CN106609249A - 克雷伯氏肺炎杆菌突变菌及其生产1,3-丙二醇的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了克雷伯氏肺炎杆菌突变菌及其生产1,3-丙二醇的应用。所述克雷伯氏肺炎杆菌突变菌为丙酮酸脱氢酶系活性失活的克雷伯氏肺炎杆菌，或丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的克雷伯氏肺炎杆菌，或丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脱氢酶活性同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌。通过所述酶对应基因的失活获得相应的克雷伯氏肺炎杆菌突变菌。所述的克雷伯氏肺炎杆菌突变菌能够在以甘油为碳源的培养基中，进行微氧发酵生产1,3-丙二醇。本发明所述的克雷伯氏肺炎杆菌突变菌发酵生产1,3-丙二醇，相对于野生菌能够提高1,3-丙二醇的生产强度或者1,3-丙二醇的质量转化率。

Description

克雷伯氏肺炎杆菌突变菌及其生产1，3-丙二醇的应用

技术领域

本发明属于菌株的基因工程改造技术领域，具体涉及克雷伯氏肺炎杆菌突变菌及其生产1,3-丙二醇的应用。

背景技术

1,3-丙二醇是一种重要的化学品，其与二元酸聚合可以合成聚酯材料，其中比较重要的是与对苯二甲酸聚合形成聚对苯二甲酸丙二醇酯，是一种性能优良的纺织材料。1,3-丙二醇可以通过化学方法合成，也可以利用生物方法合成。包括丁酸梭菌、弗氏柠檬酸菌、克雷伯氏产酸杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌肺炎杆菌等细菌可以利用甘油代谢合成1,3-丙二醇。杜邦公司开发了利用大肠杆菌工程菌株以葡萄糖为碳源合成1,3-丙二醇的方法。

克雷伯氏肺炎杆菌是一种重要的工业微生物，用于生物法生产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、乙偶姻、2-酮基-D-葡萄糖酸等化学品的生产菌株。克雷伯氏肺炎杆菌具有生长旺盛，培养条件粗放等优点。克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丙二醇具有底物转化率高，产物终浓度高等优点。

丙酮酸是生物体的一个中间代谢产物，多种碳源通过代谢都可以合成丙酮酸，而细胞内的丙酮酸又可以合成多种其他代谢产物，丙酮酸处于细胞代谢的一个非常重要的位置。在克雷伯氏肺炎杆菌中，丙酮酸是合成乳酸的原料，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下，还原生成乳酸。在克雷伯氏肺炎杆菌中，丙酮酸是合成乙酰辅酶A的原料，丙酮酸合成乙酰乳酸有两条途径，一条是在丙酮酸脱氢酶系的催化下形成乙酰辅酶A，放出二氧化碳，同时还原NAD形成NADH，另外一条途径是在丙酮酸甲酸裂解酶的催化下形成乙酰辅酶A，同时形成甲酸。这样在克雷伯氏肺炎杆菌的细胞内丙酮酸就处于一个多通道的节点。

在克雷伯氏肺炎杆菌中，甘油脱水可以形成3-羟基丙醛，3-羟基丙醛经过还原形成1,3-丙二醇，另外一部分甘油可以氧化形成二羟基丙酮，进而磷酸 化形成磷酸二羟基丙酮进入酵解途径，甘油也可以先磷酸化形成甘油-3-磷酸，再氧化形成磷酸二羟基丙酮进入酵解途径，也形成丙酮酸。

发明内容

本发明的目的是，提供克雷伯氏肺炎杆菌突变菌及所述突变菌的制备方法和所述突变菌用于发酵生产1,3-丙二醇的应用。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

本发明提供一种克雷伯氏肺炎杆菌突变菌，所述克雷伯氏肺炎杆菌突变菌为丙酮酸脱氢酶系活性失活的克雷伯氏肺炎杆菌，或丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的克雷伯氏肺炎杆菌，或丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脱氢酶活性同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌。

进一步地，所述丙酮酸脱氢酶系活性失活通过丙酮酸脱氢酶系基因中的一个或多个基因失活来实现；所述丙酮酸甲酸裂解酶活性失活通过丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因失活来实现；所述丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脱氢酶活性同时失活通过丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因和乳酸脱氢酶ldhA基因同时失活来实现。

所述丙酮酸脱氢酶系活性失活的克雷伯氏肺炎杆菌的制备方法为：将克雷伯氏肺炎杆菌丙酮酸脱氢酶系的基因中一个或多个基因进行失活来获得丙酮酸脱氢酶系活性失活的克雷伯氏肺炎杆菌。所述丙酮酸脱氢酶系是指催化丙酮酸形成乙酰辅酶A，同时释放出二氧化碳并转化NAD形成NADH的酶系。丙酮酸脱氢酶系也称为乙偶姻脱氢酶系或丙酮酸脱氢酶复合物，可以催化乙偶姻分解成乙酰辅酶A和乙醛。所述丙酮酸脱氢酶系由焦磷酸硫胺素依赖的丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶和二氢硫辛酰胺脱氢酶组成；其中丙酮酸脱氢酶α亚基由acoA基因编码，丙酮酸脱氢酶β亚基由acoB基因编码，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶由acoC基因编码，二氢硫辛酰胺脱氢酶由acoD基因编码，其中的调节基因为acoK基因。

所述丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的克雷伯氏肺炎杆菌的制备方法为：将克雷伯氏肺炎杆菌丙酮酸甲酸裂解酶基因失活来获得丙酮酸甲酸裂解酶活 性失活的克雷伯氏肺炎杆菌。所述丙酮酸甲酸裂解酶是催化丙酮酸形成乙酰辅酶A，同时形成甲酸的酶。所述丙酮酸甲酸裂解酶由pflB基因编码。

所述丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脱氢酶活性同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌的制备方法为：将克雷伯氏肺炎杆菌丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脱氢酶基因失活来获得丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脱氢酶活性同时失活的的克雷伯氏肺炎杆菌。所述乳酸脱氢酶由催化丙酮酸还原形成乳酸的酶。乳酸脱氢酶由ldhA基因编码。

所述基因失活的方法采用同源重组法或Red重组酶介导的同源重组法。

本发明还提供了克雷伯氏肺炎杆菌突变菌生产1,3-丙二醇的应用，所述克雷伯氏肺炎杆菌突变菌为丙酮酸脱氢酶系活性失活的克雷伯氏肺炎杆菌。

进一步地，所述丙酮酸脱氢酶系活性失活的克雷伯氏肺炎杆菌通过丙酮酸脱氢酶系基因中的一个或多个基因失活获得。

本发明还提供了克雷伯氏肺炎杆菌突变菌生产1,3-丙二醇的应用，所述克雷伯氏肺炎杆菌突变菌为丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的克雷伯氏肺炎杆菌。

进一步地，所述丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的克雷伯氏肺炎杆菌通过丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因失活获得。

