KR20010032720A

KR20010032720A - 재조합 유기체에 의한 글리세롤의 생산방법

Info

Publication number: KR20010032720A
Application number: KR1020007006009A
Authority: KR
Inventors: 라메쉬 브이. 나이르; 마크 에스. 페인; 도날드 이. 트림버; 페르난도 발레
Original assignee: 메리 이. 보울러; 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니; 마가렛 에이.혼; 제넨코 인터내셔날 인코포레이티드
Priority date: 1997-12-02
Filing date: 1998-12-02
Publication date: 2001-04-25
Also published as: JP4570775B2; DE69831813T2; BR9815361B1; US20060286653A1; WO1999028480A1; HK1028419A1; CA2311601A1; EP1034278A1; AU1619199A; CN1284132A; US7005291B1; IL136407A0; BR9815361A; KR100550203B1; JP2001525175A; CN1202253C; CA2311601C; DE69831813D1; ATE305972T1; US7402415B2

Abstract

다양한 탄소 기질로부터 글리세롤을 생산하는 데 유용한 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 및(또는) 글리세롤-3-포스파타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 유기체가 제공된다. 이 유기체는 나아가 글리세롤 키나제 및 글리세롤 디히드로게나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 내재성 유전자내에 붕괴를 포함한다.

Description

재조합 유기체에 의한 글리세롤의 생산방법{Method for The Production of Glycerol by Recombinant Organisms}

글리세롤은 화장품, 액체비누, 음식, 약제, 윤활제, 부동액 및 기타 수 많은 응용용도로 산업상 크게 요구되는 화합물이다. 글리세롤의 에스테르는 지방 및 기름 산업에서 중요하다. 역사적으로, 글리세롤은 동물지방 및 유사 원료로부터 분리되어 왔다; 그렇지만, 이 방법은 힘들고 비능률적이다. 미생물에 의한 글리세롤의 생산이 바람직하다.

모든 유기체가 글리세롤을 합성할 수 있는 자연적 능력을 갖고 있지는 않다. 그러나, 몇 종류의 세균, 조류(藻類) 및 효모로부터 글리세롤의 생물학적 생산은 공지되어 있다. 세균 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 및 락토바실러스 리코페르시카(Lactobacillus lycopersica)는 글레세롤을 합성한다. 글리세롤 생산은 할로내성 조류 두날리엘라 sp. 및 아스테로모나스 그라실리스에게서 높은 외부 염농도에 대한 방어작용으로 발견된다(Ben-Amotz 등의 문헌[Experientia 38:49-52 (1982)]). 비슷하게, 다양한 삼투내성 효모는 방어적 측정(measure)으로서 글리세롤을 합성한다. 사카로미체스의 대부분의 균주는 알코올 발효동안에 약간의 글리세롤을 생산하고 이러한 생산은 삼투 압박(stress)을 적용하여 증가시킬 수 있다(Albertyn 등의 문헌[Mol.Cell.Biol. 14,4135-4144 (1994)]). 금세기 초 글리세롤은 아황산염 또는 알칼리와 같은 조종시약을 사카로미체스 배양에 가하여 상업적으로 생산되었다. 불활성 복합물(complex)의 생성을 통하여, 조종시약은 아세트알데히드의 에탄올로의 전환을 차단하거나 억제한다; 따라서, 과다한 환원 당량(NADH)을 사용하거나 디히드록시아세톤 포스페이트(DHAP)로 "조종"하여 글리세롤 생산을 감소시킨다. 상기 방법은 아황산염에 기인한 효모 성장의 부분적 억제에 의해 제한된다. 이러한 제한은 다른 메카니즘에 의해 과다 NADH 당량을 생산하는 알칼리의 이용으로 부분적으로 극복될 수 있다. 이러한 실시에 있어서, 알칼리는 카니짜로 불균형을 일으켜 아세트알데히드의 2 당량으로부터 에탄올 및 아세트산을 생산하도록 한다. 따라서, 비록 글리세롤을 자연적으로 발생하는 유기체로부터 생산할 수 있다하더라도, 생산은 종종 배양의 삼투 압박 조절에 대한 요구 및 아황산염의 생산에 종속된다. 이러한 제한이 없는 방법이 바람직하다. 글리세롤 생합성 경로의 핵심 단계를 암호화하는 외부 유전자를 함유하는 재조합 유기체로부터 글리세롤을 생산하는 것이 상기 방법에 대한 하나의 가능한 길이다.

글리세롤 생합성 경로에 포함된 수 많은 유전자들이 단리되어 왔다. 예를 들어, 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제(DAR1, GPD1)를 암호화하는 유전자가 사카로미체스 디아스타티쿠스로부터 클론이 만들어지고 서열화된 바 있다(Wang 등의 문헌[J.Bact. 176:7091-7095(1994)]). DAR1 유전자를 클론으로 셔틀 벡터 내로 클로닝하고 이를 사용하여 발현이 활성 효소를 만드는 대장균(E. coli)을 변형시켰다. Wang등은 상기 문헌에서 DAR1이 세포 삼투적 환경에 의해 조절된다는 것을 인식하지만 유전자가 재조합 유기체에서 글리세롤의 생산을 증가시키기 위해 어떻게 사용될 수 있는지를 제시하지는 않는다.

다른 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 효소들로 단리되어 왔다. 예를 들어, sn-글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제가 사카로미체스 세레비지애로부터 클론이 만들어지고 서열화된 바 있다(Larason등의 문헌[Mol.Microbiol., 10:1101 (1993)]). Albertyn등의 문헌[Mol.Cell.Biol., 14:4135 (1994)]은 사카로미체스 세레비지애로부터 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제를 암호화하는 GPD1의 클로닝을 보여주고 있다. Wang등의 문헌과 같이 알버틴 등의 문헌 및 라라슨(Larason) 등의 문헌 둘 다 상기 유전자의 조절에 대한 삼투-감도를 인식하지만 어떻게 유전자가 재조합 유기체에서 글리세롤의 생산에 사용될 수 있는 지를 제시하지는 않는다.

G3PDH의 경우처럼, 글리세롤-3-포스파타제가 사카로미체스 세레비지애로부터 단리되었으며 그 단백질은 GPP1 및 GPP2 유전자에 의해 암호화되는 것으로서 확인되었다(Norbeck등의 문헌[J.Biol.Chem., 271:13875 (1996)]). G3PDH를 암호화하는 유전자처럼, GPP2는 삼투적으로 유도되는 것으로 보인다.

비록 G3PDH 및 G3P 포스파타제를 암호화하는 유전자가 분리되었더라도, 함께 또는 분리되어 발현된 G3PDH/G3P 포스파타제를 갖는 재조합 유기체로부터의 글리세롤 생산을 증명하는 기술을 보여주지 못한다. 나아가, 세포에 일정한 압박(염 또는 삼투질)을 세포에 적용하는 것이 불필요한 이러한 두 효소 활성을 이용하여 어떤 야생형태의 유기체로부터 글리세롤을 효율적으로 생산할 수 있다는 것을 제시하지도 않았다. 실제로, 당해 분야는 G3PDH 활성이 글리세롤 생산에 영향을 줄 수 없다고 제시한다. 예를 들어, Eustace의 문헌[Can.J.Microbial., 33:112-117 (1987)]은 부모 균주보다 더 큰 수준으로 글리세롤을 생산하는 잡종 효모 균주를 보여주고 있다. 그러나, Eustace는 또한 G3PDH 활성은 야생형태와 반대로 잡종 균주에서 일정함을 유지하거나 다소 낮다는 것을 보여준다.

글리세롤은 산업적으로 유용한 물질이다. 그러나, 상업적 의미도 갖는 다른 화합물이 글리세롤 생합성 경로로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 글리세롤 생산 유기체를 조작하여, 폴리에스테르 섬유의 생산 및 폴리우레탄과 고리화합물의 제조에 잠재적 유용성을 갖는 단량체인 1,3-프로판디올(미국. 5686276)을 생산할 수 있다. 예를 들어, 일부 유기체에서, 글리세롤이 탈수효소 및 산화환원효소 각각의 작용을 통해 3-히드록시프로피온알데히드로 전환되고 나서 1,3-프로판디올로 전환된다는 것이 알려져 있다. 1,3-프로판디올을 생산할 수 있는 세균 균주가 예를 들어, 시트로박터, 클로스트리디움, 엔테로박터, 일리오박터, 클렙시엘라, 락토바실러스 및 펠로박터로 이루어진 군에서 발견된 바 있다. 글리세롤 탈수효소 및 디올 탈수효소 시스템이 Seyfried등의 문헌[J.Bacteriol. 178:5793-5796 (1996)] 및 Tobimatsu등의 문헌[J.Biol.Chem. 270:7142-7148 (1995)] 각각에 기재되어 있다. 1,3-프로판디올을 생산할 수 있는, 외인성 탈수효소를 함유하는 재조합 유기체는 (미국. 5686276)에 기재되어 있다. 비록 이러한 유기체가 1,3-프로판디올을 생산할 지라도, 이들이 글리세롤 전환이 최소화되는 시스템에서 유리할 것이라는 것이 분명하다.

글리세롤의 전환이 최소화되는 경우 1,3-프로판디올의 생산을 위한 글리세롤 생산 유기체를 처리하는데 있어서 많은 이점이 있다. 생리학적 조건하에 글리세롤을 효율적으로 생산할 수 있는 미생물이 산업적으로 바람직하며, 특히 삼투적 압박 또는 조종시약의 첨가에 의해 동요할 수 있는 복잡한 이화(catabolic) 또는 생합성 경로(예. 1,3-프로판디올의 생산)의 부분으로서 글리세롤 자체가 생체내 기질로 사용될 수 있는 경우 바람직하다. 글리세롤 키나제 및 글리세롤 디히드로게나제 돌연변이체를 생산하려는 일부 시도가 있었다. 예를 들어, De Koning등의 문헌[Appl.Microbiol Biotechnol. 32:693-698 (1990)]은, 디히드록시아세톤 키나제 및 글리세롤 키나제에서 차단된 메틸로트로픽(methylotropic) 효모 한세눌라 폴리모르파의 돌연변이에 의한 디히드록시아세톤 및 글리세롤의 메탄올 의존성 생산을 보고하고 있다. 동화반응의 크실로스-5-포스페이트 보조기질을 보충하는 데 요구되는, 메탄올 및 추가적 기질이 글리세롤 생산에 사용되었다; 그러나, 디히드록시아세톤 환원효소(글리세롤 디히드로게나제)도 또한 요구된다. 비슷하게, Shaw 및 Cameron의 요약서[211회 ACS 국가 회의, 뉴올리안즈, LA, 3월 24-28(1996), BIOT-154 출판사: 미국화학협회, 워싱톤 D.C.]는 1,3-프로판디올 생산의 최적화를 위한 ldhA(락테이트 디히드로게나제) glpK(글리세롤 키나제), 및 tpiA(트리오스포스페이트 이성화효소)의 제거를 연구하였다. 그들은 글리세롤 또는 1,3-프로판디올 생산을 위한 G3PDH 또는 G3P 포스파타제에 대한 클로닝된 유전자의 발현을 주장하지 않았으며 글리세롤 디히드로게나제의 영향을 논의하지 않았다. 따라서 해결해야 할 문제는, 일정한 효소활성, 특히 각각 디히드록시아세톤 포스페이트(DHAP)의 글리세롤-3-포스페이트(G3P)로의 전환, 및 이어 글리세롤로의 전환을 촉매하는 G3PDH 및 G3P 포스파타제의 첨가 또는 증가에 의해 탄소 플럭스를 글리세롤 생산으로 향하도록 하는 과정이 결여되었다는 것이다. 일정한 효소활성, 특히 각각 글리세롤과 ATP의 G3P로의 전환 및 글리세롤의 디히드록시아세톤(또는 글리세르알데히드)으로의 전환을 촉매하는 글리세롤 키나제 및 글리세롤 디히드로게나제의 제거 또는 감소에 의하여 글리세롤로부터 탄소 플럭스를 제거해야 할 필요성에 의해 문제가 복잡해진다.

〈발명의 요약〉

본 발명은 (a) 내재성 글리세롤 키나제를 암호화하는 유전자 및 (b) 내재성 글리세롤 디히드로게나제를 암호화하는 유전자 중 하나 또는 둘 모두에서 붕괴를 포함하는(여기서 붕괴는 활성 유전자 생성물의 발현을 막음) 적합한 숙주 세포를, (a) 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 및 (b) 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키고; 일탄당, 올리고당, 다당류 및 단일 탄소 기질로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 탄소원의 존재하에 형질전환된 숙주세포를 배양하여 글리세롤을 생산하고; 생산된 글리세롤을 회수하는 것을 포함하는, 재조합 유기체로부터의 글리세롤의 생산방법을 제공한다.

나아가 본 발명은, 탈수효소 활성을 갖고 (a) 내재성 글리세롤 키나제를 암호화하는 유전자 및 (b) 내재성 글리세롤 디히드로게나제를 암호화하는 유전자 중 하나 또는 둘 모두 붕괴를 포함하는 단백질을 암호화하는 1 이상의 유전자를 가지는(여기서 (a) 또는 (b)의 유전자에서 일어나는 붕괴는 활성 유전자 생성물의 발현을 막음) 적합한 숙주세포를, (a) 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 및 (b) 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 발현 카세트로 형질전화시키고; 일탄당, 올리고당, 다당류 및 단일 탄소 기질로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 탄소원의 존재 하에 형질전환된 숙주세포를 배양하여 1,3-프로판디올을 생산하고; 생산된 1,3-프로판디올을 회수하는 것을 포함하는, 재조합 유기체로부터의 1,3-프로판디올 생산방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 내재성 유전자의 다중 복제가 도입되는 재조합 유기체로부터의 1,3-프로판디올의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 추가 실시태양은, 글리세롤 경로를 위한 이형 유전자로 형질전환된 숙주세포 뿐만 아니라 글리세롤 경로를 위한 내재성 유전자를 함유하는 숙주세포를 포함한다.

또한, 본 발명은 글리세롤 또는 1,3-프로판디올 둘 중 어느 하나의 생산에 적합한 재조합 세포를 제공하며, 여기서 숙주세포는 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 활성 및 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 활성 중 하나 또는 둘 다를 발현하는 유전자, 및 내재성 글리세롤 키나제를 암호화하는 유전자 및 내재성 글리세롤 디히드로게나제를 암호화하는 유전자 중 하나 또는 둘 다에서 붕괴가 있는 세포이며, 여기서 유전자에서의 붕괴는 활성 유전자 생성물의 발현을 막는다.

〈도면의 간단한 설명, 생물학적 기탁물 및 서열 목록〉

도1은 글리세롤 대사를 포함하는 대표적 효소 경로의 도해이다.

출원인은 하기의 특허 절차 목적을 위한 미생물 기탁의 국제적 인지에 대한 부다페스트 조약의 협약하에 하기의 생물학적 기탁물을 기탁하였다:

기탁자 확인 참조 국제기탁지정 기탁일

Escherichia coli pAH21/DH5α ATCC 98187 1996. 9.26

(GPP2 유전자 함유)

Escherichia coli (pDAR1A/AA200) ATCC 98248 1996.11. 6

(DAR1 유전자 함유)

FM5 Escherichia coli RJF10m ATCC 98597 1997.11.25

(glpK 붕괴 함유)

FM5 Escherichia coli MSP33.6 ATCC 98598 1997.11.25

(gldA 붕괴 함유)

"ATCC"는 미국 20852 메릴랜드주, 록빌, 12301 파크로운 드라이브에 위치한 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) 국제 기탁 기관을 말한다. 상기 지정은 기탁물의 수탁번호이다.

출원인은 특허출원의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 표준 표현(representation) 규칙(OJ EPO(1992.12)에 대한 보충물 No.2로 출판, EPO 청장의 결정에 대한 첨부 I 및 II) 및 37 C.F.R 1.821-1.825 및 부록 A 및 B(뉴클레오티드 및(또는) 아미노산 서열을 포함하는 출원기재 요건)에 따라 43 서열을 제출하였다.

본 발명은 분자생물학 분야에 관한 것이며 글리세롤 및 글리세롤 생합성 경로로부터 유도된 화합물의 생산을 위한 재조합 유기체의 용도에 관한 것이다. 더 나아가 본 발명은 글리세롤 및 탄소기질로부터 유도된 화합물의 생산을 위한 재조합 세포의 구성, 글리세롤-전환 글리세롤 키나제 및 글리세롤 디히드로게나제 활성을 암호화하는 내재성 유전자가 제거된, 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제(G3PDH) 및 글리세롤-3-포스파타제(G3P 포스파타제) 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 외부 유전자를 함유하는 세포에 대해 설명한다.

본 발명은 재조합 유기체내의 발효성 탄소원으로부터 글리세롤을 생물학적으로 생산하는 방법을 제공함으로써 상기 문제점을 해결한다. 이 방법은 화장품 및 제약 업계에서 유용한 글리세롤의 신속, 저렴 및 환경친화적인 원을 제공한다. 이 방법은 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제(G3PDH) 및(또는) 글리세롤-3-포스파타제(G3P 포스파타제)를 암호화하는 클로닝된 동종성 또는 이종성 유전자를 함유하는 미생물을 사용한다. 이 유전자는 내재성 글리세롤 키나제 및(또는) 글리세롤 디히드로게나제를 암호화하는 유전자에서 붕괴(disruption)를 갖는 재조합 숙주에서 발현된다. 이 방법은 글리세롤 이외에 글리세롤이 중간체인 임의의 최종 생성물의 생산에도 유용하다. 재조합 미생물은 탄소원과 접촉되고, 배양되고, 이어서 글리세롤 또는 글리세롤로부터 유도된 임의의 최종 생성물이 컨디셔닝된 매질로부터 단리된다. 유전자는 글리세롤의 생산을 위해 별개로 또는 함께 숙주 미생물에 도입될 수 있다.

출원인의 방법은 이전에 재조합 유기체에 대해 기술된 바 없으며, 두 효소를 암호화하는 유전자의 단리 및 내재성 키나제 및 디히드로게나제 유전자에서 붕괴를 갖는 숙주 세포에서의 연이은 발현을 요하지 않았었다. 출원인의 방법이 글리세롤이 주된 중간체인 화합물, 예를 들어 1,3-프로판디올의 생성에 일반적으로 적용될 수 있다는 것을 당업자들은 인식할 것이다.

본 발명에서 사용되는 하기 용어들은 청구범위 또는 명세서를 해석하기 위해 사용될 수 있다.

"글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제" 및 "G3PDH"라는 용어는 디하이드록시아세톤 포스페이트(DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트(G3P)로 전환시키는 것을 촉매화하는 효소 활성에 관여하는 폴리펩티드를 의미한다. 생체내 G3PDH는 NADH, NADPH 또는 FDA 의존성일 수 있다. NADH 의존성 효소(EC 1.1.1.8)은 예를 들어 GPD1(GenBank Z74071x2) 또는 GPD2(GenBank Z35169x1) 또는 GPD3(GenBank G984182) 또는 DAR1(GenBank Z74071x2)을 포함하는 몇몇 유전자에 의해 암호화될 수 있다. NADPH 의존성 효소(EC 1.1.194)는 gpsA(GenBank U321643, (cds 197911-196892) G466746 및 L45246)에 의해 암호화될 수 있다. FAD 의존 효소(EC 1.1.99.5)는 GUT2(GenBank Z47047x23) 또는 glpD(GenBank G147838) 또는 glpABC(GenBank M20938)에 의해 암호화된다.

"글리세롤-3-포스파타제", "sn-글리세롤-포스파타제" 또는 "d,l-글리세롤 포스파타제" 및 "G3P 포스파타제"라는 용어는 글리세롤-3-포스파타제 및 물을 글리세롤 및 무기인산염으로 전환시키는 것을 촉매화하는 효소 활성에 관여하는 폴리펩티드를 말한다. G3P 포스파타제는 예를 들어 GPP1(GenBank Z47047x125) 또는 GPP2(GenBank U18813x11)에 의해 암호화된다.

"글리세롤 키나제"라는 용어는 글리세롤 및 ATP를 글리세롤-3-인산염 및 ADP로 전환시키는 것을 촉매화하는 효소 활성에 관여하는 폴리펩티드를 말한다. 고에너지 인산염 공여체 ATP는 생리학적 치환체(예. 포스포에놀피루베이트)에 의해 대체될 수 있다. 글리세롤 키나제는 예를 들어, GUT1(GenBank U11583x19) 및 glpK(GenBank L19201)에 의해 암호화된다.

"글리세롤 디히드로게나제"는 글리세롤을 디히드록시아세톤(E.C.1.1.1.6)으로, 또는 글리세롤을 글리세르알데히드(E.C.1.1.1.72)로 전환시키는 것을 촉매화하는 효소 활성에 관여하는 폴리펩티드를 말한다. 글리세롤을 디히드록시아세톤으로 전환시키는 것을 촉매화하는 효소 활성에 관여하는 폴리펩티는 또한 "디히드록시아세톤 환원효소"라고도 한다. 글리세롤 디히드로게나제는 NADH(E.C.1.1.1.6), NADPH(E.C.1.1.1.7 2) 또는 다른 보조인자(예. E.C.1.1.99.22)에 의존할 수 있다. NADH 의존 글리세롤 디히드로게나제는 예를 들어, gldA(GenBank U00006)에 의해 암호화된다.

