CN108118064A

CN108118064A - 5-羟甲基糠醛氧化酶基因hmfo及其编码酶和应用

Info

Publication number: CN108118064A
Application number: CN201611077971.1A
Authority: CN
Inventors: 尹恒; 吴树丽; 刘启顺; 谭海东; 王文霞
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2018-06-05
Anticipated expiration: 2036-11-30
Also published as: CN108118064B

Abstract

本发明提供了一种硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)5‑羟甲基糠醛氧化酶及其制备方法，具体的说是将5‑羟甲基糠醛氧化酶的DNA序列克隆到质粒，并将重组质粒整合到宿主菌中，获得可异源表达该酶的基因工程菌株，用该菌株异源表达制备的5‑羟甲基糠醛氧化酶，能氧化5‑羟甲基糠醛转化为2,5‑呋喃二甲酸，2,5‑呋喃二甲醛和5‑甲酰基‑2‑呋喃甲酸。本发明为生物法氧化5‑羟甲基糠醛制备呋喃类大宗化学品提供技术基础。

Description

5-羟甲基糠醛氧化酶基因HMFO及其编码酶和应用

技术领域

本发明涉及一种硝基还原假单胞菌中5-羟甲基糠醛氧化酶的基因序列及其制备方法和应用。本发明还提供了该5-羟甲基糠醛的重组质粒和重组基因工程菌株。本发明的5-羟甲基糠醛氧化酶主要用于生物法制备大宗化学品领域，具体用于5-羟甲基糠醛的氧化制备呋喃类大宗化学品领域。

技术背景

随着化石资源的日益消耗，以及其带来大量温室气体的排放，可再生能源和可再生资源的开发利用在世界范围引起广泛重视。生物质是唯一可再生的碳资源，将生物质转化成平台化合物和大宗化学品是生物质转化利用的重要发展方向。5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，HMF)被认为是可由生物质原料制备的、最具价值和潜力替代石化工业中基础化学品的生物基平台化学品，在国际上被视为一种介于生物基糖化学和石油基化学之间的关键桥梁化合物(Rosatella AA,Simeonov SP,Frade RFM,et al.5-Hydroxymethylfurfural(HMF)as a building block platform:Biological properties,synthesis and synthetic applications[J].Green Chemistry,2011,13:754-793.)。欧盟BREW“以可再生原料利用生物技术生产大宗化工产品的中长期挑战”2006-2050中将HMF列为最重要的六碳平台化合物。HMF分子呋喃环上带有醛基和羟甲基，可以催化氧化生成一系列呋喃类芳香化合物，从而替代石油来源的苯类大宗化学品，因此具有广泛的经济和社会意义。

HMF带有一个醛基和一个羟甲基，根据氧化的位置和氧化程度，可以分别氧化成5-羟甲基-2-呋喃甲酸(5-hydroxymethylfuroic acid，HMFCA)，2,5-呋喃二甲醛(2,5-diformylfuranDFF)，5-甲酰基-2-呋喃甲酸(5-formylfuroic acid，FFCA)，2,5-呋喃二甲酸(2,5-furandicarboxylic acid，FDCA)(Lilga MA,Hallen RT,Gray M.Production ofOxidized Derivatives of5-Hydroxymethylfurfural(HMF)[J].Topics in Catalysis,2010,53:1264-1269)。

在这些HMF氧化产物中，FDCA的市场前景最为广阔。FDCA与石油基大宗化学品对苯二甲酸结构相似，可以替代对苯二甲酸用于制造聚酯，聚酰胺类材料(Gandini A,Silvestre AJD,Neto CP,et al.The furan counterpart of poly(ethyleneterephthalate):An alternative material based on renewable resources[J].Journal of Polymer Science Part A:Polymer Chemistry,2009,47:295-298.)，市场潜在规模可达每年百万吨级；此外、FDCA在农药和医药方面也有着广泛应用。2004年美国能源部(DOE)将FDCA列为可通过以生物质为原料制备的最具价值、最有希望替代石化产业中基础化学品的十二个平台化学品之一(Werpy T,Petersen G.Top Value Added Chemicalsfrom Biomass Volume I—Results of Screening for Potential Candidates fromSugars and Synthesis Gas[J].2004.)。2012年国际能源署(IEA)将FDCA列为生物基来源的C6平台化合物(Jong Ed,Higson A,Walsh P,et al.Bio-based Chemicals Value AddedProducts from Biorefinerie[J].2012)。HMF的其他氧化产物同样具有非常重要的应用价值。DFF具有醛的典型化学性质，可以作为聚合物单体以及药物和农药中间体(Hopkins KT,Wilson WD,Bender BC,et al.Extended Aromatic Furan Amidino Derivatives asAnti-Pneumocystis carinii Agents[J].Medicinal Chemistry,1998,41:3872-3878.)，功能性材料(Ma J,Du Z,Xu J,et al.Efficient aerobic oxidation of 5-hydroxymethylfurfural to 2,5-diformylfuran,and synthesis of a fluorescentmaterial[J].ChemSusChem,2011,4:51-54)，具有广泛应用。而HMFCA自身带有羧基和羟甲基，可以自身或者与其他化合物聚合成多种聚酯(Hirai H.Oligomers fromHydroxymethylfurancarboxylic Acid[J].Journal of Macromolecular Science:PartA-Chemistry,2006,21:1165-1179.)，同时还可以作为白介素抑制剂(Braisted AC,OslobJD,Delano WL,et al.Discovery of a Potent Small Molecule IL-2Inhibitor throughFragment Assembly[J].J.AM.CHEM.SOC.,2013,125:3714-3715.)。