本发明还提供了克雷伯氏肺炎杆菌突变菌生产1,3-丙二醇的应用，所述克雷伯氏肺炎杆菌突变菌为丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脱氢酶活性同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌。

进一步地，所述丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脱氢酶活性同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌通过丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因和乳酸脱氢酶ldhA基因同时失活获得。

本发明还提供了所述克雷伯氏肺炎杆菌突变菌生产1,3-丙二醇的方法，该方法为：将所述的克雷伯氏肺炎杆菌突变菌接种到以甘油为碳源的培养基中，进行微氧发酵生产1,3-丙二醇。

进一步地，所述微氧发酵生产1,3-丙二醇的培养条件为：发酵液pH值为6.8～7.2，发酵温度为30～40℃。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

相对于克雷伯氏肺炎杆菌野生菌株，失活丙酮酸脱氢酶酶系的克雷伯氏肺炎杆菌突变菌可以提高1,3-丙二醇的生产强度；失活丙酮酸甲酸裂解酶的克雷伯氏肺炎杆菌突变菌可以提高1,3-丙二醇的底物转化率；同时失活丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脱氢酶的克雷伯氏肺炎杆菌突变菌可以进一步提高1,3-丙二醇的底物转化率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

实施例1

利用基因重组方法对克雷伯氏肺炎杆菌丙酮酸脱氢酶系基因进行失活，来实现丙酮酸脱氢酶系活性失活。

本实施例中的克雷伯氏肺炎杆菌采用CGMCC 1.6366的菌株(该菌株也称为TUAC01、AC01)，CGMCC 1.6366的菌株已经在授权发明专利ZL201310346916.8中公开，另外在公开文献(Wei Dong,Wang Min,Shi Jiping,Hao Jian.Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.201239:1219–1226)中也已经公开该菌株。该菌株是一株用于生产1,3-丙二醇，2,3-丁二醇，乙偶姻和2-酮基葡萄糖酸的菌株。该菌分离自土壤，分离过程及性状描述见文献(Hao Jian,等.Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1,3-propanediol under aerobic conditions.World Journal of Microbiology Biotechnology 2008,24:1731-1740)。

利用Red重组酶辅助的同源重组方法敲除克雷伯氏肺炎杆菌中aocK基因，来实现消除菌株丙酮酸脱氢酶系活性，步骤如下：

1)利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌丙酮酸酶系及调控基因序列(acoK，acoA，acoB，acoC，acoD)，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。

根据克雷伯氏肺炎杆菌342(Genbank:NC_011283)基因组信息，设计丙酮酸脱氢酶系及调控基因PCR引物，上游引物aco-s： TTAATCCAGTAATTTCATCTCCAGCGCCCG(SEQ ID NO.1所示)，下游引物aco-a：TTATTGATGCAATGGTTGATCGCAGGCCGC(SEQ ID NO.2所示)。

通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得丙酮酸脱氢酶系(acoK，acoA，acoB，acoC，acoD)基因片段，通过TA克隆方法连接到pMD-18T simple质粒(商业产品)上，命名为pMD18T-aco质粒，序列测定结果如(SEQ ID NO.3所示)。其中1-2766为acoK阅读框，3019-3978为acoA阅读框，3990-5009为acoB阅读框，5013-6548为acoC阅读框，6538-7935为acoD阅读框。

2)利用步骤1克隆到的基因序列，制备两侧连有长同源臂中间连接抗性盒的DNA片段。

本步骤中的操作，采用在大肠杆中利用Red重组酶催化，具有短同源臂连接抗性盒的DNA片段与pMD18T-aco质粒进行同源重组，获得pMD18T-aco质粒上重组失活的acoK基因，利用该质粒作为模板通过PCR扩增具有长的同源臂的DNA片段，该片段两侧连有与acoK基因同源的序列，中间连接抗性盒。

本步骤操作原理和使用的质粒和菌株等材料可参见(Wei et.al.Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology 2012)，具体步骤如下：

a.pMD18T-aco质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌DH5α-pIJ790中，命名为DH5α-pMD18T-aco。

b.设计引物acoK-s1和acoK-a1，序列分别为：

CTCAGCCAGTAAAATGCAGGCTTGCGGCGCATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.4所示)和GCTGCAGGCCCAGGACCAACTGGTGGAAATTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.5所示)。

利用引物acoK-s1和acoK-a1，以质粒pIJ773为模板扩增出长约1.4Kb的DNA片段A。该片段的两端分别具有与acoK序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ773质粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。

c.利用DNA片段A转化感受态DH5α-pMD18T-aco感受态细胞。利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择安普霉素抗性的菌株，安普霉素用量为50mg/L。

DNA片段A两侧的同源序列与质粒pMD18T-aco上的acoK同源部分发生重组，获得质粒，并命名为pMD18T-ΔacoK质粒。

d.利用引物aco-s(SEQ ID NO.1所示)和acoK-a2ATGAAGCCATTGGATTTAGAAGGTCGCCAA(SEQ ID NO.6所示)，以pMD18T-ΔacoK质粒为模板进行PCR扩增，获得2.4Kb的DNA片段B。

DNA片段B两端分别具有acoK基因序列，该序列作为同源臂。DNA片段B中间具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段B用于进行CGMCC1.6366染色体上acoK基因重组的线性DNA片段。

3)利用转化将制备的DNA片段B转入到克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366中，DNA片段B与染色体上的丙酮酸脱氢酶酶系基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体丙酮酸脱氢酶酶系调控基因重组失活的菌株，具体步骤如下：

将pDK6-red质粒转化到CGMCC 1.6366中，获得CGMCC1.6366-pDK6-red菌株，线性DNA片段B电击转化CGMCC 1.6366-pDK6-red感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株。命名为Kp-acoK^-。该菌株的丙酮酸脱氢酶系的调控基因通过同源重组而失活。

实施例2

利用Red重组酶辅助的同源重组方法敲除克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366中的aocA基因，来实现菌株丙酮酸脱氢酶系活性失活。

1)制备两侧连有aocA基因同源臂中间连接抗性盒的DNA片段。

具体步骤如下：

a.设计引物acoA-s1和acoA-a1，序列分别为：

ATGCTCAGCAAACAGGCGTTATTGCAGGCTATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.7所示)和TCAGTATGAGACATAAACGTCTGTCAGCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO.8所示)。

利用引物acoA-s1和acoA-a1，以质粒pIJ773为模板扩增出长约1.4Kb的DNA片段A1。该片段的两端分别具有与acoA序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ773质粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。

b.利用DNA片段A1转化实施例1中制备的感受态DH5α-pMD18T-aco感受态细胞。利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择安普霉素抗性的菌株，安普霉素用量为50mg/L。

