CN1284132A

CN1284132A - 用重组生物体生产甘油的方法

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Publication number: CN1284132A
Application number: CN98813415A
Authority: CN
Inventors: R·V·奈尔; M·S·佩恩; D·E·特里布尔; F·瓦尔
Original assignee: Zenniko International; EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: Zenniko International; EIDP Inc
Priority date: 1997-12-02
Filing date: 1998-12-02
Publication date: 2001-02-14
Anticipated expiration: 2018-12-02
Also published as: JP4570775B2; DE69831813T2; BR9815361B1; US20060286653A1; WO1999028480A1; HK1028419A1; CA2311601A1; EP1034278A1; AU1619199A; US7005291B1; IL136407A0; BR9815361A; KR100550203B1; KR20010032720A; JP2001525175A; CN1202253C; CA2311601C; DE69831813D1; ATE305972T1; US7402415B2

Abstract

提供含有编码用于由各种碳底物生产甘油的甘油－3－磷酸脱氢酶和/或甘油－3－磷酸酶活性的基因的重组生物体。所述重组体在编码具有甘油激酶和甘油脱氢酶活性蛋白的内源性基因中还含有破坏。

Description

用重组生物体生产甘油的方法

发明领域

本发明涉及分子生物学领域和采用重组生物体生产甘油和由甘油生物合成途径衍生的化合物。更具体地讲，本发明描述了用于生产甘油和由碳底物衍生的化合物的重组细胞的构建、含其编码的蛋白具有甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)和甘油-3-磷酸酶(G3P磷酸酶)活性的外源基因的细胞，在所述细胞中编码转化甘油的甘油激酶活性和甘油脱氢酶活性的内源基因已经缺失。

背景

甘油是一种工业上大量需要的化合物，用于化妆品、液体皂、食品、药物、润滑剂、防冻液以及无数其它用途。甘油酯在油脂工业中是重要的。历史上，已经从动物脂肪和相似来源中分离出甘油；然而，所述方法耗费劳力并且无效率。最好是由微生物生产甘油。

不是所有生物体都具有合成甘油的天然能力。然而，已知一些细菌、藻类和酵母的物种可生物产生甘油。细菌地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)和蕃茄乳杆菌(Lactobacillus lycopersica)合成甘油。发现耐盐藻杜氏藻属物种(Dunaliella sp.)和Asteromonas gracilis产生甘油以保护性抗外界高盐浓度(Ben-Amotz等，(1982)Experientia 38：49-52)。同样，各种耐渗透酵母合成甘油作为保护性措施。大多数酵母属(Saccharomyces)菌株在乙醇发酵期间产生一些甘油，并且施加渗透胁迫可以增强合成甘油(Albertyn等，(1994)Mol.Cell．Biol.14，4135-4144)。本世纪初，工业上用加入诸如亚硫酸盐或碱的导向剂(steeringreagent)的酵母属培养物生产甘油。所述导向剂通过形成无活性复合物阻断或抑制乙醛转化为乙醇；因此，可利用过量的还原性相当物(NADH)或“导向”二羟丙酮磷酸还原，以产生甘油。该方法受限于亚硫酸盐引起的对酵母生长的部分抑制。该限制可以通过采用碱得到部分克服，所述碱通过不同的机理形成过量NADH相当物。在该实践中，所述碱启动Cannizarro歧化反应以由两个当量的乙醛产生乙醇和乙酸。因此，尽管由天然存在的生物体生成甘油是可能的，但是生产常常需要控制培养物的渗透胁迫和亚硫酸盐的产生。需要没有这些限制的方法。对于这样的方法，由含编码甘油生物合成途径重要步骤的外源基因的重组生物体生产甘油是一种可能途径。

已经分离了许多参与甘油生物合成途径的基因。例如，已经从糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)克隆并测序了编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因(DAR1，GPD1)(Wang等，(1994)，J．Bact.176：7091-7095)。将DAR1基因克隆入穿梭载体并用来转化大肠杆菌，该基因在大肠杆菌中的表达产生活性酶。Wang等(同上)认识到，DAR1受细胞渗透环境的调节，但是并未提示该基因在重组生物体中可以如何用来提高甘油产量。

已经分离了其它甘油-3-磷酸脱氢酶。例如已经从酿酒酵母(S．cerevisiae)克隆并测序分析了sn-甘油-3-磷酸脱氢酶(Larason等，(1993)Mol.Microbiol.，10：1101)。Albertyn等((1994)Mol.Cell.Biol.，14：4135)指出，从酿酒酵母克隆编码甘油-3-磷酸脱氢酶的GPD1。如同Wang等一样，Albertyn等和Larason等均认识到该基因是渗透敏感性调节的，但是并未提示该基因可以如何用于重组生物体生产甘油。

正如G3DPH一样，已经从酿酒酵母分离甘油-3-磷酸酶，并鉴定该蛋白由GPP1和GPP2基因编码(Norbeck等，(1996)J.Biol.Chem.，271：13875)。像G3DPH编码基因一样，似乎GPP2是渗透诱导的。

虽然已经分离出G3PDH和G3P磷酸酶的编码基因，但是本领域仍没有已知的技术指出由一起表达或分别表达G3PDH/G3P磷酸酶的重组生物体生产甘油。也没有已知的技术提出由具有这两种酶活性的任何野生型生物体生产甘油，所述酶活性不需要对所述细胞施与某种胁迫(盐或渗压剂(osmolyte))。事实上，所述技术提出G3PDH活性可能不影响甘油生产。例如，Eustace((1987)，Can.J．Microbiol.，33：112-117))指出杂交酵母菌株产生甘油的水平高于亲代株。然而，Eustace也指出与野生型相反，在杂交的酵母菌株中G3PDH活性保持不变或略微降低。

甘油是工业上有用的物质。然而，其它在工业上具有重要性的化合物也可以得自甘油生物途径。例如，可以将生产甘油的生物体工程改造来生产一种在聚酯纤维生产中和聚氨基甲酸酯以及环状化合物生产中具有潜在用途的单体1，3-丙二醇(U.S.5686276)。已知例如，在某些生物体中，分别通过脱水酶和氧化还原酶的作用将甘油转化为3-羟基丙醛，然后转化为1，3-丙二醇。例如在种群柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、梭菌属(Clostridium)、肠杆菌属(Ehterobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳杆菌属(Lactobacillus)和暗杆菌属(Pelobacter)中已经发现能够产生1，3-丙二醇的菌株。甘油脱水酶系统和二醇脱水酶系统分别描述于Seyfried等，(1996)J．Bacteriol.178：5793-5796和Tobimatsu等，(1995)J．Bilo．Chem.270：7142-7148。能够产生1，3-丙二醇的含有外源脱水酶的重组生物体已有描述(U.S.5686276)。尽管这些生物体产生1，3-丙二醇，但是清楚的是，它们得益于使甘油转化最小化的系统。

在甘油转化最小化时，对用于生产1，3-丙二醇的产甘油生物体工程改造具有许多优点。工业上需要能够在生理条件下有效产生甘油的微生物，尤其是当甘油本身作为更为复杂的可以通过渗透胁迫或加入导向剂进行干扰的分解代谢或生物合成途径(例如产生1，3-丙二醇)的部分用作体内底物时。在产生甘油激酶和甘油脱氢酶突变体方面已经进行了某些努力。例如，De Koning等((1900)Appl.MicrobiolBiotechnol.32：693-698)报道，用二羟基丙酮激酶和甘油激酶阻断的甲基营养型酵母多形汉母逊酵母(Hansenula polymorpha)突变体来依赖甲醇生产二羟基丙酮和甘油。补充同化反应的木酮糖-5-磷酸共底物需要的甲醇和另一底物用来生产甘油；然而也需要二羟基丙酮还原酶(甘油脱氢酶)。同样，Shaw和Cameron(Book of Abstracts，第211届ACS国家会议，New Orleans，LA，1996年3月24-28目，BIOT-154Publisher：American Chemical Society，Washington，D.C.)研究通过缺失ldhA(乳酸脱氢酶)、glpK(甘油激酶)和tpiA(丙糖磷酸异构酶)来优化1，3-丙二醇生产。他们没有提出表达G3PDH或G3P磷酸酶克隆基因来生产甘油或1，3-丙二醇，他们也未讨论甘油脱氢酶的影响。

所以，上述待解决的问题是缺乏通过加入或增强一些酶活性引导碳流向甘油生产，特别是分别催化二羟丙酮磷酸(DHAP)转化为甘油-3-磷酸(G3P)、然后转化为甘油的G3PDH和G3P磷酸酶。该问题的复杂性在于需要通过缺失或降低某些酶活性尤其是分别催化甘油加ATP转化为G3P和甘油转化为二羟丙酮(或甘油醛)的甘油激酶和甘油脱氢酶活性，从而控制碳流脱离甘油。

发明概述

本发明提供由重组生物体生产甘油的方法，包括：用包含以下以下一个或两个基因的表达盒转化合适的宿主细胞，所述基因为：(a)编码具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的蛋白的基因和(b)编码具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的蛋白的基因；其中所述合适的宿主细胞在以下一个或两个基因中有破坏，所述基因是(a)内源性甘油激酶编码基因和(b)内源性甘油脱氢酶编码基因；其中所述破坏阻止活性基因产物的表达；在存在至少一种选自单糖、寡糖、多糖和一碳底物的碳源的情况下，培养转化的宿主细胞，由此生产甘油；以及回收所产生的甘油。

本发明还提供由重组生物体生产1，3-丙二醇的方法，包括：用包含以下一个或两个基因的表达盒转化合适的宿主细胞，所述基因为：(a)编码具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的蛋白的基因和(b)编码具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的蛋白的基因；所述合适的宿主细胞含有至少一种具脱水酶活性蛋白的编码基因且在以下一个或两个基因中有破坏，所述基因是(a)内源性甘油激酶编码基因和(b)内源性甘油脱氢酶编码基因，其中基因(a)或(b)中的破坏阻止活性基因产物的表达；在存在至少一种选自单糖、寡糖、多糖和一碳底物的碳源的情况下，培养转化的宿主细胞，由此生产1，3-丙二醇；以及回收所产生的1，3-丙二醇。

此外，本发明提供由引入多拷贝内源性基因的重组生物体生产1，3-丙二醇的方法。

本发明的另一实施方案包括用甘油途径的异源基因转化的宿主细胞以及含有甘油途径内源基因的宿主细胞。

另外，本发明提供适合生产甘油或1，3-丙二醇的重组细胞，所述宿主细胞具有表达甘油-3-磷酸脱氢酶活性和甘油-3-磷酸磷酸酶活性中的一种或两种的基因，其中所述细胞也在内源性甘油激酶编码基因和内源性甘油脱氢酶编码基因中的一个或两个基因中有破坏，其中所述基因的破坏阻止活性基因产物的表达。

附图、生物保藏和序列表简述

图1图示涉及甘油代谢的典型酶途径。

申请人根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条款进行了下列生物保藏：保藏人鉴定参考国际保藏名称保藏日期大肠杆菌pAH21/DH5α ATCC 98187 1996年9月26日(含有GPP2基因)大肠杆菌(pDAR1A/AA200) ATCC 98248 1996年11月6日(含有DAR1基因)FM5大肠杆菌RJF10m ATCC 98597 1997年11月25日(含有glpK破坏)FM5大肠杆菌MSP33.6 ATCC 98598 1997年11月25日(含有gldA破坏)

“ATCC”是指国际保藏机构美国典型培养物保藏中心，位于12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 U.S.A.。所述名称是所保藏材料的保藏号。

根据专利申请中核苷酸序列和氨基酸序列标准表示规则(EPO局长的决定(Decision of the President of the EPO)的附录Ⅰ和附录Ⅱ，发表于OJ EPO的增刊第2期，12/1992)和37 C.F.R.1.821-1.825以及附录A和B(对包含核苷酸和/或氨基酸序列的申请说明书的要求)，申请人提供了43种序列。

发明详述

本发明通过提供在重组生物体中由可发酵碳源生物生产甘油的方法来解决上述问题。所述方法提供可用于化妆品和制药工业的快速、便宜和环保的甘油源。所述方法采用含有克隆的同源或异源甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)和/或甘油-3-磷酸酶(G3P磷酸酶)编码基因的微生物。这些基因在内源甘油激酶和/或甘油脱氢酶编码基因已破坏的重组宿主中表达。该方法可用于生产甘油以及甘油为中间体的任何终末产物。将所述重组微生物与碳源接触并培养，然后从条件培养基分离由其衍生的甘油或任何终末产物。所述基因可以分别或同时掺入宿主微生物以生产甘油。

申请人的方法先前没有关于重组生物体的描述，并且该方法需要分离编码所述两种酶的基因以及所述基因随后在内源性激酶和脱氢酶基因已破坏的宿主细胞中表达。熟悉该领域的人员会知道，本申请人的方法一般可用于生产甘油是重要中间体的化合物如1，3-丙二醇。

用于本文的下列术语可以用来解释权利要求书和说明书。

术语“甘油-3-磷酸脱氢酶”和“G3PDH”指的是负责催化二羟丙酮磷酸(DHAP)转化为甘油-3-磷酸(G3P)的酶活性的一种多肽。在体内G3PDH可以是NADH、NADPH或FAD依赖性的。NADH依赖酶(EC 1.1.1.8)例如由几种基因编码，包括GPD1(GenBank Z74071x2)、或GPD2(GenBank Z35169x1)、或GPD3(GenBank G984182)或DAR1(GenBank Z74071x2)。NADPH依赖酶(EC 1.1.1.94)由gpsA(GenBankU321643、(cds 197911-196892)G466764和L45246)编码。FDA依赖酶(EC 1.1.99.5)由GUT2(GenBank Z47047x23)、或glpD(GenBankG147838)或glpABC(GenBank M20938)编码。

术语“甘油-3-磷酸酶”、“sn-甘油-3-磷酸酶”、或“d，1-甘油磷酸酶”和“G3P磷酸酶”是指一种负责催化甘油-3-磷酸转化为甘油和无机磷酸的酶活性的多肽。G3P磷酸酶例如由GPP1(GenBankZ47047x125)或GPP2(GenBank U18813x11)编码。

术语“甘油激酶”是一种负责催化甘油和ATP转化为甘油-3-磷酸和ADP的酶活性的多肽。高能磷酸供体ATP可以用生理取代物(例如磷酸烯醇丙酮酸)替代。甘油激酶例如由GUT1(GenBank U11583x19)和glpK(GenBank L19201)编码。

术语“甘油脱氢酶”是指负责催化甘油转化为二羟丙酮(E.C.1.1.1.6)或甘油转化为甘油醛(E.C.1.1.1.72)的酶活性的多肽。负责催化甘油转化为二羟丙酮的酶活性的多肽也称为“二羟丙酮还原酶”。甘油脱氢酶可能依赖于NADH(E.C.1.1.1.6)、NADPH(E.C.1.1.1.72)或其它辅因子(例如E.C.1.1.99.22)。NADH依赖性甘油脱氢酶由例如gldA(GenBand U00006)编码。