HMF的化学转化已经取得较多进展，主要是以钌，锰和钒(Nie J,Xie J,LiuH.Efficient aerobic oxidation of 5-hydroxymethylfurfural to2,5-diformylfuranon supported Ru catalysts[J].Journal of Catalysis,2013,301:83-91.AmarasekaraAS,Green D,McMillan E.Efficient oxidation of5-hydroxymethylfurfural to 2,5-diformylfuran using Mn(III)–salen catalysts[J].Catalysis Communications,2008,9:286-288.Halliday GA,Young RJ,Jr.,Grushin VV.One-pot,two-step,practicalcatalytic synthesis of2,5-diformylfuran from fructose[J].Org Lett,2003,5:2003-5.Siankevich S,Savoglidis G,Fei Z,et al.A novel platinum nanocatalystfor the oxidation of5-Hydroxymethylfurfural into 2,5-Furandicarboxylic acidunder mild conditions[J].Journal of Catalysis,2014,315:67-74.)等金属催化剂催化HMF氧化制备DFF和MA，用铂，金和钯等(Gorbanev YY,Klitgaard SK,Woodley JM,etal.Gold-catalyzed aerobic oxidation of 5-hydroxymethylfurfural in water atambient temperature[J].ChemSusChem,2009,2:672-675.Zhang Z,Zhen J,Liu B,etal.Selective aerobic oxidation of the biomass-derived precursor5-hydroxymethylfurfural to 2,5-furandicarboxylic acid under mild conditionsover a magnetic palladium nanocatalyst[J].Green Chem.,2015,17:1308-1317.)催化HMF氧化制备FDCA。然而所有的这些方法都需要较高温度和压力，存在产物选择性和底物耐受性差的问题。与化学转化相比，生物转化具有反应条件温和，选择性高的特点。

近几年，生物转化HMF越来越成为人们关注的重点。HMF的生物催化氧化主要有全细胞催化和分离酶胞外催化氧化两种。Wierckx等(Koopman F,Wierckx N,de Winde JH,etal.Efficient whole-cell biotransformation of5-(hydroxymethyl)furfural intoFDCA,2,5-furandicarboxylic acid[J].Bioresour Technol,2010,101:6291-6296.)利用氧化还原酶仅限用于有氧条件的特点，利用全细胞催化氧化HMF，其FDCA收率能达到97％。但全细胞催化过程需要持续的碳源，同时生成的FDCA不易分离，不利于下游氧化产物的回收。而胞外酶氧化能够作用于更高的底物浓度，产物回收率高，且耗水量低，胞外催化氧化HMF制备下游大宗化学品日益成为大家研究的重点。一种醇氧化酶(AAO)被发现在pH 6的磷酸盐缓冲体系中能完全氧化HMF转化为FFCA(Carro J,Ferreira P,Rodriguez L,et al.5-hydroxymethylfurfural conversion by fungal aryl-alcohol oxidase andunspecific peroxygenase[J].FEBS J,2014.)。半乳糖氧化酶能选择性氧化HMF转化为DFF，黄嘌呤氧化酶氧化HMF转化为HMFCA(Qin Y-Z,Li Y-M,Zong M-H,et al.Enzyme-catalyzed selective oxidation of 5-hydroxymethylfurfural(HMF)and separationof HMF and 2,5-diformylfuran using deep eutectic solvents[J].Green Chem.,2015,17:3718-3722.)，这些酶选择性较高，但是不能同时完成HMF到FDCA的三步氧化，而且反应pH多为中性。与上述氧化酶相比，5-羟甲基糠醛氧化酶是一种FAD依赖酶，在FAD辅因子的作用下能完全氧化HMF转化为FDCA，首个可以单酶氧化5-羟甲基糠醛完全转化为FDCA的酶，而且反应介质为磷酸盐缓冲液，更环保，在将5-羟甲基糠醛氧化制备呋喃类大宗化学品领域的应用方面具有优势(Dijkman WP,Groothuis DE,Fraaije MW.Enzyme-catalyzedoxidation of 5-hydroxymethylfurfural to furan-2,5-dicarboxylic acid[J].AngewChem Int Ed Engl,2014,53:6515-6518.)。