DNA片段A1两侧的同源序列与质粒pMD18T-acoA上的aco同源部分发生重组，获得质粒，并命名为pMD18T-ΔacoA质粒。

c.利用引物acoA–s2GGCGATACGTTCACCCTGGGCGACCATCTG(SEQ ID NO.9所示)和acoA-a2GTCGTCGTCGCGAATTGACTGGATTAACAG(SEQ ID NO.10所示)，以pMD18T-ΔacoA质粒为模板进行PCR扩增，获得2.4Kbp的DNA片段B2。

DNA片段B2两端分别具有acoA基因外侧相邻序列，该序列作为同源臂。DNA片段B2中间具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段B2用于进行CGMCC1.6366染色体上acoA基因重组的线性DNA片段。

2)将制备的DNA片段B2转入到克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366中，DNA片段B2与染色体上的丙酮酸脱氢酶系基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体丙酮酸脱氢酶酶系基因重组失活的菌株，具体步骤如下：

将pDK6-red质粒转化到CGMCC 1.6366中，获得CGMCC1.6366-pDK6-red菌株，线性DNA片段B2电击转化CGMCC 1.6366-pDK6-red感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株。命名为Kp-acoA^-。该菌株的丙酮酸脱氢酶系的acoA基因通过同源重组而失活。

实施例3

利用Red重组酶辅助的同源重组方法克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366中失活aocB基因，来实现菌株丙酮酸脱氢酶系活性失活。

操作过程同实施例2，其中引物acoB-s CATTACCGAGTCGGCCATCATCGGAATGGCATTCCGGGGATCCGTCGACC (SEQ ID NO.11所示)和acoB-a ACCACCTCGACCGAGATCCCCTCTCTGGCCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.12所示)替代acoA-s和acoA-a。引物acoB-s2CGGTCAAACGTGCGCGAGAAGGCGGTGGCC(SEQ ID NO.13所示)和acoB-a2CGCCTACCTGAAGCGTCTCACCCTCTCGGG(SEQ ID NO.14所示)替代acoA-s2和acoA-a2

通过基因敲除工作，获得丙酮酸脱氢酶系acoB基因突变的菌株，命名为Kp-acoB^-。

实施例4

利用Red重组酶辅助的同源重组方法在克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366中失活aocC基因，来实现消除菌株丙酮酸脱氢酶系活性。

操作过程同实施例2，其中引物acoC-s AGTCCGCGGCAGCGGGCGCG GGGATCGTATATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.15所示)和acoC-a CCTTCACCAGCAGGTCATTAACCGAAATCTTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.16所示)替代acoA-s和acoA-a。引物acoC-s2ATGAGCGAAATCAAGACGCTTGAAATGCCA(SEQ ID NO.17所示)和acoC-a2GCACATCGTATTTATCGTGCATAGCTCGTC(SEQ ID NO.18所示)替代acoA-s2和acoA-a2

通过基因敲除工作，获得丙酮酸脱氢酶系acoC基因突变的菌株，命名为Kp-acoC^-。

实施例5

利用Red重组酶辅助的同源重组方法在克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366中失活aocD基因，来实现消除菌株丙酮酸脱氢酶系活性。

操作过程同实施例2，其中引物acoD-s TTGCCCAGGTCGCTATTAA TCATCGGTTCAATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.19所示)和acoD-a TTACTTGCGTCACCAGGGTCTGGGTATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.20所示)替代acoA-s和acoA-a。引物acoD-s2ATGCACGATAAATACGATGTGCTGATCATC(SEQ ID NO.21 所示)和acoD-a2TTATTGATGCAATGGTTGATCGCAGGCCGC(SEQ ID NO.22所示)替代acoA-s2和acoA-a2

通过基因敲除工作，获得丙酮酸脱氢酶系acoD基因失活的菌株，命名为Kp-acoD^-。

实施例6

利用Red重组酶辅助的同源重组方法在克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366中失活丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB，来实现消除菌株丙酮酸甲酸裂解酶活性。

1)利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌丙酮酸甲酸裂解基因序列(pflB)，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。

根据克雷伯氏肺炎杆菌342(Genbank:NC_011283)基因组信息，设计丙酮酸甲酸裂解酶基因PCR引物，上游引物pflB-s：ATGTCCGAGCTTAATGAAAAGTTAGCCACA(SEQ ID NO.23所示)，下游引物pflB-a：TTACATGGTCTGAGTGAAGGTACGGGTAAT(SEQ ID NO.24所示)。

通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)基因片段，通过TA克隆方法连接到pMD-18T simple质粒上，命名为pMD18T-pflB质粒，序列测定结果如(SEQ ID NO.25所示)。

2)利用步骤1克隆到的基因序列，制备两侧连有长同源臂中间连接抗性盒的DNA片段。

a.pMD18T-pflB质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌DH5α-pIJ790中，命名为DH5α-pMD18T-pflB。

b.设计引物pflB-s1和pflB-a1，序列分别为：CTGGTCTGCCGGATGCTTACGGCCGTGGTCATTCCGGGGATCCGTCGACC

(SEQ ID NO.26所示)和GTGCAGTTTCTGAATTTTCTTCATGAAACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO.27所示)。

利用引物pflB-s1和pflB-a1，以质粒pIJ773为模板扩增出长约1.4Kb的DNA片段C。该片段的两端分别具有与pflB序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ773质粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。

c.利用DNA片段C转化感受态DH5α-pMD18T-pflB感受态细胞。选择安普霉素抗性的转化子，安普霉素用量为50mg/L。

DNA片段C两侧的同源序列与质粒pMD18T-pflB上的pflB同源部分发生重组，获得质粒，并命名为pMD18T-ΔpflB质粒。

d.利用引物pflB-s(SEQ ID NO.23所示)和pflB-a(SEQ ID NO.24所示)，以pMD18T-ΔpflB质粒为模板进行PCR扩增，获得2.4Kb的DNA片段D。

DNA片段D两端分别具有pflB基因序列，该序列作为同源臂。DNA片段D中间具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段D用于进行CGMCC1.6366染色体上pflB基因重组的线性DNA片段。

3)利用转化将制备的DNA片段D转入到克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366中，DNA片段D与染色体上的丙酮酸甲酸裂解酶基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体丙酮酸甲酸裂解酶基因重组失活的菌株，具体步骤如下：

将pDK6-red质粒转化到CGMCC 1.6366中，获得CGMCC1.6366-pDK6-red菌株，线性DNA片段D电击转化CGMCC 1.6366-pDK6-red感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株。命名为Kp-pflB^-。该菌株的丙酮酸甲酸裂解酶基因通过同源重组而失活。

实施例7

利用Red重组酶辅助的同源重组方法在克雷伯氏肺炎杆菌Kp-pflB^-中失活乳酸脱氢酶基因(ldhA)，来实现同时消除菌株丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脱氢酶活性。

1)利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌乳酸脱氢酶基因序列(ldhA)，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。

