CN104862296A - 一种比酶活和稳定性提高的融合型腈水合酶 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种比酶活和稳定性提高的融合型腈水合酶，属于基因工程领域。本发明将来源于恶臭假单胞菌的腈水合酶在大肠杆菌中高效表达并采用亚基融合策略提高稳定性及产物耐受性。本发明方法简单高效安全，能够在较短的表达周期里获得稳定性高，产物耐受性强的大量可溶性腈水合酶，有利于在简单条件下进行大规模工业生产，以及进一步对融合型腈水合酶成熟机制的理论研究。

Description

一种比酶活和稳定性提高的融合型腈水合酶
本申请是申请号为：201510195795.0，申请日为：2015年04月22日，申请名称为：一种比酶活和稳定性提高的融合型腈水合酶的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种比酶活和稳定性提高的融合型腈水合酶，属于基因工程领域。
背景技术
腈水合酶(Nitrile hydratase，简称NHase，EC4.2.1.84)，是一类可以催化腈类物质通过水合作用反应转化为高附加值的酰胺类化合物的金属酶。腈水合酶的结构编码基因包括一个α亚基、一个β亚基和一个调控亚基三个基因。根据活性中心螯合的金属离子的不同，腈水合酶一般可以分为钴型腈水合酶(Co-NHase)和铁型腈水合酶(Fe-NHase)。
腈水合酶在工业生产上已经被广泛应用，其中用这种酶所生产的丙烯酰胺已近百万吨，占整个丙烯酰胺产量的三分之一。生物技术相对于传统的化学合成法有着成本低、能耗少、少污染的优势。然而，在工业生产中，大部分具有高酶活的工业腈水合酶都存在着稳定性差的缺点。例如，来源于Pseudomonas chlororaphilsB23和Rhodococcus sp.N-774的腈水合酶在20℃的条件下保持稳定，而来源于第三代腈水合酶工业生产用菌Rhodococcus rhodochrous J1的腈水合酶也仅仅在10～30℃的条件下稳定。而且由于腈类水合反应是一个放热的过程，所以生产过程中必须通过降温来保持酶活的发挥，因此导致了大量的能耗，提高了生产成本。在工业生产过程中，除了要提高腈水合酶的热稳定性，提高腈水合酶对高浓度产物酰胺的耐受性也是很有必要的。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种提高腈水合酶稳定性和耐受性的分子改造方法。由于原始腈水合酶的亚基是分离的，在高温条件下可能会解聚，从而终止酶活。通过分子手段在基因水平上以共价键的方式融合两个亚基，消除了亚基解聚的可能性。从而使得融合型腈水合酶的稳定性提高，更适用于工业生产。该策略具有广泛的通用性，对不同来源的亚基分离的腈水合酶均适用。
本发明的第一个目的是提供一种比酶活和稳定性提高的融合型腈水合酶。
所述腈水合酶融合表达了β亚基和α亚基并同时表达调控亚基，或者融合表达β亚基、α亚基和调控亚基。
所述腈水合酶，在本发明的一种实施方式中，其基因顺序按照β亚基、α亚基、调控亚基这样的顺序。
所述腈水合酶，在本发明的一种实施方式中，是从来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida NRRL-18668)的序列为SEQ ID NO.1所示的腈水合酶改造得到的。其α亚基、β亚基、调控亚基的氨基酸序列与恶臭假单胞菌的相同。
所述腈水合酶，在本发明的一种实施方式中，其β亚基的氨基酸序列是SEQ ID NO.2，α亚基的氨基酸序列是SEQ ID NO.3，调控亚基的氨基酸序列是SEQ ID NO.4。
所述β亚基和α亚基的基因之间通过核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示的linker连接。
所述腈水合酶，在本发明的一种实施方式中，其核苷酸序列是SEQ ID NO.6或SEQ IDNO.7所示的序列。
本发明的第二个目的是提供含有所述腈水合酶的质粒载体。
本发明的第三个目的是提供表达所述腈水合酶的基因工程菌。
所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，是大肠杆菌。
本发明的第四个目的是提供一种所述基因工程菌的构建方法。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，是将SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列克隆到表达载体pET-28a中，然后转化到Escherichia coli BL21中，即得到基因工程菌。
本发明的第五个目的是提供一种利用所述基因工程菌发酵生产腈水合酶的方法，其特征在于，所述方法是：将重组大肠杆菌接种于含有16g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L NaCl的培养基中，于37℃培养至OD600＝0.8，然后加入IPTG和CoCl2·6H2O进行诱导，诱导温度为24℃，诱导16h。
本发明的第六个目的是提供一种提高腈水合酶比酶活和热稳定性的方法。
所述方法是融合表达腈水合酶的β亚基和α亚基并同时表达调控亚基，或者融合表达β亚基、α亚基和调控亚基。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，是按照β亚基、α亚基、调控亚基的基因顺序表达腈水合酶，β亚基、α亚基通过序列如SEQ ID NO.5所示的linker连接。