本专利通过NCBI软件Blast分析筛选到一株硝基还原假单胞菌(Pseudomonasnitroreducens)具有5-羟甲基糠醛氧化活性，将其基因进行克隆、测序和在宿主菌种表达，构建高产5-羟甲基糠醛氧化酶菌株，获得高活性5-羟甲基糠醛氧化酶，用于制备氧化5-羟甲基糠醛转化为2,5-呋喃二甲酸，2,5-呋喃二甲醛和5-甲酰基-2-呋喃甲酸。该酶在FAD辅因子作用下，能将HMF氧化到FDCA，且该酶反应pH范围较宽，尤其在碱性环境中酶活更高，环境适应性更强，有利于产业化。本专利为生物法氧化5-羟甲基糠醛制备呋喃类大宗化学品提供技术基础，为生物法氧化5-羟甲基糠醛提供了一条绿色、环保的路线。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组5-羟甲基糠醛氧化酶的制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下。

一种来源于硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens，保藏编号：CICCNO.20703)的5-羟甲基糠醛氧化酶基因HMFO，其核苷酸序列具有如下特征之一：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有5-羟甲基糠醛氧化酶活性的核苷酸序列。

所述的5-羟甲基糠醛氧化酶基因编码的5-羟甲基糠醛氧化酶，其编码的氨基酸序列具有如下特征之一：

1)序列表中SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-532位氨基酸残基序列；

2)对序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有5-羟甲基糠醛氧化酶活性的氨基酸序列。

所述的5-羟甲基糠醛氧化酶的制备方法，将5-羟甲基糠醛氧化酶的DNA序列克隆到大肠杆菌表达载体pET21a，并将重组质粒整合到宿主菌大肠杆菌BL21中，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的5-羟甲基糠醛氧化酶。

所述的表达载体为大肠杆菌表达载体或者酵母表达载体，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞(Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5α)，或者酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis)。

所述的重组5-羟甲基糠醛氧化酶，其特征在于：可用于氧化5-羟甲基糠醛以及其他初级醇，初级硫醇，偕二醇。

所述的重组5-羟甲基糠醛氧化酶，酶反应pH范围较宽，尤其在碱性环境中酶活更高，环境适应性更强；其催化氧化5-羟甲基糠醛反应的pH在6-10之间，优选为8-9；反应温度在20-40℃之间。

与现有技术相比，本发明的优势在于以下几点：

1.本专利发现的5-羟甲基糠醛氧化酶基因来源于硝基还原假单胞菌，为一种新的5-羟甲基氧化酶。

2.本专利发明的5-羟甲基氧化酶活性更高，催化反应时间更短；

3.5-羟甲基氧化酶在碱性时具有较好活性，环境适应性更好，催化反应时底物转化率更高，更有利于产业化。

附图说明

图1：5-羟甲基糠醛氧化酶HMFO基因的电泳检测。

图2：5-羟甲基糠醛氧化酶HMFO纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)

各泳道加入的样品分别是：泳道1-E.coli BL21/pET21a-HMFO诱导表达前的菌液沉淀；泳道2-E.coli BL21/pET21a-HMFO破菌后上清；泳道3-E.coli BL21/pET21a-HMFO破菌后沉淀；泳道4-破菌上清经镍柱的流出液；泳道M-预染蛋白分子量标准；泳道5-40mmol/L咪唑洗脱液；泳道6-60mmol/L咪唑洗脱液；泳道7-80mmol/L咪唑洗脱液；泳道8-250mmol/L咪唑洗脱液；泳道9-500mmol/L咪唑洗脱液。

图3：5-羟甲基糠醛氧化酶催化氧化HMF。

图4:5-羟甲基糠醛氧化酶最适pH值测定。

图5：5-羟甲基糠醛氧化酶最适温度测定。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进一步说明。

实施实例1：5-羟甲基糠醛氧化酶基因序列分析

测序的结果采用GenBank数据库中的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)分析，Vector NTI Suite 8.0软件进行多序列比对，分析序列信息。