根据克雷伯氏肺炎杆菌342(Genbank:NC_011283)基因组信息，设计乳酸脱氢酶基因PCR引物，上游引物ldhA-s： GTGTCGTTAATTATCTCGCTCATTGAGAGC(SEQ ID NO.28所示)，下游引物ldhA-a：CTAATGCATCAGGTCGGCGAGCTTATAGAC(SEQ ID NO.29所示)。

通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得乳酸脱氢酶(ldhA)基因片段，通过TA克隆方法连接到pMD-18T simple质粒上，命名为pMD18T-ldhA质粒，序列测定结果如(SEQ ID NO.30所示)。其中649-1638为ldhA阅读框。

2)利用步骤1克隆到的基因序列，制备两侧连有长同源臂中间连接抗性盒的DNA片段。

a.pMD18T-ldhA质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌DH5α-pIJ790中，命名为DH5α-pMD18T-ldhA。

b.设计引物ldhA-s1和ldhA-a1，序列分别为：AACTTTGTCTTTCAAAGAGATTCCGCAAATATTCCGGGGATCCGTCGACC

(SEQ ID NO.31所示)和AATCAGACGATAGCGTTCGGGCAGGTTTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.32所示)。

利用引物ldhA-s1和ldhA-a1，以质粒pIJ778为模板扩增出长约1.4Kb的DNA片段E。该片段的两端分别具有与ldhA序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ778质粒的链霉素抗性基因aadA。

c.利用DNA片段E转化感受态DH5α-pMD18T-ldhA感受态细胞。选择链霉素抗性的转化子，链霉素用量为25mg/L。

DNA片段E两侧的同源序列与质粒pMD18T-ldhA上的ldhA同源部分发生重组，获得质粒，并命名为pMD18T-ΔldhA质粒。

d.利用引物ldhA-s(SEQ ID NO.28所示)和ldhA-a(SEQ ID NO.29所示)，以pMD18T-ΔldhA质粒为模板进行PCR扩增，获得2.4Kb的DNA片段F。

DNA片段F两端分别具有ldhA基因序列，该序列作为同源臂。DNA片段F中间具有链霉素抗性基因aadA，DNA片段F用于进行Kp-pflB^-染色体上 ldhA基因重组的线性DNA片段。

3)利用转化将制备的DNA片段F转入到克雷伯氏肺炎杆菌Kp-pflB^-中，DNA片段F与染色体上的乳酸脱氢酶(ldhA)基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体乳酸脱氢酶基因重组失活的菌株，具体步骤如下：

将pDK6-red质粒转化到Kp-pflB^-中，获得Kp-pflB^--pDK6-red菌株，线性DNA片段F电击转化Kp-pflB^--pDK6-red感受态细胞。利用链霉素筛选抗性菌株。命名为Kp-pflB^--ldhA^-。该菌株的乳酸脱氢酶基因和丙酮酸甲酸裂解酶基因通过同源重组而同时失活。

实施例8

将实施例1-7中获得的丙酮酸脱氢酶系活性失活的菌株、丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的菌株、丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脱氢酶活性同时失活的菌株进行1,3-丙二醇发酵实验。

1)种子培养，将构建的突变株和出发野生型菌株接种到250ml锥形瓶中，瓶中含有50ml液体种子培养基。种子培养基成分为：蛋白胨5g/L，NaCL 5g/L，酵母粉10g/L。将种子瓶放置在30℃震荡培养过夜。

2)发酵培养，将一瓶种子接种到5L发酵罐中，罐中装有3L发酵培养基，通风0.5L/min，搅拌转速200转/min，利用碱液调节发酵液pH值为7.0，37℃培养12小时。

发酵培养基配方为：硫酸铵4g/L；磷酸氢二钾0.69g/L；磷酸二氢钾0.25g/L；硫酸镁0.2g/L；酵母粉1.5g/L；甘油30g/L；微量元素1.0ml/L；铁溶液1.0ml/L。

其中，微量元素为：硫酸锰100mg/L；氯化锌70mg/L；钼酸钠35mg/L；硼酸60mg/L；氯化钴200mg/L；硫酸铜29.28mg/L；氯化镍25mg/L；浓盐酸(37％)0.9ml/L。

铁溶液为：每升水中加入硫酸亚铁5.0g，37％的浓盐酸4ml。

定时取样，测定发酵液中各组分含量，甘油消耗完全为发酵终点。测定方法采用液相色谱法测定，利用HPX-87H色谱柱对发酵液组分进行分离，利用紫外和视差检测器检测。流动相0.05mol/L硫酸水溶液，流速0.8ml/min， 柱温箱60℃。各菌株发酵结果如表1所示。

表1，各菌株发酵生产1,3-丙二醇结果

由表1中数据可以看出，失活丙酮酸脱氢酶系活性的突变菌株与出发野生菌株相比较，1,3-丙二醇的生产强度增大了0.26-0.27g/Lh，但是底物甘油向1,3-丙二醇的质量转化率降低了2.5-3％。失活丙酮酸甲酸裂解酶活性的突变株与出发野生菌株相比较，1,3-丙二醇的生产强度降低了0.14g/Lh，但是底物甘油向1,3-丙二醇的质量转化率增加了2.3％。同时失活丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脱氢酶活性的突变株与出发野生菌株相比较，1,3-丙二醇的生产强度降低了0.09g/Lh，但是底物甘油向1,3-丙二醇的质量转化率增加了4.6％。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

<110> 中国科学院上海高等研究院

<120> 克雷伯氏肺炎杆菌突变菌及其制备方法和应用

<130> 2015

<160> 32

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttaatccagt aatttcatct ccagcgcccg 30

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttattgatgc aatggttgat cgcaggccgc 30