术语“脱水酶”将指能够异构化或转化甘油分子为产物3-羟基丙醛的任何酶。为了本发明的目的，脱水酶包括分别优选甘油和1，2-丙二醇作底物的甘油脱水酶(E.C.4.2.1.30)和二醇脱水酶(E.C.4.2.1.28)。在弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)中，例如，甘油脱水酶由其基因序列表示为dhaB，dhaC和dhaE(GenBank U09771：碱基对分别为8556-10223，10235-10819和10822-11250)的三种多肽编码。在产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)中，二醇脱水酶由其基因序列表示为pddA、pddB和pddC(GenBank D45071：碱基对分别为121-1785、1796-2407和2485-3006)的三种多肽编码。

术语“GPD1”、“DAR1”、“OSG1”、“D2830”和“YDL022W”彼此通用，是指编码胞质甘油-3-磷酸脱氢酶的基因，其特征为SEQ IDNO：1所示碱基序列。

术语“GPD2”是指编码胞质甘油-3-磷酸脱氢酶的基因，其特征为SEQ ID NO：2所示碱基序列。

术语“GUT2”和“YIL155C”彼此通用，指的是编码线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶的基因，其特征为SEQ ID NO：3所示碱基序列。

术语“GPP1”、“RHR2”和“YIL053W”彼此通用，指的是编码胞质甘油-3-磷酸酶的基因，其特征为SEQ ID NO：4所示碱基序列。

术语“GPP2”、“HOR2”和“YER062C”彼此通用，指的是编码胞质甘油-3-磷酸酶的基因，其特征为SEQ ID NO：5所示碱基序列。

术语“GUT1”是指编码胞质甘油激酶的基因，且特征为SEQ IDNO：6所示的碱基序列。术语“glpK”是指另一个编码甘油激酶的基因，其特征为GeneBank L19201碱基对77347-78855所示碱基序列。

术语“gldA”是指编码甘油脱氢酶的基因，其特征为GeneBankU00006碱基对3174-4316所示碱基序列。术语“dhaD”是指另一个编码甘油脱氢酶的基因，其特征为GeneBank U09771碱基对2557-3654所示碱基序列。

本文所用的术语“功能”和“酶功能”是指进行特定化学反应需要改变能量的酶的催化活性。这种活性可以用于平衡反应，在所述平衡反应中在合适条件下可以完成产物和底物两者的生成。

术语“多肽”和“蛋白”彼此通用。

术语“碳底物”和“碳源”指能被本发明宿主生物体代谢的碳源，特别是选自单糖、寡糖、多糖和一碳底物或它们的混合物的常用碳源。

“转化”是指通过化学反应降解或改变化学化合物或底物的复杂性的生物体或细胞的代谢过程。

术语“宿主细胞”和“宿主生物体”是指能够接受外源或异源基因以及额外拷贝的内源基因并表达这些基因以产生活性基因产物的微生物。

术语“生产细胞”和“生产生物体”是指工程改造来生产甘油或可以衍生自甘油生物合成途径的化合物的细胞。所述生产细胞将是重组的，并含具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性蛋白的编码基因和具甘油-3-磷酸酶活性蛋白的编码基因中的一个或两个。除了G3PDH和G3P磷酸酶基因外，所述宿主细胞将在内源性甘油激酶编码基因和内源性甘油脱氢酶编码基因中的一个或两个基因中有破坏。在所述生产细胞设计用来生产1，3-丙二醇时，它另外含有具脱水酶活性蛋白的编码基因。

术语“外源基因”、“外源DNA”、“异源基因”和“异源DNA”全都是指已经置于不同宿主生物体内的某种生物体的天然遗传物质。

关于基因或基因表达的多肽的本文所用术语“内源性”，是指生产细胞天然的、而不是得自另一种生物体的基因或多肽。因此“内源性甘油激酶”和“内源性甘油脱氢酶”是指生产细胞的天然基因编码的多肽的术语。

术语“重组生物体”和“转化宿主”是指用异源或外源基因转化的任何生物体。本发明的重组生物体表达编码G3PDH和G3P磷酸酶的外源基因，以由合适碳底物生产甘油。另外，术语“重组生物体”和“转化宿主”是指用内源性(或同源性)基因转化的任何生物体，以便增加基因拷贝数。

“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码区域之前(5’非编码区)和之后(3’非编码区)的调节序列。术语“天然”和“野生型”基因是指发现于自然界、具有其自身调节序列的基因。

术语“编码(encoding)”和“编码(coding)”是指基因通过其转录和翻译机制产生氨基酸序列的过程。编码特定氨基酸序列的方法是指包括可能涉及不引起编码的氨基酸变化的碱基改变的DNA序列、或涉及可能改变一个或一个以上氨基酸的碱基变化但是不影响该DNA序列所编码蛋白的功能特性的DNA序列。所以本发明包括特定典型序列以外的其它序列。也设想了基本上不影响所产生蛋白分子功能特性的序列修饰，诸如导致沉默变化的缺失、插入或取代。例如设想了反映遗传密码简并性、或导致在指定部位产生化学上相当氨基酸的基因序列中的变化；因此，疏水氨基酸丙氨酸的密码子可以由编码另一疏水性较低的残基(诸如甘氨酸)或疏水性较高的残基(诸如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。同样，也可以预期导致一种负电荷残基取代另一负电荷残基(诸如天冬氨酸取代谷氨酸)或者一种正电荷残基取代另一种正电荷残基(诸如赖氨酸取代精氨酸)的变化产生生物学相当的产物。也可以预期，导致该蛋白分子N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化将不改变该蛋白活性。实际上在某些情况下，为了研究改变对该蛋白生物活性的影响，可能最好是制备该序列的突变体。以上提出的各种改变与确定所编码产物生物活性的保留一样，完全是本领域的常规技术。此外，该领域技术人员会认识到，本发明包括的序列也根据其与本文所列举的序列在严格杂交条件(0.1XSSC，0.1％SDS，65℃)下的杂交能力进行定义。

术语“表达”是指由编码该基因产物序列的基因转录以及翻译成为基因产物。

本文所用的术语“质粒”、“载体”和“盒”是指常常携带的基因不是该细胞重要代谢的部分、并且通常是环状双链DNA分子形式的染色体外元件。这类元件可以是得自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，可以是线性或环形结构的单链或双链DNA或RNA，其中许多核苷酸序列已经结合或重组为一种独特结构，该独特结构能够将启动子片段和选定基因产物的DNA序列以及合适的3’非翻译序列导入细胞。“转化盒”是指含有外源基因和除了该外源基因外还含有促进特定宿主细胞转化的元件的特定载体。“表达盒”是指含有外源基因和除了该外源基因外还含有允许所述基因在外源宿主中表达提高的元件的特定载体。

术语“转化”和“转染”指在掺入核酸后细胞中获得新基因。所获得的基因可以整合到染色体DNA中或作为染色体外复制序列导入。术语“转化体”是指转化产生的细胞。

术语“遗传性改变”指通过转化或突变改变遗传物质的方法。用于基因的术语“破坏”和“基因断裂”是指通过在基因中加入或缺失该基因的重要部分使得该基因编码的蛋白不表达或不以活性形式表达而遗传性改变生物体的方法。甘油生物合成途径

设想了通过操作发现于大多数微生物中的甘油生物合成途径，可以在重组生物体中生产甘油。通常在ATP存在下通过己糖激酶使诸如葡萄糖的碳底物转化为葡萄糖-6-磷酸。葡萄糖-磷酸异构酶催化葡萄糖-6磷酸转化为果糖-6磷酸，然后通过6-磷酸果糖激酶的作用转化为果糖-1，6-二磷酸。之后醛缩酶使该二磷酸变为二羟丙酮磷酸(DHAP)。最后NADH依赖性G3PDH将DHAP转化为甘油-3-磷酸，再后甘油-3-磷酸通过G3P磷酸酶脱磷酸为甘油(Agarwal(1990)，Adv.Biochem.Engrg.41：114)。G3PDH、甘油脱氢酶、G3P磷酸酶和甘油激酶的编码基因

本发明提供适合在宿主细胞中表达G3PDH和G3P磷酸酶活性的基因。

已知编码G3PDH的基因。例如，GPD1已经从酵母属分离并且具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列，该碱基序列编码SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列(Wang等，同上)。同样，也已经从酵母属分离出由GPD2编码的G3PDH活性，GPD2具有SEQ ID NO：2所示的碱基序列，编码SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列(Eriksson等，(1995)Mol.Microbiol.，17：95)。

为了本发明目的，设想编码负责G3PDH活性的多肽的任何基因都是合适的，其中所述活性能够催化二羟丙酮磷酸(DHAP)转化为甘油-3-磷酸(G3P)。此外，设想编码分别对应于基因GPD1、GPD2、GUT2、gpsA、glpD和glpABC的α亚单位的SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12所示的G3PDH氨基酸序列的任何基因在本发明中都是有功能的，其中所述氨基酸序列可以包含不改变该酶功能的氨基酸取代、缺失或加入。本领域技术人员会理解，从其它来源分离的G3PDH的编码基因也将适用于本发明。例如从原核生物分离的基因包括GenBank登记号M34393、M20938、L06231、U12567、L45246、L45323、L45324、L45325、U32164、U32689和U39682。从真菌分离的基因包括GenBank登记号U30625、U30876和X56162；从昆虫分离的基因包括GenBank登记号X61223和X14179；以及从哺乳动物源分离的基因包括GenBank登记号U12424、M25558和X78593。

已知G3P磷酸酶的编码基因。例如GPP2已经从酿酒酵母分离并具有SEQ ID NO：5所示的碱基序列，所述碱基序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示(Norbeck等，(1996)，J．Biol．Chem.，271：13875)。

为了本发明目的，编码G3P磷酸酶活性的任何基因均适用于本发明方法，其中所述活性能够催化甘油-3-磷酸和水转化为甘油和无机磷酸。此外，编码分别对应于基因GPP2和GPP1的SEQ ID NO：13和14所示的G3P磷酸酶氨基酸序列的任何基因在本发明中都是有功能的，其中所述氨基酸序列包括包含不改变G3P磷酸酶酶功能的氨基酸取代、缺失或加入的任何氨基酸序列。本领域技术人员会理解，从其它来源分离的G3P磷酸酶编码基因也将适用于本发明。例如用一种或多种以下一般或特定的磷酸酶可以实现甘油-3-磷酸脱磷酸产生甘油，所述磷酸酶如下：碱性磷酸酶(EC 3.1.3.1)[GenBank M19159、M29663、U02550或M33965]；酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)[GenBankU51210、U19789、U28658或L20566]；甘油-3-磷酸酶(EC 3.1.3.-)[GenBank Z38060或U18813x11]；葡萄糖-1-磷酸酶(EC 3.1.3.10)[GenBank M33807]；葡萄糖-6-磷酸酶(EC 3.1.3.9)[GenBank U00445]；果糖-1，6-二磷酸酶(EC 3.1.3.11)[GenBank X12545或J03207]或磷脂酰(phosphotidyl)甘油磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.27)[GenBank M23546和M23628]。

已知甘油激酶的编码基因。例如来自酵母的甘油激酶编码基因GUT1已经分离并测序(Pavlik等(1993)，Curr.Genet.，24：21)，其碱基序列如SEQ ID NO：6所示，该序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。另一方面，得自大肠杆菌的glpK编码甘油激酶，其特征为GeneBankL9201，碱基对77347-78855所示的碱基序列。

已知编码甘油脱氢酶的基因。例如得自大肠杆菌的gldA编码甘油脱氢酶，其特征为GeneBank U00006，碱基对3174-4316所示的碱基序列。另一方面，dhaD是得自弗氏柠檬酸杆菌的另一个甘油脱氢酶编码基因，其特征为GeneBank U09771，碱基对2557-3654所示的碱基序列。宿主细胞

通过表达G3PDH和G3P磷酸酶重组生产甘油的合适宿主细胞可以是或者原核生物细胞或者真核生物细胞，并且只受其表达活性酶的能力的限制。优选的宿主细胞是那些通常用于生产甘油的细菌、酵母和丝状真菌，例如柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷伯氏菌属、气杆菌属(Aerobacter)、乳杆菌属、曲霉属(Aspergillus)、酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、毛霉属(Mucor)、球拟酵母属(Torulopsis)、甲基细菌属(Methylobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)和假单胞菌属(Pseudomonas)。在本发明中优选宿主细胞是大肠杆菌和酵母属。

当甘油在1，3-丙二醇生产中是重要中间体时，所述宿主细胞将含有或者具脱水酶活性蛋白的内源性编码基因或者通过转化获得了这种基因。特别适于生产1，3-丙二醇的宿主细胞是含有编码脱水酶的内源性基因的柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷伯氏菌属、气杆菌属、乳杆菌属和沙门氏菌属。此外，缺乏这种内源性基因的宿主细胞包括大肠杆菌。载体和表达盒

本发明提供适合将G3PDH和G3P磷酸酶克隆、转化入合适宿主细胞并在其中表达的各种载体和转化盒以及表达盒。合适的载体是那些与所用细菌相容的载体。合适的载体可以得自于例如细菌、病毒(诸如噬菌体T7或M-13衍生噬菌体)、粘粒、酵母或植物。获得和使用这类载体的方法是本领域技术人员已知的(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual-第1、2、3卷(Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY，1989))。

通常，上述载体或盒含有指导合适基因转录和翻译的序列、选择标记以及允许自主复制和染色体整合的序列。合适的载体包含带有转录起始控制的该基因的5’区，以及包含控制转录终止的该DNA片段的3’区。最优选的是，这两种控制区均得自与转化的宿主细胞同源的基因。这类控制区不必得自选作生产宿主的特定物种的天然基因。

可用来在所需宿主细胞中驱动G3PDH和G3P磷酸酶基因表达的起始控制区或启动子种类繁多，并是本领域技术人员熟悉的。实际上能够驱动这些基因的任何启动子均适合于本发明，所述启动子包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL1O、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO和TPI(可用于在酵母属中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属中表达)；以及lac、trp、λPL、λPR、T7、tac和trc(用于在大肠杆菌中表达)。

终止控制区也可以得自所述优选宿主的各种天然基因。任选的是，终止位点可以是非必需的；然而假如包括其中则是最优选的。

为了有效表达上述例举的(instant)酶，编码该类酶的DNA可通过起始密码子操作性连接至选定的表达控制区，这样表达导致形成合适的信使RNA。转化合适宿主并表达用于生产甘油的G3PDH和G3P磷酸酶

一旦构建了合适的盒后，将其用来转化合适的宿主细胞。通过诸如转化(例如用钙透化细胞、电穿孔)或通过采用重组噬菌体病毒的转染的已知方法(Sanbrook等，同上)，可以将含有G3PDH和/或G3P磷酸酶的编码基因的盒导入所述宿主细胞。

正如在一般方法和实施例中全面叙述的一样，在本发明中AH21和DAR1盒用来转化大肠杆菌DH5α。

另一方面，设想了可以操作含有内源性G3PDH和/或G3P磷酸酶基因的合适宿主细胞，使得向上调节相关基因以生产甘油。

向上调节内源性基因的方法是本领域众所周知的。例如，为了向上调节所需要的基因，一般将结构基因置于受体微生物识别的DNA启动子区的下游。除了启动子外，可以包括增强或控制异源基因表达的其它调节序列。此外，人们可以通过用于相同目的的任何已知遗传操作来改变内源性基因的调节序列。表达可以通过诱导物或阻抑物控制，以便所述微生物同步表达完成需要的代谢途径必需的基因。