"탈수효소"라는 용어는 글리세롤 분자를 생성물 3-히드록시프로피온-알데히드로 이성화 또는 전환시킬 수 있는 임의의 효소를 말한다. 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 디히드로게나제는 각각 글리세롤 및 1,2-프로판디올의 바람직한 기질을 갖는 글리세롤 탈수효소(E.C.4.2.1.30) 및 디올 탈수효소(E.C.4.2.1.28)을 포함한다. 예를 들어 "Citrobacter freundii"에서는, 글리세롤 탈수효소는 유전자 서열이 dhaB, dhaC 및 dhaE(GenBank U09771: 각각 염기쌍 8556-10223, 염기쌍 10235-10819 및 염기쌍 10822-11250)으로 표현되는 3 개의 폴리펩티드에 의해 암호화된다. 예를 들어 "Klebsiella oxytoca"에서는, 디올 탈수효소는 유전자 서열이 pddA, pddB 및 pddC(GenBank D45071: 각각 염기쌍 121-1785, 염기쌍 1796-2470 및 염기쌍 2485-3006)으로 표현되는 3개의 폴리펩티드에 의해 암호화된다.

"GPD1", "DAR1", "OSG1", "D2830" 및 "YDL022W"라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 세포질 글리세롤-3-인산염 디히드로게나제를 암호화하는 유전자를 말하고, SEQ0 ID NO:1로서 주어진 염기서열을 특징으로 한다.

"GPD2"라는 용어는 세포질 글리세롤-3-인산염 디히드로게나제를 암호화하는 유전자를 말하고, SEQ ID NO:2로서 주어지는 염기서열을 특징으로 한다.

"GUT2" 및 "YIL155C"라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있고, 미토콘드리아 글리세롤-3-인산염 디히드로게나제를 암호화하는 유전자를 말하고, SEQ ID NO;3으로써 주어지는 염기서열을 특징으로 한다.

"GPP1", "RHR2" 및 "YIL053W"라는 용어는 상호교환적으로 사용되고, 세포질 글리세롤-3-인산염을 암호화하는 유전자를 의미하고, SEQ ID NO:4로 주어지는 염기서열을 특징으로 한다.

"GPP2", "HOR2" 및 "YER062C"라는 용어는 상호교환적으로 사용되고, 세포질 글리세롤-3-인산염을 암호화하는 유전자를 의미하고, SEQ ID NO: 5로 주어지는 염기서열을 특징으로 한다.

"GUT1"이라는 용어는 세포질 글리세롤 키나제를 암호화하는 유전자를 말하고, SEQ ID NO:6로써 주어지는 염기서열을 특징으로 한다. "glpK"라는 용어는 글리세롤 키나제를 암호화하는 다른 유전자를 말하고, GenBank L19201, 염기쌍 77347-78855로 주어지는 염기서열을 특징으로 한다.

"gldA"라는 용어는 글리세롤 디히드로게나제를 암호화하는 유전자를 말하고, GenBank U00006, 염기쌍 3174-4316로 주어지는 염기서열에 의해 특징지어진다. "dhaD"라는 용어는 글리세롤 디히드로게나제를 암호화하는 다른 유전자를 말하고, GenBank U09771, 염기쌍 2557-3654로 주어지는 염기서열을 특징으로 한다.

본 명세서에서 사용되는 "작용" 및 "효소작용"이라는 용어는 특정 화학반응을 수행하기 위해 필요한 에너지를 변경하는데 있어 효소의 촉매활성을 말한다. 이와 같은 활성은 생성물 및 기질 모두의 생성이 적합한 조건 하에서 달성될 수 있는 화학평형상태의 반응에 적용될 수 있다.

"폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용된다.

"탄소기질" 및 "탄소원"이라는 용어는 본 발명의 숙주 유기체에 의해 신진대사작용될 수 있는 탄소원을 말하며, 특히 단당류, 올리고당류, 다당류 및 단일 탄소기질 또는 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 탄소원을 의미한다.

"전환"이란, 화학반응에 의해 화학 화합물 또는 기질의 복잡성을 낮추거나 변경시키는 유기체 또는 세포의 대사공정을 말한다.

"숙주 세포" 및 "숙주 유기체"라는 용어는, 외부(foreign) 또는 이종성 유전자 및 내재성 유전자의 추가 복제물을 수용하고, 이들 유전자를 발현시켜 활성 유전자 생성물을 생산할 수 있는 미생물을 말한다.

"생성 세포" 및 "생성 유기체"라는 용어는, 글리세롤 생합성 경로로부터 유도될 수 있는 글리세롤 또는 화합물을 생산하기 위해 가공되는 세포를 말한다. 생성 세포는 재조합될 수 있고, 글리세롤-3-포스파타제 디히드로게나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 및 글리세롤-3-인산염 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 중 하나 또는 둘 모두를 함유한다. G3PDH 및 G3P 포스파타제 유전자에 부가하여, 숙주 세포는 내재성 글리세롤 키나제를 암호화하는 유전자 및 내재성 글리세롤 디히드로게나제를 암호화하는 유전자 중 하나 또는 둘 모두에서 붕괴를 함유할 것이다. 생성 세포가 1,3-프로판디올을 생산하도록 고안된 경우, 이는 탈수효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 추가로 함유할 것이다.

"외부 유전자", "외부 DNA", "이종성 유전자" 및 "이종성 DNA"라는 용어는 모두 다른 숙주 유기체 내에 배치되었던 하나의 유기체 고유의 유전물질을 말한다.

유전자 또는 유전자에 의해 발현되는 폴리펩티드에 관하여 본 명세서에서 사용되는 "내재성"이라는 용어는 생성 세포에 고유하며 다른 유기체로부터 유도되지 않은 유전자 또는 폴리펩티드를 말한다. 따라서, "내재성 글리세롤 키나제" 및 "내재성 글리세롤 디히드로게나제"란 생성 세포 고유의 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드를 의미하는 용어이다.

"재조합 유기체" 및 "형질전환된 숙주"라는 용어는 이종성 또는 외부 유전자로 형질전환된 임의의 유기체를 말한다. 본 발명의 재조합 유기체는 적합한 탄소기질로부터 글리세롤을 생산하기 위해 G3PDH 및 G3P 포스파타제를 암호화하는 외부 유전자를 발현시킨다. 부가적으로, "재조합 유기체" 및 "형질전환된 숙주"라는 용어는 유전자의 복제수를 증가시키기 위해 내재성(또는 동종성) 유전자로 형질전환된 임의의 유기체를 말한다.

"유전자"란 코딩 지역을 선행하고(5'비-코딩) 뒤따르는(3'비-코딩)으로 이어지는 조절서열(regulatory sequence)을 포함하는 특정 단백질을 발현시키는 핵산 단편이다. "고유의" 및 "야생형" 유전자라는 용어는 그 자신의 조절서열을 가진 자연적으로 발견되는 것 같은 유전자를 말한다.

"암호화" 및 "코딩"이라는 용어는, 유전자가 전사 또는 번역의 메카니즘을 통해 아미노산 서열을 만드는 방법을 말한다. 특정 아미노산 서열을 암호화하는 방법이란, 암호화된 아미노산에서 변화를 야기하지 않는 염기 변화를 포함할 수 있는 DNA 서열, 또는 1 이상의 아미노산을 변경시킬 수 있으나 DNA 서열에 의해 암호화된 단백질의 작용성 성질에 영향을 미치지 않는 염기변화를 포함할 수 있는 DNA 서열을 포함하는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명은 구체적인 예시 서열 이상에까지 확장된다. 생성 단백질 분자의 작용성질에 실질적으로 영향을 주지 않는, 조용한 변화를 낳는 서열에서의 삭제, 삽입 또는 치환과 같은 서열에 대한 수정도 또한 의도된다. 예를 들어, 유전 암호의 퇴화를 반영하거나, 또는 소정의 위치에서 화학적으로 등가인 아미노산의 생산을 초래하는 유전자 서열 상의 변경이 의도되고, 따라서 아미노산 알라닌, 소수성 아미노산에 대한 코돈은, 글리신과 같은 소수성이 더 약한 다른 잔기, 또는 발린, 류신 또는 이소류신과 같은 소수성이 더 강한 잔기를 암호화하는 코돈으로 대체될 수 있다. 유사하게, 다른 화합물 대신 1 음전하로 하전된 기로의 치환(예를 들어 글루탐산 대신 아스파르트산으로), 또는 다른 화합물 대신 1 양전하로 하전된 잔기로의 치환(예를 들어 아르기닌 대신 리신으로)을 초래하는 변화는 생물학적으로 등가인 생성물을 생산할 것으로 기대할 수 있다. 단백질 분자의 N-말단 부분 및 C-말단부분의 변경을 야기하는 뉴클레오티드 변화는 또한 단백질의 활성을 변경하는 것으로 기대되지 않을 것이다. 경우에 따라서는, 단백질의 생물학적 활성에 대한 변경의 효과를 연구하기 위해 서열의 변종을 만드는 것이 실제 바람직할 수 있다. 각각의 제안된 변경은 암호화된 생성물에서의 생물학적 활성의 보유성을 결정하는 것과 같이 당업계의 통상적인 기술 범위 내이다. 나아가, 당업자는 본 발명에 속하는 서열은 또한 본 명세서에서 예시된 서열과 함께 엄격한 조건(0.1X SSC, 0.1% SDS, 65℃)하에서의 혼성화 능력에 의해서도 정의된다는 것을 인식한다.

"발현"이라는 용어는 유전자 생성물의 서열을 암호화하는 유전자로부터 유전자 생성물로의 전사 및 번역을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"라는 용어는 세포의 주대사작용의 일부가 아니고 보통 원형 2가닥 DNA 분자의 형태를 취하는 유전자를 종종 운반하는 여분의 염색체 성분을 말한다. 이들 성분은 임의의 원으로부터 유도된, 자가복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열, 선형 또는 원형의 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 여기서 상당수의 뉴클레오티드 서열이 결합되었거나 또는 재조합되어, 적합한 3' 비번역 서열을 따라 선택된 유전자 생성물에 대한 프로모터 단편 및 DNA 서열을 세포내로 도입시킬 수 있는 독특한 구조를 갖는다. "형질전환 카세트"란, 외부 유전자 및 그 이외의 특정 숙주 세포의 형질전환을 촉진시키는 성분을 함유하는 특정 벡터를 말한다. "발현 카세트"란, 발현 카세트 및 그 이외의 외부 숙주에서의 유전자의 발현을 고양시키는 성분을 함유하는 특정 벡터를 말한다.

"형질전환" 및 "트랜스펙션"이라는 용어는, 핵산을 도입한 수 세포내의 새로운 유전자의 획득을 말한다. 획득된 유전자는 염색체 DNA로 통합되거나, 염색체 이외의 복사서열로서 도입될 수 있다. "형질전환체"라는 용어는 형질전환에 의해 생성되는 세포를 말한다.

"유전적으로 변경된"이라는 용어는 형질전환 또는 돌연변이에 의해 유전물질을 변화시키는 방법을 말한다. 유전자에 적용된 "붕괴" 및 "유전자 차단"이라는 용어는, 유전자의 중요부분을 유전자로부터 삭제하거나 유전자에 첨가하여 유전자에 의해 암호화된 단백질이 발현되지 않거나 활성 형태로 발현되지 않게 함으로써, 유기체를 유전적으로 변경하는 방법을 말한다.

글리세롤 생합성 경로

대부분의 미생물에서 발견되는 글리세롤 생합성 경로의 조작에 의해 재조합 유기체에서 글리세롤이 생성될 수 있다고 여겨진다. 전형적으로, 글루코스와 같은 탄소 기질은 ATP의 존재 하에서 헥소키나제에 의해 글루코스-6-포스페이트로 전환된다. 글루코스-포스페이트 이소머라제는 글루코스-6-포스페이트를 프룩토스-6-포스페이트로 전환시키고, 이어서 6-포스포프룩토키나제의 작용을 통하여 프룩토스-1,6-디포스페이트로 전환시키는 것을 촉매시킨다. 이어서 이 디포스페이트는 알돌라제를 통하여 디히드록시아세톤 포스페이트(DHAP)로 취해진다. 마지막으로, NADH-의존성 G3PDH는 DHAP를 글리세롤-3-포스페이트로 전환시키고, 이는 이어서 G3P 포스파타제에 의해 글리세롤로 탈인산화된다. (아가왈(1990), 문헌 [Adv. Biochem. Engrg, 41:114]).

G3PDH, 글리세롤 디히드로게나제, G3P 포스파타제 및 글리세롤 키나제를 암호화하는 유전자들

본 발명은 숙주세포내에서 G3PDH 및 G3P 포스파타제 활성을 발현시키기에 적합한 유전자를 제공한다.

G3PDH를 암호화하는 유전자는 공지이다. 예를 들어, GPD1은 사카로미체스로 부터 단리되었고, SEQ ID NO:1으로 주어진 염기서열을 가지며, SEQ ID NO:7로 주어지는 아미노산 서열을 암호화한다(Wang 등, 상기 참조). 유사하게, G3PDH 활성은 또한 서열 목록 SEQ ID NO:2의 염기 서열을 가지고, SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 암호화하는 GPD2에 의해 암호화되고 이는 또한 사카로미체스로부터 단리되었다(Eriksson 등, (1995) 문헌[Mol. Microbiol., 17:95]).

본 발명의 목적을 위하여, G3PDH 활성과 연관된 폴리펩티드를 암호화하는 임의의 유전자도 적합한 것으로 생각되며, 여기서 이 활성은 디히드록시아세톤 포스페이트(DHAP)로부터 글리세롤-3-포스페이트(G3P)로의 전환을 촉매할 수 있는 것이다. 또한, GPD1, GPD2, GUT2, gpsA, glpD 및 glpABC의 α-서브유닛 유전자에 각각 해당하는 SEQ ID NOS: 7,8,9,10,11 및 12로 주어지는 G3PDH의 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 유전자도 본 발명에서는 기능적일 것이고, 이 아미노산 서열은 효소의 기능을 변화시키지 않는 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 함유할 수 있다고 본다. 당업자라면 다른 원으로부터 단리된 G3PDH를 암호화하는 유전자도 본 발명의 용도에 적합할 것이라는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, GenBank 수탁 번호 M34393, M20938, L06231, U12567, L45246, L45323, L45324, L45325, U32164, U32689 및 U39682를 포함하는 원핵생물로부터 단리된 유전자 등이다. 곰팡이로부터 단리된 유전자는 GenBank 수탁 번호 U30625, U30876 및 X56162를 포함하고; 곤충으로부터 단리된 유전자는 GenBank 수탁 번호 X61223 및 X14179를 포함하고; 포유동물 원으로부터 단리된 유전자는 GenBank 수탁 번호 U12424, M25558 및 X78593을 포함한다.

G3P 포스파타제를 암호화하는 유전자는 공지이다. 예를 들어, GPP2는 사카로미체스 세레비지애로부터 단리되었고, SEQ ID NO:5로 주어지는 염기 서열을 가지며, 이는 SEQ ID NO:13으로 주어지는 아미노산 서열을 암호화한다(Norbeck 등, (1996) 문헌[J. Biol. Chem., 271:13875]).

본 발명의 목적을 위하여, G3P 포스파타제 활성을 암호화하는 임의의 유전자도 본 방법에 사용되기에 적합한데, 여기서 그 활성은 글리세롤-3-포스페이트 및 물로부터 글리세롤 및 무기 인산염으로의 전환을 촉매할 수 있는 것이다. 또한, 각각 GPP2 및 GPP1 유전자에 해당하는 SEQ ID NOS:13 및 14에 의해 주어지는 바와 같은 G3P 포스파타제의 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 유전자도 본 발명에서 기능적일 것이고, 본 발명은 G3P 포스파타제 효소의 기능을 변화시키지 않는 아미노산 치환, 결손 또는 첨가를 함유하는 임의의 아미노산 서열을 포함할 것이다. 숙련가라면 다른 소스에서 단리된 G3P 포스파타제를 암호화하는 유전자도 본 발명에의 용도에 적합하다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 글리세롤을 형성하기 위한 글리세롤-3-포스페이트의 탈인산화는 하기의 일반적 또는 특별한 포스파타제 하나 이상으로 달성할 수 있다: 알칼리성 포스파타제(EC 3.1.3.1)[GenBank M19159, M29663, U02550 또는 M33965]; 산 포스파타제(EC 3.1.3.2)[GenBank U51210, U19789, U28658 또는 L20566]; 글리세롤-3-포스파타제(EC 3.1.3.-)[GenBank Z38060 또는 U18813x11]; 글루코스-1-포스파타제(EC 3.1.3.10)[GenBank M33807]; 글루코스-6-포스파타제(EC 3.1.3.9)[GenBank U00445]; 프룩토스-1,6-비스포스파타제(EC 3.1.3.11)[GenBank X12545 또는 J03207] 또는 포스포티딜 글리세로 포스페이트 포스파타제(EC 3.1.3.27)[GenBank M23546 및 M23628].

글리세롤 키나제를 암호화하는 유전자가 공지이다. 예를 들어, 사카로미체스로부터 글리세롤 키나제를 암호화하는 GUT1이 단리되었고 서열분석되어(Pavlik 등(1993), 문헌[Curr. Genet., 24:21]), 그 염기 서열이 SEQ ID NO:6에 제공되고 이는 SEQ ID NO:15에 주어진 아미노산 서열을 암호화한다. 별법으로, glpK는 E. coli로부터의 글리세롤 키나제를 암호화하고, 이는 염기쌍 77347-78855의, GenBank L19201에 제공되는 염기 서열을 특징으로 한다.

글리세롤 디히드로게나제를 암호화하는 유전자가 공지이다. 예를 들어, gldA는 E. coli로부터의 글리세롤 디히드로게나제를 암호화하고, 이는 염기쌍 3174-4316의, GenBank U00006으로 제공되는 염기 서열을 특징으로 한다. 별법으로, dhaD는 시트로박터 프레운다이로부터 글리세롤 디히드로게나제를 암호화하는 또다른 유전자를 칭하고 이는 염기쌍 2557-3654의 GenBank U09771로 제공되는 염기 서열을 특징으로 한다.

숙주세포

G3PDH 및 G3P 포스파타제 발현에 의한 글리세롤의 재조합적 생산을 위한 적합한 숙주 세포는 원핵생물이거나 또는 진핵생물일 수 있고, 오직 활성 효소를 발현시키는 능력에 의해서만 제한받을 것이다. 바람직한 숙주 세포는 일반적으로 글리세롤 생산에 유용한, 박테리아, 효모 및 섬유성 진균류, 즉 시트로박터, 엔테로박터, 클로스트리듐, 클렙시엘라, 에어로박터, 락토바실러스, 아스페르질러스, 사카로미체스, 시조사카로미체스, 자이고사카로미체스, 피키아, 클루이베로미체스, 칸디다, 한스에눌라, 데바리오미체스, 무코, 토룰롭시스, 메틸로박터, 에스케리키아, 살모넬라, 바실러스, 스트렙토미체스 및 수도모나스 등일 것이다. 본 발명에서 바람직한 것은 E. coli 및 사카로미체스이다.

1,3-프로판디올의 생산에서 글리세롤이 핵심 중간체인 경우, 숙주세포는 탈수효소 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 내재성적 유전자를 가지거나 또는 형질전환을 통하여 이러한 유전자를 획득할 것이다. 1,3-프로판디올의 생산에 특히 적합한 숙주 세포로는 시트로박터, 엔테로박터, 클로스트리듐, 클렙시엘라, 에어로박터, 락토바실러스 및 살모넬라이고 이들은 탈수효소를 암호화하는 내재성적 유전자를 갖는다. 부가적으로 이러한 내재성적 유전자를 결한 숙주 세포로는 E. coli를 포함한다.

벡터 및 발현 카세트

본 발명은 적합한 숙주 세포로의 G3PDH 및 G3P 포스파타제의 클로닝, 형질전환 및 발현에 적합한 다양한 벡터 및 형질전환 및 발현 카세트를 제공한다. 적합한 벡터는 사용되는 박테리아와 양립가능한 것들일 것이다. 적합한 벡터들은 예를 들어, 박테리아, 바이러스(박테리오파지 T7 또는 M13 유도 파지 등), 코스미드, 효모 또는 식물로부터 유도될 수 있다. 이러한 벡터들을 얻고 사용하는 프로토콜은 당업계에 공지이다(삼부루크 등, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual-volumns 1,2,3(Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1989)]).

전형적으로, 벡터 또는 카세트는 적당한 유전자의 전사 및 번역을 지시하는 서열, 선택가능한 마커 및 독립적 복제 또는 염색체내 삽입을 가능하게 하는 서열을 포함한다. 적합한 벡터들은 전사 개시 조절을 함유하는 유전자의 5'부위 및 전사 종결을 조절하는 DNA 단편의 3'부위를 함유한다. 두 조절 부위는 형질전환된 숙주 세포와 동종인 유전자로부터 유도된 때가 가장 바람직하다. 이러한 조절부위가, 생산 숙주로 선택된 특정 종에 천연적으로 존재하는 유전자로부터 유도될 필요는 없다.

원하는 숙주 세포 내에서 G3PDH 및 G3P 포스파타제 유전자의 발현을 유도하기에 유용한 개시 조절 부위 또는 프로모터는 다양하고 당업자에게 친숙하다. 사실상 이러한 유전자를 유도할 수 있는 어떠한 프로모터도 본 발명에 적합하고, 예로는 CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO 및 TPI(사카로미체스에서의 발현에 유용함); AOX1(피키아에서의 발현에 유용함); 및 lac, trp, λP_L, λP_R, T7, tac 및 trc(E. coli에서의 발현에 유용함) 등이 있으나 이에 국한되지 않는다.

종결 조절 부위도 바람직한 숙주에 천연적으로 존재하는 다양한 유전자로부터 유도될 수 있다. 임의로, 종결부위는 불필요할 수도 있으나, 포함되면 가장 바람직하다.

인스턴트 효소의 효과적인 발현을 위하여, 효소를 암호화하는 DNA를 선택된 발현 조절 부위에 개시 코돈을 통하여 작동가능하게 연결하여 그 발현에 의해 적합한 메신저 RNA가 형성되도록 한다.