本发明还要求保护所述腈水合酶的应用，尤其是在丙烯酰胺生产方面的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明的酶，相对于野生酶，其比酶活提高、热稳定性增强、对产物的耐受性提高，可以克服现有的腈水合酶热稳定性不高、底物耐受性不足的问题；
(2)本发明的基于亚基融合的提高比酶活和热稳定性的方法，利用亚基融合策略将B和A基因用连接肽linker1融合为一个单独的肽段，并在BA基因下游共表达调控蛋白P14K基因，避免了在高温条件下可能会亚基解聚，提高了融合型腈水合酶的稳定性；同时为了避免P14K降解，还可以在BA融合的基础上将P14K基因融合在A基因下游。
附图说明
图1：野生型腈水合酶和融合型腈水合酶在大肠杆菌中的表达电泳图；其中泳道1为marker，泳道2为wild-type NHase，泳道3为NHase-(BA)，泳道4为NHase-(BA)P14K，泳道5为NHase-(BAP14K)；
图2：野生型腈水合酶和融合型腈水合酶在50℃处理时的半衰期；
图3：野生型腈水合酶和融合型腈水合酶的产物耐受性；
图4：野生型腈水合酶和融合型腈水合酶的最适pH。
具体实施方式
2YT培养基：蛋白胨16g/L，酵母浸膏10g/L，NaCl5g/L
腈水合酶反应体系：底物为500μl200mM的烟腈，加入10μl适宜浓度的纯酶反应10min后用500μl乙腈终止反应，并离心去除沉淀，取上清过0.22μm的膜后作为液相测定的样品。
腈水合酶HPLC检测：流动相水乙腈缓冲液；检测波长215nm；色谱柱为C18柱。
实施例1：表达野生型腈水合酶BAP14K的重组菌的构建
构建方法如下：
(1)根据NCBI公开的恶臭假单胞菌的腈水合酶序列设计上游及下游引物，通过PCR得到原始腈水合酶基因ABP14K，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。恶臭假单胞菌来源的腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2，α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.3，调控亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
(2)利用限制性内切酶Nde I和Hind III同时处理扩增得到的腈水合酶基因和pET-24a质粒，并连接两酶切产物得到含有原始腈水合酶基因的表达载体，得到pET-24a-ABP14K。
(3)以B-up和B-down(BA)，A-up(BA)和A-down(AP)，P14K-up(AP)和P-down为引物，pET24a-ABP14K质粒为模板，进行重叠PCR扩增。首先以B-up和B-down(BA)扩增得到基因B，以A-up(BA)和A-down(AP)为引物扩增得到基因A，以P14K-up(AP)和P-down为引物扩增得到基因P，再取等量的基因B、A和P，以B-up和P-down为引物PCR扩增得到全长的基因BAP14K，得到野生型腈水合酶表达质粒pET-24a-BAP14K，表达出的腈水合酶定义为wild-type NHase。
(4)将上一步得到的质粒pET-24a-BAP14K转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3))，验证筛选阳性转化子，即得到表达野生型腈水合酶BAP14K的重组菌。
表1为本发明用到的引物。
表1本发明中用到的引物
注：限制性酶切位点用斜体和粗体标出；重叠序列部分用下划线标出。
实施例2：融合表达β亚基、α亚基的NHase-(BA)P14K的重组菌的构建
构建方法如下：
(1)基于野生型腈水合酶pET-24a-BAP14K，设计引物Linker1-up和Linker1-down，并用全质粒扩增方法连接B和A基因，链接肽为linker1(序列如SEQ ID NO.5所示)，得到pET-24a-(BA)P14K，设计上游及下游引物B-Nde I-up和P-Hind III-down，通过PCR得到(BA)P14K基因，再利用限制性内切酶Nde I和Hind III同时处理扩增得到的腈水合酶基因和pET-28a质粒，并连接两酶切产物得到含有亚基融合型腈水合酶基因(序列为SEQ ID NO.6所示)的表达质粒pET-28a-(BA)P14K，表达出的腈水合酶定义为NHase-(BA)P14K。
(2)将上一步得到的质粒pET-28a-(BA)P14K转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3))，验证筛选阳性转化子，即得到融合表达β亚基、α亚基的NHase-(BA)P14K的重组菌。
实施例3：融合表达β亚基、α亚基、调控亚基的NHase-(BAP14K)的重组菌的构建
构建方法如下：
(1)以pET-28a-(BA)P14K为模板，设计引物Linker2-up和Linker2-down，并用全质粒扩增方法连接A和P14K亚基基因，链接肽为linker2，得到含有亚基融合型腈水合酶基因(序列为SEQ ID NO.7所示)的表达质粒pET-28a-(BAP14K)，表达出的腈水合酶定义为NHase-(BAP14K)。
(2)将成功构建的pET-28a-(BAP14K)质粒转化大肠杆菌表达宿主(Escherichia coli BL21(DE3))，验证筛选阳性转化子，即得到融合表达β亚基、α亚基、调控亚基的NHase-(BAP14K)的重组菌。
实施例4：腈水合酶的表达及酶学性质分析
本实施例是用实施例1-3得到的重组菌进行腈水合酶的表达。