在本发明中，含有内源性G3PDH和/或G3P磷酸酶活性编码基因的宿主细胞可以置于调节型启动子(例如lac或osmy)或组成型启动子控制之下。例如，可以构建一种盒以含有特定的诱导型启动子或组成型启动子，其侧翼为足够长度并同源于天然基因的DNA以便可以寻靶。在合适的生长条件下导入所述盒将引起所述盒和基因的靶部分之间发生同源重组，并用调节型启动子取代相关的天然启动子。这类方法可以用来实现向上调节内源性G3PDH和/或G3P磷酸酶活性编码基因以生产甘油。破坏酶活性的随机诱变和位点专一诱变

生物体代谢甘油的酶途径是本领域已知的，见图1。甘油通过ATP依赖性甘油激酶转化为甘油-3-磷酸(G3P)；然后G3P可以通过G3PDH氧化为DHAP。在第二个途径中，甘油通过甘油脱氢酶氧化为二羟丙酮(DHA)；然后DHA通过ATP依赖性DHA激酶转化为DHAP。在第三个途径中，甘油通过甘油脱氢酶氧化为甘油醛；甘油醛可以通过ATP依赖性激酶磷酸化为甘油醛-3-磷酸。通过丙糖磷酸异构酶的作用相互转化的DHAP和甘油醛-3-磷酸可以进一步通过中心代谢途径代谢。这些途径因引入副产物对甘油生产是有害的。

本发明的一个方面是能够提供其中转化甘油的甘油激酶活性和甘油脱氢酶活性已经缺失、用于生产甘油的生产生物体。产生缺失突变体的方法是常见的并且是本领域众所周知的。例如，将野生型细胞暴露于各种因子如辐射或化学诱变剂，然后筛选所需要的表型。当通过辐射产生突变时，可以使用紫外(UV)或离子辐射。适用于基因突变的短波UV波长范围为200nm-300nm，其中优选254nm。在该波长内的UV辐射主要引起核酸序列中的胍和胞嘧啶变为腺嘌呤和腺苷。因为所有细胞都具有修复大多数UV诱导的突变的DNA修复机制，所以可以加入因子如咖啡因和其它抑制剂中断所述修复过程并最大化有效突变数。应用300nm-400nm范围的光的长波UV突变也可以，但是一般不如短波UV光有效，除非结合使用各种与所述DNA相互作用的激活剂如补骨脂素染料。

用化学剂的诱变也有效产生突变体，常规使用的物质包括影响非复制DNA的化学药品如HNO2和NH2OH以及影响复制DNA的因子如吖啶染料，后者值得注意的是引起移码突变。采用辐射或化学试剂产生突变的具体方法在本领域中已有充分文献论述。参见例如Thoma D.Brock载于Biotechnology：A Textbook of IndustrislMicrobiology，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.，或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36，227，(1992)，所述文献通过引用结合到本文。

诱变发生后，可以用各种方法选择具有需要表型的突变体。在根据产生所需产物或中间体的能力筛选变细胞的情况下，随机筛选是最常见的。另一方面，在只有抗性菌落可以产生的情况下，通过在选择性培养基中使诱变的群体生长可以进行突变体的选择性分离。突变体选择方法获得了高度发展并是工业微生物领域周知的。参见Brock，同上，DeMancilha等，Food Chem.，14，313，(1984)。

随机靶向基因的生物诱变剂是本领域众所周知的。参见例如DeBruijn和Rossbach载于Methods for General and Molecular Bacteriology(1994)American Society for Microbiology，Washington，D.C.。另一方面，如果已知基因序列，则通过与合适质粒同源重组实现基因特定缺失或取代的染色体基因的破坏。参见例如Hamilton等，(1989)J.Bacteriol.171：46174622，Balbas等，(1993)Gene 136：211-213，Gueldener等，(1996)Nucleic Acids Res．24：2519-2524，和Smith等，(1996)Methods Mol.Cell Biol.5：270-277。

预期任何上述方法均可以用来在优选的生产生物体中缺失或失活甘油激酶和甘油脱氢酶。培养基和碳底物

本发明中的发酵培养基必须含有合适的碳底物。合适的碳底物可以包括但不限于单糖诸如葡萄糖和果糖、寡糖诸如乳糖或蔗糖、多糖诸如淀粉或纤维素、或它们的混合物、和可再生原料的非纯化混合物诸如干酪乳清渗透物、玉米浆、甜菜糖蜜和大麦芽。此外，所述碳底物也可以是已经证实代谢转化为关键的生化中间体的一碳底物诸如二氧化碳或甲醇。

已有报道，在甲基营养酵母中(Yamada等(1989)，Agric.Biol.Chem.，53(2)：541-543)和在细菌中(Hunter等(1985)，Biochemistry，24：4148-4155)由一碳源(例如甲醇、甲醛或甲酸盐)生产甘油。这些生物体可以同化氧化状态的从甲烷到甲酸盐范围的一碳化合物，并且生产甘油。该碳同化途径可以通过核酮糖一磷酸、通过丝氨酸或通过木酮糖一磷酸(Gottschalk，Bacterial Metabolism，第二版，Springer-Verlag：纽约(1986))。所述核酮糖一磷酸途径涉及甲酸与核酮糖-5-磷酸缩合形成6碳糖，6碳糖变为果糖，最终形成三碳产物一甘油醛-3-磷酸。同样，所述丝氨酸途径通过亚甲四氢叶酸将一碳化合物同化入糖酵解途径。

除了一碳和二碳底物外，也已知甲基营养生物体利用诸如甲胺、葡糖胺的许多其它含碳化合物和各种氨基酸用于代谢活动。例如，已知甲基营养酵母利用甲胺碳形成海藻糖或甘油(Bellion等(1993)，Microb.Growth Cl Compd.，[Int.Symp.]，第7期，415-32，编辑：Murrell，J.Collin；Kelly，Don P.。出版商：Intercept，Andover，英国)。同样，各种念珠菌属菌种可以代谢丙氨酸或油酸(Sulter等(1990)，Arch.Microbiol.，153(5)：485-9)。因此，在本发明中所用的碳源可以包括种类繁多的含碳底物，并且只受生物体选择的限制。

尽管上述所有碳底物和它们的混合物均适用于本发明，但是优选的碳底物为单糖、寡糖、多糖、一碳底物或它们的混合物。更优选的糖诸如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、以及诸如甲醇和二氧化碳的一碳底物。作为碳底物最优选葡萄糖。

除了合适的碳源外，发酵培养基必须含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂以及其它组分，这些是本领域技术人员已知、适合培养物生长和促进生产甘油所必需的酶途径的。培养条件

通常，细胞在合适培养基中于30℃生长。优选的生长培养基为普通工业制备的培养基，诸如Luria Bertani(LB)肉汤、SabouraudDextrose(SD)肉汤或酵母培养基(YM)肉汤。也可以采用其它确定成分或合成的生长培养基，用于特定微生物生长的合适培养基是微生物学或发酵学领域技术人员已知的。使用已知直接或间接调节分解代谢物阻抑的物质(例如环3’∶5’腺苷酸)也可以加入到该反应培养基中。同样，也可以与基因操作结合或作为基因操作的替代方法，使用提高甘油产量的已知酶活性调节物质(例如亚硫酸盐、亚硫酸氢盐和碱)。

发酵的合适pH范围是pH 5.0-9.0，其中初始状态优选pH范围为6.0-8.0。

在有氧或无氧的条件下进行反应，其中优选无氧或微需氧的条件。鉴定G3PDH、甘油脱氢酶、G3P磷酸酶和甘油激酶活性

通过酶检测法测量蛋白G3PDH、G3P磷酸酶、甘油脱氢酶和甘油激酶的表达水平。一般来说，G3PDH活性和甘油脱氢酶活性检测在DHAP转化为G-3-P和DHA转化为甘油的过程中分别依赖于的共底物NADH的光谱性质。NADH具有固有的紫外/可见光吸收，可以于340nm下用分光光度法监测其消耗。G3P磷酸酶活性可以通过检测该反应中释放出的无机磷酸盐的任何方法进行检测。最普遍使用的检测方法采用可见光谱测定蓝色磷钼酸铵复合物。甘油激酶活性可以通过检测得自甘油和ATP的G3P进行检测，例如采用NMR检测。必要时，可以例如采用替代辅因子对各个酶的更具体的特性进行分析。鉴定和回收甘油以及其它产物(例如1，3-丙二醇)

甘油和其它产物(例如1，3-丙二醇)可以通过对无细胞提取物进行高效液相层析(HPLC)和气相层析/质谱(GC/MS)分析法分析鉴定和定量。优选的方法是采用无梯度的0.01N硫酸流动相，在分析性离子交换柱上分析发酵培养基。

从发酵培养基回收甘油的方法是本领域技术人员已知的。例如，对所述反应混合物进行以下序贯步骤可以从细胞培养基获得甘油，所述步骤是：过滤、脱水、有机溶剂提取和分级蒸馏(美国专利第2，986，495号)。

优选实施方案的描述

甘油的生产

本发明描述了采用重组生物体由合适碳源生产甘油的方法。用携带具甘油-3-磷酸脱氢酶活性蛋白的编码基因和具甘油-3-磷酸酶活性蛋白的编码基因中一个或两个基因的表达盒转化的细菌宿主细胞特别适合本发明。除了所述G3PDH和G3P磷酸酶基因外，所述宿主细胞将在内源性甘油激酶编码基因和内源性甘油脱氢酶编码基因中的一个或两个基因内有破坏。外源性G3PDG和G3P磷酸酶基因(提供由碳源到甘油的途径))与基因破坏(阻断甘油转化)的联合效应是产生能够有效并可靠地生产甘油的生物体。

尽管最适甘油生产的生物体含有上述基因破坏，但是在缺乏这种基因破坏的情况下，用含有中外源性G3PDG和G3P磷酸酶基因的一个或两个的宿主细胞生产甘油是可能的。例如携带DAR1基因的重组大肠杆菌菌株AA200(实施例1)根据发酵参数能够生产甘油0.38g／L-0.48g/L同样，携带并可表达GPP2基因的大肠杆菌DH5α(实施例2)能够产生甘油0.2g/L。当两种基因均存在的情况下(实施例3和4)，甘油产量达到约40g/L。在两种基因均存在并去除了内源性甘油激酶活性的情况下可见甘油转化减少(实施例8)。而且，甘油脱氢酶活性的存在与在葡萄糖有限的情况下的甘油转化有关；因此，预期去除甘油脱氢酶活性将导致甘油转化减少(实施例8)。l，3-丙二醇的生产

本发明也可以适用于通过采用表达外源G3PDH和/或G3P磷酸酶基因且内源性甘油激酶和/或甘油脱氢酶活性已破坏的重组生物体来生产l，3-丙二醇。另外，本发明提供由其中导入多拷贝内源性基因的重组生物体生产1，3-丙二醇的方法。除了这些遗传改变外，所述生产细胞还需要存在活性脱水酶的编码基因。所述脱水酶活性可以是甘油脱水酶或二醇脱水酶活性。所述脱水酶活性可以产生自内源性基因的表达或转染入宿主生物体的外源基因的表达。编码合适脱水酶的基因的分离和表达是本领域众所周知的，并在1996年11月5日提交的PCT/US96/06705和U.S.5686276以及U.S.5633362中由申请人指出，所述专利文献通过引用结合到本文中。应该认识到，因为甘油是1，3-丙二醇生产中的重要中间体，所以所述宿主细胞含有脱水酶活性和表达的外源性G3PDH和/或G3P磷酸酶基因和不存在转化甘油的甘油激酶或甘油脱氢酶活性的情况下，该细胞将特别适于生产1，3-丙二醇。

在以下实施例中进一步详细说明本发明。应该理解的是，这些实施例尽管指出本发明优选的实施方案，但仅仅是为了说明。从上述讨论和这些实施例中，本领域技术人员能够明确本发明的基本特征，并可在不偏离本发明的精神和范畴内对其进行各种改变和改进以将其用于各种用途和情况。

实施例一般方法

磷酸化、连接和转化的方法是本领域技术人员熟知的。适合用于以下实施例的技术可以发现于Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。

适合细菌培养物的保持和生长的材料和方法是本领域技术人员熟知的。适合用于以下实施例的技术可以发现于Manual of Methods forGeneral Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.BriggsPhillips，编辑)，美国微生物协会，华盛顿(1994)，或发现于Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology(Thomas D.Brock，第二版(1989)，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA)。所有用于细菌细胞生长和保持的试剂和材料均从Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或Sigma化学公司(St.Louis，MO)获得，除非另外具体说明。

缩写的意义如下：“h”指小时，“min”指分钟，“sec”指秒，“d”指天，“mL”指毫升，“L”指升。

细胞株

以下大肠杆菌菌株用于转化和表达G3PDH和G3P磷酸酶。从大肠杆菌遗传保藏中心、ATCC或由Life Technologies(Gaithersburg，MD)获得菌株。

AA200(garB10 fhuA22 ompF627 fadL701 relAl pit-10 spoT1 tpi-1phoM510 mcrB1)(Anderson等，(1970)，J．Gen Microbiol.，62：329)。

BB20(tonA22ΔphoA8 fadL701 relA1 glpR2 glpD3 pit-10 gpsA20spoT1 T2R)(Cronan等，J．Bact.，118：598)。

DH5α(deoR end-A1 gyrA96 hsdR17 recA1 relA1 supE44 thi-1Δ(lacZYA-argFV169)phi80lacZΔM15F)(Woodcock等，(1989)，Nucl.Acids Res.，17：3469)。

FM5大肠杆菌(ATCC 53911)。

甘油的鉴定

通过HPLC和/或GC监测葡萄糖转化为甘油。采用层析领域技术人员可获得的标准技术和材料进行分析。一种合适方法采用使用UV(210nm)和RI检测的Waters Maxima 820 HPLC系统。将样品注射入装备有Shodex SH-1011P前置柱(6mm×50mm)的Shodex SH-1011柱(8mm×300mm；Waters，Milfotd，MA)，温度控制于50℃，采用0.01NH₂SO₄作流速为0.69mL/分钟的流动相。当需要定量分析时，用已知量三甲基乙酸作外标制备样品。通常，1，3-丙二醇(RI检测)、甘油(RI检测)和葡萄糖(RI检测)的保留时间分别是21.39分钟、17.03分钟和12.66分钟。

也通过GC/MS分析甘油。采用DB-WAX柱(30m，0.32mm I.D.，0.25um薄膜厚度，J & W Scientific，Folsom，CA)，用气相层析和质谱分析法检测甘油的分离和定量，按以下条件进行：注射器∶分流注射器，1∶15；样品体积：1uL；温度分布型：初始温度150℃保持30秒，40℃/min至180℃，20℃/min至240℃，保持2.5分钟。检测：EI质谱分析法(Hewlett Packard 5971，San Femando，CA)，定量SIM采用离子61m/z和64m/z作为甘油和甘油-d8的靶离子，以及用离子43m/z作甘油的鉴定离子(qualifier ion)。甘油-d8用作内标。检测甘油-3-磷酸酶即G3P磷酸酶