적합한 숙주의 형질전환 및 글리세롤 생산을 위한 G3PDH 및 G3P 포스파타제의 발현

일단 적합한 카세트가 구축되면 이들은 적합한 숙주세포를 형질전환시키는데 사용된다. G3PDH 및(또는) G3P 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 카세트의 숙주세포로의 도입은, 예를 들어 칼슘 투과성 세포, 전기투과를 이용한 형질전환, 또는 재조합 파지 바이러스를 이용한 트랜스펙션과 같은 공지의 방법으로 달성할 수 있다(삼부루크 등, 상기참조).

"일반적 방법" 및 "실시예"에서 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명에서는 E. coli DH5α 및 FM5를 형질전환시키기 위하여 AH21 및 DAR1 카세트를 사용하였다.

별법으로, 내재성적 G3PDH 및(또는) G3P 포스파타제 유전자를 함유하는 적당한 숙주세포를 조작하여 글리세롤을 생산하기 위해 관련 유전자를 업 조절시키는 것을 고려할 수 있다.

내재성적 유전자의 업 조절 방법은 당업계에 공지이다. 예를 들어, 원하는 유전자(들)을 업 조절하기 위하여, 수용체 미생물에 의해 인식되는 DNA 상의 프로모터 부위로부터 다운스트림에 구조 유전자를 일반적으로 위치시킨다. 프로모터 이외에, 이종성 유전자로부터의 발현을 증가 또는 조절하는 다른 조절 서열을 포함할 수도 있다. 또한, 동일한 목적을 위하여 임의의 공지의 유전적 조작에 의해 내재성적 유전자의 조절 서열을 변화시킬 수도 있다. 발현은 유도체 또는 억제체에 의해 조절되어 당해 미생물이 원하는 대사적 경로를 완성시키는데 필요한 유전자(들)을 통합적으로 발현시키도록 한다.

본 발명에서, G3PDH 및(또는) G3P 포스파타제 활성을 암호화하는 내재성적 유전자를 함유하는 숙주세포가, 조절되는 프로모터(예. lac 또는 osmy) 또는 구조적 프로모터의 조절하에 놓여질 수 있다. 예를 들어, 특정 유도가능한 또는 구조적 프로모터를 함유하고, 타겟팅을 허락하도록 천연의 유전자와 상동성을 가지고 충분한 길이의 DNA를 양끝에 가지도록 카세트를 구성할 수 있다. 적당한 성장 조건하에서 이 카세트의 도입은 카세트와 유전자의 타겟 부위 사이의 동종적 재조합을 가져와, 관련된 천연의 프로모터가 조절가능한 프로모터로 치환될 것이다. 이러한 방법을 채용하여 글리세롤 생산을 위한 G3PDH 및(또는) G3P 포스파타제 활성을 암호화하는 내재성적 유전자의 업 조절을 가능하게 할 수 있다.

효소 활성 붕괴를 위한 무작위 및 부위 특이적 돌연변이화

유기체가 글리세롤을 대사하는 효소적 경로가 당업계에 공지이다. 도1 참조. 글리세롤은 ATP-의존성 글리세롤 키나제에 의해 글리세롤-3-포스페이트(G3P)로 전환되고; 이어서 G3P는 G3PDH에 의해 DHAP로 산화될 수 있다. 두번째 경로에서는, 글리세롤 디히드로게나제에 의해 글리세롤이 디히드록시아세톤(DHA)으로 산화되고; DHA는 ATP-의존성 DHA 키나제에 의해 DHAP로 전환될 수 있다. 세번째 경로에서는, 글리세롤 디히드로게나제에 의해 글리세롤이 글리세르알데히드로 산화되고; 글리세르알데히드는 ATP-의존성 키나제에 의해 글리세르알데히드-3-포스페이트로 인산화될 수 있다. 트리오스포스페이트 이소머라제의 작용에 의해 상호전환되는 DHAP 및 글리세르알데히드-3-포스페이트는 중앙 대사 경로를 경유하여 더욱 대사될 수 있다. 이들 경로는 부산물을 개입시켜 글리세롤 생산에 유해하다.

본 발명의 일 양상은, 글리세롤 생산을 위하여 글리세롤 키나제 및 글리세롤 디히드로게나제의 글리세롤 전환 활성이 상실된 생산 유기체를 제공하는 능력이다. 결손 돌연변이체를 창제하는 방법은 통상적이고 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 야생형 세포를 방사능 또는 화학적 돌연변이원과 같은 다양한 제제에 노출시키고 이어서 원하는 표현형을 스크리닝할 수 있다. 방사선 조사로 돌연변이체를 창제하는 경우에는 자외선(UV) 또는 이온화 방사를 사용할 수 있다. 유전적 돌연변이를 위한 적합한 단파 UV 파장은 200 nm 내지 300 nm의 범위에 속할 것이고 254 nm가 바람직하다. 이 파장에서의 UV 조사는 원칙적으로 구아니딘 및 시토신을 아데닌 및 티미딘으로 핵산 서열내 변화를 야기한다. 모든 세포는 대부분의 UV 유도된 돌연변이를 복구할 수 있는 DNA 복구 메카니즘을 가지기 때문에, 카페인과 같은 제제 및 기타 억제제를 첨가하여 복구 프로세스를 중단시키고 효과적인 돌연변이의 수를 최대화할 수 있다. 300 nm 내지 400 nm 범위의 광을 이용하는 장파장 UV 돌연변이도 가능하나, DNA와 상호작용하는 프소라렌(psoralen) 염료와 같은 다양한 활성자와 함께 사용되지 않으면, 일반적으로는 단파 UV 광만큼 효과적이지 않다.

화학물질을 이용하는 돌연변이화도 또한 돌연변이체를 생성하는데 효과적이고, 흔히 사용되는 물질로는 HNO₂및 NH₂OH와 같은 비복제 DNA에 영향을 주는 화학물질 및 프레임이동 돌연변이를 야기하는 것으로 유명한 아크리딘 염료와 같은 복제하는 DNA에 영향을 주는 물질이 있다. 방사능 또는 화학물질을 이용하여 돌연변이체를 창제하는 구체적인 방법은 당업계에 상세히 기록되어 있다. 예를 들어, 본문에 참고로 삽입되는, 토마스 디 브록(Thomas D. Brock)의 문헌[Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition(1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA.] 또는 데시판데, 무쿤드(Deshpande, Mukund V.)의 문헌 [Appl. Biochem. Biotechnol., 36, 227, (1992)] 참조.

돌연변이화를 만든 후, 원하는 표현형을 갖는 돌연변이체를 다양한 방법으로 선택할 수 있다. 원하는 산물 또는 중간체를 생산하는 능력에 의하여 돌연변이된 세포를 선택하는 무작위 스크리닝이 가장 흔하다. 별법으로, 돌연변이체의 선택적인 단리는, 내성 콜로니만 살 수 있는 선택적 배지상에서 돌연변이시킨 군을 성장시키는 것으로 수행될 수 있다. 돌연변이체의 선택 방법은 매우 발전되었고 산업적 미생물학 분야에서 잘 알려져 있다. 브록(상기 참조), 데만실하 (DeMancilha) 등, 문헌[Food Chem., 14, 313,(1984)] 참조.

유전자를 무작위적으로 타겟팅하는 생물학적 돌연변이 물질이 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 데 브루이진 및 로스바흐(De Bruijin and Rossbach)의 문헌[Methods for General and Molecular Bacteriology (1994) American Society for Microbiology, Washington D.C.] 참조. 별법으로, 유전자 서열이 공지이면, 적당한 플라스미드와 동종적 재조합에 의해 특정의 결손 또는 치환을 갖는 염색체 유전자 붕괴가 달성된다. 예를 들어, 하밀톤(Hamilton) 등의 문헌[J. Bacteriol. 171:4617-4622 (1989)], 발바스(Balbas) 등의 문헌[Gene 136:211-213 (1993)], 구엘데너(Gueldener) 등의 문헌[Nucleic Acids Res. 24:2519-2524 (1996)] 및 스미스(Smith) 등의 문헌[Methods Mol. Cell. Biol. 5:270-277 (1996)] 참조.

바람직한 생산 유기체내에서 글리세롤 키나제 및 글리세롤 디히드로게나제 활성의 제거 또는 불활성화를 위하여 상기 인용한 방법중 임의의 방법도 사용될 수 있음이 예견된다.

배지 및 탄소 기질

본 발명의 발효 배지는 적당한 탄소 기질을 함유하여야 한다. 적당한 기질은 글루코스 및 프룩토스와 같은 단당류, 락토스 또는 수크로스와 같은 올리고당, 전분 또는 셀룰로스 또는 이들의 혼합물과 같은 다당류, 및 치즈 유장 퍼미에이트, 콘스티프 리쿼, 사탕무 당밀 및 보리 엿기름과 같은 갱신가능한 공급원료로부터의 정제되지 않은 혼합물 등이 있고 이에 국한되지 않는다. 부가적으로, 탄소 기질은 중요한 생화학적 중간체로의 대사적 전환이 증명되어 있는, 이산화 탄소 또는 메탄올과 같은 단일 탄소 기질일 수도 있다.

단일 탄소원(예. 메탄올, 포름알데히드 또는 포르메이트)으로부터 글리세롤의 생산이 메틸로트로픽 효모(야마다 등(1989) Agric. Biol. Chem., 53(2):541-543) 및 박테리아(헌터 등(1985), Biochemistry, 24:4148-4155)에서 보고된 적이 있다. 이들 유기체들은 메탄올 내지 포르메이트의 산화 상태에 걸치는 단일 탄소 화합물을 동화하여 글리세롤을 생산할 수 있다. 탄소 동화의 경로는 리불로스 모노포스페이트를 통하거나, 세린을 통하거나 또는 크실룰로스-모노포스페이트를 통할 수 있다(곳츠쵸크(Gottschalk), Bacterial Metabolism, Second Edition, Springer-Verlag: New York(1986)). 리불로스 모노포스페이트 경로는 포르메이트와 리불로스-5-포스페이트의 축합으로 6탄당을 형성하고 이것이 프룩토스가 되고, 결국 글리세르알데히드-3-포스페이트인 3탄당 산물이 되는 것을 포함한다. 유사하게, 세린 경로는 단일 탄소 화합물을 동화하여 메틸렌테트라히드로폴레이트를 경유하여 해당 경로로 들어가게 한다.

메틸로트로픽 유기체는 단일 탄소 및 2 탄소 기질 이외에, 수많은 다른 탄소 함유 화합물(메틸아민, 글루코스아민, 및 대사적 활성을 위한 다양한 아미노산)을 이용하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 메틸로트로픽 효모는 메틸아민으로부터의 탄소를 이용하여 트레할로스 또는 글리세롤을 형성하는 것으로 알려져 있다(벨리온 등(1993), Microb. Growth C1 Compd., [Int. Symp.] 7th, 415-32. Editors: Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, UK). 유사하게, 칸디다의 다양한 종은 알라닌 또는 올레익 에시드를 대사시킬 것이다(술터 등(1990), Arch. Microbiol., 153(5):485-9). 따라서, 본 발명에서 사용된 탄소원은 다양한 탄소 함유 기질을 포함할 수 있고 유기체의 선택에 의해서만 제한될 것이다.

상기 언급한 모든 탄소 기질들 및 그의 혼합물이 본 발명에 적합하지만, 바람직한 탄소 기질로는 단당류, 올리고당, 다당류, 단일-탄소 기질 또는 이의 혼합물이다. 더욱 바람직한 당은 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 말토스, 락토스와 같은 당, 및 메탄올 및 이산화탄소와 같은 단일 탄소 기질이다. 탄소 기질로서 가장 바람직한 당은 글루코스이다.

적당한 탄소 기질 이외에, 발효 배지는 당업계의 숙련가에게 배양물의 성장 및 글리세롤 생산에 필요한 효소적 경로의 촉진에 적합한 것으로 공지된, 적합한 미네랄, 염, 조인자, 완충액 및 기타 성분들을 함유하여야 한다.

배양조건

전형적으로 세포는 적당한 배지에서 30℃에서 성장시킨다. 바람직한 성장 배지는 루리아 버타니(LB) 브로쓰, 사부로드 덱스트로스(SD) 브로쓰 또는 효모 배지(YM) 브로쓰와 같은 흔한 시판되는 제조된 배지이다. 기타의 정의된 또는 합성 성장 배지가 또한 사용될 수 있고, 미생물 또는 발효과학 기술분야의 당업자에게는 특정 미생물의 성장용으로 적당한 배지가 공지일 것이다. 직접 또는 간접적으로 이화적 억제(catabolite repression)를 조절하는 것으로 알려진 물질(예를 들어 시클릭 아데노신 3':5'-모노포스페이트)을 사용하여 반응 배지내에 혼입시킬 수도 있다. 유사하게, 글리세롤 생산의 향상을 가져오도록 효소적 활성을 조절하는 것으로 알려진 물질(예. 설파이트, 비설파이트 및 알칼리)의 사용은 유전적 조작을 대체하는 것으로서 또는 유전적 조작과 함께 사용될 수 있다.

발효를 위한 적합한 pH 범위는 pH 5.0 내지 pH 9.0이고, 초기 조건을 위하여는 pH 6.0 내지 pH 8.0이 바람직하다.

반응은 혐기상태 또는 호기상태에서 수행될 수 있고, 혐기 또는 마이크로호기 상태가 바람직하다.

G3PDH, 글리세롤 디히드로게나제, G3P 포스파타제 및 글리세롤 키나제 활성의 확인

G3PDH, G3P 포스파타제, 글리세롤 디히드로게나제, 및 글리세롤 키나제 단백질들의 발현양은 효소 검정으로 측정된다. 일반적으로, G3PDH 활성 및 글리세롤 디히드로게나제 활성 검정은, 각각 DHAP로부터 G-3-P로의 전환 및 DHA로부터 글리세롤로의 전환에서 공동 기질인 NADH의 스펙트럼 특성에 의존적이다. NADH는 내재적 UV/vis 흡광도를 가지고 그 소모는 340 nm에서 분광광도계로 측정될 수 있다. G3P 포스파타제 활성은 반응중에 유리된 무기 인산염을 측정하는 임의의 방법으로 측정할 수 있다. 가장 흔히 사용되는 측정 방법은 블루 색상의 포스포몰립데이트 암모늄 복합체의 가시적 스펙트럼 측정을 이용한다. 글리세롤 키나제 활성은 예를 들어 NMR에 의해 글리세롤 및 ATP로부터의 G3P의 검출에 의해 측정될 수 있다. 필요하다면 예를 들어 별개의 공인자(cofactor)를 이용하여 개별적 효소의 더욱 특이적인 특성을 향한 검정을 할 수 있다.

글리세롤 및 기타 산물(예를 들어 1,3-프로판디올)의 확인 및 회수

글리세롤 및 기타 산물(예. 1,3-프로판디올)은 세포제거된 추출물에 대한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 기체 크로마토그래피/질량 분석기(GC/MS)의 분석으로 확인 및 정량화할 수 있다. 바람직하게는 0.01 N 황산의 이동상을 이용하는 분석적 이온 교환 칼럼에서 평등한 양상(isocratic fashion)으로 발효 배지를 분석하는 HPLC 방법이다.

발효배지로부터 글리세롤을 회수하는 방법들은 당업계에 공지이다. 예를 들어, 반응 혼합물을 하기의 일련의 단계를 거치게 하여 글리세롤을 세포로부터 수득할 수 있다: 여과; 수분 제거; 유기 용매 추출; 및 분별 증류(미국 특허 제2,986,495호).

바람직한 실시태양에 대한 설명

글리세롤의 생산

본 발명은 재조합 유기체를 이용하여 적합한 탄소원으로부터 글리세롤을 생산하는 방법을 기술한다. 본 발명에서 특히 적합한 것은, 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 유전자 및 글리세롤-3-포스파타제 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 유전자 중 하나 또는 둘 다를 함유하는 발현 카세트로 형질전환된 박테리아 숙주세포이다. G3PDH 및 G3P 포스파타제 유전자 이외에, 숙주세포는 내재성적 글리세롤 키나제 및 글리세롤 디히드로게나제 효소를 암호화하는 유전자들 중 하나 또는 모두에서의 붕괴를 함유할 것이다. 유전자 붕괴(글리세롤의 전환을 차단함)와 함께 외부의 G3PDH 및 G3P 포스파타제 유전자의 조합 효과(탄소원으로부터 글리세롤로의 경로를 제공함)는 효율적이고 믿을만한 글리세롤 생산이 가능한 유기체를 만들 것이다.

비록 글리세롤 생산에 최적인 유기체는 상기한 유전자 붕괴를 함유하지만, 이러한 붕괴가 없이 외부의 G3PDH 및 G3P 포스파타제 유전자의 하나 또는 모두를 함유하는 숙주 세포로도 글리세롤 생산이 가능하다. 예를 들어, DAR1 유전자를 함유하는 재조합 E. coli 균주 AA200(실시예1)은 발효 파라미터에 의존적으로 0.38 g/L와 0.48 g/L 사이의 글리세롤을 생산할 수 있었다. 유사하게, 발현 가능한 GPP2 유전자를 함유하는 E. coli DH5α(실시예2)은 0.2 g/L의 글리세롤을 생산할 수 있었다. 두 유전자가 모두 존재하는 경우(실시예 3 및 4), 약 40 g/L의 글리세롤 생산이 달성되었다. 두 유전자가 내재성 글리세롤 키나제 활성의 제거와 함께 존재하는 경우에는 글리세롤의 전환 감소가 관찰될 수 있다(실시예 8). 나아가, 글리세롤 디히드로게나제 활성의 존재는 글루코스-제한적 조건 하에서 글리세롤의 전환과 연관되어 있고, 따라서, 글리세롤 디히드로게나제 활성의 제거는 글리세롤 전환의 감소를 가져올 것으로 예상된다(실시예8).

1,3-프로판디올의 생산

본 발명은 또한 외부 G3PDH 및(또는) G3P 포스파타제 유전자를 발현시키고 내재성 글리세롤 키나제 및(또는) 글리세롤 디히드로게나제 활성의 붕괴를 함유하는 재조합 유기체를 이용함으로써 1,3-프로판디올의 생산에도 적용될 수 있다. 부가적으로 본 발명은, 복수개의 내재성 유전자의 복제물이 도입된 재조합 유기체로부터 1,3-프로판디올을 생산하는 방법을 제공한다. 이들 유전적 변화 이외에, 생산 세포는 활성 탈수효소를 암호화하는 유전자의 존재를 필요로 할 것이다. 탈수효소 활성은 글리세롤 탈수효소 또는 디올 탈수효소일 것이다. 탈수효소 활성은 내재성 유전자의 발현으로부터 또는 숙주 유기체로 트랜스펙션된 외부 유전자의 발현으로부터 생길 수 있다. 적합한 탈수효소를 암호화하는 유전자의 단리 및 발현은 당업계에 잘 알려져 있고, 1996년 11월 5일자로 출원된 PCT/US96/06705 및 미국 제5686276호 및 제5633362호에 본 출원인에 의해 교시되어 있다(이들 문헌을 참고로 본문에 삽입함). 1,3-프로판디올의 생산에 글리세롤이 중요한 중간체이기 때문에, 발현되는 외부 G3PDH 및(또는) G3P 포스파타제 유전자와 조합하여, 그리고 글리세롤을 전환시키는 글리세롤 키나제 또는 글리세롤 디히드로게나제 활성의 부존재 하에서 숙주 세포가 탈수효소 활성을 함유할 경우 이 세포는 1,3-프로판디올의 생산에 특히 적합할 것이다.

본 발명은 하기의 실시예에서 더욱 정의된다. 이들 실시예들은 본 발명의 바람직한 실시태양을 나타내고 단지 설명의 도구로서만 주어진 것을 이해해야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당업계의 숙련가라면 본 발명의 필수적 특성을 확신할 수 있고, 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 용도 및 조건으로 본 발명의 다양한 변경 및 개질을 할 수 있다.

일반적 방법

인산화, 연결, 및 형질전환의 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다. 하기의 실시예에서 사용되기에 적합한 기술들은 삼브루크 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]에서 찾아 볼 수 있다.

박테리아 배양물의 유지 및 성장에 적합한 재료 및 방법들이 당업계에 잘 알려져 있다. 하기의 실시예에서 사용되기에 적합한 기술들은 문헌[Manual of Methods for General Bacteriology (Philipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips, eds), American Society for Microbiology, Washington D.C.(1994)] 또는 문헌[Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology (Thomas D. Brock, Second Edition(1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA)]에서 찾아볼 수 있다. 박테리아 세포의 성장 및 유지에 사용된 모든 시약 및 재료들은 달리 특정하지 않은 한, 알드리치 케미칼스(Milwaukee, WI), 디프코 래버러토리(DIFCO Laboratories, Detroit, MI), GIBCO/BRL(Gaithersburg, MD) 또는 시그마 케미칼 컴퍼니(St. Louis, MO)로부터 구입한 것이다.

약자의 의미는 다음과 같다: "h"는 시간, "min"은 분, "sec"는 초, "d"는 일, "mL"는 밀리리터, "L"은 리터.

세포 균주

이하의 대장균(Escherichia coli) 균주를 사용하여 G3PDH 및 G3P 포스파타제의 형질전환 및 발현시켰다. 균주들은 이. 콜라이 제네틱 스톡 센터, ATCC 또는 라이프 테크놀로지 (매릴랜드주 게더스버그 소재) 사로부터 입수하였다.

AA200 (garB10 fhuA22 ompF627fadL701 relA1 pit-10 spoT1 tpi-1 phoM510 mcrB1) (Abderson 등, 문헌[J. Gen. Microbiol., 62:329 (1970)]).

BB20 (tonA22 ΔphoA8fadL701 relA1 glpR2 glpD3 pit-10 gpsA20 spoT1 T2R) (Cronan 등, 문헌[J. Bact., 118:598]).

DH5α (deoR endA1 gyrA96 hsdR17 recA1 relA1 supE44 thi-1 Δ(lacZYA-argFV169) phi80lacZΔM15 F^-) (Woodstock 등, 문헌[Nucl. Acids Res., 17:3469 (1989)]).