获得的5-羟甲基糠醛氧化酶基因(命名为HMFO)编码区长1632bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。HMFO编码543个氨基酸和一个终止密码子，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，蛋白质理论分子量为58686Da，预测等电点为5.96，氨基酸中带电的有152个，占34.45％，酸性氨基酸有65个，占13.17％，碱性氨基酸有52个，占12.98％，极性氨基酸有102个，占19.07％，疏水性氨基酸有205个，占36.44％。Ala有58个，Gly有56个，Glu有26个。

(1)SEQ ID No.1的信息(参见序列表)

(a)序列特征

*长度：1632碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Pseudomonas nitroreducens菌株。

序列表：

SEQ ID NO.1

ATGACCACTCCTCGCTATGACCACATCATCGTCGGCGGCGGCAGCGCCGGCAGCGTGCTTGCCAGCCGCCTCAGCGCCGACCCGCAACGCCACGTCCTGCTCATCGAAGCCGGCCCGGACACCCCACCCCACGCCACGCCGGCGGAAATCCTCGACGGCCACAACCCCTTCCGCCTGCGCCTGGAACTGCGCGATCGCTATTTCTGGCCGGACCTGAGCGTCCGCCACGGTGCGCAGCCCGAAGGCATCGAGCGCCCCGAGCGCTATCTCGAGCAGGCCCGCTTGCTCGGCGGCGGCTCCAGCGTCAACGTGCTGGTGGCCAACCGCGGTCTGCCGCGCGACTACGACCAGTGGGCAGCGCTGGGTGCCGAAGGCTGGGGCTGGGACGACGTGCTGCCGTACTTCCGCAAGCTCGAACGCGACACCGACTACGCCGGCCCGCTGCACGGGCATGACGGGCCGATCCCGATCAGCCGCGTCTCCACCCGCGACTGGACGCCCTTCACCCGCTCCGTGGTCTCGGCGCTGCAAGCCGAAGGCCTGCGCGACATCGGCGACCAGAACGGCGTGTTCGACGACGGCTACTTCGCCCCCGCGGTAAACCTGGAGCATGGCCAGCGCGTGTCCGCCGCCCGCGGCTACCTCGATGAAGCAGTGCGCGCACGGCCCAACCTGACGCTGTGGACCGACAGCCAGGTACTCGGCCTGCAACGCGAGGGCACGCGCATCACCGGCGTCGAACTGCAACGTAACGGTGAGCACGTCACCGTGGGGGCTGGCGAAGTCATCCTCGCCGCCGGAGCGCTGCAATCGCCGGCCTTCCTGCTGCGTAGCGGCATCGGCCCGGCCAGCCAGTTGCAGGAGCTGGGCATCGAGGTGATCGTCGACCGCCCCGGCGTCGGCGGCAACCTGTGGGAGCACAGCTCGCTGGGCACCCTCGCCACCCTGGGCGATGCCGCCCGCTCGGACGCCGTGCTGGCACGGCCCGGCACCTCGCACCAACTGGGTATCCGGGTGTCCTCGGGCGTCGATCCGGACACGCCCTCGGACCTCTACCTGGCCATCGGCGCGGACGCCGAGCGCGGCGTGGCCCACGCGCTGTTCTGGATCAACAAACCCAGCTCCAGTGGCCGCCTGACCTTGCGCGATCGCGACCCGGCAAGCCCGCCGCACGTCGATTTCAACCTGCTCTCCGACCCTCGCGATCTGCAACGCGCCCGTGTGGCGCTGCGCACCATCCAGCGCCTGTTCAAGCACCCGGTCCTGGCGCGCTACGAACTGCAATTGGCGCTTACCCCCTTCGCCGTGCCGCAACCGGGCGGGCCGAAGCTGGAAACCCTGCTGGCCGACGACACGGCGCTGGAAGCCTACCTGCGCCGGCACATAGGCGGCGTCTGGCACCCCAGCGGTACCTGCCGCATCGGCACCGCCGATGACCCGCAGGCCGTGGTCGACAGCGCCGGTCGCGTCCATGGCGTGGAAGGCCTGCGTGTCGCCGACGCCTCGATCATCCCGGTGATCCCCACCGCCAACACCAACCTGCCGACCCTGATGCTCGCCGAGAAAATCGCCGACGCCATCCTGGGCGGAGCCAAGCTTTCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA

SEQ ID No.2的信息

(a)序列特征

*长度：544氨基酸残基

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白

SEQ ID NO.2

MTTPRYDHIIVGGGSAGSVLASRLSADPQRHVLLIEAGPDTPPHATPAEILDGHNPFRLRLELRDRYFWPDLSVRHGAQPEGIERPERYLEQARLLGGGSSVNVLVANRGLPRDYDQWAALGAEGWGWDDVLPYFRKLERDTDYAGPLHGHDGPIPISRVSTRDWTPFTRSVVSALQAEGLRDIGDQNGVFDDGYFAPAVNLEHGQRVSAARGYLDEAVRARPNLTLWTDSQVLGLQREGTRITGVELQRNGEHVTVGAGEVILAAGALQSPAFLLRSGIGPASQLQELGIEVIVDRPGVGGNLWEHSSLGTLATLGDAARSDAVLARPGTSHQLGIRVSSGVDPDTPSDLYLAIGADAERGVAHALFWINKPSSSGRLTLRDRDPASPPHVDFNLLSDPRDLQRARVALRTIQRLFKHPVLARYELQLALTPFAVPQPGGPKLETLLADDTALEAYLRRHIGGVWHPSGTCRIGTADDPQAVVDSAGRVHGVEGLRVADASIIPVIPTANTNLPTLMLAEKIADAILGGAKLSAALEHHHHHH

实施例2 5-羟甲基糠醛氧化酶HMFO全长基因克隆

按细菌基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa公司)操作步骤提取硝基还原假单胞菌的基因组DNA。对5-羟甲基糠醛氧化酶基因序列进行多序列比对分析后，设计引物F：5’-AGTCCATATGACCACTCCTCGCTATGAC-3’和R：5’-ATATAAGCTTGGCTCCGCCCAGAATG-3’。以硝基还原假单胞菌菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃4min，1个循环；98℃10s，68℃5s每个循环降低0.2℃，72℃1min 45s，35个循环；72℃10min，1个循环。1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，产物大小为1596bp。胶回收试剂盒(购自Axygen公司)纯化PCR产物。

实施例3重组质粒PET21a-HMFO的构建

纯化后的PCR产物和空载体pET21a分别用限制性内切酶Nde Ⅰ和Hid Ⅲ进行双酶切，胶回收试剂盒纯化酶切产物，在T4DNA连接酶的作用下，将纯化的酶切产物进行连接，连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞后，涂布于含有100μg/ml的氨苄LB(酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L)固体培养基上，37℃培养12h。取单克隆接入含有100μg/ml氨苄的液体LB培养基中培养，提取质粒。将重组质粒分别用限制性内切酶Nde Ⅰ和HidⅢ进行双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，得到条带大小正确的酶切产物，初步证明构建的重组质粒正确，然后将该重组质粒PET21a-HMFO送去北京六合华大基因科技股份有限公司测序。结果表明，在PET21a的Nde Ⅰ和Hid Ⅲ酶切位点之间插入5-羟甲基糠醛氧化酶的基因，插入方向正确，进一步证明构建的重组质粒正确。

实施例4重组质粒转化至大肠杆菌宿主细胞BL21

取1μL质粒加入50μL BL21感受态细胞冰浴10min到30min，42℃水浴2min，冰浴2min到10min加400μL LB液体培养基，37℃，150r/min摇30min。取适量涂布于含有100μg/ml的氨苄LB(酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L)固体培养基上，37℃培养12h。

实施例5重组菌株的诱导表达

挑单菌落于200ml LB液体培养基(氨苄浓度100μg/mL)，37℃，180r/min培养至OD₆₀₀值0.6-0.8；加IPTG至终浓度为0.1mmol/L 16℃，180r/min诱导表达14h。8000r/min离心10min，去除上清，菌体加NAT缓冲液(20mM Tris-Hcl 0.5M Nacl 10％甘油)再悬浮，超声破碎，8000r/min离心，去除菌体，获得酶液，Ni柱纯化，得纯化蛋白。

实施例6HMFO基因在酵母中表达

1.重组质粒pPICZαA-HMFO突变体的构建：将实施例1纯化的PCR产物与T载体pMD19-T进行TA连接，连接产物转化E.coli Top10，经蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定获得阳性克隆子，同时提取质粒送去北京六合华大基因科技股份有限公司测序。将测序正确的质粒和空载体pPICZαA(购自Invitrogen公司)分别用限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切，胶回收试剂盒纯化酶切产物，在T4DNA连接酶的作用下，将纯化的酶切产物进行连接，连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞后，涂布于含有25μg/ml博来霉素(Zeocin，Invitrogen公司)的LLB(酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉15g/L)固体培养基上，37℃培养12h，菌落PCR进行验证。挑取阳性单克隆接入含有25μg/mlZeocin的液体LLB培养基中培养，提取质粒。将重组质粒分别用限制性内切酶NdeI和HindⅢ进行双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，得到条带大小正确的酶切产物，初步证明构建的重组质粒正确，然后将该重组质粒pPICZαA-HMFO送去北京六合华大基因科技股份有限公司测序。结果表明，在pPICZαA的NdeI和HindⅢ酶切位点之间插入了成熟HMFO基因，插入方向正确，进一步证明构建的重组质粒正确。