通过在pH 6.5的bis-Tris或MES和镁缓冲液中温育所述提取物和有机磷酸盐底物，进行酶活性检测。所用底物不是1-α-甘油磷酸，就是d，1-α-甘油磷酸。在该检测中所述试剂的终浓度是：缓冲液(20mM，bis-Tris或50mM MES)；MgCl₂(10Mm)；以及底物(20mM)。如果样品中的总蛋白低并且用酸猝灭不发生可见的沉淀，则方便地在比色杯中检测样品。该方法包括在含有20mM底物(50μl，200mM)、50mMMES、10mM MgCl₂、pH 6.5缓冲液的比色杯中温育酶样品。该最终磷酸酶检测体积为0.5mL。将该含酶样品加入到上述反应混合物中；混合比色杯中的内容物，然后将比色杯置于循环的水浴中，于37℃保持5-120分钟，时间长度取决于酶样品中的磷酸酶活性是否在范围2-0.02U/mL内。通过加入酸性钼酸盐试剂(0.4mL)猝灭该酶反应。在加入Fiske SubbaRaw试剂(0.1mL)和蒸馏水(1.5mL)后，混合上述溶液，并让其显色。10分钟后，让其发生完全显色，采用Cary 219 UV/可见光分光光度计于660nm读样品的吸光度。将释放的有机磷酸盐的量与标准曲线相比，该标准曲线是通过采用无机磷原液(0.65mM)和制备无机磷酸盐终浓度范围为0.026-0.130μmol/mL的6个标准品制作的。分光光度检测法检测甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)活性

使用如下改良Bell等发表方法((1975)，J.Biol.Chem.，250：7153-8)的下列方法。该方法包括温育比色杯中的酶样品，比色杯中含有0.2mMNADH、2.0mM二羟丙酮磷酸(DHAP)和酶的具有5mM DTT的pH 7.5的0.1M Tris/HCl缓冲液，总体积为1.0mL，温度为30℃。设定分光光度计以于340nm固定波长监测吸光度变化。以只含缓冲液的比色杯作为该仪器的空白。在将所述酶加到比色杯中后，进行吸光度读数。加入第一种底物NADH(50uL 4mM NADH；吸光度应增加大约1.25AU)以确定本底速率。应观测该本底速率至少3分钟。然后加入第二种底物DHAP(50uL 40mM DHAP)，监测吸光度随时间的变化至少3分钟以确定总速率。从总速率减去本底速率确定G3PDH活性。13C-NMR检测甘油激酶活性

将适量的通常为无细胞粗提取物的酶加入到反应混合物中，于25℃反应75分钟，所述反应混合物含有40mM ATP、20mM MgSO₄、21mM均一¹³C标记的甘油(99％，Cambridge Isotope Laboratories)和0.1MTris-HCl，pH 9。用¹³C-NMR(125MHz)检测甘油转化为甘油3-磷酸：甘油(63.11ppm，d，J=41Hz和72.66ppm，t，J=41Hz)；甘油3-磷酸(62.93ppm，d，J=41Hz；65.31ppm，br d，J=43Hz；和72.66mmp，dt，J=6，41Hz)。NADH联动甘油脱氢酶检测

在通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后，检测大肠杆菌菌株(gldA)中的NADH联动甘油脱氢酶活性。采用吩嗪硫酸二甲酯(PMS)作中间体，将甘油加NAD⁺转化为二羟丙酮加NADH的转化与溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓转化为深色的甲_的转化偶联起来(Tang等，(1997)J.Bacteriol.140：182)。

采用天然凝胶(8-16％TG，1.5mm，得自Novex，San Diego，CA的15种泳道凝胶)，用标准方法复份进行电泳。通过用50mM Tris或碳酸钾缓冲液pH 9洗涤3次，每次10分钟，从所述凝胶去除残留的甘油。在15mL含有50mM Tris或碳酸钾pH 9、60mg硫酸铵、75mg NAD⁺、1.5mg MTT和0.5mg PMS、含有或不含有甘油(终浓度约0.16M)的检测液中对复份凝胶进行显色。

此外，在聚丙烯酰胺凝胶电泳后，通过与针对纯化的肺炎克雷伯氏茵(K．pneumoniae)甘油脱氢酶(dhaD)的多克隆抗体反应，，检测在大肠杆菌菌株(gldA)中是否存在NADH联动的甘油脱氢酶活性。质粒构建和菌株构建克隆和表达甘油-3-磷酸酶以提高大肠杆菌DH5α和FM5中的甘油生产

由ATCC获得酿酒酵母染色体Vλ克隆6592(GenBank，登记号U18813x11)。通过用于5’端掺入BamHⅠ-RBS-XbaⅠ位点和于3’端掺入SamⅠ位点的合成引物(SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17)，从靶DNAλ克隆进行克隆，从而克隆甘油-3-磷酸磷酸酶(GPP2)基因。将所述产物在SrfⅠ位点亚克隆到pCR-Script(Stratagene，Madison，WI)中，以产生含有GPP2的质粒pAH15。为了从pCR-Script SK+中的lac启动子表达，质粒pAHl5含有无活性取向的GPP2基因。将得自pAH15、含有GPP2基因的BamHⅠ-SmaⅠ片段插入到pBlueScriptⅡ SK+中，以产生质粒pAHl9。为了从所述lac启动子表达，pAHl9含有正确取向的GPP2基因。将得自pAH19、含有GPP2基因的XbaI-PstI片段插入到pPHOX2中，以产生质粒pAH21。pAH21/DH5α是表达质粒。用于在大肠杆菌中超量表达DAR1的质粒

采用合成引物(SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19)，通过由酿酒酵母基因组DNA PCR克隆而分离DAR1。成功的PCR克隆使NcoⅠ位点置于DAR1的5’端，其中在NcoⅠ中的ATG是DAR1起始密码子蛋氨酸。在DAR1的3’端，在翻译终止子之后导入BamHⅠ位点。用NcoⅠ+BamHⅠ消化所述PCR片段，并克隆到表达质粒这pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，NJ)中的相同位点，以产生pDAR1A。

为了在DAR1的5’端产生更好的核塘体结合位点，将通过退火合成引物(SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21)获得的SpeⅠ-RBS-NcoⅠ接头插入到pDAR1A的NcoⅠ位点，以产生pAH40。为了从pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，NJ)的trc启动子表达，质粒pAH40含有正确取向的新的RBS和DAR1基因。将得自pDAR1A的NcoⅠ-BamHⅠ片段和通过退火合成引物(SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23)获得的第二组SpeⅠ-RBS-NcoⅠ接头插入到pBC-SK+(Stratagene，Madison，WI)的SpeⅠ-BamHⅠ位点，以产生质粒pAH42。质粒pAH42含有氯霉素抗性基因。构建用于DAR1和GPP2的表达盒

采用标准分子生物学方法，由上述各个DAR1和GPP2亚克隆装配用于DAR1和GPP2的表达盒。将得自pAH19、含有核糖体结合位点(RBS)和GPP2基因的BamHⅠ-PstⅠ片段插入到pAH40中，以产生pAH43。将得自pAH19、含有RBS和GPP2基因的BamHⅠ-PstⅠ片段插入至pAH42中，以产生pAH45。

对GPP2的5’端的核糖体结合位点进行如下修饰。通过将合成引物GATCCAGGAAACAGA(SEQ ID NO：24)和CTAGTCTGTTTCCTG(SEQ ID NO：25)退火到得自pAH19、含GGP2基因的XbaⅠ-PstⅠ片段而获得的BamHⅠ-RBS-SpeⅠ接头插入到pAH40的BamHⅠ-PstⅠ位点，以产生pAH48。质粒pAH48为了从pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，NJ)的trc启动子表达而正确取向的含有DAR1基因、修饰的RBS、和GPP2基因。转化大肠杆菌

采用标准分子生物学技术将本文所述的所有质粒转化到大肠杆菌DH5α或FM5中。通过其DNA RFLP图型验证转化体。

实施例1

由用G3PDH基因转化的大肠杆菌生产甘油培养基

采用用pDAR1A转化的大肠杆菌细胞，用合成培养基无氧或有氧生产甘油。该培养基每升含有：6.0g Na₂HPO₄、3.0g KH₂PO₄、1.0gNH₄Cl、0.5g NaCl、1mL 20％MgSO₄·7H₂O、8.0g葡萄糖、40mg水解酪蛋白氨基酸、0.5ml 1％盐酸硫胺素、100mg氨苄青霉素。生长条件

带有pDAR1A或pTrc99A载体的菌株AA200生长于有氧条件下的50mL培养基中，于37℃在250mL培养瓶中以250rpm震荡培养。在A₆₀₀为0.2-0.3时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷使其终浓度为1mM，并继续培养48小时。对于无氧生长，用诱导细胞样品填装带盖的Falcon#2054管，并于37℃旋转轻轻混合48小时。通过HPLC分析培养物上清液确定甘油产量。菌株pDAR1A/AA200在无氧条件下培养48小时后产生甘油0.38g/L，在有氧条件下产生甘油0.48g/L。

实施例2

由用G3P磷酸酶基因(GPP2)转化的大肠杆菌生产甘油培养基

在摇瓶中采用合成phoA培养基以证实在大肠杆菌中因GPP2表达使甘油增加。每升phoA培养基含有：Amisoy 12g；硫酸铵0.62g；MOPS10.5g；柠檬酸钠1.2g；NaOH(1M)10mL；1M MgSO₄ 12mL；100X微量元素12mL；50％葡萄糖，10mL；1％硫胺素，10mL；100mg/mL L-脯氨酸，10mL；2.5mM FeCl₃，5mL；混合磷酸缓冲液，2mL(5mL 0.2MNaH₂PO₄+9mL 0.2M KH₂PO₄)，pH 7.0。对于每升pho培养基，上述100X微量元素含有：ZnSO₄·7H₂O，0.58g；MnSO₄·H₂O，0.34g；CuSO₄·5H₂O，0．49g；CoCl₂·6H₂O，0．47g；H₃BO₃，0.12g；NaMoO₄·2H₂O，0.48g。摇瓶实验

菌株pAH21/DH5α(含有GPP2基因)和pPHOX2/DH5α(对照)于37℃在250mL摇瓶中的45mL培养基(phoA培养基，50ug/mL羧苄青霉素和1ug/mL维生素B₁₂)中生长。所述培养物在有氧条件(250rpm震摇)下生长24小时。通过HPLC分析培养物上清液确定甘油产量。24小时后pAH21/DH5α的甘油产量为0.2g/L。

实施例3

采用含GPP2和DAR1的重组大肠杆菌由D-葡萄糖生产甘油

于37℃在摇瓶培养物(锥形瓶，液体体积是总体积的1/5)中进行有氧生长，以证实含pAH43的大肠杆菌DH5α产生的甘油增加。

通过用抗生素选择的过夜LB/1％葡萄糖培养物接种，在基本培养基/1％葡萄糖摇瓶中开始培养。基本培养基是：过滤除菌的已知成分培养基，终pH为6.8(HCl)，每升含有：12.6g(NH₄)₂SO₄、13.7gK₂HPO₄、0.2g酵母提取物(Difco)、1g NaHCO₃、5mg维生素B₁₂、5mL改良Balch微量元素液(其组成可以发现于一般和分子细菌学方法(P.Gerhardt等编辑，第158页，美国微生物协会，Washington，DC(1994))。摇瓶于37℃剧烈震摇过夜培养，之后取样用于上清液的GC分析。24小时后pAH43/DH5α显示的甘油产量为3.8g/L。

实施例4

采用含GPP2和DAR1的重组大肠杆菌由D-葡萄糖生产甘油

实施例4说明由含GPP2和DAR1的重组大肠杆菌DH5α/pAH48生产葡萄糖。

按上述一般方法中所述，构建菌株DH5α/pAH48。预培养

为了接种到发酵运行(fermentation run)中，进行DH5α/pAH48预培养。预培养的组分和方案列表如下。

预培养培养基KH₂PO₄ 30.0g/L柠檬酸 2.0g/LMgSO₄·7H₂O 2.0g/L98％H₂SO₄ 2.0mL/L柠檬酸铁铵 0.3g/LCaCl₂·2H₂O 0.2g/L酵母提取物 5.0g/L微量金属 5.0mL/L葡萄糖 10.0g/L羧苄青霉素 100.0mg/L

将上述培养基组分一起混合，并用NH₄OH将其pH调节到6.8。之后将培养基过滤除菌。

按照以下配方使用微量金属：柠檬酸一水合物 4.0g／LMgSO₄·7H₂O 3.0g／LMnSO₄·H₂O 0.5g／LNaCl 1.0g／LFeSO₄·7H₂O 0.1g／LCoCl₂·6H₂O 0.1g／LCaCl₂ 0.1g/LZnSO₄·7H₂O 0.1g/LCuSO₄·5H₂O 10mg/LAlK(SO₄)₂·12H₂O 10mg/LH₃BO₃ 10mg/LNa₂MoO₄·2H₂O 10mg/LNiSO₄·6H₂O 10mg/LNa₂SeO₃ 10mg/LNa₂WO₄·2H₂O 10mg/L

培养物开始自从50μl冻藏原液(15％甘油用作冷冻保护剂)接种到2L锥形瓶中的600mL培养基的种子培养物。培养物于30℃在250rpm的摇床中生长大约12小时，然后用来接种发酵罐。发酵生长容器

15L搅拌釜发酵罐培养基KH₂PO₄ 6.8g/L柠檬酸 2.0g/LMgSO₄·7H₂O 2.0g/L98％H₂SO₄ 2.0mL/L柠檬酸铁铵 0.3g/LCaCl₂·2H₂O 0.2g/L

Mazu DF204消泡剂 1.0mL/L

上述组分在发酵罐容器中一并灭菌。用NH₄OH将其pH调升到6.7。酵母提取物(5g/L)和微量金属液(5mL/L)由过滤除菌的原液无菌性加入。由60％进料加入葡萄糖使其终浓度为10g/L。以100mg/L加入羧苄青霉素。接种后体积为6L。发酵的环境条件

所述温度控制在36℃，空气流率控制在每分钟6标准升。托持压力控制在0.5巴。搅拌器设定为350rpm。氨水用来控制pH于6.7。控制葡萄糖进料(60％葡萄糖一水合物)速率以保持过量葡萄糖。结果

发酵运行的结果见表1。

表1EFT OD550 [葡萄糖] [甘油] 进料的总产生的总(hr) (AU) (g/L) (g/L) 葡萄糖(g) 甘油量(g)0 0.8 9.3 256 4.7 4.0 2.0 49 148 5.4 0 3.6 71 2510 6.7 0.0 4.7 116 3312 7.4 2.1 7.0 157 4914.2 10.4 0.3 10.0 230 7016.2 18.1 9.7 15.5 259 10618.2 12.4 14.5 30520.2 11.8 17.4 17.7 353 11922.2 11.0 12.6 38224.2 10.8 6.5 26.6 404 17826.2 10.9 6.8 44228.2 10.4 10.3 31.5 463 21630.2 10.2 13.1 30.4 493 21332.2 10.1 8.1 28.2 512 19634.2 10.2 3.5 33.4 530 22336.2 10.1 5.8 54838.2 9.8 5.1 36.1 512 233