FM5 Escherichia coli (ATCC 53911)

글리세롤의 확인

글루코스에서 글리세롤로의 전환은 HPLC 및(또는) GC로 모니터하였다. 크로마토그래피 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 이용할 수 있는 표준적인 기술 및 물질들을 사용하여 분석을 수행하였다. 한가지 적절한 방법으로 UV (210nm) 및 RI 검출을 사용하는 워터스 맥시마 820 HPLC 시스템(Waters Maxima 820 HPLC system)을 사용하였다. 유동 속도를 분당 0.69㎖로 하여 이동상으로 0.01N H₂SO₄를 사용하여 50℃로 온도 조절된 쇼덱스(Shodex) SH-1011P 예비 컬럼 (6 mm × 50 mm)이 장착된 쇼덱스 SH-1011 컬럼 (8 mm × 300 mm, 매사추세츠주 밀포드에 소재한 워터스사 제품)에 시료를 주입하였다. 정량적인 분석을 원하는 경우, 외부 표준 물질로서 알려진 양의 트리메틸아세트산과 함께 시료를 제조하였다. 전형적으로는, 1,3-프로판디올 (RI 검출), 글리세롤 (RI 검출) 및 글루코스 (RI 검출)의 보유 시간들은 각각 21.39분, 17.03분 및 12.66분이었다.

글리세롤 역시 GC/MS로 분석하였다. 글리세롤의 분리 및 정량화를 위한 질량 분광계 검출을 사용하는 가스 크로마토그래피는 DB-WAX 컬럼 (30 m, 내경 0.32 mm, 필름 두께 0.25㎛, 캘리포니아주 폴섬에 소재한 제이 앤 더블유 사이언티픽(J＆W Scientific) 제품)을 사용하여 이하의 조건에서 수행하였다: 인젝터:스플릿, 1:15, 시료 부피: 1㎕, 온도 프로파일: 초기 온도 150℃에서 30초간 유지, 180℃까지 분당 40℃로 승온, 240℃까지 분당 20℃로 승온 후 2.5분간 유지.

검출 : EI 질량 분광계 (캘리포니아주 산페르난도 소재 휴렛 팩커드 5971), 글리세롤 및 글리세롤-d8에 대한 타겟 이온으로서 이온 61 m/z 및 64 m/z를, 글리세롤에 대한 적격자(qualifier) 이온으로 이온 43 m/z를 사용하는 정량 SIM. 글리세롤-d8을 내부 표준으로 사용하였다.

글리세롤 3-포스파타제, G3P 포스파타제에 대한 분석

추출물을 비스-트리스 또는 MES 및 pH 6.5인 마그네슘 완충제 중에서 유기 포스페이트 기질로 배양함으로써 효소 활성에 대한 분석을 수행하였다. 사용된 기질은 1-α-글리세롤 포스페이트 또는 d,1-α-글리세롤 포스페이트였다. 분석에서 시약들의 최종 농도는 완충제 (20mM 비스-트리스 또는 50mM MES), MgCl₂(10mM) 및 기질 (20mM)이다. 시료중의 전체 단백질 농도가 낮고 산 반응종결(acid quench)로 가시적인 침전이 발생하지 않으면, 시료를 큐벳 내에서 손쉽게 평가하였다. 이 방법은 20 mM 기질 (50㎕, 200 mM), 50 mM MES, 10 mM MgCl₂, pH 6.5 완충제를 함유하는 큐벳 중에서 효소 시료를 배양하는 것을 포함한다. 최종 포스파타제 분석물 부피는 0.5㎖였다. 효소를 함유하는 시료를 반응 혼합물에 가하고 큐벳의 내용물을 섞은 다음 큐벳을 물이 순환하는 수조에 37℃에서 5 내지 120분간 둔다. 시간의 길이는 2 내지 0.02 U/㎖ 범위인 효소 시료중의 포스파타제 활성에 의존한다. 산 몰리브데이트 시약 (0.4㎖)을 가하여 효소 반응을 종결시켰다. 피스케 수바로우(Fiske SubbaRow) 시약 (0.1㎖) 및 증류수 (1.5㎖)를 가한 다음, 용액을 혼합하고 발현되도록 방치하였다. 10분 후, 완전한 색 발현이 일어나도록 하기 위해 시료의 흡광도를 660 nm에서 캐리(Cary) 219 UV/Vis 분광 광도계로 측정하였다. 방출된 무기 포스페이트의 양을 모액 무기 포스페이트 용액 (0.65 mM)을 사용하고 최종 무기 포스페이트 농도 범위가 0.026 내지 0.130 μmol/㎖인 6개의 표준을 준비하여 제조된 표준 큐벳과 비교하였다.

글리세롤 3-포스페이트 디히드로게나제 (G3PDH) 활성의 분광 광도계 분석

이하의 절차들을 벨(Bell) 등의 문헌 [J. Biol. Chem., 250:7153-8 (1975)]에 발표된 방법으로부터 아래와 같이 수정하여 사용하였다. 이 방법은 30℃에서 1.0㎖ 전체 부피중에 0.2 mM NADH, 2.0 mM 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP), 및 0.1 M Tris/HCl, pH 7.5 완충제와 5 mM DTT 중의 효소를 포함하는 큐벳내의 효소 시료를 배양하는 것을 포함한다. 분광 광도계를 고정된 파장인 340 nm에서 흡광도 변화를 모니터하기 위해 설정하였다. 완충제만을 함유하는 큐벳에 대해 장비의 영점을 조절하였다. 큐벳에 효소를 가한 다음 흡광도 값을 읽었다. 첫 번째 기질인 NADH (50㎕ 4 mM NADH; 흡광도는 약 1.25 AU로 증가해야 함)를 가하여 배경 비율(background rate)을 측정하였다. 그 비율은 적어도 3분 이상 후속되어야 한다. 그 다음 두 번째 기질인 DHAP (50㎕ 40 mM DHAP)를 가하고 시간에 따른 흡광도 변화를 적어도 3분간 모니터하여 전체 비율을 측정하였다. G3PDH 활성은 전체 비율로부터 배경 비율을 감한 것으로 정의하였다.

글리세롤 키나제 활성의¹³C-NMR 분석

적당량의 효소, 전형적으로는 세포가 없는 정제전 추출물을 25℃에서 75분 동안 40 mM ATP, 20 mM MgSO₄, 균일하게¹³C 라벨링한 21 mM 글리세롤 (99%, Cambridge Isotope Laboratories) 및 0.1 M 트리스-HCl, pH 9를 함유하는 반응 혼합물에 가하였다. 글리세롤로부터 글리세롤 3-포스페이트로의 전환을¹³C-NMR로 검출하였다(125MHz). 글리세롤 (63.11 ppm, d, J = 41 Hz 및 72.66 ppm, t, J = 41 Hz), 글리세롤 3-포스페이트 (62.93 ppm, d, J = 41 Hz, 65.31 ppm, 넓은 d, J = 43 Hz 및 72.66 ppm, dt, J = 6, 41 Hz).

NADH 결합된 글리세롤 디히드로게나제 분석

비변성 (non-denaturing) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 단백질을 분리한 후 대장균 균주 (gldA) 중의 NADH 결합된 글리세롤 디히드로게나제 활성을 측정하였다. 글리세롤 및 NAD⁺로부터 디하이드록시아세톤 및 NADH로의 전환을, 조정자 (mediator)로서 페나진 메토술페이트 (PMS)를 사용하여, 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT)로부터 짙은 색을 띤 포르마잔 (formazan)으로의 전환과 커플링시켰다 [Tang 등 (1997) J. Bacteriol. 140:182].

전기영동은 천연 겔 (8-16% TG, 1.5 mm, 15열 겔, 캘리포니아주 산디에고에 소재한 노벡스사로부터 입수)을 사용하는 표준 절차에 따라 2회 수행하였다. 남은 글리세롤을 pH 가 9인 50 mM 트리스 또는 탄산칼륨 완충제로 10분간 3회 세척하여 겔로부터 제거하였다. 두 개의 겔을 글리세롤의 존재 및 부존재하에서 (최종농도 약 0.16M) pH 9인 트리스 50 mM 또는 탄산칼륨, 암모늄 술페이트 60 mg, NAD⁺75 mg, MTT 1.5 mg 및 PMS 0.5 mg을 함유하는 분석 용액 15㎖ 중에서 전개시켰다.

폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 이어, 정제된 케이. 뉴모니아 (K. pneumoniae) 글리세롤 디히드로게나제 (dhaD)에 대한 폴리클로날 항체와의 반응에 의해 대장균 균주 (gldA) 중의 NADH 결합된 글리세롤 디히드로게나제 활성의 존재 또는 부존재를 측정하였다.

플라스미드 제조 및 균주 제조

대장균 DH5α 및 FM5 중의 글리세롤 생성을 증가시키기 위한 글리세롤 3-포스페이트의 클로닝 및 발현

사카로미체스 세레비지아 염색체 V 람다 클론 6592 (진 뱅크(Gene Bank), 취득 번호 U18813x11)을 ATCC로부터 얻었다. 글리세롤 3-포스페이트 포스파타제 (GPP2) 유전자를, BamHI-RBS-XbaI 자리를 5' 말단에, 그리고 SmaI 자리를 3' 말단에 도입하는 합성 프라이머 (SEQ ID NO:16 과 SEQ ID NO:17)를 사용하여 타겟 DNA로서 람다 클론으로부터 클로닝하여 복제하였다. 생성물을 SrfI 자리에서 pCR-Script (Stratagene, Madison, WI)내로 서브클로닝하여 GPP2를 함유하는 플라스미드 pAH15를 생성시켰다. 플라스미드 pAH15는 pCR-Script SK+ 중의 락(lac) 프로모터로부터의 발현을 위한 비활성 배향내에 GPP2 유전자를 함유한다. GPP2 유전자를 포함하는 플라스미드 pAH15로부터의 BamHI-SmaI 단편을 pBlueScriptII SK+ 내로 삽입시켜 플라스미드 pAH19를 생성시켰다. pAH19는 lac 프로모터로부터의 발현을 위한 올바른 배향 내에 GPP2 유전자를 함유한다. GPP2 유전자를 포함하는 pAH19로부터 유래한 XbaI-PstI 단편을 pPHOX2 내로 삽입하여 플라스미드 pAH21을 생성하였다. pAH21/DH5α는 발현 플라스미드이다.

대장균 내의 DAR1의 과발현(over-expression)을 위한 플라스미드

합성 프라이머 (SEQ ID NO:18 및 SEQ ID NO:19)를 사용하여 게놈 에스. 세레비지아 DNA로부터 PCR 클로닝에 의해 DAR1을 단리하였다. 성공적인 PCR 클로닝은, NcoI 내의 ATG가 DAR1 개시제 메티오닌인 DAR1의 5' 말단에 NcoI 자리를 위치시킨다. 전이 종결자에 이어 DAR1의 3' 말단에 BamHI 자리가 도입된다. PCR 단편들을 NcoI + BamHI로 소화시키고 발현 플라스미드 pTrc99A (뉴저지주 피스카타웨이에 소재한 파마시아사 제조)내의 동일한 자리 내로 클로닝하여 pDAR1A를 생성한다.

DAR1의 5' 말단에 보다 나은 리보솜 결합 자리를 생성하기 위해 합성 프라이머 (SEQ ID NO:20 및 SEQ ID NO:21)을 어닐링하여 얻은 SpeI-RBS-NcoI 링커를 pDAR1A의 NcoI 자리 내로 삽입하여 pAH40을 생성한다. 플라스미드 pAH40은 pTrc99A (뉴저지주 피스카타웨이에 소재한 파마시아사 제조)의 trc 프로모터로부터의 발현을 위한 올바른 배향으로 새로운 RBS 및 DAR1 유전자를 포함한다. pDAR1A로부터 유래한 NcoI-BamHI 단편 및 합성 프라이머 (SEQ ID NO:22 와 SEQ ID NO:23)를 어닐링하여 얻은 SpeI-RBS-NcoI 링커의 두번째 세트를 pBC-SK+ (위스콘신주 배디슨에 소재한 스트라타진사 제조)의 SpeI-BamHI 자리 내로 삽입하여 플라스미드 pAH42를 생성한다. 플라스미드 pAH42는 클로람페니콜(chloramphenicol) 내성 유전자를 포함한다.

DAR1 및 GPP2에 대한 발현 카세트의 제조

DAR1 및 GPP2의 발현 카세트를 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 상술한 DAR1 및 GPP2 서브클론 각각으로부터 모았다. 리보솜 결합 자리 (RBS) 및 GPP2 유전자를 함유하는 pAH19로부터 유래한 BamHI-PstI 단편을 pAH40내로 삽입하여 pAH43을 생성하였다. RBS 및 GPP2 유전자를 함유하는 pAH19로부터 유래한 BamHI-PstI 단편을 pAH42내로 삽입하여 pAH45를 생성하였다.

GPP2의 5' 말단의 리보솜 결합 자리를 이하와 같이 변경시켰다. GPP2 유전자를 함유하는 pAH19로부터 유래한 XbaI-PstI 단편에 합성 프라이머 GATCCAGGAAACAGA (SEQ ID NO:24)와 CTAGTCATGTTTCCTG (SEQ ID NO:25)를 어닐링하여 얻은 BamHI-RBS-SpeI 링커를 pAH40의 BamHI-PstI 자리내로 삽입하여 pAH48 을 생성하였다. 플라스미드 pAH48은 pTrc99A (뉴저지주 피스카타웨이에 소재한 파마시아사 제조)의 trc 프로모터로부터의 발현을 위한 올바른 배향으로 DAR1 유전자, 개조된 RBS 및 GPP2 유전자를 함유한다.

대장균의 형질전환

본 명세서에 기재된 모든 플라스미드는 표준 분자생물학 기술을 사용하여 대장균 DH5α 또는 FM5로 형질전환하였다. 형질전환체들은 그 DNA RFLP 패턴에 의해 증명되었다.

〈실시예 1〉

G3PDH 유전자로 형질전환된 대장균으로부터의 글리세롤의 생산배지

pDAR1A로 형질전환된 대장균 세포를 사용하는 글리세롤의 혐기성 또는 호기성 생산에 합성 배지를 사용하였다. 배지는 리터당 Na₂HPO₄6.0g, KH₂PO₄3.0g, NH₄Cl 1.0g, NaCl 0.5g, 20% MgSO₄.7H₂O 1㎖, 글루코스 8.0g, 카사미노산 40mg, 1% 티아민 하이드로클로라이드 0.5㎖ 및 앰피실린 100mg을 함유한다.

생장 조건

pDAR1A 또는 pTrc99A 벡터를 포함하는 균주 AA200를 37℃에서 250㎖ 플라스크에서 250 rpm으로 진탕되는 매질 50㎖ 중에서 호기성 조건하에서 생장시켰다. A₆₀₀에서 0.2 내지 0.3 이소프로필티오-β-D-갈락토시드를 가하여 최종 농도를 1mM 로 하고 48시간 동안 배양을 계속하였다. 혐기성 생장의 경우, 유도된 세포 시료들을 팔콘(Falcon) #2054 튜브에 채우고 뚜껑을 닫고 37℃에서 48시간 동안 회전시켜 부드럽게 혼합하였다. 글리세롤 생성은 배양 상청액을 HPLC로 분석하여 결정하였다. 균주 pDAR1A/AA200은 혐기성 조건하에서 48시간 후 0.38 g/ℓ의 글리세롤을 생성하고 호기성 조건하에서는 0.48 g/ℓ를 생성하였다.

〈실시예 2〉

G3P 포스파타제 유전자 (GPP2)로 형질전환시킨 대장균으로부터의

글리세롤의 생산 배지

대장균 내에서의 GPP2 발현에 의한 글리세롤의 증가를 설명하기 위하여 쉐이크 플라스크에 담긴 합성 phoA 배지를 사용하였다. 이 phoA 배지는 리터당 아미소이 12g, 황산 암모늄 0.62g, MOPS 10.5g, 구연산 나트륨염 1.2g, NaOH(1M) 10mL, MgSO₄(1M) 12mL, 100X 미량 원소 12mL, 50% 글루코스 10mL, 1% 티아민 10mL, 100mg/mL L-프롤린 10mL, 2.5mM FeCl₃5mL, 혼합 포스페이트 완충액 2mL (0.2M NaH₂PO₄5mL + 0.2M K₂HPO₄9mL)을 함유하고, pH는 7에 이른다. 여기서 100X 미량 원소란 phoA 배지 1 리터당 ZnSO₄·7H₂O 0.58g, MnSO₄·H₂O 0.34g, CuSO₄·5H₂O 0.49g, CoCl₂·6H₂O 0.47g, H₃BO₃0.12g, NaMoO₄·2H₂O 0.48g을 함유한다.

쉐이크 플라스크 실험

37℃에서 균주 pAH21/DH5α (GPP2 유전자 함유) 및 pPHOX2/DH5α (대조군)를 45mL의 배지(phoA 배지, 50ug/mL 카베니실린, 1ug/mL 비타민 B₁₂)가 담긴 250mL 쉐이크 플라스크 내에서 성장시켰다. 24시간 동안 호기성 조건에서 배양시켰다(250 rpm 진탕). 배양액의 상청액을 HPLC로 분석하여 글리세롤의 생산량을 측정하였다. 24시간 후 pAH21/DH5α에 의하여 생산된 글리세롤은 0.2g/L이었다.

〈실시예 3〉

GPP2 및 DAR1 모두를 함유한 재조합 대장균을 사용하는 D-글루코스로부터

글리세롤의 생산

DH5α 함유 pAH43 대장균에 의해 글리세롤 생산량을 증가시키기 위하여 37℃에서 호기성 조건으로 쉐이크 플라스크 배양(엘렌마이어 플라스크, 액 부피는 전체 부피의 1/5)을 하였다.

항생제에 의해 선별한 LB/1% 글루코스 일야 배양물로 접종하여, 최소 배지/1% 글루코스 쉐이크 플라스크 배양을 시작하였다. 최소 배지는 여과 멸균된 한정 배지로서 최종 pH는 6.8(HCl)이었다. 이 최소 배지는 1 리터당 (NH₄)₂SO₄12.6g, K₂HPO₄13.7g, 0.2g 효모 추출액(디프코사 제품), NaHCO₃1g, 비타민 B₁₂5mg, 변형된 Balch 미량 원소 용액 5mL (구체적인 성분은 문헌[Methods for General and Molecular Bacteriology, 피. 거하트 등 편집, American Society for Microbiology, 와싱턴, 디씨(1994); 158면] 참조)을 함유한다. 이 쉐이크 플라스크를 37℃에서 교반을 격렬하게 하면서 하루밤새 배양하였다. 그 후, 샘플을 취하여 상청액에 대해 GC 분석을 하였다. 24시간 후 pAH43/DH5α에 의하여 생산된 글리세롤은 3.8g/L이었다.

〈실시예 4〉

GPP2 및 DAR1 모두를 함유하는 재조합 대장균을 사용하는,

D-글루코스로부터 글리세롤의 생산

실시예 4는 GPP2와 DAR1 모두를 함유하는 재조합 대장균 DH5α/pAH48으로부터 글루코스를 생산하는 것을 설명한다.

균주 DH5α/pAH48은 "일반적 방법"에서 상술한 바에 따라 얻었다.

예비 배양

DH5α/pAH48을 발효기에 종균하기 위하여 예비 배양하였다. 예비 배양을 위한 성분 및 프로토콜을 이하 열거하였다.

예비 배양 배지

KH₂PO₄30.0g/L

구연산 2.0g/L

MgSO₄·7H₂O 2.0g/L

98% H₂SO₄2.0mL/L

제2철 암모늄 시트레이트 0.3g/L

CaCl₂·2H₂O 2.0g/L

효모 추출액 5.0g/L

미량 금속 5.0mL/L

글루코스 10.0g/L

카베니실린 100.0mg/L

상기 배지 성분들을 혼합하고 NH₄OH로 pH를 6.8로 맞추었다. 그 후, 배지를 여과 멸균하였다.

미량 금속은 다음과 같이 조제하였다.

구연산, 일수화물 4.0g/L

MgSO₄·7H₂O 3.0g/L

MnSO₄·H₂O 0.5g/L

NaCl 1.0g/L

FeSO₄·7H₂O 0.1g/L

CoCl₂·6H₂O 0.1g/L

CaCl₂0.1g/L

ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L

CuSO₄·5H₂O 10mg/L

AlK(SO₄)₂·12H₂O 10mg/L

H₃BO₃10mg/L

Na₂MoO₄·2H₂O 10mg/L

NiSO₄·6H₂O 10mg/L

Na₂SeO₃10mg/L

Na₂WO₄·2H₂O 10mg/L

배양은 50μL의 냉동 원액(항냉동제로서 15% 글리세롤)으로 2L 엘렌마이어 플라스크에 담긴 600mL 배지에 접종을 하여 종균 배양으로 시작하였다. 30℃에서 250rpm 진탕기에서 약 12시간 동안 배양을 한 후 이를 이용하여 발효기에 종균하였다.

발효 배양

발효 용기

15L 교반 탱크 발효기

배 지

KH₂PO₄6.8g/L

구연산 2.0g/L

MgSO₄·7H₂O 2.0g/L

98% H₂SO₄2.0mL/L

제2철 암모늄 시트레이트 0.3g/L

CaCl₂·2H₂O 0.2g/L

Mazu DF204 소포제 1.0mL/L

상기 성분 모두를 발효기 내부에서 함께 멸균시켰다. NH₄OH를 사용하여 pH를 6.7까지 올렸다. 여과 멸균된 저장 용액으로부터 효모 추출액(5g/L)와 미량 금속 용액(5mL/L)를 무균적으로 첨가하였다. 60% 공급액으로부터 최종 농도가 10g/L가 되도록 글루코스를 첨가하였다. 카베니실린을 100mg/L의 농도로 첨가하였다. 접종 후 부피는 6L였다.

