5mM的葡萄糖，pH为7.0。转化在转速为200rpm的摇床中进行，细胞用量为20mg/mL (湿重)，转化温度为30℃。每隔1h分别取样进行检测，液相色谱图见图1。结果如图3及 图4所示，在3h时，重组菌BL21-ElSDR-SSP1627的HMF转化率仅为49％，4种突变体重 组菌的转化率在79.3％-98％，选择性在98.5％-99％，时空产率在26.4-32.7mM/h。其中重组菌 BL21-ElSDR-SSP1627-A38S使100mM HMF在3h内几乎完全转化，时空产率可达32.7mM/h， 催化效率较重组菌BL21-ElSDR-SSP1627更高，也明显高于其他已报道的重组菌株。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 路德维希肠杆菌氧化还原酶的突变体及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 747
<212> DNA
<213> 路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)
<400> 1
atgacagata acatcatagg caaagtaatt gtaatcacgg gcgcatcaag cggtatgggt 60
gaagcggctg cacgttatct tgctgaaaaa ggagcaaagg ttgtgatggc agcgcggaga 120
atagaccgca ttgaggccat tgcgagtgag ctccaaaagc agaataaaga agccatcgcc 180
gtcgcaaccg atgtgacgaa acttgatgac gtaaacaacc tcattgagac tgcggtcaac 240
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gaacagggaa atgtcgatga atggaatcag atgattgatg tcaatctgcg cggggttcta 360
cacgggattg ctgcggtgtt gccttatatg aaatcgcaaa aaacaggtca tatcattaac 420
accgcatctg ttgctgcaca ccttgtcttc cagagttctg ctgtctattc ggcgacaaaa 480
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Claims (8)

1.路德维希肠杆菌氧化还原酶突变体，其特征在于，所述突变体是在野生型路德维希肠杆菌氧化还原酶上发生如下任意一种或几种突变：
A1）第38位的丙氨酸突变为丝氨酸；
A2）第94位的亮氨酸突变为色氨酸；
A3）第145位的丙氨酸突变为酪氨酸；
A4）第192位的谷氨酸突变为甲硫氨酸。
2.根据权利要求1所述的路德维希肠杆菌氧化还原酶突变体，其特征在于，所述突变体包括：
B1）如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列包括如下任意一种或几种；
B2）在B1）中的氨基酸序列经过取代、修饰、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有氧化还原酶活性；
B3）所述氨基酸序列与B1）中的氨基酸至少有90%以上的同源性。
3.编码权利要求1或2所述的路德维希肠杆菌氧化还原酶突变体的核酸或基因，其特征在于，所述核酸或基因包括如下任意一种或几种：
C1）如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；
C2）在C1）中的核苷酸序列经过取代、修饰、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有氧化还原酶活性；
C3）与C1）中的核苷酸序列至少有90%的同源性。
4.表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌，其特征在于，其包含编码路德维希肠杆菌氧化还原酶的基因或其包含权利要求3所述的核酸或基因。
5.权利要求1或2所述的路德维希肠杆菌氧化还原酶突变体、权利要求3所述的核酸或基因、权利要求4所述的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌在生产5-羟甲基糠醛中的应用。
6.一种合成2,5-二羟甲基呋喃的方法，其特征在于，包括以下步骤：将编码路德维希肠杆菌氧化还原酶的基因或权利要求3所述的核酸或基因插入表达载体，然后导入大肠杆菌，得到重组菌；采用所述重组菌在磷酸缓冲液中转化5-羟甲基糠醛为2,5-二羟甲基呋喃。
7.根据权利要求6所述的合成2,5-二羟甲基呋喃的方法，其特征在于，所述重组菌的接种量为15-25 mg/mL。
8.根据权利要求6所述的合成2,5-二羟甲基呋喃的方法，其特征在于，所述所述磷酸缓冲液中5-羟甲基糠醛的浓度为25-150mM，所述磷酸缓冲液中还含有葡萄糖，所述葡萄糖与5-羟甲基糠醛的摩尔比为0-1:1，转化在20-45℃的温度及pH 5.5-8.0下进行。
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