<210> 3

<211> 7935

<212> DNA

<213> 克雷伯氏肺炎杆菌

<400> 3

ttaatccagt aatttcatct ccagcgcccg actcatcgct tgagtgcggc tattcacttt 60

aagcttcgcg tagatgtttt tgatgtgcca tttgaccgtc tcggcagaaa tagctaggga 120

gcgggcgatt tctttgttca tctgaccttc agcgatcagc tgtaatatct gaaattctcg 180

ctcgctgagt tccccatgaa tatcggggct tccactattt agcggtgttc tgtctgcagg 240

cgcgcgcttg tctgcccagg gttcatggac tatcccttcc tctgtacaag ccgaagagaa 300

atcattcata ccgataagca aaggttgcaa ggtatcgcca gcgtcaagaa agaggccctt 360

gagatgctgt tgttcagcca gcagcagcac tggttgaaat gtcgtgcgcg cagcggcagt 420

tttgccgctg ttccacaagg ctaatgacca gagcgtacgc agacgcgctg cggttaacct 480

gtccccccgg ctttcctgat cggagaccat ctcagccagt aaaatgcagg cttgcggcgc 540

ctggcctctg gcgagaagaa gccggctgcg gctaagggat gcagacataa cgatggcgcg 600

ttggcaggga tgttcggcat ccattctgaa gctggcggcc atttgttcaa gctgccgttg 660

cagttgctct gcgccggtga aattgccgcg ctgcaggcgc accctcacct gctcggctaa 720

caacatggcc tggagccgtt gccagccgcg agacaccgca aggcgctgcg catgctccag 780

caatcgctcg gcctcatagg gcatatcgct atctaaggcc tgacgcgcga gataggtata 840

gcaacgactc agcgcgtcgg gtggactgaa ccggtcgatg aattcgagcc ggtcggctaa 900

cagatgctcg ggcgagtcac ccctctgaca ttcataggct atctccgcca gcagcggcgc 960

cagcgtcgcg ccactggtcg actgggtgcc ggtataacat tcagcctggc gcaacgtttt 1020

ctctgcgtac cacccggctt ttcccagatc gccctgacaa agatgacact gggcaatgat 1080

aaacgcgcga tataccgaga caaacagatt atctaaagga ctttccggag agggcatatg 1140

ctgttgaacc tccagcgcgt cgtgatagcg ctggttaaca acatggcaat agctgagaat 1200

attgcatatc agaccatcaa cccaggtgtc gccgcagggc acttcggcca gcaacggctg 1260

aacaatagcc agactctccg ggatgttttc agcaaaggct tcgcaaattg cccgcacaac 1320

gcgcaattta caccaggtgc tgcgggttaa atcatcacgg tgatgaagca ccatctgatc 1380

gaggttatca agcagctgcc tcgactcatc aaagtggaaa taatgcgcca gtgcccaggc 1440

caggttaatt tgcaggtcaa tgcgcgcagg atcggtgctg ggcggtaaat gatgcatcca 1500

tgagatcagg gtatcgatat ccccttcttc cgccagtgac tgagcgcttg cgccgtcctg 1560

cccggggcta tgcaccggct tgcctgcgct gagcgcatgg cgtaccgcct cagaccacag 1620

cttctgttcg acgaaccaat gactggctaa ttcatgtagc tgtttgcgat caatagcgtt 1680

gttctgctgc agcatggtcc gaagattttc ctgcaacaga ggatggtagc ggaaccagta 1740

gccttgttcg tcaagggctg acaaaaaaag gttgtgtcgc tcaatccatg ccagcatcgc 1800

tttactatca tcacgtccag tcactgcatt gcataattcg gcatttaacc gactgaggaa 1860

ggacgttttc accagaaaat caagaacctg ttccggcagc ggatccagta ccacctcttt 1920

cagatagcgg gcaatagacc gtgttcctcc atgcatattg cgcaacagat gctcgggatc 1980

atgctgtaat tctgcggaca atgaagcgat cttcatccct gcaatccagc cctctgtcac 2040

ggactgtagc cgctgtgcat ggtggttgct gaggggtagc gcaaccgtgc ggctaaaata 2100

gtgttttgtt tcttcgagcg tgaattgcag gtctcgatca tagatttcca ccagttggtc 2160

ctgggcctgc agctggctca gcgcaagatt cgggtggaaa cggctgccaa tgatcagatg 2220

caaagcggca ggcgcatgct tgagtaaata ccccagcgct tcatagaccc cacgatcgtt 2280

aatcacgtgg aagtcgtcga tgatcaggta tacgtcatgc gggcaatagt gtagctggtt 2340

aatgagcccg gccagcagtt gctcggagct ggagagcttc tgttcttcca tgtcacgcca 2400

gaaatcggcg tcccagtcag catagagtgg acgcaatgct tgcagcagat aaggaataaa 2460

ctgccatacg tcatcatcat cctcatcgag gctcagccag gcgatacgtt caccctgggc 2520

gaccatctgc tgatgccatt gcgccaacag cgtggttttg ccaaatccag cgccggcgca 2580

gacgacgccc aaccggcact gctgaacggg attgagaagc tgaagaagcc gggggcgctc 2640

cagcaattgt atcgaggagc gaggcgggac gaatttggtc aggattaacg gcaagcctcg 2700

cgtcagccgc aatggcccgg agaccagtga gggtgattgg cgaccttcta aatccaatgg 2760

cttcatccgt ggtgtctact cgctttgttt tttttcaatt gtacgccagc caccgggatg 2820

acatggggca ggcaaacttt atggctacac aaaatttaga aagtttgacc tcaagcatga 2880

aaacccccac ctaccccccc atgaaggtgg cttcgcactc tctctaaccg ctcgtagatt 2940

cattgcatgg gtgtggccag ggttattcgc cctgtctgtt ggccccgcct ggtgaccttt 3000

attgaggaga attaaacgat gctcagcaaa caggcgttat tgcaggctta ccgcaagatg 3060

cgggagatca ggacctttga agagcggttg catcaggaaa ataccagcgg tgatattccc 3120

ggcttcattc acctttatac cggtgaggag gccatcgcgg tgggggtctg cgaaaattta 3180

acgagcgcag attttattgg ttcaacacac cgtggacatg gccactgtat tgctaaaggg 3240

tgcgacattc acggcatgat ggccgaaata ttcggtaagg acagcgggtt atgtcgcggt 3300

aagggtgggt cgatgcacat tgccgatctg tcgaaaggaa tgctgggagc gaacgctatc 3360

gttgggggag cccctcccct ggccatcggc gccgcgctaa cggcaaagac gctaaaaacc 3420

ggcaacgtcg gtgtctcttt tacgggcgat gggggttcta atcagggcct ggtctttgaa 3480

gccatcaata tggccgtcgt gctccagctc ccagcggtct ttattttcga gaacaacggt 3540

tacggcgaag ggaccggtca tgactacgcc gtgggtgggc gtgatatcgc ccgacgcgcc 3600

gctggcttcg gcctgccggc agtgaccgtt gatggcaccg atttctttgc cgtttatgag 3660

gccacttcag aggcggtcaa acgtgcgcga gaaggcggtg gcccaagcgt cattgaggcc 3720

aaagccttcc gctggcacgg tcattttgag ggggatcccg cgctataccg cgcggaaggt 3780

gaagtgcaac gcctgcgtga acaacatgat ccgctgaaga ttttcaccgc taaggtcaaa 3840

cagcatatca ccccggaaga actggcagcg attgacgagg aagtcgaagc ccttgtcaac 3900

gatgcggtat tgaaggcccg cgccgctgcc tatccggctc cggaagacct gctgacagac 3960

gtttatgtct catactgagg gtgataacta tggcgattaa aacctatcgt gaagcggtca 4020