기타 발효 조건

온도는 36℃로 유지하고, 공기 유속은 분당 6 표준 리터로 유지하였다. 역방향 압력은 0.5bar로 유지하였다. 교반기의 속도는 350rpm으로 유지하였다. 수성 암모니아를 사용하여 pH를 6.7로 유지하였다. 글루코스 (60% 글루코스 일수화물) 공급 속도는 글루코스가 과량이 되도록 유지하였다.

발효 운전 결과 (표 1 참조)

경과시간(시간)	OD550(AU)	글루코스농도(g/L)	글리세롤농도(g/L)	글루코스의 총 주입량(g)	글리세롤의 총 생산량(g)
0	0.8	9.3		25
6	4.7	4.0	2.0	49	14
8	5.4	0	3.6	71	25
10	6.7	0.0	4.7	116	33
12	7.4	2.1	7.0	157	49
14.2	10.4	0.3	10.0	230	70
16.2	18.1	9.7	15.5	259	106
18.2	12.4	14.5		305
20.2	11.8	17.4	17.7	353	119
22.2	11.0	12.6		382
24.2	10.8	6.5	26.6	404	178
26.2	10.9	6.8		442
28.2	10.4	10.3	31.5	463	216
30.2	10.2	13.1	30.4	493	213
32.2	10.1	8.1	28.2	512	196
34.2	10.2	3.5	33.4	530	223
36.2	10.1	5.8		548
38.2	9.8	5.1	36.1	512	233

〈실시예 5〉

글루코스로부터 글리세롤을 생산하기 위한

대장균 FM5의 글리세롤 키나제 변이주의 조작

대장균 FM5 내에서 글리세롤 키나제 유전자를 치환하기 위한 삽입 플라스미드의 제조

퓨어진(Puregene) DNA 분리 키트(Gentra Systems, 미네소타주 미네아폴리스)를 사용하여 대장균 FM5의 게놈 DNA를 제조하였다. SEQ ID NO: 26 및 27의 프라이머를 사용하여 FM5 게놈 DNA로부터 일부 glpF 및 글리세롤 키나제(glpK) 유전자를 함유한 1.0 kb의 DNA 단편을 PCR (물리스 및 팔루나, 문헌[Methods Enzymol., 155: 335-350면 (1987)] 참조)에 의해 증폭시켰다. SEQ ID NO: 28과 29의 프라이머를 사용하여 FM5 게놈 DNA로부터 일부 glpK 및 glpX 유전자들을 함유한 1.1 kb DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시켰다. MunI 자리를 SEQ ID NO: 28의 프라이머에 삽입시켰다. SEQ ID NO: 28의 프라이머의 5' 말단은 SEQ ID NO: 27의 프라이머에 대한 역 상보체이고, 이로써 후속적인 오버랩 연장 PCR이 가능하게 된다. 오버랩 연장 기술(호튼 등, 문헌[Biotechniques, 8: 528-535면 (1990)] 참조)에 의한 유전자 스플라이싱에 의해 상기 두 PCR 단편들(주형으로서)과 SEQ ID NO: 26과 29의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 2.1 kb 단편을 제조하였다. 이 단편은 1.5 kb glpK 유전자의 중앙 부분으로부터 0.8kb가 결실된 것을 나타낸다. 전체적으로, 이 단편은 MunI 클로닝 부위(부분적 glpK 내에)의 양 쪽에 1.0 kb와 1.1 kb 플랭킹 영역을 가지는데 이는 동형 재조합에 의해 염색체 유전자가 치환되게 한다.

상기 2.1 kb PCR 단편은 평활 말단(멍 빈(mung bean) 뉴클레아제 사용)이며, 이를 제로 블런트 PCR 클로닝 키트(캘리포니아주 샌디애고 소재 인비트로젠사 제품)를 사용하여 pCR-Blunt 벡터 내로 클로닝하여 카나마이신과 제오신(Zeocin) 내성 유전자를 함유하는 5.6 kb의 플라스미드 pRN 100를 제조하였다. pLoxCat1(이에 대한 결과는 미발표 상태)로부터 얻은 1.2 kb HincII 단편(박테리오파지 P1 loxP 부위에 의해 플랭크된 클로람페니콜 내성 유전자를 함유함; Snaith 등의 문헌[Genem 166: 173-174 (1995)] 참조)을 사용하여 MunI으로 분해된(그리고 평활 말단화된) 플라스미드 pRN100에 연결시킴으로써 플라스미드 pRN100 중의 glpK 단편을 붕괴시켜 6.9 kb의 플라스미드 pRN101-1을 제조하였다. SEQ ID NO: 30과 31의 프라이머를 사용하여 R6K 오리진을 함유하는 376 bp의 단편을 벡터 pGP704[밀러 및 메칼라노스, J. Bacteriol., 170: 2575-2583면(1988) 참조]로부터 PCR에 의해 증폭시키고, 평활 말단으로 만든 후, pRN101-1로부터 얻어진 5.3 kb의 Asp718-AatII 단편(평활 말단이었슴)에 연결시켜 카나마이신 및 클로람페니콜 내성 유전자를 함유하는 5.7 kb의 플라스미드 pRN102-1을 제조하였다. pRN101-1 중의 ColE1 오리진 영역을 R6K 오리진으로 치환하여 pRN102-1을 제조하였는데, 여기에서도 역시 제오신 내성 유전자 대부분이 결실되었다. pRN102-1 복제를 위한 숙주로는, R6K 오리진이 작용하기 위해 필요한 pir 유전자를 함유하고 있는 대장균 SY327를 사용하였다(Miller ＆ Mekalanos, 문헌[J. Bacteriol., 170: 2575-2583, (1988)] 참조).

클로람페니콜 내성 유전자가 붕괴된

글리세롤 키나제 돌연변이 RJF10m의 조작

대장균 FM5를 비-복제 삽입 플라스미드 pRN102-1로 전기형질전환 시키고 클로람페닐콜-내성 (12.5 μg/mL) 및 카나마이신-감수성 (30 μg/mL) 형질전환체를 1mM 글리세롤을 함유하고 있는 M9 최소 배지에서 글리세롤 비-활용성으로 추가 스크리닝 하였다. 완전한 glpK 유전자로 프로브하여 서던 분석을 한 결과 (Sourthern, J. Mol. Biol., 98:503-517, 1975), 그 중 하나의 돌연변이인 RJF10m으로부터의 게놈 DNA의 EcoRI 분해물이, 클로람페니콜 내성 유전자 내의 추가 EcoRI 자리의 존재로 인하여 생긴 7.9 kb 및 2.0 kb의 두 개의 예상 밴드를 보이는 것으로 보아, 이중-교차 삽입물 (glpK 유전자 대체)임을 알 수 있었다. 야생형 대조물은 하나의 예상되는 9.4 kb 밴드만을 나타내었다.¹³C NMR 분석에 의하여 돌연변이 RJF10m가¹³C-표지된 글리세롤과 ATP를 글리세롤-3-포스페이트로 전환시킬 수 없음을 확인하였다. 이 glpK 돌연변이를 SEQ ID NO:32와 SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34와 SEQ ID NO:35, 및 SEQ ID NO:32와 SEQ ID NO:35로 된 프라이머 조합을 이용한 게놈 PCR에 의하여 추가 분석하였더니 각각 2.3 kb, 2.4 kb 및 4.0 kb의 예상되는 PCR 단편을 생성하였다. SEQ ID NO:32와 SEQ ID NO:35 프라이머를 이용한 야생형 비교 실험은 예상되는 3.5 kb 밴드를 만들었다. 글루코스로부터 글리세롤을 만들도록 하기 위하여 glpK 돌연변이 대장균 RJF10m을 pAH48 플라스미드로 전기형질전환시켰다. glpK 돌연변이 대장균 RJF10m을 1997. 11. 24자로 부타페스트 조약의 협약 하에 ATCC에 기탁하였다.

클로람페니콜 내성 유전자 붕괴가 제거된 글리세롤 키나제 돌연변이 RJF10의 조작

37 ℃의 YENB 배지 (0.75% 이스트 추출액, 0.8% 영양 브로쓰)에서 일야 배양한 후, 물 현탁 상태의 대장균 RJF10m을, IPTG-유도성 lacUV5 프로모터 조절 하의 박테리오파지 P1 Cre 리콤비나제 유전자, 온도-감수성 pSC101 레플리콘 및 앰피실린 내성 유전자를 가진 pJW 168 플라스미드로 전기형질전환시켰다 (미발표 결과). 30 ℃의 SOC 배지에서 충분히 배양시킨 후, 카르베니실린 (50 μg/mL) 및 IPTG (1 mM)이 보충된 LB 아가 배지에서 형질전환체를 30℃(pJW168 복제에 대해 허용되는 온도)에서 선별하였다. loxP 자리에서 Cre 리콤비나제가 매개하는 재조합에 의하여 클로람페니콜 내성 유전자가 절단 제거되도록하기 위하여 (Hoess 및 Abremski, J. Mol. Bio., 181:351-362, 1985), 모은 콜로니들을 카르베니실린 및 IPTG가 보충된 신선한 LB 아가 배지에서 두 번에 걸쳐, 밤새 배양하고 (30 ℃) 배지를 옮겨 주었다. 마커 유전자의 제거를 나타내는 카르베니실린-내성 및 클로람페니콜-감수성 콜로니를 확인하기 위하여, 위 결과로 얻어진 콜로니를 카르베니실린 및 IPTG가 보충된 LB 아가 배지 및 클로람페니콜 (12.5 μg/mL)이 보충된 LB 아가 배지에 레플리카-플레이트 하였다. 이 콜로니 중 하나는 밤새 30 ℃에서 배양하여 LB 배지 10mL에 접종하였다. 30 ℃에서 OD (600 nm) 0.6 으로 자라게 한 후, 그 배양물을 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 미리 가온한 LB 아가 배지에 몇 단계 희석하여 플레이트 하고 이 플레이트 들을 42 ℃ (pJW 168의 복제 비허용 온도)에서 밤새 배양하였다. pJW 168 플라스미드의 손실을 나타내는 카르베니실린-감수 콜로니를 확인하기 위하여 위 결과의 콜로니를 LB 아가 배지 및 카르베니실린 (75 μg/mL)으로 보충된 LB 아가 배지에 레플리카 플레이트하였다. 그와 같은 glpK 돌연변이 RJF10 중 하나를 SEQ ID NO:32 및 SEQ ID NO:35 프라이머를 사용한 게놈 PCR로 분석한 결과 마커 유전자의 절단 제거를 확인하는 3.0 kb 예측 밴드를 나타내었다. 돌연변이 RJF10의 글리세롤 비-활용성을, 1 mM 글리세롤을 함유하는 M9 최소배지에서 성장하지 못하는 것에 의해 확인하였다.

〈실시예 6〉

GLDA 유전자가 녹아웃된 대장균 균주의 제조

각각 말단 SPh1 및 Xba1 자리를 가지는 SEQ ID NO:36 및 SEQ ID NO:37 프라이머를 사용하여, PCR 기법으로 (K. B. Mullis 및 F. A. Faloona (1987) Meth. Enzymol. 155:335-350) 대장균으로부터 gldA 유전자를 분리한 후, pUC 18의 SPh1 및 Xba1 자리 사이에 클론하여 (T. Maniatis 1982 Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, NY) pKP8을 만들었다. pKP8을 gldA 유전자 내의 특이한 Sal1 및 Nco1 자리에서 잘라, 각 말단을 클레노우를 사용하여 플러쉬-말단으로 만든 후 재결합시켜 gldA 가운데에 109bp가 결실되고 고유의 Sal1 자리를 재생하여 pKP9을 만들었다. 카나마이신 내성을 부여하는 유전자(kan)를 가지고 있으며 번역 개시코돈 상류의 약 400 bp DNA 및 번역 종료 코돈 하류의 약 100 bp DNA를 포함하는 1.4 kb DNA 단편을, 말단 Sal1 자리를 가지고 있는 SEQ ID NO:38 및 SEQ ID NO:39를 프라이머로 한 PCR에 의하여 pET-28a(+) (Novagen, Madison, Wis)로부터 단리하였다. 이 단편을 pKP9의 특이 Sal1 자리로 서브클론하여 pKP13을 얻었다. 각각 말단 Sph1 및 Xba1부위를 갖는 SEQ ID NO:40 및 SEQ ID NO:41 프라이머를 이용한 PCR에 의하여 pKP13으로부터, gldA 번역 개시코돈의 204 bp 하류에서 시작하고 gldA 번역 종료코돈의 178 bp 상류에서 종료하며, 칸(kan) 삽입을 가진 2.1 kb DNA 단편을 단리하였으며, 이 단편을 pMAK705 (Genencor International, Palo Alto Calif.)의 Sph1 및 Xba1 자리 사이에 서브클론하여 pMP33을 얻었다. 대장균 FM5를 pMP33으로 형질전환시키고 30℃(pMAK705 복제의 허용온도)에서 20 μg/mL 칸(kan)에서 선별하였다. 한 개의 콜로니를 밤새 30 ℃에서 20 μg/mL 칸(kan)으로 보충된 액체 배지에서 확장시켰다. 20 μg/mL 칸(kan)에 약 32,000 세포를 플레이트하여 pMAK705의 복제 제한 온도인 44 ℃에서 16 시간동안 배양하였다. 44 ℃에서 배양된 형질전환체는 약 0.0001 빈도로 염색체에 삽입되었다. 형질전환체에서 염색체로의 삽입 현상의 성질을 PCR과 서던블롯 (E.M. Southern 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517) 으로 분석하였다. gldA의 산물인 글리세롤 디히드로게나제 단백질이 형질전환체에서 생성되었는지를 확인하기 위하여 웨스턴블롯 (H. Towbin 등, 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. 76:4350, (1979)]) 분석을 사용하였다. 형질전환체에 글리세롤 디히드로게나제 활성이 잔존하는지를 확인하기 위하여 활성 검정을 사용하였다. 네이티브 겔 (Native gel) 상의 글리세롤 디히드로게나제 밴드의 활성을, 글리세롤 + NAD(+) --〉 디히드록시아세톤 + NADH 로의 전환 반응을, 테트라졸리움 다이, MMT[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드]를 페나진 메토술페이트를 매개체로하여 짙은 색을 내는 포르마잔으로 전환시키는 반응에 커플링시킴으로써 측정하였다. 글리세롤 디히드로게나제는 또한 30 mM 암모늄 술페이트 및 100 mM 트리스, pH 9의 존재를 필요로 한다 (C.T Tang 등, 문헌[J. Bacteriol. 140:182, (1997)]). 분석한 8개의 형질전환체 중 6개가 gldA 녹아웃으로 판명되었다. 대장균 MSP33.6을 1997. 11. 24자로 부다페스트 조약의 협약 하에서 ATCC에 기탁하였다.

〈실시예 7〉

GLPK 및 GLDA 유전자 녹아웃을 가진 대장균 균주의 제조

각각 말단 Sph1 및 Xba1 자리를 갖는 SEQ ID NO:42 및 SEQ ID NO:43 프라이머를 이용한 PCR에 의하여 대장균으로부터, gldA 유전자를 함유하고 번역 개시코돈의 상류에 228 bp DNA를, 번역 종료코돈의 하류에 220 bp DNA를 포함하는 1.6 kb DNA 단편을 단리하였으며, 이 단편을 pUC18의 Sph1 및 Xba1 자리 사이에 클론하여 pQN2를 얻었다. pQN2를 gldA 유전자 내의 고유한 Sal1 및 Nco1 자리에서 잘라 그 말단을 클레노우로 플러쉬 엔드로 만들고 재 결합시켜, gldA의 중간에 109 bp가 결실되고 특유의 Sal1 부위가 재생된 pQN4를 생성하였다. 카나마이신 내성을 부여하는 유전자 (kan)을 함유하고 loxP 부위를 양쪽에 지니는 1.2 kb DNA 단편을 Stu1/Xho1 단편으로서 pLoxKan2 (Genencor International, Palo Alto, Calif.)로부터 단리하였다. 그 말단을 클레노우로 플러쉬 엔드로 만들고, 그 후에 pQN4의 Sal1 자리에 서브클론하여 pQN8을 생성하였다. 각각 말단 Sph1 및 Xba1 자리를 갖는 SEQ ID NO:44 및 SEQ ID NO:45 프라이머를 이용한 PCR에 의하여 R6K 복제 개시점을 갖는 0.4 kb DNA 단편을 pGP704 (Miller 및 Mekanlanos, J. Bacteriol., 170:2575-2583, 1988)로부터 단리하여, 이 단편을 pQN8로부터의 gldA::kan 카세트를 포함하는 2.8 kb Sph1/Xba1 DNA 단편에 연결시켜 pKP22를 만들었다. 클로람페니콜 내성을 부여하는 유전자 (cam)을 포함하고 loxP 부위를 양쪽에 지니는 1.0 kb DNA 단편을 Xba1 단편으로서 pLoxCat2 (Genencor International, Palo Alto, Calif.)로부터 단리하여, 이 단편을 pKP22의 Xba1 부위에 서브클론하여 pKP23을 제작하였다. glpK-인 대장균 균주 RJF10 (실시예 5 참조)을 pKP23으로 형질전환시키고, 이중 교차 삽입을 나타내는 kanRcamS 표현형의 형질전환체를 단리하여, 서던 블롯 분석으로 확인하였다. (실시예 6에 기재된 바와 같은) 글리세롤 디히드로게나제 겔 활성 시험은 활성이 있는 글리세롤 디히드로게나제가 이들 형질전환체에 존재하지 않음을 보여주었다. 실시예5에 기술된 바와 같이, Cre-생성용 플라스미드 pJW168을 사용하여, 염색체로부터 kan 마커를 제거하여 KLP23 균주를 제조하였다. 몇개의 kanS 표현형 단리체가 글리세롤 디히드로게나제 활성을 보이지 않았으며, 서던 블롯 분석에서 kan 마커가 손실되었음을 확인하였다.

SEQ ID NO:44

CACGCATGCAGTTCAACCTGTTGATAGTAC

SEQ ID NO:45

GCGTCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATG

〈실시예 8〉

글리세롤 키나제(GLPK) 활성이 있고 없는 GPP2 및 DAR1을 둘 모두 함유하는 재조합 대장균에 의한, D-글루코스로부터 생성된 글리세롤의 소모

실시예 8은 재조합 대장균 FM5/pAH48 및 RJF10/pAH48에 의한 글리세롤의 소모를 예시한다. FM5/pAH48 균주 및 RJF10/pAH48 균주는 상기 "일반적 방법"에 기술된 바와 같이 제작되었다.

예비 배양

FM5/pAH48 및 RJF10/pAH48은 발효기에 종균(seeding)하기 위하여 발효에 사용되는 동일한 배지 또는 1% 글루코스를 보충한 LB에서 예비 배양되었다. 카르베니실린 또는 앰피실린 중 하나를 사용하여(100mg/L) 플라스미드를 유지하였다 (100mg/L). 발효 배지는 실시예 4에 기술된 바와 같다.

배양물은 냉동 저장액(항동결제로서 15% 글리세롤)으로부터 나온 것을 2-L 얼렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 내의 600mL 배지에 담아, 진탕기에서 250rpm으로 30℃에 약 12시간 동안 생장시킨 다음, 발효조 종균에 사용하였다.

발효 생장

5-7 L의 초기 부피를 갖는 15-L 교반 탱크 발효조는 실시예 4에 기술한 바와 같이 준비되었다. 카르베니실린 또는 앰피실린 중 하나가 플라스미드를 유지하기 위하여 사용되었다(100mg/L).

글리세롤 키나제(GlpK) 활성을 평가하기 위한 환경 조건

온도는 30℃로 조절되었고 기류 속도는 분당 6 표준 리터로 조절되었다. 배면 압력은 0.5 바아로 조절되었다. 용해 산소 장력은 교반에 의해 10%로 조절되었다. 수성 암모니아를 사용하여 pH를 6.7로 조절하였다. 글루코스 공급율(60% 글루코스)은 글리세롤이 축적되어 적어도 25g/L이 될 때까지 과량의 글루코스를 유지하도록 조절되었다. 그 다음 글루코스를 고갈시켜, 글리세롤의 순 대사(net metabolism)를 얻었다. 표 2는 결과적인 글리세롤의 전환을 나타낸다.

FM5/pAH48 (wt) 및 RJF10/pAH48 (glpK)에 의한 글리세롤의 전환

균주	실시예 번호	글리세롤 소모율 g/OD/hr
FM5/pAH48	2	0.095 ± 0.015
RJF10/pAH48	3	0.021 ± 0.011

표 2의 데이터에 의해 알 수 있는 바와 같이, 내재성 글리세롤 키나제 활성이 제거되는 경우에 글리세롤 소모율이 약 4-5배 감소한다.

글리세롤 디히드로게나아제(GldA) 활성을 평가하기 위한 환경 조건

온도는 30℃로 조절되었고 기류 속도는 분당 6 표준 리터로 조절되었다. 배면 압력은 0.5 바아로 조절되었다. 용해 산소 장력은 교반에 의해 10%로 조절되었다. 수성 암모니아를 사용하여 pH를 6.7로 조절하였다. 제1 발효에서, 글루코스는 발효기간 동안 과량으로 유지되었다. 제2 발효는 최초 25시간 후에 잔여의 글루코스 없이 수행되었다. 두 번의 발효로부터 시간에 따른 샘플을 취하여 GlpK 및 GldA 활성을 평가하였다. 표 3은 글리세롤 선택성에 대한 GldA의 효과를 보여주는 RJF10/pAH48 발효를 요약한 것이다.

두 번의 RJF10/pAH48 발효로부터의 GldA 및 GlpK 활성

발효	시간(hrs)	GldA	GlpK	전체 선택성(g/g)
1	254661	--+	---	42%49%54%
2	254661	+++++	---	41%14%12%

표 3의 데이터에 의해 알 수 있는 바와 같이, 글리세롤 디히드로게나아제 (GldA) 활성의 존재는 글루코스-제한 환경하에서 글리세롤의 전환과 연관되어 있다. 따라서, 글리세롤 디히드로게나아제 활성을 제거하는 것은 글리세롤 전환을 감소시킬 것으로 예측된다.