实施例5

工程改造大肠杆菌FM5的甘油激酶突变体以由葡萄糖生产甘油构建用于大肠杆菌FM5中的甘油激酶基因置换的整合质粒

用Puregene DNA分离试剂盒(Gentra Sytems，Minneapolis，MN)制备大肠杆菌FM5基因组DNA。采用引物SEQ ID NO：26和SEQ INNO：27，通过PCR(Mullis和Faloona，Meethods Enzymol.，155：335-350，1987)从FM5基因组DNA扩增含部分glpF和甘油激酶(glpK)基因的1.0kb DNA片段。采用引物SEQ ID NO：28和SEQ IN NO：29，通过PCR从FM5基因组DNA扩增含部分glpK和glpX基因的1.1 kb DNA片段。将MunⅠ位点加入引物SEQ ID NO：28中。引物SEQ ID NO：28的5’端是引物SEQ ID NO：27的反向互补物，以便能够进行随后的重叠延伸PCR。采用重叠延伸技术的基因剪接(Horton等，BioTechniques，8：528-535，1990)用来采用上述两种PCR片段作模板和采用引物SEQ IDNO：26和SEQ ID NO：29，通过PCR产生2.1kb片段。该片段在1.5kbglpK基因的中心区缺失0.8kb。总而言之，该片段在MunⅠ克隆位点(在部分glpK中)的两侧具有1.0 kb和1.1 kb侧翼区，从而使得可以通过同源重组进行染色体基因置换。

将上述2.1 kb PCR片段平端化(采用菜豆核酸酶)，并采用0平端PCR克隆试剂盒(Zero Blunt PCR Cloning Kit)(Invitrogen，San Diego，CA)克隆入pCR-Blunt载体，产生含有卡那霉素和Zeocin抗性基因的5.6kb质粒pRN100。得自pLoxCatl(结果未公开)、含有氯霉素抗性基因、侧翼为噬菌体P1 loxP位点(Snaith等，Gene，166：173-174，1995)的1.2kbHincⅡ片段用来通过将其连接至MunⅠ消化的(并平端化)质粒pRN100，从而间断质粒pRN100中的glpK片段，产生6.9kb质粒pRN101-1。采用引物SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31通过PCR从载体pGP704(Miller和Mekalanos，J.Bacteriol.，170：2575-2583，1988)扩增含有R6K起点的376 bp片段，将其平端化并连接至得自pRN101-1的5.3kb Asp718-AatⅡ片段(它是平端的)，产生含有卡那霉素和氯霉素抗性基因的5.7kb质粒pRN102-1。用R6K起点置换pRN101-1中的Co1E1起点区，产生也包括缺失大部分Zeocin抗性基因的pRN102-1。用于pRN102-1复制的宿主为含有R6K起点功能必需的pir基因的大肠杆菌SY327(Miller和Mekalanos，J.Bacteriol.，170：2575-2583，1988)。

工程改造具有氯霉素抗性基因间断的甘油激酶突变体RJF10m

大肠杆菌FM5用非复制型整合质粒pRN102-1电转化，并进一步在含有1mM甘油的M9基本培养基上筛选不利用甘油的氯霉素抗性(12.5μg/mL)和卡那霉素敏感性(30μg/mL)的转化体。这种突变体RJF10m的EcoRⅠ消化物当用完整的glpK基因通过Southern分析(Southern，J．Mol.Biol.，98：503-517，1975)探测时，表明它是双交换整合体(glpK基因置换体)，因为观察到由于在氯霉素抗性基因中存在另一EcoRⅠ位点而预期的7.9kb和2.0kb两个带。野生型对照产生预期的单个9.4 bk带。¹³C NMR分析突变体RJF10m证实，它不能将¹³C标记的甘油和ATP转化为甘油-3-磷酸。采用引物组合SEQ ID NO：32和SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35以及SEQ ID NO：32和SEQ IDNO：35，通过基因组PCR进一步分析该glpK突变体，该突变体分别产生预期的2.3kb、2.4kb和4.0kb PCR片段。所述野生型对照用引物SEQID NO：32和SEQ ID NO：35产生预期的3.5 bk带。glpK突变体RJF10m用质粒pAH48电转化，使得可以由葡萄糖产生甘油。glpK突变体大肠杆菌RJF10m已经根据布达佩斯条约在1997年11月24日保藏于ATCC。工程改造除去氯霉素抗性基因间断的甘油激酶突变体RJF10

在YENB培养基(0.75％酵母提取物、0.8％营养肉汤)于37℃过夜生长后，大肠杆菌RJF10m的水悬浮物用质粒pJW168(结果未公开)电转化，所述质粒含有IPTG诱导型lacUV5启动子控制下的噬菌体P1 Cre重组酶基因、温度敏感型pSC101复制子和氨苄青霉素抗性基因。在转化体于30℃在SOC培养基上长出生长晕(outgrowth)时，于30℃(pWJ168复制许可温度)在补充羧苄青霉素(50μg/mL)和IPTG(1mM)的LB琼脂培养基上选择转化体。于30℃在补充羧苄青霉素和IPTG的新鲜LB琼脂培养基上进行合并菌落的连续两次过夜转移，以便使得可以通过在Cre重组酶介导的loxP位点上的重组，切除染色体氯霉素抗性基因(Hoess和Abremski，J.Mol.Biol.，181：351-362，1985)。所产生的菌落平板影印接种到补充羧苄青霉素和IPTG的LB琼脂培养基和补充氯霉素(12.5μg/mL)的LB琼脂上，以鉴定表示标记基因去除的羧苄青霉素抗性和氯霉素敏感性的菌落。用一个这样菌落的30℃过夜培养物接种10mL LB培养基。在于30℃生长到OD(600nm)为0.6时，将该培养物于37℃培养过夜。将数个稀释物平板接种到预温热的LB琼脂培养基上，该平板于42℃(pWJ168复制的非许可温度)培养过夜。将所产生的菌落平板影印接种到补充羧苄青霉素(75μg/mL)的LB琼脂培养基和LB琼脂培养基上，以鉴定表示质粒pWJ168缺失的羧苄青霉素敏感性菌落。采用引物SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：35通过基因组PCR进一步分析一种这样的glpK突变体RJP10，产生证实标记基因切除的预期的3.0kb条带。突变体RJF10在含1mM甘油的M9基本培养基上不生长证实它不利用甘油。用质粒pAH48电转化glpK突变体RJF10，以使得可以由葡萄糖产生甘油。

实施例6

构建gldA基因失效的大肠杆菌菌株

采用分别掺入到末端Sph1和Xba1位点的引物SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37通过PCR(K.B.Mullis和F.A．Faloona(1987)Meth.Enzymol.155：335-350)从大肠杆菌分离gldA基因，并在pUC18中的Sph1和Xba1位点之间克隆(T.Maniatis 1982 Molecular Cloning.ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor，Cold Spring Harbor，NY)产生pKP8。在gldA基因中的唯一的Sal1和Nco1位点切割pKP8，其末端用Klenow使其平端化并重新连接，使得在gldA的中间产生109 bp的缺失并重新产生唯一的Sal1位点，从而产生pKP9。含有赋予卡那霉素抗性的基因(kan)并包括翻译起始密码子上游的约400 bp DNA和翻译终止密码子下游的约100 bp DNA的1.4kb DNA片段，用掺入末端Sal1位点的引物SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39通过PCR从pET-28a(+)(Novagen，Madison，Wis)分离，并亚克隆入pKP9的独特的Sal1位点产生pKP13。开始于gldA翻译起始密码子下游204 bp并终止于gldA翻译终止密码子上游178 bp并含有kan插入的2.1kbDNA片段，采用分别掺入末端Sph1和Xba1位点的引物SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41通过PCR从pKP13分离，并亚克隆入在pMAK705(Genencor International，Palo Alto，Calif.)中的Sph1和Xba1位点之间产生pMP33。用pMP33转化大肠杆菌FM5，并在20μg/mL kan上于30℃(pMAK705复制的允许温度)进行选择。将一个茵落在补充20μg/mL kan的液体培养基中于30℃扩增过夜。约32，00O细胞平板接种于20μg/mL kan上，并于44℃(pMAK705复制的限制性温度)培养16小时。生长于44℃的转化体具有整合入染色体的质粒，其发生频率约O.0001。PCR和DNA印迹(E.M.Southern 1975 J.Mol.Biol.98：503-517)分析用来检测在所述转化体中染色体整合事件的性质。蛋白质印迹分析(H.Towbin等，(1979)Proc.Natl.Acad．Sci.76：4350)用来检测gldA的产物甘油脱氢酶蛋白是否在转化体中产生。活性分析用来确定在所述转化体中是否保留甘油脱氢酶活性。用吩嗪硫酸二甲酯作中间体，将甘油+NAD(+)→二羟丙酮+NADH的转化与四唑鎓染料MTT[溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓]至深色的甲_的转化偶联起来，从而检测在天然凝胶上的甘油脱氢酶带的活性。甘油脱氢酶活性也需要存在30mM硫酸铵和100mM Tris，pH 9(C.-T.Tang等，(1997)J.Bacteriol.140：182)。在所分析的8种转化体中，其中6种确定是gldA失效的。大肠杆菌MSP33.6已经于1997年11月24日根据布达佩斯条约保藏于ATCC。

实施例7

构建glpK和gldA基因失效的大肠杆菌茵株

采用分别掺入末端Sph1和Xba1位点的引物SEQ ID NO：42和SEQID NO：43，通过PCR从大肠杆菌分离包含gldA基因并包括翻译起始密码子上游的约228 bp DNA和翻译终止密码子下游的220 bp DNA的1.6kb DNA片段，并在pUCl8中的Sph1和Xba1位点之间克隆产生pQN2。在gldA基因中的唯一的Sal1和Nco1位点切割pQN2，其末端用Klenow使其平端化并重新连接，使得在gldA的中间产生109bp的缺失并重新产生唯一的Sal1位点，从而产生pQN4。从作为Stu1/Xho1片段的pLoxKan2(Genencor International，Palo Alto，Calif.)分离含有赋予卡那霉素抗性的基因(kna)、侧翼为loxP位点的1.2kb DNA片段，用Klenow平端化并在用Klenow平端化末端后在Sal1位点亚克隆入pQN4产生pQN8。采用分别掺入末端Sph1和Xba1位点的引物SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45，通过PCR从pGP704(Miller和Mekalanos，JBacteriol.，170：2575-2583，1988)分离含有R6K复制起点的0.4kb DNA片段，并连接至得自pQN8含有gldA：：kan盒的2.8kb Sph1/Xba1 DNA片段产生pKP22。含有赋予氯霉素抗性的基因(cam)、侧翼为loxP位点的1.0kbDNA片段，从作为Xba1片段的pLoxCat2(Genencor International，PaloAlto，Calif.)分离，并在Xba1位点亚克隆入pKP22产生pKP23。)))用pKP23转化为glpK-的大肠杆菌菌株RJF10(参见实施例5)，并分离具有表型kanRcamS的转化体，通过DNA印迹分析证实表明它是双交换整合的转化体。甘油脱氢酶凝胶活性分析(如实施例6中所述)表明活性甘油脱氢酶不存在于这些转化体中。如实施例5所述，采用产生Cre的质粒pJW168从染色体去除kan标记以产生菌株KLP23。数个具有表型kanS的分离物表明无甘油脱氢酶活性，而且DNA印迹分析证实缺乏kan标记。SEQ ID NO：44CACGCATGCAGTTCAACCTGTTGATAGTACSEQ OD NO：45GCGTCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATG

实施例8含有GPP2和DAR1、具有和不具有甘油激酶(GLPK)活性的重组体大

肠杆菌由D-葡萄糖产生的甘油的消耗

实施例8阐明重组体大肠杆菌FM5/pAH48和RJF10/pAH48的甘油消耗。菌株FM5/pAH48和RJF10/pAH48按上述通用方法中所述构建。

预培养将FM5/AH48和RJF10/pAH48预培养以接种发酵罐的用于发酵的相同培养基或补充1％葡萄糖的LB。使用羧苄青霉素或氨苄青霉素(100mg/L)以用于质粒维持。发酵培养基如实施例4所述。

培养物开始于2L锥形瓶中的600mL培养基中的冻藏原液(15％甘油用作冷冻保护剂)，于30℃在250rpm的摇床中生长大约12小时，然后用来接种发酵罐。发酵生长

按实施例4中所述制备装有5-7L初始体积物的15L搅拌釜发酵罐。使用羧苄青霉素或氨苄青霉素(100mg/L)以用于质粒维持。评价甘油激酶(GlpK)活性的环境条件

温度控制于36℃，空气流率控制在每分钟6标准升。托持压力控制在0.5巴。溶解氧张力通过搅拌控制于10％。氨水用来控制pH于6.7。控制葡萄糖进料(60％葡萄糖)速率以保持过量葡萄糖直到甘油累积至至少25g/L为止。然后耗竭葡萄糖使得产生甘油净代谢。表2显示甘油的转化结果。

表2

FM5/pAH48(wt)和RJF10/pAH48(glpK)的甘油转化

甘油消耗率

菌株实例数 g/OD/hr

FM5/pAH48 2 0.095±0.015

RJF10/pAH48 3 0.021±0.011

根据表2数据可看出，在内源性甘油激酶活性消除后甘油消耗率下降约4-5倍。评价甘油脱氢酶(GldA)活性的环境条件

温度控制于30℃而空气流率控制在每分钟6标准升。托持压力控制在0.5巴。溶解氧张力通过搅拌控制于10％。氨水用来控制pH于6.7。在第一次发酵中，发酵期间保持葡萄糖过量。操作第二次发酵使其在初始24小时后无葡萄糖残留。在两次发酵期间随时间采集样品用于评价GlpK和GldA活性分析。表3概述了RJF10/pAH48发酵，表明GldA对甘油选择性的影响。

表3

两次RJF10/pAH48发酵的GldA和GlpK活性

时间总体选择性发酵 (hrs) GldA GlpK (g/g)1 25 - - 42％46 - - 49％61 + - 54％2 25 + - 41％46 ++ - 14％61 ++ - 12％

根据表3数据可看见，甘油脱氢酶(GldA)活性的存在与甘油在限制葡萄糖的条件下的转化有关；因此，推测消除甘油脱氢酶活性将减少甘油转化。

实施例9

采用含有GPP2和DAR1的重组蟑螂埃希氏菌由D-葡萄糖生产甘油

实施例9阐述由含有GPP2和DAR1基因的重组蟑螂埃希氏菌从D-葡萄糖生产甘油。

得自ATCC而ATCC保藏号为33429的蟑螂埃希氏菌(E.blattae)于30℃生长直至培养物在600nm的OD约0.6 AU为止。然后采用电穿孔技术，用含有GPP2和DAR1基因(描述于WO 98/21341)的质粒pAH48转化所述培养物。用DNA RFLP分布型和抗生素抗性(200μg/mL羧苄青霉素)证实转化体。