aggaagccct ggctcaggaa atggaacgcg atgaacgcgt ggtgctcatc ggtgaagatt 4080

tgcgtggcgg tcatggcgga aatgcgcccg aagaggcgaa gatagaagcc tttggcggtg 4140

tgctcggcgt cactaaaggg ctgtggacgc agttcggctc cgatcgggtg atcgacacgc 4200

ccattaccga gtcggccatc atcggaatgg cggccggcgc cgcagcgacg ggtctgcggc 4260

cggtcgcgga attgatgttc atggattttt ttggcgtgag tcacgatgcg ctgtacaacc 4320

aggcggctaa gttccgctac atgtttggtg gcaaagccag agccccgctg gtgatgcgag 4380

ggatgatcgg cgcggggttt tccgccgcgg cccagcattc acagtcaccc tataatatct 4440

ttgccaccac gccagggctg aaggtggtgg tgccctcgac gccttatgac gtcaaaggtc 4500

tgttaatcca gtcaattcgc gacgacgacc cggtggtttt ctgcgagcat aaaatgctgt 4560

acgacctcaa gggcgaggta ccggacgaga gctataccct cccgctaggt gtagccaact 4620

atacccgcga aggagaagac gtcaccatca ttgcgttgtc ggcaatggtg cataaagcca 4680

atcaggtggc ggacaaactg gccagagagg ggatctcggt cgaggtggtc gacccgcgga 4740

ccatttcgcc gctggatgag gaagggattc tggaatcggt ggcgtccacg gggcgggtag 4800

tgattgtcga cgaatccgcg gcacgcttcg gttttgcgca tgatgtcgcg gcgctgatcg 4860

cgtcccaggc attccatttc ctcaaagcgc ccgttctgct ggtgacgccg ccacacacgc 4920

cggtcccgtt ctcccctgct ctcgaaaaac tctggatccc tggcgtagaa cgtatcgaag 4980

cagccgtccg tcaagtgctg gaggattaac ctatgagcga aatcaagacg cttgaaatgc 5040

caaagtgggg gctttccatg gaagaaggct tgctcgctcg gtgggcaatc caggagggtg 5100

acagcttcac cccagggcag gaaatctgtg agattgaaac cagtaaaatc gtcaatgtgc 5160

tggaggcccc ctttgccggt acgttacgtc ggatactcgc ccgagagggt gagacgcttc 5220

aggtaggcgc cgtgctggcc ctggcggctg acgcttcggt cagcgatgct gacctggacg 5280

aattcgctgc cactctggct acggcgaaat ccgcagcccc tggcacggag gctgccgcgc 5340

cggacgtagc ggcacaggca ggcgctaagc caccttccgt tgtttcgccg ccatccaaca 5400

gccccgagcc ccccgttggg cagaccgaca tccccgtcag tctgcaaggc gtgaccgatg 5460

tgactcaggt taatgccacg ccccatgcgt tacgactctc tgcccgctgg ggtgtcgacc 5520

tgaaaaaagt ccgcggcagc gggcgcgggg atcgtatctc tgtttctgat ctggaaagcg 5580

cgatccttgc cgccggcggt cgcctggcct ccccgacgcc ccctgttcgt cgcagcaaag 5640

cgccccgctc gcatgccgat gacagccagg tatcggccac cccgctggcg cgccgtctgg 5700

ccggcaagct gggtatcaac ttgcatgact gccgaagcag cggttcacgc ggccgggtga 5760

gtcgcgatga tgtgctggcc gcggcgttgt tactcgacga gcacccgcag accagcccgg 5820

tacaggagag taccccggta ccctatgaaa gcatccccat gtccggtatg cggcgggcta 5880

tcgcctctcg cctgcaaacg tccaagcaac agtctcccca tttccgtttg agcgtcgatc 5940

tcgatctgga acgactgtta gcgctacgtc aggaaattaa ccgcgaagta cccggcgtca 6000

agatttcggt taatgacctg ctggtgaagg cctgcgccct ggcgctggtg gccgtgcctg 6060

acgtcaacat tcagtttgat gaagcgacac aaagtatccg ccgctttgcg gatgccgaca 6120

tttcagtggc cgttgcgctg cctgccgggc taattacccc tattgttcgc tcggcgaacc 6180

ggaaatcaat tagcgacata tcgaacgaaa ttcactcgct ggtgaccagg gccaaagcgg 6240

gcacgctgaa gccggaagag ttccaggggg ggacctttag cgtgtcaaat ctggggatgc 6300

ttggcgtccg gcagtttgac gccatcatca atccaccgca aagtgcaatc ctcgccattg 6360

gcgccggcga aatgcgggcg gtagtacgcg acgggcaaat cgtcgcgcgc cagcaaatga 6420

cggtatcgct atcctgcgat caccgggtta tcgatggcgc ggcaggtgcg gcttttctcc 6480

gggaactcag gcgactggct gaaaccccaa ccttgatgtt tatccaggag acgagctatg 6540

cacgataaat acgatgtgct gatcatcggc ggtggtcctg ggggatatgt ggccgccatc 6600

cgtgccggcc agctagggct tcgtaccgca ttagtggaga aacaacatct gggcggcatc 6660

tgcctgaact ggggatgcat tccaaccaag gcgctgttgc atggcgctga ggtcgcgcac 6720

agtatcaccc atgccagtca gctgggcatc agcgtgggtg aggtgaacat cgatctgcag 6780

aaactggtgc agtttagccg taccgtatcg caacagctca ccggcggggt ggcgtacctg 6840

ttgaagaaaa atggcgtgca ggtcattgat ggcaccgcgc ggctgcgcgg caaggggcaa 6900

ataacggtcg aggatgcccg aggggagacg cgcgattacc gggccgatca cgtgatcctg 6960

gccacgggcg cccgaccacg cgcattacca ggcatcgcgc cagatggcga atatatctgg 7020

acctatttcg aggcgctgcg gcctaagcta ttgcccaggt cgctattaat catcggttca 7080

ggggcgattg gcgtcgagtt cgccagcctt tataacgatc tgggctgtaa agtgacgctg 7140

gtcgagctgg cgtcgcagtt tttgccagtg gaagatgccg aggtgtctgc agcagtgcgt 7200

aagtcattcg aaaaacgcgg tattcaggtc catacccaga ccctggtgac gcaagtaaag 7260

ctcaccggga ccggggtgcg ctgcaccatg aaaaacaccg gcgccgaata ttctcaggac 7320

gtcgaacgtg tgctgctggc ggtcggcgta cagccgaata ttgaagatct ggggctggaa 7380

acgctgggcg tcgagttaga ccgcggtttt atcaagacgg acaccgcttg tcgtactaac 7440

gtattcgggc tgtatgccat cggcgatgta gccggcccgc cgtgcctggc gcacaaggcc 7500

agccacgaag gcgtgctctg cgttgagaca ctggctggtg tcgaaggcgc ccacccgctt 7560

gatcgcgact atgtgcccgg ttgcacgtat gcccggcccc aggttgccag tctgggcctg 7620

acggaatcga cggccctggc caggggacgg cccgtcagga tcggtaagtt ctcctggcag 7680

aataatggta aggcgctggc cagcggcgag acagagggtt ttgtgaagac gattttcgat 7740

gctgaaaccg gcgagttgct gggcgcgcat atggttggcg cacaggtcac ggaactgatc 7800

caggggtttg gcatcgcccg tcacctggag gccacagatg aaagtctcct gtcgatgatc 7860

ttcgcgcatc caacactttc cgaagcgatg catgaatcca tcctcgcggc ctgcgatcaa 7920

ccattgcatc aataa 7935

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ctcagccagt aaaatgcagg cttgcggcgc attccgggga tccgtcgacc 50