〈실시예 9〉

GPP2 및 DAR1을 둘 다 함유하는 재조합 이.블라태(E. BLATTAE)를 이용한,

D-글루코스로부터 글리세롤의 생산

실시예 9는 GPP2 및 DAR1 유전자를 둘다 함유하는 재조합 이.블라태로부터의, D-글루코스로부터 글리세롤의 생산을 예시한다.

ATCC 수탁번호가 33429로서 ATCC로부터 얻은 이.블라태를, 600nm에서의 OD값이 약 0.6AU인 배양에 이르기까지 30℃에서 생장시켰다. 이어서 배양물을, GPP2 및 DAR1 유전자(WO 98/21341에 기술됨)를 함유하는 플라스미드인 pAH48로 전기천공법(electroporation)에 의해 형질전환시켰다. 형질전환체는 DNA RFLP 패턴 및 항생제 내성(200㎍/mL 카르베니실린)에 의해 확인되었다.

형질전환된 이.블라태를 35℃에서 쉐이크-플라스크 배양으로 호기성 환경에서 생장시켰다. 배양물은 항생제 선별성을 갖춘 2% 글루코스 첨가 제한 배지에서 생장시킨 후, 항생제 선별성을 갖춘 1% 글루코스 첨가 LB에서 밤새 생장시킨 배양물로부터 접종함으로써 배양을 시작하였다. 제한 배지는 리터당 KH₂PO₄27.2g, 구연산 2g, MgSO₄·7H₂O 2g, 98% H₂SO₄1.2ml, 페릭 암모늄 시트레이트 0.3g, CaCl₂·2H₂O 0.2g, 효모 추출물(디프코) 10g, 변형된 발취의 미량-원소 용액(그 조성은 문헌[Methods for General and Molecular Bacteriology, P. Gerhardt 등, eds, p. 158, American Society for Microbiology, Washington, DC 1994]으로부터 알 수 있음) 5mL을 함유하였다. 제한 배지를 여과 멸균하고 NH₄OH로 최종 pH 6.8로 조정하였다. 쉐이크-플라스크를 격렬하게 진탕시키면서 35℃에서 밤새 배양하였다. 이어서 글리세롤 존재 분석을 위하여 상청액을 HPLC 분석하였다. 밤새 배양한 후에, pAH48을 함유하는 이.블라태가 글리세롤 7.63g/L을 생산하였다. 동일한 조건하에 생장시킨 야생형 이.블라태 (ATCC 33429) 대조군은 글리세롤 0.2g/L을 생산하였다.

〈실시예 10〉

염색체내로 통합된 GPP2 및 DAR1을 둘 다 함유하고 GLDA 및 GLPK는 결여된

재조합 대장균을 이용한, D-글루코스로부터 글리세롤의 생산

이 실시예는 gldA 및 glpK 유전자의 기능을 없애고 GPP2 및 DAR1을 암호화하는 유전자를 둘다 숙주세포 염색체에 통합시킨 재조합 대장균으로부터의, D-글루코스로부터 글리세롤의 생산을 예시한다.

실시예 7에 기술한 바와 같이 제조된 대장균 균주 KLP23은 글리세롤 키나제 (glpK의 산물) 및 글리세롤 디히드로게나아제(gldA의 산물) 활성을 둘 다 결여한 것이다. 염색체의 ampC 위치에 통합된 DAR1, GPP2 및 loxP 플랭크된 클로람페니콜 내성 유전자를 함유하는 KLP23을 제조하였고, 이를 AH76RIcm으로 칭하였다.

cre-lox 통합 시스템(상기 Hoess)에 기초하여 통합 플라스미드를 고안하고 제작하였다. 통합 플라스미드를 만들기 위하여, pLoxCat1의 HindIII - SmaI 단편을 선형화된 pAH48의 HindIII 및 SmaI에 삽입함으로써 pAH48cm2를 만들었다. pAH48 플라스미드는 trc 프로모터의 조절하에 발현되는 DAR1 및 GPP2 유전자를 함유한다. pAH48cm2의 3.5kb ApaI 단편을 T4 DNA 폴리머라제(뵈링거 만하임 바이오케미칼) 및 dNTPs로 평활말단화하고, 대장균 SY327(Miller 등, J. Bacteriol. 170: 2575-2583, 1998)을 숙주로 사용하여 선형화된 pInt-ampC(제넨코어 인터내셔널, 캘리포니아주)의 NruI로 삽입하여, pAH76 및 pAH76R을 만들었다. "R"은 통합 카세트의 역방향을 의미한다. 플라스미드 pAH76 및 pAH76R은 둘 다 복제 개시점 R6K을 함유하며, KLP23 내에서 복제가능하지 않다. 플라스미드 pAH76 및 pAH76R을 이용하여, 대장균 염색체의 ampC 위치에 통합하기 위하여 KLP23을 형질전환시켰다. 형질전환체는 클로람페니콜 10㎍/ml 상에서 선별되었고 카나마이신 감수성이었으며, 이중 교차 통합을 생성하였다. 이들 대장균 형질전환체는 AH76Icm 및 AH76RIcm으로 명명되었다.

AH76RIcm 배양물은 항생제 선별성을 갖춘 1% 글로코스 첨가 LB 배지에서 밤새 배양한 것으로부터 접종함으로써 시작하여, 2.5% 글루코스를 첨가한 쉐이크-플라스크내의 제한 배지(실시예 9에 기술함)에서 생장시켰다. 쉐이크-플라스크(얼렌마이어 플라스크, 총부피의 1/5의 액체 부피)를 격렬하게 진탕하면서 밤새 37℃에서 배양한 후에, 상청액을 샘플로 하여 발색효소 분석법(시그마, 공정 번호 337)을 사용하여 모나크 2000 인스트루먼트(인스트루멘테이션 러보러토리 컴퍼니, 매사츄세츠주 렉싱턴) 상에서 글리세롤에 대한 분석을 하였다. AH77RIcm은 25시간 후에 6.7g/L의 글리세롤 생산을 나타내었다.

대장균 AH76RI는 AH76RIcm으로부터 삭제된 클로람페니콜 유전자를 갖는다. 클로람페니콜 유전자는 실시예 5에 기술된 바와 같이, Cre-생성 플라스미드인 pJW168을 사용하여 염색체로부터 삭제되었다. 형질전환체는 30℃에서 1mM IPTG 유도하에서 카르베니실린 내성 및 클로람페니콜 감수성에 의하여 선별되었다. 클로람페니콜 유전자의 제거 후에, AH76RI를 항생제가 없는 LB 배지 상에서 생장시켜 pJW168을 보존하였다. AH76RI의 최종본은 클로람페니콜 또는 카르베니실린 선별 상에서 생장하지 못한다.

AH76RI 배양은 밤새 배양한 1% 글로코스 첨가 LB 배양물로부터 접종함으로써 시작하여, 2% 글루코스를 첨가한 쉐이크-플라스크내의 제한 배지에서 생장시켰다. 쉐이크-플라스크를 격렬하게 진탕하면서 밤새 35℃에서 배양한 후에, 상청액을 샘플로 하여 발색효소 분석법(시그마, 공정 번호 337)을 사용하여 모나크 2000 인스트루먼트(인스트루멘테이션 러보러토리 컴퍼니, 매사츄세츠주 렉싱턴) 상에서 글리세롤에 대한 분석을 하였다. AH77RI는 24시간 후에 4.6g/L의 글리세롤 생산을 나타내었다.

이 실시예에 기술된 모든 플라스미드는 표준 분자생물학 기술을 이용하여 대장균 KLP23으로 형질전환되었다. 형질전환체는 DNA RFLP 패턴, 항생제 재성, PCR 증폭 또는 G3P 포스포타제 분석에 의하여 검증되었다.

기탁된 미생물에 관한 공시사항

(PCT 규칙 13bis)

+A. 하기 공시사항은 명세서 제5면, 제20행에 언급된 미생물에 관한 것이다.
B. 기탁의표시
기탁 기관 명칭 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)
기탁 기관 주소 미합중국 20110 - 2209 버지니아주 마나싸스 유니버시티 불바드 10801
기탁일 1996년 9월 26일	기탁 번호 ATCC 98187
C. 추가 공시 사항
유럽 특허가 청구된 그들 지정국과 관련하여, 기탁된 미생물의 시료는 유럽 특허의 허여에 관한 의사가 공개될 때까지 또는 취하되거나 취하 간주된 날 까지만, 시료 분양을 신청한자에 의해 지정된 전문인에게 분양함으로써 이용될 수 있다. (EPC 규약 28(4))
D. 공시 사항이 적용되는 지정국

E. 공시 사항의 별도 공급
하기 공시사항은 후에 국제사무국에 제출될 것이다.
수리관청용임이 서류는 국제 출원과 함께 출원시 접수되었음을 확인함.	국제사무국용임이 서류는 국제사무국에 의하여 접수됨.
권한을 받은 관리서명	권한을 받은 관리

기탁된 미생물에 관한 공시사항

(PCT 규칙 13bis)

A. 하기 공시사항은 명세서 제5면, 제21행에 언급된 미생물에 관한 것이다.
B. 기탁의표시
기탁 기관 명칭 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)
기탁 기관 주소 미합중국 20110 - 2209 버지니아주 마나싸스 유니버시티 불바드 10801
기탁일 1996년 11월 6일	기탁 번호 ATCC 98248
C. 추가 공시 사항
유럽 특허가 청구된 그들 지정국과 관련하여, 기탁된 미생물의 시료는 유럽 특허의 허여에 관한 의사가 공개될 때까지 또는 취하되거나 취하 간주된 날 까지만, 시료 분양을 신청한자에 의해 지정된 전문인에게 분양함으로써 이용될 수 있다. (EPC 규약 28(4))
D. 공시 사항이 적용되는 지정국

E. 공시 사항의 별도 공급
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기탁된 미생물에 관한 공시사항

(PCT 규칙 13bis)

A. 하기 공시사항은 명세서 제5면, 제22행에 언급된 미생물에 관한 것이다.
B. 기탁의표시
기탁 기관 명칭 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)
기탁 기관 주소 미합중국 20110 - 2209 버지니아주 마나싸스 유니버시티 불바드 10801
기탁일 1997년 11월 25일	기탁 번호 ATCC 98597
C. 추가 공시 사항
유럽 특허가 청구된 그들 지정국과 관련하여, 기탁된 미생물의 시료는 유럽 특허의 허여에 관한 의사가 공개될 때까지 또는 취하되거나 취하 간주된 날 까지만, 시료 분양을 신청한자에 의해 지정된 전문인에게 분양함으로써 이용될 수 있다. (EPC 규약 28(4))
D. 공시 사항이 적용되는 지정국

E. 공시 사항의 별도 공급
하기 공시사항은 후에 국제사무국에 제출될 것이다.
수리관청용임이 서류는 국제 출원과 함께 출원시 접수되었음을 확인함.	국제사무국용임이 서류는 국제사무국에 의하여 접수됨.
권한을 받은 관리서명	권한을 받은 관리

기탁된 미생물에 관한 공시사항

(PCT 규칙 13bis)

A. 하기 공시사항은 명세서 제5면, 제23행에 언급된 미생물에 관한 것이다.
B. 기탁의표시
기탁 기관 명칭 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)
기탁 기관 주소 미합중국 20110 - 2209 버지니아주 마나싸스 유니버시티 불바드 10801
기탁일 1997년 11월 25일	기탁 번호 ATCC 98598
C. 추가 공시 사항
유럽 특허가 청구된 그들 지정국과 관련하여, 기탁된 미생물의 시료는 유럽 특허의 허여에 관한 의사가 공개될 때까지 또는 취하되거나 취하 간주된 날 까지만, 시료 분양을 신청한자에 의해 지정된 전문인에게 분양함으로써 이용될 수 있다. (EPC 규약 28(4))
D. 공시 사항이 적용되는 지정국

E. 공시 사항의 별도 공급
하기 공시사항은 후에 국제사무국에 제출될 것이다.
수리관청용임이 서류는 국제 출원과 함께 출원시 접수되었음을 확인함.	국제사무국용임이 서류는 국제사무국에 의하여 접수됨.
권한을 받은 관리서명	권한을 받은 관리

〈110〉 E.I.Du Pont de Nemours and Company

Genecor International, Inc.