2.重组质粒电转化至毕赤酵母X-33：用SacI线性化重组质粒pPICZαA-HMFO，参照GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit(法国Fermentas公司)的操作说明对单酶切产物进行柱式纯化，1％琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果，按照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册(pPICZαA,B,and C Pichia expression vectors for selection onZeocin^TMand purification of recombinant proteins)进行电转化和诱导表达。取5ul线性化的重组质粒电转化至毕赤酵母感受态细胞X-33(购自Invitrogen公司)，线性化的空载体pPICZαA作为对照同时进行电转化，电转化的条件为：2mm转化杯，2000V电压，200Ω电阻，25uF电容，在含有100μg/mLZeocin的YPDS(山梨醇181.6g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L)抗性平板上，30℃培养3-4后长出单菌落，挑取了9个单菌落进行酵母菌落PCR。

3.重组菌株的诱导表达：将阳性克隆单菌落接种至50ml BMGY(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB13.4g/L，10％甘油100ml，4×10^-5％生物素，100.0mM pH 6.0的磷酸盐缓冲液100ml)培养基中，28℃，200rpm培养至OD600＝2-6，室温下1500rpm离心5min，收集菌体，用100mlBMMY(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB13.4g/L，4×10^-5％生物素，100.0mM pH 6.0的磷酸盐缓冲液100ml，0.5％的甲醇)重悬菌体，28℃，180rpm进行诱导表达，每24h加入终浓度为0.5％的甲醇，同时取样5ml，进行菌体密度、菌体湿重的测定。诱导96h后，4℃，8000rpm离心20min收集上清，获得5-羟甲基糠醛氧化酶。SDS-PAGE检测诱导表达效果，在SDS-PAGE电泳胶上呈现一条大约55kD的蛋白条带。

实施例7 5-羟甲基糠醛氧化酶最适pH检测

分别取100uL 10mg/mL香草醇于850uL 50mM甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.2)，醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.05.0),50mM磷酸钾缓冲液(pH6.07.08.0)50mM甘氨酸-氢氧化钠(pH9.010.0)分别加入50ug HMFO，30℃反应1h。按标准方法测定酶活。以最高酶活力为100％计算相对酶活。结果如图4所示，HMFO的最适反应pH值为8.0。

实施例8 5-羟甲基糠醛氧化酶最适温度检测

取10组100uL 10mg/mL香草醇于850uL 50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)中，加入50ugHMFO，分别在25,30,40,45,50,55℃下反应1h。产物于340nM下检测。按标准方法测定酶活。以最高酶活力为100％计算相对酶活。结果如图5所示，HMFO的最适反应温度为30℃。

实施例9 5-羟甲基糠醛氧化酶催化氧化5-羟甲基糠醛

取23.3mg 5-羟甲基糠醛于25mL 50mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)中，加入0.39mgHMFO，通空气，在25℃下搅拌反应24h。5-羟甲基糠醛的转化率89％，产物5-甲酰基-2-呋喃甲酸，2,5-呋喃二甲醛，2,5-呋喃二甲酸的收率分别为58％，9％，8％。

实施例10 5-羟甲基糠醛氧化酶催化氧化2,5-呋喃二甲醛制备2,5-呋喃二甲酸，5-甲酰基-2-呋喃甲酸

取2mM 2,5-呋喃二甲醛于25mL 50mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)加入2uM HMFO，通空气，在25℃下搅拌反应。HPLC检测反应产物。2,5-呋喃二甲醛转化率100％，5-甲酰基-2-呋喃甲酸收率91％，2,5-呋喃二甲酸收率9％。

实施例11 5-羟甲基糠醛氧化酶催化氧化HMF制备FDCA

取23.8mg 5-羟甲基糠醛于25mL 50mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)中，加入0.25mgHMFO，20uM FAD辅因子，通空气，在25℃下搅拌反应24h。5-羟甲基糠醛转化率100％，产物5-甲酰基-2-呋喃甲酸，2,5-呋喃二甲醛，2,5-呋喃二甲酸的收率分别为0％，0％，99.9％。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 5-羟甲基糠醛氧化酶基因HMFO及其编码酶和应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1635

<212> DNA

<213> Pseudomonas nitroreducens菌株

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(1635)