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gctgcaggcc caggaccaac tggtggaaat tgtaggctgg agctgcttc 49

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atgaagccat tggatttaga aggtcgccaa 30

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atgctcagca aacaggcgtt attgcaggct attccgggga tccgtcgacc 50

<210> 8

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<212> DNA

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tcagtatgag acataaacgt ctgtcagcag tgtaggctgg agctgcttc 49

<210> 9

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<213> 人工序列

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ggcgatacgt tcaccctggg cgaccatctg 30

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<212> DNA

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gtcgtcgtcg cgaattgact ggattaacag 30

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<213> 人工序列

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cattaccgag tcggccatca tcggaatggc attccgggga tccgtcgacc cattaccgag 60

tcggccatca tcggaatggc attccgggga tccgtcgacc 100

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

accacctcga ccgagatccc ctctctggcc tgtaggctgg agctgcttc 49

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<212> DNA

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cggtcaaacg tgcgcgagaa ggcggtggcc 30

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<213> 人工序列

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cgcctacctg aagcgtctca ccctctcggg 30

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agtccgcggc agcgggcgcg gggatcgtat attccgggga tccgtcgacc 50

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<213> 人工序列

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ccttcaccag caggtcatta accgaaatct tgtaggctgg agctgcttc 49

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atgagcgaaa tcaagacgct tgaaatgcca 30

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<213> 人工序列

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gcacatcgta tttatcgtgc atagctcgtc 30

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ttgcccaggt cgctattaat catcggttca attccgggga tccgtcgacc 50

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ttacttgcgt caccagggtc tgggtatggt gtaggctgga gctgcttc 48

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atgcacgata aatacgatgt gctgatcatc 30

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ttattgatgc aatggttgat cgcaggccgc 30

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<212> DNA

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atgtccgagc ttaatgaaaa gttagccaca 30

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<213> 克雷伯氏肺炎杆菌

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atgtccgagc ttaatgaaaa gttagccaca gcctgggaag gttttgcgaa aggtgactgg 60

cagaatgaag tcaacgtccg tgactttatt cagaaaaact acaccccata tgaaggcgac 120

gaatccttcc tggctggcgc gactgaagcg accaccaagc tgtgggacag cgtaatggaa 180

ggtgtaaaac aggaaaaccg cactcacgcg cctgttgatt ttgacactgc cctggcctcc 240

accatcacct ctcacgacgc aggctatatc gagaaaggtc tggaaaaaat cgttggtctg 300

cagaccgaag cgccgctgaa acgtgcgatc atcccgttcg gtggtattaa aatggttgaa 360

ggttcctgca aagcgtacaa tcgcgagctg gacccgatgc tgaaaaaaat cttcactgag 420

taccgtaaaa ctcacaacca gggcgttttc gacgtctata ctccggacat cctgcgctgc 480

cgtaaatccg gcgtgctgac tggtctgccg gatgcttacg gccgtggtcg tatcatcggt 540

gactaccgtc gcgttgcgct gtacggtatc gacttcctga tgaaagacaa attcgcccag 600

ttcaactctc tgcaagcgaa actggaaagc ggcgaagatc tggaagcgac catccgtctg 660

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tatggctacg acatctccgg tccggcgacc accgctcagg aagctatcca gtggacctac 780

ttcggttacc tggctgccgt taaatctcag aacggcgcgg caatgtcctt cggtcgtacc 840

tccagcttcc tggatatcta catcgaacgt gacctgcagg cgggtaaaat caccgagcaa 900

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accccggaat acgatgaact gttctccggt gacccgattt gggcaacaga atccatcggc 1020

ggtatgggcg ttgacggccg tactctggtg accaaaaaca gcttccgctt cctgaacacc 1080

ctgtacacca tggggccgtc tccggagccg aacatcacta tcctgtggtc tgaaaaactg 1140

ccgctgagct tcaagaaatt cgctgctaaa gtgtccatcg atacctcttc actgcagtat 1200

gagaacgatg acctgatgcg tccggacttc aacaacgacg actacgctat cgcatgctgc 1260

gtaagcccga tggttgttgg taagcaaatg cagttcttcg gtgctcgcgc caacctcgca 1320

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gatcacttca tggactggct ggctaaacag tacgtcactg cgctgaacat catccactac 1500

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gaaggcgaat acccgcagtt tggtaacaac gatgctcgcg tcgatgacat ggccgttgac 1740

ctggttgaac gtttcatgaa gaaaattcag aaactgcaca cctaccgcaa cgcgatcccg 1800

actcagtctg ttctgaccat cacctctaac gtggtatatg gtaagaaaac cggtaacacc 1860

ccagacggtc gtcgcgctgg cgcgccgttc ggaccaggtg ctaacccgat gcacggccgt 1920

gaccagaaag gtgctgttgc ctctctgacc tccgtagcga aactgccgtt tgcttacgcg 1980

aaagatggta tctcttacac cttctctatc gtaccgaacg cgctgggtaa agatgatgaa 2040

gttcgtaaga ccaacctggc gggtctgatg gatggttact tccaccacga agcgtccatc 2100

gaaggtggtc agcacctgaa cgtgaacgta atgaaccgcg aaatgctgct cgacgcgatg 2160

gaaaacccgg aaaaatatcc gcagctgacc atccgcgtat ctggctacgc tgtacgtttt 2220

aactccctga ccaaagaaca gcagcaggac gttattaccc gtaccttcac tcagaccatg 2280

taa 2283

<210> 26

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ctggtctgcc ggatgcttac ggccgtggtc attccgggga tccgtcgacc 50

<210> 27

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gtgcagtttc tgaattttct tcatgaaacg tgtaggctgg agctgcttc 49

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gtgtcgttaa ttatctcgct cattgagagc 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ctaatgcatc aggtcggcga gcttatagac 30