〈120〉 Method for the production of glycerol by recombinant organisms

〈130〉 002902

〈150〉 US 08/982,783

〈151〉 1997-12-02

〈160〉 45

〈170〉 KOPATIN 1.5

〈210〉 1

〈211〉 1380

〈212〉 DNA

〈213〉 Saccharomyces

〈400〉 1

ctttaatttt cttttatctt actctcctac ataagacatc aagaaacaat tgtatattgt 60

acaccccccc cctccacaaa cacaaatatt gataatataa agatgtctgc tgctgctgat 120

agattaaact taacttccgg ccacttgaat gctggtagaa agagaagttc ctcttctgtt 180

tctttgaagg ctgccgaaaa gcctttcaag gttactgtga ttggatctgg taactggggt 240

actactattg ccaaggtggt tgccgaaaat tgtaagggat acccagaagt tttcgctcca 300

atagtacaaa tgtgggtgtt cgaagaagag atcaatggtg aaaaattgac tgaaatcata 360

aatactagac atcaaaacgt gaaatacttg cctggcatca ctctacccga caatttggtt 420

gctaatccag acttgattga ttcagtcaag gatgtcgaca tcatcgtttt caacattcca 480

catcaatttt tgccccgtat ctgtagccaa ttgaaaggtc atgttgattc acacgtcaga 540

gctatctcct gtctaaaggg ttttgaagtt ggtgctaaag gtgtccaatt gctatcctct 600

tacatcactg aggaactagg tattcaatgt ggtgctctat ctggtgctaa cattgccacc 660

gaagtcgctc aagaacactg gtctgaaaca acagttgctt accacattcc aaaggatttc 720

agaggcgagg gcaaggacgt cgaccataag gttctaaagg ccttgttcca cagaccttac 780

ttccacgtta gtgtcatcga agatgttgct ggtatctcca tctgtggtgc tttgaagaac 840

gttgttgcct taggttgtgg tttcgtcgaa ggtctaggct ggggtaacaa cgcttctgct 900

gccatccaaa gagtcggttt gggtgagatc atcagattcg gtcaaatgtt tttcccagaa 960

tctagagaag aaacatacta ccaagagtct gctggtgttg ctgatttgat caccacctgc 1020

gctggtggta gaaacgtcaa ggttgctagg ctaatggcta cttctggtaa ggacgcctgg 1080

gaatgtgaaa aggagttgtt gaatggccaa tccgctcaag gtttaattac ctgcaaagaa 1140

gttcacgaat ggttggaaac atgtggctct gtcgaagact tcccattatt tgaagccgta 1200

taccaaatcg tttacaacaa ctacccaatg aagaacctgc cggacatgat tgaagaatta 1260

gatctacatg aagattagat ttattggaga aagataacat atcatacttc ccccactttt 1320

ttcgaggctc ttctatatca tattcataaa ttagcattat gtcatttctc ataactactt 1380

1380

〈210〉 2

〈211〉 2946

〈212〉 DNA

〈213〉 Saccharomyces

〈400〉 2

gaattcgagc ctgaagtgct gattaccttc aggtagactt catcttgacc catcaacccc 60

agcgtcaatc ctgcaaatac accacccagc agcactagga tgatagagat aatatagtac 120

gtggtaacgc ttgcctcatc acctacgcta tggccggaat cggcaacatc cctagaattg 180

agtacgtgtg atccggataa caacggcagt gaatatatct tcggtatcgt aaagatgtga 240

tataagatga tgtataccca atgaggagcg cctgatcgtg acctagacct tagtggcaaa 300

aacgacatat ctattatagt ggggagagtt tcgtgcaaat aacagacgca gcagcaagta 360

actgtgacga tatcaactct ttttttatta tgtaataagc aaacaagcac gaatggggaa 420

agcctatgtg caatcaccaa ggtcgtccct tttttcccat ttgctaattt agaatttaaa 480

gaaaccaaaa gaatgaagaa agaaaacaaa tactagccct aaccctgact tcgtttctat 540

gataataccc tgctttaatg aacggtatgc cctagggtat atctcactct gtacgttaca 600

aactccggtt attttatcgg aacatccgag cacccgcgcc ttcctcaacc caggcaccgc 660

cccaggtaac cgtgcgcgat gagctaatcc tgagccatca cccaccccac ccgttgatga 720

cagcaattcg ggagggcgaa aataaaactg gagcaaggaa ttaccatcac cgtcaccatc 780

accatcatat cgccttagcc tctagccata gccatcatgc aagcgtgtat cttctaagat 840

tcagtcatca tcattaccga gtttgttttc cttcacatga tgaagaaggt ttgagtatgc 900

tcgaaacaat aagacgacga tggctctgcc attggttata ttacgctttt gcggcgaggt 960

gccgatgggt tgctgagggg aagagtgttt agcttacgga cctattgcca ttgttattcc 1020

gattaatcta ttgttcagca gctcttctct accctgtcat tctagtattt tttttttttt 1080

tttttggttt tacttttttt tcttcttgcc tttttttctt gttacttttt ttctagtttt 1140

ttttccttcc actaagcttt ttccttgatt tatccttggg ttcttctttc tactccttta 1200

gatttttttt ttatatatta atttttaagt ttatgtattt tggtagattc aattctcttt 1260

ccctttcctt ttccttcgct ccccttcctt atcaatgctt gctgtcagaa gattaacaag 1320

atacacattc cttaagcgaa cgcatccggt gttatatact cgtcgtgcat ataaaatttt 1380

gccttcaaga tctactttcc taagaagatc attattacaa acacaactgc actcaaagat 1440

gactgctcat actaatatca aacagcacaa acactgtcat gaggaccatc ctatcagaag 1500

atcggactct gccgtgtcaa ttgtacattt gaaacgtgcg cccttcaagg ttacagtgat 1560

tggttctggt aactggggga ccaccatcgc caaagtcatt gcggaaaaca cagaattgca 1620

ttcccatatc ttcgagccag aggtgagaat gtgggttttt gatgaaaaga tcggcgacga 1680

aaatctgacg gatatcataa atacaagaca ccagaacgtt aaatatctac ccaatattga 1740

cctgccccat aatctagtgg ccgatcctga tcttttacac tccatcaagg gtgctgacat 1800

ccttgttttc aacatccctc atcaattttt accaaacata gtcaaacaat tgcaaggcca 1860

cgtggcccct catgtaaggg ccatctcgtg tctaaaaggg ttcgagttgg gctccaaggg 1920

tgtgcaattg ctatcctcct atgttactga tgagttagga atccaatgtg gcgcactatc 1980

tggtgcaaac ttggcaccgg aagtggccaa ggagcattgg tccgaaacca ccgtggctta 2040

ccaactacca aaggattatc aaggtgatgg caaggatgta gatcataaga ttttgaaatt 2100

gctgttccac agaccttact tccacgtcaa tgtcatcgat gatgttgctg gtatatccat 2160

tgccggtgcc ttgaagaacg tcgtggcact tgcatgtggt ttcgtagaag gtatgggatg 2220

gggtaacaat gcctccgcag ccattcaaag gctgggttta ggtgaaatta tcaagttcgg 2280

tagaatgttt ttcccagaat ccaaagtcga gacctactat caagaatccg ctggtgttgc 2340

agatctgatc accacctgct caggcggtag aaacgtcaag gttgccacat acatggccaa 2400

gaccggtaag tcagccttgg aagcagaaaa ggaattgctt aacggtcaat ccgcccaagg 2460

gataatcaca tgcagagaag ttcacgagtg gctacaaaca tgtgagttga cccaagaatt 2520

cccaattatt cgaggcagtc taccagatag tctacaacaa cgtccgcatg gaagacctac 2580

cggagatgat tgaagagcta gacatcgatg acgaatagac actctccccc cccctccccc 2640

tctgatcttt cctgttgcct ctttttcccc caaccaattt atcattatac acaagttcta 2700

caactactac tagtaacatt actacagtta ttataatttt ctattctctt tttctttaag 2760

aatctatcat taacgttaat ttctatatat acataactac cattatacac gctattatcg 2820

tttacatatc acatcaccgt taatgaaaga tacgacaccc tgtacactaa cacaattaaa 2880

taatcgccat aaccttttct gttatctata gcccttaaag ctgtttcttc gagcttttca 2940

ctgcag 2946

〈210〉 3

〈211〉 3178

〈212〉 DNA

〈400〉 3

ctgcagaact tcgtctgctc tgtgcccatc ctcgcggtta gaaagaagct gaattgtttc 60

atgcgcaagg gcatcagcga gtgaccaata atcactgcac taattccttt ttagcaacac 120

atacttatat acagcaccag accttatgtc ttttctctgc tccgatacgt tatcccaccc 180

aacttttatt tcagttttgg caggggaaat ttcacaaccc cgcacgctaa aaatcgtatt 240

taaacttaaa agagaacagc cacaaatagg gaactttggt ctaaacgaag gactctccct 300

cccttatctt gaccgtgcta ttgccatcac tgctacaaga ctaaatacgt actaatatat 360

gttttcggta acgagaagaa gagctgccgg tgcagctgct gccatggcca cagccacggg 420

gacgctgtac tggatgacta gccaaggtga taggccgtta gtgcacaatg acccgagcta 480

catggtgcaa ttccccaccg ccgctccacc ggcaggtctc tagacgagac ctgctggacc 540

gtctggacaa gacgcatcaa ttcgacgtgt tgatcatcgg tggcggggcc acggggacag 600

gatgtgccct agatgctgcg accaggggac tcaatgtggc ccttgttgaa aagggggatt 660

ttgcctcggg aacgtcgtcc aaatctacca agatgattca cggtggggtg cggtacttag 720

agaaggcctt ctgggagttc tccaaggcac aactggatct ggtcatcgag gcactcaacg 780

agcgtaaaca tcttatcaac actgcccctc acctgtgcac ggtgctacca attctgatcc 840

ccatctacag cacctggcag gtcccgtaca tctatatggg ctgtaaattc tacgatttct 900

ttggcggttc ccaaaacttg aaaaaatcat acctactgtc caaatccgcc accgtggaga 960

aggctcccat gcttaccaca gacaatttaa aggcctcgct tgtgtaccat gatgggtcct 1020

ttaacgactc gcgtttgaac gccactttag ccatcacggg tgtggagaac ggcgctaccg 1080

tcttgatcta tgtcgaggta caaaaattga tcaaagaccc aacttctggt aaggttatcg 1140

gtgccgaggc ccgggacgtt gagactaatg agcttgtcag aatcaacgct aaatgtgtgg 1200

tcaatgccac gggcccatac agtgacgcca ttttgcaaat ggaccgcaac ccatccggtc 1260

tgccggactc cccgctaaac gacaactcca agatcaagtc gactttcaat caaatctccg 1320

tcatggaccc gaaaatggtc atcccatcta ttggcgttca catcgtattg ccctcttttt 1380

actccccgaa ggatatgggt ttgttggacg tcagaacctc tgatggcaga gtgatgttct 1440

ttttaccttg gcagggcaaa gtccttgccg gcaccacaga catcccacta aagcaagtcc 1500

cagaaaaccc tatgcctaca gaggctgata ttcaagatat cttgaaagaa ctacagcact 1560

atatcgaatt ccccgtgaaa agagaagacg tgctaagtgc atgggctggt gtcagacctt 1620

tggtcagaga tccacgtaca atccccgcag acgggaagaa gggctctgcc actcagggcg 1680

tggtaagatc ccacttcttg ttcacttcgg ataatggcct aattactatt gcaggtggta 1740

aatggactac ttacagacaa atggctgagg aaacagtcga caaagttgtc gaagttggcg 1800

gattccacaa cctgaaacct tgtcacacaa gagatattaa gcttgctggt gcagaagaat 1860

ggacgcaaaa ctatgtggct ttattggctc aaaactacca tttatcatca aaaatgtcca 1920

actacttggt tcaaaactac ggaacccgtt cctctatcat ttgcgaattt ttcaaagaat 1980

ccatggaaaa taaactgcct ttgtccttag ccgacaagga aaataacgta atctactcta 2040

gcgaggagaa caacttggtc aattttgata ctttcagata tccattcaca atcggtgagt 2100

taaagtattc catgcagtac gaatattgta gaactccctt ggacttcctt ttaagaagaa 2160

caagattcgc cttcttggac gccaaggaag ctttgaatgc cgtgcatgcc accgtcaaag 2220

ttatgggtga tgagttcaat tggtcggaga aaaagaggca gtgggaactt gaaaaaactg 2280

tgaacttcat ccaaggacgt ttcggtgtct aaatcgatca tgatagttaa gggtgacaaa 2340

gataacattc acaagagtaa taataatggt aatgatgata ataataataa tgatagtaat 2400

aacaataata ataatggtgg taatggcaat gaaatcgcta ttattaccta ttttccttaa 2460

tggaagagtt aaagtaaact aaaaaaacta caaaaatata tgaagaaaaa aaaaaaaaga 2520

ggtaatagac tctactacta caattgatct tcaaattatg accttcctag tgtttatatt 2580

ctatttccaa tacataatat aatctatata atcattgctg gtagacttcc gttttaatat 2640

cgttttaatt atccccttta tctctagtct agttttatca taaaatatag aaacactaaa 2700

taatattctt caaacggtcc tggtgcatac gcaatacata tttatggtgc aaaaaaaaaa 2760

atggaaaatt ttgctagtca taaacccttt cataaaacaa tacgtagaca tcgctacttg 2820

aaattttcaa gtttttatca gatccatgtt tcctatctgc cttgacaacc tcatcgtcga 2880

aatagtacca tttagaacgc ccaatattca cattgtgttc aaggtcttta ttcaccagtg 2940

acgtgtaatg gccatgatta atgtgcctgt atggttaacc actccaaata gcttatattt 3000

catagtgtca ttgtttttca atataatgtt tagtatcaat ggatatgtta cgacggtgtt 3060

atttttcttg gtcaaatcgt aataaaatct cgataaatgg atgactaaga tttttggtaa 3120

agttacaaaa tttatcgttt tcactgttgt caattttttg ttcttgtaat cactcgag 3178

〈210〉 4

〈211〉 816

〈212〉 DNA

〈400〉 4

atgaaacgtt tcaatgtttt aaaatatatc agaacaacaa aagcaaatat acaaaccatc 60

gcaatgcctt tgaccacaaa acctttatct ttgaaaatca acgccgctct attcgatgtt 120

gacggtacca tcatcatctc tcaaccagcc attgctgctt tctggagaga tttcggtaaa 180

gacaagcctt acttcgatgc cgaacacgtt attcacatct ctcacggttg gagaacttac 240

gatgccattg ccaagttcgc tccagacttt gctgatgaag aatacgttaa caagctagaa 300

ggtgaaatcc cagaaaagta cggtgaacac tccatcgaag ttccaggtgc tgtcaagttg 360

tgtaatgctt tgaacgcctt gccaaaggaa aaatgggctg tcgccacctc tggtacccgt 420

gacatggcca agaaatggtt cgacattttg aagatcaaga gaccagaata cttcatcacc 480

gccaatgatg tcaagcaagg taagcctcac ccagaaccat acttaaaggg tagaaacggt 540

ttgggtttcc caattaatga acaagaccca tccaaatcta aggttgttgt ctttgaagac 600

gcaccagctg gtattgctgc tggtaaggct gctggctgta aaatcgttgg tattgctacc 660

actttcgatt tggacttctt gaaggaaaag ggttgtgaca tcattgtcaa gaaccacgaa 720

tctatcagag tcggtgaata caacgctgaa accgatgaag tcgaattgat ctttgatgac 780

tacttatacg ctaaggatga cttgttgaaa tggtaa 816

〈210〉 5

〈211〉 753

〈212〉 DNA

〈213〉 Saccharomyces cerevisiae

〈400〉 5

atgggattga ctactaaacc tctatctttg aaagttaacg ccgctttgtt cgacgtcgac 60

ggtaccatta tcatctctca accagccatt gctgcattct ggagggattt cggtaaggac 120

aaaccttatt tcgatgctga acacgttatc caagtctcgc atggttggag aacgtttgat 180

gccattgcta agttcgctcc agactttgcc aatgaagagt atgttaacaa attagaagct 240

gaaattccgg tcaagtacgg tgaaaaatcc attgaagtcc caggtgcagt taagctgtgc 300

aacgctttga acgctctacc aaaagagaaa tgggctgtgg caacttccgg tacccgtgat 360

atggcacaaa aatggttcga gcatctggga atcaggagac caaagtactt cattaccgct 420

aatgatgtca aacagggtaa gcctcatcca gaaccatatc tgaagggcag gaatggctta 480

ggatatccga tcaatgagca agacccttcc aaatctaagg tagtagtatt tgaagacgct 540

ccagcaggta ttgccgccgg aaaagccgcc ggttgtaaga tcattggtat tgccactact 600

ttcgacttgg acttcctaaa ggaaaaaggc tgtgacatca ttgtcaaaaa ccacgaatcc 660

atcagagttg gcggctacaa tgccgaaaca gacgaagttg aattcatttt tgacgactac 720

ttatatgcta aggacgatct gttgaaatgg taa 753

〈210〉 6

〈211〉 391

〈212〉 PRT

〈213〉 Saccharomyces

〈400〉 6

Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn

1 5 10 15

Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu

20 25 30

Lys Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr

35 40 45

Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe

50 55 60

Ala Pro Ile Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Glu Ile Asn Gly Glu

65 70 75 80

Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu

85 90 95

Pro Gly Ile Thr Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile

100 105 110

Asp Ser Val Lys Asp Val Asp Ile Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln

115 120 125

Phe Leu Pro Arg Ile Cys Ser Gln Leu Lys Gly His Val Asp Ser His

130 135 140

Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Ala Lys Gly

145 150 155 160

Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Glu Glu Leu Gly Ile Gln Cys

165 170 175

Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His

180 185 190

Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr His Ile Pro Lys Asp Phe Arg Gly

195 200 205

Glu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg

210 215 220

Pro Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile

225 230 235 240

Cys Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu

245 250 255

Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly

260 265 270

Leu Gly Glu Ile Ile Arg Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu Ser Arg

275 280 285

Glu Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr

290 295 300

Thr Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Leu Met Ala Thr

305 310 315 320

Ser Gly Lys Asp Ala Trp Glu Cys Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln

325 330 335

Ser Ala Gln Gly Leu Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu

340 345 350

Thr Cys Gly Ser Val Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln

355 360 365

Ile Val Tyr Asn Asn Tyr Pro Met Lys Asn Leu Pro Asp Met Ile Glu

370 375 380

Glu Leu Asp Leu His Glu Asp

385 390

〈210〉 7

〈211〉 2520

〈212〉 DNA

〈213〉 Saccharomyces

〈400〉 7

tgtattggcc acgataacca ccctttgtat actgtttttg tttttcacat ggtaaataac 60

gacttttatt aaacaacgta tgtaaaaaca taacaagaat ctacccatac aggccatttc 120

gtaattcttc tcttctaatt ggagtaaaac catcaattaa agggtgtgga gtagcatagt 180

gaggggctga ctgcattgac aaaaaaattg aaaaaaaaaa aggaaaagga aaggaaaaaa 240

agacagccaa gacttttaga acggataagg tgtaataaaa tgtgggggga tgcctgttct 300

cgaaccatat aaaatatacc atgtggtttg agttgtggcc ggaactatac aaatagttat 360

atgtttccct ctctcttccg acttgtagta ttctccaaac gttacatatt ccgatcaagc 420

cagcgccttt acactagttt aaaacaagaa cagagccgta tgtccaaaat aatggaagat 480

ttacgaagtg actacgtccc gcttatcgcc agtattgatg taggaacgac ctcatccaga 540

tgcattctgt tcaacagatg gggccaggac gtttcaaaac accaaattga atattcaact 600

tcagcatcga agggcaagat tggggtgtct ggcctaagga gaccctctac agccccagct 660

cgtgaaacac caaacgccgg tgacatcaaa accagcggaa agcccatctt ttctgcagaa 720

ggctatgcca ttcaagaaac caaattccta aaaatcgagg aattggactt ggacttccat 780

aacgaaccca cgttgaagtt ccccaaaccg ggttgggttg agtgccatcc gcagaaatta 840

ctggtgaacg tcgtccaatg ccttgcctca agtttgctct ctctgcagac tatcaacagc 900

gaacgtgtag caaacggtct cccaccttac aaggtaatat gcatgggtat agcaaacatg 960

agagaaacca caattctgtg gtcccgccgc acaggaaaac caattgttaa ctacggtatt 1020

gtttggaacg acaccagaac gatcaaaatc gttagagaca aatggcaaaa cactagcgtc 1080

gataggcaac tgcagcttag acagaagact ggattgccat tgctctccac gtatttctcc 1140

tgttccaagc tgcgctggtt cctcgacaat gagcctctgt gtaccaaggc gtatgaggag 1200

aacgacctga tgttcggcac tgtggacaca tggctgattt accaattaac taaacaaaag 1260

gcgttcgttt ctgacgtaac caacgcttcc agaactggat ttatgaacct ctccacttta 1320

aagtacgaca acgagttgct ggaattttgg ggtattgaca agaacctgat tcacatgccc 1380

gaaattgtgt cctcatctca atactacggt gactttggca ttcctgattg gataatggaa 1440

aagctacacg attcgccaaa aacagtactg cgagatctag tcaagagaaa cctgcccata 1500

cagggctgtc tgggcgacca aagcgcatcc atggtggggc aactcgctta caaacccggt 1560

gctgcaaaat gtacttatgg taccggttgc tttttactgt acaatacggg gaccaaaaaa 1620

ttgatctccc aacatggcgc actgacgact ctagcatttt ggttcccaca tttgcaagag 1680

tacggtggcc aaaaaccaga attgagcaag ccacattttg cattagaggg ttccgtcgct 1740

gtggctggtg ctgtggtcca atggctacgt gataatttac gattgatcga taaatcagag 1800

gatgtcggac cgattgcatc tacggttcct gattctggtg gcgtagtttt cgtccccgca 1860

tttagtggcc tattcgctcc ctattgggac ccagatgcca gagccaccat aatggggatg 1920

tctcaattca ctactgcctc ccacatcgcc agagctgccg tggaaggtgt ttgctttcaa 1980

gccagggcta tcttgaaggc aatgagttct gacgcgtttg gtgaaggttc caaagacagg 2040

gactttttag aggaaatttc cgacgtcaca tatgaaaagt cgcccctgtc ggttctggca 2100

gtggatggcg ggatgtcgag gtctaatgaa gtcatgcaaa ttcaagccga tatcctaggt 2160

ccctgtgtca aagtcagaag gtctccgaca gcggaatgta ccgcattggg ggcagccatt 2220

gcagccaata tggctttcaa ggatgtgaac gagcgcccat tatggaagga cctacacgat 2280

gttaagaaat gggtctttta caatggaatg gagaaaaacg aacaaatatc accagaggct 2340

catccaaacc ttaagatatt cagaagtgaa tccgacgatg ctgaaaggag aaagcattgg 2400

aagtattggg aagttgccgt ggaaagatcc aaaggttggc tgaaggacat agaaggtgaa 2460

cacgaacagg ttctagaaaa cttccaataa caacataaat aatttctatt aacaatgtaa 2520

2520

〈210〉 8

〈211〉 384

〈212〉 PRT

〈213〉 Saccharomyces

〈400〉 8

Met Thr Ala His Thr Asn Ile Lys Gln His Lys His Cys His Glu Asp

1 5 10 15

His Pro Ile Arg Arg Ser Asp Ser Ala Val Ser Ile Val His Leu Lys

20 25 30

Arg Ala Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr

35 40 45

Thr Ile Ala Lys Val Ile Ala Glu Asn Thr Glu Leu His Ser His Ile

50 55 60

Phe Glu Pro Glu Val Arg Met Trp Val Phe Asp Glu Lys Ile Gly Asp

65 70 75 80

Glu Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr

85 90 95

Leu Pro Asn Ile Asp Leu Pro His Asn Leu Val Ala Asp Pro Asp Leu

100 105 110

Leu His Ser Ile Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Phe Asn Ile Pro His

115 120 125

Gln Phe Leu Pro Asn Ile Val Lys Gln Leu Gln Gly His Val Ala Pro

130 135 140

His Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Leu Gly Ser Lys

145 150 155 160

Gly Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Val Thr Asp Glu Leu Gly Ile Gln

165 170 175

Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu

180 185 190

His Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Leu Pro Lys Asp Tyr Gln

195 200 205

Gly Asp Gly Lys Asp Val Asp His Lys Ile Leu Lys Leu Leu Phe His

210 215 220

Arg Pro Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser

225 230 235 240

Ile Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Ala Cys Gly Phe Val

245 250 255

Glu Gly Met Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Leu

260 265 270

Gly Leu Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser

275 280 285

Lys Val Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile

290 295 300

Thr Thr Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Thr Tyr Met Ala

305 310 315 320

Lys Thr Gly Lys Ser Ala Leu Glu Ala Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly

325 330 335

Gln Ser Ala Gln Gly Ile Ile Thr Cys Arg Glu Val His Glu Trp Leu

340 345 350

Gln Thr Cys Glu Leu Thr Gln Glu Phe Pro Ile Ile Arg Gly Ser Leu

355 360 365

Pro Asp Ser Leu Gln Gln Arg Pro His Gly Arg Pro Thr Gly Asp Asp

370 375 380

〈210〉 9

〈211〉 614

〈212〉 PRT

〈400〉 9

Met Thr Arg Ala Thr Trp Cys Asn Ser Pro Pro Pro Leu His Arg Gln

1 5 10 15

Val Ser Arg Arg Asp Leu Leu Asp Arg Leu Asp Lys Thr His Gln Phe

20 25 30

Asp Val Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ala Thr Gly Thr Gly Cys Ala Leu

35 40 45

Asp Ala Ala Thr Arg Gly Leu Asn Val Ala Leu Val Glu Lys Gly Asp

50 55 60

Phe Ala Ser Gly Thr Ser Ser Lys Ser Thr Lys Met Ile His Gly Gly

65 70 75 80

Val Arg Tyr Leu Glu Lys Ala Phe Trp Glu Phe Ser Lys Ala Gln Leu

85 90 95

Asp Leu Val Ile Glu Ala Leu Asn Glu Arg Lys His Leu Ile Asn Thr

100 105 110

Ala Pro His Leu Cys Thr Val Leu Pro Ile Leu Ile Pro Ile Tyr Ser

115 120 125

Thr Trp Gln Val Pro Tyr Ile Tyr Met Gly Cys Lys Phe Tyr Asp Phe

130 135 140

Phe Gly Gly Ser Gln Asn Leu Lys Lys Ser Tyr Leu Leu Ser Lys Ser

145 150 155 160

Ala Thr Val Glu Lys Ala Pro Met Leu Thr Thr Asp Asn Leu Lys Ala

165 170 175

Ser Leu Val Tyr His Asp Gly Ser Phe Asn Asp Ser Arg Leu Asn Ala

180 185 190

Thr Leu Ala Ile Thr Gly Val Glu Asn Gly Ala Thr Val Leu Ile Tyr

195 200 205

Val Glu Val Gln Lys Leu Ile Lys Asp Pro Thr Ser Gly Lys Val Ile

210 215 220

Gly Ala Glu Ala Arg Asp Val Glu Thr Asn Glu Leu Val Arg Ile Asn

225 230 235 240

Ala Lys Cys Val Val Asn Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Asp Ala Ile Leu

245 250 255

Gln Met Asp Arg Asn Pro Ser Gly Leu Pro Asp Ser Pro Leu Asn Asp

260 265 270

Asn Ser Lys Ile Lys Ser Thr Phe Asn Gln Ile Ser Val Met Asp Pro

275 280 285

Lys Met Val Ile Pro Ser Ile Gly Val His Ile Val Leu Pro Ser Phe

290 295 300

Tyr Ser Pro Lys Asp Met Gly Leu Leu Asp Val Arg Thr Ser Asp Gly

305 310 315 320

Arg Val Met Phe Phe Leu Pro Trp Gln Gly Lys Val Leu Ala Gly Thr

325 330 335

Thr Asp Ile Pro Leu Lys Gln Val Pro Glu Asn Pro Met Pro Thr Glu

340 345 350

Ala Asp Ile Gln Asp Ile Leu Lys Glu Leu Gln His Tyr Ile Glu Phe

355 360 365

Pro Val Lys Arg Glu Asp Val Leu Ser Ala Trp Ala Gly Val Arg Pro

370 375 380

Leu Val Arg Asp Pro Arg Thr Ile Pro Ala Asp Gly Lys Lys Gly Ser

385 390 395 400

Ala Thr Gln Gly Val Val Arg Ser His Phe Leu Phe Thr Ser Asp Asn

405 410 415

Gly Leu Ile Thr Ile Ala Gly Gly Lys Trp Thr Thr Tyr Arg Gln Met

420 425 430

Ala Glu Glu Thr Val Asp Lys Val Val Glu Val Gly Gly Phe His Asn

435 440 445

Leu Lys Pro Cys His Thr Arg Asp Ile Lys Leu Ala Gly Ala Glu Glu

450 455 460

Trp Thr Gln Asn Tyr Val Ala Leu Leu Ala Gln Asn Tyr His Leu Ser

465 470 475 480

Ser Lys Met Ser Asn Tyr Leu Val Gln Asn Tyr Gly Thr Arg Ser Ser

485 490 495

Ile Ile Cys Glu Phe Phe Lys Glu Ser Met Glu Asn Lys Leu Pro Leu

500 505 510

Ser Leu Ala Asp Lys Glu Asn Asn Val Ile Tyr Ser Ser Glu Glu Asn

515 520 525

Asn Leu Val Asn Phe Asp Thr Phe Arg Tyr Pro Phe Thr Ile Gly Glu

530 535 540

Leu Lys Tyr Ser Met Gln Tyr Glu Tyr Cys Arg Thr Pro Leu Asp Phe

545 550 555 560

Leu Leu Arg Arg Thr Arg Phe Ala Phe Leu Asp Ala Lys Glu Ala Leu

565 570 575

Asn Ala Val His Ala Thr Val Lys Val Met Gly Asp Glu Phe Asn Trp

580 585 590

Ser Glu Lys Lys Arg Gln Trp Glu Leu Glu Lys Thr Val Asn Phe Ile

595 600 605

Gln Gly Arg Phe Gly Val

610

〈210〉 10

〈211〉 339

〈212〉 PRT

〈400〉 10

Met Asn Gln Arg Asn Ala Ser Met Thr Val Ile Gly Ala Gly Ser Tyr

1 5 10 15

Gly Thr Ala Leu Ala Ile Thr Leu Ala Arg Asn Gly His Glu Val Val

20 25 30

Leu Trp Gly His Asp Pro Glu His Ile Ala Thr Leu Glu Arg Asp Arg

35 40 45

Cys Asn Ala Ala Phe Leu Pro Asp Val Pro Phe Pro Asp Thr Leu His

50 55 60

Leu Glu Ser Asp Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ala Ser Arg Asn Ile Leu