重组大肠杆菌首先在10ml的2YT液体培养基(卡那霉素终浓度为50μg/ml)中活化培养，温度为37℃，然后以1％的接种量转接至500ml的2YT液体培养基中，待OD600达到0.8时，加入IPTG(终浓度为0.4mM)诱导，并加入钴离子(终浓度为0.05g/l)以获得成熟酶，然后在24℃培养16小时。收集成熟的大肠杆菌，用SDS-PAGE检测表达量。
SDS-PAGE结果显示，本发明构建的野生型及融合型腈水合酶均可以在大肠杆菌中大量表达，如图1。其中泳道3为仅融合表达了β亚基和α亚基、不表达调控亚基的重组菌。
(1)酶活力的比较：
腈水合酶活力的测定：将表达正常的大肠杆菌大量培养，离心收集成熟的细胞，用0.01M的磷酸盐缓冲液(pH7.5)重悬，反复离心重悬两次后，用超声波破碎法破碎细胞，离心得到上清，然后进行纯化，得到纯化的酶测定酶浓度，稀释到合适的酶浓度用HPLC检测酶活。
结果显示，与野生型腈水合酶wild-type NHase相比，融合型腈水合酶NHase-(BA)P14K的比酶活499.2U/mg，NHase-(BAP14K)的比酶活为452.5U/mg，相比野生型腈水合酶wild-typeNHase的324.8U/mg，分别提高了53.7％、39.3％。此外，图1中泳道3的酶，酶活仅为69.1U/mg。
同时，还比较了wild-type NHase、NHase-(BA)与NHase-(BA)P14K的反应动力学参数。结果显示，NHase-(BA)P14K和NHase-(BAP14K)的催化常数Kcat大约为wild-type NHase的2倍，表明NHase-(BA)P14K和NHase-(BAP14K)比wild-type NHase可以进行更快的催化反应。此外，NHase-(BA)P14K的kcat/Km值约为wild-type NHase的1.5倍，表明NHase-(BA)P14K具有更高的催化效率。
(2)酶的热稳定性比较：
比较方法：首先将酶溶液加入空的EP管中，置于50℃金属浴中处理，处理一定时间置于冰上，然后再置于25℃金属浴中加入200mM烟腈底物进行反应，反应十分钟后加入色谱纯乙腈终止反应。
热稳定性结果如图2所示。在50℃温浴处理时，NHase-(BA)P14K的半衰期(26min)是wild-type NHase(9min)的3倍左右，而NHase-(BAP14K)(18min)的半衰期为wild-type NHase的2倍左右。
(3)腈水合酶产物耐受性比较
比较方法：反应体系内有20mM底物烟腈，并加入或不加0.5M产物烟酰胺，柱状图为反应十分钟时检测到的底物减少量。计算同一种酶在含有产物的反应体系中的底物减少量占不含产物的反应体系中的底物减少量的比率，来比较不同酶的产物耐受性。
结果如图3所示。
对于产物耐受性，在含有产物烟酰胺的反应体系中，与wild-type NHase相比，NHase-(BA)P14K和NHase-(BAP14K)的底物消耗量分别提高了26％、18％。在不含有烟酰胺的反应体系中，与wild-type NHase相比，NHase-(BA)P14K和NHase-(BAP14K)的底物消耗量分别提高了23％、15％。而对于酶自身，wild-type NHase的底物减少比率(含有产物的反应体系中的底物减少量占不含产物的反应体系中的底物减少量的比率)为0.8，NHase-(BA)P14K和NHase-(BAP14K)的分别为0.86和0.83，NHase-(BA)P14K和NHase-(BAP14K)的比率均比wild-type NHase高，表明融合型腈水合酶具有更高的产物耐受性。
(4)酶的最适pH值比较
比较了wild-type NHase、NHase-(BA)P14K和NHase-(BAP14K)在不同pH条件下的酶活，将各自在最适pH下的酶活定义为1(即100％)，结果如图4所示。结果显示，这3个酶的最适pH都在7.5左右。
以上数据表明，通过融合表达β亚基和α亚基并同时表达调控亚基，或者融合表达β亚基、α亚基和调控亚基，能够显著提高腈水合酶的酶活力、热稳定性和产物耐受性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种比酶活和稳定性提高的融合型腈水合酶，其特征在于，所述腈水合酶融合表达了β亚基、α亚基和调控亚基。
2.根据权利要求1所述的腈水合酶，其特征在于，所述β亚基和α亚基的基因之间通过核苷酸序列为SEQ ID NO.5所述的linker连接。
3.根据权利要求1所述的腈水合酶，其特征在于，所述腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，调控亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的腈水合酶，其特征在于，所述腈水合酶的核苷酸序列是SEQ IDNO.7所示的序列。
5.一种提高腈水合酶比酶活和热稳定性的方法，其特征在于，所述方法是融合表达β亚基、α亚基和调控亚基。
6.含有权利要求1所述腈水合酶的质粒载体。
7.表达权利要求1所述腈水合酶的基因工程菌。
8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是大肠杆菌。
9.一种权利要求8所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法是将SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列克隆到表达载体pET-28a中，然后转化到Escherichia coli BL21中，即得到基因工程菌。
10.权利要求1所述腈水合酶在丙烯酰胺生产方面的应用。
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