<400> 1

atgaccactc ctcgctatga ccacatcatc gtcggcggcg gcagcgccgg cagcgtgctt 60

gccagccgcc tcagcgccga cccgcaacgc cacgtcctgc tcatcgaagc cggcccggac 120

accccacccc acgccacgcc ggcggaaatc ctcgacggcc acaacccctt ccgcctgcgc 180

ctggaactgc gcgatcgcta tttctggccg gacctgagcg tccgccacgg tgcgcagccc 240

gaaggcatcg agcgccccga gcgctatctc gagcaggccc gcttgctcgg cggcggctcc 300

agcgtcaacg tgctggtggc caaccgcggt ctgccgcgcg actacgacca gtgggcagcg 360

ctgggtgccg aaggctgggg ctgggacgac gtgctgccgt acttccgcaa gctcgaacgc 420

gacaccgact acgccggccc gctgcacggg catgacgggc cgatcccgat cagccgcgtc 480

tccacccgcg actggacgcc cttcacccgc tccgtggtct cggcgctgca agccgaaggc 540

ctgcgcgaca tcggcgacca gaacggcgtg ttcgacgacg gctacttcgc ccccgcggta 600

aacctggagc atggccagcg cgtgtccgcc gcccgcggct acctcgatga agcagtgcgc 660

gcacggccca acctgacgct gtggaccgac agccaggtac tcggcctgca acgcgagggc 720

acgcgcatca ccggcgtcga actgcaacgt aacggtgagc acgtcaccgt gggggctggc 780

gaagtcatcc tcgccgccgg agcgctgcaa tcgccggcct tcctgctgcg tagcggcatc 840

ggcccggcca gccagttgca ggagctgggc atcgaggtga tcgtcgaccg ccccggcgtc 900

ggcggcaacc tgtgggagca cagctcgctg ggcaccctcg ccaccctggg cgatgccgcc 960

cgctcggacg ccgtgctggc acggcccggc acctcgcacc aactgggtat ccgggtgtcc 1020

tcgggcgtcg atccggacac gccctcggac ctctacctgg ccatcggcgc ggacgccgag 1080

cgcggcgtgg cccacgcgct gttctggatc aacaaaccca gctccagtgg ccgcctgacc 1140

ttgcgcgatc gcgacccggc aagcccgccg cacgtcgatt tcaacctgct ctccgaccct 1200

cgcgatctgc aacgcgcccg tgtggcgctg cgcaccatcc agcgcctgtt caagcacccg 1260

gtcctggcgc gctacgaact gcaattggcg cttaccccct tcgccgtgcc gcaaccgggc 1320

gggccgaagc tggaaaccct gctggccgac gacacggcgc tggaagccta cctgcgccgg 1380

cacataggcg gcgtctggca ccccagcggt acctgccgca tcggcaccgc cgatgacccg 1440

caggccgtgg tcgacagcgc cggtcgcgtc catggcgtgg aaggcctgcg tgtcgccgac 1500

gcctcgatca tcccggtgat ccccaccgcc aacaccaacc tgccgaccct gatgctcgcc 1560

gagaaaatcg ccgacgccat cctgggcgga gccaagcttt cggccgcact cgagcaccac 1620

caccaccacc actga 1635

<210> 2

<211> 544

<212> PRT

<213> Pseudomonas nitroreducens菌株

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(544)