转化的蟑螂埃希氏菌于35℃在摇瓶培养物中有氧生长。该培养物在加2％葡萄糖的已知成分培养基中在抗生素选择下生长，通过由在加1％葡萄糖的LB上生长过夜的培养物接种开始，同时进行抗生素选择。每升所述已知成分培养基含有：27.2g KH₂PO₄、2g柠檬酸、2gMgSO₄·7H₂O、1.2ml 98％H₂SO₄、0.3g柠檬酸铁铵、0.2gCaCl₂·2H₂O、10g酵母提取物(Difco)、5mL改良的Balch微量元素溶液(其组分可见于一般以及分子细菌学方法(P.Gerhardt等编辑，第158页，美国微生物学协会，华盛顿，(1994))。该已知成分培养基过滤除菌并用NH₄OH调节至终pH6.8。所述摇瓶在充分振摇下于35℃培养过夜，然后将上清液经HPLC分析甘油的存在。过夜培养后，含有pAH48的蟑螂埃希氏菌产生甘油7.63g/L。生长于相同条件下的野生型蟑螂埃希氏菌(ATCC 33429)对照产生甘油=0.2g/L。

实施例10用gldA和glpK缺陷而含有整合入染色体的GPP2和DAR1的重组大肠杆

菌由D-葡萄糖产生甘油

该实施例说明gldA和glpK基因失效且含有整合入宿主细胞染色体的GPP2和DAR1编码基因的重组大肠杆菌由D葡萄糖生产甘油。

按实施例7制备的大肠杆菌菌株KLP23缺乏甘油激酶(glpK产物)和甘油脱氢酶(gldA产物)活性。制备含有侧翼为在ampC位点整合入染色体的氯霉素抗性基因的DAR1、GPP2和loxP的KLP23并称为AH76RIcm。

在cre-lox整合系统(Hoess，同上)的基础上设计和构建整合质粒。为了产生所述整合质粒，将pLoxCatl的Hind Ⅲ-SmaⅠ片段插入HindⅢ和SmaⅠ线性化的pAH48产生，pAH48cm2。pAH48质粒含有在trc启动子控制下表达的DAR1和GPP2基因。pAH48cm2的3.5kb ApaLⅠ片段用T4 DNA聚合酶(Boehringer Mannheim Biochemical)和dNTP平端化，并采用大肠杆菌SY327(Miller等，J.Bacteriol.170：2575-2583，1998)作为宿主，将其插入NruⅠ线性化的pInt-ampC(GenencorInternational，CA)产生pAH76和pAH76R。“R”是指反向的整合盒。质粒pAH76和pAH76R均含有R6K复制起点且不能在KLP24中复制。质粒pAH76和pAH76R用来转化KLP23，以在大肠杆菌染色体的ampC部位整合。所述转化体在10μg/ml氯霉素上进行选择并是卡那霉素敏感性的，因此产生双交换的整合。这些大肠杆菌转化体命名为AH76cm和AH76IRIcm。

AH76RIcm培养物始自由具有1％葡萄糖和抗生素选择的过夜LB培养物接种，生长于已知成分培养基(描述于实施例9)加2.5％葡萄糖的摇瓶中。所述摇瓶(锥形瓶，液体体积为摇瓶体积的1/5)充分振摇下于37℃培养过夜，之后取样上清液样品用于在Monarch 2000仪器(Instrumentation Laboratory Co.，Lexington，MA)上采用比色酶分析法(Sigma，第337号方法)分析甘油。25小时后，AH77RIcm显示甘油产量为6.7g/L。

大肠杆菌pAH76RI具有AH76RIcm缺失的氯霉素基因。按实施例5所述，采用产Cre的质粒pJW168使氯霉素基因从染色体缺失。于30℃在1mM IPTG诱导下选择羧苄青霉素抗性而氯霉素敏感型的转化体。在去除所述氯霉素基因后，AH76RI生长于不含任何抗生素的LB培养基上以消除PJW168。最后形式的AH76RI不能于氯霉素或羧苄青霉素选择下生长。

AH76RI培养物始自由LB/1％葡萄糖过夜培养物接种，生长于已知成分培养基加2％葡萄糖的摇瓶中。所述摇瓶充分振摇下于35℃培养过夜，之后取上清液样品用于在Monarch 2000仪器(InstrumentationLaboratory Co.，Lexington，MA)上采用比色酶分析法(Sigma，第337号方法)分析甘油。24小时后，AH77RI显示甘油产量为4.6g/L。