65 70 75 80

Val Val Val Pro Ser His Val Phe Gly Glu Val Leu Arg Gln Ile Lys

85 90 95

Pro Leu Met Arg Pro Asp Ala Arg Leu Val Trp Ala Thr Lys Gly Leu

100 105 110

Glu Ala Glu Thr Gly Arg Leu Leu Gln Asp Val Ala Arg Glu Ala Leu

115 120 125

Gly Asp Gln Ile Pro Leu Ala Val Ile Ser Gly Pro Thr Phe Ala Lys

130 135 140

Glu Leu Ala Ala Gly Leu Pro Thr Ala Ile Ser Leu Ala Ser Thr Asp

145 150 155 160

Gln Thr Phe Ala Asp Asp Leu Gln Gln Leu Leu His Cys Gly Lys Ser

165 170 175

Phe Arg Val Tyr Ser Asn Pro Asp Phe Ile Gly Val Gln Leu Gly Gly

180 185 190

Ala Val Lys Asn Val Ile Ala Ile Gly Ala Gly Met Ser Asp Gly Ile

195 200 205

Gly Phe Gly Ala Asn Ala Arg Thr Ala Leu Ile Thr Arg Gly Leu Ala

210 215 220

Glu Met Ser Arg Leu Gly Ala Ala Leu Gly Ala Asp Pro Ala Thr Phe

225 230 235 240

Met Gly Met Ala Gly Leu Gly Asp Leu Val Leu Thr Cys Thr Asp Asn

245 250 255

Gln Ser Arg Asn Arg Arg Phe Gly Met Met Leu Gly Gln Gly Met Asp

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Val Gln Ser Ala Gln Glu Lys Ile Gly Gln Val Val Glu Gly Tyr Arg

275 280 285

Asn Thr Lys Glu Val Arg Glu Leu Ala His Arg Phe Gly Val Glu Met

290 295 300

Pro Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Gln Val Leu Tyr Cys Gly Lys Asn Ala

305 310 315 320

Arg Glu Ala Ala Leu Thr Leu Leu Gly Arg Ala Arg Lys Asp Glu Arg

325 330 335

Ser Ser His

〈210〉 11

〈211〉 501

〈212〉 PRT

〈400〉 11

Met Glu Thr Lys Asp Leu Ile Val Ile Gly Gly Gly Ile Asn Gly Ala

1 5 10 15

Gly Ile Ala Ala Asp Ala Ala Gly Arg Gly Leu Ser Val Leu Met Leu

20 25 30

Glu Ala Gln Asp Leu Ala Cys Ala Thr Ser Ser Ala Ser Ser Lys Leu

35 40 45

Ile His Gly Gly Leu Arg Tyr Leu Glu His Tyr Glu Phe Arg Leu Val

50 55 60

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65 70 75 80

Ile Ala Phe Pro Met Arg Phe Arg Leu Pro His Arg Pro His Leu Arg

85 90 95

Pro Ala Trp Met Ile Arg Ile Gly Leu Phe Met Tyr Asp His Leu Gly

100 105 110

Lys Arg Thr Ser Leu Pro Gly Ser Thr Gly Leu Arg Phe Gly Ala Asn

115 120 125

Ser Val Leu Lys Pro Glu Ile Lys Arg Gly Phe Glu Tyr Ser Asp Cys

130 135 140

Trp Val Asp Asp Ala Arg Leu Val Leu Ala Asn Ala Gln Met Val Val

145 150 155 160

Arg Lys Gly Gly Glu Val Leu Thr Arg Thr Arg Ala Thr Ser Ala Arg

165 170 175

Arg Glu Asn Gly Leu Trp Ile Val Glu Ala Glu Asp Ile Asp Thr Gly

180 185 190

Lys Lys Tyr Ser Trp Gln Ala Arg Gly Leu Val Asn Ala Thr Gly Pro

195 200 205

Trp Val Lys Gln Phe Phe Asp Asp Gly Met His Leu Pro Ser Pro Tyr

210 215 220

Gly Ile Arg Leu Ile Lys Gly Ser His Ile Val Val Pro Arg Val His

225 230 235 240

Thr Gln Lys Gln Ala Tyr Ile Leu Gln Asn Glu Asp Lys Arg Ile Val

245 250 255

Phe Val Ile Pro Trp Met Asp Glu Phe Ser Ile Ile Gly Thr Thr Asp

260 265 270

Val Glu Tyr Lys Gly Asp Pro Lys Ala Val Lys Ile Glu Glu Ser Glu

275 280 285

Ile Asn Tyr Leu Leu Asn Val Tyr Asn Thr His Phe Lys Lys Gln Leu

290 295 300

Ser Arg Asp Asp Ile Val Trp Thr Tyr Ser Gly Val Arg Pro Leu Cys

305 310 315 320

Asp Asp Glu Ser Asp Ser Pro Gln Ala Ile Thr Arg Asp Tyr Thr Leu

325 330 335

Asp Ile His Asp Glu Asn Gly Lys Ala Pro Leu Leu Ser Val Phe Gly

340 345 350

Gly Lys Leu Thr Thr Tyr Arg Lys Leu Ala Glu His Ala Leu Glu Lys

355 360 365

Leu Thr Pro Tyr Tyr Gln Gly Ile Gly Pro Ala Trp Thr Lys Glu Ser

370 375 380

Val Leu Pro Gly Gly Ala Ile Glu Gly Asp Arg Asp Asp Tyr Ala Ala

385 390 395 400

Arg Leu Arg Arg Arg Tyr Pro Phe Leu Thr Glu Ser Leu Ala Arg His

405 410 415

Tyr Ala Arg Thr Tyr Gly Ser Asn Ser Glu Leu Leu Leu Gly Asn Ala

420 425 430

Gly Thr Val Ser Asp Leu Gly Glu Asp Phe Gly His Glu Phe Tyr Glu

435 440 445

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465 470 475 480

Gln Gln Ser Arg Val Ser Gln Trp Leu Val Glu Tyr Thr Gln Gln Arg

485 490 495

Leu Ser Leu Ala Ser

500

〈210〉 12

〈211〉 542

〈212〉 PRT

〈400〉 12

Met Lys Thr Arg Asp Ser Gln Ser Ser Asp Val Ile Ile Ile Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ala Thr Gly Ala Gly Ile Ala Arg Asp Cys Ala Leu Arg Gly Leu

20 25 30

Arg Val Ile Leu Val Glu Arg His Asp Ile Ala Thr Gly Ala Thr Gly

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Arg Asn His Gly Leu Leu His Ser Gly Ala Arg Tyr Ala Val Thr Asp

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65 70 75 80

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Glu Ala Gly Ile Ser Ala Glu Ala Ile Asp Pro Gln Gln Ala Arg Ile

115 120 125

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165 170 175

Leu Ile Arg Glu Gly Ala Thr Val Cys Gly Val Arg Val Arg Asn His

180 185 190

Leu Thr Gly Glu Thr Gln Ala Leu His Ala Pro Val Val Val Asn Ala

195 200 205

Ala Gly Ile Trp Gly Gln His Ile Ala Glu Tyr Ala Asp Leu Arg Ile

210 215 220

Arg Met Phe Pro Ala Lys Gly Ser Leu Leu Ile Met Asp His Arg Ile

225 230 235 240

Asn Gln His Val Ile Asn Arg Cys Arg Lys Pro Ser Asp Ala Asp Ile

245 250 255

Leu Val Pro Gly Asp Thr Ile Ser Leu Ile Gly Thr Thr Ser Leu Arg

260 265 270

Ile Asp Tyr Asn Glu Ile Asp Asp Asn Arg Val Thr Ala Glu Glu Val

275 280 285

Asp Ile Leu Leu Arg Glu Gly Glu Lys Leu Ala Pro Val Met Ala Lys

290 295 300

Thr Arg Ile Leu Arg Ala Tyr Ser Gly Val Arg Pro Leu Val Ala Ser

305 310 315 320

Asp Asp Asp Pro Ser Gly Arg Asn Leu Ser Arg Gly Ile Val Leu Leu

325 330 335

Asp His Ala Glu Arg Asp Gly Leu Asp Gly Phe Ile Thr Ile Thr Gly

340 345 350

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355 360 365

Val Cys Arg Lys Leu Gly Asn Thr Arg Pro Cys Thr Thr Ala Asp Leu

370 375 380

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385 390 395 400

Ile Ser Leu Pro Ala Pro Leu Arg Gly Ser Ala Val Tyr Arg His Gly

405 410 415

Asp Arg Thr Pro Ala Trp Leu Ser Glu Gly Arg Leu His Arg Ser Leu

420 425 430

Val Cys Glu Cys Glu Ala Val Thr Ala Gly Glu Val Gln Tyr Ala Val

435 440 445

Glu Asn Leu Asn Val Asn Ser Leu Leu Asp Leu Arg Arg Arg Thr Arg

450 455 460

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465 470 475 480

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485 490 495

Gln Leu Ser Thr Phe Leu Asn Glu Arg Trp Lys Gly Val Gln Pro Ile

500 505 510

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515 520 525

Gln Gly Leu Cys Gly Leu Glu Lys Glu Gln Lys Asp Ala Leu

530 535 540

〈210〉 13

〈211〉 250

〈212〉 PRT

〈213〉 Saccharomyces cerevisiae

〈400〉 13

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1 5 10 15

Phe Asp Val Asp Gly Thr Ile Ile Ile Ser Gln Pro Ala Ile Ala Ala

20 25 30

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Val Ile Gln Val Ser His Gly Trp Arg Thr Phe Asp Ala Ile Ala Lys

50 55 60

Phe Ala Pro Asp Phe Ala Asn Glu Glu Tyr Val Asn Lys Leu Glu Ala

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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Gly Tyr Pro Ile Asn Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser Lys Val Val Val

165 170 175

Phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Ala Ala Gly Lys Ala Ala Gly Cys

180 185 190

Lys Ile Ile Gly Ile Ala Thr Thr Phe Asp Leu Asp Phe Leu Lys Glu

195 200 205

Lys Gly Cys Asp Ile Ile Val Lys Asn His Glu Ser Ile Arg Val Gly

210 215 220

Gly Tyr Asn Ala Glu Thr Asp Glu Val Glu Phe Ile Phe Asp Asp Tyr

225 230 235 240

Leu Tyr Ala Lys Asp Asp Leu Leu Lys Trp

245 250

〈210〉 14

〈211〉 271

〈212〉 PRT

〈400〉 14

Met Lys Arg Phe Asn Val Leu Lys Tyr Ile Arg Thr Thr Lys Ala Asn

1 5 10 15

Ile Gln Thr Ile Ala Met Pro Leu Thr Thr Lys Pro Leu Ser Leu Lys

20 25 30

Ile Asn Ala Ala Leu Phe Asp Val Asp Gly Thr Ile Ile Ile Ser Gln

35 40 45

Pro Ala Ile Ala Ala Phe Trp Arg Asp Phe Gly Lys Asp Lys Pro Tyr

50 55 60

Phe Asp Ala Glu His Val Ile His Ile Ser His Gly Trp Arg Thr Tyr

65 70 75 80

Asp Ala Ile Ala Lys Phe Ala Pro Asp Phe Ala Asp Glu Glu Tyr Val

85 90 95

Asn Lys Leu Glu Gly Glu Ile Pro Glu Lys Tyr Gly Glu His Ser Ile

100 105 110

Glu Val Pro Gly Ala Val Lys Leu Cys Asn Ala Leu Asn Ala Leu Pro

115 120 125

Lys Glu Lys Trp Ala Val Ala Thr Ser Gly Thr Arg Asp Met Ala Lys

130 135 140

Lys Trp Phe Asp Ile Leu Lys Ile Lys Arg Pro Glu Tyr Phe Ile Thr

145 150 155 160

Ala Asn Asp Val Lys Gln Gly Lys Pro His Pro Glu Pro Tyr Leu Lys

165 170 175

Gly Arg Asn Gly Leu Gly Phe Pro Ile Asn Glu Gln Asp Pro Ser Lys

180 185 190

Ser Lys Val Val Val Phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Ala Ala Gly

195 200 205

Lys Ala Ala Gly Cys Lys Ile Val Gly Ile Ala Thr Thr Phe Asp Leu

210 215 220

Asp Phe Leu Lys Glu Lys Gly Cys Asp Ile Ile Val Lys Asn His Glu

225 230 235 240

Ser Ile Arg Val Gly Glu Tyr Asn Ala Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu

245 250 255

Ile Phe Asp Asp Tyr Leu Tyr Ala Lys Asp Asp Leu Leu Lys Trp

260 265 270

〈210〉 15

〈211〉 709

〈212〉 PRT

〈213〉 Saccharomyces

〈400〉 15

Met Phe Pro Ser Leu Phe Arg Leu Val Val Phe Ser Lys Arg Tyr Ile

1 5 10 15

Phe Arg Ser Ser Gln Arg Leu Tyr Thr Ser Leu Lys Gln Glu Gln Ser

20 25 30

Arg Met Ser Lys Ile Met Glu Asp Leu Arg Ser Asp Tyr Val Pro Leu

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65 70 75 80

Ser Ala Ser Lys Gly Lys Ile Gly Val Ser Gly Leu Arg Arg Pro Ser

85 90 95

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100 105 110

Gly Lys Pro Ile Phe Ser Ala Glu Gly Tyr Ala Ile Gln Glu Thr Lys

115 120 125

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Leu Lys Phe Pro Lys Pro Gly Trp Val Glu Cys His Pro Gln Lys Leu

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Leu Val Asn Val Val Gln Cys Leu Ala Ser Ser Leu Leu Ser Leu Gln

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Arg Arg Thr Gly Lys Pro Ile Val Asn Tyr Gly Ile Val Trp Asn Asp

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Thr Arg Thr Ile Lys Ile Val Arg Asp Lys Trp Gln Asn Thr Ser Val

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245 250 255

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260 265 270

Leu Cys Thr Lys Ala Tyr Glu Glu Asn Asp Leu Met Phe Gly Thr Val

275 280 285

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Asp Val Thr Asn Ala Ser Arg Thr Gly Phe Met Asn Leu Ser Thr Leu

305 310 315 320

Lys Tyr Asp Asn Glu Leu Leu Glu Phe Trp Gly Ile Asp Lys Asn Leu

325 330 335

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435 440 445

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530 535 540

Leu Lys Ala Met Ser Ser Asp Ala Phe Gly Glu Gly Ser Lys Asp Arg

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705

〈210〉 16

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〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

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〈210〉 17

〈211〉 36

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 17

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〈210〉 18

〈211〉 34

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 18

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〈210〉 19

〈211〉 39

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 19

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〈210〉 20

〈211〉 24

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 20

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〈210〉 21

〈211〉 24

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 21

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〈210〉 22

〈211〉 19

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 22

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〈210〉 23

〈211〉 19

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 23

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〈210〉 24

〈211〉 15

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 24

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〈210〉 25

〈211〉 15

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 25

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〈210〉 26

〈211〉 22

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 26

gctttctgtg ctgcggcttt ag 22

〈210〉 27

〈211〉 23

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 27

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〈210〉 28

〈211〉 51

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 28

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〈210〉 29

〈211〉 23

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 29

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〈210〉 30

〈211〉 25

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

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〈210〉 31

〈211〉 23

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 31

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〈210〉 32

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〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

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〈210〉 33

〈211〉 20

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 33

atggagaaaa aaatcactgg 20

〈210〉 34

〈211〉 20

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 34

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〈210〉 35

〈211〉 20

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 35

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〈210〉 36

〈211〉 26

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 36

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〈210〉 37

〈211〉 29

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 37

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〈210〉 38

〈211〉 26

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 38

gaagtcgacc gctgcgcctt atccgg 26

〈210〉 39

〈211〉 28

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 39

cgcgtcgacg tttacaattt caggtggc 28

〈210〉 40

〈211〉 23

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 40

gcagcatgct ggactggtag tag 23

〈210〉 41

〈211〉 27

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 41

cagtctagag ttattggcaa acctacc 27

〈210〉 42

〈211〉 25

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 42

gatgcatgcc cagggcggag acggc 25

〈210〉 43

〈211〉 29

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 43

ctaacgattg ttctctagag aaaatgtcc 29

〈210〉 44

〈211〉 30

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 44

cacgcatgca gttcaacctg ttgatagtac 30

〈210〉 45

〈211〉 28

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 synthetic primer

〈400〉 45

gcgtctagat ccttttaaat taaaaatg 28

Claims

(i) 하기 유전자,

(a) 글리세롤 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 내재성

유전자, 및

(b) 글리세롤 디히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는

내재성 유전자

중 어느 하나 또는 둘 모두에 붕괴(disruption)를 갖는 (여기서 붕괴는 활성 유전자 생성물의 발현을 막음) 적합한 숙주세포를,

하기 유전자,

(a) 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제 활성을 갖는 단백질을

암호화하는 유전자, 및

(b) 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 활성을 갖는 단백질을 암호화

하는 유전자

중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키는 단계,

(ii) 단계 (i)에서 형질전환된 숙주세포를 일탄당, 올리고당, 다당류 및 단일 탄소 기질(single-carbon substrates)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 탄소원의 존재하에 배양하여 글리세롤을 생성하는 단계, 및

(iii) 임의로 단계 (ii)에서 생성된 글리세롤을 회수하는 단계

를 포함하는, 재조합 유기체로부터의 글리세롤 생산방법.
제1항에 있어서, 발현 카세트가 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 발현 카세트가 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 발현 카세트가 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 효소 및 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 숙주세포가 내재성 글리세롤 키나제 효소를 암호화하는 유전자에 붕괴(여기서 붕괴는 활성 유전자 생성물의 발현을 막음)를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 숙주세포가 내재성 글리세롤 디히드로게나제 효소를 암호화하는 유전자에 붕괴(여기서 붕괴는 활성 유전자 생성물의 발현을 막음)를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 숙주세포가 (a) 내재성 글리세롤 키나제 효소를 암호화하는 유전자에 붕괴 및 (b) 내재성 글리세롤 디히드로게나제 효소를 암호화하는 유전자에 붕괴 (여기서 각 유전자에의 붕괴는 유전자로부터 활성 유전자 생성물의 발현을 막음)를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 적합한 숙주세포는 박테리아, 효모 및 선상균류로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 적합한 숙주세포는 시트로박터, 엔테로박터, 클로스트리듐, 클렙시엘라, 에어로박터, 락토바실러스, 아스페르질러스, 사카로미체스, 시조사카로미체스, 자이고사카로미체스, 피키아, 클루이베로미체스, 칸디다, 한스에눌라, 데바리오미체스, 무코, 토룰롭시스, 메틸로박터, 에스케리키아, 살모넬라, 바실러스, 스트렙토미체스 및 수도모나스로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제9항에 있어서, 적합한 숙주세포는 대장균 또는 사카로미체스 sp.인 방법.
제1항에 있어서, 탄소원은 글루코스인 방법.
제1항에 있어서, 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 갖는 단백질은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열(여기서, 아미노산 서열은 효소의 기능적 성질을 변화시키지 않는 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함함)에 해당하는 방법.
제1항에 있어서, 글리세롤-3-포스파타제 활성을 갖는 단백질은 서열번호 13 및 14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열(여기서, 아미노산 서열은 효소의 기능적 성질을 변화시키지 않는 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수도 있음)에 해당하는 방법.
(a) 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자,

(b) 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자,

(c) 내재성 글리세롤 키나제를 암호화하는 유전자에 붕괴, 및

(d) 내재성 글리세롤 디히드로게나제를 암호화하는 유전자에 붕괴

(여기서, (c) 및 (d)의 유전자에의 붕괴는 활성 유전자 생성물의 발현을 막고, 숙주세포는 일탄당, 올리고당, 다당류 및 단일 탄소 기질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 탄소원을 글리세롤로 전환시킴)를 포함하는 형질전환된 숙주세포.
(a) 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자,

(b) 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자, 및

(c) 내재성 글리세롤 디히드로게나제를 암호화하는 유전자에 붕괴

(여기서, (c)의 유전자에의 붕괴는 활성 유전자 생성물의 발현을 막고, 숙주세포는 일탄당, 올리고당, 다당류 및 단일 탄소 기질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 탄소원을 글리세롤로 전환시킴)를 포함하는 형질전환된 숙주세포.
(a) 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자,

(b) 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자, 및

(c) 내재성 글리세롤 키나제를 암호화하는 유전자에 붕괴

(여기서, (c)의 유전자에의 붕괴는 활성 유전자 생성물의 발현을 막고 또한 숙주세포는 일탄당, 올리고당, 다당류 및 단일 탄소 기질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 탄소원을 글리세롤로 전환시킴)를 포함하는 형질전환된 숙주세포.
(i) 하기 유전자,

(a) 글리세롤 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 내재성

유전자, 및

(b) 글리세롤 디히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는

내재성 유전자

중 어느 하나 또는 둘 모두에 붕괴(disruption)를 갖고 (여기서 (a) 또는 (b)의 유전자에의 붕괴는 활성 유전자 생성물의 발현을 막는다) 탈수효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 갖는 적합한 숙주세포를,

하기 유전자,

(a) 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 갖는 단백질을

암호화하는 유전자, 및

(b) 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 활성을 갖는 단백질을 암호화

하는 유전자

중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키는 단계,

(ii) 단계 (i)에서 형질전환된 숙주세포를 일탄당, 올리고당, 다당류 및 단일 탄소 기질(single-carbon substrates)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 탄소원의 존재하에 배양하여 1,3-프로판디올을 생성하는 단계, 및

(iii) 단계 (ii)에서 생성된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계

를 포함하는, 재조합 유기체로부터의 1,3-프로판디올 생산방법.
제17항에 있어서, 탈수효소 활성을 갖는 단백질은 글리세롤 탈수효소 및 디올 탈수효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제18항에 있어서, 글리세롤 탈수효소는 클렙시엘라, 락토바실러스, 엔테로박터, 시트로박터, 펠로박터, 일리오박터 및 클로스트리디움으로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물로부터 단리된 유전자에 의해 암호화되는 방법.
제18항에 있어서, 디올 탈수효소는 클렙시엘라 및 살모넬라로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물로부터 단리된 유전자에 의해 암호화되는 방법.