<400> 2

Met Thr Thr Pro Arg Tyr Asp His Ile Ile Val Gly Gly Gly Ser Ala

1 5 10 15

Gly Ser Val Leu Ala Ser Arg Leu Ser Ala Asp Pro Gln Arg His Val

20 25 30

Leu Leu Ile Glu Ala Gly Pro Asp Thr Pro Pro His Ala Thr Pro Ala

35 40 45

Glu Ile Leu Asp Gly His Asn Pro Phe Arg Leu Arg Leu Glu Leu Arg

50 55 60

Asp Arg Tyr Phe Trp Pro Asp Leu Ser Val Arg His Gly Ala Gln Pro

65 70 75 80

Glu Gly Ile Glu Arg Pro Glu Arg Tyr Leu Glu Gln Ala Arg Leu Leu

85 90 95

Gly Gly Gly Ser Ser Val Asn Val Leu Val Ala Asn Arg Gly Leu Pro

100 105 110

Arg Asp Tyr Asp Gln Trp Ala Ala Leu Gly Ala Glu Gly Trp Gly Trp

115 120 125

Asp Asp Val Leu Pro Tyr Phe Arg Lys Leu Glu Arg Asp Thr Asp Tyr

130 135 140

Ala Gly Pro Leu His Gly His Asp Gly Pro Ile Pro Ile Ser Arg Val

145 150 155 160

Ser Thr Arg Asp Trp Thr Pro Phe Thr Arg Ser Val Val Ser Ala Leu

165 170 175

Gln Ala Glu Gly Leu Arg Asp Ile Gly Asp Gln Asn Gly Val Phe Asp

180 185 190

Asp Gly Tyr Phe Ala Pro Ala Val Asn Leu Glu His Gly Gln Arg Val

195 200 205

Ser Ala Ala Arg Gly Tyr Leu Asp Glu Ala Val Arg Ala Arg Pro Asn

210 215 220

Leu Thr Leu Trp Thr Asp Ser Gln Val Leu Gly Leu Gln Arg Glu Gly

225 230 235 240

Thr Arg Ile Thr Gly Val Glu Leu Gln Arg Asn Gly Glu His Val Thr

245 250 255

Val Gly Ala Gly Glu Val Ile Leu Ala Ala Gly Ala Leu Gln Ser Pro

260 265 270

Ala Phe Leu Leu Arg Ser Gly Ile Gly Pro Ala Ser Gln Leu Gln Glu

275 280 285

Leu Gly Ile Glu Val Ile Val Asp Arg Pro Gly Val Gly Gly Asn Leu

290 295 300

Trp Glu His Ser Ser Leu Gly Thr Leu Ala Thr Leu Gly Asp Ala Ala

305 310 315 320

Arg Ser Asp Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr Ser His Gln Leu Gly

325 330 335

Ile Arg Val Ser Ser Gly Val Asp Pro Asp Thr Pro Ser Asp Leu Tyr

340 345 350

Leu Ala Ile Gly Ala Asp Ala Glu Arg Gly Val Ala His Ala Leu Phe

355 360 365

Trp Ile Asn Lys Pro Ser Ser Ser Gly Arg Leu Thr Leu Arg Asp Arg

370 375 380

Asp Pro Ala Ser Pro Pro His Val Asp Phe Asn Leu Leu Ser Asp Pro

385 390 395 400

Arg Asp Leu Gln Arg Ala Arg Val Ala Leu Arg Thr Ile Gln Arg Leu

405 410 415

Phe Lys His Pro Val Leu Ala Arg Tyr Glu Leu Gln Leu Ala Leu Thr

420 425 430

Pro Phe Ala Val Pro Gln Pro Gly Gly Pro Lys Leu Glu Thr Leu Leu

435 440 445

Ala Asp Asp Thr Ala Leu Glu Ala Tyr Leu Arg Arg His Ile Gly Gly

450 455 460

Val Trp His Pro Ser Gly Thr Cys Arg Ile Gly Thr Ala Asp Asp Pro

465 470 475 480

Gln Ala Val Val Asp Ser Ala Gly Arg Val His Gly Val Glu Gly Leu

485 490 495

Arg Val Ala Asp Ala Ser Ile Ile Pro Val Ile Pro Thr Ala Asn Thr

500 505 510

Asn Leu Pro Thr Leu Met Leu Ala Glu Lys Ile Ala Asp Ala Ile Leu

515 520 525

Gly Gly Ala Lys Leu Ser Ala Ala Leu Glu His His His His His His

530 535 540

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工设计

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(28)

<400> 3

agtccatatg accactcctc gctatgac 28

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工设计

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(26)

<400> 4

atataagctt ggctccgccc agaatg 26

Claims

1.一种5-羟甲基糠醛氧化酶基因HMFO，其核苷酸序列具有如下特征之一：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2.一种权利要求1所述的5-羟甲基糠醛氧化酶基因编码的5-羟甲基糠醛氧化酶，其特征在于：其编码的氨基酸序列具有如下特征之一：

3.一种权利要求2所述的5-羟甲基糠醛氧化酶的制备方法，其特征在于：将5-羟甲基糠醛氧化酶的DNA序列克隆到大肠杆菌表达载体pET21a，并将重组质粒整合到宿主细胞中，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的5-羟甲基糠醛氧化酶。

4.根据权利要求3，其特征在于：所述的表达载体为大肠杆菌表达载体或者酵母表达载体的制备方法，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞(Escherichia coli BL21、Escherichiacoli JM109、Escherichia coli DH5α中的一种或二种以上)，或者酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis中的一种或二种以上)中的一种或二种以上。

5.一种权利要求2所述的重组5-羟甲基糠醛氧化酶的应用，其特征在于：可用于氧化5-羟甲基糠醛以及酚类，呋喃类，不饱和直链的初级醇和初级硫醇，以及可自发水合的偕二醇中的一种或二种以上。

6.根据权利要求5所述的重组5-羟甲基糠醛氧化酶的应用，其特征在于：其催化氧化5-羟甲基糠醛反应的pH在6-10之间，优选为8-9；反应温度在20-40℃之间。