该实施例中描述的所有质粒均用标准分子生物学技术转化入大肠杆菌KLP23。所述转化体通过DNA RFLP型、抗生素抗性、PCR扩增或G3P磷酸酶分析证实。

序列表(1)一般资料：

(ⅰ)申请人：

(A)姓名：E.I.DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY

(B)街道：1007 MARKET STREET

(C)城市：WILMINGTON

(D)州：DELAWARE

(E)国家：美国

(F)邮政编码：19898

(G)电话：302-892-8112

(H)传真：302-773-0164

(I)用户电报：6717325

(ⅱ)发明名称：用重组生物体生产甘油的方法

(ⅲ)序列数：43

(ⅳ)计算机可读形式：

(A)媒体类型：软盘，3.5英寸

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：MICROSOFT WINDOWS 95

(D)软件：MICROSOFT WORD VERSION 7.0A

(ⅴ)当前申请数据：

(A)申请号：

(B)申请日：

(C)分类：

(ⅵ)在先申请数据：

(A)申请号：08/982，783

(B)申请日：1997年12月2日

(C)分类：

(ⅶ)代理律师/代理人资料：

(A)姓名：FLORD，LINDA AXAMETHY

(B)注册号：33，692

(C)参考/档案号：CR-9981-C(2)SEQ ID NO：1的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1380个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：1：CTTTAATTTT CTTTTATCTT ACTCTCCTAC ATAAGACATC AAGAAACAAT TGTATATTGT 60ACACCCCCCC CCTCCACAAA CACAAATATT GATAATATAA AGATGTCTGC TGCTGCTGAT 120AGATTAAACT TAACTTCCGG CCACTTGAAT GCTGGTAGAA AGAGAAGTTC CTCTTCTGTT 180TCTTTGAAGG CTGCCGAAAA GCCTTTCAAG GTTACTGTGA TTGGATCTGG TAACTGGGGT 240ACTACTATTG CCAAGGTGGT TGCCGAAAAT TGTAAGGGAT ACCCAGAAGT TTTCGCTCCA 300ATAGTACAAA TGTGGGTGTT CGAAGAAGAG ATCAATGGTG AAAAATTGAC TGAAATCATA 360AATACTAGAC ATCAAAACGT GAAATACTTG CCTGGCATCA CTCTACCCGA CAATTTGGTT 420GCTAATCCAG ACTTGATTGA TTCAGTCAAG GATGTCGACA TCATCGTTTT CAACATTCCA 480CATCAATTTT TGCCCCGTAT CTGTAGCCAA TTGAAAGGTC ATGTTGATTC ACACGTCAGA 540GCTATCTCCT GTCTAAAGGG TTTTGAAGTT GGTGCTAAAG GTGTCCAATT GCTATCCTCT 600TACATCACTG AGGAACTAGG TATTCAATGT GGTGCTCTAT CTGGTGCTAA CATTGCCACC 660GAAGTCGCTC AAGAACACTG GTCTGAAACA ACAGTTGCTT ACCACATTCC AAAGGATTTC 720AGAGGCGAGG GCAAGGACGT CGACCATAAG GTTCTAAAGG CCTTGTTCCA CAGACCTTAC 780TTCCACGTTA GTGTCATCGA AGATGTTGCT GGTATCTCCA TCTGTGGTGC TTTGAAGAAC 840GTTGTTGCCT TAGGTTGTGG TTTCGTCGAA GGTCTAGGCT GGGGTAACAA CGCTTCTGCT 900GCCATCCAAA GAGTCGGTTT GGGTGAGATC ATCAGATTCG GTCAAATGTT TTTCCCAGAA 960TCTAGAGAAG AAACATACTA CCAAGAGTCT GCTGGTGTTG CTGATTTGAT CACCACCTGC 1020GCTGGTGGTA GAAACGTCAA GGTTGCTAGG CTAATGGCTA CTTCTGGTAA GGACGCCTGG 1080GAATGTGAAA AGGAGTTGTT GAATGGCCAA TCCGCTCAAG GTTTAATTAC CTGCAAAGAA 1140GTTCACGAAT GGTTGGAAAC ATGTGGCTCT GTCGAAGACT TCCCATTATT TGAAGCCGTA 1200TACCAAATCG TTTACAACAA CTACCCAATG AAGAACCTGC CGGACATGAT TGAAGAATTA 1260GATCTACATG AAGATTAGAT TTATTGGAGA AAGATAACAT ATCATACTTC CCCCACTTTT 1320TTCGAGGCTC TTCTATATCA TATTCATAAA TTAGCATTAT GTCATTTCTC ATAACTACTT 1380(2)SEQ ID NO：2的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：2946个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID N0：2：GAATTCGAGC CTGAAGTGCT GATTACCTTC AGGTAGACTT CATCTTGACC CATCAACCCC 60AGCGTCAATC CTGCAAATAC ACCACCCAGC AGCACTAGGA TGATAGAGAT AATATAGTAC 120GTGGTAACGC TTGCCTCATC ACCTACGCTA TGGCCGGAAT CGGCAACATC CCTAGAATTG 180AGTACGTGTG ATCCGGATAA CAACGGCAGT GAATATATCT TCGGTATCGT AAAGATGTGA 240TATAAGATGA TGTATACCCA ATGAGGAGCG CCTGATCGTG ACCTAGACCT TAGTGGCAAA 300AACGACATAT CTATTATAGT GGGGAGAGTT TCGTGCAAAT AACAGACGCA GCAGCAAGTA 360ACTGTGACGA TATCAACTCT TTTTTTATTA TGTAATAAGC AAACAAGCAC GAATGGGGAA 420AGCCTATGTG CAATCACCAA GGTCGTCCCT TTTTTCCCAT TTGCTAATTT AGAATTTAAA 480GAAACCAAAA GAATGAAGAA AGAAAACAAA TACTAGCCCT AACCCTGACT TCGTTTCTAT 540GATAATACCC TGCTTTAATG AACGGTATGC CCTAGGGTAT ATCTCACTCT GTACGTTACA 600AACTCCGGTT ATTTTATCGG AACATCCGAG CACCCGCGCC TTCCTCAACC CAGGCACCGC 660CCCAGGTAAC CGTGCGCGAT GAGCTAATCC TGAGCCATCA CCCACCCCAC CCGTTGATGA 720CAGCAATTCG GGAGGGCGAA AATAAAACTG GAGCAAGGAA TTACCATCAC CGTCACCATC 780ACCATCATAT CGCCTTAGCC TCTAGCCATA GCCATCATGC AAGCGTGTAT CTTCTAAGAT 840TCAGTCATCA TCATTACCGA GTTTGTTTTC CTTCACATGA TGAAGAAGGT TTGAGTATGC 900TCGAAACAAT AAGACGACGA TGGCTCTGCC ATTGGTTATA TTACGCTTTT GCGGCGAGGT 960GCCGATGGGT TGCTGAGGGG AAGAGTGTTT AGCTTACGGA CCTATTGCCA TTGTTATTCC 1020GATTAATCTA TTGTTCAGCA GCTCTTCTCT ACCCTGTCAT TCTAGTATTT TTTTTTTTTT 1080TTTTTGGTTT TACTTTTTTT TCTTCTTGCC TTTTTTTCTT GTTACTTTTT TTCTAGTTTT 1140TTTTCCTTCC ACTAAGCTTT TTCCTTGATT TATCCTTGGG TTCTTCTTTC TACTCCTTTA 1200GATTTTTTTT TTATATATTA ATTTTTAAGT TTATGTATTT TGGTAGATTC AATTCTCTTT 1260CCCTTTCCTT TTCCTTCGCT CCCCTTCCTT ATCAATGCTT GCTGTCAGAA GATTAACAAG 1320ATACACATTC CTTAAGCGAA CGCATCCGGT GTTATATACT CGTCGTGCAT ATAAAATTTT 1380GCCTTCAAGA TCTACTTTCC TAAGAAGATC ATTATTACAA ACACAACTGC ACTCAAAGAT 1440GACTGCTCAT ACTAATATCA AACAGCACAA ACACTGTCAT GAGGACCATC CTATCAGAAG 1500ATCGGACTCT GCCGTGTCAA TTGTACATTT GAAACGTGCG CCCTTCAAGG TTACAGTGAT 1560TGGTTCTGGT AACTGGGGGA CCACCATCGC CAAAGTCATT GCGGAAAACA CAGAATTGCA 1620TTCCCATATC TTCGAGCCAG AGGTGACAAT GTGGGTTTTT GATGAAAAGA TCGGCGACGA 1680AAATCTGACG GATATCATAA ATACAAGACA CCAGAACGTT AAATATCTAC CCAATATTGA 1740CCTGCCCCAT AATCTAGTGG CCGATCCTGA TCTTTTACAC TCCATCAAGG GTGCTGACAT 1800CCTTGTTTTC AACATCCCTC ATCAATTTTT ACCAAACATA GTCAAACAAT TGCAAGGCCA 1860CGTGGCCCCT CATGTAAGGG CCATCTCGTG TCTAAAAGGG TTCGAGTTGG GCTCCAAGGG 1920TGTGCAATTG CTATCCTCCT ATGTTACTGA TGAGTTAGGA ATCCAATGTG GCGCACTATC 1980TGGTGCAAAC TTGGCACCGG AAGTGGCCAA GGAGCATTGG TCCGAAACCA CCGTGGCTTA 2040CCAACTACCA AAGGATTATC AAGGTGATGG CAAGGATGTA GATCATAAGA TTTTGAAATT 2100GCTGTTCCAC AGACCTTACT TCCACGTCAA TGTCATCGAT GATGTTGCTG GTATATCCAT 2160TGCCGGTGCC TTGAAGAACG TCGTGGCACT TGCATGTGGT TTCGTAGAAG GTATGGGATG 2220GGGTAACAAT GCCTCCGCAG CCATTCAAAG GCTGGGTTTA GGTGAAATTA TCAAGTTCGG 2280TAGAATGTTT TTCCCAGAAT CCAAAGTCGA GACCTACTAT CAAGAATCCG CTGGTGTTGC 2340AGATCTGATC ACCACCTGCT CAGGCGGTAG AAACGTCAAG GTTGCCACAT ACATGGCCAA 2400GACCGGTAAG TCAGCCTTGG AAGCAGAAAA GGAATTGCTT AACGGTCAAT CCGCCCAAGG 2460GATAATCACA TGCAGAGAAG TTCACGAGTG GCTACAAACA TGTGAGTTGA CCCAAGAATT 2520CCCAATTATT CGAGGCAGTC TACCAGATAG TCTACAACAA CGTCCGCATG GAAGACCTAC 2580CGGAGATGAT TGAAGAGCTA GACATCGATG ACGAATAGAC ACTCTCCCCC CCCCTCCCCC 2640TCTGATCTTT CCTGTTGCCT CTTTTTCCCC CAACCAATTT ATCATTATAC ACAAGTTCTA 2700CAACTACTAC TAGTAACATT ACTACAGTTA TTATAATTTT CTATTCTCTT TTTCTTTAAG 2760AATCTATCAT TAACGTTAAT TTCTATATAT ACATAACTAC CATTATACAC GCTATTATCG 2820TTTACATATC ACATCACCGT TAATGAAAGA TACGACACCC TGTACACTAA CACAATTAAA 2880TAATCGCCAT AACCTTTTCT GTTATCTATA GCCCTTAAAG CTGTTTCTTC GAGCTTTTCA 2940CTGCAG 2946(2)SEQ ID NO：3的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：3178个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID N0：3：CTGCAGAACT TCGTCTGCTC TGTGCCCATC CTCGCGGTTA GAAAGAAGCT GAATTGTTTC 60ATGCGCAAGG GCATCAGCGA GTGACCAATA ATCACTGCAC TAATTCCTTT TTAGCAACAC 120ATACTTATAT ACAGCACCAG ACCTTATGTC TTTTCTCTGC TCCGATACGT TATCCCACCC 180AACTTTTATT TCAGTTTTGG CAGGGGAAAT TTCACAACCC CGCACGCTAA AAATCGTATT 240TAAACTTAAA AGAGAACAGC CACAAATAGG GAACTTTGGT CTAAACGAAG GACTCTCCCT 300CCCTTATCTT GACCGTGCTA TTGCCATCAC TGCTACAAGA CTAAATACGT ACTAATATAT 360GTTTTCGGTA ACGAGAAGAA GAGCTGCCGG TGCAGCTGCT GCCATGGCCA CAGCCACGGG 420GACGCTGTAC TGGATGACTA GCCAAGGTGA TAGGCCGTTA GTGCACAATG ACCCGAGCTA 480CATGGTGCAA TTCCCCACCG CCGCTCCACC GGCAGGTCTC TAGACGAGAC CTGCTGGACC 540GTCTGGACAA GACGCATCAA TTCGACGTGT TGATCATCGG TGGCGGGGCC ACGGGGACAG 600GATGTGCCCT AGATGCTGCG ACCAGGGGAC TCAATGTGGC CCTTGTTGAA AAGGGGGATT 660TTGCCTCGGG AACGTCGTCC AAATCTACCA AGATGATTCA CGGTGGGGTG CGGTACTTAG 720AGAAGGCCTT CTGGGAGTTC TCCAAGGCAC AACTGGATCT GGTCATCGAG GCACTCAACG 780AGCGTAAACA TCTTATCAAC ACTGCCCCTC ACCTGTGCAC GGTGCTACCA ATTCTGATCC 840CCATCTACAG CACCTGGCAG GTCCCGTACA TCTATATGGG CTGTAAATTC TACGATTTCT 900TTGGCGGTTC CCAAAACTTG AAAAAATCAT ACCTACTGTC CAAATCCGCC ACCGTGGAGA 960AGGCTCCCAT GCTTACCACA GACAATTTAA AGGCCTCGCT TGTGTACCAT GATGGGTCCT 1020TTAACGACTC GCGTTTGAAC GCCACTTTAG CCATCACGGG TGTGGAGAAC GGCGCTACCG 1080TCTTGATCTA TGTCGAGGTA CAAAAATTGA TCAAAGACCC AACTTCTGGT AAGGTTATCG 1140GTGCCGAGGC CCGGGACGTT GAGACTAATG AGCTTGTCAG AATCAACGCT AAATGTGTGG 1200TCAATGCCAC GGGCCCATAC AGTGACGCCA TTTTGCAAAT GGACCGCAAC CCATCCGGTC 1260TGCCGGACTC CCCGCTAAAC GACAACTCCA AGATCAAGTC GACTTTCAAT CAAATCTCCG 1320TCATGGACCC GAAAATGGTC ATCCCATCTA TTGGCGTTCA CATCGTATTG CCCTCTTTTT 1380ACTCCCCGAA GGATATGGGT TTGTTGGACG TCAGAACCTC TGATGGCAGA GTGATGTTCT 1440TTTTACCTTG GCAGGGCAAA GTCCTTGCCG GCACCACAGA CATCCCACTA AAGCAAGTCC 1500CAGAAAACCC TATGCCTACA GAGGCTGATA TTCAAGATAT CTTGAAAGAA CTACAGCACT 1560ATATCGAATT CCCCGTGAAA AGAGAAGACG TGCTAAGTGC ATGGGCTGGT GTCAGACCTT 1620TGGTCAGAGA TCCACGTACA ATCCCCGCAG ACGGGAAGAA GGGCTCTGCC ACTCAGGGCG 1680TGGTAAGATC CCACTTCTTG TTCACTTCGG ATAATGGCCT AATTACTATT GCAGGTGGTA 1740AATGGACTAC TTACAGACAA ATGGCTGAGG AAACAGTCGA CAAAGTTGTC GAAGTTGGCG 1800GATTCCACAA CCTGAAACCT TGTCACACAA GAGATATTAA GCTTGCTGGT GCAGAAGAAT 1860GGACGCAAAA CTATGTGGCT TTATTGGCTC AAAACTACCA TTTATCATCA AAAATGTCCA 1920ACTACTTGGT TCAAAACTAC GGAACCCGTT CCTCTATCAT TTGCGAATTT TTCAAAGAAT 1980CCATGGAAAA TAAACTGCCT TTGTCCTTAG CCGACAAGGA AAATAACGTA ATCTACTCTA 2040GCGAGGAGAA CAACTTGGTC AATTTTGATA CTTTCAGATA TCCATTCACA ATCGGTGAGT 2100TAAAGTATTC CATGCAGTAC GAATATTGTA GAACTCCCTT GGACTTCCTT TTAAGAAGAA 2160CAAGATTCGC CTTCTTGGAC GCCAAGGAAG CTTTGAATGC CGTGCATGCC ACCGTCAAAG 2220TTATGGGTGA TGAGTTCAAT TGGTCGGAGA AAAAGAGGCA GTGGGAACTT GAAAAAACTG 2280TGAACTTCAT CCAAGGACGT TTCGGTGTCT AAATCGATCA TGATAGTTAA GGGTGACAAA 2340GATAACATTC ACAAGAGTAA TAATAATGGT AATGATGATA ATAATAATAA TGATAGTAAT 2400AACAATAATA ATAATGGTGG TAATGGCAAT GAAATCGCTA TTATTACCTA TTTTCCTTAA 2460TGGAAGAGTT AAAGTAAACT AAAAAAACTA CAAAAATATA TGAAGAAAAA AAAAAAAAGA 2520GGTAATAGAC TCTACTACTA CAATTGATCT TCAAATTATG ACCTTCCTAG TGTTTATATT 2580CTATTTCCAA TACATAATAT AATCTATATA ATCATTGCTG GTAGACTTCC GTTTTAATAT 2640CGTTTTAATT ATCCCCTTTA TCTCTAGTCT AGTTTTATCA TAAAATATAG AAACACTAAA 2700TAATATTCTT CAAACGGTCC TGGTGCATAC GCAATACATA TTTATGGTGC AAAAAAAAAA 2760ATGGAAAATT TTGCTAGTCA TAAACCCTTT CATAAAACAA TACGTAGACA TCGCTACTTG 2820AAATTTTCAA GTTTTTATCA GATCCATGTT TCCTATCTGC CTTGACAACC TCATCGTCGA 2880AATAGTACCA TTTAGAACGC CCAATATTCA CATTGTGTTC AAGGTCTTTA TTCACCAGTG 2940ACGTGTAATG GCCATGATTA ATGTGCCTGT ATGGTTAACC ACTCCAAATA GCTTATATTT 3000CATAGTGTCA TTGTTTTTCA ATATAATGTT TAGTATCAAT GGATATGTTA CGACGGTGTT 3060ATTTTTCTTG GTCAAATCGT AATAAAATCT CGATAAATGG ATGACTAAGA TTTTTGGTAA 3120AGTTACAAAA TTTATCGTTT TCACTGTTGT CAATTTTTTG TTCTTGTAAT CACTCGAG 3178(2)SEQ ID NO：4的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：816个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：4：ATGAAACGTT TCAATGTTTT AAAATATATC AGAACAACAA AAGCAAATAT ACAAACCATC 60GCAATGCCTT TGACCACAAA ACCTTTATCT TTGAAAATCA ACGCCGCTCT ATTCGATGTT 120GACGGTACCA TCATCATCTC TCAACCAGCC ATTGCTGCTT TCTGGAGAGA TTTCGGTAAA 180GACAAGCCTT ACTTCGATGC CGAACACGTT ATTCACATCT CTCACGGTTG GAGAACTTAC 240GATGCCATTG CCAAGTTCGC TCCAGACTTT GCTGATGAAG AATACGTTAA CAAGCTAGAA 300GGTGAAATCC CAGAAAAGTA CGGTGAACAC TCCATCGAAG TTCCAGGTGC TGTCAAGTTG 360TGTAATGCTT TGAACGCCTT GCCAAAGGAA AAATGGGCTG TCGCCACCTC TGGTACCCGT 420GACATGGCCA AGAAATGGTT CGACATTTTG AAGATCAAGA GACCAGAATA CTTCATCACC 480GCCAATGATG TCAAGCAAGG TAAGCCTCAC CCAGAACCAT ACTTAAAGGG TAGAAACGGT 540TTGGGTTTCC CAATTAATGA ACAAGACCCA TCCAAATCTA AGGTTGTTGT CTTTGAAGAC 600GCACCAGCTG GTATTGCTGC TGGTAAGGCT GCTGGCTGTA AAATCGTTGG TATTGCTACC 660ACTTTCGATT TGGACTTCTT GAAGGAAAAG GGTTGTGACA TCATTGTCAA GAACCACGAA 720TCTATCAGAG TCGGTGAATA CAACGCTGAA ACCGATGAAG TCGAATTGAT CTTTGATGAC 780TACTTATACG CTAAGGATGA CTTGTTGAAA TGGTAA 816(2)SEQ ID NO：5的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：753个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：5：ATGGGATTGA CTACTAAACC TCTATCTTTG AAAGTTAACG CCGCTTTGTT CGACGTCGAC 60GGTACCATTA TCATCTCTCA ACCAGCCATT GCTGCATTCT GGAGGGATTT CGGTAAGGAC 120AAACCTTATT TCGATGCTGA ACACGTTATC CAAGTCTCGC ATGGTTGGAG AACGTTTGAT 180GCCATTGCTA AGTTCGCTCC AGACTTTGCC AATGAAGAGT ATGTTAACAA ATTAGAAGCT 240GAAATTCCGG TCAAGTACGG TGAAAAATCC ATTGAAGTCC CAGGTGCAGT TAAGCTGTGC 300AACGCTTTGA ACGCTCTACC AAAAGAGAAA TGGGCTGTGG CAACTTCCGG TACCCGTGAT 360ATGGCACAAA AATGGTTCGA GCATCTGGGA ATCAGGAGAC CAAAGTACTT CATTACCGCT 420AATGATGTCA AACAGGGTAA GCCTCATCCA GAACCATATC TGAAGGGCAG GAATGGCTTA 480GGATATCCGA TCAATGAGCA AGACCCTTCC AAATCTAAGG TAGTAGTATT TGAAGACGCT 540CCAGCAGGTA TTGCCGCCGG AAAAGCCGCC GGTTGTAAGA TCATTGGTAT TGCCACTACT 600TTCGACTTGG ACTTCCTAAA GGAAAAAGGC TGTGACATCA TTGTCAAAAA CCACGAATCC 660ATCAGAGTTG GCGGCTACAA TGCCGAAACA GACGAAGTTG AATTCATTTT TGACGACTAC 720TTATATGCTA AGGACGATCT GTTGAAATGG TAA 753(2)SEQ ID NO：6的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：2520个碱基时

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

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(C)链型：未知

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(ⅱ)分子类型：蛋白质

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(C)链型：未知

(D)拓扑结构：未知

(ⅱ)分子类型：蛋白质

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：614个氨基酸

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(C)链型：未知

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(ⅱ)分子类型：蛋白质

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(ⅰ)序列特征：

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(ⅱ)分子类型：蛋白质

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(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

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(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：11：Met Glu Thr Lys Asp Leu Ile Val Ile Gly Gly Gly Ile Asn Gly Ala1 5 10 15Gly Ile Ala Ala Asp Ala Ala Gly Arg Gly Leu Ser Val Leu Met Leu

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435 440 445Ala Glu Leu Lys Tyr Leu Val Asp His Glu Trp Val Arg Arg Ala Asp

450 455 460Asp Ala Leu Trp Arg Arg Thr Lys Gln Gly Met Trp Leu Asn Ala Asp465 470 475 480Gln Gln Ser Arg Val Ser Gln Trp Leu Val Glu Tyr Thr Gln Gln Arg

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：542个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑结构：未知

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：12：Met Lys Thr Arg Asp Ser Gln Ser Ser Asp Val Ile Ile Ile Gly Gly1 5 10 15Gly Ala Thr Gly Ala Gly Ile Ala Arg Asp Cys Ala Leu Arg Gly Leu

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325 330 335Asp Mis Ala Glu Arg Asp Gly Leu Asp Gly Phe Ile Thr Ile Thr Gly

340 345 350Gly Lys Leu Met Thr Tyr Arg Leu Met Ala Glu Trp Ala Thr Asp Ala

355 360 365Val Cys Arg Lys Leu Gly Asn Thr Arg Pro Cys Thr Thr Ala Asp Leu

370 375 380Ala Leu Pro Gly Ser Gln Glu Pro Ala Glu Val Thr Leu Arg Lys Val385 390 395 400Ile Ser Leu Pro Ala Pro Leu Arg Gly Ser Ala Val Tyr Arg His Gly

405 410 415Asp Arg Thr Pro Ala Tr9 Leu Ser Glu Gly Arg Leu His Arg Ser Leu

420 425 430Val Cys Glu Cys Glu Ala Val Thr Ala Gly Glu Val Gln Tyr Ala Val

435 440 445Glu Asn Leu Asn Val Asn Ser Leu Leu Asp Leu Arg Arg Arg Thr Arg

450 455 460Val Gly Met Gly Thr Cys Gln Gly Glu Leu Cys Ala Cys Arg Ala Ala465 470 475 480Gly Leu Leu Gln Arg Phe Asn Val Thr Thr Ser Ala Gln Ser Ile Glu

485 490 495Gln Leu Ser Thr Phe Leu Asn Glu Arg Trp Lys Gly Val Gln Pro Ile

500 505 510Ala Trp Gly Asp Ala Leu Arg Glu Ser Glu Phe Thr Arg Trp Val Tyr

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530 535 540(2)SEQ ID NO：13的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：250个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑结构：未知

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：13：Met Gly Leu Thr Thr Lys Pro Leu Ser Leu Lys Val Asn Ala Ala Leu1 5 10 15Phe Asp Val Asp Gly Thr Ile Ile Ile Ser Gln Pro Ala Ile Ala Ala

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245 250(2)SEQ ID NO：14的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：271个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑结构：未知

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：14：Met Lys Arg Phe Asn Val Leu Lys Tyr Ile Arg Thr Thr Lys Ala Asn1 5 10 15Ile Gln Thr Ile Ala Met Pro Leu Thr Thr Lys Pro Leu Ser Leu Lys

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100 105 110Glu Val Pro Gly Ala Val Lys Leu Cys Asn Ala Leu Asn Ala Leu Pro