<210> 30

<211> 2201

<212> DNA

<213> 克雷伯氏肺炎杆菌

<400> 30

gtgtcgttaa ttatctcgct cattgagagc gcacagggcc actatccatt ggtattactg 60

atggttttcc tgctcacttt cactaaatcc tgcgcgctgg tgtcgctggc gatcccgggc 120

acctccggcc tgctgctgct ggggacattc gcgtccgcca gcctgggtca tttcctgtta 180

atgtggtcca gcgccagcct cggcgccatc ggcggattct ggctctcgtg gtggttaggc 240

gttcgctatc gtcaccgcct cacgcagttg cgctggctga ccgccgagcg gctggcccgc 300

agtcgactct tttttcagcg ccgcgggctg tgggcggtct ttttcagtcg cttcctctct 360

cccctgcgcg ccaccctgcc cctggtcagc ggcgccagcg gcctgccgct gtggtcgttt 420

cagctggcta acgtcacctc cggtctgctg tggccgtttc tgctgctctc ccccggcgct 480

ttaagcctga gtttgtggtg aaaaaacttt gtctttcaaa gagattccgc aaatccgcga 540

tatgctctag aattaggata agcacctgct atttaaacta ttttttaata attgtacgat 600

tattttaaat atgctaccgt gacgttataa tcactggaga aaagtcttat gaaaatcgcg 660

gtttacagta cgaagcagta cgataaaaag tacctgcagc acgttaatga tacttacggc 720

tttgaactgg aattcttcga cttcctgctg acagagaaaa ccgccaaaac cgcccacggt 780

tgcgaagcgg tatgcatctt cgtcaatgac gacggcagcc gtccggtgct ggaggagctg 840

aaggcccacg gcgtgaagta tatcgccctg cgctgcgccg ggtttaacaa cgtcgacctc 900

gaggcggcga aagcgcttgg cctgcgcgtc gtgcgcgtcc cggcctactc gccggaagcg 960

gtcgctgaac atgcgatcgg catgatgatg tcgcttaacc gccgcatcca ccgcgcctac 1020

cagcgtaccc gtgatgccaa tttctccctc gaaggcctca ccggtttcac catgtacggc 1080

aaaaccgccg gggtgatcgg caccgggaaa attggcgtgg cgatgctacg gatccttaaa 1140

ggcttcggca tgcgtctgct ggcttttgac ccgtacccaa gcgccgccgc gctggagctg 1200

ggggtggaat atgttgacct ggccacgctg tacaaggagt cggacgtgat ctccctgcac 1260

tgcccgctca ccgacgaaaa ctaccatctg ctcaatcgcg aggccttcga tcagatgaag 1320

gacggggtga tggtgattaa caccagccgc ggcgcgctga tcgattccca ggcggccatc 1380

gatgccctga agcaccagaa aatcggcgcg ctggggctgg acgtttatga gaacgaacgc 1440

gatctgttct tcgaagacaa atctaacgac gtgatccagg acgacgtctt ccgtcgcctc 1500

tccgcctgcc acaacgtgct gttcaccggc catcaggcgt tcctcaccgc cgaggcgctg 1560

atcagcattt cggagaccac cctgggcaat ctgcagcagg tcgccaacgg tgaaacctgc 1620

ccgaacgcta tcgtctgatt cctttccctt ttgtgctcct ctccccgggg gagcacattc 1680

agataatccc cacagatccc cgctgcgata ccgttacact ggctttgttt tattagtaat 1740

gtgaatgttt tggagtaaaa atgaacaaat ttgcggcatt actggcggca gggttgctgc 1800

tgtccggctg tgtctataac agtaaggtgt ccaccggcgc ggaacagcta cagcatcatc 1860

gtttcgtgtt gaccagcgtc aacggccagg cggtgaacgc gggcgaccgg ccgctggagc 1920

tgagcttcgg cgagaagacg actcttacgg gcaatatgta tgtttcgggc aatatgtgca 1980

acggcttcag cggggaaggt aaggtgtcgg acggcgagct gaaggttaaa tcgctggcga 2040

tgacccggat gctgtgccac gatgcccagc tcaataccct tgacgcgacc attggtaaga 2100

tgctgcgcga gggcgcgcag gtcgatctga cggaaaacca gttgacgctg gcgaccgccg 2160

accagacgct ggtctataag ctcgccgacc tgatgcatta g 2201

<210> 31

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

aactttgtct ttcaaagaga ttccgcaaat attccgggga tccgtcgacc 50

<210> 32

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

aatcagacga tagcgttcgg gcaggtttca tgtaggctgg agctgcttc 49

Claims (10)

1.克雷伯氏肺炎杆菌突变菌，其特征在于：所述克雷伯氏肺炎杆菌突变菌为丙酮酸脱氢酶系活性失活的克雷伯氏肺炎杆菌，或丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的克雷伯氏肺炎杆菌，或丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脱氢酶活性同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌。

2.如权利要求1所述的克雷伯氏肺炎杆菌突变菌，其特征在于：所述丙酮酸脱氢酶系活性失活通过丙酮酸脱氢酶系基因中的一个或多个基因失活来实现；所述丙酮酸甲酸裂解酶活性失活通过丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因失活来实现；所述丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脱氢酶活性同时失活通过丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因和乳酸脱氢酶ldhA基因同时失活来实现。

3.克雷伯氏肺炎杆菌突变菌生产1,3-丙二醇的应用，所述克雷伯氏肺炎杆菌突变菌为丙酮酸脱氢酶系活性失活的克雷伯氏肺炎杆菌。

4.如权利要求3所述的克雷伯氏肺炎杆菌突变菌生产1,3-丙二醇的应用，其特征在于：所述丙酮酸脱氢酶系活性失活的克雷伯氏肺炎杆菌通过丙酮酸脱氢酶系基因中的一个或多个基因失活获得。

5.克雷伯氏肺炎杆菌突变菌生产1,3-丙二醇的应用，所述克雷伯氏肺炎杆菌突变菌为丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的克雷伯氏肺炎杆菌。

6.如权利要求5所述的克雷伯氏肺炎杆菌突变菌生产1,3-丙二醇的应用，其特征在于：所述丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的克雷伯氏肺炎杆菌通过丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因失活获得。

7.克雷伯氏肺炎杆菌突变菌生产1,3-丙二醇的应用，所述克雷伯氏肺炎杆菌突变菌为丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脱氢酶活性同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌。

8.如权利要求7所述的克雷伯氏肺炎杆菌突变菌生产1,3-丙二醇的应用，其特征在于：所述丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脱氢酶活性同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌通过丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因和乳酸脱氢酶ldhA基因同时失活获得。

9.权利要求1或2所述的克雷伯氏肺炎杆菌突变菌生产1,3-丙二醇的方法，该方法为：将所述的克雷伯氏肺炎杆菌突变菌接种到以甘油为碳源的培养基中，进行微氧发酵生产1,3-丙二醇。

10.如权利要求9所述的克雷伯氏肺炎杆菌突变菌生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，所述微氧发酵生产1,3-丙二醇的培养条件为：发酵液pH值为6.8～7.2，发酵温度为30～40℃。