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130 135 140Lys Trp Phe Asp Ile Leu Lys Ile Lys Arg Pro Glu Tyr Phe Ile Thr145 150 155 160Ala Asn Asp Val Lys Gln Gly Lys Pro His Pro Glu Pro Tyr Leu Lys

165 170 175Gly Arg Asn Gly Leu Gly Phe Pro Ile Asn Glu Gln Asp Pro Ser Lys

180 185 190Ser Lys Val Val Val Phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Ala Ala Gly

195 200 205Lys Ala Ala Gly Cys Lys Ile Val Gly Ile Ala Thr Thr Phe Asp Leu

210 215 220Asp Phe Leu Lys Glu Lys Gly Cys Asp Ile Ile Val Lys Asn His Glu225 230 235 240Ser Ile Arg Val Gly Glu Tyr Asn Ala Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu

245 250 255Ile Phe Asp Asp Tyr Leu Tyr Ala Lys Asp Asp Leu Leu Lys Trp

260 265 270(2)SEQ ID NO：15的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：700个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑结构：未知

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹi)序列描述：SEQ ID NO：15：Met Phe Pro Ser Leu Phe Arg Leu Val Val Phe Ser Lys Arg Tyr Ile1 5 10 15Phe Arg Ser Ser Gln Arg Leu Tyr Thr Ser Leu Lys Gln Glu Gln Ser

20 25 30Arg Met Ser Lys Ile Met Glu Asp Leu Arg Ser Asp Tyr Val Pro Leu

35 40 45Ile Ala Ser Ile Asp Val Gly Thr Thr Ser Ser Arg Cys Ile Leu Phe

50 55 60Asn Arg Trp Gly Gln Asp Val Ser Lys His Gln Ile Glu Tyr Ser Thr65 70 75 80Ser Ala Ser Lys Gly Lys Ile Gly Val Ser Gly Leu Arg Arg Pro Ser

85 90 95Thr Ala Pro Ala Arg Glu Thr Pro Asn Ala Gly Asp Ile Lys Thr Ser

100 105 110Gly Lys Pro Ile Phe Ser Ala Glu Gly Tyr Ala Ile Gln Glu Thr Lys

115 120 125Phe Leu Lys Ile Glu Glu Leu Asp Leu Asp Phe His Asn Glu Pro Thr

130 135 140Leu Lys Phe Pro Lys Pro Gly Trp Val Glu Cys His Pro Gln Lys Leu145 150 155 160Leu Val Asn Val Val Gln Cys Leu Ala Ser Ser Leu Leu Ser Leu Gln

165 170 175Thr Ile Asn Ser Glu Arg Val Ala Asn Gly Leu Pro Pro Tyr Lys Val

180 185 190Ile Cys Met Gly Ile Ala Asn Met Arg Glu Thr Thr Ile Leu Trp Ser

195 200 205Arg Arg Thr Gly Lys Pro Ile Val Asn Tyr Gly Ile Val Trp Asn Asp

210 215 220Thr Arg Thr Ile Lys Ile Val Arg Asp Lys Trp Gln Asn Thr Ser Val225 230 235 240Asp Arg Gln Leu Gln Leu Arg Gln Lys Thr Gly Leu Pro Leu Leu Ser

245 250 255Thr Tyr Phe Ser Cys Ser Lys Leu Arg Trp Phe Leu Asp Asn Glu Pro

260 265 270Leu Cys Thr Lys Ala Tyr Glu Glu Asn Asp Leu Met Phe Gly Thr Val

275 280 285Asp Thr Trp Leu Ile Tyr Gln Leu Thr Lys Gln Lys Ala Phe Val Ser

290 295 300Asp Val Thr Asn Ala Ser Arg Thr Gly Phe Met Asn Leu Ser Thr Leu305 310 315 320Lys Tyr Asp Asn Glu Leu Leu Glu Phe Trp Gly Ile Asp Lys Asn Leu

325 330 335Ile His Met Pro Glu Ile Val Ser Ser Ser Gln Tyr Tyr Gly Asp Phe

340 345 350Gly Ile Pro Asp Trp Ile Met Glu Lys Leu His Asp Ser Pro Lys Thr

355 360 365Val Leu Arg Asp Leu Val Lys Arg Asn Leu Pro Ile Gln Gly Cys Leu

370 375 380Gly Asp Gin Ser Ala Ser Met Val Gly Gln Leu Ala Tyr Lys Pro Gly385 390 395 400Ala Ala Lys Cys Thr Tyr Gly Thr Gly Cys Phe Leu Leu Tyr Asn Thr

405 410 415Gly Thr Lys Lys Leu Ile Ser Gln His Gly Ala Leu Thr Thr Leu Ala

420 425 430Phe Trp Phe Pro His Leu Gln Glu Tyr Gly Gly Gln Lys Pro Glu Leu

435 440 445Ser Lys Pro His Phe Ala Leu Glu Gly Ser Val Ala Val Ala Gly Ala

450 455 460Val Val Gln Trp Leu Arg Asp Asn Leu Arg Leu Ile Asp Lys Ser Glu465 470 475 480Asp Val Gly Pro Ile Ala Ser Thr Val Pro Asp Ser Gly Gly Val Val

485 490 495Phe Val Pro Ala Phe Ser Gly Leu Phe Ala Pro Tyr Trp Asp Pro Asp

500 505 510Ala Arg Ala Thr Ile Met Gly Met Ser Gln Phe Thr Thr Ala Ser His

515 520 525Ile Ala Arg Ala Ala Val Glu Gly Val Cys Phe Gln Ala Arg Ala Ile

530 535 540Leu Lys Ala Met Ser Ser Asp Ala Phe Gly Glu Gly Ser Lys Asp Arg545 550 555 560Asp Phe Leu Glu Glu Ile Ser Asp Val Thr Tyr Glu Lys Ser Pro Leu

565 570 575Ser Val Leu Ala Val Asp Gly Gly Met Ser Arg Ser Asn Glu Val Met

580 585 590Gln Ile Gln Ala Asp Ile Leu Gly Pro Cys Val Lys Val Arg Arg Ser

595 600 605Pro Thr Ala Glu Cys Thr Ala Leu Gly Ala Ala Ile Ala Ala Asn Met

610 615 620Ala Phe Lys Asp Val Asn Glu Arg Pro Leu Trp Lys Asp Leu His Asp625 630 635 640Val Lys Lys Trp Val Phe Tyr Asn Gly Met Glu Lys Asn Glu Gln Ile

645 650 655Ser Pro Glu Ala His Pro Asn Leu Lys Ile Phe Arg Ser Glu Ser Asp

660 665 670Asp Ala Glu Arg Arg Lys His Trp Lys Tyr Trp Glu Val Ala Val Glu

675 680 685Arg Ser Lys Gly Trp Leu Lys Asp Ile Glu Gly Glu His Glu Gln Val

690 695 700Leu Glu Asn Phe Gln705(2)SEQ ID NO：16的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：51个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：16：GCGCGGATCC AGGAGTCTAG AATTATGGGA TTGACTACTA AACCTCTATC T 51(2)SEQ ID NO：17的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：36个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：17：GATACGCCCG GGTTACCATT TCAACAGATC GTCCTT 36(2)SEQ ID NO：18的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：34个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：18：TTGATAATAT AACCATGGCT GCTGCTGCTG ATAG 34(2)SEQ ID NO：19的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：19：GTATGATATG TTATCTTGGA TCCAATAAAT CTAATCTTC 39(2)SEQ ID NO：20的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：19个碱基时

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：19个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

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(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc=“引物”

(ⅲ)假说：否

(ⅳ)反义：否

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(ⅰ)序列特征：

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(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc=“引物”

(ⅲ)假说：否

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：25：CTAGTCTGTT TCCTG 15(2)SEQ ID NO：26的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：22个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/dese=“引物”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：26：GCTTTCTGTG CTGCGGCTTT AG 22(2)SEQ ID NO：27的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/dese=“引物”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：27：TGGTCGAGGA TCCACTTCAC TTT 23(2)SEQ ID NO：28的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：51个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/dese=“引物”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：28：AAAGTGAAGT GGATCCTCGA CCAATTGGAT GGTGGCGCAG TAGCAAACAA T 51(2)SEQ ID NO：29的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc=“引物”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：29：GGATCACCGC CGCAGAAACT ACG 23(2)SEQ ID NO：30的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc=“引物”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：30：CTGTCAGCCG TTAAGTGTTC CTGTG 25(2)SEQ ID NO：3l的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc=“引物”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：3l：CAGTTCAACC TGTTGATAGT ACG 23(2)SEQ ID NO：32的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc=“引物”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：32：ATGAGTCAAA CATCAACCTT 20(2)SEQ ID NO：33的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc=“引物”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：33：ATGGAGAAAA AAATCACTGG 20(2)SEQ ID NO：34的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基时

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc=“引物”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：34：TTACGCCCCG CCCTGCCACT 20(2)SEQ ID NO：35的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/dese=“引物”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：35：TCAGAGGATG TGCACCTGCA 20(2)SEQ ID NO：36的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc=“引物”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：36：CGAGCATGCC GCATTTGGCA CTACTC 26(2)SEQ ID NO：37的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/dese=“引物”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：37：GCGTCTAGAG TAGGTTATTC CCACTCTTG 29(2)SEQ ID NO：38的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc=“引物”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：38：GAAGTCGACC GCTGCGCCTT ATCCGG 26(2)SEQ ID NO：39的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：28个碱基时

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc=“引物”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：39：CGCGTCGACG TTTACAATTT CAGGTGGC 28(2)SEQ ID NO：40的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/dese=“引物”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：40：GCAGCATGCT GGACTGGTAG TAG 23(2)SEQ ID NO：41的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc=“引物”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：41：CAGTCTAGAG TTATTGGCAA ACCTACC 27(2)SEQ ID NO：42的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc=“引物”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：42：GATGCATGCC CAGGGCGGAG ACGGC 25(2)SEQ ID NO：43的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc=“引物”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：43：CTAACGATTG TTCTCTAGAG AAAATGTCC 29(2)SEQ ID NO：44的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/dese=“引物”

(ⅲ)假说：否

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：44：CACGCATGCA GTTCAACCTG TTGATAGTAC 30(2)SEQ ID NO：45的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc=“引物”

(ⅲ)假说：否

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：45：GCGTCTAGAT CCTTTTAAAT TAAAAATG 28

Claims

1．一种由重组生物体生产甘油的方法，它包括：

(ⅰ)用含有以下一个或两个基因的表达盒转化合适的宿主细胞：

(a)编码具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的蛋白的基因，和

(b)编码具有甘油-3-磷酸酶活性的蛋白的基因，

所述合适的宿主细胞在以下一个或两个基因中具有破坏

(a)编码具有甘油激酶活性的多肽的内源性基因，和

(b)编具有甘油脱氢酶活性的多肽的内源性基因，

其中所述破坏阻止活性基因产物的表达；

(ⅱ)在存在至少一种选自单糖、寡糖、多糖和一碳底物的碳源的情况下培养(ⅰ)的转化宿主细胞，由此生产甘油；和

(ⅲ)任选地回收在(ⅱ)中生产的甘油。

2．权利要求1的方法，其中所述表达盒包括甘油-3-磷酸脱氢酶的编码基因。

3．权利要求1的方法，其中所述表达盒包括甘油-3-磷酸磷酸酶的编码基因。

4．权利要求1的方法，其中所述表达盒包括编码甘油-3-磷酸磷酸酶和甘油-3-磷酸脱氢酶的基因。

5．权利要求1的方法，其中所述宿主细胞在内源性甘油激酶的编码基因中含有一个破坏，其中所述破坏阻止活性基因产物表达。

6．权利要求1的方法，其中所述宿主细胞在内源性甘油脱氢酶的编码基因中含有一个破坏，其中所述破坏阻止活性基因产物表达。

7．权利要求1的方法，其中所述宿主细胞含有a)在编码内源性甘油激酶的基因中的一个破坏和b)在编码内源性甘油脱氢酶的基因中的一个破坏，其中相应的基因中的破坏阻止由任何一个基因表达活性基因产物。

8．权利要求1的方法，其中所述合适的宿主细胞选自细菌、酵母和丝状真菌。

9．权利要求8的方法，其中所述合适的宿主细胞选自柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷伯氏菌属、气杆菌属、乳杆菌属、曲霉属、酵母属、裂殖酵母属、接合酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、念珠菌属、汉逊酵母属、德巴利酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基细菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属和假单胞菌属。

10．权利要求9的方法，其中所述合的适宿主细胞是大肠杆菌或酵母属菌种。

11．权利要求1的方法，其中所述碳源是葡萄糖。

12．权利要求1的方法，其中所述具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的蛋白对应于选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的氨基酸序列，而其中所述氨基酸序列包括不改变所述酶功能特性的氨基酸取代、缺失或插入。

13．权利要求1的方法，其中所述具有甘油-3-磷酸酶活性的蛋白对应于选自SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的氨基酸序列，而其中所述氨基酸序列包括不改变所述酶功能的氨基酸取代、缺失或插入。

14．一种转化的宿主细胞，它包含

(a)一个编码具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的蛋白的基因；

(b)一个编码具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的蛋白的基因；

(c)一个破坏的内源性甘油激酶的编码基因和；

(d)一个破坏的内源性甘油脱氢酶的编码基因；

其中在基因(c)和(d)中的破坏阻止表达活性基因产物，并且其中所述宿主细胞将至少一种选自单糖、寡糖、多糖和一碳底物的碳源转化为甘油。

15．一种转化的宿主细胞，它包含

(a)一个编码具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的蛋白的基因；

(b)一个编码具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的蛋白的基因；和

(c)一个破坏的内源性甘油脱氢酶的编码基因；

其中在基因(c)中的破坏阻止表达活性基因产物，并且其中所述宿主细胞将至少一种选自单糖、寡糖、多糖和一碳底物的碳源转化为甘油。

16．一种转化的宿主细胞，它包含

(a)一个编码具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的蛋白的基因；

(b)一个编码具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的蛋白的基因；和

(c)一个破坏的内源性甘油激酶的编码基因；

17．一种由重组生物体生产1，3-丙二醇的方法，它包括：

(ⅰ)用含有以下一个或两个基因的表达盒转化合适的宿主细胞

(a)编码具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的蛋白的基因，和

(b)编码具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的蛋白的基因，

所述合适的宿主细胞具有至少一个编码具有脱水酶活性蛋白的基因且在以下一个或两个基因中具有破坏：

(a)编码具有甘油激酶活性的多肽的内源性基因，和

(b)编具有甘油脱氢酶活性的多肽的内源性基因，

其中所述在基因(a)或(b)中的破坏阻止活性基因产物的表达，

(ⅲ)回收在(ⅱ)中生产的1，3-丙二醇。

18．权利要求17的方法，其中所述具有脱水酶活性的蛋白选自甘油脱水酶和二醇脱水酶。

19．权利要求18的方法，其中所述甘油脱水酶由分离自微生物的一个基因编码，所述微生物选自克雷伯氏菌属、乳杆菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、暗杆菌属、泥杆菌属和梭菌属。

20．权利要求18的方法，其中所述二醇脱水酶由分离自微生物的一个基因编码，所述微生物选自克雷伯氏菌属和沙门氏菌属。